Генетически кодируемый фотосенсибилизатор как инструмент воздействия на жизнеспособность и скорость пролиферации клеток эукариот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Серебровская, Екатерина Олеговна

• Серебровская, Екатерина Олеговна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Серебровская, Екатерина Олеговна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Механизмы фотосенсибилизации

Фотофизика

Фотохимия

Молекулярные механизмы программируемой клеточной смерти при

фото динамической терапии

Апоптоз

Каспаз-независимый апоптоз

Автофагия

Некроз

Внутриклеточной локализации фотосенсибилизатора на механизм

фотодинамического воздействия

Лизосомы и лизосомные катепсины как медиаторы клеточной гибели,

вызванной окислительным стрессом

Эндоплазматическийретикулум как мишень фотодинамического

воздействия

Ядро как мишень фотодинамического воздействия

Механизм повреждения ДНК при фотосенсибилизации

Клеточный ответ на повреждение ДНК

Сверочные точки клеточного цикла

Сверочная точка G1/S

Сверочная точка S-фазы

Сверочная точка сборки веретена деления

Использование клинически значимых фотосенсибилизаторов для

индукции окислительных повреждений в ядре

Направленная доставка к опухолевым клеткам

Антитела для направленной доставки

Иммуноконъюгаты

Конъюгаты антител с радионуклидами

Конъюгаты антител с химиотерапевтическими агентами

Конъюгаты антител с белковыми токсинами

Направленная доставка фотосенсибилизаторов с помощью

моноклональных антител

Влияние антигена

Влияние антитела

Формат антител

Антитело 4D5 - история создания и характеристики

Влияние свойств опухоли

Прямое и непрямое воздействие фотосенсибилизатора на опухоль

Фотоиммуноконъюгаты

Фотоиммуноконъюгаты для детекции опухолей

Фотоиммуноконъюгаты для терапии опухолей

Фотоактивные флуоресцентные белки и генетически кодируемый фотосенсибилизатор KillerRed

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Методы

Генетические конструкции

Выделение плазмидной ДНК

Трансформация клеток Е. coli методом электропорации

Электрофорез ДНК в агарозном геле

Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического

разделения

Культивация штаммов-продуцентов Е. coli, индукция

Вертикальный гель-электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях

флуоресцентных белков

Вестерн-блот анализ

Выделение белка на Ni-NTA-сефарозе

Эксклюзионная хроматография (гель-фильтрация)

Обессоливание белков с помощью колонок NAP5 и PD10 (Amerscham

Biosciences, носитель сефадекс G25M)

Клеточные линии и условия культивирования

Флуоресцентно-микроскопический анализ

Анализ жизнеспособности клеток, МТТ-тест

Временная трансфекция эукариотических клеток

Лентивирусная трансдукция эукариотических клеток

Стерильная проточная сортировка клеток и проточная

цитофлуориметрия

Анализ клеточного цикла с помощью окрашивания йодистым пропидием и

проточной цитофлуориметрии

Модифицированный клоногенный метод с подсчетом числа клеток в

индивидуальных колониях

Метод оценки фото-цитостатического воздействия методом прямого

подсчета с внутренним контролем

Манипуляции с эмбрионамиX.laevis

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Генетически кодируемый иммунофотосенсибилизатор

Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантного белка 4D5 scFv-

KillerRed-His 5

Характеристика специфичности связывания 4D5-KillerRed-His5

Фототоксичность рекомбинантного белка 4D5-KillerRed-His5

Тандем фототоксического белка KillerRed в составе белка слияния с коровым гистоном Н2В вызывает временную остановку клеточного цикла.

Задержка клеточного деления при облучении

Механизм, обеспечивающий задержку клеточного деления при облучении

интерфазных клеток

Механизм, обеспечивающий нерасхождение хромосом при облучении

метафазных клеток

Использование H2B-tKR для нарушения развития тканей in vivo

Лизосомы как мишень фототоксического воздействия KillerRed

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

Тезисы докладов на конференциях

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. СТРАТЕГИЯ ВЫБОРА РЕГИОНОВ (ГЕЙТИРОВАНИЯ) ПРИ ПРОТОЧНО-ЦИТОФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. СХЕМЫ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ С Н2В-TKR, ПОЛУЧЕННЫХ В ДАННОЙ РАБОТЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетически кодируемый фотосенсибилизатор как инструмент воздействия на жизнеспособность и скорость пролиферации клеток эукариот»

Введение

Фотодинамическая терапия (ФДТ) является многообещающим методом, использующим комбинацию воздействия химических фотосенсибилизаторов и видимого света для индукции клеточной гибели в опухолевых тканях.

Еще в начале двадцатого столетия было обнаружено, что опухолевая клетка обладает свойством селективно накапливать и некоторое время удерживать различные фотосенсибилизаторы. За последние 20 лет были получены убедительные результаты по ФДТ, включающей использование частично очищенных, коммерчески доступных производных гематопорфиринов (РЬоиэйтгй), на пациентах с ранней и поздней стадиями рака легкого, желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы. В то же время, взрывной рост количества работ, посвященных синтезу и исследованию новых фотосенсибилизаторов, пик которого пришелся на 2000е годы, привел к некоторому замедлению исследования преимуществ и недостатков тех или иных фотосенсибилизаторов в различных областях применения.

Основным ограничением ФДТ является недостаточная селективность накопления фотосенсибилизаторов, которая может приводить к значительному повреждению нормальных тканей при облучении больших поверхностей, например, при воздействии на диссеминированные интраперитонеальные опухоли или мезотелиому. Конъюгация фотосенсибилизаторов с моноклональными антителами к опухолеспецифичным антигенам предоставляет возможность преодолеть это ограничение, однако синтез таких конъюгатов также сопряжен с различными затруднениями, например, недостаточной воспроизводимостью синтеза конъюгатов, а также потерей аффинности антител или эффективности фотосенсибилизатора.

Кроме того, на эффективность ФДТ оказывает существенное влияние субклеточная локализация фотосенсибилизатора, обусловленная его химическими свойствами. Однако этот аспект ФДТ плохо поддается изучению, поскольку фотосенсибилизаторы редко локализуются только в одном компартменте клетки. В то же время, некоторые компартменты, такие, как ядро, остаются практически недоступными для клинически значимых фотосенсибилизаторов, хотя ряд работ свидетельствует о значительной чувствительности ядра к фотодинамическому воздействию, если обеспечена ядерная доставка фотосенсибилизатора.

Недавно был описан первый полностью генетически кодируемый фотосенсибилизатор - фототоксичный красный флуоресцентный белок, названный КШегЯеё, способный производить активные формы кислорода при облучении зеленым светом. Настоящая работа посвящена использованию КШег11ес1 для решения проблем, описанных выше, как то: воспроизводимого получения молекул, содержащих в составе фотосенсибилизатор и моноклональное антитело, а также изучения влияния субклеточной

локализации на механизм ФДТ и обнаружения наиболее чувствительных к фото динамическому воздействию клеточных компартментов. Было продемонстрировано, что КШегЫес! в составе гибридных молекул с моноклональными антителами, а также с различными маркерами субклеточной локализации является мощным инструментом воздействия на жизнеспособность и скорость пролиферации специфических популяций эукариотических клеток.

Обзор литературы

Механизмы фотосенсибилизации

Фотофизика

Поглощение света в живых организмах эндогенными или экзогенными фотосенсибилизаторами в присутствии кислорода вызывает окисление, приводящее ко многим химическим и биологическим эффектам, многие из которых являются повреждающими [1]. Фотосенсибилизаторами называют молекулы, способные поглощать свет и впоследствии вступать в химические реакции, которые в их отсутствии были бы невозможны. Фотосенсибилизатор может подвергаться химическим модификациям в процессе реакции, но это не является обязательным условием. В фотохимических реакциях принимают участие различные короткоживущие активные формы, одной из которых является синглетный кислород. Существуют также нефотохимические методы получения некоторых активных форм. Некоторые из них также являются интермедиатами, вызывающими повреждения в живых организмах, вызванные, например, смогом и другими загрязняющими окружающую среду агентами. Рисунок 1 графически иллюстрирует процессы поглощения света и переноса энергии, происходящих при ФДТ. Фотосенсибилизатор (ФС) в основном (невозбужденном) состоянии имеет два электрона с противоположными спинами (синглетное состояние) на низшей молекулярной орбитали. После поглощения фотона один из этих электронов переходит на следующую энергетическую орбиталь с сохранением спина (первое возбужденное синглетное состояние). Это состояние имеет время жизни порядка наносекунд и может переходить в основное энергетическое состояние путем перехода энергии в тепло или свет (флуоресценция). Из первого возбужденного синглетного состояния молекула может перейти также в относительно долгоживущее триплетное возбужденное состояние, если возбужденный электрон изменит свой спин на противоположный.

Цитотоксичность

Рис. 1 Графическая иллюстрация фотофизических и фотохимических процессов, протекающих при фотодинамическом воздействии (по [2]).

Фотохимия

Фотосенсибилизатор, находящийся в возбужденном триплетном состоянии, может принимать участие в двух типах реакций (Рис. 1) Реакция первого типа подразумевает непосредственное взаимодействие фотосенсибилизатора с субстратом, например, клеточной мембраной, с переносом протона или электрона, что приводит к образованию катион-радикала или анион-радикала. Радикалы могут затем реагировать с кислородом с образованием активных форм кислорода. В реакции второго типа фотосенсибилизатор в триплетном возбужденном состоянии реагирует непосредственно с молекулярный кислородом, что приводит к образованию синглетного кислорода. Оба типа реакций могут протекать одновременно, и соотношение между ними зависит от типа фотосенсибилизатора, концентраций субстрата и кислорода.

Первой стадией процессов первого типа обычно является образование супероксид аниона путем переноса электрона с фотосенсибилизатора на молекулярный кислород (моновалентное восстановление) [3]. Сам по себе супероксид анион не очень реакционноспособен, но может подвергаться процессу дисмутации с образованием пероксида водорода и кислорода (процесс, катализируемый ферментом супероксиддисмутазой). Пероксид водорода, в свою очередь, может проникать сквозь клеточную мембрану. Супероксид-анион также участвует в образовании крайне реакционноспособного гидроксильного радикала (НО*). В ходе этого процесса супероксид играет роль восстановителя, отдавая электрон на восстановление

•2 I

иона металла (например, Бе ), которые катализируют превращение пероксида водорода в гидроксильный радикал. Это так называемая реакция Фентона, открытая более ста лет назад. Эта реакция важна в биологических системах, поскольку все клетки содержат определенное количество железа, меди и других металлов, способных катализировать эту реакцию. Супероксид может затем реагировать с гидроксильным радикалом с образованием синглетного кислорода или с N0" с образованием пероксинитрита, также очень реакционноспособной молекулы. Гидроксильный радикал, как и супероксид-анион, легко проникает через мембрану и не может быть экспортирован из клетки, где может реагировать с органическими субстратами, например, жирными кислотами, с образованием гидроксилированного соединения, которое, в свою очередь, также является радикалом. Гидроксильный радикал может также отбирать электрон от органических молекул, окисляя их. Получившийся окисленный субстрат также является радикалом и может окислять другие молекул - образуется цепная реакция. Такие цепные реакции характерны для окислительного повреждения жирных кислот и демонстрируют, почему гидроксильный радикал производит гораздо больше повреждений, чем можно было бы ожидать.

Таким образом, активные формы кислорода, вместе с синглетным кислородом, образующимся в ходе реакций второго типа, являются окислителями, способными взаимодействовать с многими биологическими молекулами. Остатки цистеина, метионина, тирозина, гистидина и триптофана в молекулах белков являются важными мишенями для окислителей [4,5]. Цистеин и метионин окисляются преимущественно до сульфоксидов, гистидин - до нестабильного эндопероксида, триптофан участвует в сложной цепочке превращений с образованием формилкинуренина. Ненасыщенные липиды образуют гидропероксиды (ЬООН) [6,7].

Возможны также и повреждения ДНК. Окислению могут подвергаться как азотистые основания, так и сахара, что приводит к образованию ДНК-белковых связей - вида повреждения, наиболее тяжело подвергающегося репарации. Хотя все клетки способны восстанавливаться после определенной степени окислительного повреждения, начиная с определенного уровня окислительное повреждение вызывает мутации и гибель клетки. Гуанин в наибольшей степени подвержен окислительному повреждению, вызываемому синглетным кислородом [8].

В связи с высокой реакционной способностью и коротким временем жизни синглетный кислород и гидроксильный радикал обладают очень небольшим радиусом действия - для синглетного кислорода он составляет около 20 нм [9].

Транспорт фотосенсибилизатора к клетке осуществляется за счет различных компонентов крови, среди которых большое значение имеют комплексы белков с липидами, липопротеины низкой плотности. Методами

флуоресцентной микроскопии было показано, что сенсибилизаторы первоначально адсорбируются на плазматической мембране клетки, в течение нескольких часов проходят через мембрану внутрь клетки и затем адсорбируются на внутренних мембранах органелл, таких, например, как митохондрии [1].

Молекулярные механизмы программируемой клеточной смерти при фотодинамической терапии

Программируемая клеточная смерть (ПКС) это генетически кодируемая форма клеточного самоубийства, происходящего в строго определенном месте и в строго определенное время в процессе эмбрионального развития [10]. Охарактеризовано 3 морфологически различные формы ПКС [11]. ПКС 1-ого типа характеризуется фенотипическими изменениями, включающими конденсацию ядра и сжатие всей клетки. ПКС 2-ого типа характеризуется лизосомной деградацией клетки и наличием автофагосом. ПКС 3-его типа характеризуется набуханием клетки и быстрым развитием проницаемости плазматической мембраны. В настоящее время эти процессы имеют название апоптоза, автофагии и некроза, соответственно, и являются клеточными программами, играющими центральную роль в нормальном развитии, гомеостазе тканей и в удалении ненормальных или поврежденных клеток [10,12].

Известно, что фотодинамическая терапия с помощью фотосенсибилизаторов, преимущественно накапливающихся в клеточной мембране или лизосомах вызывает преимущественно некроз [13], в то время, как сенсибилизаторы, накапливающиеся в митохондриях, индуцируют апоптоз путем высвобождения АИФ (апоптоз-индуцирующих факторов), например, цитохрома С [14]. Недавно было высказано предположение, что фотосенсибилизаторы, накапливающиеся в лизосомах, могут также вызывать и апоптоз [15,16]. Механизм переключения между путями клеточной гибели на данный момент исследован недостаточно, однако имеются данные, свидетельствующие о роли внутриклеточной концентрации АТФ [17]. Авторами было продемонстрировано, что в условиях, неблагоприятных для гликолиза, фотодинамическая терапия фотосенсибилизатором, обычно вызывающим апоптоз, приводила в основном к некротической клеточной гибели. Кроме того, известны фотосенсибилизаторы, для которых изменение времени инкубации перед облучением приводит к изменению соотношения апоптоз/некроз [18].

Апоптоз

Апоптоз это АТФ-зависимый процесс, характеризующийся конденсацией хроматина, разрезанием хромосомной ДНК на межнуклеосомные фрагменты, сжатием клетки, блеббингом мембраны,

формированием апоптотических телец с цельной клеточной мембраной, и их фагоцитозом посредством окружающих клеток. Биохимически апоптоз характеризуется активацией каспаз - высоко консервативного семейства цистеин-зависимых аспартат-специфичных протеиназ [19]. Существует два пути активации каспаз - внешний (с участием «лигандов смерти» - death ligands), и внутренний - митохондриальный, связанный с пермеабилизацией митохондриальных мембран и выходом в цитозоль нескольких апоптогенных белков, например, цитохрома С, накапливающихся в межмембранном пространстве митохондрий [20].

Показано, что после фотодинамической терапии активируется в основном митохондриальный путь активации каспаз [21]. В типичном случае ФДТ после выхода цитохрома С из межмембранного пространства митохондрий запускается каскад активации каспаз, приводящий к апоптотическому морфотипу. Это в особенности относится к фотосенсибилизаторам с преимущественной митохондриальной локализацией, которые при ФДТ быстро инициируют пермеабилизацию митохондриальных мембран (ПММ) [22]. Основной молекулярный механизм возникновения ПММ, в частности, вопрос, происходит ли пермеабилизация за счет нарушения внутренней или внешней мембраны митохондрий, является не только фундаментальной проблемой, но и практическим вопросом, затрагивающим стратегию применения ФДТ. Однако механизм разрушения митохондрий при клеточной смерти до сих пор обсуждается [23].

Высокая аффинность некоторых митохондриальных фотосенсибилизаторов к основным компонентам поры, вызывающей проницаемость митохондриальных мембран, считается непосредственной причиной возникновения ПММ при ФДТ в культуре клеток. Фотосенсибилизатор фотофрин IX (PpIX), распределяющийся в цитоплазме и цитоплазматических мембранах клетки, является известным лигандом к периферическому бензодиазепиновому рецептору (ПБР), который по некоторым данным является компонентом поры, вызывающей проницаемость митохондриальных мембран. Блокирование связывания фотофрина с ПБР другим нефотосенсибилизирующим лигандом вызывает отмену фотосенсибилизации [24-26].

Для фотосенсибилизаторов, обладающих более низким сродством к митохондриям, в частности, таких, как гиперицин и Форскан (мета-тетрагидроксифенилхлорин), преимущественно локализующихся в эндоплазматическом ретикулуме, роль поры, вызывающей проницаемость митохондриальных мембран, в индукции апоптоза остается неясной [27,28].

Каспаз-независимый апоптоз

Активация каспазы являются основным, но не единственным определяющим фактором для возникновения апоптотической морфологии.

Довольно часто удается показать, что ингибирование каспаз вызывает либо маленький, либо кратковременный эффект на ход апоптоза в клетках, подвергающихся ФДТ [29]. Причина в том, что если ПММ уже возникла, апоптоз может протекать, хотя и медленнее, независимо от каспазной активности. Известными индукторами каспаз-независимых путей апоптоза являются флавопротеины АИФ и эндонуклеаза О [30]. Эти белки высвобождаются в цитозоль при возникновении ПММ, и участвуют в конденсации хроматина и фрагментации ДНК вне зависимости от активности каспаз.

В заключении, следует отметить, что независимо от механизма пермеабилизации митохондриальных мембран, индукция апоптотических механизмов клеточной гибели приводит к активации каспаз-зависимых и независимых путей, которые действуют параллельно, обеспечивая гибель клетки [30].

Автофагия

Ввиду высокой реакционной способности фотогенерируемых активных форм кислорода, неудивительно, что для удаления фотоповрежденных окисленных органелл или деградации крупных агрегатов белков, возникших в результате фотоиндуцированных реакций, которые не могут быть удалены с помощью убиквитин-протеасомной системы или системы ЭПР-опосредованной деградации, инициируется автофагия. Поскольку автофагия является самоограничивающим процессом, представляется возможным, что ее продолжительное поддержание приводит к энергетическому коллапсу, приводящему к клеточной гибели [27].

На данный момент существуют два независимых свидетельства об индукции автофагии при ФДТ, указывающие на связь между автофагией и клеточной гибелью [27,31].

Некроз

Некроз морфологически характеризуется вакуоляризацией цитоплазмы, набуханием клетки и разрушением плазматической мембраны, приводящим к воспалительной реакции в связи с высвобождением клеточного содержимого, в том числе и про-воспалительных молекул.

Некроз является завершением биоэнергетической катастрофы, вызванной истощением запасов АТФ до уровня, несовместимого с жизнью клетки[12]. Некроз является преимущественным типом клеточной смерти при ФДТ с использованием фотосенсибилизаторов, локализующихся на плазматической мембране [32,33]. По всей видимости, это связано с быстрой потерей целостности клеточной мембраны, невозможности поддержания потоков ионов через клеточную мембрану и быстрым истощением внутриклеточных запасов АТФ, как показано с использованием Фотофрина и фталоцианина цинка [18].

В некоторых моделях некроз, в отличие от вторичного некроза, возникающего на поздних стадиях апоптоза, является предпочтительной формой клеточной гибели также для фотосенсибилизаторов, исходно локализующихся, или впоследствии транслоцирующихся, в другие клеточные компартменты. Это предполагает наличие механизмов, координирующих процессы, приводящие клетку к некрозу, а не к апоптозу. К факторам, вызывающим предпочтительно некротическую гибель, относятся повышенный внутриклеточный уровень кальция, а также локализация и тип генерируемых активных форм кислорода. Показано, например, что в клетках HeLa, нагруженных фотосенсибилизатором Mitotracker Red интенсивное облучение вызывало фотогенерацию, как синглетного кислорода '02, так и супероксид-аниона) 02", что приводило к гибели клетки путем некроза [34].

В то же время, с использованием специфических тушителей активных форм кислорода было показано, что генерация !02 на мембранах комплекса Гольджи и эндоплазматического ретикулума (ЭПР) вызывает некроз, а другие активные формы кислорода приводят к индукции апоптоза [35].

Понимание различий на молекулярном уровне и взаимодействий между различными путями клеточной гибели несомненно является необходимым для разработки наиболее эффективных терапевтических методик фотодинамической терапии и увеличения эффективности уничтожения раковых клеток, в которых один или несколько из этих путей могут быть нарушены.

Внутриклеточной локализации фотосенсибилизатора на механизм фотодинамического воздействия

Опухолевые клетки характеризуются рядом отличительных свойств, которые способны влиять на их чувствительность к тем или иным воздействиям. Эти свойства суммированы в Табл. 1.

Свойство Эндоплазматичес- Лизосома Митохондрия Ядро

опухолевой кии ретикулум

клетки

Высокая Чувствитель-

скорость ность к

пролифераци и повреждениям ДНК.

Высокий Чувствитель-

уровень ность к

экспрессии повреждению

катепсинов лизосом.

Гипоксия Неправильный фолдинг белков, вызванный нарушенным формированием 8 мостиков.

Высокий Повышенное Нестабильность Повреждение Повреждение

уровень образование мембран. митохондриально ДНК.

активных перекисных и й ДНК.

форм карбонильных

кислорода соединении.

Ацидоз Большие лизосомы.

Измененный Ошибки Повышение

метаболизм гликозилирования. уровня

глюкозы продуктов метаболизма глюкозы, приводящее к повышенной экспрессии катепсинов.

Таблица 1. Отличительные свойства опухолевой клетки и их влияние на чувствительность органелл к различным воздействиям (согласно [36]).

Применительно к фотодинамическому воздействию, эти свойства могут определять механизм клеточной гибели, а также наиболее чувствительные к воздействию фотосенсибилизатора клеточные органеллы.

Лизосомы и лизосомные катепсины как медиаторы клеточной гибели, вызванной окислительным стрессом

Долгое время считалось, что лизосомы не являются значимой мишенью для фотосенсибилизаторов в связи с технической сложностью задачи

нацеливания сенсибилизатора в лизосому и корректной демонстрации лизосомной локализации [37]. В 1997 году Brunk et al. [38] показали, что фотоокисление лизосомных мембран с помощью лизосомотропного флуорофора акридинового оранжевого вызывает релокализацию флуорофора и гибель клетки. Было показано, что различный уровень фотоповреждения может вызывать либо период автофагии с сохранением жизнеспособности клетки, либо апоптотическую гибель (при средней интенсивности воздействия), либо некроз (при максимальной интенсивности). Авторами была предложен механизм, который впоследствии был подтвержден экспериментально, согласно которому фотоповреждение лизосомной мембраны вызывает высвобождение протеолитических ферментов, которые и опосредуют гибель клетки. Было также показано, что повреждения, аналогичные фотоокислительным, вызываются окислительным стрессом при воздействии пероксида водорода. В дальнейшем было показано, что одним из основных медиаторов наблюдаемого эффекта является катепсин D [39]. На модели индуцированного лизосомо-опосредованного апоптоза в человеческих фибробластах было показано, что высвобождение катепсина D вызывает выход цитохрома С и падение мембранного потенциала митохондрий [40]. Однако, в дальнейшем было показано, что митохондриальный каспаз-зависимый апоптоз не является единственным путем, активируемым при дестабилизации лизосомных мембран. По современным представлениям, существует два механизма индукции клеточной гибели при участии лизосомных протеаз -каспаз-зависимый и каспаз-независимый, и выбор между этими путями зависит от типа стимула и типа клеток.

При реализации каспаз-зависимого пути основной клеточной мишенью катепсинов является Bid - проапоптотический белок семейства Вс1-2, что было подтверждено в ряде клеточных моделей [41]. Было также показано, что микроинъекция катепсина D, но не катепсина В, вызывает каспаз-зависимый апоптоз в фибробластах человека [42]. Клеточной мишенью активированного белка Bid является проапоптотический белок того же семейства Вах, активация которого приводит к выходу апоптогенных факторов из митохондрий [43]. Кроме того, показана прямая активация прокаспазы-2 и каспазы-8 катепсином D in vitro с образованием фрагмента, проявляющего существенную проапоптотическую активность [44,45].

Существует также все растущий набор экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что апоптоз может протекать по полностью каспаз-независимому пути [46]. Это особенно важно для многоклеточного организма в случае, когда каспаз-опосредованные пути полностью инактивированы, как это бывает, например, в раковых клетках. Некоторые модели каспаз-независимого апоптоза полностью зависят от катепсинов. Например, показано, что активация Вах катепсином D приводит к высвобождению АИФ (апоптоз-индуцирующих факторов) из митохондрий и каспаз-независимую гибель Т-

лимфоцитов [47]. Этот механизм, по всей видимости, обусловлен избыточным притоком ионов Са2+ и гиперактивацией поли-АДФ-рибозо-полимеразы (ПАРП) [48].

Все вышеперечисленные примеры подтверждают критическую роль лизосом в осуществлении программируемой клеточной гибели. В настоящее время признается факт существования особого пути клеточной гибели, «лизосомо-опосредованная клеточная гибель» [45]. Однако, поскольку этот путь, как было продемонстрировано выше, может осуществляться с помощью различных механизмов в зависимости от непосредственного способа нарушения лизосомных мембран, следует указать, какие экспериментальные данные касаются непосредственно клеточной гибели, вызванной фотоповреждением лизосом. Помимо пионерской работы Brunk et al. [38] существует еще ряд работ, посвященных механизмам клеточной гибели, вызванной лизосомотропными фотосенсибилизаторами. Показана индукция апоптоза при фотосенсибилизации клеток гепатомы мыши 1с1с7 и Тао с помощью фотосенсибилизатора N-ацетил хлорина е6 [49]. Авторы продемонстрировали, что меньший уровень экспрессии катепсинов В и D в клетках линии Тао приводит к меньшему уровню активированного Bid в цитоплазме и, соответственно, большей устойчивости этой линии к фотодинамическому воздействию с использованием лизосомотропного фотосенсибилизатора. Однако тем же коллективом авторов на модели in vitro ранее было показано, что фармакологическое ингибирование катепсинов В, L и D не вызывает снижения уровня активированного Bid в цитоплазме [50]. Ив то же время, исследование Ichinose и соавторами [51] фотосенсибилизатора второго поколения ATX-slO, демонстрирующего локализацию в митохондриях и лизосомах, показало, что ингибирование катепсинов В и D защищает клетки аденокарциномы молочной железы MCF-7 от фототоксического воздействия.

Эндоплазматический ретикулум как мишень фотодинамического воздействия

Трансмембранные и секретируемые белки транслоцируются в люмен эндоплазматического ретикулума, где затем фолдируются и подвергаются модификациям [52]. Накопление неправильно фолдированных белков в ЭПР запускает внутриклеточные сигналы, называемые ответом на нефолдированные белки (unfolded protein response). Этот процесс включает: 1) индукцию транскрипции шаперонов и других белков, отвечающих за фолдинг, например GPR78, GPR94 и дисульфид-изомеразу [53]; 2) снижение уровня трансляции для предотвращения дальнейшего накопления белков в ЭПР; 3) ЭПР-опосредованную деградацию для очистки ЭПР от неправильно фолдированных белков.

Опухолевые клетки демонстрируют такие признаки повышенной нагрузки на эндоплазматический ретикулум (ЭПР-стресса), как гиперэкспрессия шаперонов, кальретикулина и кальнексина [54]. Среди факторов, способствующих такому свойству клетки, стоит отметить недостаток глюкозы в областях опухолей, удаленных от кровеносных сосудов, и пониженные значения рН [53]. Гиперэкспрессия шаперонов эндоплазматического ретикулума ассоциирована с устойчивостью к химиотерапевтическим агентам [55]. Если конститутивно повышенная нагрузка на ЭПР является защитной мерой, мишенью терапии может являться именно этот защитный механизм. И действительно, деградация неправильно фолдированных белков предотвращает клеточную гибель, опосредованную ЭПР [56].

Избыточный ЭПР-стресс ведет к индукции апоптоза. Хотя он активирует в том числе и факторы, характерные также для других стрессовых ответов, не связанных с ЭПР, однако механизмы активации, по всей видимости, различаются. Так, активированный IRE1 привлекает к мембране ЭПР фактор TRAF2, который, в свою очередь, активирует проапоптотическую киназу ASK1, что в конечном итоге приводит к активации JNK и апоптозу [57]. Выход Са2+ из ЭПР приводит к активации кальций-зависимых протеиназ -капьпаинов, которые способны к ограниченному протеолизу внутриклеточных субстратов, связанных с передачей апоптотических сигналов, в частности, Bid [58], Вах [59], а также каспазы 7 [59].

Есть примеры успешного применения фотосенсибилизаторов, связывающихся преимущественно с мембраной ЭПР, для индукции клеточной гибели, однако в этом случае эффект, по мнению авторов, связан с нарушением мембраны ЭПР [60]. В то же время известно, что фото динамическая терапия с

помощью гиперицина приводит к снижению уровня белка SERCA2, что

■ji

приводит к нарушению гомеостаза Са и гибели клетки. Защита SERCA2

94-

восстанавливает уровень Са в ЭПР и предотвращает гибель клетки. Следовательно, фотодеструкция SERCA2 и результирующая неспособность

94-

ЭПР поддерживать гомеостаз Са является причиной гибели клетки при

94-

фотодинамической терапии гиперицином. Падение уровня Са в ЭПР быстро приводит к апоптозу, опосредованному Вах/Вак механизмом митохондриальной проницаемости [27].

Фототоксичность при фотодинамической терапии клеток HL60 аминолевулиновой кислотой обусловлена двумя параллельно протекающими процессами, один из которых представляет собой митохондриальный путь индукции апоптоза, а другой обусловлен нарушением гомеостаза кальция и активацией апоптотических механизмов, связанных с ЭПР-стрессом [61]. Согласно приведенным данным, после терапии аминолевулиновой кислотой повышается уровень экспрессии Са2+-связывающих шаперонов ERp57 и ERp72, а также понижается уровень антиапоптотических белков Вс1-2 и Bel-

х(Ь). Ингибирование инициаторной каспазы 9, каспазы 3 и кальций-зависимой протеазы кальпаина не приводило к снижению уровня фрагментации ДНК. Проводились также исследования роли кальпаинов в фототоксичности бисульфонированной соли фталоцианина алюминия на клеточной линии лимфобластов человека ССКБ-СЕМ [22]. Фотосенсибилизация приводила к активации кальпаинов (согласно экспериментам с флуорогенным субстратом), однако ингибирование кальпаинов с помощью ингибитора кальпаина-П и РБ 150606 не влияло на эффективность ФДТ.

Ядро как мишень фотодинамического воздействия

Механизм повреждения ДНК при фотосенсибилизации

Как упоминалось ранее, механистически фотосенсибилизация может подразумевать перенос электрона, отрыв атома водорода, образование синглетного кислорода или активных свободных радикалов. Во многих исследованиях в области свободно-радикальной химии ДНК, свободные радикалы генерировались в результате фотосенсибилизации 2-метил-1,4-нафтохиноном или рибофлавином. Некоторые производные антрахинона приводят к селективному разрезанию одноцепочечных участков в составе шпилечных структур ДНК [62]. В результате фотовозбуждения сначала молекула фотосенсибилизатора переходит в возбужденное синглетное состояние с очень коротким временем жизни, а затем происходит интеркомбинационная конверсия с переходом в триплетное состояние. Триплетное состояние обладает большим временем жизни и может вступать в реакцию с другими веществами. Молекула в возбужденном состоянии может быть как хорошим донором, так и хорошим акцептором электрона. Производные антрахинона в основном выступают в роли электрон-акцепторов [реакция (1)], а бензофенон и некоторые хиноны также способны к отрыву атома водорода [реакция (2)]

В молекуле ДНК отрыв электрона происходит в основном от гуанина (преимущественно в составе ОС-сайтов), если фотосенсибилизаторами выступают интеркалирующие хиноны [63,64]. В случае неинтеркалирующих хинонов, способных к отрыву атома водорода, происходит неселективный разрыв молекулы ДНК [65]. Стоит отметить, что 1,4-бензохинон и некоторые другие хиноны вступают в реакцию с водой [66], и эти конкурирующие реакции надо принимать в расчет при использовании их в качестве фотосенсибилизаторов.

В + РЬ2С=0* -> + *С(РЬ)2-0-ЬШ + Р1г2С=0* Я* + ,С(РЬ)2-ОН

(1) (2)

Фотосенсибилизатор в триплетном состоянии вступает в реакцию с молекулой О2 со скоростями, лимитированными скоростью диффузии. Когда энергия триплетного состояния близка к разности энергий между триплетным и синглетным возбужденным состоянием [O^1 Ag); АЕ = 96 кДж* моль"1], происходит перенос энергии [реакция (3)].

02 + S* —> Oz^Ag) + S (3)

Этот богатый энергией 02 имеет очень короткое время жизни в воде (к = 2.5 ~ 105 с"1; в D20 его время жизни гораздо длиннее, к = 1.6 ~ 104 с"1). Синглетный кислород обычно проявляет небольшую реакционную способность, однако с рядом соединений, например, с 2-дезоксигуанозином и его производными, он реагирует достаточно быстро (Wilkinson, Helman et al. 1995). Для того, чтобы исследовать роль синглетного кислорода отдельно, необходимо использовать фотосенсибилизаторы, преимущественно генерирующие синглетный кислород, например бенгал-роз [67]. Триплетное состоянии этого фотосенсибилизатора обладает слишком низкой энергией, чтобы стали возможны перенос электрона или отрыв водорода от ДНК и сходных субстратов.

Бензофенон кетил радикал реагирует с молекулярным кислородом с образованием синглетного кислорода [реакция (4)]:

'C(Ph)2-0- (*C(Ph)2-OH) + 02 -> Ph2C=0 + Of (Н02*) (4)

В то же время, редокс-потенциал семихинона рибофлавина, например, [р£а = 8.3 [68]] так близок к потенциалу 02'~, что перенос электрона на 02 происходит очень медленно [£<3.8 х 104 дм3 моль-1 с-1 [69]]. Поэтому флавин семихинон радикал деградирует по бимолекулярному механизму. Таким образом, хотя первичная реакция одинакова для обоих фотосенсибилизаторов, продукты и их соотношения могут существенно отличаться в зависимости от того, играет ли синглетный кислород существенную роль в их образовании. Является ли это одной из причин наблюдаемых отличий между реакциями этих фотосенсибилизаторов с ДНК и другими модельными субстратами, требует дальнейшего изучения [70].

Другая широко исследуемая группа фотосенсибилизаторов - комплексы рутения (II) и осмия (II), которые в возбужденном состоянии становятся сильными окислителями [75]. Как и в случае других одноэлектронных окислителей, преимущественным субстратом для их атаки оказывается G.

Таким образом, существует множество агентов, которые могут индуцировать повреждение ДНК посредством свободных радикалов. Кроме того, существуют реакции, усиливающие повреждение, которые приводят к тому, что один радикал может вызывать несколько повреждений. Например, реакция Фентона (с участием Н202 и ионов переходных металлов) могут

приводить к сайт-специфической генерации гидроксильного радикала 'ОН, в случае если ион переходного металла связан с ДНК. К основным типам повреждений ДНК относятся повреждения отдельных оснований, апуринизация/апиримидинизация, одноцепочечные и двуцепочечные разрывы. Кроме того, могут возникать сшивки между молекулами ДНК, а также молекулами ДНК и белка.

В клетках, где ДНК всегда находится в окружении белков, с одной стороны доступ свободных радикалов к ДНК затруднен, но с другой стороны возможно вторичное повреждение ДНК реакционно-способными интермедиатами реакции свободных радикалов с белками.

Возможно также образование несколько типов сшивок ДНК-ДНК. Исходно считалось, что возможно возникновение межмолекулярных сшивок, приводящих к увеличению молекулярной массы. Однако в случае клеточных систем это считается весьма маловероятным событием. Более вероятной считается рекомбинация двух радикалов ДНК, расположенных на одной и той же макромолекуле. Это приводит к образованию петли без увеличения молекулярной массы.

Образование ДНК-белковых сшивок также возможно различными путями. Во-первых, возможна простая рекомбинация между радикалом белка и радикалом ДНК. Для этого требуется независимое одновременное возникновение двух радикалов в достаточной близости друг от друга, чтобы вклад конкурирующих реакций с 02 и глутатионом был бы минимален. Такая ситуация возможна под воздействием ионизирующего облучения. Во-вторых, возможно образование ДНК-белковых сшивок под воздействием единственного радикала. Было показано, что гуанил-радикал является хорошим кандидатом для осуществления такой реакции [71]. Показано также, что такие аминокислоты как серин, лизин и треонин могут ковалентно присоединяться к радикалу, возникающему в результате реакции фотовозбужденного бензофенона с 2'-дезоксигуанозином или его производными [72]. Кроме того, белки, связанные с ДНК, могут обеспечивать перенос «дырки» через молекулу ДНК [73], что может приводить к образованию ДНК-белковых сшивок через остаток тирозина [74]. Хлороальбумин фталоцианин [75] и другие фотосенсибилизаторы [76] также могут приводит к образованию ДНК-белковых сшивок. Роль синглетного кислорода была обнаружена по возрастанию частоты сшивок в присутствии 020. Проводилось также сравнение эффективности образования ДНК-белковых сшивок при облучении клеток млекопитающих ультрафиолетовым излучением различных спектральных характеристик [77]. Было показано, что для биологически значимых доз УФ-А облучения выход ДНК-белковых сшивок в 8 раз выше, чем для аналогичных доз УФ-В и С. Принимая во внимание, что воздействие УФ-А на клетки в основном опосредовано фотосенсибилизацией с участием клеточных хромофоров, можно

предположить, что образование ДНК-белковых сшивок является существенным механизмом повреждения ДНК при фотосенсибилизации. Аналогичные данные получены авторами также для одноцепочечных разрывов.

Продукты реакций перекисного окисления белков также могут при реакции с ДНК приводить к образованию ДНК-белковых сшивок [78]. Хелатирование ионов переходных металлов уменьшает частоту возникновения сшивок. Однако механизм взаимодействия продуктов перекисного окисления белков с ДНК до конца не изучен.

Кроме того, продукты, возникающие при повреждении ДНК, например, после апуринизации (2'- дезоксирибонолактон), также могут взаимодействовать с белками с образованием ДНК-белковых сшивок [79].

Как упоминалось ранее, пероксид водорода, продукт дисмутации супероксид анион радикала клеточным ферментом супероксиддисмутазой также может вызывать повреждение ДНК в ходе реакции по механизму Фентона. При этом, добавление ДМСО, тушителя гидроксильного радикала, снижает частоту возникновения одноцепочечных разрывов и хромосомных аберраций при обработке клеток пероксидом водорода [80]. Освобождение ДНК от ионов переходных металлов путем диализа с хелатированием позволяло устранить эффект Н202. В клетках млекопитающих число одноцепочечных разрывов существенно больше для Н202, чем для дозы рентгеновского облучения с эквивалентной токсичностью [81]. Для протекания реакции Фентона необходимо, чтобы железо находилось в низшей степени окисления:

Fe2+ + Н202 Fe3+ + 'ОН + ОН" (5)

После того, как все Fe2+ использовано, реакция должна остановиться. Однако, в клеточных системах этого не происходит. Предполагается, что Fe3+ медленно восстанавливается пероксидом водорода.

Fe3+ + Н202 -> Fe2+ + Н02' + Н+ (6)

In vitro скорость реакции (6) очень мала [82], но в клетках ионы переходных металлов могут быть восстановлены клеточными восстанавливающими агентами, например, аскорбатом или любым другим сильным восстановителем, образующимся в ходе метаболических процессов. Косвенным подтверждением такого механизма служит тот факт, что споры, в которых метаболические процессы отсутствуют, повреждаются пероксидом водорода только при высоких температурах.

Помимо реакции Фентона, Н202 может также окислять азотистые

п

основания. Например, аденин окисляется с образованием N -оксида [83].

Гидроперекиси, образовавшиеся в результате автоокисления липидов, также способны реагировать с ДНК с образованием одно- и двуцепочечных разрывов.

Клеточный ответ на повреждение ДНК

Сеерочные точки клеточного цикла

Сверочными точками называются биохимические пути, которые приводят к замедлению или приостановке протекания клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК [84]. В последнее время термин «сверочная точка» приобрел более широкое значение, как совокупность всех клеточных процессов, запускаемых в ответ на повреждение ДНК - остановка клеточного цикла, репарация ДНК и апоптоз. Однако, репарация происходит и в отсутствии активации сверочных точек, а апоптоз может запускаться независимо от клеточного цикла. Следовательно, термин «сверочная точка, контролирующая повреждение ДНК» должен применяться только в отношении событий, ответственных за остановку или замедление протекания клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК. Сверочные точки не являются «механизмами пограничного контроля» на этапах перехода между фазами клеточного цикла. Они функционируют непрерывно, оценивая целостность генома, и соответственно контролируя протекание клеточного цикла [85]. Клеточный цикл эукариотической клетки состоит из 4 фаз внутри цикла (Gl, S, G2, М), и одной фазы вне цикла - GO. В норме, переход между фазами строго контролируется теми же белками, которые участвуют в функционировании сверочных точек. Следовательно, сверочные точки являются не какими-то уникальными путями, активируемыми в ответ на повреждение ДНК, а путями, которые функционируют также и в норме, однако повреждение ДНК вызывает существенное усиление их сигнала.

Существуют сверочные точки, которые ингибируют переход G1/S, сверочная точка, контролирующая повреждение ДНК в S-фазе, а также сверочная точка перехода от G2 к М.

Как и любые другие пути внутриклеточной передачи сигнала, сверочные точки включают 3 основных типа компонентов: сенсоры, передатчики сигнала и эффекторы. Компоненты разных сверочных точек могут частично пересекаться, например, белок ATM, в одних путях функционирующий как сенсор, а в других как компонент передачи сигнала. При этом молекулы-сенсоры повреждений ДНК едины для всех сверочных точек, однако соотношение их вклада различно для разных сверочных точек [86].

Уникальными компонентами сверочных точек являются молекулы -эффекторы [87]. Их роль заключается в дефосфорилировании циклин-

зависимых киназ, которые непосредственно участвуют в осуществлении переходов между фазами клеточного цикла [88].

^ ДНК

AW

Повреждение

ЩЩШ1Ш

ATR ATRIP ig ATM Сенсорь

claipin 55р -ES1 Шттт

/ >

сш шт Передача

сигнала

I

р53

: :

Эффекторы

G1 . S --G2 -- М

Рис. 2 Компоненты сверочных точек, контролирующих повреждения ДНК, в клетках человека (по [86]).

Сверочная точка G1/S

Сверочная точка G1/S предотвращает переход в S-фазу в присутствии повреждено ДНК, ингибируя инициацию репликации. Переход к S-фазе становится неизбежен после прохождения определенной временной точки, которая в человеческих клетках примерно на 2 часа предшествует собственно началу синтеза ДНК. Однако, если в клетке присутствуют повреждения ДНК, переход к S-фазе тормозится независимо от того, пройдена ли уже «точка невозврата», или нет. В ответ на повреждение ДНК активируется киназа ATM и фосфорилирует множество субстратов, важнейшими из которых являются р53 и Chk2. В результате активируются 2 пути, результатом которых является остановка клеточного цикла на границе G1/S [88]. Первый, быстрый, вызывает

фосфоршшрование и инактивацию Chk2, что, в свою очередь препятствует активации Cdc45 и инициации репликации ДНК. Второй, более медленный путь приводит к длительной р53-зависимой остановке клеточного цикла.

Повышение уровня р53 в ответ на повреждения ДНК вызывает апоптоз в клетках кожи, в тимоцитах [89] и в клетках кишечного эпителия [90]. Хемотераиевтические агенты или нарушения регуляции клеточного цикла вследствие конститутивной экспрессии транскрипционного фактора EIIF , аденовирусного белка Е1А или гиперэкспрессия с-тус также вызывает р53-зависимый апоптоз.

Однако, по-видимому, р53 индуцирует только специфические виды апоптоза, вызванные сильными повреждениями ДНК или нарушением регуляцией клеточного цикла. Так, обработка клеток глюкокортикоидами вызывает апоптоз как в тимоцитах из р53 +/+, так и р53 -/- мышей [89].

Сверочная точки S-фазы

Сверочная точка S-фазы активируется повреждениями ДНК, полученными в S-фазе цикла, или нерепарировэнными повреждениями, которые не попали под контроль сверочной точки G1/S, Преимущественным механизмом данной сверочной точки является ипгибирование поздних точек инициации репликации [91]. Белки ATM, BRCA1 и 2 связываются с поврежденной ДНК и участвуют в ее репарации, но в то же время активируют сверочную точку посредством каскада сигнальных событий. На данный момент считается, что функционирование сверочной точки S-фазы обеспечивается двумя путями. Первый, хорошо изученный, включает уже упомянутые белки ATM, Chk2, Cdc25A, Cdk2. Второй, который зависит от фосфорилирования когезина SMC1 киназой ATM, активирует репарационные процессы при посредстве когезинов SMC1 и SMC3 [92].

шшшш

атм

н2ах "^пг 53вр1

щ5с1

СИк2 1

/ | X

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Серебровская, Екатерина Олеговна

Выводы

1. Разработан полностью генетически кодируемый ммунофотосенсибилизатор, содержащий в качестве нацеливающего домена анти-НЕК2/пеи-миниантитело 4D5, а в качестве эффекторного домена фотосенсибилизатор KillerRed. Показано специфическое связывание белка 4D5-KillerRed-His5 с опухолевыми клетками, гиперэкспрессирующими опухолевый маркер HER2/neu.

2. Полученный рекомбинантный белок обладает избирательной фототоксичностью по отношению к опухолевым клеткам, гиперэкспрессирующим опухолевый маркер HER2/neu.

3. Разработана стратегия фотоиндуцируемого воздействия на скорость пролиферации клеток эукариот с помощью гибридного белка H2B-tKR на основе генетически кодируемого фотосенсибилизатора KillerRed. Показано снижение скорости пролиферации культуры клеток, временно или стабильно экспрессирующих H2B-ÍKT, при облучении зеленым светом.

4. Обнаружено, что облучение зеленым светом вызывает повреждение геномной ДНК интерфазных клеток, экспрессирующих H2B-tKR. В то же время, облучение метафазных клеток вызывает нарушение прохождения митоза и нерасхождение хромосом независимо от активации сверочной точки сборки веретена деления.

5. H2B-ÍKR является перспективным инструментом для исследования роли специфических клеточных популяций в процессе эмбриогенеза in vivo, а также для изучения механизмов регуляции митоза и мейоза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Serebrovskaya Е.О., Edelweiss E.F., Stremovskiy О.А., Lukyanov K.A., Chudakov D.M., and Deyev S.M. Targeting cancer cells by using an antireceptor antibody-photosensitizer fusion protein. PNAS 2009, 23, 9221-9225

2. Lukyanov K.A., Serebrovskaya E.O., Lukyanov S., Chudakov D.M. Fluorescent proteins as light-inducible photochemical partners. Photochem Photobiol Sci. 2010, 9, 1301-1306

3. E. О. Серебровская, О. А. Стремовский, Д. M. Чудаков, К. А. Лукьянов, С. М. Деев, Генетически кодируемый иммунофотосенсибилизатор. Биоорг. химия, (2011)

4. Ekaterina О Serebrovskaya, Tatiana V Gorodnicheva, Galina V Ermakova, Elena A. Solovieva, George V Sharonov, Elena V Zagaynova, Dmitriy Mihaylovich Chudakov, Sergey Lukyanov, Andrey G Zaraisky and Konstantin A Lukyanov, Light-induced blockage of cell division with a chromatin-targeted phototoxic fluorescent protein. Biochem. J. (2011)

Тезисы докладов на конференциях

1. Детекция маркера опухолей р 185HER2/neu на клетках человеческой аденокарциномы яичника SKOV-3 с помощью белка слияния анти-р185-Ш112/пеи-мини-антитело-КШег1^. Е. Акципетрова, Э. Эдельвейс, О. Стремовский, С. М. Деев. XIX Международная зимняя школа молодых ученых «Перспективные направления биохимии, биофизики, молекулярной биологии и биотехнологии» (2007, ИБХ РАН, Москва, Россия)

2. Визуализация клеток человеческой аденокарциномы яичника SKOV-3, гиперэкспрессирующих онкомаркер HER2/neu, с помощью рекмбинантного белка анти-НЕК-2/КЕи-мини-антитело-КШег1^. Е. Акципетрова, Э. Эдельвейс, О. Стремовский, Д. Чудаков, К. Лукьянов, С. М. Деев. XI Общероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2007, Санкт-Петербург, Россия), с. 113.

3. Chromatin-targeted phototoxic fluorescent protein blocks cell division. Ekaterina O. Serebrovskaya, Tatiana V. Gorodnicheva, Galina V. Ermakova, Elena A. Solovieva, George V. Sharonov, Sergey Lukyanov, Andrey G. Zaraisky, Konstantin A. Lukyanov. Международная конференция молодых ученых по биологическим наукам. (2010, Неймеген, Нидерланды), с. 78-79

4. Повышение эффективности генетически кодируемого фотосенсибилизатора KillerRed и создание на его основе инструмента для ингибирования клеточного деления с помощью света. Е.О.Серебровская, С.А.Лукьянов. Фундаментальная наука для биологии и медицины (2010, Москва)

Заключение

В данной работе были предложены методы использования фототоксического флуоресцентного белка KillerRed как молекулярного инструмента для воздействия на жизнеспособность и скорость пролиферации эукариотических клеток.

Во-первых, в данной работе был впервые создан полностью генетически кодируемый иммунофотосенсибилизатор. По сравнению с химическими фотосенсибилизаторами, генетически кодируемый фотосенсибилизатор обладает рядом преимуществ. Например, открывается возможность более воспроизводимой биотехнологической наработки, а также получения иммунофотосенсибилизатора с однозначно определенным соотношением антител о/фотосенсибилизатор. В то же время, его низкая, по сравнению с химическими фотосенсибилизаторами, фототоксичность является недостатком и требует дальнейшего улучшения свойств самого фотосенсибилизатора.

Во-вторых, были детально исследованы фототоксические эффекты при внутриклеточной экспрессии фотосенсибилизатора KillerRed в различных субклеточных локализациях. Было обнаружено, что ядро является наиболее чувствительным к фотодинамическому воздействию компартментом клетки. Так, KillerRed в составе белка слияния с гистоном Н2В позволяет достичь снижения скорости пролиферации клеточной культуры при интенсивностях света, на порядок более низких, чем в остальных случаях. Было показано, что задержка деления клеток, экспрессирующих ШВ-tKR, под воздействием зеленого света обусловлена повреждением геномной ДНК. Было также показано, что облучение эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus laevis, тканеспецифично экспрессирующих H2B-tKR, может вызывать ожидаемые нарушения развития данных тканей ш vivo. Следовательно, тканеспецифическая экспрессия химерного белка H2B-tKR может быть уникальным инструментом для исследования роли пространственно-временных факторов дифференциации для нормального эмбрионального развития. Кроме того, H2B-tKR может быть мощным оптогенетическим инструментом для исследования протекания митоза и мейоза как таковых.

Наконец, для KillerRed, локализованного на поверхности лизосом, было показано, что фототоксический эффект обусловлен попаданием в цитоплазму лизосомных катепсинов, вызывающих активацию эффекторной каспазы 3 и последующий апоптоз. Данная локализация KillerRed может давать преимущество в случае, если опухолевые клетки характеризуются повышенной экспрессией катепсинов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Серебровская, Екатерина Олеговна, 2011 год

Список литературы

1 Миронов АФ (1996) Фотодинамическая терапия рака - новый эффективный

метод диагностики и лечения злокачественных опухолей. Соросоеский образовательный журнал, 32-40.

2 Castaño a, Demidova Т & Hamblin М (2004) Mechanisms in photodynamic

therapy: part one. photosensitizers, photochemistry and cellular localization. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy 1, 279-293.

3 Bilski P, Motten AG, Bilska M & Chignell CF (1993) The photooxidation of

diethylhydroxylamine by rose bengal in micellar and nonmicellar aqueous solutions. Photochemistry andphotobiology 58, 11-8.

4 Gruñe T, Klotz LO, Gieche J, Rudeck M & Sies H (2001) Protein oxidation and

proteolysis by the nonradical oxidants singlet oxygen or peroxynitrite. Free radical biology & medicine 30, 1243-53.

5 Midden WR & Dahl ТА (1992) Biological inactivation by singlet oxygen:

distinguishing 02(1 delta g) and 02(1 sigma g+). Biochimica et biophysica acta 1117,216-22.

6 Bachowski GJ, Pintar TJ & Girotti AW (1991) Photosensitized lipid peroxidation

and enzyme inactivation by membrane-bound merocyanine 540: reaction mechanisms in the absence and presence of ascorbate. Photochemistry and photobiology 53, 481-91.

7 Bachowski GJ, Korytowski W & Girotti AW (1994) Characterization of lipid

hydroperoxides generated by photodynamic treatment of leukemia cells. Lipids 29,449-59.

8 Buchko GW, Wagner JR, Cadet J, Raoul S & Weinfeld M (1995) Methylene blue-

mediated photooxidation of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine. Biochimica et biophysica acta 1263, 17-24.

9 Moan J & Berg К (1991) The photodegradation of porphyrins in cells can be used

to estimate the lifetime of singlet oxygen. Photochemistry and photobiology 53, 549-53.

10 Lockshin RA & Zakeri Z (2004) Apoptosis, autophagy, and more. The

international journal of biochemistry & cell biology 36, 2405-19.

11 Schweichel JU & Merker HJ (1973) The morphology of various types of cell death in prenatal tissues. Teratology 7, 253-66.

12 Edinger AL & Thompson CB (2004) Death by design: apoptosis, necrosis and

autophagy. Current opinion in cell biology 16, 663-9.

13 Kessel D, Luo Y, Deng Y & Chang CK (1997) The role of subcellular localization

in initiation of apoptosis by photodynamic therapy. Photochemistry and photobiology 65, 422-6.

14 Varnes ME, Chiu SM, Xue LY & Oleinick NL (1999) Photodynamic therapy-

induced apoptosis in lymphoma cells: translocation of cytochrome c causes inhibition of respiration as well as caspase activation. Biochemical and biophysical research communications 255, 673-9.

15 Fickweiler S, Abels C, Karrer S, Baumler W, Landthaler M, Hofstadter F &

Szeimies RM (1999) Photosensitization of human skin cell lines by ATMPn (9-acetoxy-2,7,12,17-tetrakis-(beta-methoxyethyl)-porphycene) in vitro: mechanism of action. Journal ofphotochemistry and photobiology. B, Biology 48, 27-35.

16 Kessel D, Luo Y, Mathieu P & Reiners JJ (2000) Determinants of the apoptotic

response to lysosomal photodamage. Photochemistry and photobiology 71, 196200.

17 Kirveliene V, Sadauskaite A, Kadziauskas J, Sasnauskiene S & Juodka B (2003)

Correlation of death modes of photosensitized cells with intracellular ATP concentration. FEBS letters 553, 167-72.

18 Fabris C, Valduga G, Miotto G, Borsetto L, Jori G, Garbisa S & Reddi E (2001)

Photosensitization with zinc (II) phthalocyanine as a switch in the decision between apoptosis and necrosis. Cancer research 61, 7495-500.

19 Lamkanfi M, Declercq W, Kalai M, Saelens X & Vandenabeele P (2002) Alice in

caspase land. A phylogenetic analysis of caspases from worm to man. Cell death and differentiation 9, 358-61.

20 Desagher S, Osen-Sand A, Nichols A, Eskes R, Montessuit S, Lauper S,

Maundrell K, Antonsson B & Martinou JC (1999) Bid-induced conformational change of Bax is responsible for mitochondrial cytochrome c release during apoptosis. The Journal of cell biology 144, 891-901.

21 Oleinick NL & Evans HH (1998) The photobiology of photodynamic therapy:

cellular targets and mechanisms. Radiation research 150, S146-56.

22 Almeida RD, Gomes ER, Carvalho AP & Duarte CB (2004) Calpains are

activated by photodynamic therapy but do not contribute to apoptotic tumor cell death. Cancer letters 216, 183-9.

23 Rasola A & Bernardi P (2007) The mitochondrial permeability transition pore and

its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis : an international journal on programmed cell death 12, 815-33.

24 Dougherty TJ, Gomer CJ, Henderson BW, Jori G, Kessel D, Korbelik M, Moan J

& Peng Q (1998) Photodynamic therapy. Journal of the National Cancer Institute 90, 889-905.

25 Furre IE, Shahzidi S, Luksiene Z, Moller MTN, Borgen E, Morgan J, Tkacz-

Stachowska K, Nesland JM & Peng Q (2005) Targeting PBR by hexaminolevulinate-mediated photodynamic therapy induces apoptosis through translocation of apoptosis-inducing factor in human leukemia cells. Cancer research 65, 11051-60.

26 Kessel D, Antolovich M & Smith KM (2001) The role of the peripheral

benzodiazepine receptor in the apoptotic response to photodynamic therapy. Photochemistry andphotobiology 74, 346-9.

27 Buytaert E, Callewaert G, Hendrickx N, Scorrano L, Hartmann D, Missiaen L,

Vandenheede JR, Heirman I, Grooten J & Agostinis P (2006) Role of endoplasmic reticulum depletion and multidomain proapoptotic BAX and BAK proteins in shaping cell death after hypericin-mediated photodynamic therapy. The FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 20, 756-8.

28 Chaloupka R, Petit PX, Israel N & Sureau F (1999) Over-expression of Bcl-2 does

not protect cells from hypericin photo-induced mitochondrial membrane depolarization, but delays subsequent events in the apoptotic pathway. FEBS letters 462, 295-301.

29 Oleinick NL, Morris RL & Belichenko I (2002) The role of apoptosis in response

to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochemical & photobiological sciences : Official journal of the European Photochemistry Association and the European Society for Photobiology 1, 1-21.

30 Buytaert E, Dewaele M & Agostinis P (2007) Molecular effectors of multiple cell

death pathways initiated by photodynamic therapy. Biochimica et biophysica acta 1776, 86-107.

31 Kessel D, Vicente MGH & Reiners JJ Initiation of apoptosis and autophagy by

photodynamic therapy. Autophagy 2, 289-90.

32 Almeida RD, Manadas BJ, Carvalho AP & Duarte CB (2004) Intracellular

signaling mechanisms in photodynamic therapy. Biochimica et biophysica acta 1704, 59-86.

33 Moor AC (2000) Signaling pathways in cell death and survival after

photodynamic therapy. Journal of photochemistry andphotobiology. B, Biology 57, 1-13.

34 Chernyak BV, Izyumov DS, Lyamzaev KG, Pashkovskaya AA, Pletjushkina OY,

Antonenko YN, Sakharov DV, Wirtz KWA & Skulachev VP Production of reactive oxygen species in mitochondria of HeLa cells under oxidative stress. Biochimica et biophysica acta 1757, 525-34.

35 Matroule JY, Carthy CM, Granville DJ, Jolois O, Hunt DW & Piette J (2001)

Mechanism of colon cancer cell apoptosis mediated by pyropheophorbide-a methylester photosensitization. Oncogene 20, 4070-84.

36 Linder S & Shoshan MC (2005) Lysosomes and endoplasmic reticulum: targets

for improved, selective anticancer therapy. Drug resistance updates : reviews and commentaries in antimicrobial and anticancer chemotherapy 8, 199-204.

37 Geze M, Morliere P, Maziere JC, Smith KM & Santus R (1993) Lysosomes, a key

target of hydrophobic photosensitizers proposed for photochemotherapeutic applications. Journal ofphotochemistry and photobiology. B, Biology 20, 23-35.

38 Brunk UT, Dalen H, Roberg K & Hellquist HB (1997) Photo-oxidative disruption

of lysosomal membranes causes apoptosis of cultured human fibroblasts. Free radical biology & medicine 23, 616-26.

39 Roberg K & Ollinger K (1998) Oxidative stress causes relocation of the lysosomal

enzyme cathepsin D with ensuing apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes. The American journal ofpathology 152, 1151-6.

40 Roberg K, Johansson U & Ollinger K (1999) Lysosomal release of cathepsin D

precedes relocation of cytochrome c and loss of mitochondrial transmembrane potential during apoptosis induced by oxidative stress. Free radical biology & medicine 27, 1228-37.

41 Cirman T, Oresic K, Mazovec GD, Turk V, Reed JC, Myers RM, Salvesen GS &

Turk B (2004) Selective disruption of lysosomes in HeLa cells triggers apoptosis mediated by cleavage of Bid by multiple papain-like lysosomal cathepsins. The Journal of biological chemistry 279, 3578-87.

42 Roberg K, Kagedal K & Ollinger K (2002) Microinjection of cathepsin d induces

caspase-dependent apoptosis in fibroblasts. The American journal ofpathology 161, 89-96.

43 Saelens X, Festjens N, Vande Walle L, van Gurp M, van Loo G & Vandenabeele

P (2004) Toxic proteins released from mitochondria in cell death. Oncogene 23, 2861-74.

44 Conus S, Perozzo R, Reinheckel T, Peters C, Scapozza L, Yousefi S & Simon fi-

ll (2008) Caspase-8 is activated by cathepsin D initiating neutrophil apoptosis during the resolution of inflammation. The Journal of experimental medicine 205, 685-98.

45 Guicciardi ME, Leist M & Gores GJ (2004) Lysosomes in cell death. Oncogene

23,2881-90.

46 Leist M & Jaattela M (2001) Four deaths and a funeral: from caspases to

alternative mechanisms. Nature reviews. Molecular cell biology 2, 589-98.

47 Bidere N, Lorenzo HK, Carmona S, Laforge M, Harper F, Dumont C & Senik A

(2003) Cathepsin D triggers Bax activation, resulting in selective apoptosis-inducing factor (AIF) relocation in T lymphocytes entering the early commitment phase to apoptosis. The Journal of biological chemistry 278, 31401 -11.

48 Yu S-W, Wang H, Poitras MF, Coombs C, Bowers WJ, Federoff HJ, Poirier GG,

Dawson TM & Dawson VL (2002) Mediation of poly(ADP-ribose) polymerase-1 -dependent cell death by apoptosis-inducing factor. Science (New York, N. Y.) 297,259-63.

49 Caruso JA, Mathieu PA, Joiakim A, Leeson B, Kessel D, Sloane BF & Reiners JJ

(2004) Differential susceptibilities of murine hepatoma lclc7 and Tao cells to the lysosomal photosensitizerNPe6: influence of aryl hydrocarbon receptor on lysosomal fragility and protease contents. Molecular pharmacology 65,1016-28.

50 Reiners JJ, Caruso JA, Mathieu P, Chelladurai B, Yin X-M & Kessel D (2002)

Release of cytochrome c and activation of pro-caspase-9 following lysosomal photodamage involves Bid cleavage. Cell death and differentiation 9, 934-44.

51 Ichinose S, Usuda J, Hirata T, Inoue T, Ohtani K, Maehara S, Kubota M, Imai K,

Tsunoda Y, Kuroiwa Y, Yamada K, Tsutsui H, Furukawa K, Okunaka T, Oleinick NL & Kato H (2006) Lysosomal cathepsin initiates apoptosis, which is regulated by photodamage to Bcl-2 at mitochondria in photodynamic therapy using a novel photosensitizer, ATX-slO (Na). International journal of oncology 29, 349-55.

52 Ellgaard L, Molinari M & Helenius A (1999) Setting the standards: quality control

in the secretory pathway. Science (New York, N.Y.) 286, 1882-8.

53 Lee AS (2001) The glucose-regulated proteins: stress induction and clinical

applications. Trends in biochemical sciences 26, 504-10.

54 Chen X, Ding Y, Liu C-G, Mikhail S & Yang CS (2002) Overexpression of

glucose-regulated protein 94 (Grp94) in esophageal adenocarcinomas of a rat surgical model and humans. Carcinogenesis 23, 123-30.

55 Reddy RK, Mao C, Baumeister P, Austin RC, Kaufman RJ & Lee AS (2003)

Endoplasmic reticulum chaperone protein GRP78 protects cells from apoptosis induced by topoisomerase inhibitors: role of ATP binding site in suppression of caspase-7 activation. The Journal of biological chemistry 278, 20915-24.

56 Haynes CM, Titus EA & Cooper AA (2004) Degradation of misfolded proteins

prevents ER-derived oxidative stress and cell death. Molecular cell 15, 767-76.

57 Urano F, Bertolotti A & Ron D (2000) IRE1 and efferent signaling from the

endoplasmic reticulum. Journal of cell science 113 Pt 21, 3697-702.

58 Mandic A, Hansson J, Linder S & Shoshan MC (2003) Cisplatin induces

endoplasmic reticulum stress and nucleus-independent apoptotic signaling. The Journal of biological chemistry 278, 9100-6.

59 Wood DE, Thomas A, Devi LA, Berman Y, Beavis RC, Reed JC & Newcomb

EW (1998) Bax cleavage is mediated by calpain during drug-induced apoptosis. Oncogene 17, 1069-78.

60 Piette J, Volanti C, Vantieghem A, Matroule J-Y, Habraken Y & Agostinis P

(2003) Cell death and growth arrest in response to photodynamic therapy with membrane-bound photosensitizers. Biochemical pharmacology 66, 1651-9.

61 Grebenova D, Kuzelova K, Smetana K, Pluskalova M, Cajthamlova H, Marinov I,

Fuchs O, Soucek J, Jarolim P & Hrkal Z (2003) Mitochondrial and endoplasmic reticulum stress-induced apoptotic pathways are activated by 5-aminolevulinic acid-based photodynamic therapy in HL60 leukemia cells. Journal of photochemistry andphotobiology. B, Biology 69, 71-85.

62 Henderson PT, Armitage B & Schuster GB (1998) Selective photocleavage of

DNA by anthraquinone derivatives: targeting the single-strand region of hairpin structures. Biochemistry 37, 2991-3000.

63 Ito K, Inoue S, Yamamoto K & Kawanishi S (1993) 8-Hydroxydeoxyguanosine

formation at the 5' site of 5'-GG-3' sequences in double-stranded DNA by UV radiation with riboflavin. The Journal of biological chemistry 268, 13221-7.

64 Saito I, Takayama M, Nakamura T, Sugiyama H, Komeda Y & Iwasaki M (1995)

The most electron-donating sites in duplex DNA: guanine-guanine stacking rule. Nucleic acids symposium series, 191-2.

65 Breslin DT, Yu C, Ly D & Schuster GB (1997) Structural modification changes

the DNA binding mode of cation-substituted anthraquinone photonucleases: association by intercalation or minor groove binding determines the DNA cleavage efficiency. Biochemistry 36, 10463-73.

66 Von Sonntag J, Mvula E, Hildenbrand K & Von Sonntag C (2004)

Photohydroxylation of 1,4-benzoquinone in aqueous solution revisited.

Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany) 10, 440-51.

67 Muñoz F, Mvula E, Braslavsky SE & von Sonntag C (2001) Singlet dioxygen

formation in ozone reactions in aqueous solution. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2, 1109-1116.

68 Land EJ & Swallow AJ (1969) One-electron reactions in biochemical systems as

studied by pulse radiolysis. II. Riboflavin. Biochemistry 8, 2117-25.

69 Vaish SP & Tollin G (1971) Flash photolysis of flavins. V. Oxidation and

disproportionation of flavin radicals. Journal of bioenergetics 2, 61-72.

70 Delatour T, Douki T, Gasparutto D, Brochier MC & Cadet J (1998) A novel

vicinal lesion obtained from the oxidative photosensitization of TpdG: characterization and mechanistic aspects. Chemical research in toxicology 11, 1005-13.

71 Nguyen,Kim L DNA-Protein Cross-Linking from Oxidation of Guanine via the

Flash-Quench Technique. Journal of the American Chemical Society 122, 3585 -3594.

72 Ohnishi T, Mori E & Takahashi A (2009) DNA double-strand breaks: their

production, recognition, and repair in eukaryotes. Mutation research 669, 8-12.

73 Wagenknecht HA, Rajski SR, Pascaly M, Stemp ED & Barton JK (2001) Direct

observation of radical intermediates in protein-dependent DNA charge transport. Journal of the American Chemical Society 123, 4400-7.

74 Wagenknecht HA, Stemp ED & Barton JK (2000) DNA-Bound peptide radicals

generated through DNA-mediated electron transport. Biochemistry 39, 5483-91.

75 Ramakrishnan N, Clay ME, Xue LY, Evans HH, Rodriguez-Antunez A &

OleinickNL (1988) Induction of DNA-protein cross-links in Chinese hamster cells by the photodynamic action of chloroaluminum phthalocyanine and visible light. Photochemistry andphotobiology 48, 297-303.

76 Villanueva A, Cañete M, Trigueros C, Rodríguez-Borlado L & Juarranz A (1993)

Photodynamic induction of DNA-protein cross-linking in solution by several sensitizers and visible light. Biopolymers 33,239-44.

77 Peak JG & Peak MJ (1991) Comparison of initial yields of DNA-to-protein

crosslinks and single-strand breaks induced in cultured human cells by far- and near-ultraviolet light, blue light and X-rays. Mutation research 246, 187-91.

78 Luxford C, Morin B, Dean RT & Davies MJ (1999) Histone HI - and other

protein- and amino acid-hydroperoxides can give rise to free radicals which oxidize DNA. The Biochemical journal 344 Pt 1, 125-34.

79 Hashimoto M, Greenberg MM, Kow YW, Hwang JT «fe Cunningham RP (2001)

The 2-deoxyribonolactone lesion produced in DNA by neocarzinostatin and other damaging agents forms cross-links with the base-excision repair enzyme endonuclease III. Journal of the American Chemical Society 123, 3161-2.

80 Oya Y, Yamamoto K & Tonomura A (1986) The biological activity of hydrogen

peroxide. I. Induction of chromosome-type aberrations susceptible to inhibition by scavengers of hydroxyl radicals in human embryonic fibroblasts. Mutation research 172, 245-53.

81 Bradley MO & Erickson LC (1981) Comparison of the effects of hydrogen

peroxide and x-ray irradiation on toxicity, mutation, and DNA damage/repair in mammalian cells (V-79). Biochimica et biophysica acta 654, 135-41.

82 Henle ES, Luo Y & Linn S (1996) Fe2+, Fe3+, and oxygen react with DNA-

derived radicals formed during iron-mediated Fenton reactions. Biochemistry 35, 12212-9.

83 Rhaese HJ (1968) Chemical analysis of DNA alterations. 3. Isolation and

characterization of adenine oxidation products obtained from oligo- and monodeoxyadenylic acids treated with hydroxyl radicals. Biochimica et biophysica acta 166, 311-26.

84 Nyberg KA, Michelson RJ, Putnam CW & Weinert TA (2002) Toward

maintaining the genome: DNA damage and replication checkpoints. Annual review of genetics 36, 617-56.

85 Nasmyth K (1996) Viewpoint: putting the cell cycle in order. Science (New York,

N.Y.) 274, 1643-5.

86 Sancar A, Lindsey-Boltz LA, Unsal-Ka9maz K & Linn S (2004) Molecular

mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Annual review of biochemistry 73, 39-85.

87 Alcasabas AA, Osborn AJ, Bachant J, Hu F, Werler PJ, Bousset K, Furuya K,

Diffley JF, Carr AM & Elledge SJ (2001) Mrcl transduces signals of DNA replication stress to activate Rad53. Nature cell biology 3, 958-65.

88 Bartek J & Lukas J (2001) Mammalian Gl- and S-phase checkpoints in response

to DNA damage. Current opinion in cell biology 13, 738-47.

89 Lowe SW, Schmitt EM, Smith SW, Osborne BA & Jacks T (1993) p53 is required

for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes. Nature 362, 847-9.

90 Merritt AJ, Potten CS, Kemp CJ, Hickman JA, Balmain A, Lane DP & Hall PA

(1994) The role of p53 in spontaneous and radiation-induced apoptosis in the gastrointestinal tract of normal and p53-deficient mice. Cancer research 54, 6147.

91 Painter RB & Young BR (1980) Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new

explanation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 77, 7315-7.

92 Kim S-T, Xu B & Kastan MB (2002) Involvement of the cohesin protein, Smcl,

in Atm-dependent and independent responses to DNA damage. Genes & development 16, 560-70.

93 Erenpreisa J, Ivanov A, Wheatley SP, Kosmacek EA, Ianzini F, Anisimov AP,

Mackey M, Davis PJ, Plakhins G & Illidge TM (2008) Endopolyploidy in irradiated p53-deficient tumour cell lines: persistence of cell division activity in giant cells expressing Aurora-B kinase. Cell biology international 32, 1044-56.

94 Rudner AD & Murray AW (1996) The spindle assembly checkpoint. Current opinion in cell biology 8, 773-80.

95 Cahill DP, Lengauer C, Yu J, Riggins GJ, Willson JK, Markowitz SD, Kinzler

KW & Vogelstein B (1998) Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature 392, 300-3.

96 Tinker-Kulberg RL & Morgan DO (1999) Pdsl and Espl control both anaphase

and mitotic exit in normal cells and after DNA damage. Genes & development 13, 1936-49.

97 Mikhailov A, Cole RW & Rieder CL (2002) DNA damage during mitosis in

human cells delays the metaphase/anaphase transition via the spindle-assembly checkpoint. Current biology : CB12, 1797-806.

98 Wiseman H & Halliwell B (1996) Damage to DNA by reactive oxygen and

nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. The Biochemical journal 313 ( Pt 1, 17-29.

99 Akhlynina TV, Jans D a, Rosenkranz a a, Statsyuk NV, Balashova IY, Toth G,

Pavo I, Rubin a B & Sobolev a S (1997) Nuclear targeting of chlorin e6 enhances its photosensitizing activity. The Journal of biological chemistry 272, 20328-31.

100 Sobolev AS, Jans DA & Rosenkranz AA (2000) Targeted intracellular delivery of photosensitizers. Progress in biophysics and molecular biology 73, 51-90.

101 Rosenkranz AA, Jans DA & Sobolev AS (2000) Targeted intracellular delivery of photosensitizers to enhance photodynamic efficiency. Immunology and cell biology 78, 452-64.

102 Akhlynina TV, Jans D a, Statsyuk NV, Balashova IY, Toth G, Pavo I, Rosenkranz a a, Naroditsky BS & Sobolev a S (1999) Adenoviruses synergize with nuclear localization signals to enhance nuclear delivery and photodynamic action of internalizable conjugates containing chlorin e6. International journal of cancer. Journal international du cancer 81, 734-40.

103 Rosenkranz AA, Lunin VG, Gulak PV, Sergienko OV, Maria A, Voronina OL, Gilyazova DG, John AP, Kofner AA, Mironov AF, Jans DA & Sobolev AS (2003) activity. The FASEB Journal.

104 De Nardo GL, De Nardo SJ, Miyao NP, Mills SL, Peng JS, O'Grady LF, Epstein AL & Young WC Non-dehalogenation mechanisms for excretion of radioiodine after administration of labeled antibodies. The International journal of biological markers 3, 1-9.

105 Maloney DG, Liles TM, Czerwinski DK, Waldichuk C, Rosenberg J, Grillo-Lopez A & Levy R (1994) Phase I clinical trial using escalating single-dose

infusion of chimeric anti-CD20 monoclonal antibody (IDEC-C2B8) in patients with recurrent B-cell lymphoma. Blood 84, 2457-66.

106 Emens LA Trastuzumab: targeted therapy for the management of HER-2/neu-overexpressing metastatic breast cancer. American journal of therapeutics 12, 243-53.

107 Welt S, Divgi CR, Scott AM, Garin-Chesa P, Finn RD, Graham M, Carswell EA, Cohen A, Larson SM & Old LJ (1994) Antibody targeting in metastatic colon cancer: a phase I study of monoclonal antibody F19 against a cell-surface protein of reactive tumor stromal fibroblasts. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 12, 1193-203.

108 Posey JA, Khazaeli MB, DelGrosso A, Saleh MN, Lin CY, Huse W & LoBuglio AF (2001) A pilot trial of Vitaxin, a humanized anti-vitronectin receptor (anti alpha v beta 3) antibody in patients with metastatic cancer. Cancer biotherapy & radiopharmaceuticals 16, 125-32.

109 Borghaei H & Schilder RJ (2004) Safety and efficacy of radioimmunotherapy with yttrium 90 ibritumomab tiuxetan (Zevalin). Seminars in nuclear medicine 34,4-9.

110 Albrecht H, Burke PA, Natarajan A, Xiong C-Y, Kalicinsky M, DeNardo GL & DeNardo SJ Production of soluble ScFvs with C-terminal-free thiol for site-specific conjugation or stable dimeric ScFvs on demand. Bioconjugate chemistry 15, 16-26.

111 Nielsen UB, Adams GP, Weiner LM & Marks JD (2000) Targeting of bivalent anti-ErbB2 diabody antibody fragments to tumor cells is independent of the intrinsic antibody affinity. Cancer research 60, 6434-40.

112 Adams GP, Shaller CC, Dadachova E, Simmons HH, Horak EM, Tesfaye A, Klein-Szanto AJP, Marks JD, Brechbiel MW & Weiner LM (2004) A single treatment of yttrium-90-labeled CHX-A"-C6.5 diabody inhibits the growth of established human tumor xenografts in immunodeficient mice. Cancer research 64, 6200-6.

113 Trail PA, Willner D, Lasch SJ, Henderson AJ, Hofstead S, Casazza AM, Firestone RA, Hellstrom I & Hellstrom KE (1993) Cure of xenografted human carcinomas by BR96-doxorubicin immunoconjugates. Science (New York, N.Y.) 261,212-5.

114 Ghetie V, Swindell E, Uhr JW & Vitetta ES (1993) Purification and properties of immunotoxins containing one vs. two deglycosylated ricin A chains. Journal of immunological methods 166, 117-22.

115 Bera TK, Viner J, Brinkmann E & Pastan I (1999) Pharmacokinetics and antitumor activity of a bivalent disulfide-stabilized Fv immunotoxin with improved antigen binding to erbB2. Cancer research 59, 4018-22.

116 De Lorenzo C, Arciello A, Cozzolino R, Palmer DB, Laccetti P, Piccoli R & D'Alessio G (2004) A fully human antitumor immunoRNase selective for ErbB-2-positive carcinomas. Cancer research 64, 4870-4.

117 Kretzschmar T & von Rüden T (2002) Antibody discovery: phage display. Current opinion in biotechnology 13, 598-602.

118 van Dongen GAMS, Visser GWM & Vrouenraets MB (2004) Photosensitizer-antibody conjugates for detection and therapy of cancer. Advanced drug delivery reviews 56, 31-52.

119 de Bree R, Roos JC, Quak JJ, den Hollander W, Wilhelm AJ, van Lingen A, Snow GB & Dongen GA (1995) Biodistribution of radiolabeled monoclonal antibody E48 IgG and F(ab')2 in patients with head and neck cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 1, 277-86.

120 Kellermann SA & Green LL (2002) Antibody discovery: the use of transgenic mice to generate human monoclonal antibodies for therapeutics. Current opinion in biotechnology 13, 593-7.

121 Skelton D, Satake N & Kohn DB (2001) The enhanced green fluorescent protein (eGFP) is minimally immunogenic in C57BL/6 mice. Gene therapy 8, 1813-4.

122 LeSauteur L, Cheung NK, Lisbona R & Saragovi HU (1996) Small molecule nerve growth factor analogs image receptors in vivo. Nature biotechnology 14, 1120-2.

123 Willuda J, Kubetzko S, Waibel R, Schubiger P a, Zangemeister-Wittke U & Pliickthun a (2001) Tumor targeting of mono-, di-, and tetravalent anti-

pi 85(HER-2) miniantibodies multimerized by self-associating peptides. The Journal of biological chemistry 276,14385-92.

124 Pliickthun A & Pack P (1997) New protein engineering approaches to multivalent and bispecific antibody fragments. Immunotechnology: an international journal of immunological engineering 3, 83-105.

125 Batra SK, Jain M, Wittel UA, Chauhan SC & Colcher D (2002) Pharmacokinetics and biodistribution of genetically engineered antibodies. Current opinion in biotechnology 13, 603-8.

126 Ross JS, Schenkein DP, Pietrusko R, Rolfe M, Linette GP, Stec J, Stagliano NE, Ginsburg GS, Symmans WF, Pusztai L & Hortobagyi GN (2004) Targeted Therapies for Cancer 2004. American Journal of Clinical Pathology 122, 598609.

127 Olafsen T, Kenanova VE, Sundaresan G, Anderson A-L, Crow D, Yazaki PJ, Li L, Press MF, Gambhir SS, Williams LE, Wong JYC, Raubitschek AA, Shively JE & Wu AM (2005) Optimizing radiolabeled engineered anti-pl85HER2 antibody fragments for in vivo imaging. Cancer research 65, 5907-16.

128 Hudziak RM, Schlessinger J & Ullrich A (1987) Increased expression of the putative growth factor receptor pl85HER2 causes transformation and tumorigenesis of NIH 3T3 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 84, 7159-63.

129 Hudziak RM, Lewis GD, Shalaby MR, Eessalu TE, Aggarwal BB, Ullrich A & Shepard HM (1988) Amplified expression of the HER2/ERBB2 oncogene induces resistance to tumor necrosis factor alpha in NIH 3T3 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 85, 5102-6.

130 Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JB, Henner D, Wong WL, Rowland AM, Kotts C, Carver ME & Shepard HM (1992) Humanization of an anti-

pi 85HER2 antibody for human cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89,4285-9.

131 Jung S & Pliickthun A (1997) Improving in vivo folding and stability of a single-chain Fv antibody fragment by loop grafting. Protein engineering 10, 959-66.

132 Cobb LM (1989) Intratumour factors influencing the access of antibody to tumour cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII28, 235-40.

133 Chatal JF, Saccavini JC, Gestin JF, Thedrez P, Curtet C, Kremer M, Guerreau D, Nolibe D, Fumoleau P & Guillard Y (1989) Biodistribution of indium-111-labeled OC 125 monoclonal antibody intraperitoneally injected into patients operated on for ovarian carcinomas. Cancer research 49, 3087-94.

134 Ramakrishnan N, Oleinick NL, Clay ME, Horng MF, Antunez AR & Evans HH (1989) DNA lesions and DNA degradation in mouse lymphoma L5178Y cells after photodynamic treatment sensitized by chloroaluminum phthalocyanine. Photochemistry andphotobiology 50, 373-8.

135 McMahon KS, Wieman TJ, Moore PH & Fingar VH (1994) Effects of photodynamic therapy using mono-L-aspartyl chlorin e6 on vessel constriction, vessel leakage, and tumor response. Cancer research 54, 5374-9.

136 Fingar VH, Wieman TJ, Karavolos PS, Doak KW, Ouellet R & van Lier JE (1993) The effects of photodynamic therapy using differently substituted zinc phthalocyanines on vessel constriction, vessel leakage and tumor response. Photochemistry andphotobiology 58, 251-8.

137 Krosl G, Korbelik M & Dougherty GJ (1995) Induction of immune cell infiltration into murine SCCVII tumour by photofrin-based photodynamic therapy. British journal of cancer 71, 549-55.

138 Jiang FN, Jiang S, Liu D, Richter A & Levy JG (1990) Development of technology for linking photosensitizers to a model monoclonal antibody. Journal of immunological methods 134, 139-49.

139 Hamblin MR, Miller JL & Hasan T (1996) Effect of charge on the interaction of site-specific photoimmunoconjugates with human ovarian cancer cells. Cancer research 56, 5205-10.

140 Brasseur N, Langlois R, La Madeleine C, Ouellet R & van Lier JE (1999) Receptor-mediated targeting of phthalocyanines to macrophages via covalent coupling to native or maleylated bovine serum albumin. Photochemistry and photobiology 69, 345-52.

141 Robert B, Mach JP, Mani JC, Ychou M, Folli S, Artus JC & Pelegrin a (1996) Cytokine targeting in tumors using a bispecific antibody directed against carcinoembryonic antigen and tumor necrosis factor alpha. Cancer research 56, 4758-65.

142 Vrouenraets MB, Visser GW, Stewart F a, Stigter M, Oppelaar H, Postmus PE, Snow GB & van Dongen G a (1999) Development of meta-tetrahydroxyphenylchlorin-monoclonal antibody conjugates for

photo immunotherapy. Cancer research 59, 1505-13.

143 Del Governatore M, Hamblin MR, Piccinini EE, Ugolini G & Hasan T (2000) Targeted photodestruction of human colon cancer cells using charged 17.1 A chlorin e6 immunoconjugates. British journal of cancer 82, 56-64.

144 Pardridge WM, Bickel U, Buciak J, Yang J, Diagne A & Aepinus C (1994) Cationization of a monoclonal antibody to the human immunodeficiency virus REV protein enhances cellular uptake but does not impair antigen binding of the antibody. Immunology letters 42, 191-5.

145 Allen CM, Sharman WM, La Madeleine C, Weber JM, Langlois R, Ouellet R & van Lier JE (1999) Photodynamic therapy: tumor targeting with adenoviral proteins. Photochemistry andphotobiology 70, 512-23.

146 Gijsens A, Missiaen L, Merlevede W & de Witte P (2000) Epidermal growth factor-mediated targeting of chlorin e6 selectively potentiates its photodynamic activity. Cancer research 60, 2197-202.

147 Del Governatore M, Hamblin MR, Shea CR, Rizvi I, Molpus KG, Tanabe KK & Hasan T (2000) Experimental photoimmunotherapy of hepatic metastases of colorectal cancer with a 17.1 A chlorin(e6) immunoconjugate. Cancer research 60, 4200-5.

148 Pelegrin A, Folli S, Buchegger F, Mach JP, Wagnieres G & van den Bergh H (1991) Antibody-fluorescein conjugates for photoimmunodiagnosis of human colon carcinoma in nude mice. Cancer 67, 2529-37.

149 Folli S, Westermann P, Braichotte D, Pelegrin A, Wagnieres G, van den Bergh H & Mach JP (1994) Antibody-indocyanin conjugates for immunophotodetection of human squamous cell carcinoma in nude mice. Cancer research 54, 2643-9.

150 Vogel CA, Galmiche MC, Westermann P, Sun LQ, Pelegrin A, Folli S, Bischof Delaloye A, Slosman DO, Mach JP & Buchegger F (1996) Carcinoembryonic antigen expression, antibody localisation and immunophotodetection of human colon cancer liver metastases in nude mice: a model for radioimmunotherapy. International journal of cancer. Journal international du cancer 67, 294-302.

151 Gutowski M, Carcenac M, Pourquier D, Larroque C, Saint-Aubert B, Rouanet P & Pelegrin A (2001) Intraoperative immunophotodetection for radical resection of cancers: evaluation in an experimental model. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 7, 1142-8.

152 Soukos NS, Hamblin MR, Keel S, Fabian RL, Deutsch TF & Hasan T (2001) Epidermal growth factor receptor-targeted immunophotodiagnosis and photoimmunotherapy of oral precancer in vivo. Cancer research 61, 4490-6.

153 Mew D, Wat CK, Towers GH & Levy JG (1983) Photoimmunotherapy: treatment of animal tumors with tumor-specific monoclonal antibody-hematoporphyrin conjugates. Journal of immunology (.Baltimore, Md. : 1950) 130, 1473-7.

154 Berki T & Nemeth P (1992) Photo-immunotargeting with haematoporphyrin conjugates activated by a low-power He-Ne laser. Cancer immunology, immunotherapy : CII35, 69-74.

155 Jiang FN, Liu DJ, Neyndorff H, Chester M, Jiang SY & Levy JG (1991) Photodynamic killing of human squamous cell carcinoma cells using a monoclonal antibody-photosensitizer conjugate. Journal of the National Cancer Institute S3, 1218-25.

156 Hemming AW, Davis NL, Dubois B, Quenville NF & Finley RJ (1993) Photodynamic therapy of squamous cell carcinoma. An evaluation of a new photosensitizing agent, benzoporphyrin derivative and new photoimmunoconjugate. Surgical oncology 2, 187-96.

157 Oseroff AR, Ara G, Ohuoha D, Aprille J, Bommer JC, Yarmush ML, Foley J & Cincotta L (1987) Strategies for selective cancer photochemotherapy: antibody-targeted and selective carcinoma cell photolysis. Photochemistry and photobiology 46, 83-96.

158 Chudakov DM, Lukyanov S & Lukyanov KA (2005) Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in biotechnology 23, 605-13.

159 Johnson FH, Shimomura O & Saiga Y (1961) Luminescence Potency of the Cypridina System. Science (New York, N.Y.) 134, 1755-6.

160 Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG & Cormier MJ (1992) Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 111, 229-33.

161 Chalfie M (1995) Green fluorescent protein. Photochemistry and photobiology 62, 651-6.

162 Wang S & Hazelrigg T (1994) Implications for bed mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nature 369, 400-03.

163 Matz MV, Fradkov AF, Labas YA, Savitsky AP, Zaraisky AG, Markelov ML & Lukyanov SA (1999) Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nature biotechnology 17, 969-73.

164 Haddock SHD, Mastroianni N & Christianson LM (2010) A photoactivatable green-fluorescent protein from the phylum Ctenophora. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society 277, 1155-60.

165 Shagin D a, Barsova EV, Yanushevich YG, Fradkov AF, Lukyanov K a, Labas Y a, Semenova TN, Ugalde J a, Meyers A, Nunez JM, Widder E a, Lukyanov S a & Matz MV (2004) GFP-like proteins as ubiquitous metazoan superfamily: evolution of functional features and structural complexity. Molecular biology and evolution 21, 841-50.

166 Deheyn DD, Kubokawa K, McCarthy JK, Murakami A, Porrachia M, Rouse GW & Holland ND (2007) Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. The Biological bulletin 213, 95-100.

167 Alexandrova AY, Arnold K, Schaub S, Vasiliev JM, Meister J-J, Bershadsky AD & Verkhovsky AB (2008) Comparative dynamics of retrograde actin flow and focal adhesions: formation of nascent adhesions triggers transition from fast to slow flow. PloS one 3, e3234.

168 Verkhusha VV & Lukyanov KA (2004) The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. Nature biotechnology 22, 289-96.

169 Remington SJ (2006) Fluorescent proteins: maturation, photochemistry and photophysics. Current opinion in structural biology 16, 714-21.

170 Ormo M, Cubitt AB, Kallio IC, Gross LA, Tsien RY & Remington SJ (1996) Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science (New York, N.Y.) 273, 1392-5.

171 Cody CW, Prasher DC, Westler WM, Prendergast FG & Ward WW (1993) Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein. Biochemistry 32, 1212-8.

172 Gross LA, Baird GS, Hoffman RC, Baldridge KK & Tsien RY (2000) The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 97, 11990-5.

173 Yarbrough D, Wachter RM, Kallio K, Matz MV & Remington SJ (2001) Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 462-7.

174 Tretyakova YA, Pakhomov AA & Martynov VI (2007) Chromophore structure of the kindling fluorescent protein asFP595 from Anemonia sulcata. Journal of the American Chemical Society 129, 7748-9.

175 Yampolsky IV, Remington SJ, Martynov VI, Potapov VK, Lukyanov S & Lukyanov KA (2005) Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata. Biochemistry 44, 5788-93.

176 Ando R, Hama H, Yamamoto-Hino M, Mizuno H & Miyawaki A (2002) An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a

fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 12651-6.

177 Mizuno H, Mal TK, Tong Kl, Ando R, Furuta T, Ikura M & Miyawaki A (2003) Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein. Molecular cell 12, 1051-8.

178 Bulina ME, Chudakov DM, Britanova OV, Yanushevich YG, Staroverov DB, Chepurnykh TV, Merzlyak EM, Shkrob MA, Lukyanov S & Lukyanov KA (2006) A genetically encoded photosensitizer. Nature biotechnology 24, 95-9.

179 Waldeck W, Mueller G, Wiessler M, Brom M, Toth К & Braun К (2009) Autofluorescent proteins as photosensitizer in eukaryontes. International journal of medical sciences 6, 365-73.

180 Bulina ME, Lukyanov KA, Britanova OV, Onichtchouk D, Lukyanov S & Chudakov DM (2006) Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nature protocols 1, 947-53.

181 Pletnev S, GurskayaNG, PletnevaNV, Lukyanov KA, Chudakov DM, Martynov VI, Popov VO, Kovalchuk MV, Wlodawer A, Dauter Z & Pletnev V (2009) Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed. The Journal of biological chemistry 284, 32028-39.

182 Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-5.

183 Mosmann T (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological methods 65, 55-63.

184 Campbell RE, Tour O, Palmer AE, Steinbach P a, Baird GS, Zacharias D a & Tsien RY (2002) A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 7877-82.

185 Jakob B, Splinter J, Conrad S, Voss K-O, Zink D, Durante M, Lôbrich M & Taucher-Scholz G (2011) DNA double-strand breaks in heterochromatin elicit fast repair protein recruitment, histone H2AX phosphorylation and relocation to euchromatin. Nucleic acids research 39, 6489-99.

186 Chang DC, Xu N & Luo KQ (2003) Degradation of cyclin B is required for the onset of anaphase in Mammalian cells. The Journal of biological chemistry 278, 37865-73.

187 Gorr IH, Boos D & Stemmann O (2005) Mutual inhibition of separase and Cdkl by two-step complex formation. Molecular cell 19, 135-41.

188 Martynova NY, Eroshkin FM, Ermolina LV, Ermakova GV, Korotaeva AL, Smurova KM, Gyoeva FK & Zaraisky AG (2008) The LIM-domain protein Zyxin binds the homeodomain factor Xanfl/Hesxl and modulates its activity in the anterior neural plate of Xenopus laevis embryo. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists 237, 736-49.

189 Boya P, Andreau K, Poncet D, Zamzami N, Perfettini J-L, Metivier D, Ojcius DM, Jaattela M & Kroemer G (2003) Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of experimental medicine 197, 1323-34.

190 Bucci C, Thomsen P, Nicoziani P, McCarthy J & van Deurs B (2000) Rab7: a key to lysosome biogenesis. Molecular biology of the cell 11, 467-80.

191 Perez-Alvarez S, Solesio ME, Manzanares J, Jordán J & Galindo MF (2009) Lactacystin requires reactive oxygen species and Bax redistribution to induce mitochondria-mediated cell death. British journal of pharmacology 158, 112130.

192 Droga-Mazovec G, Bojic L, Petelin A, Ivanova S, Romih R, Repnik U, Salvesen GS, Stoka V, Turk V & Turk B (2008) Cysteine cathepsins trigger caspase-dependent cell death through cleavage of bid and antiapoptotic Bcl-2 homologues. The Journal of biological chemistry 283, 19140-50.

Приложение 1. Стратегия выбора регионов (гейтирования) при проточно-цитофлуориметрическом анализе клеточного цикла.

FL3 Lin

А - выделение единичных событий является критическим при анализе клеточного цикла, однако двупараметрическая точечная диаграмма в координатах, соответствующих прямому (FS Lin) и боковому (SS Lin) светорассеянию, не позволяет это сделать.

Б - на двупараметрической точечной диаграмме в координатах, соответствующих интегралу интенсивности флуоресцентного сигнала по времени (FL3 Lin) в линейной шкале и амплитуде флуоресцентного сигнала (AUX) четко выделяется облать, соответствующая единичным событиям (R4).

В - результат последовательного применения регионов R1 и R4 (гейтирования) к гистограмме, отражающей количество детектированных событий с различной интенсивностью флуоресцентного сигнала в канале FL3 (линейная шкала).

Приложение 2. Схемы генетических конструкций с Н2В-ЖЯ, полученных в данной работе.

/

H2B-RL1 lerRedTandem 5855 fcp

Шел: (2 35) PcmvIE

Nhel (592) Kpnl (602) Histone H2B EcoRI (7 98)

Kan/Neo

SV40 or i KñNr promoter KÄNr -10 KÄNr -35

1 inker ВапШТ. (987) Sgel (993) Xhol (1006) KillerRed Kpnl (1775)

KillerRed

Not! (2524) SV40 polyA

IÍ

Hindlll (29) sp6 promoter BaMI (80)

Nhel (95)

Histone H2B EcoRI (289) Bam HI (478) KillerRed

pCS2+ H2B-KillerRedTandem 1 6002 kp

KillerRed

SV40 late poly TB praroter NotI (2254)

Bglll (37) RSV

j»-^ V' 5' Lm

" survivin promoter

Ж И® d %

%, Asp M

F03-survivin prOTDter- >|_ , 54Q) pßRISin-EFl- - cPPT

H2&-KillerRedTaridem Ä- - f H2B-KillerBedTaiidffli '

6564 tp Jf- Histone 3 V 8376 bp ^ f ' KF1-short

EcoRI '63) Fl CRI +1

BamHI (1952) V Jf Nhel (2208)

KillerRed SV40 рА/СКГ» f H2B

BamHI (3751)-/ "" " KillerRed

SV40 late polyA ^ШЯ^«^ SIN : r

Xbal (3489) KillerRed WHV KillerRed

Sail (4178)

Kan/Neo, Amp - гены устойчивости к канамицину/неомицину и ампициллину; pCMV IE - промотор ранних генов цитомегаловируса; Histone Н2В - последовательность, кодирующая гистон Н2В; linker - линкерная последовательность;

KillerRed - последовательность, кодирующая белок KillerRed;

SV40 ori - точка начала репликации вируса SV40;

Kan г promoter - промотор гена устойчивости к канамицину;

sp6 promoter - промотор SP6 РНК-полимеразы;

SV40 late polyA - промотор поздних генов вируса SV40;

ТЗ promoter - промотор РНК-полимеразы ТЗ;

survivin promoter - промотор гена сурвивина;

5'LTR - 5'-длинный концевой повтор;

3'SIN LTR - З'-самоинактивирующийся длинный концевой повтор; WHV Enhancer - энхансер рекомбинантной последовательности; EF1 short - укороченный вариант промотора гена EF1; Красным обозначены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции.