Структура и свойства фитаспазы Nicotiana tabacum тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Тужиков, Александр Иванович

• Тужиков, Александр Иванович
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Тужиков, Александр Иванович

СОДЕРЖАНИЕ.

Список условных обозначений.

Введение.

1. Каспазоподобная протеолитическая активность и ее участие в программированной смерти растительных клеток. обзор литературы).

1.1 Программированная клеточная смерть.

1.2 Каспазы.

1.3 Белковые ингибиторы каспаз животных.

1.4 Специфические пептидные ингибиторы каспаз животных.

1.5 Флуорогенные субстраты каспаз живо гных.

1.6 VPE (Vacuolar processing enzyme).

1.7 Каспазоподобная активность протеасомы.

1.8 Метакаспазы.

1.9 Саспазы.

1.10 Каспазоподобная активность в клетках листьев табака. Фитаспаза.

1.11 Субтилизин-подобные протеазы.

1.12 Синтез и активация субтилизин-подобных протеаз.

1.13 Активный центр субтилизин-подобных протеаз.

1.14 Субстрат-связывающие центры субтилизин-подобных протеаз.

2. Структура и свойства фитаспазы

Nicotiana tabacum (Результаты и обсуждение).

2.1 Биоинформатическая характеристика фитаспазы.

2.2 Рекомбинантная фитаспаза протеолитически активна, и ее активность зависит от Ser537 в активном центре.

2.3 Продомен фитаспазы подвергается автокаталитическому отщеплению (процессингу).

2.4 Автокаталитический процессинг фитаспазы происходит аспартат-специфично.

2.5 Процессинг фитаспазы необходим для протеолитической активности.

2.6 Автокаталитический процессинг'продомена необходим для секреции фитаспазы.

2.7 Сигнальный (лидерный) пептид направляет фитаспазу па путь секреции.

2.8 При индукции ПКС фитаспаза перемещается из апопласта внутрь клетки.

2.9 Использование мономерного белка-таймера для наблюдения за перемещением фитаспазы во время ПКС.

2.10 Фитаспаза находится в апопласте в активном состоянии.

2.11 Биоинформатический подход к изучению специфичности фитаспазы.

2.12 Модель функционирования фитаспазы в растительной клетке.

3 Материалы и методы.

3.1 Используемые реактивы и приборы.

3.2 Штаммы прокариот.

3.3 Линии растений.

3.4 Векторы и плазмиды.

3.5 Антитела.

3.6 Буферные среды и растворы.

3.7 Реактивы для выделении плазмид.

3.8 Среды.

3.9 Растворы для работы с агробактериями.

3.10 Работа с клетками Е. coli.

3.10.1 Приготовление компетентных клеток Е. coli.

3.10.2 Трансформация клеток E.coli.

3.11 Работа с ДНК.

3.11.1 Выделение плазмид.

3.11.2 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

3.11.3 Обработка концов фрагментов ДНК полимеразой фага Т4.

3.11.4 Обработка концов фрагментов ДНК фрагментом Кленова.

3.11.5 Лигирование ДНК.

3.11.6 Амплификация фрагментов ДНК (полимеразная цепная реакция, ПЦР).

3.11.7 Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.11.8 Элюцпя фрагментов ДНК из агарозного геля.

3.11.9 Использованные олигонуклеотиды (праймеры).

3.11.10 Направленный мутагенез.

3.11.11 Схемы клонирования.

3.11.11.1 Плазмида pUC19-(6-639)NtPhytClonelO.

3.11.11.2 Плазмида pSLl 180-(KpnI)+(6-639)NtPhytClonel0-(639-831) NtPhytClone6.

3.11.11.3 Плазмида pUC19NtPhyt.

3.11.11.4 Плазмида pBluescript HSK(+)NtPhy tGST.

3.11.11.5 Плазмида pRTL2NtPhytGST.

3.11.11.6 Плазмида pLH7000deltaNtPhyt-GST(WT).

3.11.11.7 Плазмида pBluescript IISK(+)EGFP.

3.11.11.8 Плазмида pLH7000deltaNtPhyt-EGFP(WT).

3. II. 11.9 Плазмида pLH7000deltaNtPhyt-EGFP-[His]6(WT).

3.11.11.10 Плазмида pSLl 180NtPhyt(AS).

3.11.11.11 Плазмида pLH7000deltaNtPhyt-GST(S537A).

3.11.11.12 Плазмида pLH7000deltaNtPhyt-EGFP(S537A).

3.11.11.13 Плазмида pLH7000deltaNtPliyt-GST(C540A).

3.11.11.14 Плазмида pUC 19(LF)NtPhyt.

3.11.11.15 Плазмида pLH7000deltaNtPhyt-EGFP-[His]6(LF).

3.11.11.16 Плазмида pSL 1180D 117TTHT.

3.11.11.17 Плазмида pLH7000deltaNtPhyt-EGFP-[His]6 (D117E).

3.11.11.18 Плазмида pLH7000deltaNtPhyt- EGFP-[His]6 (DU7A).

3.11.11.19 ПлазмидаpLH7000deltaNtPhyt- EGFP-[His]6(M4).

3.11.11.20 Плазмида pSL 1180FT.

3.11.11.21 Плазмида pSLl 180FTGST.

3.11.11.22 Плазмида pLH7000deltaNtPhyt-FT-GST.

3.12 Продукция и выделение рекомбинантных белков.

3.12.1 Трансформация агробактерий плазмидными конструкциями.

3.12.2 Культивация агробактерий, предшествующая инфильтрации.

3.12.3 Подготовка агробактерий к инфильтрации.

3.12.4 Инфильтрация листьев растений Nicotiana benthamiana агробактериями.

3.12.5 Коинфильтрация листьев растений Nicotiana benthamiana агробактериями для изучения локализации фитаспазы.

3.12.6 Выделение рекомбинантных белков.

3.12.7 Выделение рекомбинантных белков с тэгом GST.

3.12.8 Выделение рекомбинантных белков с тэгом EGFP-[His]6.

3.12.9 Электрофоретическое фракционирование белков с помощью системы Лэммли.

3.12.10 Проведение иммуно-блота со специфическими антителами.

3.12.11 Детекция биотинилированных белков с помощью авидин-пероксидазы.

3.13 Анализ активности фитаспазы.

3.13.1 Оценка активности фитаспазы (и ее мутантных форм) с использованием рекомбинантного белка

ОРР-Уіг020 в качестве субстрата.

3.13.2 Оценка активности фитаспазы (и ее мутантных форм) с использованием синтетических субстратов.

3.13.3 Детекция фитаепазьі-ЕСРР-[Нік]б в тканях растений Мсоїіапа Ьеткатіапа с помощью специфического биотинилированного ингибитора Ьіо-УУАО-СМК.

3.14 Исследования с использованием методов микроскопии.

3.14.1 Подготовка образцов из тканей листьев.

3.14.2 Индукция программированной клеточной смерти.

3.14.3 Конфокальная флуоресцентная микроскопия.

3.14.4 Флуоресцентная микроскопия фитаспазы с тэгом мономерным белком-таймером.

3.15 Методы биоинформатики.

3.15.1 Поиск гомологов фитаспазы.

3.15.2 Анализ доменной структуры фитаспазы.

3.15.3 Сравнение аминокислотных последовательностей.

3.15.4 Создание пространственной структуры фитаспазы.

3.15.5 Симуляция молекулярного докинга.

3.15.6 Визуализация пространственных структур.

4 Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура и свойства фитаспазы Nicotiana tabacum»

Программированная клеточная смерть (ПКС) является чрезвычайно важным процессом для нормального развития и жизнедеятельности многоклеточных организмов. Этот процесс позволяет организму избавляться от избыточных или поврежденных клеток. Самоуничтожение клетки в случае инфекционного заражения предотвращает распространение инфекции по организму. Одной из наиболее изученных форм ПКС у животных является апоптоз. Известно, что основными исполнителями апоптоза являются каспазы - белки семейства цистеиновых протеаз. Каспазы активируются в процессе ПКС и осуществляют гидролиз ограниченного числа белков-мишеней после остатка аспарагиновой кислоты в специфическом сайте узнавания. Число известных белков, расщепляемых каспазами, сравнительно невелико, однако многие из них важны для поддержания жизнедеятельности клетки.

ПКС протекает и в тканях растительных организмов. Морфологические проявления программированной смерти клеток животных и растений имеют некоторые общие черты, что может указывать на биохимическое сходство процессов, протекающих в апоптотических клетках животных и растений, и на возможное участие каспазоподобных протеаз в программированной смерти растительных клеток. Компьютерный поиск генов каспаз, структурно схожих с каспазами животных в прочитанных геномах растений, не дал результатов. Однако известно, что в погибающих при ПКС клетках растений регистрируется специфическая каспазоподобная активность. Свидетельства участия каспазоподобных ферментов в ПКС у растений в основном основываются на ингибирующих эффектах, наблюдаемых в присутствии специфических белковых и синтетических ингибиторов каспаз животных. Вероятно, апоптотические растительные протеазы структурно не являются каспазами, но имеют сходную субстратную специфичность.

В Лаборатории Молекулярной Биологии Гена НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского было обнаружено, что клеточный экстракт листьев Л7со/юпд ¡аЬасшп содержит каспазоподобную активность, способную вносить одиночный разрыв в белок \<Чг02 патогена растений агробактерии А£гоЪас1егиип ште/аЫет. Методами масс-спектрометрии удалось определить, что специфический гидролиз происходил в после остатка аспарагиновой кислоты [1]. Вскоре из экстракта листьев Ы'гсоНана юЪасит был выделен и сам фермент, который обладал рядом свойств, характерных для каспаз животных: он активировался в процессе ПКС; гидролизовал белки-субстраты после остатка аспарагиновой кислоты в специфическом сайте узнавания; замена аспартата в специфическом сайте предотвращала гидролиз; протеолитическая активность каспазоподобного фермента подавлялась ингибитором, созданным на основе сайта узнавания; ингибирование фермента приводило к подавлению развития ГТКС. По аналогии с каспазами найденный фермент получил название «фитаспазы» (phytaspase, phyto - растительный (лат.), asp - специфичный в отношении остатка аспарагиновой кислоты, ase - фермент). Была получена кДНК, предположительно кодирующая фитаспазу табака.

Задачей настоящей работы было доказать, что найденная кДНК действительно соответствует фитаспазе, получить рекомбинантный фермент и исследовать его свойства. В ходе данной работы в растениях Nicotiana benthamiana был продуцирован рекомбинантный фермент, обладающий свойствами нативной фитаспазы, установлена полная аминокислотная последовательность фермента и определены границы его структурных элементов. Установлено, что фитаспаза является аспартат-специфичной субтилизин-подобной протеазой, которая синтезируется в виде белка-предшественника, автокаталитически процессируется и секретируется во внеклеточную жидкость (апопласт). В ответ на индукцию ПКС происходит перемещение фитаспазы из апопласта внутрь умирающей клетки.

1 Каспазоиодобная протеолитическая активность и ее участие в программированной смерти растительных клеток обзор литературы)

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Тужиков, Александр Иванович

4 Выводы

1. Доказано, что кДНК табака N. /аЬасит, найденная с помощью масе-спектрометрической характеристики фитаспазы табака, кодирует фермент со свойствами и специфичностью фитаспазы табака.

2. Фитаспаза является субтилизин-подобной протеазой растений, обладает характерными особенностями структуры, присущими этому семейству ферментов.

3. Фитаспаза синтезируется в виде белка-предшественника, содержащего продомен. Отщепление продомена при процессинге происходит автокаталитически и в соответствии с аспартатной специфичностью фитаспазы.

4. Отщепление продомена фитаспазы необходимо как для образования протеолитически активного фермента, так и для секреции фитаспазы во внеклеточную среду (апопласт).

5. Фитаспаза локализована в апопласге в здоровых тканях листьев N. шЬасит. Секрецию - в апопласт направляет 1Ч-концевой сигнальный пептид белка-предшественника фитаспазы. Фитаспаза находится в апопласте в активном состоянии.

6. При индукции программированной клеточной смерти, вызванной биотическими и абиотическими стрессами, происходит перемещение фитаспазы внутрь умирающей клетки.

7. Предложена модель активного центра фитаспазы, объясняющая строгую аспартатную специфичность этого фермента.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Тужиков, Александр Иванович, 2011 год

1. Chichkova N. V., Kim S. H., Titova E. S., Kalkum M., Morozov V. S., Rubtsov Y. P., Kalinina N. O., Taliansky M. E., Vartapctian A. B. A plant caspase-like protease activated during the hypersensitive response. // Plant Cell. 2004 - V. 16 — P. 157-171.

2. Heiskanen К. M., Bhat M. В., Wang H. W., Ma J., Nieminen A. L. Mitochondrial depolarization accompanies cytochrome с release during apoptosis in PC6 cells. // J Biol Cliem. 1999 - V. 274 - P. 5654-5658.

3. Nagata S. Apoptotic DNA fragmentation. // Exp Cell Res. 2000 - V. 256 - P. 12-18.

4. Bossy-Wetzel E., Newmeyer D. D., Green D. R. Mitochondrial cytochrome с release in apoptosis occurs upstream of DEVD-specific caspase activation and independently of mitochondrial transmembrane depolarization. // EMBO J. 1998 - V. 17 - P. 37-49.

5. Yang M. Y., Chuang H., Chen R. F., Yang K. D. Reversible phosphatidylserine expression on blood granulocytes related to membrane perturbation but not DNA strand breaks. // J Leukoc Biol. 2002 - V. 71 - P. 231-237.

6. Levine В., Klionsky D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. // Dev Cell. 2004 - V. 6 - P. 463-477.

7. Yoshimori T. Autophagy: a tegulated bulk degradation process inside cells. // Biochem Biophys Res Commun. 2004 - V. 313 - P. 453-458.

8. Denecker G., Vercammen D., Declercq W., Vandenabeele P. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors. // Cell Mol Life Sci. 2001 - V. 58 - P. 356-370.

9. Bicknell G. R., Cohen G. M. Cleavage of DNA to Large Kilobase Pair Fragments Occurs in Some Forms of Necrosis as Well as Apoptosis. // Biochem Biophys Res Commun. 1995 -V. 207 - P. 40-47.

10. Chautan M., Chazal G., Cecconi F., Gruss P., Golstein P. Interdigital cell death can occur through a necrotic and caspase-independent pathway. // Curr Biol. 1999 - V. 9 - P. 967970.

11. Boiler T., Kende H. Hydro lytic enzymes in the central vacuole of plant cells. // Plant Physiol.- 1979-V. 63-P. 1123-1132.

12. Muntz K. Protein dynamics and proteolysis in plant vacuoles. // J Exp Bot. 2007 — V. 58 — P.2391-2407.

13. Drew M. C., He C. J., Morgan P. W. Programmed cell death and aerenchyma formation in roots. // Trends Plant Sci. 2000 - V. 5 - P. 123-127.

14. Gunawardena A. H. Programmed cell death and tissue remodelling in plants. // J Exp Bot. -2008-V. 59-P. 445-451.

15. Rubinstein B. Regulation of cell death in flower petals. // Plant Molccular Biology. 2000 -V. 44-P. 303-318.

16. Fukuda H. Xylogenesis: Initiation, Progression, and Cell Death. // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1996 - V. 47 - P. 299-325.

17. Greenberg J. T. Programmed cell death: a way of life for plants. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1996 V. 93 - P. 12094-12097.

18. Hofius D., Munch D., Bressendorff S., Mundy J., Petersen M. Role of autophagy in disease resistance and hypersensitive response-associated cell death. // Cell Death Differ. — 2011 -V. 18-P. 1257-1262.

19. Reape T. J., Molony E. M., McCabe P. F. Programmed cell death in plants: distinguishing between different modes. // J Exp Bot. 2008 - V. 59 - P. 435-444.

20. Mur L. A., Kenton P., Lloyd A. J., Ougham H., Prats E. The hypersensitive response; the centenary is upon us but how much do we know? // J Exp Bot. 2008 - V. 59 - P. 501-520.

21. Hatsugai N., Kuroyanagi M., Yamada K., Meshi T., Tsuda S., Kondo M., Nishimura M.5 Hara-Nishimura I. A plant vacuolar protease, VPE, mediates virus-induced hypersensitive cell death. // Science. 2004 - V. 305 - P. 855-858.

22. Heath M. C. Hypersensitive response-related death. // Plant Mol Biol. 2000 - V. 44 - P. 321-334.

23. Jones J. D., Dangl J. L. The plant immune system. // Nature. 2006 - V. 444 - P. 323-329.

24. Thomma B. P., Nürnberger T., Joosten M. H. Of PAMPs and effectors: the blurred PT1-ET1 dichotomy. // Plant Cell. 2011 - V. 23 - P. 4-15.

25. Vance R. E., Isberg R. R., Portnoy D. A. Patterns of pathogenesis: discrimination of pathogenic and nonpathogenic microbes by the innate immune system. // Cell Host Microbe. -2009-V. 6-P. 10-21.

26. Hammond-Kosack K. E., Jones J. D. Resistance gene-dependent plant defense responses. // Plant Cell.- 1996 V. 8 — P. 1773-1791.

27. Robatzek S., Chinchilla D., Boller T. Ligand-induced endocytosis of the pattern recognition receptor FLS2 in Arabidopsis. // Genes Dev. 2006 - V. 20 - P. 537-542.

28. Zipfel C., Felix G. Plants and animals: a different taste for microbes? // Curr Opin Plant Biol. -2005-V. 8-P. 353-360.

29. Grant S. R., Fisher E. J., Chang J. H., Mole B. M., Dangl J. L. Subterfuge and manipulation: type III effector proteins of phytopathogenic bacteria. // Annu Rev Microbiol. 2006 - V. 60 - P. 425-449.

30. Coll N. S., Epple P., Dangl J. L. Programmed cell death in the plant immune system. // Cell Death Differ.-2011 -V. 18-P. 1247-1256.

31. Durrant W. E., Dong X. Systemic acquired resistance. // Annu Rev Phytopathol. 2004 - V. 42 - P. 185-209.

32. Zhao Y., Thilmony R., Bender C. L., Schaller A., He S. Y., Howe G. A. Virulence systems of Pseudomonas syringae pv. tomato promote bacterial speck disease in tomato by targeting the jasmonate signaling pathway. // Plant J. 2003 - V. 36 - P. 485-499.

33. O'Brien I. E., Reutelingsperger C. P., Holdaway K. M. Annexin-V and TUNEL use in monitoring the progression of apoptosis in plants. // Cytometry. 1997 - V. 29 - P. 28-33.

34. Danon A., Delorme V., Mailhac N., Gallois P. Plant programmed cell death: A common way to die. // Plant Physiol and Biochem. 2000 - V. 38 - P. 647-655.

35. Balk J., Leaver C. J. The PET1-CMS mitochondrial mutation in sunflower is associated with premature programmed cell death and cytochrome c release. // Plant Cell. 2001 - V. 13 -P. 1803-1818.

36. Lam E. Kato N., Lawton M. Programmed cell death, mitochondria and the plant hypersensitive response. // Nature. 2001 - V. 411 - P. 848-853.

37. Hoeberichts F. A., Woltering E. J. Multiple mediators of plant programmed cell death: interplay of conserved cell death mechanisms and plant-specific regulators. // Bioessays. -2003-V. 25-P. 47-57.

38. Ryerson D. E., Heath M. C. Cleavage of Nuclear DNA into Oligonucleosomal Fragments during Cell Death Induced by Fungal Infection or by Abiotic Treatments. // Plant Cell. -1996-V. 8-P. 393-402.

39. Solomon M., Belenghi B., Deiledonne M., Menachem E., Levine A. The involvement of cysteine proteases and protease inhibitor genes in the regulation of programmed cell death in plants. // Plant Cell. 1999 - V. 11 - P. 431 -444.

40. Bonneau L., Ge Y., Drury G. E., Gallois P. What happened to plant caspases? // J Exp Bot. -2008-V. 59-P. 491-499.

41. Watanabe N., Lam E. Two Arabidopsis metacaspases AtMCPlb and AtMCP2b are arginine/lysine-specific cysteine proteases and activate apoptosis-like cell death in yeast. //J Biol Chem. 2005 - V. 280 - P. 14691 -14699.

42. He R., Drury G. E., Rotari V. I., Gordon A., Wilier M., Farzaneh T., Woltering E. J., Gallois P. Metacaspase-8 modulates programmed cell death induced by ultraviolet light and H202 in Arabidopsis. // J Biol Chem. 2008 - V. 283 - P. 774-783.

43. Chang H. Y., Yang X. Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases. // Microbiol Mol Biol Rev. 2000 - V. 64 - P. 821 -846.

44. Troy C. M., Shclanski M. L. Caspase-2 redux. // Cell Death Differ. 2003 - V. 10 - P. 101107.

45. Pop C., Salvesen G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. // J Biol Chem. 2009 - V. 284 - P. 21 777-21781.

46. Nicholson D. W. Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death.//Ceil Death Differ. 1999 - V. 6- P. 1028-1042.

47. Walters J., Pop C., Scott F. L., Drag M., Swartz P., Mattos C., Salvesen G. S., Clark A. C. A constitutively active and uninhibitable caspase-3 zymogen efficiently induces apoptosis. // Biochem J. 2009 - V. 424 - P. 335-345.

48. Fuentes-Prior P., Salvesen G. S. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. // Biochem J. 2004 - V. 384 - P. 201-232.

49. Boatright K. M., Salvesen G. S. Mechanisms of caspase activation. // Curr Opin Cell Biol. -2003-V. 15-P. 725-731.

50. Pop C., Fitzgerald P., Green D. R., Salvesen G. S. Role of proteolysis in caspase-8 activation and stabilization. // Biochemistry. 2007 - V. 46 - P. 4398-4407.

51. LeBlanc H. N., Ashkenazi A. Apo2L/TRAlL and its death and decoy receptors. II Cell Death Differ. 2003 - V. 10 - P. 66-75.

52. Carrington P. E., Sandu C., Wei Y., Hill J. M., Morisawa G., Huang T., Gavathiotis E., Werner M. H. The structure of FADD and its mode of interaction with procaspase-8. // Mol Cell. 2006 - V. 22 - P. 599-610.

53. Riedl S. J., Salvesen G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. //Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 - V. 8 - P. 405-413.

54. Yuan S., Yu X., Topf M., Ludtke S. J., Wang X., Akey C. W. Structuie of an apoptosome-procaspase-9 CARD complex.//Structure. 2010 - V. 18-P. 571-583.

55. Thornberry N. A., Lazebnik Y. Caspases: enemies within. // Science. 1998 - V. 281 - P. 1312-1316.

56. Wolf B. B., Green D. R. Suicidal tendencies: apoptotic cell death by caspase family proteinases. // J Biol Chem. 1999 - V. 274 - P. 20049-20052.

57. Martinon F., Tschopp J. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. //Cell. 2004 - V. 117-P. 561-574.

58. Yazdi A. S., Guarda G., D'Ombrain M. C., Drexler S. K. Inflammatory caspases in innate immunity and inflammation. // J Innate Immuii. 2010- V. 2 - P. 228-237.

59. Weber G. F., Menko A. S. The canonical intrinsic mitochondrial death pathway has a non-apoptotic role in signaling lens cell differentiation. // J Biol Chem. 2005 - V. 280 - P. 22135-22145.

60. Mogi M., Togari A. Activation of caspases is required for osteoblastic differentiation. // J Biol Chem. 2003 - V. 278 - P. 47477-47482.

61. Ekert P. G., Si Ike J„ Vaux D. L. Caspase inhibitors. // Cell Death Differ. 1999 - V. 6 - P. 1081-1086.

62. Zheng T. S., Hunot S., Kuida K., Flavell R. A. Caspase knockouts: matters of life and death. // Cell Death Differ. 1999 - V. 6 - P. 1043-1053.

63. Deveraux Q. L., Takahashi R., Salvesen G. S., Reed J. C. X-linked 1AP is a direct inhibitor of cell-death proteases. // Nature. 1997 - V. 388 - P. 300-304.

64. Yang Y. L., Li X. M. The IAP family: endogenous caspase inhibitors with multiple biological activities.//Cell Res.-2000-V. 10-P. 169-177.

65. Xu G., Rich R. L., Steegborn C., Min T., Huang Y., Myszka D. G., Wu H. Mutational analyses of the p35-caspase interaction. A bowstring kinetic model of caspase inhibition by p35. // J Biol Chein. 2003 - V. 278 - P. 5455-5461.

66. Wei Y., Fan T., Yu M. Inhibitoi of apoptosis proteins and apoptosis. // Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). -2008 V. 40 - P. 278-288.

67. Xu G., Cirilli M., Huang Y., Rich R. L., Myszka D. G., Wu H. Covalent inhibition revealed by the crystal structure of the caspase-8/p35 complex. // Nature. 2001 - V. 410 - P. 494497.

68. Pike R. N., Bottomley S. P., Irving J. A., Bird P. L, Whisstock J. C. Serpins: finely balanced conformational traps. // IUBMB Life. 2002 - V. 54 - P. 1-7.

69. Hansen G. Evidence for Agrobacterium-induced apoptosis in maize ceils. // Mol Plant Microbe Interact. 2000 - V. 13 - P. 649-657.

70. Powers J. C., Asgian J. L., Ekici O. D., James K. E. Irreversible inhibitors of serine, cysteine, and threonine proteases. // Chem Rev. 2002 - V. 102 - P. 4639-4750.

71. Krzymowska M., Konopka-Postupolska D., Sobczak M., Macioszek V., Ellis B. E., Hennig J. Infection of tobacco with different Pseudomanas syringae pathovars leads to distinct morphotypes of programmed cell death. // Plant J. 2007 - V. 50 - P. 253-264.

72. Sun Y. L., Zhao Y., Hong X., Zhai Z. H. Cytochrome c release and caspase activation during menadione-induced apoptosis in plants. // FEBS Lett. 1999 - V. 462 - P. 317-321.

73. De Jong A. J., Hoeberichts F. A., Yakimova E. T., Maximova E., Woltering E. J. Chemical-induced apoptotic cell death in tomato cells: involvement of caspase-like proteases. // Planta. — 2000 — V. 211 P. 656-662.

74. Belenghi B., Salomon M., Levine A. Caspase-like activity in the seedlings of Pisuin sativum eliminates weaker shoots during early vegetative development by induction of cell death. // J Exp Bot. 2004 - V. 55 - P. 889-897.

75. Ge Z. Q., Yang S., Cheng J. S., Yuan Y. J. Signal role for activation of caspase-3-like protease and burst of superoxide anions during Ce4+-induced apoptosis of cultured Taxus cuspidate cells. // Biometals. 2005 - V. 18 - P. 221-232.

76. Samadi L., Shahsavan Behboodi B. Fusaric acid induces apoptosis in saffron root-tip cells: roles of caspase-like activity, cytochrome c, and H202. II Planta. 2006 - V. 225 - P. 223234.

77. Korthout H. A., Berecki G., Bruin W., van Duijn B., Wang M. The presence and subcellular localization of caspase 3-like proteinases in plant cells. // FEBS Lett. 2000 - V. 475 - P. 139-144.

78. Mlejnek P., Prochazka S. Activation of caspase-like proteases and induction of apoptosis by isopentenyladcnosine in tobacco BY-2 cells. // Planta. -2002 V. 215 - P. 158-166.

79. He X., Kermode A. R. Proteases associated with programmed cell death of megagametophyte cells after germination of white spruce (Picea glauca) seeds. // Plant Mol Biol. 2003 - V. 52 - P. 729-744.

80. Tian R., Zhang G. Y., Yan C. H., Dai Y. R. Involvement of poIy(ADP-ribose) polymeiase and activation of caspase-3-like protease in heat shock-induced apoptosis in tobacco suspension cells. // FEBS Lett. 2000 - V. 474 - P. 11-15.

81. Kuroyanagi M., Yamada K., Hatsugai N., Kondo M., Nishimura M., Hara-Nishimura I. Vacuolar processing enzyme is essential for mycotoxin-induced cell death in Arabidopsis thaliana. IIJ Biol Chem. -2005 V. 280 - P. 32914-32920.

82. Thomas S. G., Franklin-Tong V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. // Nature. 2004 - V. 429 - P. 305-309.

83. Bosch M., Franklin-Tong V. E. Temporal and spatial activation of caspase-like enzymes induced by self-incompatibility in Papaver pollen. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2007 V. 104-P. 18327-18332.

84. Kim M., Ahn J. W., Jin U. H„ Choi D., Paek K. H., Pai H. S. Activation of the programmed cell death pathway by inhibition of proteasome function in plants. // J Biol Chem. -2003 -V. 278-P. 19406-19415.

85. Coffeen W. C., Wolpert T. J. Purification and characterization of serine proteases that exhibit caspase-like activity and are associated with programmed cell death in Avena sativa. //Plant Cell. 2004 - V. 16-P. 857-873.

86. Hiraiwa N., Nishimura M., Hara-Nishimura I. Vacuolar processing enzyme is self-catalytically activated by sequential removal of the C-terminal and N-terminal propeptides. // FEBS Lett. 1999 - V. 447 - P. 213-216.

87. Hara-Nishimura I., Inoue K., Nishimura M. A unique vacuolar processing enzyme responsible for conversion of several proprotein precursors into the mature forms. // FEBS Lett. 1991 - V. 294 - P. 89-93.

88. Yamada K., Shimada T., Nishimura M., Hara-Nishimura I. A VPE family supporting various vacuolar functions in plants. // Physiol Plant. -2005 — V. 123 — P. 369-375.

89. Shirahama-Noda K., Yamamoto A., Sugihara K., Hashimoto N., Asano M., Nishimura M.,

90. Hara-Nishimura I. Biosynthetic processing of cathepsins and lysosomal degradation are117abolished in asparaginyl endopeptidase-deficient mice. // J Biol Chem. 2003 - V. 278 - P. 33194-33199.

91. Hatsugai N., Hara-Nishimura I. Two vacuole-mediated defense strategies in plants. // Plant Signal Behav. — 2010-V. 5 P. 1568-1570.

92. Iiara-Nishimura 1., Hatsugai N., Nakaune S., Kuroyanagi M., Nishimura M. Vacuolar processing enzyme: an executor of plant cell death. // Curr Opin Plant Biol. — 2005 — V. 8 -P. 404-408.

93. Kinoshita T., Nishimura M., Hara-Nishimura I. Hotnologues of a vacuolar processing enzyme that are expressed in different organs in Arabidopsis thaliana. II Plant Mol Biol. -1995-V. 29-P. 81-89.

94. Nakaune S., Yamada K., Kondo M., Kato T., Tabata S., Nishimura M., Hara-Nishimura I. A vacuolar processing enzyme, deltaVPE, is involved in seed coat formation at the early stage of seed development. // Plant Cell. 2005 - V. 17 - P. 876-887.

95. Kinoshita T., Nishimura M., Hara-Nishimura I. The sequence and expression of the garama-VPE gene, one member of a family of three genes for vacuolar processing enzymes in Arabidopsis thaliana. // Plant Cell Physiol. 1995 - V. 36 - P. 1555-1562.

96. Kuroyanagi M., Nishimura M., Hara-Nishimura 1. Activation of Arabidopsis vacuolar processing enzyme by self-catalytic removal of an auto-inhibitory domain of the C-terminal propeptide. // Plant Cell Physiol. 2002 - V. 43 - P. 143-151.

97. Sanmartin M., Jaroszewski L., RaikhelN. V., Rojo E. Caspases. Regulating death since the origin of life. // Plant Physiol. 2005 - V. 137 - P. 841-847.

98. Lam Y. A., Xu W., DeMartino G. N., Cohen R. E. Editing of ubiquitin conjugates by an isopeptidase in the 26S proteasome. //Nature. 1997 - V. 385 - P. 737-740.

99. Whitby F. G., Masters E. 1., Kramer L., Knowiton J. R., Yao Y„ Wang C. C., Hill C. P. Structural basis for the activation of 20S proteasomes by 11S regulators. // Nature. 2000 -V. 408-P. 115-120.

100. Aravind L., Koonin E. V. Classification of the caspase-hemoglobinase fold: detection of new families and implications for the origin of the eukaryotic separins. // Proteins. 2002 -V. 46-P. 355-367.

101. Vercammen D., Declercq W., Vandenabeele P., Van Breusegem F. Are metacaspases caspases? // J Cell Biol. 2007 - V. 179 - P. 375-380.

102. Woltcring E. J. Death proteases: alive and kicking. // Trends Plant Sci. 2010 - V. 15 - P. 185-188.

103. Wolpert T. J., Macko V. Acklin W., Jaun B„ Seibl J. Meili J., Arigoni D. Structure of victorin C, the major host-selective toxin from Cochliobolus victoriae. H Cell Mol Life Sci. 1985 - V. 41 -P. 1524-1529.

104. Navarre D. A., Wolpert T. J. Victorin induction of an apoptotic/senescenee-like response in oats. // Plant Cell. 1999 - V. 1 1 - P. 237-249.

105. Tripathi L. P., Sowdhamini R. Cross genome comparisons of serine proteases in Arabidopsis and rice. // BMC Genomics. 2006 - V. 7 - P. 200.

106. Meichtry J., Amrhein N., Schaller A. Characterization of the subtilase gene family in tomato (.Lycopersicon esculentum Mill.). // Plant Mol Biol. 1999 - V. 39 - P. 749-760.

107. Smith E. L., Markland F. S., Kasper C. B., DeLange R. J., Landon M., Evans W. H. The complete amino acid sequence of two types of subtilisin, BPN' and Carlsberg. // J Biol Chem. 1966 - V. 241 - P. 5974-5976.

108. Panek J. J., Mazzarello R., Novic M., Jezierska-Mazzarello A. Impact of Mercury(II) on proteinase K catalytic center: investigations via classical and Born-Oppenheimer molecular dynamics. // Mol Divers. 2011 - V. 15 - P. 215-226.

109. Fuller R. S., Brake A., Thorner J. Yeast prohormone processing enzyme (KEX2 gene product) is a Ca2+-dependent serine protease. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 - V. 86 -P. 1434-1438.

110. Poole C. B., Jin J., McReynolds L. A. Subtilisin-like proteases in nematodes. // Molecular and Biochemical Parasitology. 2007 - V. 155 - P. 1 -8.

111. Seidah N. G., Mayer G., Zaid A., Rousselet E., Nassoury N., Poirier S., Essalmani R., Prat A. The activation and physiological functions of the proprotein convertases. // lnt J Biochem Cell Biol. -2008-V. 40 P. 1111-1125.

112. Horton J. D., Cohen J. C., Hobbs H. H. Molecular biology of PCSK9: its role in LDL metabolism. //Trends Biochem Sci. -2007 V. 32 - P. 71-77.

113. Steiner D. F. The proprotein convertases. // Curr Opin Chem Biol. 1998 - V. 2- P. 31-39.

114. Kaneda M., Tominaga N. Isolation and characterization of a proteinase from the sarcocarp of melon fruit. //J Biochem. 1975 - V. 78 - P. 1287-1296.

115. Yamagata H., Masuzawa T., Nagaoka Y., Ohnishi T., Iwasaki T. Cucumisin, a serine protease from melon fruits, shares structural homology with subtilisin and is generated from a large precursor. 1! J Biol Chem. 1994 - V. 269 - P. 32725-32731.

116. Rudenskaya G. N., Bogdanova E. A., Revina L. P., Golovkin B. N., Stepanov V. M. Macluralisin~a serine proteinase from fruits of Maclura pomifera (Raj.) Schneid. II Planta. 1995 - V. 196-P. 174-179.

117. Taylor A. A., Horsch A., Rzepczyk A., Hasenkampf C. A., Riggs C. D. Maturation and secretion of a serine proteinase is associated with events of late microsporogenesis. // Plant J.- 1997-V. 12 — P. 1261-1271.

118. Berger D., Altmann T. A subtilisin-like serine protease involved in the regulation of stomatal density and distribution in Arabidopsis lhaliana. II Genes Dev. 2000 - V. 14 - P. 1119-1131.

119. Ribeiro A., Akkermans A. D., van Kämmen A., Bisseling T., Pawlowski K. A nodule-specific gene encoding a subtilisin-like protease is expressed in early stages of actinorhizal nodule development. // Plant Cell. 1995 - V. 7 - P. 785-794.

120. Toinero P., Conejero V., Vera P. Identification of a new pathogen-induced member of the subtilisin-like processing protease family from plants. // J Biol Chem. 1997 - V. 272 - P. 14412-14419.

121. Power S. D., Adams R. M., Wells J. A. Secretion and autoproteolytic maturation of subtilisin. // Proc Nat! Acad Sei U S A. 1986 - V. 83 - P. 3096-3100.

122. Baker D., Shiau A. K., Agard D. A. The role of pro regions in protein folding. // Curr Opin Cell Biol. 1993 - V. 5 - P. 966-970.

123. Anderson E. D., VanSlyke J. K., Thulin C. D., Jean F., Thomas G. Activation of the furin endoprotease is a multiple-step process: requirements for acidification and internal propeptide cleavage. // EMBO J. 1997 - V. 16 - P. 1508-1518.

124. Kobayashi T., Inouye M. Functional analysis of the intramolecular chaperone. Mutational hot spots in the subtilisin pro-peptide and a second-site suppressor mutation within the subtilisin molecule.//J Mol Biol. 1992 - V. 226 - P. 931-933.

125. Subbian E., Yabuta Y., Shinde U. P. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone: intrinsically unstructured propeptide modulates stochastic activation of subtilisin. // J Mol Biol. 2005 - V. 347 - P. 367-383.

126. Bogacheva A. M. Plant subtilisins. // Biochemistry. 1999 - V. 64 - P. 287-293.

127. Kamiya K., Boero M., Shiraishi K. Oshiyama A. Enol-to-keto tautomerism of peptide groups. // J Phys Chem B. 2006 - V. 110 - P. 4443-4450.

128. Wilmouth R. C., Edman K., Neutze R., Wright P. A., Clifton I. J., Schneider T. R., Schofield C. J., Hajdu J. X-ray snapshots of serine protease catalysis reveal a tetrahedral intermediate. // Nat Struct Biol. 2001 - V. 8 - P. 689-694.

129. Polgar L. The catalytic triad of serine peptidases. // Cell Mol Life Sci. 2005 - V. 62 - P. 2161-2172.

130. Perona J. J., Craik C. S. Structural basis of substrate specificity in the serine proteases. // Protein Sci. 1995 - V. 4 - P. 337-360.

131. Mahon P., Bateman A. The PA domain: a protease-associated domain. // Protein Sci. 2000 -V.9-P. 1930-1934.

132. Boguski M. S., Lowe T. M., Tolstoshev C. M. dbEST—database for "expressed sequence tags". //Nat Genet. 1993 - V. 4 - P. 332-333.

133. Rawlings N. D., Morton F. R., Barrett A. J. MEROPS: the peptidase database. // Nucleic Acids Res. 2006 - V. 34 - P. D270-272.

134. Bendtsen J. D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. // J Mol Biol. 2004 - V. 340 - P. 783-795.

135. Siezen R. J., Leunissen J. A. Subtilases: the superfamily of subtilisin-like serine proteases. // Protein Sci. 1997 - V. 6 - P. 501-523.

136. Heringa J., Argos P., Egmond M. R.s de Vlieg J. Increasing thermal stability of subtilisin from mutations suggested by strongly interacting side-chain clusters. // Protein Eng. 1995 -V. 8-P. 21-30.

137. Krem M. M., Di Cera E. Molecular markers of serine protease evolution. // EMBO J. -2001 V. 20 - P. 3036-3045.

138. Rautengarten C., Steinhauser D., Bussis D., Stintzi A., Schaller А., Корка J., Altmann T. Inferring hypotheses on functional relationships of genes: Analysis of the Arabidopsis thaliana subtilase gene family. // PLoS Comput Biol. -2005 V. 1 - P. e40.

139. Bendahmane A., Querci M., Kanyuka K., Baulcombe D. C. Agrobacterium transient expression system as a tool for the isolation of disease resistance genes: application to the Rx2 locus in potato. // Plant J. 2000 - V. 21 - P. 73-81.

140. Janzik I., Macheroux P., Amrhein N„ Schaller A. LeSBTl, a subtilase from tomato plants. Overexpression in insect cells, purification, and characterization. // J Biol Chem. 2000 -V. 275-P. 5193-5199.

141. Reavy В., Bagirova S., Chichkova N. V., Fedoseeva S. V., Kim S. H., Vartapetian А. В., Taliansky M. E. Caspase-resistant VirD2 protein provides enhanced gene delivery and expression in plants. // Plant Cell Rep. 2007 - V. 26 - P. 1215-1219.

142. Vartapetian А. В., Tuzhikov A. I., Chichkova N. V., Taliansky M., Wolpert T. J. A plant alternative to animal caspases: subtilisin-like proteases. // Cell Death Differ. 2011 - V. 18 -P. 1289-1297.

143. Lambert O., Levy D., Ranck J. L., Leblanc G., Rigaud J. L. A new "gel-like" phase in dodecyl maltoside-lipid mixtures: implications in solubilization and reconstitution studies. // Biophys J. 1998 - V. 74 - P. 918-930.

144. Rapoport T. A. Protein translocation across the eukaryotic endoplasmic reticulum and bacterial plasma membranes. // Nature. 2007 - V. 450 - P. 663-669.

145. Huh G. H., Dainsz B., Matsumoto T. K., Reddy M. P., Rus A. M., Ibeas J. I., Narasimhan M. L., Bressan R. A., Hasegawa P. M. Salt causes ion disequilibrium-induced programmed cell death in yeast and plants. // Plant J. 2002 - V. 29 - P. 649-659.

146. Subach F. V., Subach O. M., Gundorov I. S., Morozova K. S., Piatkevich K. D., Cuervo A. M., Verkhusha V. V. Monomelic fluorescent timers that change color from blue to red report on cellular trafficking. // Nat Chem Biol. 2009 - V. 5 - P. 11 8-126.

147. Ottmann C., Rose R., Huttenlocher F., Cedzich A., Hauske P., Kaiser M., Huber R., Schaller A. Structural basis for Ca2+-independence and activation by homodimerization. of tomato subtilase 3. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2009 V. 106 - P. 17223-17228.

148. EswarN., Webb B., Marti-Renom M. A., Madhusudhan M. S., Eramian D., Shen M. Y., Pieper U., Sali A. Comparative protein structure modeling using MODELLER. // Curr Protoc Protein Sci. 2007 - V. Chapter 2 - P. Unit 2 9.

149. Bikadi Z., Hazai E. Application of the PM6 semi-empirical method to modeling proteins enhances docking accuracy of AutoDock. // J Cheminform. 2009 - V. 1 - P. 15.

150. Zamore P. D. Plant RNAi: How a viral silencing suppressor inactivates siRNA. // Curr Biol.— 2004 V. 14 - P. R198-200.

151. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970 - V. 227 - P. 680-685.

152. Shaner N. C., Steinbach P. A., Tsien R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. // Nat Methods. 2005 - V. 2 - P. 905-909.

153. Abramoff M. D., Magalhaes P. J., Ram S. J. Image Processing with ImageJ. // Biophotonics International. 2004 - V. 11 - P. 36-42.

154. Bateman A., Coin L., Durbin R., Finn R. D., Hollich V., Griffiths-Jones S., Khanna A., Marshall M., Moxon S., Sonnhammer E. L., Studholme D. J., Yeats C., Eddy S. R. The Pfam protein families database.//Nucleic Acids Res.-2004-V. 32-P. D138-141.

155. Nicholas K. B., Nicholas J. H. B., Deerfield II. D. W. GeneDoc: Analysis and visualization of genetic variation. // EMBNEW.NEWS. 1997 - V. 4 - P.

156. Schrodinger The PyMOL Molecular Graphics System. // LLC. 2002 - V. - P.