Фитаспаза: апоптотическая протеаза растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, доктор химических наук Чичкова, Нина Валентиновна

• Чичкова, Нина Валентиновна
• доктор химических наук
• 2011

Оглавление диссертации доктор химических наук Чичкова, Нина Валентиновна

Содержание.

Список условных обозначений.

I. Введение.

II. Программированная клеточная смерть и каспазо-подобные протеазы растений (Обзор литературы).

1. Апоптоз в клетках животных: программированная клеточная смерть с участием каспаз.

Структура и специфичность каспаз.

Мишени и классификация каспаз.

Механизмы активации каспаз.

Роль и способы регуляции активности каспаз.

2. Программированная клеточная смерть растений и поиск каспазо-подобных протеаз.

Использование пептидных субстратов и ингибиторов каспаз для выявления каспазо-подобных протеаз растений.

Метакаспазы.

Вакуолярная протеаза УРЕ.

РВА1 - субъединица протеасомы растений.

Саспаза.

3. Субтилизин-подобные протеиназы растений.

Структура субтилизин-подобных протеаз растений.

Субтилазы растений принадлежат к подсемейству 88А.

Специфичность и функции субтилизин-подобных протеаз растений.

П1. Фитаспаза: апоптотическая протеаза растений

Результаты и их обсуяедение).

1. Белок животных протимозин альфа как источник концепции.

1.1. Протимозин альфа - белок с ядерной локализацией и внутриядерной функцией.

1.2. Как можно утратить NLS.

2. Компьютерный поиск ядерных белков, утрачивающих NLS при гидролизе каспазами.

3. Фитаспаза: апоптотическая протеаза растений.

3.1. Обнаружение активности фитаспазы in vivo.

3.2. Фитаспаза: ингибиторы и субстраты.

3.3. Фитаспаза - функциональный аналог каспаз животных.

3.4. Механическое повреждение растительной ткани приводит к появлению активности фитаспазы.

4. Фитаспаза: структурно-функциональное исследование.ЮО

4.1. Выделение и идентификация фитаспаз табака и риса.

4.2. Процессинг белка-предшественника фитаспазы.

4.3. Фитаспаза локализована в апопласте здоровых листьев растении.

4.4. Фитаспаза участвует в осуществлении программированной клеточной смерти растении.

4.5. При индукции ПКС фитаспаза ре-локализуется внутрь 195 умирающеи растительной клетки.

4.6. Биологический смысл расщепления агробактериального белка VirD2 фитаспазой.

4.7. Модель активного центра фитаспазы.

5. Сравнение фитаспаз растений с каспазами животных: общие черты и различия.^ i л о

6. Заключительные замечания.1JO

IV. Материалы и методы

1. Живые организмы.

2. Векторы и плазмиды.

3. Реактивы.

4. Приборы и оборудование.

5. Работы, выполненные на заказ или в сотрудничестве.

6. Среды и буферные растворы. I

7. Работа с клетками Е. coli.

8. Манипуляции с ДНК.

9. Методы исследования фитаспазы

Конструирование плазмид с геном VirD2 для продукции белка в клетках Е. coli.

Плазмиды для продукции производных VirD2 в растениях.

Оценка эффективности переноса репортерного гена в растения.

Выделение рекомбинантных белков из клеток Е. coli.

Инокуляция листьев табака ВТМ.

Выделение фитаспазы из листьев табака.

Выделение фитаспазы из листьев риса

Обработки производных VirD2 фитаспазой и каспазой in vitro.

Масс-спектрометрический анализ белков.

Измерение активности фитаспазы с помощью флуорогенных субстратов.

Клонирование и мутагенез кДНК фитаспазы табака.

Конструирование плазмид с кДНК фитаспазы табака.

Получение агробактерий с целевой плазмидой и инфильтрация ими листьев N. benthamiana.

Выделение и анализ рекомбинантной фитапсазы из инфильтрированных листьев.

Индукция и анализ ПКС в листьях табака и бентамианы.

Исследование тканей растений с использованием микроскопии.

10. Работа с протимозином альфа и клетками животных.

Выращивание клеток.

Индукция апоптоза.

Получение фиксированных пермеабилизованных и непермеабилизованных клеток, иммунолокализация.

Исследование внутриклеточной локализации GFP-ПроТа и

EGFP-Keap

Выделение ПроТа человека.

Получение радиоактивно меченого 32Р ПроТа.

Гидролиз ПроТа каспазами in vitro.

Электрофорез ПроТа в денатурирующем полиакриламидном геле.

Получение рекомбинантных белков (His)ö-Nrf2 и zz-Keapl

Конкуренция ПроТа и Nrf2 за связывание с Keapl

11. Методы биоинформатики.

V. Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фитаспаза: апоптотическая протеаза растений»

Программированная клеточная смерть (ПКС) является фундаментальным биологическим процессом, позволяющим многоклеточным организмам удалять избыточные и поврежденные клетки. ПКС функционирует в процессе развития организма, участвует в ответе на стрессовые воздействия, вызывающие необратимые повреждения клеток, и играет защитную роль при инфекции патогенами. Наиболее изученной формой ПКС у животных является апоптоз, характеризующийся определенным набором морфологических и биохимических признаков, таких как сжатие клетки, конденсация хроматина, фрагментация ДНК, выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль и т.д. Ключевую роль в программированном самоубийстве клеток животных играют каспазы - семейство высокоспецифичных цистеиновых протеаз, активирующихся при апоптозе и вносящих единичные разрывы в молекулы ограниченного набора клеточных белков. Каспазы обладают исключительной специфичностью гидролиза, внося разрыв после остатка аспарагиновой кислоты (Б), находящегося в определенном аминокислотном контексте. Направленная фрагментация белков-мишеней каспазами приводит в конечном счете к упорядоченной гибели клетки. И напротив, ингибирование каспаз препятствует осуществлению апоптоза.

В полном соответствии с названием «апоптоз» (от греч. «опадание листьев»), ПКС функционирует и в организмах растений и используется для тех же целей, что и у животных. Следует отметить, что молекулярные механизмы ПКС растений изучены существенно хуже, чем в случае апоптоза животных клеток. Однако наличие ряда сходных черт в ПКС животных и растений позволяет предполагать, что при осуществлении ПКС организмы двух царств используют сходные принципы. В этой связи существенно и удивительно, что у растений, судя по результатам секвенирования растительных геномов, отсутствуют каспазы - основные исполнители ПКС животных. В то же время, имеются многочисленные данные о том, что ингибиторы каспаз животных способны подавлять развитие ПКС растений. В соответствии с этим, при ПКС растений часто наблюдается активация неидентифицированных «каспазо-подобных» протеаз, способных гидролизовать разнообразные пептидные субстраты каспаз. Эти результаты позволяют думать, что в осуществлении ПКС у растений задействованы протеазы, являющиеся функциональными аналогами каспаз животных, но структурно сильно отличающиеся от каспаз.

Какая протеаза играет роль каспаз животных при осуществлении ПКС у растений? Такой фермент был найден и охарактеризован в ходе выполнения данной диссертационной работы и получил название «фитаспаза» {растительная асиартат-специфичная протеаза).

II. Программированная клеточная смерть и каспазо-подобные протеазы растений (Обзор литературы)

Life is pleasant. Death is peaceful. It's the transition that's troublesome". Isaac Asimov

Существование многоклеточных организмов требует удаления избыточных и поврежденных клеток, которые образуются как в ходе нормального развития, так и в процессе взаимодействия организма с внешней средой. Клеточный процесс, направленный на последовательное уничтожение (самоубийство) нежелательных клеток, известен как программированная клеточная смерть (ПКС). Наиболее изученной формой ПКС у животных является апоптоз, который происходит с участием семейства высокоспецифичных протеолитических ферментов, называемых каспазами (caspases, cysteine-dependent aspartate-specific proteases). Каспазы вносят одиночные разрывы в молекулы ограниченного набора клеточных белков, что в конечном счете приводит к упорядоченной гибели клетки. Каспазы обладают редкой субстратной специфичностью, гидролизуя белки-мишени после остатка Asp (D), расположенного в определенном аминокислотном контексте. Для того, чтобы избежать преждевременного срабатывания механизма клеточной гибели, каспазы синтезируются и хранятся в цитоплазме клетки в виде неактивных предшественников - прокаспаз. Активация прокаспаз, заключающаяся в их процесс инге с образованием протеолитически активных ферментов, происходит при получении клеткой определенных про-апоптотических сигналов.

В растительных организмах ПКС также играет важную роль, и морфологические признаки ПКС растительных и животных клеток имеют целый ряд общих черт. Поэтому было полной неожиданностью обнаружить (путем секвенирования геномов растений), что растения не содержат генов каспаз (и, соответственно, самих этих протеолитических ферментов). Возникла дилемма: либо принцип специфической фрагментации белковмишеней после остатка D не работает при ИКС растений, или же роль каспаз в ПКС растений играют другие, структурно отличные от каспаз протеазы. Экспериментальные данные, полученные в течение последнего десятилетия, показывают, что правильным является второй сценарий. Это, в свою очередь, остро ставит вопрос: какие именно протеазы растений обладают специфичностью каспаз и ролью каспаз в осуществлении ПКС у растений.

В настоящем обзоре будут рассмотрены механизмы апоптоза в клетках животных, функционирующие с участием каспаз, и будут описаны основные участники процесса ПКС. Затем мы рассмотрим сходства и различия в проявлениях ПКС у животных и растений и приведем современные представления о протеазах растений, которые могли бы выполнять роль каспаз при ПКС в растительных организмах. Наконец, поскольку открытая в данной диссертационной работе апоптотическая протеаза растений является субтилизин-подобной протеазой (субтилазой), в заключительной части обзора собрана и проанализирована современная информация о субтилизин-подобных протеазах растений.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Чичкова, Нина Валентиновна

выводы

1. В структуре ядерного белка протнмознна альфа человека выявлен сигнал ядерной локализации, направляющий активный транспорт белка в ядро. Ядерная локализация важна для функционирования протимозина альфа, одной из функций которого является внутриядерная диссоциация комплекса транскрипционного фактора Nrf2 с белком-репрессором Кеар 1.

2. При апоптозе происходит инактивация протимозина альфа путем отщепления сигнала ядерной локализации апоптотической протеазой - каспазой. В результате фрагментации каспазой протимозин утрачивает способность накапливаться в ядре, распределяется по цитоплазме и выходит на поверхность умирающей клетки человека.

3. Поиск ядерных белков-субстратов каспаз, основанный на модели фрагментации протимозина альфа, выявил белок VirD2 патогена растений агробактерии Agrobaclerium lumefaciens как потенциальную мишень каспазо-подобных протеаз. Обнаружено, что белок VirD2 гидролизуется каспазой человека in vitro и определены места гидролиза.

4. При индукции программированной клеточной смерти в растениях табака Nicotiana tabacum, вызванной инфекцией вирусом табачной мозаики, обнаружена активация растительной протеазы, гидролизующей белок VirD2 после аминокислотного остатка D в том же месте, что и каспаза-3 человека. Эта протеаза получена в индивидуальном виде и названа фитаспазой. Активность фитаспазы регистрируется также при механическом разрушении растительной ткани. Фитаспаза имеется у самых разных растений, включая двудольные и однодольные.

5. Определена субстратная специфичность фитаспазы. Фермент гидролизует субстраты строго после остатка D, находящегося в определенном аминокислотном контексте. Предложена модель активного центра фитаспазы, объясняющая специфичность действия фермента.

6. Установлено участие фитаспазы в осуществлении программированной клеточной смерти растений, вызванной биотическими и абиотическими стрессами. Повышение уровня активности фитаспазы при суперпродукции фермента стимулирует протекание клеточной смерти, а снижение активности фитаспазы при помощи специфического ингибитора или путем РНК-интерференции подавляет программированную клеточную смерть у растений.

7. Фитаспазы табака и риса идентифицированы как близкородственные субтилизин-подобные сериновые протеазы растений. Показано, что фитаспаза синтезируется в виде неактивного белка-предшественника. В структуре профитаспазы идентифицированы Ы-концевой сигнальный пептид, продомен и протеазный домен.

8. Активная фитаспаза образуется путем автокаталитического процессинга белка-предшественника в соответствии с аспартатной специфичностью фитаспазы. Отщепление продомена необходимо для образования протеолитически активного фермента и для его секреции в межклеточную жидкость (апопласт).

9. В здоровых тканях растений фитаспаза накапливается в апопласте. За ее секрецию отвечает Ы-концевой сигнальный пептид в составе профермента. Фитаспаза присутствует в апопласте в протеолитически активном состоянии.

10. При индукции программированной клеточной смерти фитаспаза перемещается из апопласта внутрь умирающей растительной клетки.

11. Гидролиз фитаспазой белка УкБ2 агробактерий представляет собой защитный механизм растительной клетки, ограничивающий доставку в ядро и экспрессию чужеродной ДНК.

12. Сравнительный анализ апоптотических протеаз животных и растений - каспаз и фитаспаз - выявил как общие черты, так и существенные различия в свойствах и поведении этих ферментов и способах контроля клеткой их протеолитической активности.