Физико-химическое исследование систем, содержащих гепарин, ионы 3-d металлов и аминокислоты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.04, кандидат наук Францева, Юлия Викторовна

• Францева, Юлия Викторовна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Францева, Юлия Викторовна

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.Строение и кислотно-основные свойства гепарина

1.2Комплексообразование гепарина с катионами металлов: М - Ь]

17

(М2+:Со2+,Си2+,М2+;Ь, :Нер4")

1.3 Зависимость между структурой гепарина и его биологической

26

активностью

1.4 Биологическая активность металлов

(Си2+, Со2+, №2+)

1.4.1 Биологическая активность меди

1.4.2 Биологическая активность кобальта

1.4.3 Биологическая активность никеля

1.5 Аминокислоты. Биологическая активность

1.5.1 Глицин и его биологическая активность

1.5.2 Аргинин и его биологическая активность

1.5.3 Пролин и его биологическая активность

1.6 Методы исследования

1.6.1 Метод математического моделирования (МММ)

1.6.2 Калибровка стеклянного электрода при рН - метрическом титровании

1.6.3 Термогравиметрический анализ

1.6.4 Метод ИК-спектроскопии

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1 Техника и методика эксперимента

2.1.1 Методика получения твердых гепаринатов

2.1.2 Процессы комплексообразования в тройных системах

2.1.3 Методика получения комплексов на основе гепарина, ионов

(глицин - Gly, аргинин - Arg, пролин - Pro)

2.1.4 Исследование свойств гепаринатов М2+-ЬГЬ2(М2+: Ni2+, Со2+, Си2+:

56

LI: Hep; L2: Gly, Arg, Pro)

Глава 3. Обсуждение результатов

2+ 2+

3.1 Гепаринаты ионов микроэлементов М : Со , Си ,Ni

2+

3.2 Процессы комплексообразования в тройной системе М - L, - L2

(М2+: Со2+, Cu2+,Ni2+; U-Hep4-; L2: Arg, Gly, Pro)

| ^ j 2+ ^ |

3.3 Комплексы гепарина с биометаллами М : Со , Си , Ni и

79

aMHH0KHan0TaMHArg,Gly, Pro

Реализация результатов

Выводы

Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ß - полная константа образования комплексного соединения

Hep4" - тетраанион мономерного звена высокомолекулярного гепарина

Na^ep - молекула тетранатриевой соли гепарина

Arg - аргинин

Gly - глицин

Pro - пролин

Мп+- ион металла

L - лиганд

t - температура, °С

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Физико-химическое исследование систем, содержащих гепарин, ионы 3-d металлов и аминокислоты»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы.

За последние 60 лет гепарин, как эффективный и нетоксичный антикоагулянт получил широкое распространение в медицинской практике. В силу своих структурных особенностей, гепарин, представляющий собой гетерогенную смесь сульфатированных полисахаридных цепей, построенных из повторяющихся единиц D-глюкозамина и L-идуроновой кислоты, способен взаимодействовать как с ионами различных металлов, так и с низкомолекулярными биологически активными веществами. Следует отметить, что если процессы комплексообразования ионов макро и микроэлементов, и катионов редкоземельных металлов с гепарином изучены достаточно полно, то комплексообразование в тройных системах ион металла-гепарин-аминокислота исследовано в значительно меньшей степени. В то же время, такие системы представляют интерес как системы, обладающие определенной антикоагулянтной активностью. Кроме того, идентификация состава смешаннолигандных комплексов необходима для определения количественного соотношения концентраций гепарина и аминокислот при синтезе твердых гепаринатов, сведений о структуре и свойствах которых в литературе недостаточны. Поэтому исследование гепарина с катионами металлов и аминокислотами, (глицин - Gly, аргинин -Arg, пролин - Pro) делает тему данного исследования актуальной [1-12].

Цель и задачи исследования

Цель исследования: изучение физико-химических свойств систем, содержащих гепарин, ионы 3-d металлов, аминокислоты в растворе и в твердом виде.

Задачи:

1. синтез и исследование спектральных и термических свойств твердых гепаринатов ионов Со2+, Cu2+, Ni2+.

2. исследование взаимодействия гепарина с катионами Со2+, Cu2+, Ni2+ и аминокислотами (глицин, аргинин, пролин) в водном растворе, определение состава, устойчивости и области существования рН образующихся комплексов.

3. синтез и исследование методами элементного анализа, ИК -спектрального и термического анализа комплексов гепарина с катионами Со2+, Cu2+, Ni2+ и аминокислотами (глицин, аргинин, пролин).

Научная новизна работы

Впервые методом элементного анализа, спектральными и термическими методами исследованы твердые гепаринаты Со2+, Cu2+, Ni2+.

Впервые в широком интервале рН по данным потенциометрических измерений с использованием современных методов компьютерного моделирования исследованы металл - ионные равновесия в системах: Мп+-Lr L2 (Mn+: Со2+, Cu2+, Ni2+; U: Hep4-; L2: Arg, Gly, Pro).

Установлено, что в данных системах возможно образование смешаннолигандных комплексов различного состава: CoOHHepGly4", CoHepGly3", CoHepHArg2", CoHepArg3', CoHepPro, CuHepArg3", CuHepGly3", CuOHHepGly4", CuHepHArg2", CuHepPro, NiHepHArg2", NiHepGly3", NiHepPro, определены константы устойчивости образующихся комплексов и области существования рН.

Впервые в твердом виде выделены комплексы гепарина с Со , Си , Ni2+ и аминокислотами (глицин, аргинин, пролин). Полученные комплексы

исследованы методами элементного анализа, спектральными и термическими методами, предложены брутто-формулы выделенных соединений.

Практическая значимость

Оптимизированы методики синтеза комплексов гепарина с Со2+, Си2+, Ni , а также отработаны методики получения и идентификации комплексов гепарина с

Со , Си , Ni и аминокислотами (глицин, аргинин, пролин). Полученные гепаринаты перспективны при разработке новых лекарственных препаратов. Рассчитанные величины логарифмов констант образования металлокомплексов гепарина и аминокислот могут быть использованы в качестве справочных данных.

Методы исследований

Комплексообразование в водных растворах, содержащих ионы металлов, гепарин, аминокислоты (глицин, аргинин, пролин), исследованы методом потенциометрического титрования (рН - метрическое титрование).

Расчеты моделей химических равновесий и определение соответствующих констант выполнены с помощью комплекса вычислительных программ AUTOEQUIL (Свидетельство о государственной регистрации программы на ЭВМ. 2008 г. №2008612267) и программы расчета химических равновесий New DALSFEK (КСМ Soft, 2000), элементный анализ твердых гепаринатов выполнен на элементном анализаторе CHN Analyzer. Термогравиметрическое исследование проведено на приборе Derivatograph системы Paulik-Paulik-Erdey и термогравиметрическом анализаторе Pyris 1 TGA фирмы Perkin Elmer.

ИК-спектроскопическое исследование выполнено на Фурье ИК-спектрометре Equinox 55 фирмы Bruker (Германия).

Личный вклад автора

Автором непосредственно самостоятельно проведены все эксперименты, а также обработка и анализ результатов исследования.

Положения, выносимые на защиту

1. Результаты исследования процессов комплексообразования гепарина с ионами биометаллов и аминокислотами.

2. Результаты изучения физико-химических свойств твердых гепаринатов методами элементного анализа, дериватографии и ИК-спектроскопии.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих конференциях: XVI Региональных Каргинских чтениях. Тверь, 2009; XVII Региональных Каргинских чтениях. Областная научно-техническая конференция молодых ученых «Физика, химия и новые технологии». Тверь, 2010; на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», Москва, 2009 г; на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», Москва, 2010 г; XX Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии». Екатеринбург, 2010; XXI Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии». Екатеринбург, 2011; XXII Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии». Екатеринбург, 2012; XII науч. конф. аспирантов и студентов химического факультета Тверского гос. ун-та. Тверь, 2013 г; XX Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем», 11-я Международная школа молодых ученых «Синтез, структура и динамика

молекулярных систем», Тверь, 2013 г.

Диссертационное исследование выполнено в рамках проектов ФЦП. «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 20092013 годы»: соглашение № 14.1337.21.1109 и соглашение №14.132.21.1308, а также при поддержке фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере программы «У.М.Н.И.К.».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 статей, из них 5 в отечественных научных журналах входящих в перечень ВАК, а также 13 тезисов докладов на российских конференциях, в которых автором получены все основные экспериментальные результаты, проведена интерпретация

экспериментальных данных.

Структура и объем работы

Диссертация представлена на 111 страницах, иллюстрирована 44 рисунками и 23 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, состоящего из 74 библиографических ссылок.

Глава 1. Литературный обзор 1.1. Строение и кислотно - основные свойства гепарина

Гепарин, как известно, важное соединение, которое синтезируется в организме животных и человека. Можно назвать его биологически активным веществом, антикоагулянтом широкого спектра действия, регулятором физиологических и биохимических процессов, которые протекают в животном организме. В настоящее время, гепарин используется в клинической практике и является одним из эффективных препаратов [13].

В плазме крови содержится особый белок, от которого зависит его противосвертывающая способность — антитромбин III. При его взаимодействии с гепарином, антитромбин способен уменьшать реакционную способность фактора Ха и тромбина [14], за счет образования с ними эквимолярных комплексов [15].

Антитромбин по своей природе плохо влияет на процесс коагуляции, что позволяет ферментам серина воспроизводить большие количества фибрина и тромбина, которые необходимы для свертывания крови. При взаимодействии с гепарином, антитромбин, одновременно, реагируя с тромбином и фактором X, образует небольшое количество фибрина. Это прерывает цепочку взаимосвязанных процессов коагуляции крови.

Гепарин, в живых организмах синтезируется в виде протеогликана, в состав которого входит серглицин, связывающий полисахаридные цепочки - гепарина [15]. После синтеза эти цепочки способны разрываться, тем самым образуя полидисперсную смесь коротких цепочек полисахаридов. Обычно гепарин в таком виде можно увидеть в виде комплексов с протеазами в гранулах тучных клеток.

По химическому строению гепарин представляет собой высокосульфированный мукополисахарид, состоящий из чередующихся остатков - Б-глюкоуроновой кислоты и 2-амино-2-дезокси-В-глюкозы, соединенных связями 1—4. Основной связью можно назвать 1—6 гексозоамин.

Конфигурацию 2-амино-2-дезокси-0-глюкоуроновокислотной связи представляет собой -О-связь. В молекуле гепарина на тетрасахаратную единицу приходится по 5 — 6, 5 сульфатных групп.

Остатки серной кислоты присоединяются к ОН-группам глюкозамина. Высокое содержание сульфогрупп можно объяснить появлением значительного отрицательного заряда и большой подвижности в электрическом поле (Таблица 1.1.1) [16].

Таблица 1.1.1 Дисахаридный состав мукозного гепарина [16]

Дисахарид Число сульфо групп на дисахарид Доля дисаха-рида(%) Мг полностью ионизованн ого дисахарида Мг дисахарида с учетом Ыа и Н в анионных узлах

ДиА-[1->4]-01сК 0 од 335,2 354,12

ДиА-[1—>4] -ОШАс 0 0,2 377,23 396,15

ДиА(28) -[1—»4] -вШ 1 0 414,23 452,07

ДИА(28) -[1—>4] -вкИАс 1 1,5 456,26 494,10

AUA-[1—>4] -GlcN (6S) 1 3,5 414,23 452,07

AUA-[1—>4] -GlcNAc (6S) 1 2,5 456,26 494,10

AUA-[1—>4] -GlcNS 1 1,2 414,23 452,07

AUA(2S) -[Ь4] -GlcN (6S) 2 2,3 493,26 550,03

AUA(2S) -[1—>4] -GlcNAc (6S) 2 3,9 535,29 592,06

AUA(2S) -[1—>4] -GlcNS 2 4,7 493,26 550,03

AUA-[1—>4] -GlcNS (6S) 2 12 493,26 550,03

AUA(2S) -[1—>4] -GlcNS (6S) 3 68 572,29 647,98

Если рассмотреть все разновидности дисахаридов, которые характерны для гепарина, то можно увидеть, что его мономерное звено включает одну из трех сульфоновых групп или вообще оно не сульфатировано.

В работе [16] определялся количественный состав по дисахаридам мукозного гепарина методом жидкостной хроматографии. Перед началом работы гепарин обработали тремя видами ферментов.

Дисахаридный состав гепарина приведен в табл. 1.1.1. В образовавшихся дисахаридах невозможно было отличить конформационные особенности, характерные для идуроновой и глюкуроновой кислот. Поэтому кольцо уроновой кислоты единообразно обозначено как AUA, для несульфатированного моносахарида и как AUA(2S), для 2-0-

сульфатированного [16]. Можно увидеть из таблицы, что в гепарине присутствуют не все возможные виды дисахаридов. Из вышесказанного можно рассчитать средние параметры мономерного звена гепарина (Таблица 1.1.2).

Таблица 1.1.2

Усредненные параметры дисахаридного звена гепарина [16]

Название Величина

Среднее число анионных узлов на дисахарид 3,59

Доля анионных узлов, занятых атомами На 0,80

Доля анионных узлов, занятых атомами Н 0,20

Средняя молекулярная масса 610,80

Рис. 1.1.1 Структурная формула мономерного звена гепарина. Форма Н4Ь

В виду диссоциации кислотных групп, цепь гепарина сильно заряжена (рис. 1.1.1).

Кислотно-основные свойства гепарина нами были изучены ранее [17, 18, 19]. Кривая рН - метрического титрования водного раствора Ыа4Нер представлена на рис. 1.1.2.

V ЫаОН, мл

Рис. 1.1.2 Кривая титрования водного раствора гепарина + 4 экв. НС1 на фоне 0.15 МКаС1 и температуре 37°С. СЬер=1.16-10"3 М, СНСг=0.0048 М. Скаон=0-1410 М. Точки - эксперимент, линия - расчет.

На основании экспериментальных данных рН-метрического титрования, с использованием метода математического моделирования - (молекулярная матрица представлена в таблице 1.1.3) , в которой учтен спектр всех возможных молекулярных форм системы Ыа4Нер - Н20.

Таблица 1.1.3

Молекулярная матрица системы Na4Hep - Н20. Базис Н+, Hep4'

№ Молекулярная форма Lg(Pi) Ы Hep4'

1 н+ 0 1 0

2 Нер4" 0 0 1

3 он- -13.40 -1 0

4 ННер3' IgPi 1 1

5 Н2Нер2" lgP2 2 1

6 НзНер lgp3 3 1

7 Н4Нер lgp4 4 1

•2

Была идентифицирована только одна форма ННер которая отвечала протонированию карбоксильной группы а-Ь-идуроновой кислоты. Рассчитанное значение величины десятичного логарифма константы протонирования было сопоставлено -с - аналогичными значениями, приведенными в литературе (Таблица 1.1.4).

Таблица 1.1.4

Величина десятичного логарифма протонированной константы

гепарина

Ьё(3 Источник

3.62 ±0.11 наши данные

4.70±0.20 [20]

3.66±0.04 [21]

3.79±0.06 [22]

3.62 [23]

На рис. 1.1.3 представлена диаграмма распределения комплексных форм гепарина в растворе.

рн

Рис. 1.1.3 Концентрационная диаграмма распределения форм гепарина в зависимости от рН в присутствии 0.15 М NaCl и температуре 37°С. СНер =

1.16-10"3 М. 1 - ННер3", 2 - Hep4-

Полученные результаты в дальнейшем были использованы для исследования двойных и тройных систем гепарина.

1.2. Комплексообразование гепарина с катионами металлов: М2+- Lx (М2+: Со2+, Cu2+, Ni2+; L,: Hep4 )

Результаты исследований, которые показывают процессы образования комплексов «гепарин - ион металла» весьма разнообразны и противоречивы. Интерес вызывает цикл работ, выполненный D. Grant [1-12]. Работа [9], которая посвящена ИК - спектроскопическому исследованию гепарина и его металлокомплексов, требует особого внимания. Авторы провели исследование по отнесению полос поглощения натйвного гепарина.

Однако, что выводов о координации с донорными группами катионов работа не содержит. С помощью потенциометрической и поляриметрической методик было установлено, что гепарин координирует

ионы металла. Была попытка описать устойчивость образующихся комплексов. Исследования проводились для ряда б-, р- и ё-элементов.

В процессе исследований было доказано, что характер координации щелочных металлов остался невыясненным до конца, а устойчивость комплексов гепарина с ионами магния ниже, чем с ионами кальция. Обсуждение координации щелочных металлов с гепарином остается до сих пор очень спорным моментом. Известно, что ионы щелочных металлов не являются комплексообразователями, а известные примеры служат исключением, которое подтверждает известную закономерность.

Можно выстроить в определенном порядке цепочку из элементов: K+~Li+~Mg2+~Na+<Ca2+<Cu2+ по мере того, как возрастает устойчивость комплексов с гепарином ионов металлов по данным [1-12].

В [20] было подробно охарактеризованы кислотно-основные свойства гепарина и рассчитаны значения констант кислотной диссоциации: рКа = 4.70±0.20, определены логарифмы констант устойчивости комплексов гепарина и катионами кальция (^3=2.65), магния (^(3=2.08), цинка (1ёР=2.68), магния (1§р=2.08) и лантана (^(3=3.59).

Это первая работа, в которой показана структура и устойчивость металлокомплексов гепарина.

Согласно [20] работе было доказано, что полиэлектролиты взаимодействуют с окружающими их ионами. Это взаимодействие приводит конденсации противоионов на молекуле полиэлектролита. Различают «неспецифичное» и «специфичное» взаимодействия. В первом случае нельзя _ _ . -определить донорные группировки, которые участвуют в координации, а во втором, достаточно спокойно определяются группы, участвующие в координации иона.

Несомненно, внимания заслуживает работа [24], в которой авторами было исследовано взаимодействие гепарина с переходными и щелочноземельными металлами, представленными в ряд: Мп2+ > Си2+ > Са2+ > > Со2+ > Иа+ > > Ре3+ > №2+ > А13+ > 8г2+. В работе [25] были получены

нанокапсулы, которые были обработаны хлоридом железа и покрыты гепарином.

Авторами [25] показано, что гепарин образует достаточно прочные комплексы с этими ионами, о чем говорят данные ИК - спектроскопических исследований Обработка этих нанокапсул 10% растворами соляной кислоты, гидроксидом натрия, а также настаивание в фосфатном буфере не привели к разрушению комплекса.

В работе [26] можно увидеть, что наименьшее сродство проявляют к гепарину ионы стронция, наибольшее — ионы двухвалентного марганца. Из вестно также, что в организме человека содержится достаточно большое количество железа, и не последнюю роль в стабилизации концентрации железа на определенном уровне принимают углеводы и полиолы.

Гепарин имеет несколько типов донорных групп: сульфогруппы, карбоксильная, гидроксогруппы, гликозидный и эфирный кислород, амидный азот и карбонильный кислород. Отсюда получаем, что в комплексообразовании принимают участие атомы кислорода и вряд ли возможно участие депротонированных гидроксильных групп рибозных колец в образовании хелатных циклов.

Можно наблюдать, что единого мнения по поводу образования комплексов гепарина с ионами цинка и меди нет. Например, в [27] работе говорится о том, что стехиометрия комплексов не описывается 1:1. В доказательство этого можно привести данные гель - проникающей хроматографии и результаты спектрофотометрических исследований. В то же время в работе [28] можно увидеть, что при образовании комплексов с

гепарином ионов металла преобладают смешаннолигандные и средние комплексы при соотношении 1:1.

Ранее нами были исследованы процессы комплексообразования в двойной системе Нер-Ме [17, 18, 19]. Было доказано, что для для двойных систем, содержащих ионы Си2+, №2+, Со2+ гомогенность сохраняется во всем рабочем интервале рН, следовательно,отсюда можно сказать, что ограничений в применении МММ нет.

Ввиду того, что титрование проводили на фоне 0.15 М хлорида натрия, для системы СиС12 - Ыа4Нер - Н20 - ЫаС1 необходимо учесть образование хлоридных комплексов меди, т.к. концентрация хлорид-ионов в растворе как минимум в сто раз превосходит концентрацию ионов меди, и можно ожидать, что равновесие будет смещено в сторону образования форм СиС^2"1 0 = 1, 2, 3, 4). Предварительный расчет показал, что концентрации три- и тетрахлоридных комплексов ионов меди в исследуемой системе не значима и их учет слабо влияет на величину V . В связи с этим, в молекулярной матрице фиксировали только лишь логарифмы констант образования форм СиС1+ и СиС12. Гидролиз ионов Си может быть хорошо описан учетом только лишь двух равновесий - образование моногидроксо- и дигидроксокомплекса меди (II). Отсюда следует, что равновесие будет смещаться в сторону образования форм СиС1^ 0 = 1, 2, 3, 4).

Гомогенность систем МеС12 - Ыа4Нер - Н20 (Меп+: М2+, Со2+) сохранялась во всем интервале рН, нарушаясь, однако, в сильнощелочной области (рН>10,50) в системе №С12 - №4Нер - Н20. В кислой и слабокислой областях растворы окрашены в цвета, характерные для аква-ионов. По мере защелачивания среды происходит постепенное замещение молекул воды во внутренней координационной сфере ионов с замещением их на гидроксокруппы. При этом цвет раствора меняется, приобретая синюю окраску, характерную для гидроксосоединений никеля и кобальта.

В итоге моделирования равновесий в системах Men+-Na4Hep - Н20 (Меп+: Cu2+, Ni2+, Со2 +) был определен однотипный набор комплексных форм: МеНер2\ МеОННер3" и Ме(ОН)2Нер представленный в таблице 1.2.1.

Таблица 1.2.1

Итоговая база данных по логарифмам констант образования комплексов ионов микроэлементов с высокомолекулярным гепарином. I = 0.15 NaCl, t = 37°С. Термодинамический базис ОН-, Hep4", Меп+

Равновесие LgP

Си1+ + hep4' <=> Cuhep2' 7.79±0.17

Си2+ +hep4' + ОН~ о CuOHhep" 14.99±0.10

Си2+ + hep4' +2ОН' Cu(OH)2hep4' 21.44±0.11

Ni1+ + hep4' <=> Nihep2~ 3.86±0.21

Ni2+ + hep4' +OH~ <=> NiOHhep3' 8.35±0.21

Co2+ + hep4' <=> Cohep2' 4.04±0.11

Co2+ + hep4' +OH' о CoOHhep3' 9.27±0.10

Co2+ + hep4' +2OH' « Co(OH)2hep4' 12.95±0.11

Из таблицы следует, что большую устойчивость имеют комплексы гепарина с двухвалентным кобальтом.

На рис. 1.2.1 - рис. 1.2.3 приведены диаграммы распределения комплексных форм, построенные на основании результатов моделирования

химических равновесий в системах Меп+-Ыа4Нер - Н20 (Меп+: Си^, Со2+).

2+

•2+

1 ОчЮ 9 0\101 8 (МО4 7 0x10й б ОхЮ4 ' ОхЮ"1 4 0410** 3 ОчЮ^

2 0*10"* 1 0x10"1

0 0

\

*

>> £

№Нер

/ Нер*

ННер

№ОННер

> -

к

рН

Рис 1.2.1 Концентрационные диаграммы распределения комплексных форм в системах: №С1г -Иа^Нер - НгО;. Температура 37°С, ионная сила 0.15 ЫаС1

СшОИ) пч>4

рН

Рис. 1.2.2 Концентрационные диаграммы распределения комплексных форм в системах: СиС12 - Ка4Нер - Н20 - СГ;.Температура 37°С, ионная сила 0.15 ЫаС1.

1.0x10

8.0x10 -

6.0x10 -

с*, >

О

q 4,0x10"' "

2.0x10

0.0

СоНер"

■,Ccf

% л» ¥

<? Ч.

£•< О 0

4- Я

Hep ' ,р'

СоОННер f

Г

s/4 ^ л

у \ f J f» 7*

л v

Л ' '

/ ^й/

Со(ОН),Нер4"

-V

■Т.:

Т ' ! ' Г ! ' 1

23456789 10

рН

Рис. 1.2.3 Концентрационные диаграммы распределения комплексных форм в системах: СоС12 -Na4Hep - Н2О.Температура 37°С, ионная сила 0.15 NaCl. Ниже, в таблице 1.2.2 — 1.2.4 представлены молекулярные матрицы двойных систем CuCl2 - Na4Hep - Н20 - NaCl. Базис Н+, Hep4", Cu2+, Cl".

Таблица 1.2.2

Компонентная матрица молекулярных форм раствора CuCl2-Na4Hep-Н20-ЫаС1.Базис H+,Hep4",Cu2+, Cl"

№ Молекулярная форма m H" Нер4" Cu2+ Cl"

1 ьГ 0.00 1 0 0 0

2 Нер4" 0.00 0 1 0 0

3 Си2+ 0.00 0 0 1 0

4 Cl" 0.00 0 0 0 1

5 ОН" -13.40 -1 0 0 0

6 ННер3- 3.62 1 1 0 0

7 CuObT -7.70 -1 0 1 0

8 Си(ОН)2 -15.20 -2 0 1 0

9 СиС1+ 2.70 0 0 1 1

10 СиС12 5.50 0 0 1 2

11 СиНер2- № 0 1 1 0

12 Си(ОН)2Нер4- lgf32 -2 1 1 0

13 СиОННер3- -1 1 1 0

Таблица 1.2.3

Компонентная матрица молекулярных форм раствора NiCl2 - Na4Hep -Н20. Базис Н*, Hep4-, Ni2+

№ Молекулярная форма IgPi кг Нер4- Ni2+

1 Н+ 0.00 1 0 0

2 Нер4- 0.00 0 1 0

3 Ni2+ 0.00 0 0 1

4 ОН- -13.40 -1 0 0

5 ННер3- 3.79 1 1 0

6 NiOH" -9.90 -1 0 1

7 Ni(OH)2 -20.00 -2 0 1

8 NiHep2" IgPi 0 1 1

9 Ni(OH)2Hep4" lgP2 -2 1 1

10 NiOHHep3" lgp3 -1 1 1

Таблица 1.2.4

Компонентная матрица молекулярных форм раствора СоС12 - Na4Hep -Н20. Базис Я", Hep4', Со2+

№ Молекулярная форма IgPi H" Hep4' Co2+

1 Н* 0.00 1 0 0

2 Hep4' 0.00 0 1 0

3 Co2+ 0.00 0 0 1

4 OH' -13.40 -1 0 0

5 HHep3" 3.79 1 1 0

6 СоОНГ -9.70 -1 0 1

7 Со(ОН)2 -19.60 -2 0 1

8 СоНер2" № 0 1 1

9 Со(ОН)2Нер4" № -2 1 1

10 СоОННер3' № -1 1 1

1.3. Зависимость между структурой гепарина и его биологической

активностью

Спектр физиологического действия гепарина разнообразен, поэтому понятие биологическая активность велико. Сюда можно отнести регуляторное воздействие, антикоагулянтную активность, антимитотическое влияние. Но наиболее распространенным в практическом применении является антиколониальные свойства гепарина[29].

Известно, что антикоагулянтная активность тесно связана с особенностями строения молекулы гепарина. А именно, она зависит от размера скелета его молекулы, расположения и количества О - сульфатных групп, от содержания серы степени сульфатированния количества. В процессе эксперимента с плазмой крови кроликов было выяснено, что минимальное значение активности наблюдается при рН 6,1—6,5, максимальное при рН плазмы 7,3—7,5.

В процессе эксперимента было сделано заключение, что биологическая активность гепарина определяется размером формой молекулы, ее молекулярным весом, степенью карбоксилации и сульфатации[30]. Как частный случай, может быть рассмотрено десульфирование, которое протекает в результате мягкого гидролиза, сопровождающегося уменьшением биологической активности.

В свою очередь, гепарин разрушается при сильной щелочной реакции среды. Если посмотреть с другой стороны, потерю антикоагулянтной активности способна вызвать даже низкая кислотность. И степень этой потери прямо пропорциональна степени появления в молекуле гепарина свободных аминогрупп. Можно предположить, что главную роль в проявлении антикоагулянтной активности играет аминный азот. В процессе эксперимента, при температуре 25°С и рН 1—2 биологическая активность гепарина не изменяется. По истечению 60 часов при температуре 23 °С и рН 4,4 наблюдается заметное изменение биологической активности. Это объясняет наличие в молекуле гепарина кислоты. Под ее воздействием происходит образование внутренних эфиров в гепарине.

Доказано, что эта поликислота не изменяет своей антикоагулянтной активности в процессе парообработки в течении 1 часа при 100 °С и рН - 7. Отсюда следует, что гепарин можно подвергать стериализации[29]. Замечена взаимосвязь между молекулярным весом и антикоагулянтной активностью фракций гепарина. Даже при небольшом уровне сульфата у препаратов гепарина с степень полимеризации 9 отмечалась слабая активность. Активность фракций гепарина мала. Активность гепарина по мере возрастания молекулярного веса до 10000 с молекулярным весом 2500 -15500 увеличивается, но последующее возрастание не вызывает заметных сдвигов [30].

При неполном гидролизе можно отметить падение молекулярного веса, снижения вязкости в воде.

В настоящий момент нет полной информации по механизмам биосинтеза гепарина. Необходимые организму исходные вещества для получения гепарина — это неорганический фосфат и глюкоза. Вслед за полимеризацией в тучных клетках происходит сульфатация.

Высказана гипотеза, что в процессе синтеза протекает ряд специфических реакций, в которых продукт предыдущего этапа является субстратом для начала новой реакции. Для новой реакции переноса нужен определенный фермент — глюкуронозилтрансфераза, который обнаружен в мембране тучных клеток [29, 30] .Известно, что тучные клетки являются обязательной частью соединительной ткани, а их предшественники являются промакрофоги, моноцитарного

происхождения. Отсюда следует, что клеточные элементы крови такого ряда дают жизнь тучным клеткам, проникая в межклеточное пространство соединительной ткани [29].

Так как тучные клетки расположены вблизи кровеносных сосудов и содержат в себе гепарин, то можно сделать вывод о их непосредственном участии в процессе свертывания крови [29].

1.4. Биологическая активность металлов (медь - Си2+, кобальт - Со2+, никель - №2+) 1.4.1 Биологическая активность меди

Медь — микроэлемент, необходимый для нормального развития организма, входит в состав витаминов, ферментов, гормонов, дыхательных пигментов, принимает участие в процессе обмена веществ, в тканевом дыхании. Медь оказывает большое значение для поддержания структуры костей, сухожилий, легочных альвеол, эластичности стенок кровеносных сосудов, кожи. В организме /4 часть от общего количества меди находится в мышцах и костях и 10% - в печени. Обмен меди в сыворотке крови можно проследить при помощи уровня церулоплазмина и активности медьсодержащих ферментов. Медь вместе с плазмой крови поступает в печень, где и происходит синтез церулоплазмина. Церулоплазмин играет роль доставки меди ко всем тканям и клеткам организма.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Францева, Юлия Викторовна, 2013 год

Список литературы

I. Grant D., Long W.F., Williamson F.B. Evidence from potentiometric titration for lack of reversibility in the interaction between heparin and Cu2+ or Ca2+ ions // Biochem Soc Trans. - 1992. - V. 20, № 4. - P. 361.

2. Grant D., Long W.F., Williamson F.B. The binding of platinum (II) to heparin // Biochem Soc Trans. - 1996. - V. 24, № 4. - P. 204.

3. Grant D., Long W.F., Williamson F.B. Similarity and dissimilarity in aspects

2+ • •

of the binding to heparin of Ca and Zn as revealed by potentiometric titration //

Biochem Soc Trans. - 1996. - V. 24, № 2. - P. 203.

4. Grant D., Long W.F., Williamson F.B. Complexation of Fe ions by heparin // Biochem Soc Trans. - 1992. - V. 20, № 4. - P. 361.

5. Grant D., Long W.F., Williamson F.B. Examination of cation-heparin interaction by potentiometric titration // Biochem Soc Trans. - 1992. - V. 20, № 2. - P. 215.

i

6. Grant D., Long W.F., Williamson F.B. Zn -heparin interaction studied by potentiometric titration // J. Biochem. - 1992. - V. 287, № 3. - P. 849 - 853.

7. Grant D., Long W.F., Williamson F.B. A potentiometric titration study of the interaction of heparin with metal cations // J. Biochem. - 1992. - V. 285, № 2. - P. 477 -480.

8. Grant D., Moffat C.F., Long W.F., Williamson F.B. Carboxylate symmetric stretching frequencies and optical rotation shifts of heparin-cation complexes // Biochem Soc Trans. - 1991. - V. 19, № 4. - P. 392.

9. Grant D., Long W.F., Moffat C.F., Williamson F.B. Cu -heparin interaction studied by polarimetry // J. Biochem. - 1992. - V. 283, № 1. - P. 243 - 246.

10. Grant D., Long WF, Moffat CF, Williamson FB. A study of Ca(2+) - heparin complex-formation by polarimetry // J. Biochem. - 1992. - V. 282, № 2. - P. 601 - 604.

II. Grant D., Long W.F., Moffat C.F., Williamson F.B. Polarimetry of mixtures of Cu(II) ions and chemically modified heparins // Biochem Soc Trans. - 1992. - V. 20. - No.l. - P. 2.

12. Grant D., Long W.F., Moffat C.F., Williamson F.B. Polarimetry of mixtures of Cu(II) ions and chemically modified heparins // Biochem Soc Trans. - 1992. - V. 20, №1. - P. 2.

13. Белоусов Ю.Б., Моисеев B.C., Лепахин B.K. Клиническая фармакология и фармакотерапия. Руководство для врачей. -М.: Универсум, 1993.

14. Ляпина Л. А. Физиологические функции гепарина // Успехи совр. биологии. - 1987. - Т. 103, №1. - С. 66 — 80.

15. Riesenfeld J., Thunberg L., Hook M., Lindahl U. // J. Biol. Chem. - 1981. - V. 256. - P. 2389 - 2394.

16. Nikos K. Karamanos. Ion-pair high-performance liquid chromatography for determining disaccharide composition in heparin and heparan sulphate / Nikos K. Karamanos // J. of Chromatography A.- 1997, V. 765, № 6. - P. 169 - 179.

17. Семенов А.Н. Физико-химические закономерности образования металлокомплексов ионов некоторых s-, d- и f- элементов с гепарином. Автореферат дисс. канд-та хим. наук. - Тверь, 2010.

18. Гуманюк, А.В. Комплексообразование высокомолекулярного гепарина с ионами кобальта (II) и никеля (II) / А.В. Гуманюк, Т.В. Трофимова, Ю.В. Францева, А.Н. Семенов, М.А. Феофанова // Физико-химия полимеров. Сб. науч. тр. - 2010, Вып. 16. С. 231 - 236.

19. Францева, Ю.В. Исследование комплексообразования высокомолекулярного гепарина с ионами некоторых микроэлементов / Ю.В. Францева, М.А. Феофанова, А.Н. Семенов // Тезисы докладов и сообщений XVIII Всероссийской конференции. Структура и динамика молекулярных систем 28 июня - 2 июля 2010 г.

20. D.L. Rabenstein, J. М. Robert, J. Peng. Multinuclear magnetic resonance studies of the interaction of inorganic cations with heparin // Carbohydrate Res. - 1995. - V. 278. - P. 239-256.

21. Карпухин Л.Е., Феофанова M.A., Николаева Л.С., Добрынина Н.А, Мамонтов М.Н. Комплексообразование ионов магния и кальция с гепарином // Журн. неорган, химии. - 2006. - Т. 51. - № 6. - С. 979-985.

22. Семенов А. Н., Николаева Л.С., Мамонтов М.Н., Ляпина Л.А., Пасторова В.Е. , Феофанова М.А. Сравнительный анализ процессов комплексообразования ионов магния и кальция с низкомолекулярным и нефракционированным гепарином // Журн. неорган, химии. - 2007. - Т. 52. - № 4. -С. 706-712.

23. Katayama Т., Takai E.I., Kariyama R. and Kanemasa Y. Colloid titration of heparin using Cat-Floe (polydiallyldimethyl ammonium chloride) as standard polycation // Anal. Biochem. - 1978. - Vol. 88. - P. 382 - 387.

24. Parmar N., Paredes N., Berry L. R., Kim E., Chan А. К. C. Binding of heparin to alkaline earth and transition metals // Journal of Thrombosis and Haemostasis. - 2003. - V. 1. - Suppl. 1. - Abstract number P.l 105

25. Lu Yu, Yanguang Gao, Xiuli Yue, Shaoqin Liu, Zhifei Dai. Novel Hollow Microcapsules Based on Iron-Heparin Complex Multilayers // Langmuir. - 2008. - V. 24, №23.-P. 13723- 13729.

26. Manning G. S. Limiting laws and counterion condensation in polyelectrolyte solutions. I. Colligative properties. // The journal of chemical physics. -1969.-V. 51, №3.-P. 924-933.

27. Grushka E., Cohen A. S. The Binding of Cu(II) and Zn(II) Ions by Heparin // Analytical Letters. - 1982. - V. 15, № 16. - P. 1277 - 1288.

28. Rudd T. R., Skidmore M. A. et al. Site-specific interactions of copper(II) ions with heparin revealed with complementary (SRCD, NMR, FTIR and EPR) spectroscopic techniques // Carbohydrate Res. - 2008. - V. 343. - P. 2184 - 2193.

29. Кудряшов Б.А. Биологические проблемы регуляции жидкого состояния крови и ее свертывания - М. ¡Медицина, 1975.

30. Rabenstein D.L. Heparin and heparin sulfate: structure and function // Nat.Prod. Rep. - 2002, V.19. - P. 312-331.

31. Хьюз M. Неорганическая химия биологических процессов / М. Хьюз. - М.: Мир. - 1983.

32. Теппермен, Дж. Физиология обмена веществ и эндокринной системы / Дж. Теппермен, X. Теппермен. -М.: Мир. - 1989

33. Лоуренс Д.Р. Бенитт H.H. Клиническая фармакология-М.: Медицина, 1991.

34. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. - М.: Медицина, 2001. -328 с.

35. Астахов А. Глщисед КМП: просто амшокислота чи ушверсальш лжи проти стресу? // Лжи Украши. - 2004. - № 1. - С.35-36.

36. Гокин А.П., Павласек Ю. Влияние стволовых микроинъекций глицина и стрихнина на старт.рефлексы у крыс. // II Всесоюзная конференция по нейронаукам: Тез. докл., 1988. - С.179-180.

37. Годовалова Л.А., Ковалев Г.В. Влияние глицина на периферические механизмы регуляции вегетативных функций. // Физиол. журн. - 1983. - Т.29, № 4. - С.492-496

38. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Нейропротективная терапия в остром периоде церебрального ишемического инсульта. // Клинический Вестник. 2, 1995. - 6 с.

39. Госткина И.П. Влияние деманола, глицина и глютаминовой кислоты на параметры гомеостаза при смене двигательных режимов: Автореф. дис. канд. мед. наук: 14.00.25 / Морд. Гос. Ун-т им. Н.П.Огарева. - Саранск, 1998. - 17 с.

40. Скоробогатова Л.Н. Влияние деманола, глицина и глютаминовой кислоты на биоэлектрическую нестабильность миокарда: Автореф. дис. канд. мед. наук: 14.00.25 / Морд. Гос. Ун-т им. Н.П.Огарева. - Саранск, 1998. - 16 с.

41. Данилова Е.И., Графова В.Н., Решетняк В.К. Роль блокатора и стимулятора рецепторов NMDA кетамина и глицина в развитии нейропатического болевого синдрома. // Эксперим. и клинич. фармакология. - 1997. - № 4. - С. 10-13

42. Комиссарова И.А. Новое лекарство против стресса. // Terra medica. - 1996. -№ 2. - С.33-36

43. Артюхина C.B. Эффективность применения аминокислот у детей с нейрогенной дисфункцией мочевого пузыря: Автореф. дис. канд. мед. наук: 14.00.09, 14.00.35 // НИИ педиатрии науч. центра здоровья детей РАМН, Центр патологии мочеиспускания. - М.: 2000. - 22 с.

44. Савченко Ю.Н. Рассеянный склероз: Значение метаболических нарушений и аспекты патогенет. лечения: Автореф. дис. д-ра мед. наук: 14.00.13 / I Моск. мед. Ин-т им. И.М.Сеченова. - М.: 1990. - 36 с.

45. Комиссарова И.А. Новое лекарство против стресса. // Terra medica. - 1996. -№2.-С.33 -36.

46. Древаль A.B., Марченкова JI.A., Тишенина Р.С.и др. Комбинация заместительной гормональной терапии препаратами естественных метаболитов (глицином и лимонтаром) в лечении менопаузального синдрома. // Пробл. эндокринологии. - 1999. - Т.45, № 4. - С. 19-24.

47. Драчева М.А. Влияние аминокислотных препаратов глицина и лимонтара на клинику и течение псориаза: Автореф. дис. канд. мед. наук: 14.00.11 / Рос. мед. акад. последиплом. образования. - М.: 1998. - 16 с.

48. Цвиренко С.Н. Патогенетическое обоснование использования глицина в реабилитации новорожденных с внутриутробной гипотрофией на втором этапе выхаживания: Автореф. дис. канд. мед. наук: 14.00.09 / Ин-т педиатрии, акушерства и гинекологии АМН Украины. - Киев, 1995. - 20 с.

49. Якубов С. П. Молекулярные комплексы цинк(П)- и железо(Ш)порфиринов с пиридином, н-пропиламином, метиловым эфиром глицина : Автореф. дис. канд. хим. наук: 02.00.04 - физ. Химия / Институт химии растворов РАН.-Иваново, 2006.

50. Данилова Е.И., Графова В.Н., Решетняк В.К. Роль блокатора и стимулятора рецепторов NMDA кетамина и глицина в развитии нейропатического болевого синдрома. // Эксперим. и клинич. фармакология. - 1997. - № 4. - С. 10-13

51. Джозеф Ней. Глутамин плода и у находящихся в критическом состоянии новорожденных с очень низким весом при рождении: метаболизм и механизм действия // Вестн. интенсивн. терапии. - 2003. - № 2. - С. 81-86.

52. Кащенко В. А. Новый взгляд на антогенез и эффект деартериализации печени в хирургии портальной гипертензии и онкопатологии // Вестн. хирургии. -2003,-№2.-С. 114-116.

53. Лейдерман H. H. Иммунное питание (immunonutrition) // Вестн. интенсивной терапии. - 2002. - № 1. - С. 57-61.

54. Ванин А. Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований // Биохимия. - 1998. -№ 7. - С. 867-869.

55. Белоус А. М., Малахов В. А. Клеточные механизмы сосудистой патологии (обзор литературы) // Журн. АМН Украши. - 1998. - № 25. - С. 581-596.

56. Кургалюк H. М., Ткаченко Г. М., 1ккерт О. В. Функцюнування м1тохондрш за умов юшзуючого опромшювання: ефект штервально'1 rinoKciï та L-арпшну // Мед. х1м1я. -2003. -№ 1.-С. 18-21.

57. Ванин А. Ф. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы — две возможные формы стабилизации и транспорта оксида азота в биосистемах // Биохимия. - 1998. - № 7. - С. 924-930.

58. Ивашкин В. Т., Драпкина О. М. Оксид азота в регуляции функциональной активности физиологических систем // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - 2000. - № 4. - С. 16-21.

59. Батечко С. А. , Ледзевиров А.М. КОЛЛАГЕН. Новая стратегия сохранения здоровья и продления молодости, - С.5

60. Кадурина Т.И. Патогенетическое обоснование и опыт применении биологически активных добавок компании ВИТАМАКС в реабилитации больных детей с дисплазией соединительной ткани.

61. Alia And, Saradhi P.P. Suppression in mitochondrial electron transport is the prime cause behind stress induced proline accumulation Biochem.Biophys.Res.Comm-1993.-№193(1) 54-58.

62. Аксенова M. E. Тяжелые металлы: механизмы нефротоксичности // НИИ Педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, Москва // Нефрология и диализ. 2000. -Т.2, № 1-2.

63. Феофилова Е.П. Пигменты микроорганизмов / Е.П.Феофилова. - М.: Наука - 1974.-242 с

64. Рыльский А.Ф. Действие тяжелых металлов на пигментсинтезирующие Неотрицательные бактерии// В1СНИК ДОНЕЦЬКОГО НАЩОНАЛЬНОГО УШВЕРСИТЕТУ, Сер. А: Природнич1 науки, 2009, вин.

65. Россоти Ф., Россоти X. Определение констант устойчивости и других констант равновесия в растворе. - М.: Мир, 1965. - 364 с.

66. Бек М., Надьпал И. Исследование комплексообразования новейшими методами: Пер. с англ. - М.: Мир, 1989. - 413 с.

67. Евсеев А. М., Николаева JI. С. Математическое моделирование химических равновесий. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1988. - 192 с.

68. Уэндландт У. Термические методы анализа /У.Уэндландт - М.: Мир, 1978.

69. Павлова С.А., Журавлева И.В., Толчинский Ю.И. Термический анализ органических и высокомолекулярных соединений - М.: «Химия», 1983.

70. Арзамасцев А.П. Современное состояние проблемы применения ИК-спектроскопии в фармацевтическом анализе лекарственных средств/ А.П. Арзамасцев, Н.П. Садчикова, A.B. Титова // Хим.-фарм.ж. - 2008.- т. 42.- №.8.-С.47-51.

71. Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органических соединений. Практическое руководство. - М.: Мир, 1965. - 216 с.

72. Шрайнер Р., Фьюзон Р., Кёртин Д., Моррил Т. Идентификация органических соединений.-М.: Мир, 1983.

73. Казицына Л.А., Куплетская Н.Б. Применение УФ-.ИК-ДМР- и Масс-спектроскопии в органической химии. 2-е издание,переработанное и дополненное. Издательство Московского университета, 1979.

74. Сильверстейн Р., Басслер Г., Моррил Т. Спектрометрическая идентификация органических соединений. - М.: Мир, 1977.