Экспериментальные исследования онтогенеза млекопитающих на мышах линий со специфическими нарушениями функциональных систем тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.30, доктор биологических наук Семенова, Мария Львовна

• Семенова, Мария Львовна
• доктор биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации доктор биологических наук Семенова, Мария Львовна

I. ВВЕДЕНИЕ

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

II. 1. Старение организма, как результат потери функциональности живой системы: краткий обзор теорий старения. 8 II. 1.1. Пролиферирующие клеточные системы и описывающие их состояние теории старения. 12 II. 1.2. Старение на тканевом и органном уровне. 20 II.2. Лабораторные модели для исследования процессов старения и нарушения функциональности органов и тканей организма.

11.2.1. Лабораторные модели с увеличенной продолжительностью жизни.

11.2.2. Лабораторные модели с укороченной продолжительностью жизни.

11.2.3. Процессы старения у мышей линий SAM - проявление на различных уровнях организации 34 II.3.1 .Типы стволовых клеток и их потенции к дифференцировке

11.3.2. СККМ как материал для клеточных трансплантаций.

11.3.3. Некоторые аспекты дифференцировки миобластов

11.3.4. Клеточные источники для репарации мышечных волокон.

III. РАЗДЕЛ 1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ОНТОГЕНЕЗА МЛЕКОПИТАЮЩИХ НА МЫШАХ SAM,

ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХСЯ УСКОРЕННЫМ СТАРЕНИЕМ

III. 1. Методическая часть раздела 1.

III. 1.1. Характеристика линий мышей SAM.

III. 1.2.Методология постановки экспериментов.

III. 1.3. Методы исследования.

111.2.

Глава 1. Анализ возрастных хромосомных и биохимических нарушений в соматических клетках мышей SAM.

111.2.1. Возрастные морфо-функциональные и биохимические характеристики и продолжительность жизни мышей линий SAM

111.2.2. Возрастные изменения соматических клеток мышей линий SAM

111.2.3. Влияние карнозина на морфо-функциональные и биохимические показатели мышей SAMP

111.3.

Глава 2. Анализ сперматогенеза у разновозрастных мышей линий SAM

111.3.1. Возрастные аспекты сперматогенеза SAM.

111.3.2. Влияние карнозина на частоту встречаемости генетически аномальных половых клеток в семенниках мышей SAM. 132 III.4.

Глава 3. Анализ нарушений эмбрионального развития у мышей SAM 138 III.4.1. Нарушения раннего развития мышей SAMP

III.4.2. Нарушения постимплантационного развития мышей линии SAMP

IV. Раздел 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ОНТОГЕНЕЗА МЛЕКОПИТАЮЩИХ НА МЫШАХ MDX, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХСЯ НАРУШЕНИЕМ РАЗВИТИЯ МЫШЦ. 151 VI. 1. Методическая часть 2-го раздела

VI. 1.1. Характеристика линии дистрофин-дефицитных мышей mdx. 157 VI. 1.2. Методология постановки исследований

VI. 1.3. Методы исследования

VI. 2.

Глава 4. Восстановление мышечной ткани мышей mdx после проведения баллистической трансфекции

VI. 2.1. Репаративные процессы в интактной мышце мышей и после нанесения повреждения.

VI. 2.2. Распределение экспрессии трансгена в мышечной ткани мышей mdx.

IV.3.

Глава 5. Восстановление мышечной ткани мышей mdx после проведения клеточная трансплантация.

IV.3.1. Трансплантация прогениторных клеток в мышечную ткань мышей mdx.

IV.3.3. Формирование зоны распространения транспланти рованных клеток в мышечной ткани.

VI. ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальные исследования онтогенеза млекопитающих на мышах линий со специфическими нарушениями функциональных систем»

Для решения многих биомедицинских и гериатрических проблем с позиций биологии развития необходимы комплексные исследования процесса старения и факторов, влияющих на продолжительность жизни, а также различных аспектов, обеспечивающих функциональную состоятельность органов и тканей организма. Однако, смерть, наступившая в результате старости, достаточно редкое событие даже при современном уровне медицины и, несмотря на многие успехи в этой области. Старение традиционно рассматривают на организменном и популяционном уровне (распространенность в популяции болезней связанных с возрастом, продолжительность жизни, индексы смертности) или на клеточном уровне (различные модели старения клеток in vitro), а не как результат суммы онтогенетических процессов, происходящих в течение всей жизни индивидуума.

Устойчивость (надежность) технической системы равняется устойчивости (надежности) самой неустойчивой ее части. Часто причиной фатального нарушения функций является выход из строя одного, самого слабого компонента системы. Биологические системы отличаются сложностью значительно более высоких порядков, чем самые сложные технические системы. Этим объясняется большое разнообразие теорий старения, которые придают разным аспектам износа организма определяющее значение.

В настоящее время считается, что клеточное старение в культуре in vivo соответствует некоторым (но не всем) изменениям, происходящим при старении целого организма. Более 40 лет назад Хейфлик и Мурхед опубликовали данные о том, что человеческие фибробласты способны реплицироваться в культуре только ограниченное количество клеточных циклов [Hayflick, Moorhead 1961]. Это явление получило название "лимита Хейфлика" и общее признание. После прохождения определенного числа клеточных циклов фибробласты человека прекращают пролиферировать и меняют фенотип - становятся крупнее, распластываются и длительное время переживают в культуре без всяких признаков старения и без проявления маркеров клеточной гибели. Это стабильное состояние клеточной культуры называют репликативным старением, однако является ли это состояние одним из признаков старения клеток в культуре до сих пор обсуждается [Hayflick 2000]. В последние годы были опубликованы работы, доказывающие, что состарившиеся клетки отличаются от клеток более ранних пассажей по многим биохимическим и физиологическим параметрам [Campisi 2000]. Так, стареющие клетки имеют отличные от более молодых паттерны генной экспрессии, в том числе значительные различия в экспрессии многих факторов транскрипции, а также белков, составляющих каскады трансдукции [Kletsas et al., 2004; Wang et ai, 2006]. Предполагается, что молекулярные механизмы, приводящие к старению в нормальных тканях организма, включаются в раковых клетках, при лечении цитостатическими препаратами [Schmitt et al., 2002; Schmitt 2006] По некоторым данным стареющие клетки накапливаются с возрастом во многих тканях человека, таких как печень [Paradis et.al., 2001], дерма кожи [Dimri et.al., 1995] и т.д. Накопление стареющих клеток в органах и тканях на поздних этапах онтогенеза характерно не только для человека, но и для других долгоживущих млекопитающих. В недавнем исследовании, результаты которого были опубликованы в Science, показано, что у бабуинов при старении в коже происходит накопление клеток с молекулярными признаками старения и у самых старых особей количество таких клеток достигает 15% [Herbig et al., 2006]. Так как в культуре in vitro клетки, находящиеся в терминальной фазе старения часто экспрессируют цитокины и ферменты, разрушающие не только сами клетки, но и структуры внеклеточного матрикса, высказываются предположения, что и in vivo стареющие клетки, при достаточном их количестве, могут вызывать связанные с возрастом, нарушения в структуре ткани или быть одной из причин патологий, связанных со старением.

В последние годы все более широко обсуждается возможность и пределы репарации стареющих или функционально-дефектных тканей при как помощи активации собственных ресурсов организма при помощи активных фармокологических средств (препаратов), используемых как пищевые добавки, так и за счет использования современных достижений биотехнологии, генных и клеточных технологий. Эти два подхода принципиально различны. В первом случае предполагается активация внутренних процессов репарации в организме, в том числе и клеточной репарации за счет введения в организм геропротекторных средств.

В основе второго подхода постулируется невозможность восстановления функциональности ткани за счет собственных ресурсов организма по причине исходных генных дефектов или соматических мутаций. В современной науке активно разрабатываются методы заместительной генной и клеточной терапии. Только обзоров, анализирующих различные аспекты данных технологий, в настоящее время опубликовано более 10 тысяч (генная терапия) и 1 тысячи (клеточная терапия). Фактически одна из каждых трех работ, опублинованных по этим тематикам, является обзорной. Однако, несмотря на огромный интерес к этой проблеме, эффективные результаты получены только тогда, когда методы генной и клеточной восстановительной терапии разрабатываются для лечения дефектов клеток крови и кроветворных органов. Результаты, полученные для других органов и тканей во многом разочаровывают, так как исследователи надеялись на больший успех.

В связи с вышеизложенным, в нашем исследовании мы рассматриваем аспекты функциональных нарушений связанных с генетическим статусом используемых моделей (ускоренно стареющие мыши SAM и дистрофин-дефицитные мыши mdx). Другим важным аспектом работы явилось исследование возможностей и ограничений применения фармакологических агентов, методов генной терапии и замещающей клеточной терапии для компенсации патологий и восстановления функциональности системы.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

II.1. Старение организма, как результат потери функциональности живой системы: краткий обзор теорий старения.

Биология старения, в том числе - фундаментальные процессы, лежащие в ее основе, моделирование процессов старения на различных лабораторных моделях, разработка методов и фармакологических средств, способствующих увеличению продолжительности жизни, и многие другие аспекты этой широчайшей области современной науки уже многие десятилетия является предметом интенсивных исследований, проводимых специалистами различных областей биологии и медицины. В основе современной герантологии лежат классические представления Гомпертца, рассматривавшего жизнеспособность организма, как способность противостоять совокупности разрушительных процессов, воздействующих на него в течении всей жизни, а смертность - как величину, обратную жизнеспособности [Gompertz, 1825]. Результатом его теории стала формула, определяющая сущность процессов старения, как накопление энтропии в целостной системе со временем, которая до сих пор широко используемая не только для исследования влияния различных внешних и внутренних факторов на продолжительности жизни на популяционном уровне, влияние на уровень смертности различных заболеваний (в том числе и сопутствующих процессу старения) [Castro et ai, 2003; Kesteloot, Huang, 2003]. Развитие медико-биологического направления исследования старения с самого начала было связано с системным подходом к отдельному организму, как к сложной системе и существует большое количество определений этого явления. С точки зрения биологии развития наиболее четко отражающим процессы онтогенетических изменений, происходящих с возрастом, является ставшее классическим определение, данное отечественными исследователями [Донцов и др., 1997; Крутъко и др., 1998]. Они рассматривают старение, как снижение с возрастом упорядоченности структур организма и увеличение степени их износа, выражающееся в уменьшении жизнеспособности организма, т.е. в снижении способности к адаптации, в снижении функциональных способностей, а также в повышении с возрастом вероятности наступления заболеваний и смерти от различных причин. В биогеронтологии существует много различных теорий, объясняющих причины возрастных изменений за счет внутренних процессов разного уровня. Эти теории можно условно разделить на стохастические (рассматривающие старение как процесс случайных накоплений нарушений системы) и программные (постулирующие, что как при эмбриогенезе работает онтогенетическая программа развития, так и при старении работает программа смерти).

Современное представление о процессах старения во многом основано на устоявшемся представлении о том, что существует онтогенетическая "программа смерти", по аналогии с существующей у всех многоклеточных организмов программой клеточной смерти. Программируемая клеточная гибель, происходящая за счет механизмов апоптоза, играет важную роль в процессах развития животных, в том числе в процессах морфогенеза, метаморфоза, поддержания гомеостаза органов и тканей. Представление об исключительно важной роли клеточной гибели как в процессах развития, так и в процессах изменения (потери функциональности и деградации) различных структур организма старшего возраста было сформировано довольно давно, но генетические основы этого процесса были открыты С.Бреннером (S.Brenner), Х.Р.Хорвицом (H.R.Horvitz) и Дж.Салстоном (J.Sulston) при изучении онтогенеза нематоды С. elegans, исследования которых были награждены в 2002 году Нобелевской премией. У С. elegans которой было обнаружено всего 15 генов клеточной смерти, исполняющие строго определенные функции в этом процесс. Так, ced-З и ced-4 регулируют синтез индукторов апоптоза, ced-9 блокирует активность ced-4, а остальные гены (ces-1, ces-2 egl-1 ced-5, ced-6, ced-7, ced-10, ced-12, nuc-1) участвуют непосредственно в гибели клеток и в деградации и утилизации апоптозных телец. В последнее десятилетие существование генетических сетей, отвечающих за программируемую клеточную гибель обнаружили у животных, относящихся к самым разным таксономическим группам, в том числе у млекопитающих и человека/Хш, Hengartner 1999].

В последние годы общепринятым представлением является то, что клетки млекопитающих существует несколько молекулярных каскадов собственной деструкции, которые могут действовать индивидуально или в комплексе. Также известно, что в эффекторы клеточного суицида как правило имеют другие функции в процессе нормального функционирования клетки. Когда рассматривают процесс старения с эволюционной точки зрения причиной старения называют отсутствие негативной селекции генов, повреждающий эффект которых, проявляется на поздних этапах онтогенеза [Ameisen, 2005]. У большинства видов животных большая часть индивидуумов погибает по причинам не связанным со старением. Таким образом, гены, которые являются причинами различных заболеваний старших возрастов (пострепродукционных), выходят из-под прессинга эволюционных процессов. С другой стороны, по этим же причинам не происходит положительная селекция генов, действие которых в пострепродуктивный период оказывают положительный эффект и может являться причиной того, что данный индивидуум проживет дольше из-за задержки процессов старения. То есть различия в эффективности репарационных механизмов, в проявлении болезней старших возрастов и, в конечном итоге, в продолжительности жизни индивидуумов даже относящихся к одной популяции и/или родственной группе скорее зависят от того, что называют плейотропией "программ жизни", возникающей из-за исходно разного набора генных аллелей у разных животных, чем от запрограммированного включения "программ смерти" [Zafon, 2006].

Изменения, происходящие в организме при старении, проявляются на всех уровнях его строения. Во-первых, это возрастные изменения, проходящие собственно на организменном уровне, на уровне внутреннего гомеостаза организма, на его способности к регуляции в условиях постоянно изменяющейся внешней среды. Организм становиться более подверженным внешним воздействиям, в результате чего вероятность его смерти увеличивается. Во-вторых, это возрастные изменения, происходящие на уровне отдельных систем организма, его органов и тканей. В-третьих, это возрастные изменения, происходящие на клеточном и субклеточном уровнях. Достаточно часто отдельно рассматривается молекулярный уровень накопления возрастных дефектов. К нему относят все известные данные об изменении биомолекул, связанные со старением, в том числе изменения в структуре ДНК, накопление точечных мутаций, другие ошибки процессов репликации, накопление в клетке вредных и поврежденных молекул и т.д. В данном случае, такое деление скорее относится к методам исследований, используемых в современной биологии, чем отражает реальную взаимосвязь внутриклеточных процессов.

Современные информационные технологии и уровень накопленных знаний позволяет анализировать любое состояние клетки (и пролиферации, и дифференцировки, и старения, и гибели) состояние так называемых "генных сетей". Под генной сетью при этом понимается совокупность координированно экспрессирующихся генов, их белковых продуктов и взаимосвязей между ними и отвечающей за выполнение определенной функции в клетке [Ананько и др., 1999]. Процесс старения на этом уровне тогда можно рассматривать как изменение комплекса отрицательных и положительных обратных связей, стабилизирующих параметры генной сети на определенном уровне или, напротив, отклоняющих их от исходного значения. Однако, несмотря на то, что регуляторные системы, действующие по принципу обратной связи, составляют основу внутриклеточной организации, минимальной единицей живой материи, способной существовать автономно, хотя бы и в специальных условиях in vitro, способной поддерживать внутренний гомеостаз и способной к размножению, является клетка. Далее мы дадим краткий обзор теорий стрения, в зависимости от функционального состояния клеточной популяции.

II.1.1. Пролиферирующие клеточные системы и описывающие их состояние теории старения.

Современные клеточные теории старения были разработаны на основе модели культивирования клеток in vitro. Фибробласты и другие ^трансформированные клетки при культивировании in vitro претерпевают ограниченное число делений (лимит Хейфлика) [Hayflick, 1980, 2000]. По достижении этого лимита наступает репликативное старение клеток - часть клеток прекращает пролиферацию и переходит в постмитотическое состояние, часть клеток гибнет, а часть трансформируются в раковые. Фактически, старение пролиферирующих клеточных систем - это накопление дефектов, снижающих пролиферативную активность клеток и/или инициация процесса клеточной гибели, а механизмы старения - это механизмы реализующие эти дефекты.

Рассматривая модели, использующие клеточные культуры in vitro, следует с осторожностью употреблять термин старение. В данном случае скорее следует говорить о снижении пролиферативной активности или о повышении уровня апоптотической гибели клеток при их культивировании на протяжении многих клеточных циклов. Классическое определение старение - это серия временных процессов, происходящих во взрослом организме, которые раньше или позже приводят организм к смерти (жизнь к завершению). В любом случае старение может быть понято и как сложное многофакторное координированное действие большого количества различных генов. Кроме того, понятие старения включает в себя и значительную и стохастическую компоненту, складывающуюся из внешних и внутренних факторов, приводящих к повреждению и разрушению биомолекул.

Теломеразная теория старения.

В 1971 году А.М.Оловников, пришел к выводу, что при репликации хромосом их концевые участки (теломеры) с каждым делением клетки укорачиваются и при достижении определенного предела репликация хромосом в соматических клетках прекращается, клетки перестают делиться и начинается процесс их старения, заканчивающийся гибелью клетки [Оловников 1995]. Позднее был открыт белок, относящихся к классу обратных транскриптаз и способный достраивать нуклеотидные последовательности в теломерных участках хромосом - теломераза.

Теломерная теория старения также была разработана при исследовании клеток человека в культуре in vitro. Теломеры - структуры, защищающие концы хромосом и состоящие из повторяющейся последовательнстей (TTAGGG у млекопитающих и большинства других позвоночных животных) и комплекса РНК и белков, укорачиваются в каждом цикле клеточной репликации. У человека фермент теломераза, достраивающий концевые участки хромосом и препятствующий укорачиванию теломер, присутствует только в клетках полового ряда и отсутствует в большинстве соматических клеток [Wu et al., 1999; Kim et al., 2002]. Фактически, теломерный комплекс маскирует концевые участки хромосом и не дает системе репарации повреждений реагировать на них, как на поврежденную ДНК. Благодаря этому теломеры препятствуют слиянию концов хромосом и таким образом поддерживают стабильность генома [Wright, Shay, 2000]. Также привлекательность теломерной теории старения в том, что в настоящее время укорочение хромосом - это единственный известный молекулярный механизм, позволяющий клеткам учитывать количество пройденных циклов репликации. Также считается, что связанное с укорочением теломерных участков старение это не постепенных процесс, а некоторая триггерная система: программа "старение" включается до того, как длина теломер достигнет критических значений и станет причиной геномной нестабильности (слияние концевых участков хромосом, формирование кольцевых структур, анеуплоидий и т.п.), ведущей к раковому перерождению/Кшг et.al., 2002].

Остается открытым вопрос, насколько реально работает теломеразный механизм Укорочение теломерных участков в организме человека в норме не обнаруживается.

В последние годы было опубликовано несколько работ, где была исследована длина теломерных участков ядерных клеток периферической крови у пациентов после пересадки костного мозга и у их доноров. У пациентов в течение первого года после пересадки костного мозга наблюдается укорочение теломерных участков хромосом моноцитов [Lee et al 1993]. Однако для тех же пар донор-реципиент было показано, что укорочения теломер хромосом периферической крови не наблюдается. По-видимому, это связано с разной пролиферативной нагрузкой на различные линии трансплантата.

Эмбриональные фибробласты мыши ведут себя в культуре также, как и фибробласты человека. У них также наблюдается пролиферативный период определенной продолжительности и период репликативного старения. Однако такой тесной коррелятивной связи между укорочением теломерных участков хромосом и клеточным старением у мышей не наблюдается. Это связано с несколькими причинами. Во-первых, у мышей теломерные участки хромосом значительно длинее, чем у человека (30-40 Кб и 5-15 Кб соответственно). Во-вторых, у мышей теломеразная активность наблюдается не только в клетках полового ряда, но и соматических клетках [Wright et al 2000]. Поэтому некоторые исследователи считают ведущим фактором клеточного старения клеток мыши in vitro не уменьшение длины теломер (внутренняя причина), а то, что называют культуральным стрессом (т.е. совокупность внешних факторов) [Sherr et al., 2000].

Старение в результате накопления соматических мутаций.

Одной из наиболее широко распространенных теорий старения является теория соматических мутаций. Эта теория исходно была основана на наблюдениях, что такие радиационные повреждения у животных как неоплазия и генерализованная атрофия сходны с процессами, происходящими на поздних стадиях старения. И тот хорошо известный факт, что радиационное поражение приводит к мутациям в клетках различных тканей организма, дал возможность предположить, что старение может быть результатом долговременного (в течение всей жизни) воздействия природного уровня радиации и других воздействий среды, приводящих к повреждению ДНК.

Нарушение процессов клеточной пролиферации и увеличение процента клеточной гибели является одной из причин дегенерации ткани и нарушения ее функций. В связи с недостатком методов достоверного численного анализа процессов накопления мутаций in vivo, в том числе в различных органах и тканях, представляется трудным - доказательство того утверждения, что накопление мутаций в тканях стареющего организма достигает достаточно высокого уровня, чтобы являться причиной патофизиологических симптомов старения. Данные, подтверждающие эту теорию, были получены, при исследовании метафазных пластинок клеток паренхимы печени после частичной гепатоэктомии [Vijg, 2000]. Было обнаружено, что клеток с аномалиями хромосом у животных старших возрастов достоверно больше, чем у молодых животных (такие аномалии обнаруживались в 10% клеток животных 4-5 месячного возраста и более чем в 75% клеток, когда животным было больше 12 месяцев). Такой же экспоненциальный рост хромосомных аббераций был обнаружен и при исследовании состояния хромосом лейкоцитов, взятых у доноров разного возраста. У молодых доноров хромосомных аббераций в клетках крови обнаруживалось не более 2-4%, а у доноров старших возрастов таких мутаций было в шесть раз больше. Эти данные о цитогенетических нарушениях были подтверждены и при исследовании количества генных мутаций у пациентов разного возраста. Так число делеций и точечных мутаций в старших возрастах накапливается как в активных генах, так и в области некодирующей ДНК [Wijnhoven et al., 2000].

Исследование уровня мутаций в локусе HPRT (ген гипоксантин фосфорибозил трансферазы) используется многими исследователями для анализа частоты мутаций, как под воздействием различных внешних факторов, так и при старении организма. Так мутации в этом локусе у человека увеличиваются с 2x10"6 у молодых пациентов до 1x10"5 - в старших возрастах. Примерно такой же уровень мутаций был обнаружен и у мышей: 5x10'6 у молодых животных и 3x10"5 у животных старших возрастов, то есть уровень спонтанных мутаций возрастает на порядок [Strehler 1995]. Исследование уровня спонтанных мутаций в локусе HLA-A и других полиморфных локусах лимфоцитов человека демонстрирует сходные данные: уровень мутаций составляет 0.71 х 10"5 у новорожденных и возрастает до 6.53 х 10"5 у индивидуумов старших возрастов. При проведении молекулярного анализа 434 мутаций (31 индивидуум разных возрастов) были быявлена различные типы мутаций (2.8% мутаций приходиться на генный делеции, 32.5% - на митотические рекомбинации, 64,7% мутаций, не влияющих на функцию генов). Число митотических рекомбинаций и точечных мутаций, не влияющих на функции генов значимо возрастает у индивидуумов старших возрастов. Однако уровень митотических рекомбинаций существенно различается у индивидуумов одного возраста и при анализе частоты встречаемости мутаций было выявлено, что вся выборка имеет бимодальный характер распределения, то есть в выборке выявлены 2 группы, у которых уровень соматических мутаций различен [Grist et al., 1992]. Еще более высокий уровень мутаций в этом локусе был обнаружен в почечной ткани двух пациентов возрастом более 90 лет. Однако существующими методами довольно трудно выявлять специфические повреждения ДНК, накапливающиеся в различных органах и тканях в процессе старения организма. Большая часть данных, на которых основываются данные выводы, также как и при исследовании теломерных участков хромосом, были получены на модели культивирования клеток in vitro. При нормальных условиях культивирования, без введения значительных доз повреждающих агентов, уровень повреждений ДНК довольно низок (4.3x10"9 оснований) [Strehler 1995]. Представляется маловероятным, что в нормальных условиях спонтанное повреждение ДНК, может дать какой либо выраженный эффект, в том числе и приводящий к патофизиологическим эффектам, характерным для процессов старения. Процессы репарации поврежденной ДНК достаточно активны в пролиферирующих клетках, и ВТО же время, клеточные изменения, которые связывают со старением, являются не единственным результатом таких повреждений. Другими возможными событиями, которые произойдут в этом случае, являются гибель клетки, а так же клеточная трансформация.

Свободно-радикальная теория старения.

Старение на клеточном уровне - очень сложный комплексный процесс, однако существует множество подтверждений того, что один из его ведущих механизмов - увеличение содержания свободных радикалов, имеющих высокую реактивность и нормальные процессы жизнедеятельности в клетке. Свободные радикалами называют соединения, имеющие неспаренный электрон на наружной орбите и обладающие высокой реакционной способностью (супероксид-анион кислорода, окись азота, гидроксильный радикал, синклетный кислород, перекись водорода, и т.д.). Свободнорадикальное окисление происходит при утилизации кислорода и необходимо для нормального функционирования организма. Однако известно, что основным источником повреждений ДНК в клетках являются так же являются свободные радикалы - побочные продуктами окислительного фосфорилирования и еще некоторых других нормальных клеточных физиологических процессов. Участию свободно-радикальных механизмов в процессах старения посвящено огромное количество как оригинальных работ, так и аналитических обзоров [Кольтовер 2000; Обухова 1999].

В дополнение к этому существует ряд внешних агентов (таких как ультрафиолет, ионизирующая радиация [Тарусов, 1954]\ и широкий спектр химических веществ, в том числе и содержащиеся в пище), которые могут приводить к повреждению ДНК за счет повышения уровня свободных радикалов к клетке (одиночные и двойные разрывы нити ДНК, внутрихромосомные и межхромосомные сшивки и т.д.) [Kobayashi et al, 2001; Tang et al., 2000]. Так, воздействие перекиси водорода (основного источника активных форм кислорода в клетке) на Т-лимфоциты человека в культуре приводило к выраженному дозо-зависимому мутационному эффекту. Хотя частота внутригенных мутаций при воздействии перекиси водорода не увеличивалась, частота митотических рекомбинаций возрастала на 87%, а частота делеции генов - на 13%. Митотические рекомбинации и следующие за ними репарационные процессы являются причиной потери гетерозиготности на прилегающем участке ДНК. Известно, что такие потери гетерозиготности могут приводить к неопластическому перерождению клеток, за счет проявления действия некоторых рецессивных аллелей [Turner et al., 2003].

Ярким примером процесса развития окислительного стресса, приводящего к повреждению макромолекул и нарушению функционирования систем организма, является процесс старения. Старение - очень сложный комплексный процесс, однако существует множество подтверждений того, что активные формы кислорода играют в этом процессе немаловажную роль [Cross et al., 1987; Harman,

1991; Warner, Starke-Reed, 1997; Mates, Sanchez-Jimenez, 1999; Schoneich, 1999].

Свободные радикалы не только работают в митохондриальных энергетических процессах, но участвуют в процессах клеточной гибели, предупреждают злокачественную трансформацию клеток, участвуют в регуляции транспорта ионов, проницаемости клеточных мембран (в том числе и за счет процессов перикисного окисления липидов) и многих других внутриклеточных процессах. При нормальном течении клеточного метаболизма свободные радикалы не представляют, так как утилизируются клеточными ферментными системами, в том числе супероксиддисмутазой (СОД), глютатионпероксидазой, каталазлой и др. Однако при нарушении ферментных систем уровень свободных радикалов повышается - возникает состояние окислительного стресса, который вызывает существенные структурные и функциональные повреждения клетки. Так, например, N0-радикал, взаимодействуя с низкомолекулярными триолами формирует нитрозильные комплексы, которые при их высокой концентрации могут вызвать апоптотическую гибель клеток [Болдырев, 1998].

Работа антиоксидантной системы также нарушается с возрастом. Так, например, с возрастом в коже крыс происходит снижение СОД, а в мозге - активности СОД и каталазы. В эритроцитах человека с возрастом достоверно снижается активность таких ферментов, как Cu/Zn-СОД, глутатионредуктаза и глутатионтрансфераза. [Tahara et al., 2001; Ceballos-Picot et al., 1992].

Особую роль в процессе клеточного старения играют митохондрии. В начале 80-х годов прошлого века было сформулировано представление о тот, что процесс старения связан с повреждением митохондрий (в том числе, и с повреждением генома митохондрий), происходящем в результате окислительного стресса в дифференцированных постмитотических клетках. В основе этого представления лежат данные о том, что синтез митохондриальной ДНК проходит непосредственно на внутренней стороне мембраны митохондрий, то есть в месте, где формируются активные формы кислорода (АФК) и их производные, обладающие высочайшей реакционной активностью [Miquel, 1998]. Этот процесс в старших возрастных группах протекает с большей интенсивностью, так как с возрастом индивидуума происходит нарушение в работе дыхательной цепи, в частности дисбаланс активности составляющих ее ферментов [Halliwell, Gutteridge, 1999; Sohal, Weindruch, 1996; Ferrandiz et al. 1994]. Так так митохондриальная ДНК кодирует не только 13 белков дыхательной цепи и АТФ-синтазу, но и вспомогательные РНК, участвующие в процессах трансляции (рРНК, тРНК и т.д.), повреждение ДНК ведет к нарушению синтеза РНК и дисбалансу активности дыхательных ферментов [Miquel, 1998]. Снижение синтеза АТФ приводит к нарушению биоэнергетических процессов и снижению активности АТФ-зависимых внутриклеточных процессов, в том числе и белкового синтеза, дегенеративным изменениям тканей и, как следствие, на более высоких уровнях - к нарушению функций органов и тканей и старению организма.

II.1.2. Старение на тканевом и органном уровне.

Клетки в постмитотический период менее подвержены воздействию агентов и процессов, повреждающих непосредственно генетический аппарат клетки. Постмитотические клетки присутствуют в любой дифференцированной ткани, но при культивировании in vitro реально постмитотические дифференцирующиеся клетки можно только при индукции терминальной дифференцировки клеток-предшественников. Чаще старение клеток в культуре происходит по двум причинам: либо когда пролиферативный потенциал клеток оказывается исчерпанным, либо когда первичные культуры получены от стареющих индивидуумов - с возрастом появляются ошибки, связанные непосредственно с механизмами клеточной пролиферации. Другая парадигма рассматривает старение на клеточном уровне немного с другой стороны, как процесс накопления внутриклеточного "мусора", отравляющего клетку и приводящую в конце концов к ее смерти. В данном случае накопление цитоплазматических нарушений требует достаточно длительного времени и относится по большей части к постмитотическим клеткам, которые собственно и обеспечивают функциональность органов и тканей.

Одной из причин нарушения гомеостаза ткани и/или органа, является снижение числа функциональных клеток в различных тканях организма в процессе старения. В свою очередь этот процесс может регулироваться на двух различных уровнях: во-первых, это фактическое уменьшение числа клеток, происходящее за счет все более усиливающегося с возрастом доминирования процессов клеточной гибели над процессами пролиферативной активности, во-вторых, снижение функциональной активности оставшихся живых клеток. Пока процессу гибели постмитотических клеток, которая происходит по разным причинам, сопутствует достаточно активный процесс пролиферации, он исполняет две функции. Во-первых, за счет пролиферации восполняются потери, происходящие за счет клеточной гибели. Во-вторых, за счет пролиферации в ткани увеличивается процент молодых, функционально активных клеток, что обеспечивает функциональную активность ткани. В результате, пока сохраняется баланс между пролиферацией клеток-предшествеников и потерей функциональности "старых" клеток сохраняется и нормальная функция органа или ткани.

По некоторым данным стареющие клетки накапливаются с возрастом во многих тканях человека, таких как печень [Paradis et.al., 2001], дерма кожи [Dimri et.al., 1995]. Накопление стареющих клеток в органах и тканях на поздних этапах онтогенеза характерно не только для человека, но и для других долгоживущих млекопитающих. В недавнем исследовании, результаты которого были опубликованы в Science, показано, что у бабуинов при старении в коже происходит накопление клеток с молекулярными признаками старения и у самых старых особей количество таких клеток достигает 15% [Herbig et al., 2006]. Существуют исследование, оригинальным методом доказывающее, что фактический возраст клеток организма человека (за исключением головного мозга) имеет достаточно небольшой возраст - в среднем 15 лет. Это исследование основано на измерении количества радиоактивных изотопов углерода в различных органах и тканях людей, живших в то время, когда проводились атмосферные ядерные взрывы. В результате атмосфера была обогащена изотопом 14С и жившие в то время растения, утилизировали его вместе с обычным углеродом (калировачная шкала, использовавшаяся в этом исследовании была построена на основе содержания разных изотопов углерода в годовых кольцах деревьев). Ткани, взятые для исследования, были получены в результате патанатомических процедур.

Так как в культуре in vitro клетки, находящиеся в терминальной фазе старения часто экспрессируют цитокины и ферменты, разрушающие не только сами клетки, но и структуры внеклеточного матрикса, высказываются предположения, что и in vivo стареющие клетки, при достаточном их количестве, могут вызывать связанные с возрастом, нарушения в структуре ткани или быть одной из причин патологий, связанных со старением. Предполагается, что молекулярные механизмы, приводящие к старению в нормальных тканях организма, включаются в раковых клетках, при лечении цитостатическими препаратами [Schmitt et al., 2002; Schmitt 2006]. Известно, что на молекулярном уровне процесс старения контролируется опухолевыми супрессорами р53 и pRb и клеточное старение, с этой точки зрения, можно рассматривать как механизм, препятствующий образованию раковых клеток в организме.

Строение любой функциональной ткани значительно сложнее, чем совокупность клеток любой системы in vitro. Любая ткань состоит более чем из одного типа клеток. Кроме собственно дифференцированных клеток, определяющих функциональность данной ткани, в ней всегда присутствуют нейральная компонента (иннервация ткани отростками нервных клеток), сосудистые элементы (капиллярная сеть и более крупные сосуды), форменные элементы крови (в том числе и клетки иммунной системы) и некоторые другие клеточные элементы. Кроме того, во многих тканях присутствуют недифференцированные (стволовые) клетки, за счет которых и происходит репарация данной ткани в течение онтогенеза. Это могут быть как резидентные и, как правило, унипотентные клетки (стволовые клетки сперматогенного ряда, миосателлитные клетки, стволовые клетки эпидермиса и т.д.), так и мигрирующие стволовые клетки, поступающие из других областей организма (мезенхимные стволовые клетки - МСК и т.п.).

Таким образом, функциональность ткани зависит от процессов пролиферации, дифференцировка и собственно функциональной активности многих типов клеток. В данной работе мы, в основном, рассматривает две тканевые системы - сперматогенный эпителий и мышечную ткань.

В норме и при повреждении в мышечной ткани постоянно происходит гибель и регенерация (восстановление) мышечных волокон. Вопросами регенерации, механизмами ее активации в поврежденной ткани, разработками методов восстановительной терапии и методов управления регенерационными процессами в современном мире серьезно интересуются многие исследователи, не безосновательно считая регенерацию прямой дорогой к продлению жизни. Регенерационные процессы у млекопитающих и человека наиболее активно исследуют на модели мышечной ткани. Это связано, во-первых, в высокой частотой встречаемости мышечных и нейро-мышечных дегенеративных заболеваний (миодистрофия Дюшенна-Беккера - самое распространенное аутосомно-рецессивное генетическое заболевание человека). Во-вторых, особенности миодифференцировки (пролиферация мононуклеарных клеток, последовательное формирование многоядерных миосимпластов, миотуб и мышечных волокон), дает возможность быстрой и эффективной оценки процесса восстановления мышечной ткани [Озернюк 1998].

Принято выделять физиологическую и репаративную регенерацию. Физиологическая регенерация — обновление мышечных волокон, происходит благодаря клеткам-сателлитам, которые вступают в циклы пролиферации с последующей дифференцировкой в миобласты и их включением в состав предшествующих мышечных волокон. Благодаря физиологической регенерации происходит утолщение мышечных волокон и увеличение массы всей мышцы. Репаративная регенерация — восстановление мышечных волокон, которое также возможно благодаря наличию клеток-сателлитов, но происходит при восстановлении травмированной мышцы). Процессы сосстановления мышечной ткани мы рассмотрим в следующих разделах обзора.

Спермотогенный эпителий, в отличие от мышечной ткани, явялется динамической структурой, состоящей из двух клеточных популяций, разных по происхождению и функции: популяции терминально дифференцированных клеток Сертоли и популяции постоянно обновляющихся клеток сперматогенного ряда. [Райцина, 1980, 1982]. В отличее от мышечной ткани, в состав которой кроме собственно мышечных клеток входит большое число других клеточных элементов (соединительная ткань, кровеносные сосуды, окончания моторных нейронов), сперматогенный эпителий является замкнутой системой, отделенной от других клеточных популяций структурно. Это принципиально отличает эти две системы если рассматривать их с точки зрения клеточных источников для регенерации ткани. Мышечная ткань является открытой системой, могущей привлекать для своей репарации клетки из внешних источников. Сперматогенный эпителий является закрытой системой, восстановительные возможности которого ограничены собственными клеточными ресурсами.

II.2. Лабораторные модели для исследования процессов старения и нарушения функциональности органов и тканей организма.

Из всех существующих животных моделей, которые используются для исследования процессов старения и влияния различных факторов, как внешних, так и внутренних, на продолжительность жизни особи в данном обзоре мы остановимся только на млекопитающих.

Наиболее информативными как с точки зрения, какие процессы и механизмы являются реально значимыми для процессов старения человека, так и для предклинических испытаний препаратов, которые предпологается использовать для увеличения продолжительности жизни людей, являются исследования, выполненные на различных видах лабораторных млекопитающих. Подавляющее большинство таких работ традиционно проводится с использованием различных генетических линий мышей. Эти животные имеют небольшой срок жизни (2-3 года) и, кроме того, существует большое число различных линий мышей, которые имеют различные функциональные нарушения, ведущие к изменению средней продолжительности жизни. Во-первых, это животные, несущие мутации, значительно увеличивающие продолжительность их жизни, а во-вторых, это животные с укороченной продолжительностью жизни.

До недавнего времени геронтологические исследования проводились на стандартных генетических линиях животных (СВА, С57В1, BulbC, DBA и т.д.). Безусловные плюсы таких является, во-первых, в результате широчайшего использования этих линий в самых различных биологических исследованиях привело к накоплению огромного массива данных об их линейных особенностях. Во-вторых, практически отсутствующая генетическая гетерогенность внутри линии дает возможность выявлять различия с высокой степенью достоверности между экспериментальными и контрольными группами даже в случае минимальных воздействий. Однако, проведение исследований механизмов, в том числе и генетических, непосредственно влияющих на продолжительность жизни индивидуальной особи на таких моделях не представляется возможным. Развитие методов современной молекулярной генетики и эксприментальной эмбриологии привело к созданию линий животных (как правило, мышей) у которых селективно выключен один или несколько генов (рис. II-1). Это так называемные нокаутные модели (knockout mice, loss-of-function mice). Трудоемкость и методические сложности получения таких животных многократно компенсируются тем, что таким образом можно исследовать функцию любого гена на разных этапах онтогенеза. В результате создания таких моделей были получены животные, у которых срок жизни существенно сокращен или, наоборот, значительно увеличен по сравнению с нормой для животных этого вида [de Magalhaes et al., 2005; Kuro-O, 2001].

Часть исследователей считают, что для изучения процессов, происходящих в процессе старения у человека, более информативны модели с увеличенной продолжительностью жизни. Придерживающиеся этой точки зрения акцентируют внимание на том факте, что линии мышей, несущие генные мутации, приводящие к более ранней смерти, погибают в результате развившихся заболеваний, а не в результате процесса старения. Такие животные, которые не проходят все этапы онтогенетического процесса, скорее могут быть использованы как модели для исследований возможности лечения определенных заболеваний, вызванных генной дисфункцией, но не процессов старения.

II.2.1. Лабораторные модели с увеличенной продолжительностью жизни.

В последние несколько лет особенно популярными у исследователей процессов старения становятся линии мышей с увеличенной продолжительностью жизни. Наиболее часто такие животные используются при исследовании влияния на продолжительность жизни различных специальных диет, в том числе и диет жестко ограниченных по калорийности. Таких мышей называют животными с задержанным (отсроченным) старением. В литературе описано, по крайней мере, семь линий трансгенных мышей такого типа. Четыре линии мышей из этой группы несут мутации, в результате которых животные либо не способны продуцировать гормон роста в достаточном количестве, либо имеют нарушения в механизмах ответа на этот гормон [Bartke et al., 2001; Flurkey et al, 2001; Powers et al, 2006]. Продолжительность жизни у таких животных более чем на 30% длиннее, чем у животных этих же линий, не несущих мутаций. Особенностью этой группы мышей является замедленный рост и снижение размера и веса во взрослом состоянии на 30 -50% (от размеров интактных мышей родственных линий).

Генетическая линия IGF1-R-/-.

Возможно, самой интересной моделью в этой группе являются мыши, у которых нокаутирована одна из копий IGF1 рецептора. Животные гомозиготные по нокаутированному гену погибают на ранних этапах онтогенеза, как правило, еще в процессе эмбрионального развития. У мышей IGF1R+/- наблюдается большое количество нарушений развития, включая существенное изменение продолжительности жизни, к тому же коррелирующее с полом животного. Гетерозиготные самки демонстрируют увеличение продолжительности жизни на 33% по сравнению с самками, не несущими мутации, хотя при развитии они достигают нормальных размеров. Гетерозиготные самцы тоже имеют увеличенную продолжительность жизни, но выраженную в меньшей степени [Holzenberger et al., 2003].

Генетическая линия рбб-/-.

Другая линия мышей, имеющих увеличенную продолжительность жизни, несет нокаутированный ген рбб. У этих животных клетки становятся более устойчивыми к апоптозу, вызванному, как перекисным окислением, так и ультрафиолетовой радиацией [Migliacceo et al., 1999]. Белок, кодируемый геном рбб, входит в состав пути трансдукции активного кислорода, в результате которого активируются процессы, связанные с апоптозом. Фибробласты мутантных мышей (p66sh<>/') существенно более устойчивы к перикисному окислению по сравнению с клетками контрольной линии [Migliaccio et al., 1999]. Позднее было показано, что ген, кодирующий белок рбб выключает транскрипцию транскрипционного фактора FKHRA1, который регулирует транскрипцию гена, кодирующего каталазу. В отсутствии белка, кодируемого геном рбб, FKHRA остается активным и повышенная продукция каталазы (а возможно и других антиоксидантных ферментов) увеличивает устойчивость клеток к окислительному стрессу[Nemoto et al., 2002].

II.2.2. Лабораторные модели с укороченной продолжительностью жизни.

Высокий уровень гомозиготности мышей инбредных генетических линий сам по себе приводит к сокращению средней продолжительности жизни по сравнению с аутбредными линиями и, тем более, по сравнению с более генетически гетерогенными животными дикого типа. Инбредные животные широко используются при исследовании влияния различных внешних факторов (как фармакологических геропротекторных средств, так и стресс-факторов) на среднюю продолжительность жизни животных и на физиологические, биохимические и клеточные изменения, происходящие при данном воздействии. У модельных линий с нокаутированными генами привнесенные генетические нарушения могут приводить к многочисленным нарушениям онтогенетических процессов, в том числе и к сокращению сроков жизни.

Как уже упоминалось выше, большая часть линий мышей с укороченным в результате мутаций единичного гена сроком жизни, которые достаточно часто используются в геронтологических исследованиях, реально не являются моделями с ускоренным старением. Эти модели больше напоминают прогерии человека: детскую прогерию (синдром Гетчинсона- Гилфорда) и прогерию взрослых (синдром Вернера) - заболевания, характеризующиеся преждевременным старением и наследуемых по аутосомно-рецессивному типу. Прогерия детей, как правило, проявляется в возрасте 2-3 лет, прогерия взрослых - к периоду полового созревания. Изменения кожных покровов и внутренних органов, а также изменения на клеточном уровне, обусловленные преждевременным старением организма у больных прогерией сходны с процессами, происходящими при возрастном старении. У больных нарушены процессы репарации ДНК, процессы клеточной пролиферации. В результате происходят атрофические изменения дермы кожи, миокарда, мышечной ткани, нарушение нарушения суставов и остеопороз, появляются атеросклероз, остеомиелит, атеросклероз, помутнение хрусталика и другие изменения органов и тканей, при нормальном онтогенезе характерные для стареющего организма. Клинические проявления прогерий сопровождаются замедленным ростом, а в случае прогерии взрослых возникают нарушения развития половой системы, в том числе гипогонадизм. Линии мышей с некоторыми нокаутированными генами также имеют укороченный срок жизни, замедленный рост и появление возрастных изменений в ранних возрастах, часто до полового созревания.

Генетическая линия Klotho-/-.

Наиболее известна в этой группе линия мышей с нокаутированным геном Klotho, которые были получены японскими биологами около 10 лет назад [Kuro-o et al.,1997]. Онтогенез мышей Klotho-/- позволяет говорить о том, что выключение этого гена фактически вызывает нерушения, аналогичные прогериям человека. Гомозиготные мыши этой линии имеют среднюю продолжительность жизни около 7-9 недель, а рост животных прекращается уже на 3-4-той неделях постнатального развития. Гомозиготные мыши этой линии стареют и погибают до наступления половой зрелости и размножение этой линии ведут методом скрещивания гетерозиготных мышей Klotho+I-. В течение этого экстремально короткого срока жизни у мышей Klotho-I- развивается целый спектр заболеваний, которые обычно связывают с процессами старения организма: липодистрофия, кожная атрофия, остеопороз, склероз артерий и т.п. Кроме того, в течение всей жизни мышей Klotho, наблюдается ряд цитологических изменений в различных органах и тканях, в том числе значительно снижена репродуктивная функция, существенно снижено число волосяных фолликулов, наблюдается аномально ранняя атрофия тимуса. Так же нарушение двигательной активности, наблюдаемое в течение всей жизни гомозиготных животных, свидетельствуют о том, что в течение всей жизни этих мышей присутствуют и неврологические нарушения [Takahashi et al., 2000].

И у мыши и у человека белок Klotho присутствует в двух формах: трансмембранной и растворимой внеклеточной, причем у человека доминирует растворимая форма. Белок Klotho с кровотоком достигает органов-мишеней и иногда его называют гормоном, противодействующим старению [Shiraki-Iida et al, 1998]. При изучении полиморфизма гена в различных этнических популяциях человека были обнаружены аллели, отличающиеся более высоким уровнем экспрессии белка, так и более низким. Было показано, что носительство более функциональных аллелей Klotho снижает, а носительство менее функциональных - повышают риск развития таких ассоциированных со старением заболеваний, как остеопороза, атеросклероза, гипертонии и коронарной недостаточности [Arking et al., 2002; 2003; 2005].

До сих пор детально не известен биохимический эффект к которому приводит нокаутирование гена Klotho. По некоторым данным можно предположить, что ген Klotho кодирует белок, который является супрессором сигнального пути инсулина, то есть в данном случае генетический дефект затрагивает примерно те же биохимические каскады, что и у линий мышей с увеличенной продолжительностью жизни. По последним данным, Klotho воздействует на процессы старения через репрессию каскада р53/р21. Осенью 2006 года была опубликована статья, где было показано, что блокирование транскрипции гена Klotho в культуре фибробластов человека вызывает преждевременное старение культуры (снижение уровня пролиферативной активности), и повышает уровень активности гена, кодирующего белок р21. Известно, что снижение уровня активности р21 приводит к остановке клеточного цикла на границе G1/S фаз [de Oliveira, 2006]

Генетическая линия р53-А.

Еще одна линия мышей со сроком жизни, укороченным на 20-25%, была получена методом инактивации гена р53 [Tyner et al., 2002]. Продукт гена р53 играет важную роль в регуляции таких важных процессов, как клеточное деление, апоптоз, клеточный ответ на стрессовое воздействие окружающей среды, и известно, что около 50% случаев рака у человека связаны с присутствием в трансформированных клетках мутаций в гене р53. Мыши гомозиготные по данной мутации, также погибают на ранних этапах онтогенеза от многочисленных нарушений развития. А мыши, имеющие одну нормальную копию гена р53 и одну мутантную, кроме очень высокой устойчивости к раку, так же демонстрируют несколько процессов, которые обычно связывают со старением и которые по видимому связаны со снижением пролиферативной активности в различных органах и тканях. Это атрофия мышц и некоторых других тканей, медленно заживление повреждений, остеопороз, потеря волос и некоторые другие нарушения. Создатели линии предполагают, что из-за нарушения процессов клеточной пролиферации и апоптоза у мышей происходит значительно более быстрая гибель клеток в разных тканях организма, которая не успевает замещаться за счет пролиферации. Так же высказывалось предположение, что повышенная клеточная гибель у этих мышей приводит к преждевременному истощению популяций стволовых клеток - основного источника репарации тканей организма позвоночных животных.

Генетическая линия KU-80 -/-.

Еще одна модельная линия мышей - это мыши, у которых нокаутирован ген KU-80 [Lim et al., 2000]. Средняя продолжительность жизни этих мышей составляет около 35 недель, что почти в 3 раза короче, чем 100 недельная продолжительность жизни у контрольных животных. Так же как и в случае модельных линий мышей, рассмотренных ранее, кроме укороченной продолжительности жизни у этих мышей наблюдаются остеопороз, кожная атрофия, потеря волосяных фолликулов и некоторые другие нарушения, связанные с процессами старения. Так же как и у мышей гетерозиготных по нокаутированному гену р53, у мышей линии KU-80-/-достоверно реже происходит раковое перерождение клеток, чем у интактных мышей. Так же другие линии карликовых мышей, KU-80-/-мыши, начиная с возраста 2.5 недель, существенно отстают в росте от интактных мышей и имеют значительно меньшие размеры. Возможно, что и в данном случае ускоренное старение связано с прогрессирующей и не замещаемой потерей клеток в органах и тканях. Причина нарушений пролиферации и активации процессов клеточной гибели - в нарушении репарации двойных разрывов в ДНК у мышей KU-80-/-, приводящих к геномным аномалиям и индукции апоптоза.

Генетическая линия Xpd -/-.

Еще одна модельная линия мышей с ускоренным старанием - это мыши, несущие мутацию в гене Xpd [Andressoo et al., 2006; De Boer et al., 2002]. Этот Ген кодирует ДНК-хеликазу, участвующую как в репарации повреждений ДНК, так и в процессах транскрипции. Произведенный нокаут этого гена не выключил полностью ДНК-хеликазу, но значительно снизил ее активность. В результате существенно нарушенными оказались процессы транскрипции и в значительной мере сниженными оказались процесс репарации ДНК. Продолжительность жизни таких мышей сокращается в два раза (12 месяцев по сравнению с 24 месяцами у контрольных животных). В этом случае так же наблюдается стандартный комплекс процессов, характерных для мышей других модельных линий -остеопороз, ранняя потеря волосяных фолликулов, снижение фертильности самок. Хотя такие мыши рождаются нормального веса и размера, в 2 месяца их вес на 10-20% меньше, чем у контрольных животных, а вышеперечисленные признаки старения обнаруживаются уже к 6-му месяцу жизни. По-видимому, в этом случае так же нарушен баланс между пролиферацией клеток и апоптозом. Так как нарушение процессов репарации поврежденной ДНК может приводить к включению программы клеточной гибели. Однако в этом случае не были проведены исследования на сколько эти процессы затрагивают популяцию стволовых клеток [Wijnhoven et al., 2000].

Все эти генетические линии доказывают, что, как и в случае прогерий человека в результате мутации всего одного гена оказывается нарушенной работа целой системы, влияющей на продолжительность жизни особи. Однако хотя такие модели являются информативными с точки зрения изучения некоторых молекулярных механизмов, влияющих на конкретные процессы, связанные с ростом и развитием, а также с клеточной гибелью, для исследования процессов старения, протекающих в условиях, приближенных к нормальным в последние годы все больше используют модель, характеристика которой будет приведена в следующем разделе.

II.2.3. Процессы старения у мышей линий SAM - проявление на различных уровнях организации

Мыши с ускоренным старением (Senescence-Accelerated Mice) были получены в Киотском университете методом сибсовых скрещиваний мышей линии AKR/J, полученных из США (Jackon laboratory, Bar Harbor, ME, USA) в 1968 году. При позднейшем проведении молекулярно-генетичесого анализа животных линии SAM было установлено, что вначале селекции линии мышь линии AKR/J была скрещена с неизвестным партнером (микросаттелитный анализ). Линии мышей с ускоренным старением (SAM) подразделяются на две группы: собственно линии мышей с ускоренным старением (SAMP) и родственная им линия, не проявляющая признаков ускоренного старения (SAMR). В настоящее время существует 9 линий мышей SAMP (SAMP1, SAMP2, SAMP3, SAMP4, SAMP5, SAMP6, SAMP7, SAMP8, SAMP9) и 3 линии мышей SAMR (SAMR1, SAMR4, SAMR5), многие особенности которых достаточно четко охарактеризованы создателями линии [Takeda et al, 1981, 1991, 1994, 1997; Hosokawa, Abe et al 1997; Hosokawa2002J. Для разделения мышей на две эти группы использовались такие признаки как продолжительность жизни, степень старения в возрасте 8 месяцев и наличие заболеваний, связанных с возрастом, а так же выраженность этих заболеваний. Мыши линии SAMR, хотя и происходят от тех же предков, что и мыши линии SAMP имеют существенно большую среднюю продолжительность жизни, а так же признаки старения у них начинают проявляться в более старших возрастах. Детальный патологоанатомический анализ, проведеный основателями линии показал, что у разных подлиний мышей линии SAM хотя и обнаруживаются нарушения, связанные со старением. Причинами смерти, которые обнаруживались у мышей линии SAM в ходе патологоанатомических исследований, являлись формирование абсцессов, пневмония, нарушения функции почек, перерождение лимфоидных клеток.

Эти причины смертности мышей SAMP встречаются у всех линий, хотя каждая из них может быть более представлена у одной линии, чем у другой.

В современных исследованиях различают три варианта процессов старения: нормальное старение, ускоренное старение и раннее старение. В случае ускоренного старения возрастные изменения проявляются в те же сроки, что и в случае нормального старения, но связанные со старением изменения организма идут более быстрыми темпами. Термин "раннее старение" относится к тем случаем, когда признаки старения начинают проявляться в достаточно раннем возрасте, значительно раньше, чем при нормальном старении (часто даже до начала полового созревания). Модельные линии мышей, у которых признаки старения связаны с внесением в геном мутаций определенных генов, функции которых жизненно необходимы во время всех периодов онтогенеза животного (линия Klotho-/-, линия р53+/- и т.п.) безусловно, относятся к варианту «раннее старение». В особенности это касается тех линий животных, где для поддержания популяции скрещиваются особи гетерозиготные по мутантному гену, а гомозиготы проявляли признаки старения, начиная с самого раннего возраста, и не были способны к размножению. Мыши линии SAM, хотя и несут, по-видимому, некоторые функциональные нарушения генома, первые месяцы онтогенеза проходят у них без функциональных отклонений. Из-за процессов, связанных с ускоренным старением, средняя продолжительность жизни у различных линий мышей SAMP составляют 37-73% от средней продолжительности жизни мышей линии SAMR1, а выраженность признаков старения в возрасте 8 месяцев у мышей SAMP в 1.5-3.5 раза выше, чем у мышей SAMR1 того же возраста и содержавшихся при тех же условиях [Takeda, 1994]. Таким образом, мыши линии SAMP относятся не к варианту «раннее старение», а к варианту «ускоренное старение».

Поведение клеток мышей SAM в культуре in vitro.

Остается нерешенным один из вопросов, на который обращают внимание многие исследователи линии SAMP. Это вопрос о том, проявляются ли процессы старения только на уровне организма, то есть на уровне собственно мыши, или также существуют возрастные изменения на клеточном уровне. Для того чтобы ответить на этот вопрос проводились различные исследования в культуре in vitro [Hosakawa, Fuisava et al, 1997]. В этих работах изолированные фибробласто-подобные клетки из дермы кожи спинной области, взятые у мышей линий SAMP11 и SAMR1 в неонатальный период, культивировали in vitro в течение ряда пассажей. Динамика клеточной популяции in vitro оказалась достаточно схожей у обеих этих линий. Все клеточные культуры проходили через период снижения пролиферативного роста и впоследствии формировали иммортализированные клоны. Во время кризиса наблюдались изменения клеток характерные для процессов старения. Так значительно удлинялось время удвоения клеточной популяции [Hosakawa, 1994]. Цитогенетические исследования показали, что в соматических тканях мышей SAMP однонитевые разрывы ДНК накапливаются с большей скоростью, чем у мышей SAMR [Не, Yasumoto, 1994; Tobita et al., 1994]. В клетках костного мозга как мышей линии SAMP1, так и SAMR1, было обнаружено возрастное увеличение частоты сестринских хроматидных обменов, причём эта частота была выше у линии, склонной к ускоренному старению. При этом частота хромосомных аберраций была у обеих линий одинаковой на протяжении всей жизни [Lee et al., 1994]. При проведении анализа клеток методом проточной цитометрии и методом хромосомного анализа митозов было показано, что в период кризиса роста в культуре значительно увеличивается процент полиплоидных клеток, а в некоторых случаях диплоидная популяция в основном замещается на клетки с повышенной плоидностью. Но при культивировании клеток, полученных от линии SAMP11, эти изменения происходят быстрее и на более ранних пассажах, чем в культуре клеток, полученных от линии SAMR1. Хотя некоторые различия в биохимии клеток этих линий обнаруживаются с самых первых пассажей культивирования, так концентрация продуктов перекисного окисления липидов в клетках первичной культуры у SAMP11 на 50% выше, чем у SAMR1. Также было показано, что клеточные культуры, полученные из мышей линии SAMP11, оказываются более чувствительными к различным факторам культивирования (внешним факторам), включая условия окислительного стресса[Fugiscrwa, 1998]. В связи с этим встает вопрос о том, изменяется ли активность перикисного окисления липидов в клетках с возрастом. При измерении уровня липидных пероксидаз в различных тканях (мозг, сердце, печень, почки и легкие) у мышей линий SAMP8 и SAMR1 в возрасте 3,6 и 9 месяцев были обнаружены межлинейные различия: концентрация пероксидаз была достоверно выше у SAMP8, чем у SAMR1 во всех возрастных группах. В тканях мозга и у SAMP8, и у SAMR1 концентрация не изменялась с возрастом, но во всех периферических органах тканевая концентрация пероксидаз достоверно возрастала [Matsugo et al., 2000]. Таким образом, окислительный стресс оказывает негативное воздействие на клетки периферических органов как in vitro, так и in vivo и, скорее всего, является одной из причин как преждевременного старения, так и клеточных аббераций в культуре у мышей SAM.

Мыши линии SAMP как модель для исследования заболеваний, связанных с возрастными изменениями.

Исследования различных патологий мышей линии SAMP, связанных с возрастом, показали, что эти патологии являются достаточно подходящими моделями для исследования процессов, составляющих многие возрастные заболевания, характерные для человека. Эти возрастные изменения включают в себя такие, имеющие важное значение для современной гериатрии, заболевания, как старческий остеопороз, связанные с возрастом проблемы обучения и памяти, атрофические изменения переднего мозга, атрофия сетчатки, старческий амилоидоз, процессы старения иммунной системы [Takeda et al., 1981; 1997]. У разных подлиний SAM при старении обнаруживаются различные заболевания и нарушения, сходные с теми, которые проявляются в старших возрастах у человека.

В современной гериатрии возрастные заболевания человека принято делить на две категории. Первая группа - это различного типа функциональные дисфункции проявляющиеся, как правило, в поздние годы жизни, и которые при помощи методов современной медицины могут быть предотвращены либо скорректированы при помощи постоянного контроля и лечения. Другие заболевания, это заболевания, которые являются следствием изменений происходящих в стареющем организме. Это процессы, составляющие собственно неотвратимую часть старения, как на физиологическом, так и на цитологическом уровнях, следствием чего является прогрессивное старение и смерть организма. Те нарушения, связанные со старением, которые наблюдаются у линии мышей SAMP, могут быть отнесены именно к этой второй группе заболеваний. На клеточном уровне это проявляется в изменении процессов клеточной пролиферации, клеточного выживания и способности клеток к дифференцировке, что приводит в результате к значительным нарушениям на тканевом и органном уровнях и развитию старческих дегенеративных заболеваний. Морфологические изменения мышей SAM, обнаруживающиеся при старении (остеопороз, лордокифоз, облысение, катаракта и т.д.), хотя и сопутствуют возрастным изменениям, однако не являются несовместимыми с жизнью возрастными изменениями. При детальном патогистологическом анализе различных органов и тканей мышей SAM (1337 особей подлиний SAMP и 435 - SAMR) были выявлены обширные нарушения: воспалительные процессы и абсцессы легких, дегенерация почечных канальцев, ангионекроз, кисты внутренних органов и т.п.

Таблица II-1. Проявление болезней старения у мышей SAMP, (по Hosokava, 1997, с изменениями) Системные нарушения Подлинин мышей

Опорно-двигательнан система

Старческий остеопороз SAMP6, SAMP6/Ta

Нервная система и органы чувств

Трудности в обучении и дефекты SAMPl/Ngs, SAMP8, SAMP8/Ta, SAMP 10, памяти SAMP10//Ta

Атрофия переднего мозга SAMP 10

Эмоциональный дисбаланс SАМР8/Та, SAMP 1 О/Та

Абиормальные циркадные ритмы SAMP8/Ta, SAMP 1 О/Та

Атрофия сетчатки SAMP1

Старческая катаракта SAMP 1, SАМР2А

Дыхательная система

Патологии легких SAMP 1, SAMP2A

Иммунная система

Нарушение иммунного статуса, SAMP 1, SAMP2, SAMP2A связанного со старением

Система метаболизма

Старческий амелоидоз SAMP1, SAMP2, SAMP2A, SAMP7, SAMP9,

SAMP 10, SAMP 11

Сердечно-сосудистая система

Патологические изменения аорты SAMP11

Нарушение SAMP8 гематоэнцефалического барьера

С другой стороны, кроме множественных дегенеративных изменений тканей у погибших животных старших возрастов были выявлены различные типы лимфом, лимфосаркома, другие неопластические изменения лимфоидных клеток, гемангиома, аденома и другие патологические изменения, связанные с новообразованиями. Большая часть патологических изменений достоверно чаще обнаруживалась у мышей подлиний SAMP, чем у мышей SAMR [Takeda et al., 1981; 1997]. Фактически, гистологические нарушения, обнаруженные у ускоренно стареющих мышей старших возрастов, это, во-первых, дегенеративные изменения, связанные с резким снижением репаративной активности, а во вторых - неопластические изменения. То есть, возрастные события, происходящие у мышей SAM in vivo, соответствуют нарушениям поведения клеток в культуре (с одной стороны - снижение пролиферативной активности, с другой - иммортализация клеток). Таким образом, линии ускоренно стареющих мышей, которые ранее были рекомендованы как адекватные модели для биохимических исследований, демонстрируют многочисленные возраст-зависимые гисто- и цитологические изменения сходные с таковыми, обнаруживаемыми при старении у людей и часто являющимися причинами фатального исхода.

Высокая частота неопластических образований у мышей SAM дает возможность предполагать, что ускоренное старение в данном случае может быть связано с мутациями генов или с более крупными хромосомными нарушениями, вызванными активацией эндогенного мышиного вируса лейкемии, либо же с какими-то другими генетическими факторами, например с гомозиготностью по рецессивным аллелям, способствующим развитию заболеваний, связанных со старением. Так, аллель Ароа2с, гена липопротеина высокой плотности A-II (ароА-П), который накапливается при старческом амилоидозе, вызывает это заболевание у мышей SAMP1 старших возрастов [Kitagawa et al., 1994, Higuchi et al, 1997]. В данном гене у мышей наблюдается высокая степень полиморфизма и в разных инбредных линиях было обнаружено 7 его аллелей, с разной степенью способствующих проявлению патологии. У мышей линии SAMR1 присутствует другой аллель - Ароа2Ь, при котором нарушения липидного метаболизма и старческий амилоидоз отсутствуют. Несколько лет назад была получена подлиня мышей SAMP1, где аллель Ароа2с (способствующая амилоидозу) была заменена на аллель Ароа2Ь (вариант, не вызывающий амилоидоз), взятую у мышей линии SAMR1. При исследовании влияния этой аллели на липидный обмен, развитие амилоидоза, а также на скорость старения мышей SAMP1- Ароа2Ь. российская д1 государственная библиотека

Полученные данные показали, что хотя у этих мышей амилоидоз не развивался, продолжительность жизни и динамика смертности у мышей SAMP1 остались прежними, то есть аллель Ароа2с отвечает именно за развитие заболевания, но не за раннюю смертность мышей SAMP1 [Wang et al„ 2000].

Из изложенных выше данных можно сделать вывод, что однозначного ответа на вопрос, почему эти мыши стареют с такой высокой скоростью, пока не существует. Ясно одно: в ускоренном старении мышей SAM, как и в нормальном физиологическом старении, задействовано множество генов, что отличает данную модель от искусственных моногенных моделей, таких, как, скажем, мыши klotho [Киго-о, 2001].

В заключении рассмотрения патфизиологических особенностей этих линий мышей хотелось бы отметить два принципиальных отличия линий SAM, от других линий мышей с генетически измененной продолжительностью жизни. Во-первых, мыши разных подлиний SAM хотя они и имеют общее происхождение, проявляют различные комплексы старческих и дегенеративных заболеваний, в пределах одной подлини SAMP или SAMR также наблюдаются поражения различных органов и систем организма. То есть, несмотря на то, каковы были исходные причины их генетической нестабильности, патологии старших возрастов у них так же разнообразны, как у любой гетерогенной популяции, в том числе и у человека. Это делает мышей SAM адекватной моделью для комплексных исследований причин и механизмов старения.

Во-вторых, мыши SAM (в отличие от нокаутных моногенных моделей) имеют полный жизненный цикл (включая и репродуктивный период): генетический груз, приводящий к ускоренному старению и уменьшению продолжительности жизни, проявляется на цитогистологическом и морфологическом уровнях только в старших возрастах. В данном случае этот процесс можно считать не проявлением прогерии, а нормальным физиологическим старением. Это делает мышей

SAM адекватной моделью для исследований процессов старения при нормальном онтогенезе.

Уровень смертности в любой популяции животных организмов различен для различных возрастных страт. Достаточно высокий уровень смертности наблюдается среди младшей возрастной группы (детеныши). Фактически, если исключить катастрофические события, причиной этого являются два аспекта: первый - гибель молоди, имеющей различной степени тяжести генетические дефекты; второй - не до конца сформированная иммунная система у молодых особей, в следствии чего они более реактивны при воздействии различных патогенов. Уровень смертности в любой популяции увеличивается в старших возрастных группах. При исследовании уровня смертности в популяции традиционно используется модель Гомпертца, позволяющая учитывать динамику изменения уровня смертности (время, за которое происходит удвоение уровня смертности) [Finch, 1990; Mueller, 1995]. Известно, что смертность по причине болезней, связанных с мутациями, может происходить фактически до развития старческих изменений. Применение логистических моделей, оценивающих изменение в уровне смертности в различных возрастных стратах, дает выявить является ли старение доминирующей причиной в группе. Так, при помощи логистических моделей, основанных на параметрах Гомпертца, было показано, что из 20 линий мышей, используемых в геронтологических исследованиях, фактически, только для линий SAM, были получены графики дожития, характеризующие их как модель с ускоренным старением, [de Magalhaes et al., 2005].

Окислительный стресс - как возможная причина ускоренного старения у мышей линий SAM.

Комплекс цитологических и биохимических нарушений, происходящий у мышей линий SAM практически полностью может быть объяснен с позиций свободно-радикальной теории старения. Так, в тканях мышей с ускоренным процессом старения наблюдается более интенсивное, чем у контрольных животных, окислительное повреждение тканевых структур, что также косвенно может отражать более высокий уровень свободных радикалов в их тканях. Было продемонстрировано повышенное количество диеновых коньюгатов в липидной фракции печени SAMP1 по сравнению с SAMR1, причем эта разница с возрастом увеличивалась [Park et al., 1996]. В тканях мозга мышей линии SAMP8 показано отчетливое накопление карбонилов белков [Kurokawa, 1999] и повышение уровня окисленных белков цитоскелета [Butterfield et.al., 1998]. В тканях мышей линии SAMP1 наблюдается развивающееся с возрастом накопление продуктов свободнорадикального окисления липидов [Mori et al., 1998], в том числе липидных гидроперекисей [Matsugo et al., 2000], увеличение частоты хромосомных аберраций в клетках костного мозга [Takeda et al., 1991]. В мозге мышей линии SAMP8 наблюдались нарушения ядерной ДНК [Kamatsu, Hiramatsu, 1999]. Продемонстрированы также окислительные нарушения ДНК в клетках печени, мозга, мышц, легких и слизистой [Hosokawa et al., 2000]. Все эти данные косвенно подтверждают наличие в тканях мышей линии SAMP1 глубоких нарушений в метаболизме активных форм кислорода, что может являться одной из причин ускоренного процесса старения. Окислительный стресс, характерный для мышей этой линии делает мышей SAM эффективной моделью для исследования действия на ткани и органы различных фармакологических веществ и, прежде всего, антиоксидантов в целях выявления соединений (а также их эффективных доз и методов введений), которые могут быть предложены как геропротекторные средства.

II-3. Репарация тканей организма за счет внешних источников

Во многих случаях повреждения, происходящие на тканевом уровне и приводящие, в конечном итоге, к нарушению функций организма, происходит за счет внутренних ресурсов (клеточных источников). Однако, при наличии серьезных нарушений (в том числе и по причине исходных генетических аномалий) собственных источников для восстановительных процессов может быть недостаточно.

Идея активации регенерационных процессов в поврежденной или стареющей ткани организма при трансплантации клеточной суспензии активно обсуждается в научной литературе, начиная с 60 годов прошлого века. В 1961 году Till и McCulloch показали, что внутривенное введение костно-мозговых клеток от здоровой сингенной летально облученной мыши приводит к образованию колоний из клеток всех направлений гемопоэтической дифференцировки в селезенке [Till et al., 1961]. В 1970-ых годах А.Я.Фриденштейн и его сотрудники пересаживали клонообразующие фибробластоподобные клетки, полученные при культивировании клеток, выделенных из костного мозга, под капсулу почки мыши в диффузионной камере, что приводило к формированию костной или жировой ткани [Friedenstein, Shapiro-Piatetzky, 1966; Friedenstein, Chailakhjan, 1970]. В последние годы, в связи с развитием методов клеточной и молекулярной биологии, позволивших культивировать и генетически трансформировать практически любые типы клеток, а также в связи с развитием прикладной трансплантологии, разрабатывающией методы трансплантации при различных органных и тканевых патологиях у человека, направление исследований по клеточным трансплантациям приобрело особенно актуальное значение. Работы, посвященные исследованию поведения донорских клеток после ксено- алло- и аутотрансплантации, имеют как фундаментальное, так и практическое значение.

В настоящее время методы трансплантации клеток используют в фундаментальных исследованиях:

• для изучения раннего эмбриогенеза тканей и органов;

• для исследования дифференцировки тканей и клеток разных типов;

• для изучения процессов взаимодействия различных типов клеток между собой, в том числе и для конструирования органов in vitro;

• для исследования влияния микроокружения на дифференцировку клеток;

• для получения генетических химер, в том числе для изучения механизмов иммунитета и иммунного отторжения тканей;

• для получения моделей генетических заболеваний человека;

• для изучения механизмов старения и т.д.

В клинической практике методы трансплантации клеток применяют (или исследуют возможность применения):

• для лечения заболеваний системы крови (лейкозы, анемии, метаболические болезни, аутоиммунные заболевания);

• для лечения врожденных иммунодефицитных состояний,

• для коррекции иммунодефицитных состояний после химиотерапии и облучения,

• для лечения генных заболеваний человека самой различной природы (метаболические заболевания, дегенеративные заболевания и др.)

• для лечения острой печеночной недостаточности, цирроза и наследственных метаболических заболеваний печени;

• для лечения различных миодистрофий;

• для лечения дегенеративных заболеваний нервной ткани, инсультов, паркинсонизма и др.;

• для лечения генетических и дегенеративных заболеваний репродуктивной сферы;

• для коррекции инсулин-зависимого диабета тяжелых форм течения;

• для лечения дегенеративных и иных поражений кожи, слизистой, хрящей, глаз, уха и пр.;

• для внутриутробной коррекции наследственных дефектов.

Для большей части этих задач вопрос получения собственных унипотентных стволовых клеток проблематичен. В части тканей и органов стволовые клетки либо отсутствуют, либо присутствуют в недостаточном для выделения количестве. Для лечения части из вышеперечисленныхзаболеваний предполагается использовать собственные стволовые клетки пациента, но если причиной развившегося заболевания является генетический дефект организма, то они также будут нести данную мутацию.

П.ЗЛ.Типы стволовых клеток и их потенции к дифференцировке

Изучение недифференцированных клеточных источников регенерации и репарации тканей организма имеет как чисто теоретическое, так и большое практическое значение [Репин 1998]. В настоящее время две основные проблемы ограничивают применение клеточной терапии. Во-первых, это необходимость одномоментного введения пациенту огромного количества клеток, которые должны быть выращены в культуре in vitro и часто в очень короткие сроки. Вторая проблема состоит в том, что клетки, трансплантируемые пациенту, должны быть направлены по нужному пути цитодифференцировки, а знания этих процессов, которыми располагают современная биология и медицина еще далеко не полны, а в некоторых случаях фрагментарны. В настоящее время разрабатываются методические подходы с использованием трех основных клеточных источников: эмбриональных стволовых клеток, полипотентных прогениторных клеток и унипотентных прогениторных клеток.

Унипотентные стволовые клетки

УПСК могут быть получены как из эмбриональных тканей, так и от взрослых доноров. Многие ткани взрослого организма человека, как и других млекопитающих, имеют некоторую способность к регенерации за счет того, что в их состав входят стволовые унипотентные клетки. В последнее время стволовые клетки выделяют из многих источников, включая кровь, кожу, ЦНС, печень, ЖКТ и скелетные мышцы (табл. Ill-1).

Данная модель является наиболее простой для анализа и применения в клинике и поэтому попытки использовать ее в клинике предпринимаются уже более 10 лет [Law, 1992; Gage et al, 1995, 2000; Svendsen et al, 1999]. При трансплантации недифференцированных клеток всегда остается риск их спонтанного перерождения и унипотентные клетки с этой точки зрения представляются наименее опасными. К тому же при наращивании клеточной массы in vitro достаточно легко подобрать условия, обеспечивающие сохранение фенотипа таких клеток в течение многих пассажей, так как такие клетки, как правило, достаточно жестко коммитированы и дифференцируются в один, определенный тип ткани

Главный недостаток унипотентных прогениторных клеток напрямую вытекает из их главного достоинства - это недостаточная пластичность. Все органы тела животного (и человека) состоят из разных типов клеток и трансплантация унипотентных прогениторных клеток, с этой точки зрения представляется недостаточной для функционального восстановления органа. Но в последнее время появляются работы, в которых представлены аргументы что стволовые клетки разных тканей обнаруживают пластическое поведение в зависимости от состава среды культивирования в экспериментах in vitro или от сигналов от поврежденной ткани в экспериментах in vivo. Так, например, показано, что миобласты, которые являются одной из наиболее полно изученных моделей тканевой культуры и рассматриваются как полностью предетерминированные к дифференцировке в мышечную ткань, могут испытывать трансдифференцировку в адипоциты после внесения транскрипционных факторов PPAR (peroxisome-proliferator-activated receptor) и культивировании в гормональном коктейле, состоящем из дексаметазона, синтетического лейкотрина и инсулина. Иногда может быть достаточно активации всего лишь одного гена для изменения судьбы УПСК. Так, клетки линии миобластов С2С12 превращаются а адипоциты после трансфекции доминантно-негативной версией транскрипционного фактора TCF4, в их цитоплазме появляются капельки жира и они экспрессируют характерный для адипоцитов белок, связывающий жирные кислоты [Tosh, Slack, 2002].

Плюро- и полипотентных стволовые клетки.

Одним из наиболее перспективных источников клеток для клеточной терапии в настоящее время считаются мезенхимные стволовые клетки (МСК). Среди исследователей до сих пор продолжаются споры о терминологии для стволовых клеток костного мозга. Некоторые авторы считают более правильным все-таки называть их стромальными стволовыми клетками [Чайлахян и др., 2001; Bianco et al., 2001], поскольку мезенхимы как таковой во взрослом организме не существует. При употреблении термина МСК, сегодня принято иметь ввиду, что в данном случае речь идет о клетках, произошедших из эмбриональной мезенхимы на ранних стадиях развития, но сохранивших плюрипотентность во взрослом организме. Доказано, что МСК или МСК-подобные клетки присутствуют в строме костного мозга, синовиальная оболочка, мышцах, жировой ткани, а также в небольшом количестве могут быть выделены из циркулирующей крови. МСК являются плюрипотентными, они способны пролиферировать как недифференцированные клетки, имеют фибробластоподобный фенотип в культуре, образуют монослой и обладают выраженными адгезивными свойствами. МСК могут служить предшественниками многих клеточных линий, включая остеобласты, адипоциты, хондробласты, кардиомиоциты и миобласты. Было также показано, что МСК способны дифференцироваться в различные клетки немезенхимного происхождения, такие как астроциты и гепатоциты [Шегельская и др., 2003; Jorgensen et al, 2004; Gregory et al., 2005; Dezawa et al., 2005]. Для фундаментальной науки МСК представляют интерес с точки зрения изучения механизмов клеточной дифференцировки, регенерации тканей, взаимодействия различных клеточных типов в процессе эмбриогенеза и постнатальном развитии. Во многих органах и тканях млекопитающих на всех этапах онтогенеза обнаруживаются клетки, обладающие более высокой потентностью. В последние несколько лет появилось большое количество публикаций, представляющих для обсуждения как результаты исследований, так и обзоры, касающиеся данной модели. Доказано, что в некоторых органах и тканях не только эмбриона, но и взрослого организма присутствуют клетки, которые при дифференцировке в разных условиях могут давать разные клеточные линии. Наиболее богата прогениторными клетками костномозговая ткань. Зрелый костный мозг содержит как гемопоэтические, так и стромальные клетки. Имеются данные, что обе эти линии имеют общего предшественника, способного дифференцироваться как в клетки гемопоэтического ряда, так и в стромальные клетки [Hall et al., 2001]. В костном мозге человека продуцируется до 1011 терминальных клеток в день [Габбасов и др., 2003]. Считается, что эту потребность обеспечивает небольшая доля полипотентных стволовых клеток, находящихся в митотическом цикле, в то время как остальные полипотентные стволовые клетки находятся в фазе покоя. Полипотентные стволовые клетки обеспечивают две потребности взрослого организма: поддержание исходного пула и уход из него части клеток в дифференцирующуюся фракцию. Костномозговую ткань наиболее часто используют как источник полипотентных стволовых клеток для ауто- или аллогенной трансплантации. Стромальные клетки костного мозга (СККМ) обладают значительно большей пластичностью, чем это считалось ранее. Полипотентность этих клеток не ограничивается ретикулярной, хондрогенной, остеогенной и адипозной дифференцировкой. В опытах in vitro и in vivo из СККМ были выращены миобласты [Gussoni et al., 1999], гепатоциты [Lagasse et al., 2000], нервные клетки [Mezey et al., 2000; Brazelton et al., 2000], эндотелиальные клетки [Grant et al., 2002; Kocher et al., 2001], эпителий кожи и различных внутренних органов [Krause et al., 2001]. Они становятся альтернативой эмбриональным стволовым клеткам, использование которых неизбежно связано с эмбриональным клонированием человека. Подробнее потенции СККМ к различным типам дифференцировок будут рассмотрены ниже в отдельной главе. Недостатки использования СККМ заключаются в сложности предсказания их поведения in vivo, разнице в поведении в различных модельных системах, сложности в соотнесении результатов, полученных in vivo и in vitro.

Томипотентные эмбриональные стволовые клетки (ЭСК).

Наиболее пластичными являются эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). Впервые линии ЭСК были получены из внутриклеточной массы бластоцисты мыши в 1981 году [Evans, Kaufman, 1981; Martin, 1992]. Такие клетки, хотя и не являются тотипотентными в полном смысле этого слова (то есть не могут дать начало целому организму), но сохраняют паттерн генной экспрессии, характерный для клеток эпибласта внутренней клеточной массы бластоцисты и экспрессируют те белки, присутствие которых в настоящее время связывают с тотипотентностью клетки. В них экспрессируется специфический эмбриональный антиген SSEA-1, эндогенная щелочная фосфатаза [Resnick et al., 1992], специфический транскрипционный фактор Oct4 [Scholer et al., 1990; Nichols et al., 1998]. После введения в полость интактной бластоцисты ЭСК могут участвовать в формировании всех тканей и органов химерного потомства, включая половые клетки. Хотя их дифференцировку in vitro можно направлять в различные клеточные линии с помощью соответствующих эндогенных и экзогенных факторов роста и окружения [Wobus et al., 1991; Bagutti et al., 1996; Guan et al., 1999; McKay, 2000], в настоящее время в достаточной степени не разработаны технологии, позволяющие проводить их направленную дифференцировку, а существующие методики являются многоступенчатыми, сложными и дорогостоящими. Поэтому чистота полученной культуры может оказаться недостаточной для ее использования в клинической практике. Из-за высокой опасности перерождения ЭСК (из-за недостаточной изученности механизмов их пролиферации и дифференцировки и факторов, влияющих на эти процессы) очень важно полностью удалять эти клетки из получаемых культур перед клиническим использованием выращенных клеток-предшественников.

II.3.2. СККМ как материал для клеточных трансплантаций.

Из МСК различного происхождения наиболее полно исследованы стволовые клетки костного мозга (СККМ), которые были впервые описаны Александром Яковлевичем Фриденштейном в 70-е годы как негематопоэтические стволовые клетки, способные дифференцироваться в хондробласты, остеобласты и адипоциты как in vitro, так и in vivo [Fridenstein et al, 1966; 1970; 1974; 1982]. Преимущества СККМ заключаются в легкости выделения их из костного мозга людей любого возраста, поддержания в культуре без потери фенотипа и мультипотентности и в возможности использования их при аутотрансплантациях [Шумаков и др., 2002; Carvalho et al, 2004]. СККМ несут на своей поверхности такие антигенные детерминанты как: Thy-1 (CD90), эндоглин (CD 105), SH2, SH3, CD29, CD44, CD71, CD 120а, CD 124 и молекулу клеточной адгезии сосудов 1 (VCAM-1) (CD 106), но не имеют CD 14, CD34, CD45 и CD68, которые присущи гемопоэтическим стволовым клеткам [Babh et al., 2004]. СККМ, трансплантированные в эмбрион мыши на стадии бластоцисты, способны включаться во внутреннюю клеточную массу (ВКМ) и участвовать в формировании тканей всех трех зародышевых листков, что является прямым подтверждением плюрипотентности этих клеток [Jiang et al, 2002]. Однако исследование клонов СККМ показало, что только около 30% клеток могут быть индуцированы почти ко всем типам дифференцировок, остальные клетки каждого клона обладают более узкой потенцией к дифференцировкам [Muraglia A. et al., 2000]. Недавно было показано, что потенция к дифференцировке СККМ в пределах одного клона зависит от их непосредственного клеточного окружения. Так, например, клеточная плотность в культуре играет ключевую роль в индукции остеогенеза путем активации экспрессии членов семейства Rho ГТФаз [Jorgensen et al., 2004].

При трансплантации СККМ в ткани они дифференцируются в тот клеточный фенотип, который присущ данной ткани, и это связывают с их способностью выбирать путь дифференцировки в соответствии с тканевым микроокружением. Недавние исследования показали, что концентрация клеток в культуре служит важнейшим параметром, влияющим на их рост и развитие. Так, например, было показано, что клеточная плотность играет ключевую роль в индукции остеогенеза путем активации экспрессии членов семейства Rho ГТФаз [Jorgensen С. et al, 2004]. Интересным является поведение СККМ в культуре, а также влияние микроокружения и других факторов на их дифференцировку, особенно в направлении миогенного ряда. В настоящем обзоре невозможно проанализировать всю литературу, касающуюся дифференцировки СККМ, мы остановимся только на одном аспекте их потенциальных возможностей, непосредственно связанных с материалами, представленными в данной работе - способности СККМ дифференцироваться в клетки миофенотипа при культивировании in vitro и при трансплантации

II.3.3. Некоторые аспекты дифференцировки миобластов

Мышечные клетки начинают дифференцироваться еще в тот период эмбрионального развития, когда они находятся в составе сомита. РахЗ и Myf5, действуя на материал сомита одновременно, но различными путями, активируют экспрессию MyoD, в результате чего определенные клетки дермомиотома комитируются к дифференцировке в мышечные клетки. При активации MyoD ядноядерные миогенные клетки постепенно прекращают делиться и начинают сливаться в миотубы. Наиболее известным маркером этой стадии гистогенеза является миогенин. На более поздних стадиях формирования миотуб (вторичные миотубы) начинается экспрессия MRF-4. Собственно гистогенез поперечно-полосатой мускулатуры начинается с миграции клеток миотомов к местам будущих закладок мышц. Эти интенсивно размножающиеся стволовые мышечные клетки получили название промиобластов. Из части промиобластов после серии митозов формируются инициальные миобласты, способные к слиянию с промиобластами - начинается процесс формирования многоядерных мышечных клеток (миосимпластов). Начиная со стадии миобластов в дифференцирующихся мышечных клетках прекращается синтез ДНК и начинается синтез специфических мышечных белков [Данилов, 1994]. Миобласты и ранние миосимпласты характеризуются возрастающим синтезом миофибриллярных белков, однако образующиеся филламенты не имеют упорядоченного расположения в цитоплазме миосимпласта. По мере присоединения к раннему миосимпласту новых промиобластов длина его увеличивается и он получает название миотубы. Миофибриллы располагаются по периферии миотубы и тянутся вдоль ее длинной оси, а крупные овальные ядра с отчетливо выраженными зернами хроматина также выстраиваются вдоль длинной оси миотубы, занимая центральное положение. Параллельно формированию миотуб происходит дальнейшее размножение промиобластов и образование симпластов. Таким образом, поперечно-полосатые мышцы развивающегося эмбриона содержат мышечные клетки на различных этапах их дифференцировки. По мере развития эмбриона формируется все большее количество мышечных волокон, а количество миотуб и миосимпластов уменьшается (миотубы постепенно превращаются в мышечные волокна и исчезают в период раннего постнатального онтогенеза). В позднем эмбриогенезе и в неонатальный период мышечные трубочки преобразуются в мышечные волокна: их диаметр возрастает за счет значительного увеличения колличества миофибрилл, ядра смещаются к периферии волокна, уплотняются и принимают сплющенную форму. На стадии позднего эмбрионального миогенеза миотубы покрываются базальной мембраной. Промиобласты и миобласты, попавшие под базальную мембрану, плотно прилегают к миотубам не нарушая общего контура мышечного волокна. Часть из них сливается с дифференцирующейся миотубой, а часть преобразуется в миосателлитоциты. Однако в последнее время все чаще высказывается предположение, что предшественники миосателлитных клеток выделяются в отдельную клеточную линию на значительно более ранних этапах дифференцировки мышечной ткани. По мере дифференцировки мышечного волокна происходит и изменение морфологии миосателлитных клеток: количество цитоплазмы уменьшается до небольшего обьема вокруг ядра, их ядра уплотняются и уплощаются, а гетерохроматин занимает около половины площади ядра [Клишов, Данилов, 1981].

В настоящее время достигнут значительный прогресс в изучении молекулярно-биологических и молекулярно-генетических особенностей миогенеза. Результаты этих исследований позволили создать общую картину развития мышц, начиная с самых ранних стадий дифференцировки мезодермы - предшественников клеток миогенного ряда и заканчивая терминальной дифференцировкой, основным элементом которой является синтез специфических мышечных белков [Шубникова и др., 2001].

Для анализа процессов развития мышц в настоящее время сложился комплекс подходов, позволяющих при их реализации достаточно полно описать различные стороны формирования мышечной ткани [Озернюк, 1998; Kablar, Rudniski 2000]. Эти подходы включат:

1) идентификацию генов и белков, вовлеченных в процессы миогенеза;

2) фенотипический анализ мутантов, позволяющий определить роль тех или иных белков в нормальном развитии мышц;

3) изучение регуляции сборки и формирования пространственной структуры миофибрилл.

Вопросы, связанные с миодифференцировкой охватывают большой круг биологических и медицинских аспектов, разные этапы онтогенеза, процессы первичного (эмбрионального) и вторичного (регенерационного) миогенеза. Вопросы миогенеза рассматриваются в огромном числе работ, от ставших классическими, до опубликованных в последние месяцы. В данном обзоре мы рассматриваем только часть этих вопросов, касающихся одного из аспектов миодифференцировки - процесса слияния клеток, превращения одноядерных миобластов в многоядерные миосимпласты и миотубы.

В пролиферирующих миобластах, как правило, наблюдается экспрессия генов MyoD и Myf5 [Kablar et al., 2003]. Эти члены семейства bHLH-факторов экспрессируются в миобластах с момента выделения этой клеточной линии в миотоме и контролируют ход клеточного цикла и ответ миобластов на внеклеточные сигналы. Баланс между позитивными и негативными регуляторами клеточного цикла определяют дальнейшую судьбу миобластов: продолжение деления или дифференцировка. Так циклин-зависимые киназы, регулирующие развитие клеточного цикла, в комплексе со специфическими циклинами отвечают за фосфорилирование белка ретинобластомы (Rb). В дефосфорилированной форме Rb инактивирует E2F, тем самым, накладывая блок на G/ фазу клеточного цикла [Naya, Olson, 1999]. В поддержании пролиферирующих миобластов в митотическом цикле участвуют также факторы роста FGF и TGF-fi. Переход делящихся миобластов в постимитотическое состояние регулируется этими же ростовыми факторами, но выступающими в данном случае в роли негативных регуляторов. Это означает, что данный переход и активация генов миогенина и MRF4 происходят после прекращения действия факторов роста [Озернюк, 2004].

Следующий этап миогенеза связан с прекращением пролиферации миобластов и активацией генов, контролирующих синтез специфических мышечных белков. Это гены миогенина и MRF4. Есть сведения о том, что гиперполяризация внутреннего К+-канала {Kir 2.1) является индуцирующим фактором экспрессии миогенина и MEF2 на раннем этапе миогенеза [Konig et al, 2004]. Программа мышечной дифференцировки тесно связана с клеточным циклом миобластов, активация миоспецифической транскрипции (в том числе, миогенина и MRF4) наблюдается только в том случае, когда ростовые факторы блокируют деление миобластов в фазе G(/Gi клеточного цикла. Остановка деления миобластов в других фазах клеточного цикла не приводит к активации миоспецифических генов. [Montarras D., 1991 J.

В организме млекопитающих (и человека) очень ограниченное количество дифференцировок идет за счет процесса слияния клеток. Фактически, кроме формирования миотуб за счет этого процесса идет только формирование синцитиотрофобласта в эмбриональном развитии человека. Другой случай слияния клеток - это процесс оплодотворения, слияние мембран сперматозоида и ооцита. В некоторых других случаях как в тканях in vivo, так и в культуре in vitro могут присутствовать многоядерные (в основном - двуядерные) клетки, но это явление как правило связано с нарушениями процесса митоза, а не со слиянием отдельных клеток. В некоторых других случаях процесс слияния происходит достаточно редко, например при слиянии макрофагов [Vignery, 2000] Хотя в этом случае слиянию клеток тоже предшествует этап адгезивного взаимодействия (CD47 и CD 172А, иначе называемый рецептором слияния макрофагов), формирование двуядерных клеток является скорее исключением из правила и результат такого слияния - не последующая дифференцировка клеток макрофагального ряда, а появление клетки имеющей выраженные признаки остеофенотипа.

Процесс слияния мембран во всех этих случаях можно разделить на три основных этапа. Во-первых, на предварительной стадии клетки должны узнать друг-друга, то есть установить контакт с использованием поверхностных белков и/или гликопротеинов. Во-вторых, поверхностные белки обеих клеток должны обеспечить аппозицию их мембран в месте будущего слияния. Предполагается, что в этом процессе играют роль не только собственно белок-беловые или белок-липидные взаимодействия, но и процессы, связанные с изменением конформации трансмембранных белков, обеспечивающих максимально близкое расположение мембран взаимодействующих клеток [Smit, Helenius, 2004]. Третьи этапом, необходимым для слияния клеток является собственно процесс перемешивания мембран. Когда мембраны оказываются на достаточно близком расстоянии, происходит сначала перемешивание внешних слоев мембран, а затем и внутренних, целостность мембран нарушается и происходит объединение цитоплазм сливающихся клеток. До сих пор остается неизвестным, является ли участие специфических белков необходимым непосредственно для процесса слияния мембран, так липосомы, используемые для доставки в клетки генных конструкций или фармакологических агентов сливаются с мембранами клеток, хотя не содержат никаких белков в составе своей поверхности.

Условно белки, участвующие в процессе слияния клеток можно разделить на две группа. Это, во-первых, белки адгезии, в том числе и белки специализированных межклеточных контактов (первая и вторая фазы слияния). Во-вторых, это белки участвующие в процессе объединения мембран, в том числе и внутриклеточные, обеспечивающие перестройку цитоскелета, необходимую для увеличения лабильности поверхностных мембран.

Слияние миобластов в процессе первичного (эмбрионального) миогенеза

Слияние клеток во время миогенеза - это сложный многоступенчатый процесс, состоящий из ряда событий, приводящих в конечном итоге к объединению мембран и цитоплазмы мышечных клеток. Клеточные процессы во время слияния миобластов интенсивно изучаются, и эти исследования демонстрируют, что слияние миобластов - это четко скоординированное событие. Благодаря целому ряду белковых, в том числе и кальций-зависимых клеточных взаимодействий миобласты сначала узнают друг друга, затем объединяются, формируя адгезивные контакты, а затем - щелевые [Gorbe et al., 2005]. На следующем этапе происходит параллельное выравнивание мембран миобластов, а затем - их частичное, а потом и окончательное объединение. Излишки мембран миобластов после слияния удаляются в виде пузырьков. Большая часть таких работ выполнена на миобластах, индуцированных к дифференцировке в культуре in vitro, так как возможности исследования межклеточных взаимодействий in vivo всегда сильно ограничены. Молекулярные механизмы, способствующие установлению контактов между миобластами или между миобластами и миотубами исследуются уже довольно давно, однако пока остаются неизвестными многие механизмы, лежащие непосредственно в основе перестройки и объединения мембран при слиянии миобластов и образовании миотуб [Horsley, Pavlath, 2004].

В процессе формирования многоядерных миотуб наиболее детально исследованы изменения ансамбля белков клеточных поверхностей, обеспечивающих установление межклеточных контактов между миобластами и обеспечивающих компетентность к миослиянию (Табл. III-2). Значимость различных молекул для этого процесса хорошо демонстрируется в экспериментах по ингибированию их (или их рецепторов) различными химическими агентами, например, трипсином, туникамицином (ингибитор гликозилирования белков), лектинами и т.п., а также антителами к определенным белкам.

Большая часть этих белков участвует процессах адгезии различных типов клеток и межклеточных взаимодействий. Так, среди белков, присутствующих во внеклеточном матриксе, широко распространен остеопонтин - он был обнаружен у лейкоцитов, макрофагов, эндотелиальных клеток, кардиомиоцитов, а также у миобластов скелетных мышц и миофибробластов. Это кислый фосфорилированный гликопротеин, который содержит Arg-Gly-Asp последовательность, отвечающую за прикрепление клеток и служащий субстратом для адгезии и миграции клеток, но его функция во многом зависит от типа клеток и от стимула, который приводит к экспрессии и секреции данного гликопротеина. Говоря о мышечной дифференцировке, следует указать на повышенное содержание остеопонтина при этом процессе [Pereira, 2006].

Таблица III-2. Молекулы, участвующих в процессе слияния миобластов у млекопитающих при инициации процесса миослияния in vitro.

Молекула Тип клеток Возможная функция Лит. источник

Мембранные белки

Коннекси ны 40,43 Миобласты, миотубы Установление связи между миобластами перед слиянием, связь миобластов с миотубами Gar be et al, 2005, 2006; Araya el al, 2005

ADAM12 (мелтрин) миобласты металлопротеаза Yagami-Hirosima et al, 1995

VLA-4 (а4 integrin) Миобласты, миотубы, первичные миофибриллы адгезия - взаимодействие с VCAM-1 Rosen et al, 1992

VCAM-1 Миобласты, миотубы адгезия - взаимодействие с VLA-4 (•4 integrin Rosen et al., 1992

1)1 иитегрин миобласты рецептор внеклеточного матрикса, участие в процессе слияния миобластов, сборке цитоскелета мышечных волокон Pavlath, Horsley, 2004; Schwander et al., 2003

Kir 2.1 миобласты Индукция повышения внутриклеточного Са+ посредством активации Са+-каналов KonigS., 2004

Са+- каналы Т-типа миобласты, миотубы Индукция притока внутриклеточного Са+ Pavlath, Horsley, 2003

Секретируемые факторы

IL-4 ранние миотубы процесс слияния миобластов с миотубами Pavlath, Horsley, 2003

PGF2a миотубы Активация NFATC2 пути: слияние миобластов с ранними миотубами; регуляция роста скелетных мышечных волокон Pavlath, Horsley, 2003

HGF скелетные мышцы, Активация покоящихся сателлитных клеток, участие в Hayashi, 2004 миобласты регенирирующ ей мышцы регенерации мышечной ткани на ранних этапах

IGF-II миобласты Опосредованное влияние на пролиферацию и дифференцировку миобластов Claire et al., 1996; Florini et al., 1996

Внутриклеточные белки

NFATC2 миобласты, миотубы Участие в слиянии миобластов на ранних этапах; Регуляция экспрессии генов в ранних миотубах Horsley et al., 2001 калпани миобласты, миотубы Воздействие на кортикальный цитоскелет: дестабилизация сарколеммы Schollmeyer, 1986 кальмоду-лип миобласты, миотубы Сенсор уровня Са2+; перестройки цитоскелета; активация сигнального пути NFA Т(семейство транскрипционных факторов) Pavlath, Horsley, 2004

Многие работы по исследованию процесса слияния миобластов основаны на анализе функции в этом процессе белков, которые участвуют в процессе оплодотворения (слияния ооцита и спермактозоида). Так была предпринята попытка идентифицировать роль белка ADAM 12 (a disintegrin and metalloprotease) в процессе слияния миобластов, так как его гомолог ADAM участвует в слиянии сперматозоида и яйцеклетки [Miller et al., 2002; Talbot et al., 2003] Действительно, его экспрессию можно наблюдать и при неотальном развитии мышечной ткани и при дифференцировке линии мышечных клеток С2С12, хотя его функция в слиянии миобластов не известна. Известно, что функция ADAM 12 может выражаться в активации ростовых факторов как при сердечной гипертрофии, или ингибировании миостатина, негативного регулятора роста мышц, но не исключается и его непосредственная роль в прицессе миослияния. Показано, что в процессе миодифференцировки ADAM 12 взаимодействует а9-Р1-интегрином и экспрессия обоих белков существенно увеличивается именно во время слияния миобластов. Однако ингибирование экспрессии ADAM 12 при помощи аитисмысловах олигоиуклеотидов подавляет в основном формирование многоядерных миотуб (5 и более ядер), а на начало процесса слияния (формирование миотуб, содержащих 2-4 ядра), оказывает значительно меньшее воздействие [Lafuste et al 2005]. По-видимому, ADAM 12 является одним из факторов, участвующих в процессе элонгиции миотуб, когда к многоядерной ранней миотубе присоединяются мононуклеарные миобласты, увеличивающие ее размер.

Другой мембранный белок мышечных клеток (как сердечной, так и скелетной мускулатуры), кавеолин-3 представляет собой составную часть кавеол, которые инвагинациями плазмалеммы и участвуют в везикулярном транспорте и передаче сигналов. В отсутствии кавеолина-3 (клеточные линии, полученные от мышей, мутантных по этому гену), миобласты дифференцируются и начинают экспрессировать белки, характерные для более поздних стадий дифференцировки (миотуб и даже мышечных волокон), но не сливаются. Однако, сверхэкспрессия этого белка в миобластах трансгенных по гену кавеолина, также вызывает нарушение процесса миослияния. В этом случае в культуре in vitro миотубы формируются медленнее и содержат меньшее количество ядер, чем при дифференцировке интактных миобластов. По-видимому, любое нарушение везикулярного транспорта с участием кавеолина-3 нарушает процесс слияния мембран миобластов [Volonte et al., 2003]. Другими белками, участвующими в перестройке мембран миобластов являются интегрины. Миобласты дефектные по pl-интегрину присоединяются друг к другу, но не сливаются, вероятно, из-за ошибок в разборке плазматических мембран [Schwander et al., 2003].

Секретируемые и несекретируемые молекулы, участвующие в слиянии миобластов.

Известно, что многие секретируемые миобластами молекулы в течение дифференцировки и образования миотуб могут усиливать их слияние. При культивировании миобластов in vitro показано, что плотность клеток положительно влияет на успех слияния миобластов и что среда, кондиционированная миотубами, улучшает процесс слияния миобластов. По-видимому, к таким секретируемым молекулам относятся как белки, так и вещества небелковой природы. Было показано, что простагландин Е] обеспечивает преждевременное сливание миобластов [Reinecke et al., 2004]. В добавление, катензин В, цистеиновая протеаза лизосом, высвобождается при слиянии миобластов и отвечает за образование больших миотуб.

Некоторые авторы указывают на участие в слиянии миобластов транскрипционного фактора NFATC2. NFATC2 относится к семейству NFAT (ядерный фактор Т клеток), который состоит из четырех транскрипционных факторов, чувствительных к кальцию. Белки NFAT обычно фосфорилированы и находятся в цитоплазме. Но при повышении концентрации внутриклеточного кальция происходит активация кальциневрин фосфатазы, которая дефосфорилирует белки NFAT. Это приводит к их ядерной транслокации, где вместе с другими транскрипционными факторами NFAT связываются с консенсусной последовательностью ДНК и активируют транскрипцию генов. А результатом рефосфорилирования белков NFAT некоторыми киназами является их экспорт из ядра. Экспрессию трех изоформ NFAT(NFATC1-C3) можно наблюдать на протяжении почти всех стадий миогенеза. Уникальная роль NFATC2 состоит в том, что данный фактор участвует только в начальном слиянии, а не в формировании зрелой миотубы. Предполагают, что NFATC2 регулирует рост образующейся миотубы. Дополнительно были обнаружены еще два фактора, стимулирующие слияние миобластов с ранними миотубами: простагландин F2a(PGF2a) и секретируемый цитокин IL-4. Первый фактор активирует NFATC2, а второй - является его конечной мишенью. [Pavlath G.K., Horsley V., 2003].

Следует отметить, что слияние миобластов регулируется рецепторами ростовых факторов на поверхности клеток. Недавние исследования показали, что инсулиноподобные ростовые факторы (IGF I - IGF II) являются аутокринными факторами дифференцировки скелетных миобластов в культуре. mPHK IGF II и белок активируются на начальной стадии миодифференцировки и уровень секреции IGF II коррелирует с биохимической и морфологической дифференцировкой. IGF I и IGF II также усиливают мышечный рост, регенерацию и регулируют массу мышечной ткани во время эмбрионального развития [Stewart, Rotwein, 1996; Ebru Erbay et al., 2003]. Нокаутированные мыши no IGF I оказывались намного меньше по размеру по сравнению с контролем в связи с редукцией мышечной ткани. Напротив, трансгенные мыши с оверэкспрессией IGF-I демонстрировали большую массу тела с гипертрофированной мышечной тканью [HayashiS. etal., 2004].

Низкомолекулярные факторы, участвующие в слиянии миобластов.

Как и при других случаях слияния клеток, в этом процессе важную роль играют Са -зависимые процессы, причем процесс слияния зависит как от концентрации внеклеточного, так и от концентрации внутриклеточного кальция. Отдельно нужно упомянуть о важной роли кальция в процессе слияния миобластов. При низкой его концентрации миобласты присоединяются друг к другу, выравниваются, но не сливаются. Для слияния необходимо повышенное содержание кальция вне клетки. Многие считают, что данная зависимость не относится к дифференцировке миобластов, а касается лишь изменений клеточной поверхности.

Прекращение клеточного цикла миобласта происходит только после начала синтеза некоторых специфических для них белков, таких как, тяжелые цепи миозина. Даже если при этом предотвратить слияние, снизив концентрацию кальция. Согласуется с этим и тот факт, что хелатирующее соединение кальция, ЭДТА, препятствует адгезии миобластов. Внутриклеточный запас кальция также важен для слияния миобластов, так как, действие некоторых веществ, исчерпывающих эти ресурсы клетки, например, кофеина, тапсигаригина, ингибируют процесс слияния миобластов. Известно, что Са "каналы Т-типа ответственны за образование миотуб.

Регуляция слияния миобластов внутриклеточным кальцием предполагает наличие Са2+-зависимых сигнальных путей, механизмы которых пока мало изучены. Так при слиянии миобластов важную роль

2+ играет калпаин, Са -зависимая протеаза, также может участвовать в слиянии миобластов. Экспрессия калпаина остается постоянной на протяжении всего миогенеза, но во время слияния уменьшается экспрессия калпастатина, специфического ингибитора калпаина. Таким образом, способность миобластов к слиянию может напрямую зависеть от соотношения между калпаином и калпастатином [Barnoy et al 2000; Mazeres et al., 2006]. К тому же 4-хкратная сверхэкспрессия калпастатина в миобластах практически полностью подавляет процесс миослияния, а ингибирование калпастатина фармакологическими средствами, наоборот активирует процесс формирования миотуб [Barnoy et al., 2005]. Предполагается, что калпаин способствует слиянию мембран миобластов, участвуя в деградации цитоскелетных и интегральных мембранных белков, то есть вызывая нарушения кортикального слоя цитоскелета и к дестабилизации плазматической мембраны [Dedieu et al., 2004].

Ионные каналы также вовлечены в слияние миобластов. Показано, что действие К+ каналов вызывает гиперполяризацию мембран миобластов, приводит к активации кальциевых каналов Т-типа, что ведет к притоку кальция и слиянию миобластов. Электросопряжение миобластов появляется еще до начала объединения мембран, когда сохраняется индивидуальность мононуклеарных клеток [Kalderon et al., 1997]

Однако, при слиянии миобластов, по-видимому, существенную роль играет и активный трансмембранный транспорт высосомолекулярных соединений. Показано, что сверх экспрессия шаперона GRP94 (glucoseregulated protein), который в норме экспрессируется как в миобластах, так и в миотубах, способствует увеличению размера миотуб. [Gorza et al., 2003].

Инициация процесса слияния миобластов - первичное объединение мононуклеарных клеток.

В настоящее время почти полностью отсутствуют данные о процессах, лежащих в основе инициации процесса слияния мононуклеарых миобластов при миогенезе. Несмотря на то, что подавляющее большинство линий миобластов, культивируемых in vitro, являются клетками млекопитающих и, несмотря на большой интерес, который вызывают вопросы инициации процесса миослияния у млекопитающих и человека, этот молекулярные и клеточные аспекты этого процесса до сих пор остается неисследованными. Достаточно подробно молекулярные механизмы, ответственные за инициацию слияния миобластов при миогенезе были исследованы только у Drosophila melanogaster [Menon S.D. et al., 2005].

Соматические мышцы дрозофилы имеют мезодермальное происхождение - во время эмбриогенеза дрозофилы те мезодермальные клетки, которые экспрессируют фактор транскипции twist, становятся миобластами. Однако популяция миобластов оказывается неоднородной -только часть эмбриональных миобластов у дрозофилы могут выступать как инициаторы слияния, как "клетки-основательницы", к которым начинают присоединяться другие миобласты. Это группа клеток, экспрессирующая ген lethal-of-scute (HLH-содержащий фактор транскрипции) и посредством А^с/мшосредованного латерального ингибирования именно такие миобласты формируют группу «клеток-основательниц» (founder cells). Оставшиеся миобласты, экспрессирующие только twist, становятся миобластами компетентными к слиянию. Каждая из 30 миофибрилл дрозофилы образована клеткой-основательницой и миобластами способными к слиянию [Klapper R. et al., 2002]. миобласты компетентные к слиянию Y сигналы? дальмейша событий

Hbs

Sns fist

Рис. 11-1, Ассиметричное слияние клеток при формировании дикари о на (миогенеч Drosophila melanogaster) [no Taylor, 2003]: Клетка-основательница способна слиться с компетентным к слиянию миобластом. но никогда - с другой клеткой-основательницей; миобласты. компетентные к слиянию также не способны сливаться также друг с другом, а только с клеткой-основательницей или с многоядерной в последующих циклах слияния. Этот механизм обуславливается существенными различиями поверхностных белков обоих типов клеток, а также специфичностью их внутриклеточных каскадов .

Таблица II-3. Экспрессия генов миобластов разных типов, участвующих в инициации процесса формирования многоядерных миосимпластов у дрозофилы [по Galletta B.J. et al., 2004].

Клетка-основательница auf (dumbfounded); rols (rolling pebbles); ants (antisocial) миобласт, компетентный к слиянию sns (sticks and stones); mine (myoblasts incompetent); lmd (lame duck).

Обе популяции миобластов mbs (myoblast city); Dmef2; blown fuse; Dtitin; roughest (rst)

Молекулярные механизмы формирующие у Drosophila melanogaster ассиметричность миобластов (ситуацию, когда в первом раунде слияния участвуют 2 различные клетки: "клетка-основательница" и компетентный к слиянию миобласт), являются фактически теми же самыми, которые регулируют начальные этапы формирования нервной системы. Нейрогенез у Drosophila melanogaster начинается в пронейральных кластерах вентральной нейроэктодермы и только 1 из 16 клеток каждого кластера превращается в нервную, остальные приобретают эпидермальный статус. Все клетки пронейрального кластера эктодермы экспрессирует гены achaete и scute и имеет потенцию развития по нейральному пути, все клетки кластера также синтезирует рецептор Notch и лиганд Delta и способны ингибировать дифференцировку по нейральному пути и подвергнуться ингибированию. Физиологические флюктуации концентраций этих белков внутри клеток усиливаются по цепи обратной связи, и клетки с высокой активностью Delta окружаются клетками с высокой активностью Notch. Молекулы белка Delta образуют гомо- и гетеротипические связи на поверхности клеток и конкурентно взаимодействуют с Notch. Связывание с Delta меняет конформацию Notch, делает его субстратом для протеаз и инициирует взаимодействие с другими белками [Heitzler et al., 1996].

Возможно, это не единственный механизм, обеспечивающий гетерогенность популяции миобластов у Drosophila melanogaster. В табл. III-3 перечисленные гены, которые тем или иным образом участвуют в слиянии миобластов у дрозофилы; у "клеток-основательниц" и у компетентных к слиянию миобластов это список существенно различается [Menon et al., 2005].

Однако, и в случае миогенеза у дрозофилы молекулярный механизм, лежащий в основе передачи сигнала от мембраны клеток к цитоскелету и их последующих преобразований, результатом которых становиться слияние мембран (и клеток) до конца не известен. Возможная схема сигнального каскада представлена на рис.П-1. Трансмембранный белок duf связан с rols/ants, специфическими адаптерными белками клеток-основательниц, которые в свою очередь связаны с цитоплазматическим белком Mbs. Mbs взаимодействует как и с D-Crk, SH2/SH3 адаптерным белком, так и с белками Rac, ГТФазами, которые контролируют работу и перестройки цитоскелета в процессе слияния миобластов. Второй вероятный путь передачи сигнала от duf к Rac опосредован факторами loner и arf. Известно только, что loner является GEF (guanine nucleotide exchange factor). Этот белок содержит 8ес7-домен, имеющий GEF активность и способный связываться с клеточной мембраной. Еще двумя кандидатами на роль в процессе перестройки клеточных мембран являются парамиозин и D-титин. Оба белка входят в состав саркомеров, но известно, что их мутации вызывают дефекты при слиянии миобластов [Taylor, 2003].

Слияние клеток в процессе вторичного (репарационного миогенеза).

В мышцах постоянно идет процесс регенерации - обновление мышечных волокон, происходящее благодаря клеткам-сателлитам, которые вступают в циклы пролиферации с последующей дифференцировкой в миобласты и их включением в состав предшествующих мышечных волокон. Как и в случае многих других репаративных процессов, при восстановлении мышечной ткани принято выделять физиологическую и репаративную регенерации. Физиологическая регенерация - это процесс, за счет которого в интактной мышечной ткани идет постоянное замещение мышечных волокон. В здоровой мышечной ткани, как и практически во всех других тканях организма часть полностью дифференцированных элементов (в данном случае - мышечных волокон) вырабатывают свой ресурс и замещаются вновь сформированными мышечными волокнами. Как правило, этот процесс идет без повреждения соединительнотканных оболочек, окружающих мышечные волокна, за счет тех миосателлитных клеток, которые окружали погибшее волокно. Репаративная регенерация имеет место при восстановлении травмированной мышцы. Восстановительные (регенерационные) процессы в поврежденной мышце протекают сходно при различных способах травмирования (механическое повреждение, интоксикация, температурное воздействие, ишемия и т.п.). В процессе регенерации мышц можно выделить следующих два основных процесса: дегенерация и некроз поврежденных волокон, и собственно процесс регенерации. Процесс регенерации мышц можно условно разделить на несколько этапов, которые не следуют один за другим, а как бы накладываются во времени друг на друга. Во-первых, это переход миосателлитных клеток в активное состояние (превращение их в промиобласты). На месте дегенерирующих после повреждения мышечных волокон значительно уменьшается число типичных миосателлитов (клеток с узким гетерохроматиновым ядром и малым объемом цитоплазмы). В результате на месте дегенерирующих мышечных волокон появляется большое число клеток, напоминающих эмбриональные промиобласты (они обладают светлым ядром, цитоплазма содержит большое число рибосом, аппарат Гольджи и развитую эндоплазматическую сеть [Володина, 1988].

Существуют данные о том, что для запуска регенерационного процесса в мышечной ткани необходимо присутствие в поврежденной области макрофагов. Помимо удаления разрушающихся структур мышечной ткани, они, по-видимому, оказывают стимулирующее действие непосредственно на процессы регенерации. Есть данные, что совместное культивирование макрофагов и миосателлитоцитов усиливает пролиферацию миосателлитоцитов, хотя на культуру фибробластов макрофаги подобного действия не оказывают [Cantini et al., 1994]. Подобное стимулирующее действие на пролиферацию миобластов оказывает и среда, кондиционированная макрофагами, что дало возможность предположить существование фактора, выделяемого макрофагами [Cantini et al., 1995]. Методами иммуногистохимии показана экспрессия макрофагами трансформирующего фактора роста бетаЗ (TGF-РЗ), который оказывает ингибирующее действие на слияние миогенных клеток в миосимпласты. Также было показано, что макрофаги стимулируют пролиферацию промиобластов и ингибируют образование миотуб. [McLennan et al., 1997]. Собственно при формирования миотуб в культуре in vitro происходят по одной схеме и с участие одних и тех же молекулярных механизмов, вне зависимости от источника миобластов (исходные эмбриональные миобласты или миобласты вторичного миогенеза), формирующиеся при активации пролиферации миосателлитоцитов [Озернюк 1998; 2004].

Клеточные контакты, формирующиеся при слиянии миобластов.

Хотя у позвоночных животных, различий в молекулярных процессах при инициации слияния миобластов и при присоединении миобластов к многоядерным миотубам выявлено не было, на электронно-микроскопическом уровне было показано, что в первом и последующих циклах присоединения миобластов обнаруживаются существенные различия на электронно-микроскопическом уровне [Шунгская и др., 1988].

В процессе культивирования эмбриональные миобласты делятся и вытягиваются, приобретая вид веретена. Через 2-3 сут. культивирования миобласты выстраиваются в виде цепочки - происходит подстройка клеток друг к другу, чаще по типу «конец-в-конец». Когда миобласты готовы к слиянию, происходят изменения их внешней мембраны (образуются лакуны) и цитоскелета и происходит образование многоядерных миотуб, однако типы межклеточных контактов и их функции различаются в зависимости от того, происходит ли слияние одноядерных миобластов или миобластов с многоядерными миотубами. Так, на ранних этапах слияния во время подстройки миобласта к миобласту часто можно видеть десмосомы. Это адгезивный тип контакта, который служит для скрепления клеток друг с другом. Расстояние между клетками - 37-38нм, щель заполнена электронноплотным веществом, ширина десмосом - 140-150нм, ко внутреннему плотному листку мембраны прикреплены нити тонофибрилл длиной 200-400нм. Перед началом слияния плазмолеммы сливающихся клеток плотно прилегают друг к другу, образуя в некоторых местах утолщения, так называемые fasciae adherentes. Это промежуточный тип контакта, который, по-видимому, выполняет те же функции, что и десмосомы, т.е. скрепляет клетки и в культуре этот тип контакта наблюдается довольно часто. Его ширина составляет от 600 до 1 ОООнм, он характеризуется параллельно расположенными мембранами с электронноплотными внутренними листками, отсутствием тонофибрилл. Щель контакта составляет 20-25нм и частично заполнена электронноплотным веществом. Этот тип контакта отличается от десмосом отсутствием тонофибрилл, меньшим размером щели и большей протяженностью. Наряду с десмосомами и fasciae adherentes в культуре и in vivo также часто встречаются щелевидные соединения, которые имеют хорошо видимую 7-слойную структуру, щель составляет от 3 до 4 нм, а размер самого контакта - 300 нм. Этот тип контакта, служащий для обмена метаболитами и ионами, и отвечающий за электрическое сопряжение мышечных клеток, некоторыми авторами рассматривается как возможный инициатор слияния миобластов. Также в культуре мышечных клеток часто наблюдаются щелевндные соединения меньшей протяженности - точечные контакты {punctate contacts). В этом случае контактирующие клетки соединяются узкими перехватами. Они выявляются в электрически сопряженных клетках, в точках с низким сопротивлением мембран. Точечный контакт опережает появление щелевидного и, таким образом, является как бы более примитивной формой последнего [Шунгская и др., 1988. Также методами электронной микроскопии (трансмиссионный метод и метод замораживания-скалывания) было показано, что у мононуклеарных миогенных клеток (еще до начала слияния) появляются контактные зоны, состоящие из нескольких плотных контактов и десмосом [Kalderon et al, 1997].

На более поздних стадиях миогенеза, когда происходит слияние миобластов с уже образовавшимися мышечными трубочками, характерны совсем другие типы контактов. Например, контакт может представлять собой параллельно идущие мембраны двух клеток с расстоянием между ними приблизительно 10—12 нм и протяженностью до 18 мкм ("мостиковые" контакты). В какой-то мере этот контакт напоминает септальный, однако, он не имеет характерной для септальных контактов структуры перегородок. В отдельных участках такой контакт переходит в другой вид контакта - пятислойный, длиной от 100 до 200нм. По-видимому, пятислойный контакт имеет прямое отношение к моменту слияния клеток и представляет собой структуру, образованную слиянием наружных листков мембран контактирующих клеток.

Итак, в процессе миогенеза как in vivo, так и in vitro, на стадии, предшествующей слиянию, при подстройке клеток друг к другу образуются различные типы межклеточных контактов, ультраструктура и функция которых различна. По-видимому, для осуществления межклеточных взаимодействий на разных стадиях миогенеза необходимы различные типы контактов. Прежде всего, такая важная стадия, как подстройка клеток друг к другу всегда характеризуется присутствием адгезивных контактов: десмосом и промежуточных {fasciae adherentes). Далее следует появление щелевидных соединений, отвечающих за электрическое сопряжение мышечных клеток и обмен метаболитами. Наконец, появляются мостиковые контакты с их тесной подстройкой мембран клеток, присутствием «мостиков», состоящих из межклеточного материала, лежащего на поверхности клеток, представляют собой переходную стадию к пятислойному (или плотному) контакту. Последний имеет, по-видимому, прямое отношение к самому процессу слияния, так как согласно данным некоторых авторов липиды, входящие в состав плотного контакта, обладают небислойной конфигурацией, которая, как показано в модельных экспериментах способствует слиянию клеток. [Шунгская В.Е. и др., 1988].

Участие некоторых генов каскада апоптоза в процессе слияния клеток

Уже несколько лет существует гипотеза, что во всех случаях клеточных слияний, то есть и когда слияния необходимы для нормальных процессов дифференцировки, и когда единичные клеточные слияния являются результатом каких-либо патологических процессов, задействованы те же молекулярные механизмы, что и на начальных этапах апоптоза [Huppertz et al, 2001].

Если не учитывать случаи редких слияний клеток в треминально дифференцированных клетках и единичный (для данного организма) акт слияния сперматозоида и яйцеклетки, то единственными процессами клеточной дифференцировки, где за счет многократных присоединений мононуклеарных клеток происходит формирование многоядерной структуры, являются, во-первых, формирование синцитиотрофобласта в эмбриогенезе человека и, во-вторых, формирование миотуб в процессе первичного и вторичного миогенеза.

Баланс между калпаином и калпастатином, поддержание которого необходимо для процесса слияния миобластов по некоторым данным связан с активностью каспаз в клетках в период, предшествующий слиянию. Так, активность каспазы -1 возрастает по мере дифференцировки миобластов, а ее ингибирование задерживает процесс распада калпастатина и, как следствие, ингибирует процесс слияния миобластов [Вагпоу, Kosower, 2003]. Такое, не связанное с апоптозом действие каспаз наблюдается и в трофобласте человека. Недавно была доказано, что присутствие активной формы каспазы 8 в мононуклеарной клетке цитотрофобласта является необходимым условием для процесса формирования синцитиотрофобласта и процесс слияния в данном случае имеет выраженный дозо-зависимый эффект от уровня активности каспазы 8. Так, при ее полном блокировании пептидными ингибиторами, обладающими специфическим действием против каспаз, полностью блокируется и процесс слияния, а при частичном ингибировании антисмысловыми олигонуклеотидами процесс блокируется частично (рис. II-2). Антисмысловое блокирование происходит до начала трансляции мРНК и не имеет 100% эффективности, в том числе и по причине того, что уже синтезированные копии белка обеспечат некоторый уровень его функции. Двойная система регистрации, которую использовали в этой работе при исследовании процесса присоединения клеток цитотрофобласта к синцитиотрофобласту (детекция перехода меченых ядер цитотрофобласта в слой синцитиотрофобласта и переход в синцитиотрофобласт белка ОАТ4 - organic anion transporter 4, который транскрибируется только в клетках цитотрофобласта), дает возможность с высоким уровнем доверия относиться к данным об активном участии каспаз в процессе слияния клеток трофобласта/5/ad: et al., 2004].

Другой интересной особенностью действия каспаз в процессе слияния клеток трофобласта является их ассиметричное распределение в клетках цито- и синцитиотрофобласта. Инициаторная каспаза 8 присутствует в мононуклеарных клетках цитотрофобласта. При объединении мембран ее активная форма проникает в синцитий, где она активирует эффекторные каспазы. control: normal turnover cytofro phobias! antisense oligonucleotides peptide iihbitors ytotrophoblast ^^:ytotrophoblast A/"" i nactw preform ofcaspaseS I active form

Aiumst ■ Otigoiiucltoalts i

Partial block of syncytial fusion preexisting inactive profoim ofcaspase8 active form ofcaspase8 I inactive proforrM of effector caspases caspase8 geneI

• active forms dna|

TUNELfim dna| caspase 8 mRNA J inactive proform ofcaspase8

Inhibitors tractive pretorms of effector caspases syncyt iot гор ho blast

Рис. II-2 Участие каспаз в слиянии клеток трофобласта у человека (по Black et al. 2004 ): эксперименты по блокированию каспазы 8 - инактивация каспазы значительно снижает интенсивность или полностью блокирует процесс слияния клеток цитотрофобласта с синцитиотрофобластом; двуклеточная локализация каскада каспаз инициаторные (касаза 8) и эффекторные каспазы распологаются в клетках цито- и синцитиотрофобласта соответственно.

Таким образом, каспаз-зависимый протеолитический каскад оказывается разнесенным в пространстве (активные инициаторные каспазы - в мононуклеарных клетках, а активные эффекторные каспазы - только в синцитии [Black et al., 2004]. В настоящее время это единственный известный механизм, обеспечивающий ассиметрию процесса слияния синцития с клетками цитотрофобласта, причем в клетках обоих типов каспазы работают на снижение стабильности цитоскелета и облегчают процесс слияния мембран. О молекулярной ассиметрии миобластов, участвующих в слиянии нет данных, однако это показано при инициации процесса формирования миотуб у дрозофилы [Taylor, 2003].

Участие апоптозных каскадов в процессе оплодотворения не показано, но недавно были проведены исследования, дающие возможность предполагать, что в раннем развитии мыши каспаз-зависимые процессы могут играть другую роль, отличную от апоптоза [Zakeri et al, 2005]. Разные исследователи придерживаются разных мнений о том, за счет чего происходит гибель клеток в ранних эмбрионах млекопитающих. Некоторые придерживаются мнения, что гибель клеток эмбриона на стадии дробления происходит путем апоптоза, другие предполагают наличие другого, отличного от классических, механизма клеточной гибели [Van Blerkom et al., 2001; Van Blerkom et al., 2004]. Однако в ранних эмбрионах присутствуют многие белки, контролирующие клеточную гибель [Jurisicova et al., 2004].

В экспериментах по ингибированию каспаз 3, 7 и 8 изменений в уровне гибели клеток ранних эмбрионов не наблюдалось. Но при воздействии на 2-4х клеточные эмбрионы zVAD-FMK (ингибитором, полностью блокирующего активность всех каспаз), наблюдается значительное возрастание клеточной гибели на стадии бластоцисты, а также повышается процент эмбрионов с морфологическими нарушениями, приводящими, в том числе и к их разрушению и гибели. В то же время ингибитор каспаз не оказывает влияния на процесс гибели редукционных телец, хотя механизмом их гибели является апоптоз. Таким образом, процессы гибели клеток раннего эмбриона не являются каспаз-зависимыми [Zakeri et al., 2005]. Эти данные дают возможность предположить, что активность каспаз играет важную роль в раннем развитии млекопитающих, но участвует в процессах, не связанных с клеточной гибелью. На стадиях 24 бластомеров синтез каспаз (как и большинства других белков) происходит практически полностью с материнских мРНК, также как и на поздних стадиях оогенеза и в зиготе.

Другой механизм, работающий как при апоптоз-зависимой клеточной гибели, так и в процессе слияния клеток при формировании миотуб и миосимпластов - изменение распределения фосфолипида фосфотидилсерина на бислойной мембране клетки. Мембрана клетки характеризуется ассимитричной структурой и исчезновение этой структуры служит первым признаком апоптоза: при нормальных условиях фосфатидилсерин локализуется на цитоплазматической стороне клеточной мембраны, в то время как при апоптозе он обнаруживается на наружной поверхности мембраны. Временное увеличение содержания фосфатидилсерина в миобластах наблюдается на 13-й день развития эмбрионов мыши, когда идет активное формирование первичных миотуб [van den Eijnde et al, 1999]. Также уровень содержания фосфатидилсерина возрастает в культуре миобластов при инициации процесса слияния. Обработка миобластов в процессе слияния флуорохром-коньюгированным аннексином V не только блокирует процесс слияния, но и демонстрирует, что фосфатидилсерин-инвертированные зоны мембраны располагаются только в зоне контакта миобластов с миотубами (будущей зоны слияния). Проаптотические миобласты тоже экспонируют фосфатидилсерин на внешней стороне мембраны, но в дифференцирующихся клетках не наблюдается активности каспазы-3. Кроме того, внешняя экспозиция фосфатидилсерина формирование миотуб не нарушается при воздействии на миобласты ингибитора каспаз zVAD(OMe)-fmk. Возможно, что в случае апоптоза и в случае миодифференцировки задействованы различные механизмы, регулирующие распределение фосфатидилсерина в мембране [van den Eijnde et al., 2001].

При оплодотворении фосфатидилсерин, в отличие от фосфатидилинозитола, не играет ведущей роли, однако он принимает участие во взаимодействии плазматических мембран ооцита и сперматозоида. В сперматозоидах кролика, прошедших капацитацию, места связывания аннексина-V (экспонированный на внешней поверхности мембраны фосфатидилсерин) располагаются в основном в акросомальной области, причем в основном - в экваториальной зоне. После акросомной реакции фосфатидилсерин появляется также не мембране постакросомной области сперматозоида. Возможно, такое районированное распределение фосфатидилсерина в период оплодотворения является хоть и не основным, но важным механизмом для слияния сперматозоида и ооцита [Avalos-Rodriguez et al., 2004].

Известно, что для процесса перехода фосфатидилсерина на внешнюю поверхность бислойной мембраны необходимо нарушение структуры кортикального цитоскелета клетки. Как уже говорилось выше, в процессе слияния миобластов задействованы белки семейства ADAM, а также колпаин, кальций-зависимая протеаза и некоторые казпазы. участвующие в дестабилизации цитоскелета, а также - возможно в процессе локальной дестабилизации мембран миобластов в зоне слияния участвует более одного механизма или достаточно сложный каскад с дублированием запуска процесса миослияния.

Таким образом, процесс слияния миобластов скорее всего включает последовательный ряд событий:

• установление адгезивных контактов между клетками, компетентными к слиянию, формирование фокальных контактов - "узнавание";

• аппозиция мембран за счет изменения конфигурации белков адгезии;

• формирование щелевых контактов, синхронизация внутриклеточных процессов (макромолекулярных и электрических) контактирующих клеток;

• локальная перестройка цитоскелета, снижающая стабильность мембран;

• переход фосфатидилсерина на наружный слой плазматической мембраны;

• Перестройка мембран в зоне контакта и слияние клеток.

Большая часть участвующих в процессе миослияния белков и других низкомолекулярных и высокомолекулярных веществ присутствуют в большинстве животных клеток. На основе анализа имеющихся данных можно сказать, что процесс слияния миобластов слабо связан с собственно специфической молекулярной дифференцировкой мышечных клеток. Фактически, в дифференцировке скелетных миобластов можно выделить две отдельных программы - это активация каскада стадио-специфических белков миогенеза (1) и формирование необходимого механизма, обеспечивающего миослияние (2). О том, что эти две программы в значительной мере автономны, свидетельствует не только то, что собственно белки миодифференцировки (Pax 3, Mif т.д.) непосредственно не задействованы в процессе объединения мембран миобластов, но и то, что их экспрессия не нарушается при блокировании миослияния

II.3.4. Клеточные источники для репарации мышечных волокон. Миосателлитные клетки

Описание ультраструктурных и биохимических особенностей развития мышц послужило основой для современного этапа исследований данной проблемы [Озернюк, 1998].

Скелетные мышцы человека и других высших позвоночных наряду с многоядерными миофибриллами содержат некоторое количество одноядерных клеток, дифференцированных по мышечному типу и называемых обычно сателлитными клетками (СК). СК часто расценивают как стволовые клетки, поскольку основное время своей жизни они находятся в покоящемся состоянии, но активируются и вступают в клеточный цикл после повреждения мышечной ткани [Терехов и др., 2001].

СК в зрелых мышцах располагаются под базальной мембраной сарколеммы, причем плазматические мембраны сателлитной клетки и мышечного волокна разделены щелью в 3 - 15нм. СК осмотически не зависит от мышечного волокна, что исключает возможность непосредственной взаимосвязи между цитоплазмами мышечного волокна и сателлитной клетки. Располагаются СК в углублениях мышечных волокон так, что общий контур мышечного волокна не нарушается. При малых увеличениях электронного микроскопа и в световом микроскопе плазматические мембраны не видны, поэтому ядра СК достаточно долго, до появления электронно-микроскопических методов исследования, принимались за ядра мышечных волокон. Количество сателлитных клеток зависит от типа мышцы, возраста объекта и меньше от видовых различий.

У высших позвоночных и человека клетки-сателлиты имеют размеры от 10 до 25 мкм. Ядра вытянутые, темные вследствие большого количества гетерохроматина, расположенного преимущественно по периферии ядра. На долю гетерохроматина приходится 50±8,9% площади ядра, в то время как в ядрах мионов (по Шнейдеру мион - структурная единица скелетных мышц, он включает собственно мышечное волокно, сосудистый, соединительнотканный и нервный компоненты [Данилов, Радзюкевич, 1997]) гетерохроматин занимает 22±9% площади. Цитоплазма образует узкий ободок вокруг ядра и содержит мало митохондрий с незначительным числом крист, свободные рибосомы, плохо развитый эндоплазматический ретикулум, уплощенный комплекс Гольджи, отчетливые парные центриоли, гранулы гликогена. Фибриллярный компонент в цитоплазме СК в дефинитивной мышечной ткани не обнаружен. При исследовании мышечной ткани крыс на сканирующем электронном микроскопе методом замораживания скалывания СК на разломах имеют вытянутую неправильную форму с выростами на поверхности, которые заключены в выемки плазматической мембраны мышечного волокна. В целом поверхность СК выглядит более гладкой, чем поверхность мышечного волокна.

Количество СК клеток определяется возрастом животного, и в молодой мышечной ткани животных выявляются две их основные разновидности. Один тип СК имеет узкое гетерохроматиновое ядро, и тонкий слой бедной органеллами цитоплазмы. Другой тип СК содержат светлое ядро, имеют хорошо развитую цитоплазму, богатую органеллами: свободными рибосомами, полисомами, митохондриями, комплексом Гольджи с развитыми цистернами и гранулярным ЭПР с расширенными полостями цистерн. Описанные формы СК встречаются в молодой мышечной ткани мышей, крыс, плодов человека. Соотношение двух форм СК в мышцах с возрастом меняется в сторону преобладания первой разновидности [Данилов, Клишов, 1982]. По-видимому, второй тип мононуклеарных мышечных клеток - это либо миобласты, участвующие в процессе первичного миогенеза, продолжающегося в молодой мышечной ткани в период роста животного, либо пролиферирующие миобласты, возникшие в результате активации процессов вторичного миогенеза в ходе физиологической регенерации ткани.

Репарация мышечных волокон за SP-клеток.

Хотя скелетные миобласты и являются очевидным источником клеток для трансплантации при лечении мышечных патологий, но по многим параметрам они не являются оптимальным выбором. У взрослых пациентов не удается получить достоточно миогенных клеток (т.е. миосателлитных клеток), для того, чтобы вырастить в культуре нужное количество клеток для трансплантации. Первичные культуры миобластов, полученные их фетальных тканей всегда гетерогенны и содержат много немышечных клеток, а мышечные клетки находятся на разных этапах дифференцировки.

В последние годы активно рассматривается другой источник получения клеток для регенерации поврежденных мышечных волокон. Это так называемые SP-клетки (side population cells). SP-клетки впервые были обнаружены в составе костного мозга, а в последствии, - в некоторых других тканях организма, в том числе и в мышечной ткани. Основной признак, который характеризует SP-клетки и дает возможность отбирать их при помощи клеточного сортера - их способность быстро выводить из ядра интеркалирующий витальный ДНК - краситель Hoecst 33342, в результате популяция Lin(-)/Sca-l(+)/c-kit(+)/Hoechst 33342(-) может быть выделена, другим маркером, который характерен для SP-клеток, вне зависимости от того, выделены ли они из кровотока или имеют тканевую локализацию, является Abcg2, белок который выводит Hoecst 33342 из клетки. Abcg2(+)/Hoechst 33342(-) как правило относят к SP популяции [Meeson et al., 2004]. Кроме того, в некоторых работах показано, что SP клетки, CD45+ и могут давать начало гемопоэтическим колониям [Asakura et al., 2002].

По мере старения организма популяции стволовых клеток (как унипотентных, способных дифференцироваться лишь в один тип клеток, так и имеющие большие потенции к дифференцировке) истощаются либо повреждаются, что приводит к снижению эффективности регенерационных процессов и приводит к старению органов и тканей. В конце 2006 года была опубликована статья, демонстрирующая, что у мышей старших возрастов увеличивается общее количество SP-клеток в кровотоке и процент SP-клеток, устойчивых к апоптозу, так как у них значительно снижена экспрессия генов апоптоза [Pearce et al., 2006].

По некоторым данным линия SP-клеток мышечной ткани также, как и миосателлитные клетки, имеет происхождение из дермомиотома сомитов, как и линия миосателлитных клеток [Schienda et al., 2006]. В мышечной ткани взрослой мыши SP-клетки локализуются в основном в соединительно-тканных оболочках мышечных волокон, причем в зонах с большим количеством сосудов [Meeson et al., 2004]. При внутривенном введении SP-клеток мышам, подвергнутым токсическому воздействию они дают начало кроветворным клеткам, а также включаются в состав мышечных волокон. Также, при сокультивировании с пролиферирующими миосателлитными клетками, SP-клетки начинаю дифференцироваться как миобласты, экспрессируя соответствующие маркеры [Asakura et al, 2002].

Приведенные выше данные свидетельствуют, что SP-клетки являются плюропотентной популяцией, способной в разных условиях поддерживать разные типы дифференцировки.

Репарация мышечных волокон за счет немышечных клеток. В последние несколько лет был предложен другой источник получения прогениторных клеток для клеточной терапии различных заболеваний, в том числе и миодистрофии - это прогениторные клетки, получаемые из стромы костного мозга. По современным представлениям возможный терапевтический потенциал стромальных клеток костного мозга огромен и область возможного применения этих клеток в клинике быстро расширяется по мере того, как поступают новые данные о свойствах этой клеточной популяции. Идея трансплантации немышечных клеток для лечения миодистрофии основывается на данных о том, что процесс рекрутирования немиогенных стволовых клеток существует; эта гипотеза подтверждается многочисленными экспериментами, хотя многие авторы обращают внимание на низкую эффективность данного метода.

Работы по трансплантации МСК, в том числе и МСК, которые по происхождению являются СККМ, которые в последние годы привлекают все большее внимание как исследователей, так и клиницистов, основаны на представлениях о том, что строма костного мозга содержит популяцию клеток, обладающую высокой пластичностью. Известно, что в организме млекопитающих (и человека) эти клетки могут дифференцироваться в

Рис. II-3. Мезенхимная стволовая клетка в постнатальный период онтогенеза: на схеме приведены факторы, направляющие дифференцировку в определенном направлении в культуре in vitro и маркеры этих клеточных популяций; пластичность показана двойными стрелками (по Dennis. Charbord 2002).

TGF-в, PDGF - ростовые факторы, ASMA - а-актин гладкомышечных клеток; TSP-1 - тром-боспондин 1, EDa+FN - фибронектин с EDa доменом. IEI2 - глакомышечный актин, узнаваемый моноклональным антителом Е12. hlCalp - hl-калпонин, h-Cald -h калдесмон. mV - ме-тавинкулин, SMI - тяжелая цепь миозина 204 кД, Des - десмин. Dex - дексаметазон. IBMX -изобутилметилксантин, IM - индометацин, в-gp - бетаглицерофосфат. аР - аскорбат-2-фосфат; NRO - гистологический краситель нильский красный О; vK -гистологическая окраска по Ван Коссу: Coll - коллаген.

Таблица II-4. Клеточная терапия с использованием прогениторных и стволовых клеток (СК) костного мозга (КМ): результаты клинических испытаний (по Korbling, Estov 2003, с дополнениями).

Заболевание Источник клеток Метод введения Результат Цит. источн.

Незавершенный остеоге-нез у детей аллотранс-плантация /КМ Внутривенно Увеличение плотности костной ткани (усиление минерализации кости) Horwitz et al., 1999

Инфаркт миокарда Аутотранс-плантация/ КМ Интра-коронарно Уменьшение зоны инфаркта, улучшение функции желудочка и кровоснабжения мио-карда Strauer et al., 2002

Инфаркт миокарда Аутотранс-плантация/ КМ, обогащенный гемопо-этическими СК Инъекция в сердечную мышцу Увеличение функциональной деятельности левого желудочка, улучшение кровоснабжения зоны инфаркта Stamm et al., 2003

Инфаркт миокарда Аутотрансплант ация/ КМ или клетки периферической крови Иптра- коропарная инфузия Улучшение сократительных функций левого желудочка и региональных сокращений сердечной стенки зоны инфаркта Assmus et al., 2002

Ишемическая болезнь сердца аутотрансплант ация/ Клетки КМ В сердечную мышцу Улучшение кровоснабжения и функций миокарда Tse et al. 2003

Ишемическая болезнь сердца аутотрансплант ация /Клетки КМ В сердечную мышцу Улучшение кровоснабжения миокарда и функций левого желудочка Perin et al. 2003

Хроническая ишемия конечностей аутотрансплант ация/ Клетки КМ Внутримышечн ые иньекции Уменьшение болей в нокое, улучшение кровоснабжения и увеличение длительности ходьбы без болей Tateishi-Yuyama et al., 2002

Миофистроф ия Дюшенна аллотрапеплант ация /Клетки КМ Внутривенно Частичное восстановление экспрессии дистрофина в мышцах Gussoni et al., 2002

Нейродегепер ативные заболевания аллотрапеплант ация/Клетки КМ Внутривенно Генерация клеток, экспрессирующих нейральные маркеры Mezey et al., 2003

Нейродегенер ативные заболевания аллотрансплант ация/Клетки КМ Внутривенно Возможное формирование клеток Пуркинье Weimann et al., 2003 ограниченный набор клеток (это остеобласты, хондробласты, адипоциты и собственно, дифференцированные клетки стромы костного мозга) (рис. II-3). В модельных экспериментах (in vivo и in vitro) показана возможность их дифференцирвки в другие конечные клетки (например, в миобласты или нейральные производные).

Однако в большей части клинических исследований по понятным причинам нет данных о том, что трансплантированные клетки дифференцировались в функциональные клетки поврежденного органа (например, кардиомиоциты или нейральные клетки). В некоторых случаях улучшение состояния пациента наступает в результате изменений, не связанных с функциональными дифференцировками, а например, с улучшением васкуляризации и кровоснабжения [Tateishi-Yuyama et al., 2002]. Еще одним цитологическим основанием для использования клеточных трансплантаций в течение ряда лет считался феномен трансдифференцировки in vivo. Так, при аутопсии ткани головного мозга было показано, что через 6 лет после трансплантации трем женщинам костного мозга от доноров-мужчин, у реципиенток в области гиппокампа примерно 1% нейронов и 1-2% астроцитов и клеток микроглии несут У-хромосому [Cogle et al., 2004]. Трансплантация клеток костного мозга (от XY донора XX реуипиенту) показала, что они могут дифференцироваться в самые разные типы клеток, в том числе и в миоциты [Ferrari et al., 1998; 2002], и в гепатоциты [Petersen et al., 1999], и в нейроны [Eglitis, Mezey, 1997; Weissman, 2000], в эндотелиальные клетки [Shi et al., 1998] - в биоптатах этих органов обнаруживались ХУ клетки из донорского трансплантата.

Не менее широко известен и процесс химеризации тканей трансплантированных органов клетками реципиента. Так, через 30-64 недели после пересадки печени, в трансплантированном органе обнаруживаются собственные клетки реципиента, причем большая их часть (65-т.е. клетки, относящиеся к энтодермальным производным (1,6% от клеток реципиента в трансплантированном органе и 0,62% всех гепатоцитов) [Ng et al., 2003].

Причиной изменения фенотипа клеток костного мозга может являться стресс, вызванный изменением окружающей среды, однако хотя клетка может демонстрировать некоторые белковые синтезы, характерные для данной ткани, это не значит, что она прошла весь путь дифференцировки и стала полностью функциональной клеткой этой ткани. Так, в начале 2006 года было показано, что МСК, сокультивируемые с нейронами (на ростовой среде для нервных клеток) приобретают морфологию нейронов, не повторяют полностью их фенотип [Croft, Przyborski, 2006]. Другая гипотеза, объясняющая причины изменения фенотипа МСК привлечения гипотезы об их трансдифференцировке - основана на данных о том, что клетки костного мозга (прогениторные) способны сливаться с дифференцированными клетками в культуре, при этом дикарион имеет тот же фенотип, который имеют дифференцированные клетки [Terada et al., 2002]. Также показано, МСК, полученные из костного мозга способны сливаться с некоторыми типами нейронов и кардиомиоцитами, а также гепатоцитами в культуре in vitro [Alvares et al., 2003; Wang et al., 2003].

Однако если считать слияние клеток костного мозга основным механизмом включения их в состав других органов и тканей, то остается непонятным, почему этот процесс не идет с достаточной эффективностью в той ткани, для которой слияние клеток является естественным этапом дифференцировки - скелетной мускулатуры. Еще в 90-х годах XX века было показано, что трансплантированные клетки костного мозга могут включаться в мышечную ткань пациентов, больных миодистрофией Дюшена. К сожалению, такое включение происходит очень редко - 1 клетка на 7 миллионов [Partridge et al., 1998]. Статья о том, что клетки костного мозга при трансплантации больному пациенту могут превращаться в мышечные была опубликована группой исследователей из детского госпиталя Лос-Анжелеса и детского госпиталя Бостона в 2002 году. В этой работе был описан случай, когда пациенту пересаживали клетки костного мозга для восстановления кроветворения после онкологического лечения. Через 13 лет после трансплантации клеток костного мозга у этого пациента взяли биопсию мышечной ткани и обнаружили, что в состав этой мышечной ткани входят ядра, полученные от донора. Несмотря на полученные от донора новые клетки, участвующие в дифференцировке мышечных волокон, дегенерация мышц у пациента не прекратилась, но этот случай вселил надежду в исследователей, что в будущем станет возможным пересаживать пациентам МСК, выращенные в культуре in vitro fSmogorzewska, Weinberg, 2004].

В связи с низкой эффективностью трансплантации МСК в мышечную ткань в последнее время появилось некоторое количество работ, в которых исследуются возможные пути дифференцировки МСК в мышечные клетки in vitro. Но, к сожалению попытки дифференцировать МСК в миобласты в культуре in vitro тоже демонстрируют низкую эффективность и потенции МСК к дифференцировке в миогенные клетки во многом зависят от того, из какого источника эти клетки получены. Было показано, что МСК, полученные из костного мозга взрослых кроликов и мышей могут дифференцироваться в культуре в мышечные клетки под влиянием 5-азацитидина [Wakitani et al, 2005; Rangappa, 2003]. Различные МСК человека реагируют на воздействие 5-азацитидина по-разному. Так, МСК человека, полученные из синовиальной мембраны дифференцируются в миобласты, хотя процент миогенных клеток в такой культуре тоже низок. Другие МСК человека, полученные из тканей взрослого организма (в том числе и клетки, выделенные из стромы костного мозга), практически полностью теряют способность приобретать миофенотип [De Bari, 2001]. Использование таких индуцирующих веществ как стероиды (гидрокортизон и дексаметазон) также не провело к достаточно эффективным результатам, хотя некоторое положительное действие было отмечено, когда использовалась культура фетальных МСК человека.

Другим подходом к дифференцировке МСК в мышечные клетки в культуре - это культивирование их в среде, кондиционированной миобластами. В этих работах при каждой замене среды в ростовую среду добавляется 40-50% среды, в которой росли миобласты. Эффективность такого подхода составляет 1-2%, при котором МСК человека уходят в мышечную дифференцировку. Известно, что при культивировании клетки экзоцитируют во внешнюю среду, т.е. среду для культивирования, большое количество факторов, влияющих определенным образом на свое окружение. В этом случае не известно какие именно вещества воздействуют на культуру МСК и вызывают направление по пути миодифференцировки [ChanJ. et al, 2006].

Низкий процент превращения МСК в мышечные клетки как при культивировании in vitro, так и при трансплантации в мышечную ткань свидетельствует о существовании ограничений на включение МСК в состав миосимпластов, миотуб и мышечных волокон. Поэтому представляется интересным детально проследить цитоморфологические процессы, происходящие при дифференцировке МСК в мышечные клетки.

Целью данной работы являлось изучить особенности течения онтогенеза и возникающих нарушений, приводящих к аномалиям функциональных систем и в итоге - к уменьшению продолжительности жизни индивидуума. Для приближения к этой цели исследовать состояние в онтогенезе функциональных систем в соответствии со следующими поставленными задачами:

На модели ускоренно стареющих мышей (SAM) исследовать возрастные морфо-функциональные характеристики и состояние соматических клеток;

Провести анализ сперматогенеза у разновозрастных мышей SAM; Исследовать воздействие антиоксиданта карнозина на возрастные морфо-функциональные характеристики мышей SAM; Исследовать воздействие антиоксиданта карнозина на возрастную динамику сперматогенеза мышей SAM;

Провести анализ нарушений эмбрионального развития у мышей SAM;

На модели дистрофин-дефицитных мышей mdx исследовать процесс восстановления мышечной ткани после проведения соматической трансфекции;

На модели дистрофин-дефицитных мышей mdx исследовать восстановление мышечной ткани методом клеточной трансплантации с использованием мышечных и немышечных источников прогениторных клеток.

Заключение диссертации по теме «Биология развития, эмбриология», Семенова, Мария Львовна

VI. выводы

1. Нарушения, характерные для линии SAM, проявляются и нарастают с возрастом в виде микроядерных аббераций, робертсоновских транслокаций и в виде перехода к эндоредупликации в клетках печени.

2. Для эмбриональных фибробластов линии SAMP1 характерен более высокий уровень гетерогенности теломер, чем для линии SAMR1 на фоне общего высокого уровня активности теломеразы; выявлено ускоренное "пролиферативное старение" в ряду CBA-SAMR1-SAMP1

3. Для мышей линии SAM выявлены возраст-зависимые нарушения сперматогенного эпителия, а именно снижение числа клеток Сертоли, увеличение числа микроядерных аббераций в клетках сперматогенного ряда, нарушение морфологии головок сперматид, выраженные в большей степени у SAMP1, чем у SAMR1.

4. Карнозин увеличивает среднюю продолжительность жизни, значимо улучшает морфо-функциональные (по критериям GSS) и биохимические показатели животных, но не влияет на максимальную продолжительность жизни и оказывает линиеспецифичное, в т. ч. и негативное влияние на сперматогенный эпителий.

5. Предложена и применена модель сперматогенного эпителия как двухкомпонентной функциональной системы для оценки воздействия факторов, связанных с процессами старения.

6. У ранних эмбрионов мышей SAM выявлены нарушения процессов компактизации и кавитации, обнаружена экстремально выраженная композиционная гетерогенность, в чем проявляется генетический статус линии.

7. В терапии мышечной дистрофии при помощи инъекции клеточной суспензии прогениторных клеток человека (миобласты и СККМ) в мышцы mdx мышей показано формирование дистрофин-положительных волокон в зоне раневого канала.

8. Миобласты и СККМ человека, трансплантированные в мышечную ткань мыши формируют устойчивую зону распространения в течение первых 6 часов, размеры которой впоследствии не увеличиваются.

9. Методом баллистической трансфекции показано, что мышечные волокна, содержащие трансген, располагаются в зоне экспериментального повреждения, где наблюдается высокая регенеративная активность.

10. Показано, что при использовании клеточной трансплантации и генетической трансфекции соматических клеток in vivo в целях реперации тканевых дефектов для эффективного процесса регенерации необходимо сопутствующее механическое нарушение целостности ткани.

11. Предложена гипотеза, объясняющая эффективность клеточной трансплантации и генетической трансфекции соматических клеток в зависимости от физиологической или репаративной регенерации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нарушение нормальной функции органов и тканей, рассматриваемое как нарушение репаративных процессов может происходить как в рамках общего процесса старения, так и в результате как бы незначительных генетических аномалий, пораждающих каскад событий, приводящих к гибели организма. В данной работе мы анализировали процессы поддержания и восстановления тканевых систем на двух, генетически различных моделях - линиях мышей с ускоренным старением SAM (соматические клетки и клетки полового ряда) и линии мышей mdx, имеющих мутацию в гене дистрофина (мышечная ткань). При всех очевидных различаях эти две модели имеют следующие общие моменты. В обоих случаях в систему входят непролиферирующие, терминально дифференцированные клетки, имеющие достаточно долгий срок жизни. В обоих случаях в систему входит популяция стволовых клеток, которые значительную часть онтогенеза пребывают в пролиферативно неактивном состоянии. И в обоих случаях в систему входят пролиферирующие клетки или, скорее, клетки "полного цикла", для которых характерны последовательные периоды активной пролиферации и дифференцировка. По такому принципу организованы многие ткани млекопитающих и результаты, полученные на этих двух моделях, во многом могут быть применены и к ним.

Мы установили, что процесс физиологической регенерации активно идет в мышечной ткани мышей mdx, в любом возрасте присутствуют все стадии формирования волокон - от самых ранних до функционально-зрелых. Однако и трансплантированные клетки и вводимый трансген не включаются в этот репарационный процесс. В то же время, и включение трансгена, и появление дистрофин-положительных мышечных волокон, сформированных с участием трансплантированных клеток, наблюдается только в зоне раневого повреждения или в зоне инъекционного канала. Таким образом, полученные нами данные показывают, что восстановление поврежденной мышечной ткани при проведении генетической трансфекции или клеточной трансплантации, идет только в местах сильных повреждение, нарушающих структуру ткани, то есть при активации процесса репаративной регенерации. Таким образом, для интенсивных восстановительных процессов в этой системе необходимо создание условий для прохождения репаративной, а не физиологической регенерации.

В современном мире все больше внимания уделяется тому, что называют "продолжительностью здоровья" - по аналогии с "продолжительностью жизни" и увеличение срока активной жизни индивидуума - фактически главная задача медицины. Ведущая роль генетического статуса организма, комплекс аллелей "генов старения" уже не вызывает сомнения, как и то, что сроки жизни различных индивидуумов (даже существующих в сходных условиях) существенно различаются. Известны основные "гены старения" или, как их чаще называют, биомаркеры старения: Арое (кодирует липопротеин низкой плотности) [Dubelaar et al 2004] GSTT1, IL6, IL10, PON1, and SIRT3 [Glatt et al 2007; Johnson 2006], В будущем, по мере того как будет исследоваться полиморфизм различных генов, эта группа -будет только увеличиваться. Однако, у видов с регуляционным типом развития, к которым относятся и все млекопитающие и человек, скорее всего никогда не будет обнаружен "ген смерти" и срок завершения онтогенеза не будет фатально определен. Старение по причине синергированной дисфункции работы многих генов не оставляет надежды на то, у млекопитающих (и человека) будет найден ген, выключение или замена которого позволит отодвинуть или исключить для индивидуума фатальный исход. С этой точки зрения особенно ценными становятся модели, в основе старения которых лежит такая же дисфункция работы разних генов, даже и не связанных напрямую со старением или клеточной гибелью. Линии мышей SAM, у которых не мутационное выключение одного гена, а изменение активности многих генов приводит к нежелательному фенотипу ускоренного старения и, в результате, к ухудшению качества жизни и более раннему наступлению смерти индивида. Исследования, проведенные на этой модели, показывающие, что все этапы онтогенеза мышей этой линии (от ранних эмбриональных стадий до самой старшей возрастной группы) показали оптимальность применения этой модели в геронтологических исследованиях.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Семенова, Мария Львовна, 2007 год

1. Баранов B.C., Баранов А.Н., Зеленин В.А. Современное состояние и перспективы генной терапии миодистрофии Дюшенна в мире и в России. // Генетика. 2001. Т. 37. С. 1046-1054.

2. Болдырев А.А. Na/K-АТФаза как олигомерный ансамбль. //Биохимия. 2001. Т.66. С.1013-1025.

3. Болдырев А.А. Карнозин и защита тканей от окислительного стресса. /М.: Диалог-МГУ. 1999.362.С.

4. Болдырев А.А. Карнозин: биологическая роль и возможное применение в медицине. // Биохимия. 1992. Т.57. С.898-904.

5. Болдырев А.А. Карнозин: биологическое значение и возможности применения в медицине. //Изд-во Моск. ун-та. 1998. 320С.

6. Болдырев А.А. Проблемы и перспективы исследования биологической роди карнозина. //Биохимия. 2000. Т.65. С.884 890.

7. Болдырев А.А., Юнева М.О., Сорокина Е.В. Антиоксидантные системы в тканях мышей линий SAM (senescence-accelerated mice), характеризующейся ускоренным процессом старения. //Биохимия. 2001. Т.ббю С.430 1437.

8. Володина А.В., Поздняков О.М. Особенности посттравматической дифференцировки клеток-сателлитов в скелетной мышце. //Бюл. эксперимент биологии и медицины. 1988. Т. 105. №.6. С.755-757.

9. Габаева Н.С. О строении и функциях фолликулярного эпителия семенников позвоночных. //В кн. «Современные проблемы сперматогенеза». 1982. М.: Наука. С. 108- 159.

10. Габбасов З.А., Соболева Э.Л. Стромальные стволовые клетки взрослого организма резерв восстановительной хирургии. //Клиническая геронтология. 2003. Т.5. С.20-24.

11. Талант С., Семенова М., Юнева М. Карнозин как потенциальное средство против старения. //Биохимия. 2000. Т. 65. №7. С.866-868.

12. Галлант С., Семёнова М., Юнева М. Карнозин как потенциальное «средство» против старения. //Биохимия. 2000. Т.65. С.1018 1021.

13. Гопко А.В., Захидов С.Т., Маршак T.JL, Кулибин А.Ю., Семенова М.Л., Макаров А.А. Генетическая нестабильность мужских гамет у мышей-долгожителей линии SAMP1, склонной к ускоренному старению. //ДАН 2003. Т.392. С.461-463.

14. Гопко А.В., Кулибин А.Ю., Семенова M.JL, Захидов С.Т. Изменение процессов развития клеток сперматогенного эпителия ускоренно стареющих мышей SAM под влиянием карнозина. //Бюлл. эксп. биол. медицины. 2005. Т. 140. №8. С.206-209.

15. Гуляева Н.В. Супероксидперехватывающая активность карнозина в присутствии ионов цинка и меди. //Биохимия. 1987. Т.52. С.1216-1220.

16. Данилов Р.К., Клишов А.А. Миосателиоциты и проблема камбиальности скелетномышечной ткани. //Успехи современной биологии. 1982. Т.93. Вып.З. С.409-420.

17. Данилов Р.К., Очерки гистологии мышечной ткани. /Уфа. 1994.49С.

18. Данилов Р.К., Радзюкевич T.J1. Формирование двигательных единиц у позвоночных (патофизиологический анализ). //Морфология. 1997. Т. 112. № 4. С.7-17.

19. Донцов В.И., Крутько В.Н., Подколзин А.А.Старение: механизмы и пути преодоления. /1997. 240С.

20. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих./Л.Наука. 1988. 228С.

21. Дыбан А.П., Пучков В.Ф., Баранов B.C., Самошкина Н.А., Чеботарь Н.А. Лабораторные млекопитающие: мышь, крыса, кролик, хомячок / В кн.юбъекты биологии развития. М "Наука" 1975. Р.505-567.

22. Захидов С.Т. Современные достижения в исследованиях проблемы сперматогенеза./В кн. «Проблемы репродуктивной биологии в трудах профессора С. И. Кулаева и его последователей». 1998. М.: Изд во Московского ун - та, С.234 - 259.

23. Захидов С.Т., Кулибин А.Ю. Возрастание генетической нестабильности в сперматогониальной системе мышей ускоренно стареющих мышей SAMP1 на модели мутагенеза, вызванного дипином.//ДАН. 2006. V.407. Р.192-194.

24. Захидов С.Т., Маршак Т.Л., Голиченков В.А. Возможность перехода высокодифференцированных клеток Сертоли к пролиферации после действия химических мутагенов. //ДАН. 1995. Т. 3446. С. 692 694.

25. Захидов С.Т., Семенова М.Л., Гордеева О.Ф., Беляева А.А. Сперматогенез у мышей линии SAMP1, склонных к ускоренному старению. //ДАН. 1999. Т.365. №3. С.403-405.

26. ЗЬЗахидов С.Т., М.Л.Семенова, О.Ф.Гордеева, А.А.Беляева. Сперматогенез у мышей линии SAMP1, склонных к ускоренному старению. //ДАН. 1999. Т.365. С.403-405.

27. Зеленина И.А., Семенова M.JI., Алимов А.А., Колесников В.А., Голиченков

28. B.А., Зеленин А.В. Использование высоко-скоростной механической инъекции для переноса чужеродной ДНК в ранние эмбрионы мыши. //Генетика. 1991. Т.27. №. 12. С.2182-2186.

29. Клишов А.А., Данилов Р.К. Миосаттелиты. //Арх. Анатомии, гистологии и эмбриолгии. 1981. Т.80. №1. С.95-107.

30. Коваленко Д.В., Шафеи Р.А., Зеленина И.А., Семенова М.Л., Самуилова О.В., Жданов Р.И. Металлонуклеолипосомные комплексы как средство доставки генов в скелетные мышцы. //Генетика. 1996. Т.32. № 9. С. 1299-1301.

31. Колесников В.А., Зеленина И.А.,. Семенова М.Л., Шафеи Р., Зеленин А.В. Баллистическая трансфекция клеток млекопитающих in vivo. //Онтогенез. 1995 Т.26 N6. С.1-14.

32. Кольтовер В.К. Свободнорадикальная теория старения: исторический очерк. //Успехи геронтологии. 2000. Т.4. С.33-40.

33. Кулибин А.Ю., Захидов С.Т., Маршак Т.Л., Гопко А.В., Михалева Я.Ю. Семенова М.Л. Изучение сперматогенной структуры у мышей-долгожителей SAMP1, склонных к ускоренному старению. //ДАН. 2005. Т.404. №6. С.831-834.

34. Курносова Т.Р. Деструкция и регенерация семенных канальцев после локального рентгеновского облучения семенников половозрелых крыс. //Онтогенез. 1987. Т. 18. С.183-191.

35. Озершок Н.Д. Сравнительные особенности миогенеза у беспозвоночных, низших и высших позвоночных животных. //Онтогенез. 2004. Т.35. №6.1. C.441-450.

36. Оловников A.M. Эффект неполного концевого восстановления двуцепочечных молекул ДНК.// Известия АН. Серия биологическая. 1995. № 5. С.501-503.

37. Остапенко О.В., Бойцов А.С., Баранов А.Н. Лесина Е.А., Михайлов В.М. Баранов B.C. Зависимость эффективности трансфекции мышечных волокон in vivo от условий электропорации. // Общая генетика. 2004. Т. 40. С. 41-48.

38. Потапов И.В., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. Клеточная кардиомиопластика. //Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2001. Т.2. С.46-53.

39. Райцина С.С. Гематотестикулярный барьер и его роль в регуляции сперматогенеза и фертилыюсти.// Акушер, гинекол. 1980.V.4. Р.5-7.

40. Райцина С.С. Цикл сперматогенного эпителия и кинетика сперматогенеза у млекопитающих./В кн. «Современные проблемы сперматогенеза». 1982. М.: Наука. С.73-107.

41. Репин B.C. Трансплантация клеток: новые реальности в медицине. //Бюл. эксперимент биологии и медицины. 1998. №126 (приложение 1). С.14-28.

42. Розенфельд С.В., Того Е.Ф. Влияние эпиталона на частоту хромосомных повреждений у мышей SAM с ускоренным старением. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2002. Т. 133. С.320-322.

43. Рузен-Ранге Э. Сперматогенез у животных. //М., «Мир», 1980.

44. Сабурина И.Н., Семенова M.JI., Томм Н.А. Трансплантация эмбриональных миобластов и стромальных клеток костного мозга человека в скелетную мышцу мышей линии C57Bl/10J-mdx. //Бюл.эксперим.биологии и медицины. 2004. Т.137. С.593-596.

45. Самосудова Н.В., Шунгская В.Е., Ларин Ю.С. Особенности ультраструктуры пятислойного контакта и его роль в слиянии миобластов. //Цитология. 1988. Т.ХХХ. № 9. С. 1073-1077.

46. Семенова И.В., Андреева В.В., Семенова М.Л., Акимов С.С., Прудковский И.А., Зеленин А.В. Японские ускоренно стареющие мыши модель, связывающая старение in vivo и in vitro. //Цитология 2001. Т.43. №9. С.888-889.

47. Семенова М.Л. Клеточные контакты в трофэктодерме бластоцисты при экспериментальной эмбриональной диапаузе у мышей. //Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16 Биология. 1993. №2. С.31-34.

48. Семенова М.Л., Зеленина И.А., Шафеи Р.А., Голиченков В.А. Наследственная миодистрофия: биоинженерные подходы к репарации мышечных волокон. //Онтогенез. 2005. Т.36. №4. С.310-318.

49. Семенова М.Л., Зеленина И.А., Шафеи Р.А., Голиченков В.А. Наследственная миодистрофия: биоинженерные подходы к репарации мышечных волокон. //Онтогенез. 2005. Т.36. № 4. С.310-318.

50. Стволинский С.Л., Доброта Д. Противоишемическая активность карнозина. //Биохимия. 2000. Т.65. С.998-1005.

51. Тарусов Б.Н. Основы биологического действия радиоактивных излучений. //М.: Медгиз, 1954. 140 С.

52. Терехов С.М., Крохипа Т.Б., Шишкин С.С., Крахмалева И.Н., Захаров С.Ф., Ершова Е.С. Культивируемые миобласты человека как стволовые клетки мышечной ткани в медико-биологических исследованиях. //Известия АН: Серия биологическая. 2001. №6. С.745-752.

53. Урываева И.В., Делоне Г.В., Маршак Т.Н., Семенова M.JL, Захидов С.Т. Изменения хромосом и клеточного цикла в клетках печени ускоренно стареющих мышей линии SAMR1. //ДАН 2004. Т.395. №3. С.411-414.

54. Урываева И.В., Маршак TJL, Захидов С.Т., Семенова M.JL, Делоне Г.В. Накопление с возрастом микроядерных аббераций в клетках печени ускоренно стареющих мышей линии SAM. //ДАН. 1999. Т.368. №5. С.703-705.

55. Урываева И.В., Маршак Т.Л., Захидов СТ., Семенова M.JL, Делоне Г.В. Накопление с возрастом микроядерных аберраций в клетках печени ускоренно стареющих мышей линий SAM. //Докл. РАН. 1999. Т.368. С703-705.

56. Урываева И.В., Фактор В.М. Фракция роста печени, ее состав по плоидности и изменение при старении. //Онтогенез. 1975. Т.6. С.458-465.

57. Хипкис А.Р. Карнозин и карбонильные группы белка: возможная взаимосвязь.//Биохимия, 2000. Т.65. С.907-916.

58. Холлидей Р., МакФарланд Г.А. Роль карнозина в поддержании жизнедеятельности клеток. //Биохимия. 2000. Т.65. С.991-997.

59. Шахов В.П., Попов С.В., Афанасьев С.А. Пластический потенциал мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения заболеваний, связанных с повреждением сердечной ткани. //Кардиология. 2005. Т.45. №2. С.45-46.

60. Шубникова Е.А., Юрина Н.А., Гусев Н.Б., Балезина О.П., Большакова Г.Б. Мышечные ткани. //Москва. Медицина. 2001. 234С.

61. Шунгская В.Е., Самосудова Н.В., Ларин Ю.С. Образование межклеточных контактов в миогенезе. //Архив Анатомии, Гистологии и Эмбриологии. 1988. T.XCIV. №1. С.73-79.

62. Щегельская Е.А., Микулинский Ю.Е., Ревищин А.В., Омельченко Е.А., Кульшин В.Е., Грищенко В.И., Корочкин Л.И. Плюрипотентность клеток стромы костного мозга и перспективы их использования в клеточной терапии. //Онтогенез. 2003. Т.34. №3. С.228-235.

63. Ameisen J.C. Selective "death programs" or pleiotropic"life programs"? Looking for programmed cell death in the light of evolution. //J Soc Biol. 2005. V.199. N.3. P.175-89.

64. Araya R., Eckardt D., Maxeiner S., Kruger 0., Theis M., Willecke K., Saez J.C. Expression of connexins during differentiation and regeneration of skeletal muscle: functional relevance of connexin43. //J Cell Sci. V.l 18. N.l. P.27-37.

65. Arking D.E., Atzmon G., Arking A., Barzilai N., Dietz H.C. Association between a functional variant of the KLOTHO gene and high-density lipoprotein cholesterol, blood pressure, stroke, and longevity. //Circ Res. 2005. V.96. N.4. P.412-8.

66. Arking D.E., Becker D.M., Yanek L.R., Fallin D., Judge D.P., Moy TF, Becker LC, Dietz HC. KLOTHO allele status and the risk of early-onset occult coronary artery disease. //Am J Hum Genet. 2003.V.72. N.5. P.l 154-61.

67. Arking D.E., Krebsova A., Macek M. Sr, Macek M. Jr., Arking A., Mian I.S., Fried L., Hamosh A., Dey S., Mcintosh I., Dietz H.C. Association of human aging with a functional variant of klotho. //Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V.99. N.2. P.856-61.

68. Asakura A, Seale P, Girgis-Gabardo A, Rudnicki MA. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle //J Cell Biol. 2002.V.159. N.l. P. 123-34.

69. Bagutti C., Wobus A.M., Fassler R., Watt F.M. Differentiation of embryonal stem cells into keratinocytes: comparison of wild-type and beta 1 integrin-deficient cells. //Dev Biol. 1996. V.l79. P. 184-96.

70. Baksh D., Song L., Tuan R.S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. //J. Cell. Mol. Med. 2004. V.8. N.3. P.301-316.

71. Barnoy S., Kosower N.S. Caspase-1-induced calpastatin degradation in myoblast differentiation and fusion: cross-talk between the caspase and calpain systems. //FEBS Lett. 2003. V.546. N.2-3. P.213-7

72. Barnoy S., Maki M., Kosower N.S. Overexpression of calpastatin inhibits L8 myoblast fusion. //Biochem Biophys Res Commun. 2005. V.332. N.3, P.697-701.

73. Barnoy S., Supino-Rosin L., Kosower N.S. Regulation of calpain and calpastatin in differentiating myoblasts: mRNA levels, protein synthesis and stability. //Biochem J. 2000. V.351. N.Pt2. P.413^120.

74. Bartke A. New findings in transgenic, gene knockout and mutant mice.// Exp Gerontol. 2006. V. 41. P. 1217-1219.

75. Beauchamp J.R., Morgan J.E., Pagel C.N, Partridge T.A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. Hi Cell Biol. 1999. V.144. P.l 113-22.

76. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential application. //Stem Cells. 2001. V.19. N.3. P.180-192.

77. Billig H., Furuta I., Rivier C. et al. Apoptosis in testis germ cells: developmental changes in gonadotropin dependence and localization to selective tubule stages. //Endocrinology. 1995. V.136. P.5-12.

78. Black S., Kadyrov M., Kaufmann P., Ugele В., Emans N., Huppertz B. Syncytial fusion of human trophoblast depends on caspase 8. //Cell Death Differ. 2004. V.l 1. №1 P.90-98.

79. Blaveri K., Heslop L., Yu D.S., Rosenblatt J.D., Gross J.G., Partridge T.A., Morgan J.E. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. //Dev Dyn 1999. V.216. N3. P.244-256.

80. Boekelheide K., Lee J., Shipp E.B. et al. Expression of Fas system-related genes in the testis during development and after toxicant exposure. //Toxicol Lett. 1998. V.102-103. P.503-508.

81. Boldyrev A., Abe H., Stvolinsky S., Tyulina O. Effects of carnosine and related compounds on generation of free oxygen species: A comparative study. //Comp Biochem Physiol В Biochem Mol Biol. 1995. V.l 12В. P.481-485.

82. Boldyrev A., Gallant S., Golichenkov V., Semenova M., Yuneva M. Effect of carnosine on the physiological parameters and life span of senescence accelerated mice. //Ann. reports on SAM studies. 1998. V.14. P.83-84.

83. Boldyrev A., Song R., Lawrence D., Carpenter D.O. Carnosine protects against excitotoxic cell death independently of effects on reactive oxygen species. //Neurosci. 1999. V.94. P.571-577.

84. Boldyrev A.A., Stvolinsky S.L., Tyulina O.V., Koshelev V.B., Hori N., Carpenter D. Biochemical and physiological evidence that carnosine is an endogenous neuroprotector against free radicals. //Cell. Molec. Neurobiol. 1997. V.l7. P.259-271.

85. Brazelton Т., Rossi F.M., Keshet G.I., Blau H.M. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. //Science. 2000. V.290. P. 1775-9.

86. Brunskill N., Hayes C., Morrissey J., Klahr S. Changes in lipid environment decrease Na/K-ATPase activity in obstructive nephropathy. //Kidney Int.V.39. P.843-849.

87. Bulfield G., Siller W.G., Wight P.A., Moore K.J. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V.81. P.l 1891192.

88. Bulygina E., Gallant S., Kramarenko G., Stvolinsky S., Yuneva M., Boldyrev A. Characterization of the age changes in brain and liver enzymes of Senescence-Accelerated Mice (SAM). //J. of Anti-Aging Med. 1999. V.2. P.43-49.

89. Bulygina E.R., Gallant S.Ch., Kramarenko G.G., Stvolinsky S.L., Semyonova M.L., Boldyrev A.A. Effect of camosine on age induced changes in Senescence-Accelerated Mice (SAM). // J. Anti-Aging Med. 1999. V.2, N.4, P.337-342

90. Burchinsky S.G., Kuznecova S.M. Brain monoamine oxidase and aging: a review. //Voprosy Med. Khim. 1988. V.34, P.2-9.

91. Bustos-C)bregon E., Ramirez 0. Ageing and testicular function in Octogon degus. //Andrologia. 1997. V.29. P.319-326.

92. Campisi J. Cancer, aging and cellular senescence.// In vivo. 2000. V.14. P.183-188

93. Campisi J. Cellular senescence and apoptosis: how cellular responses might influence aging phenotypes. //Exp. Gerontol. 2003. V.38. P.5-11.111 .Campisi J. Cellular senescence as a tumor-suppressor mechanism. //Trends Cell Biol. 2001 V.ll. P.27-31.

94. Cantini M., Carraro U. Macrophage-released factor stimulates selectively myogenic cells in primary muscle culture. //J. Neuropathol. Exp. Neuro. 1995. V.54. P.121-128.

95. Carrillo M. C, Kanai S., Sato Y., and Kitani K. Age-related changes in antioxidant enzymes activity are region and organ, as well as sex, selective in the rat. //Mech. Age Dev. 1992. V.65. P.l87-198.

96. Chan W.K.M., Decker E.A., Chow C.K. et al. Effect of dietary on plasma and tissue antioxidant concentrations and on lipid oxidation in rat skeletal muscle. //Lipids. 1994. V.29. P.46M66.

97. Charrasse S., Meriane M., Comunale F., Blangy A., Gauthier-Rouviere C. N-cadherin-dependent cell-cell contact regulates Rho GTPases and beta-catenin localization in mouse C2C12 myoblasts.//J Cell Biol. 2002. V.158. P. 953-965

98. Childers M.K., Okamura C.S., Bogan D.J. Myofiber injury and regeneration in a canine homologue of Duchenne muscular dystrophy. // Am J Phys Med Rehabil. 2001. V. 80. P. 175-81.

99. Chiu R.C., Zibaitis A., Kao R.L. Cellular cardiomyoplasty: myocardial regeneration with satellite cell implantation. //Ann Thorac Surg. 1995. V.60. P. 1218.

100. Cho C., Jung-Ha. H., Willis W.D. et al. Protamine 2 deficiency leads to sperm DNA damage and embryo death in mice. //Biol. Reprod. 2003. V.69. P.211-217.

101. Choi J.H., Kim J.I., Kim D.W., Moon Y.S., Kim I.S., Chung H.Y. Age-related physiological changes in brain membranes of senescence accelerated mouse (SAM). //In: The SAM Model of Senescence. Ed.: Takeda T. Excerpta Medica. Amsterdam. 1994. P.321-324.

102. Choi S.Y., Kwon H Y., Kwon O.B., Kang J.H. Hydrogen peroxide-mediated Cu,Zn-superoxide dismutase fragmentation: protection by carnosine, homocarnosine and anserine. //Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 14723. P.651-657.

103. Clermont Y. Quantitative analysis of spermatogenesis in the rat: arevised model for the renewal of spermatogonia. //Am J Anat, 1962, V. 111, P. 111-129.

104. Cogle C.R., Yachnis A.T., Laywell E.D., Zander D.S., Wingard P.J., Steindler P.D., Scott E.W. Bone marrow transdifferentiation in brain after transplantation: a retrospective study. //Lancet. 2004. V.363. N.9419. P.1432-7.

105. Collins CA, Morgan JE. Duchenne's muscular dystrophy: animal models used to investigate pathogenesis and develop therapeutic strategies.// Int J Exp Pathol. 2003. V. 84. №4. P. 165-72.

106. Cooper B.J., Winand N.J., Stedman H et al. The homologue of the Duchenne locus is defective in X-linked muscular dystrophy of dogs. //Nature. 1988 V. 334. P. 154-156.

107. Cossu G. Fusion of bone marrow-derived stem cells with striated muscle may not be sufficient to activate muscle genes. II J. Clin. Invest. 2004. V.l 14. P.1540-1543.

108. Croft A.P., Przyborski S.A. Formation of neurons by non-neural adult stem cells: potential mechanism implicates an artifact of growth in culture. //Stem Cells. 2006. V.24.N.8. P.1841-51

109. Cross C.E., Halliwell В., Borish E.T., Pryor W.A., Ames B.N., Saul R.L., McCord J.M. and Harman D. Oxygen radicals and human disease. //Ann. Intern. Med. 1987. V.l07. P.526-545.

110. Dantzer D., Ferguson P., Hill R.P., Keating A., Kandel R.A., Wunder J.S., O'Sullivan В., Sandhu J., Waddell J., Bell R.S. Effect of radiation and cell implantation on wound healing in a rat model. //J Surg Oncol. 2003. V.83. N.3. P.185-190.

111. Dass S.B., Ali S.F. Evaluation of gamma-hydroxybutyric acid for genotoxicity in the mouse micronucleus assay. //Ann NY Acad Sci. 2004. V.1025. P.538-42.

112. Day Y., Roman M., Naviaux R.K., Verma I.M. Gene therapy via primary myoblasts: long-term expression of facror IX protein following transplantation in vivo. //Proc. Natl. Acad. USA. 1992. V.89. P. 1892-1895.

113. Dedieu S., Poussard S., Mazeres G., Grise F., Dargelos E., Cottin P., Brustis J.J. Myoblast migration is regulated by calpain through its involvement in cell attachment and cytoskeletal organization. //Exp Cell Res. 2004. V.292. N.l. P. 187200.

114. Dennis J.E., Carbillet J.P., Caplan A.I., Charbord P. The STRO-1+ marrow cell population is multipotential. //Cells Tissues Organs. 2002. V.170. P.73-82.

115. Dennis J.E., Charbord P. Origin and differentiation of human and murine stroma. //Stem Cells. 2002. V.20. P.205-214.

116. Derycke L.D., Bracke M.E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling.// Int J Dev Biol. 2004. V.48 P.463-76.

117. Dezawa M., Ishikawa H., Itokazu Y., Yoshihara Т., Hoshino M., Takeda S., Ide C., Nabeshima Y. Bone marrow stromal cells generate muscle cells and repair muscle degeneration. //Science. 2005. V.309. P.314-317.

118. Dickson G., Roberts M.L., Wells D.J., Fabb S.A. Recombinant micro-genes and dystrophin viral vectors. //Neuromuscul Disord. 2002. Suppl 1. P. S40-44.

119. Dumble M., Gatza C., Tyner S., Venkatachalam S., Donehower L.A. Insights into aging obtained from p53 mutant mouse models. //Ann N Y Acad Sci. 2004 V.1019. P.171-7.

120. Edelberg J.M., Tang L., Hattori K., Lyden D., Rafii S. Young adult bone marrowderived endothelial precursor cells restore aging-impaired cardiac angiogenic function. //Circ. Res. 2002. V.90. P.E89-E93.

121. Eglitis M.A., Mezey E. Hematopoietic cells differentiate into both microglia and macroglia in the brains of adult mice //Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1997. V.94. P.4080^1085.

122. Ehmcke J, Joshi B, Hergenrother SD, Schlatt S. Aging does not affect spermatogenic recovery after experimentally induced injury in mice. //Reproduction. 2007. VI33. P.75-83.

123. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. //Nature. 1981.V.292. P. 154-156.

124. Fan Y, Maley M., Beilharz M., Grounds M. Rapid death of injected myoblasts in myoblast transfer therapy. //Muscle Nerve. 1996. V.19. P.853-60.

125. Fang L.J., Fu X.B., Sun T.Z., Li J.F., Cheng В., Yang Y.H., Wang Y.X. An experimental study on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into vascular endothelial cells. //Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2003. V.19. N1. P.22-4

126. Ferrandiz M.L., Martinez M., Juan D., Diez A., Bustos G., and Miquel J. Impairment of mitochondrial oxidative phosphorylation in the brain of aged mice. //Brain Res. 1994. V.644. P.335-338.

127. Ferrari G. Mavilio F. Myogenic stem cells from the bone marrow: a therapeutic alternative for muscular dystrophy? //Nueromusc. Desord. 2002. V.l2. P.S7-S10/

128. Ferrari G., G. Cusella-De Angelis, Coletta M.,Paolucci E., Stornaiuolo A., Cossu Mavilio F. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. //Science. 1998. V.279. P.1528-1530.

129. Finkel T. and Holbrook N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. //Nature. 2000.V.408. P.239-247.

130. Florini J.R., Ewton D.Z., Coolican S.A. Growth hormone and the insulin-like growth factor system of myogenesis. //Endocrine Reviews. 1996. V.l 7. P.481-517.

131. Flurkey K., Papaconstantinou J., Miller R.A., Harrison D.E. Lifespan extension and delayed immune and collagen aging in mutant mice with defects in growth hormone production. //Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V.5. N.98.12. P.6736-6744.

132. Formigli L., Francini F., Chiappini L., Zecchi-Orlandini S., Bani D. Relaxin favors the morphofunctional integration between skeletal myoblasts and adult cardiomyocytes in coculture. //Ann N Y Acad Sci. 2005. V.l041. P.444-445.

133. French L.E., Hahne M., Viard I. et al. Fas and Fas ligand in embryos and adult mice: ligand expression in several immune-privileged tissues and coexpression inadult tissues caractrized by apoptotic cell turnover. Hi Cell Biol. 1996. V.133. P.335-343.

134. Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. //Cell Tissue Kinet. 1970. V.3. P.393-403.

135. Friedenstein A.J., Latzinik N.W., Grosheva AG Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. //Exp Hematol. 1982. V.10. P.217-227.

136. Friedenstein A.J., Shapiro-Piatetzky 1.1., Petrakova K.V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Hi Embryol Exp Morphol. 1966. V.l 6. P.381-390.

137. Fujibayashi Y., Yamomoto S., Waki A., and Yokoyama A. Mitochondrial DNA deletion in SAMP8 brain and diagnosis of oxidative stress. //Ann. Reports on SAM Studies. 1996.V.l2. P.59-60.

138. Gaetani G.F., Kirkman H.N., Mangerini R., and Ferraris A.M. Importance of catalase in the disposal of H202 within human erythrocytes. //Blood. 1994. V.84. P.325-330.

139. Gage F.H. Mammalian neural stem cells. //Science. 2000. V.287. P.1433-1438.

140. Galletta B.J., Chakravarti M., Banerjee R., Abmayr S.M. SNS: adhesive properties, localization requirements and ectodomain dependence in S2 cells and embryonic myoblasts. //Mechanisms of Development. 2004. N121. P. 1455-1468.

141. Garcia De La Asuncion J., Millan A., Pla R., Bruseghini L., Esteras A., Pallardo F. V., Sastre J., and Vina J. Mitochondrial glutathione oxidation correlates with age-associated oxidative damage to mitochondrial DNA. //FASEB J. 1996. V.10. P.333-338.

142. Gilgun-Sherki Y., Melamed E., and Offen D. Oxidative stress induced neurodegenerative diseases: the need for antioxidants that penetrate the blood brain barrier. //Neuropharmacol. 2001. V.40. P.959-975.

143. Gille J.J.P., Pasman P., Berkel C.G.M., Joenje H. Effect of antioxidants on hyperoxia-induced chromosomal breakage in Chinese hamster ovary cells: protection by carnosine. //Mutagenesis. 1991. V.6, P.313-318.

144. Glatt SJ, Chayavichitsilp P, Depp C, Schork NJ, Jeste DV Successful Aging: From Phenotype to Genotype.// Biol Psychiatry. 2007 Jan 6; Epub ahead of print.

145. Goichberg P., Shtutman M., Ben-Ze'ev A. Geiger B. Recruitment of beta-catenin to cadherin-mediated intercellular adhesions is involved in myogenic induction. // J Cell Sci. 2001 V.l 14. P.1309-19

146. Gollins H., McMahon J., Wells K.E., Wells D.J. High-efficiency plasmid gene transfer into dystrophic muscle. // Gene Ther. 2003. V.10 P.504-12.

147. Gompertz B. On the nature of the function expressive of the low of human mortality and on a new mode of determining life contingencies.// Philos. Trans. Roy. Soc. London. 1825. Vol.115. P.513-585.

148. Goodell M.A., Jackson K.A., Majka S.M., Mi Т., Wang H., Pocius J., Hartley C.J., Majesky M.W., Entman M.L., Michael L.H., Hirschi K.K. Stem cell plasticity in muscle and bone marrow. //Ann N Y Acad. Sci. 2001. V.938. P.208-218.

149. Gorza L., Vitadello M. Reduced amount of the glucose-regulated protein GRP94 in skeletal myoblasts results in loss of fusion competence. //FASEB J. 2000. V.l4. N.3. P.461-75.

150. Gregorevic P., Plant D.R., Leeding K.S et al. Improved contractile function of the mdx dystrophic mouse diaphragm muscle after insulin-like growth factor-I administration.// Am J Pathol. 2002. V.l61 № 6. P. 2263-72.

151. Gregory C.A., Ylostalo J., D.J. Prockop. Adult bone marrow stem/progenitor cells (MSCs) are preconditioned by microenvironmental niches in culture: a two-stage hypothesis for regulation of MSC fate. //Sci. STKE. 2005. N294. P.37.

152. Grist S.A., McCarron M., Kutlaca A., Turner D.R., Morley A.A. In vivo human somatic mutation: frequency and spectrum with age. // Mutat Res. 1992. V.266. P. 189-96.

153. Grune Т., Reinheckel Т., and Davies K. J. Degradation of oxidized proteins in mammalian cells. // The FASEB J. 1997. V.l 1. P.526-534.

154. Grzmil P., Golas A., Muller C., Styrna J. The influence of the deletion on the long arm of the Y chromosome on sperm motility in mice.//Theriogenology. 2006 Nov 23 Epub ahead of print.

155. Guan K., Rohwedel J., Wobus A.M. Embryonic stem cell differentiation models: cardiogenesis, myogenesis, neurogenesis, epithelial and vascular smooth muscle cell differentiation in vitro. //Cytotechnology. 1999. V.30. P.211-226.

156. Guerette В., Celestin F., Skuk D. et al. Prevention by anti-LFA-1 of acute myoblast death following transplantation.// J Immunol. 1997. V. 159. P. 25222531.

157. Gussoni E., Soneoka Y., Strickland C.D., Buzney E.A., Khan M.K., Flint A.F., Kunkel L.M., Mulligan R.C. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation. //Nature 1999. V.401. P.390-4.

158. Halvorsen Т., Levine F. Diabetes mellitus-cell transplantation and dene therapy approaches. //Curr.Mol.Med. 2001. V.l. N2. P.273-286.

159. Harman D. Aging: A theory based on free radicals and radiation chemistry. //J.Gerontol. 1956. V. N.l 1. P.298-300.

160. Harman D. Free radical theory of aging: Beneficial efects of adding antioxidants to the maternal mouse diet on the life span of offspring; possible explanation of the sex difference in longevity. //Age. 1979. V.2. P. 109-122.

161. Harman D. The aging process: major risk factor for disease and death. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88. P.5360-5363.

162. Hayashi S., Aso H., Watanabe K., Ohwada S.,-Yamaguchi T. Sequence of IGF-I, IGF-II, and HGF expression in regenerating skeletal muscle. //Histochem Cell Biol. 2004. V.l22. P.427-434.

163. Hayflick L. Recent advances in the cell biology of aging. //Mech Ageing Dev. 1980. V.l4. N.l-2. P.59-79.

164. Hayflick L. The illusion of cell immortality. //Br J Cancer. 2000. V.83. N.7. P.841-6.

165. Hayflick L., Moorhead P. The serial cultivation of human diploid cell strains. //Exp.Cell Res. 1961. V.25. P.585-621.

166. He P. Yasumoto K. Effect of paraquat and/or butylated hydroxytoluene administration on hepatic DNA single strand breaks in senescence accelerated mice. In: The SAM Model of Senescence (T. Takeda Ed.). //Excerpta Medica. Amsterdam. 1994. P. 133-136.

167. Heitzler P., Bourouis M., Ruel L., Carteret C., Simpson P. Genes of the Enhancer of split and achaete-scute complexes are required for a regulatory loop between

168. Notch and Delta during lateral signalling in Drosophila. //Development. 1996. V.l22. N.l. P.161-71.

169. Herbig U., Ferreira M., Condel L., Carey D., Sedivy J.M. Cellular senescence in aging primates. //Science. 2006. V.311. N.5765. P.1257.

170. Higuchi K. Genetic characterisation of senescence-accelerated mouse (SAM). //Experimental Gerontology. 1997. V.32. P. 129-138.

171. Higuchi K., Wang J., Kitagawa K., et al. Accelerated senile amyloidosis induced by amyloidogenic Apoa-II gene shortens the life span of mice but does not accelerate the rate of senescence. //J. Gerontol. A Biol Sci Med Sci. 1996. V.51. P.295-302.

172. Hipkiss A.R. Carnosine and protein carbonyl groups: a possible relationship. //Biochemistry (Moscow). 2000. V.65. P.907-916.

173. Holzenberger M. The GH/IGF-I axis and longevity. //Eur J Endocrinol. 2004 V.151. N.l. P.23-27.

174. Horsley V, Pavlath GK. Forming a multinucleated cell: molecules that regulate myoblast fusion. Cells Tissues Organs. //2004. V.l76. N.l-3. P.67-78.

175. Hosokawa M. A higher oxidative status accelerates senescence and aggravates age-dependent disorders in SAMP strains of mice. //Mech Ageing Dev. 2002. V.123. N12. P.1553-61.

176. Hosokawa M., Fuisawa H., Zhu Bing-Hua, et al. In vitro study of the mechanisms of senescence acceleration. //Exp. Gerotol. 1997. V.32. P. 197-203.

177. Hosokawa M., Fujisawa H., Ax S., Zahn-Daimler G., and Zahn R. K. Age-associated DNA damage is accelerated in the senescence-accelerated mice. //Mech. Ageing Dev. 2000. V.l 18. P.61-70.

178. Huard J., Acsadi G., Massic В., Karpati G. Gene trasfer to sceletal muscles by isogenic myoblasts. //Hum. Gene Tber. 1994. V.5. P.949-958.

179. Johnson Т.Е. Recent results: biomarkers of aging.// Exp Gerontol. 2006 V. 41. P.1243-1246.

180. Jorgensen C., Gordeladze J. and Noel D. Tissue engineering through autologous mesenchymal stem cells. //Current Opinion in Biotechnology. 2004. V.15. P.406-410.

181. Jurisicova A., Acton B.M. Deadly decisions: the role of genes regulating programmed cell death in human preimplantation embryo development. //Reproduction. 2004 Sep. V.128. N.3. P.281-91.

182. Kablar В., Krastel K., Tajbakhsh S., Rudnicki M.A. Myf5 and MyoD activation define independent myogenic compartments during embryonic development. //Dev Biol. 2003. V.258. N2. P.307-318.

183. Kablar В., Rudnicki M.A. Skeletal muscle development in the mouse embryo.// Histol Histopathol. 2000. V.15. P.649-56.

184. Kalderon N., Epstein M.L., Gilula N.B. Cell-to-cell communications and myogenesis. //J Cell Biol. 1977. V.75. P.788-806.

185. Kamatsu M. and Hiramatsu M. Age-associated changes in brain nuclear DNA damage of male and female SAMP8 and effect of Toki-Shakuyaku-San on it. //Ann. Reports on SAM Studies. 1999. V.15. P.85-86.

186. Kantha S.S., Wada S., Tanaka H., Takeuchi M., Watabe S., Ochi H. Carnosine sustains the retention of cell morphology in continuous fibroblast culture subjected to nutritional insult. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V.223. P.278-282.

187. Kapsa R., Quigley A., Lynch G.S. et al. In vivo and in vitro correction of the mdx dystrophin gene nonsense mutation by short-fragment homologous replacement. // Hum Gene Ther. 2001. V. 12. P. 629-42.

188. Kesteloot H., Huang X. On the relationship between human all-cause mortality and age. //Eur J Epidemiol. 2003. V.18. N.6. P.503-11.

189. Kim S.H., Kaminker P. and Campisi J. Telomeres, aging and cancer: in search of a happy ending. //Oncogene. 2002. V.21. P.503-511

190. Kiryushko D, Berezin V, Bock E. Regulators of neurite outgrowth: role of cell adhesion molecules. // Ann N Y Acad Sci. 2004. V.1014: P.140-54.

191. Kitagawa K, Naiki H, Takeda T, Higuchi K. Age-associated decreases in the messenger ribonucleic acid level and the rate of synthesis of apolipoprotein A-II in murine senile amyloidosis //Lab Invest. 1994. V.70. P.565-71

192. Kitamura Y., Zhao Z.H., Ohnuki Т., Takei M., and Nomura Y. Age-related changes in transmitter glutamate and NMDA receptor/channels in the brain of senescence-accelerated mouse. //Neurosci. Lett. 1992. V.137. P. 169-172.

193. Klapper R., Stute C., Schomaker O., Strasser Т., Janning W., Renkawitz-Pohl R., Holz A. The formation of syncytia within the visceral musculature of the

194. Drosophila midgut is dependent on duf, sns and mbc. //Mechanisms of Development. 2002. V.l 10. P.85-96.

195. Kletsas D., Pratsinis H., Mariatos G., Zacharatos P., Gorgoulis V.G. The proinflammatory phenotype of senescent cells: the p53-mediated ICAM-1 expression //Ann N Y Acad Sci. 2004 V.1019. P.330-332.

196. Knight J. A. The biochemistry of Aging. //Advances in clinical chemistry.2000.V.35. P.l-62;

197. Kobayashi N., Katsumi S., Imoto K., Nakagawa A., Miyagawa S., Furumura M., Mori T. Quantitation and visualization of ultraviolet-induced DNA damage using specific antibodies: application to pigmentcell biology. //Pigment Cell Res2001.V14. P.94—102.

198. Koh G.Y., Klug M.G., Soonpaa M.H., Field L.J. Differentiation and long-term survival of C2C12 myoblast grafts in heart. Hi. Clin Invest. 1993. V.92. N.3. P.1548-1554.

199. Kohen R., Misgav R., and Ginsburg I. The SOD like activity of coppencarnosine, coppenanserine and copper : homocarnosine complexes. //Free Rad. Res. Com. -1991. V.12-13. P.179-185.

200. Koji T. Nonradioaktive in situ nick translation: a useful molecular histochemical tool to detect single-stranded DNA breaks. //Acta Histochem Cytochem. 1996. V.29. P.71-79.

201. Koji Т., Hishikawa Y., Ando H. et al. Expression of Fas and Fas ligand in normal and ischemia-reperfusion testes: involvement of the Fas system in the induction of germ cell apoptosis in the damaged mouse testis. //Biol Reprod. 2001. V.64. P.946-954.

202. Koltover V. K. Reliability concept as a trend in biophysics of aging. //Adv. Gerontol. 1998. V.2, P.37-41.

203. Komura S. Yoshino K., Ohishi N., and Yagi K. Serum lipid peroxide level of the senescence accelerated mouse. In: The SAM Model of Senescence (T. Takeda Ed.). //Excerpta Medica. Amsterdam. 1994. P. 141-144.

204. Korbling M., Estov Z Adult stem cells for tissue repair a new therapeutic concept? //N Engl J Med. 2003. V.349. P.570-582.

205. Korbling M., Estrov Z., Champlin R. Adult stem cells and tissue repair. //Bone Marrow Transplant. 2003. V.l. P.S23-24.

206. Kosheleva N.V., Semenova M.L. Preimplantation development of SAMP1 mice and the influence of intermittent hyhjxic traning on SAMP1 embryogenesis. //Ann. reports on SAM studies. 2006. V.21. P.49-50.

207. Kramarenko G., Yuneva M., Semenova M., and Boldyrev A. Characterization of age changes in tissues of Senescence Accelerated Mice. //Ann. Reports on SAM Studies. 1999. V.15.P.9-10.

208. Krause D.S., Theise N.D., Collector M.I., Henegariu O., Hwang S., Gardner R., Neutzel S., Sharkis S.J. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. //Cell 2001. V.l05. P.369-77.

209. Krebsbach P.H., Kuznetsov S.A., Bianco P., Robey P.G. Bone marrow stromal cells: characterization and clinical application. //Biol. Med. 1999. V.10. N2. P. 165181.

210. Kule PJ, Raymond JP, Karbon W, Ferkani JW NMDA receptors: heterogeneity and agonism. / In: Exicatory Amino Acid Receptors. NY: Ellis Horwood. 1999. P. 121161

211. Kurokawa T. Increase in oxidative stress in the cerebral cortex preceding the appearance of the neuronal dysfunction of SAMP8. //Ann. Reports on SAM Studies. 1999. V.l 5. P.43-44.

212. Kuro-o M. Disease model: human aging.Trends. //Mol Med. 2001 .V.7 N.4. P.179-81.

213. Kuro-o M., Matsumura Y., Aizawa H., et al. Mutation of the mouse Klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. //Nature. 1998. V.390. P.45-51.

214. Kuznetsov S.A., Friedenstein A.J., Robey P.G. Factors required for bone marrow stromal fibroblast colony formation in vitro. //Br J Haematol. 1997. V.97. P.561-570.

215. Kuznetsov S.A., Krebsbach P.H., Satomura K., Kerr J., Riminucci M., Benayahu D., Robey P.G. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. //J Bone Miner Res. 1997. V.l2. P. 13351347.

216. Lafreniere J.F., Mills P., Tremblay J.P., Fahime E.E. Growth factors improve the in vivo migration of human skeletal myoblasts by modulating their endogenous proteolytic activity. // Transplantation. 2004. V. 77. P. 1741-7.

217. Lafuste P, Sonnet C, Chazaud B, Dreyfus PA, Gherardi RK, Wewer UM, Authier FJ. ADAM 12 and alpha9betal integrin are instrumental in human myogenic cell differentiation. //Mol Biol Cell. 2005. V.16. N.2. P.861-70

218. Lagasse E., Connors H., Al-Dhalimy M., Reitsma M., Dohse M., Osborne L., Wang X., Finegold M., Weissman I.L., Grompe M. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. //Nat Med. 2000. V.6. P. 1229-34.

219. Lan H. Y. Tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiatin mechanisms in proximal tubule cells. //Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2003. V.12. P.25-29.

220. Lardinois O.M. Reactions of bovine liver catalase with 02" and H202. //Free Rad. Res. 1995. V.22. P.251-274.

221. Law P., Goodwin Т., Fang Q., Deering M., Duggirala V., Larkin C., Florendo J.A., Quinley Т., Cornett J., Shirzad A., Yoo Т., Holcomb R. Whole body myoblast transfer. //Transplantation Proceedings. 1994. V.26. N.6. P.3381-3383.

222. Lee J.H., Kosinski P.A., Kemp D.M. Contribution of human bone marrow stem cells to individual skeletal myotubes followed by myogenic gene activation. //Experimental Cell Research. 2005. V.307. P. 174- 182.

223. Lee R.J., Kang K.S., Nam S.Y., Park J.H., Lee Y.S, Yun Y.W., and Cho M.H. Effect of carnosine and related compounds on monosaccharide autooxidation and H202 formation. //Korean J. Physiol. Pharmacol. 1999. V.3. P.251-261.

224. Lenaz G., Bovina C., Formiggini G., and Castelli G. P. Mitochondria, oxidative stress and antioxidant defenses. //Acta Biochim Pol. 1999. V.46. P. 1-21.

225. Li R.K., Mickle D.A.G., Weisel R.D. et al. In vivo survival and function of transplanted rat cardiomyocytes. //Circ. Res. 1996. V.78. N.2. P.283-288.

226. Lim DS, Vogel H, Willerford DM, Sands AT, Piatt KA, Hasty P. Analysis of ku80-mutant mice and cells with deficient levels of p53.//Mol Cell Biol. 2000 Jun;20(l l):3772-80.

227. Lindahl Т. Supression of spontaneous mutagenesis in human cells by DNA base excision-repair///Mutat. Res. 2000. V.462. P.129-135.

228. Linge C., Green M.R., Brooks R.F. A method for removal fibroblasts from human tissue culture systems //Exp. Cell Res. 1989. V.l85 P.519-528

229. Linnane A. W., Zhang C, Baumer A., and Nagley P. Mitochondrial DNA mutation and the ageing process: bioenergy and pharmacological intervention. //Mutat. Res. 1992. V.275. P.195-208.

230. Liochev S. I., Hausladen A., Beyer W. F., Fridovich I. NADPH: ferredoxin oxidoreductase acts as a paraquat diaphorase and is a member of the soxRS regulon. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V.91. P.1328-1331.

231. Lippman R.D. Free radical-induced lipoperoxidation and aging./In: CRA Handbook of Free Radicals and Antioxidants in Biomedicine. Eds.Miquel J., Quintanilha А. Т., Weber H.). CRC Press, Boca Raton, FL. 1989. 197P.

232. Lithgow G.J.,Andersen J.K. The real Dorian Grey mouse //BioEssay. 2000. V.22. P.410-413.

233. Liu Q.A., Hengartner M.O. The molecular mechanism of programmed cell death in C. elegans. //Ann N Y Acad Sci. 1999.V.887. P.92-104.

234. Liu T.B., Fedak P.W., Weisel R.D., et al. Enhanced IGF-1 expression improves smooth muscle cell engraftment after cell transplantation. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004 V. 287 P. H2840-9.

235. Liu X., Kim C.N., Yang J., Jemmerson R., and Wang X. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c. //Cell. 1996. V.86. P. 147-157.

236. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., and Randal R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. //J. Biol. Chem. 1951. V.193. P.265-275.

237. Lu D., Wang L., Chen J. Intraarterial administration of marrow stromal cell in a rat model of traumatic brain injury //Neurotrauma. 2000. V.l 8. N8. P.813-819.

238. Lu Q.L., Rabinowitz A., Chen Y.C., et al. From the Cover: Systemic delivery of antisense oligoribonucleotide restores dystrophin expression in body-wide skeletal muscles. //Proc Natl Acad Sci USA. 2005.V.102. P. 198-203.

239. Lucas P.A., Culcutt A.F., Southerland S.S. A population of cells resident within embryonic and newborn rat skeletal muscle is capable to differentiate into multipke mesodermal phenotypes. //Wound Rep. Regen. 1995. V.3. P.457-468.

240. Lucas P.A., Warejcka D.J., Zhang L.M. Effect of rat mesenchymal stem cells on the development of abdominal adhesions after surgery. //J.Rurg.Res. 1996. V.62. P.229-232.

241. Lutz W.K. Endogenous genotoxic agents and processes as a basis of spontaneous carcinogenesis. //Mutat. Res. 1990. V.275. P.305-315.

242. Ma K., Chan J.K., Zhu G., Wu Z. Myocyte enhancer factor 2 acetylation by p300 enhances its DNA binding activity, transcriptional activity, and myogenic differentiation. //Mol Cell Biol. 2005. V.25. N9. P.3575-3582.

243. Machmood A., Lu D., Wang L., Chop M. Treatment of traumatic brain injury in female rats with intravenous administration of bone marrow stromal cells. //Neurosurgery. 2001. V.49. N5. P.l 196-1203.

244. Magalhaes J.P., Cabral J.A., Magalhaes D. The influence of genes on the aging process of mice: a statistical assessment of the genetics of aging. //Genetics. 2005 V.l69. N.l. P.265-74.

245. Maier B, Gluba W, Bernier В et al. Modulation of mammalian life span by the short isoform of p53//Genes & Development, 2004, Vol. 18, pp. 306 319.

246. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S. Cardiomyocytes can be generatated from marrow stromal cells in vitro. //J. Clin Invest. 1999. VI03. N.5. P.697-705.

247. Margolis F. L. Carnosine in the primary of olfactory pathway. //Science. 1974.V.184. P.909-914.

248. Maria CS., Revilla E., Ayala A., de la Cruz С P., and Machado A.Changes in the histidine residues of Cu/Zn-SOD during aging. //FEBS Lett. 1995.V.374. P.85-88.

249. Masuya M., Drake C.J., Fleming P.A., Reilly C.M., Zeng II., Hill W.D., Martin-Studdard A., Hess D.C., Ogawa M. Hematopoietic origin of glomerular mesangial cells. //Blood 2003. V.101. P.2215-2218.

250. Mates J.M., Sanchez-Jimenez F. Antioxidant enzymes and their implication in pathophysiological processes. //Frontiers in Biosci. 1999. V.4. P.d339-345.

251. Mazeres G., Leloup L., Daury L., Cottin P., Brustis J.J. Myoblast attachment and spreading are regulated by different patterns by ubiquitous calpains. //Cell Motil Cytoskeleton. 2006. V.63. N.4. P. 193-207.

252. McClearn G.E. Biogerontologic theories. //Exp. Gerontol. 1997. V.32. P.3-10.

253. McFarland G.A., Holliday, R. Further evidence for the rejuvenating effects of the dipeptide L-carnosine on cultured human diploid fibroblasts. //Exp. Geront.1999. V.34, P.35-45.

254. McFarland G.A., Holliday, R. Retardation of the senescence of cultured human diploid fibroblasts by carnosine. //Exp. Cell Res. 1994. V.212, P.167-175.

255. McKay R. Stem cells-hype and hope. //Nature. 2000. V.406. P.361-364.

256. McLaren A. Mammalian germ cells: birth, sex, and immortality. //Cell Structure and Function, 2001. V.26. P.l 19-122.

257. McLennan I.S., Koishi K., Cellular localisation of transforming growth factor-beta 2 and -beta 3 (TGF-beta2, TGF-beta3) in damaged and regenerating skeletal muscles. //Dev Dyn. 1997. V.208. P.278-89.

258. Medvedev Z.A. On the immortality of the germ line: genetic and biochemical mechanism. A review. //Mech. Ageing Dev. 1981. V. 17. P.331-359.

259. Medvinsky A., Gan O., Semenova M., Samoylina N. Development of day-8 colony-forming unit-spleen hematopoietic progenitors during early murine embryogenesis: spatial and temporal mapping. //Blood. 1995. V.87. N3. P.557-566.

260. Meeson A.P., Hawke T.J., Graham S., Jiang N., Elterman J., Hutcheson K., Dimaio J.M., Gallardo T.D., Garry D.J. Cellular and molecular regulation of skeletal muscle side population cells. //Stem Cells. 2004. V22. N.7. P. 1305-20

261. Mege R.M., Goudou D., Diaz C., et al. N-cadherin and N-CAM in myoblast fusion: compared localization and effect of blockage by peptides and antibodies. // J. Cell Sci. 1992 V. 103. P. 897-906.

262. Melov S. Mitochondrial oxidative stress. Physiologic consequences and potential for a role in aging. //Ann. N Y Acad. Sci. 2000. V.908. P.219-225.

263. Melov S., Ravenscroft J., Malik S., Gill M. S., Walker D. W., Clayton P. E., Wallace D. C, Malfroy В., Doctrow S. R., and Lithgow G. J. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. //Science. 2000. V.289.P. 1567-1569.

264. Mendias C.L., Tatsumi R., Allen R.E. Role of cyclooxygenase-1 and -2 in satellite cell proliferation, differentiation, and fusion. //Muscle Nerve. 2004. V.30, N4, P.497-500.

265. Мепоп S.D., Osman Z., Chenchill K., Chia W. A positive feedback loop between Dumbfounded and Rolling pebbles leads to myotube enlargement in Drosophila. //The Journal of Cell Biology. 2005.V.169. N.6. P.909-920.

266. Mezey E., Chandross K.J., Harta G., Maki R.A., McKercher S.R. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. //Science 2000. V.290. P. 1779-1782.

267. Mezey E., Key S., Vogelsang G., Szalayova I., Lange G.D., Crain B. Transplanted bone marrow generates new neurons in human brains. //Proc Natl Acad Sci USA. 2003. V.100. P.1364-1369.

268. Michele D.E., Campbell K.P. Dystrophin-glycoprotein complex: post-translational processing and dystroglycan function. // J Biol Chem. 2003. V. 278. P. 15457-60.

269. Migliaccio E., Giorgio M., Mele S. The p66shc adaptor protein controls oxidative stress response and life span in mammals. //Nature. 1999. V.402. P.309-313.

270. Miquel J. An update on the mitochondrial-DNA mutation hypothesis of cell aging. // Mutat Res. 1992. V.275. P.209-16.

271. Miquel J. An update on the oxygen stress-mitochondrial mutation theory of aging: genetic and evolutionary implications. //Exp. Gerontol. 1998. V.33. P.l 13-126.

272. Misra H. and Fridovich I. The role of superoxide anion in the autooxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. Hi. Biol. Chem. 1972. V.247. P.3170-3175.

273. Miyamoto M. Characteristics of memory and behavioral disorders in SAMP8 mice. In: The SAM Model of Senescence (Takeda T. Ed.). //Excerpta Medica, Amsterdam. 1999 P.61-66.

274. Monnat R.J., Loeb L.A. Mechanisms of neoplastic transformation. //Cancer Invest. 1983. V.l. P.175-183.

275. Montarras D., Chelly J., Bober E., Arnold H., Ott M.O., Gros F., Pinset C. Developmental patterns in the expression of Myf5, MyoD, myogenin, and MRF4 during myogenesis. //New Biol. 1991. V.3. N.6. P.592-600.

276. Morgan J.E. Myogenicity in vitro and in vivo mouse muscle cells separated on discontinuous Percll gradients Hi. Neurol. Sci. 1988 V.85. P. 197-207.

277. Morgan J.E. Phosphorylase kinase activities in damaged mouse skeletal muscles. Hi Neurol Sci. 1988. V.86. P.149-58.

278. Morgan J.E., Coulton G.R., Partridge T.A. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. // Muscle Nerve 1989. V. 12. P. 401—409.

279. Morgan J.E., Partridge T.A. Cell transplantation and gene therapy in muscular dystrophy. //Bioessays. 1992. V.l4. P.641-5.

280. Mori A., Utsumi K., Liu J., and Hosokawa M. Oxidative damage in the Senescence-Accelerated Mouse. //Annals NY Acad. Sci. 1998. V.854. P.239-250.

281. Muller W.U., Streffer C. Micronucleus assays. // In: Advances in Mutagenesis Research (ed. by G.Obe) Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York. 1994. P.4-134.

282. Munsie M., Schlatt S., deKretser D.M., Loveland K.L. Expression of stem cell factor in the postnatal rat testis. //Mol. Reprod. Dev. 1997. V.47. P. 19-25.

283. Miinsterberg A.E., Lassar A.B. Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite. //Development. 1995. V. 121. N.3. P.651-660.

284. Muraglia A., Cancedda R., Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. Hi Cell Sci. 2000. V.l 13. P.l 161-6.

285. Nakahara H., Kanno Т., Inai Y., Utsumi K., Hiramatsu M., Mori A., and Packer L. Mitochondrial dysfunction in the Senescence Accelerated Mouse (SAM). //Free Rad. Biol. Med. 1998. V.24. N.l. P.85-92.

286. Natalicchio A., Laviola L., De Tullio C., et al. Role of the p66Shc isoform in insulin-like growth factor I receptor signaling through MEK/Erk and regulation of actin cytoskeleton in rat myoblasts. // J Biol Chem. 2004. V. 279. P.43900-9.

287. Naya F.J., Olson E. MEF2: a transcriptional target for signaling pathways controlling skeletal muscle growth and differentiation. //Current Opinion in Cell Biology. 1999. V.ll. P.683-688.

288. Nemoto S., Takeda K., Yu Z. X., Ferrans V. J., and Finkel T. Role of mitochondrial oxidants as regulators of cellular metabolism. //Mol. Cell. Biol. 2000. V.20. P.7311-7318.

289. Neuzil J. and Stocker R. Bilirubin attenuates radical-mediated damage to serum albumin. //FEBS Lett. 1993. V.331. P.281-284.

290. Newcomb T. G., Loeb L. A. Mechanisms of mutagenicity of oxidatively-modified bases. In: Molecular Biology of Free Radicals in Human Disease. //Aruoma O. and Halliwell B. (Eds.). Oica International, Saint Lucia, London. 1998. P. 139-166.

291. Ng 1.О., Chan K.L., Shek W.H., Lee J.M., Fong D.Y., Lo C.M., Fan S.T. High frequency of chimerism in transplanted livers. //Hepatology. 2003 Oct. V.38. N.4. P.989-98

292. Nichols J., Zevnik В., Anastassiadis K., Niwa H., Klewe-Nebenius D., Chambers L, Scholer H., Smith A. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. //Cell. 1998. V.95. P.379-391.

293. Nisitani S., Hosokawa M., Sasaki M.S. et al. Acceleration of chromosome aberrations in the senescence-accelerated stains of mice. //Mutat. Res. 1990. V. 237. P. 221-228.

294. Nomura Y., Wang В. X., Qi S. В., Namba Т., and Kaneko S. Biochemical changes related to aging in the senescence-accelerated mouse. //Exp. Gerontol. 1989. V24. P.49-55.

295. Owen M., Friedenstein AJ. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. //Ciba Found Symp. 1988. V.l36. P.42-60.

296. Pagano S.F., Impagnatiello F., Girelli M., .Isolation and characterization of neural stem cells from the adult human olfactory bulb. //Stem Cells. 200. V.l8. N.4. P.295-300.

297. Paradis V., Youssef N., Dargere D., Ba N., Bonvoust F., Bedossa P. Replicative senescence in normal liver, chronic hepatitis C, and hepatocellular carcinomas. //Hum. Pathol. 2001. V.32. P.327-332.

298. Park J. W., Choi С. H., Kim M. S., Chung M. H. Oxidative status in senescence-accelerated mice. // J. Gerontol. 1996. V.51, P. B337-B345.

299. Partridge T, Lu QL, Morris G, Hoffman E. // Is myoblast transplantation effective? //Nat Med. 1998. V.4. P. 1208-1209.

300. Pate E, White H, Cooke R. Determination of the myosin step size from mechanical and kinetic data. //Proc Natl Acad Sci USA. 1993. V.90. P.2451-2455.

301. Pavlath G.K., Horsley V. Cell fusion in skeletal muscle: central role of NFATC2 in regulating muscle cell size. //Cell Cycle. 2003. V.2. N.5. P.420-423.

302. Pavlov A.R., Revina A.A., Dupin A.M. et al. The mechanism of interaction of carnosine with superoxide radicals in water solutions. //Bioehim. Biophys. Acta. 1993. V.l 157. P.304-312.

303. Pearce D.J., Anjos-Afonso F., Ridler C.M., Eddaoudi A., Bonnet D. Age dependent increase in SP distribution within Hematopoiesis: implications for our understanding of the mechanism of aging. //Stem Cells. 2006 Dec 7 Epub ahead of print.

304. Penafiel R., Ruzafa C., Monserrat F., Cremades A. Gender-related differences in carnosine, anserine and lysine content of murine skeletal muscle. // Amino Acids. 2004. V.26. P. 53-58.

305. Pereira O.R., Carvalho S.N., Stumbo C., Rodrigues C.A.B., Porto L.C., Moura A.S., Carvalho L. Osteopontin expression in ciculture of differentiating rat fetal skeletal fibroblasts and myoblasts. //In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 2006. V.42. P.4-7.

306. Petersen B.E., Bowen W.C., Patrene K.D. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. //Science. 1999. V.284. N.5417. P.l 168-1170.

307. Piatek P., Pach D., Kamenczak A., Schmager J. Cytogenetic aspects of buprenorphine maintenance treatment program—preliminary report. //Przegl Lek. 2005. V62. N6. P391-393.

308. Piccolo F., Moore S.A., Ford G.C., Campbell K.P. Intracellular accumulation and reduced sarcolemmal expression of dysferlin in limb-girdle muscular dystrophies. //Ann Neurol. 2000. V.48 P.902-912.

309. Pin C.L., Hrychyn A.W., Rogers K.A. Embryonic and fetal rat myoblasts form different muscle fiber types in an ectopic in vivo environment. //Dev Dynam. 2002. V.224. P.253-66.

310. Poewe W.H. and Wenning G.K. The natural history of Parkinson's disease. //Ann. Neurol. 1998. V.44. P. S1-S9.

311. Porter W.L. Paradoxical behaviour of antioxidants in food and biological systems. //Tox. Ind. Health. 1993. V.9.P.93-122.

312. Poulsom R., Alison M.R., Forbes S.J., Wright N.A. Adult stem cell plasticity. Hi Pathol. 2002. V.197. N4. P.441-456.

313. Powers R.W. 3rd, Harrison D.E., Flurkey K. Pituitary removal in adult mice increases life span. // Mech Ageing Dev. 2006. V.l27. P.658-559.

314. Pownall M.E., Gustafsson M.K., Emerson C.P. Myogenic regulatori factors and the specification of muscle progenitors in vertebrate embryos. //Cell Dev. Biol. 2002. V.l8. P.748-783.

315. Pownall M.E., Gustafsson M.K., Emerson C.P. Myogenic regulatory factors and the specification of muscle progenitors in vertebrate embryos. // Annu Rev. Cell. Dev. Biol. 2002. V.l8. P.747-83.

316. Prockop D.J., Azizi S.A., Phinney D.G. Potential use of marrow stromal cell as terapeutic vectors for diseases of the central nervous system. //Prog. Brain Research. 2000. V.l28. P.293-297.

317. Pryor W.A. Oxy-radicals and related species: Their formation, lifetime and reaction. //Annu. Rev. Physiol. 1986. V.48. P.657-667.

318. Quarrie J.К., Riabowol K.T. Murine models of life span extension. //Sci Aging Knowledge Environ. 2004 V.4. N.31. P. 1-5.

319. Radice G.L., Rayburn H., Matsunami H., et al.Developmental defects in mouse embryos lacking N-cadherin. // Dev. Biol. 1997. V. 181. P. 64-78.

320. Raha S. and Robinson В. H. Mitochondria, oxygen free radicals, disease and aging. //Trends in Biochem. Sci. 2000. V.25. P.502-508.

321. Rando T.A. Oligonucleotide-mediated gene therapy for muscular dystrophies. // Neuromuscul Disord. 2002. Suppl. P. S55-60.

322. Rando T.A., Blau H.M. Primary mouse myoblast purification, characterization and transplantation for cell-mediated gene-therapy //J. Cell. Biol. 1994. V.125. P.1275-1287.

323. Rando T.A., Pavlath G.K., Blau H.M. The fate of myoblasts following transplantation into mature muscle. //Exp. Cell Res. 1995. V.220. P.383-389.

324. Rangappa, S., Fen C., Lee E. H. Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes. //Ann Thorac Surg. 2003. V.75. P.775-779.

325. Rauch C., Brunet A.C., Deleule J., Farge E. C2C12 myoblast/osteoblast transdifferentiation steps enhanced by epigenetic inhibition of BMP2 endocytosis. //Am J Physiol Cell Physiol. 2002. V.283. P.C235-C243.

326. Rawls A., Valdez M.R., Zhang W., Richardson J., Klein W.H., Olson E.N. Overlapping functions of the myogenic bHLH genes MRF4 and MyoD revealed in double mutant mice. // Development. 1998. V.125. N.13. P.2349-2358.

327. Reinecke H., MacDonald G.H., Hauschka S.D., Murry C.E. Electromechanical coupling between skeletal and cardiac muscle: implication for infarct repair. //J Cell Biol. 2000. V.l49. P.731-740.

328. Reinecke H., Minami E., Poppa V., Murry C.E. Evidence for fusion between cardiac and skeletal muscle cells. // Circ Res. 2004. V.94. N.6. P.56-60.

329. Riggs J.E. Aging, increasing genomic entropy, and neurodegenerative disease. //Neurol. Clin. 1999. V.l6. P.757-770.

330. Riminucci M., Bradbeer J.N., Corsi A., Gentili C., Descalzi F., Cancedda R., Bianco P. Vis-a-vis cells and the priming of bone formation. //J Bone Miner Res. 1998. V.13. P.1852-1861.

331. Rinsch C., Peduto G., Schneider B.L., Aebischer P. Inducing acceptance to encapculated xenogenic myoblasts. //Transplantation. 2001. V.71. P.345-351.

332. Rivier F., Alkan O., Flint A.F., et al. Role of bone marrow cell trafficking in replenishing skeletal muscle SP and MP cell populations. // J Cell Sci. 2004 V.l 17. P. 1979-88

333. Robert E., Schwartz R.E., Reyes M. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells Hi. Clin. Invest. 2002. V.l09. N.10. P.1291-1302.

334. Rohwedel J., Guan K., Wobus A.M. Induction of cellular differentiation by retinoic acid in vitro. // Cells Tissues Organs. 1999. V.l65. P. 190-202.

335. Rosen G.D., Sanes J.R., LaChance R., Cunningham J.M., Roman J., Dean D.C. Roles for the integrin VLA-4 and its counter receptor VCAM-1 in myogenesis.//Cell. 1992. V.69. P. 1107-1111.

336. Ross A., Waimare K., Moss J., et al. Testicular degeneration in Bcl-w-deficient mice. //Nature, genetic. 1998. V.l8. P.251-256

337. Rotter V., Schwartz D., Almon E., et al. Mice with induced level of protein exhibit the testicular giant-cell degenerative syndrome. // PNAS. 1993. V.90. P.9075-9079.

338. Rouger K., Brault M., Daval N., Leroux I., Guigand L., Lesoeur J., Fernandez B.Cherel Y. Muscle satellite cell heterogeneity: in vitro and in vivo evidences for populations that fuse differently. //Cell Tissue Res. 2004. V.317. V3. P.319-326.

339. Rubtsov A. M., Schara M., Sentjurc M., and Boldyrev A. A. Hydroxyl radical-scavenging activity of carnosine: a spin trapping study. //Acta Pharm.Yugosl. 1991. V.41. P.401-407.

340. Ruggiero RA, Bustuoabad OD. The biological sense of cancer: a hypothesis. // Theor Biol Med Model. 2006. V.15 P.43.

341. Sabourin L.A., Girgis-Gabardo A., Seale P., Asakura A., Rudnicki M.A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. Hi Cell Biol. 1999. V.l44. N.4. P.631-643.

342. Santa Maria L., Rojasa C.V., Minguella J.J. Signals from damaged but not undamaged skeletal muscle induce myogenic differentiation of rat bone-marrow-derived mesenchymal stem cells. //Experimental Cell Research. 2004. V.300.P.418- 426.

343. Sastre J., Pallardo F.V., Vina J. The role of mitochondrial oxidative stress in aging. //Free Radic Biol Med. 2003 V.l. N.35. P.l-8.

344. Satomura K., Krebsbach P., Bianco P., Gehron R. P. Osteogenic imprinting upstream of marrow stromal cell differentiation. Hi Cell Biochem 2000. V.78. P.391-403.

345. Scavo L.M., Karas M., Murray M., Leroith D. Insulin-like growth factor-I stimulates both cell growth and lipogenesis during differentiation of human mesenchymal stem cells into adipocytes. // Clin Endocrinol Metab. 2004. V.89. P.3543-53.

346. Schienda J., Engleka K.A., Jun S., Hansen M.S., Epstein J.A., Tabin C.J., Kunkel L.M., Kardon G. Somitic origin of limb muscle satellite and side population cells. //Proc Natl Acad Sci USA. 2006. V.l 03. N4. P.945-50.

347. Schmalbruch H. The morphology of regeneration of skeletal muscles in the rat.//.Tissue Cell. 1976. V.8. P.673-92.

348. Schmid W., The micronucleus test. //Mut. res. 1975. V.31. P.9-15.

349. Schmitt C.A. Cellular senescence and cancer treatment. //Biochim Biophys Acta. 2006. Epub ahead of print.

350. Schmitt C.A., Fridman J.S., Yang M., Lee S., Baranov E., Hoffman R.M. and Lowe S.W. A senescence program controlled by p53 and pl6INK4a contributes to the outcome of cancer therapy. //Cell. 2002 V.109. P.335-346

351. Schoeffner D.J., Warren D.A., Muralidara S. et al. Organ weights and fat volume in rats as a function of strain and age. //J Toxicol Environ Health A. 1999. V.56. N.7. P.449-62.

352. Scholer H.R., Dressier G.R., Balling R., Rohdewohld H., Gruss P. Oct-4: a germline-specific transcription factor mapping to the mouse t-complex. //EMBO J. 1990. V.9. P.2185-95.

353. Schoneich C. Reactive oxygen species and biological aging: a mechanistic approach. //Exp. Gerontol. 1999. V.34. P. 19-34.

354. Schwander M, Leu M, Stumm M, Dorchies OM, Ruegg UT, Schittny J, Muller U. Betal integrins regulate myoblast fusion and sarcomere assembly. //Dev Cell. 2003. V.4. N.5. P.673-85

355. Schwander M., Leu M., Stumm M., Dorchies O.M., Ruegg Urs Т., Schittny J., Muller U. 131 integrins regulate myoblast fusion and sarcomere assembly. //Developmental Cell. 2003. V.4. P.673-685.

356. Scott J.E. Oxygen and the connective tissues. //Trends Biochcm Sci. 1992. V.17. P.340-343.

357. Scott J.M., Li S., Harper S.Q., Wclikson R., et al. Viral vectors for gene transfer of micro-, mini-, or full-length dystrophin. // Neuromuscul Disord. 2002. Suppl 1. P. S23-9.

358. Semenova M.L., Kraqmarenko G.G., Aleksandrova A.A., Gallant S., Boldyrev A.A. Na/K-ATPase activity and postimplantation loss in SAMP1 mice. //Ann. reports on SAM studies. 2001. V.17. P. 107-109.

359. Sherr C.J and DePinho R.A. (2000) Cellular senescence: Mitotic clock or culture shock? //Cell V.102. P.407-410.

360. Shi D., Reinecke H, Murry C.E., Torok-Storb B. Myogenic fusion of human bone marrow stromal cells, but not hematopoietic cells. //Blood. 2004. V.104. N.l. P.290-294.

361. Shi Q., Rafii S., Wu M.H-D., Wijelath E.S., Yu C., Ishida A., Fujita Y., Kothari S., Mohle R., Sauvage L.R., Moore M.A.S., Storb R.F., Hammond W.P. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. //Blood. 1998. V.92. N.2. P.362-367.

362. Shigenaga M.K., Hagen T.M., and Ames B.N. Oxidative damage and mitochondrial decay in aging. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V.91. P.10771-10778.

363. Shimizu N., Itoh N., Utiyama H., Wahl G.M. Selective cnrapment of extrachromosomally amplified DNA by nuclear budding and micronucleation during S phase. //J.Cell Biol. 1998. V.140. P.1307-1320.

364. Shimura M., Tanaka Y., Nakamura S. et al. Micronuclei formation and aneuploidy induced by Vpr, an accessory gene of Human immunodeficiency virus type III. //FASEB J. 1999. V.13. P.621- 637.

365. Shin C.S., Lecanda F., Sheikh S., et al. Relative abundance of different cadherins defines differentiation of mesenchymal precursors into osteogenic, myogenic, or adipogenic pathways. //J Cell Biochem. 2000 V. 78. P. 566-77.

366. Shiomi Т., Takahara Y., Nakamori C, Hayase M, Sakaguchi I., Yoshimura K., Makino S., and Katsuura M. Age-related changes in receptors of neurotransmitters and synaptic proteins in the brain of SAM. //Ann. Reports on SAM Studies. 1996. V.12. P.lll-112.

367. Shiraki-Iida Т., Aizawa H., Matsumura Y., Sekine S., Iida A., Anazawa H., Nagai R., Kuro-o M., Nabeshima Y. Structure of the mouse klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted protein. //FEBS Lett. 1998. V.424. N.l-2. P.6-10.

368. Sicinski P., Geng Y., Ryder-Cook A.S., Barnard E.A., Darlison M.G., Barnard P.J. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. //Science. 1989. V.244. P. 1578-80.

369. Sies H. Oxidative Stress II. Oxidants and antioxidants. //Academic Press, London. 1991.

370. Simmons P.J., Torok-Storb B. Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonalantibody, STRO-1. //Blood 1991. V.78. P.55-62.

371. Simons J.W. Coming of age: "dysgeneses" a theory connecting induction of persistent delayed genomic instability with disturbed cellular ageing. //Int. J. Radiat. Biol. 2000. V.76. P.1533-1543.

372. Skuk D., Roy В., Goulet M., Tremblay J.P. Successful myoblast transplantation in primates depends on appropriate cell delivery and induction of regeneration in the host muscle. //Exp Neurol. 1999. V.155. P.22-30.

373. Slagboom P.E. The aging genome: determinant or target? //Mutat. Res. 1990. V.237. P. 83-187.

374. Slater T. F. Recent advances in biochemical pathology: toxic liver injury. //Pion Press. 1976.P. 1-283.

375. Sloter E., Nath J., Eskenazi В., Wyrobek A.J. Effects of male age on the frequencies of germinal and heritable chromosomal abnormalities in humans and rodents. //Fertil Steril. 2004 V.81. N.4. P.925-43.

376. Smogorzewska E.M., Weinberg K.I. Treatment progress of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). //Med Wieku Rozwoj. 2004. V.8. N.L P.25-32.

377. Smythe G.M., Fan Y., Grounds M. Enchanced migration and fusion of donor myoblasts in distrophic and normal host muscle. //Muscle Nerve. 2000. V.23. P.560-574.

378. Sohal R.S. and Weindruch R. Oxidative stress, caloric restriction and aging. //Science. 1996. V.273. P.59-63.

379. Sotiropoulos A., Ohanna M., Kedzia C., Menon R.K., Kopchick J.J., Kelly P.A., Pende M. Growth hormone promotes skeletal muscle cell fusion independent ofinsulin-like growth factor 1 up-regulation. //Proc Natl Acad Sci USA. 2006 V.l 03 N.l9. P.7315-20.

380. Spink N., Brown D.G., Skelly J.V., Neidle S. Sequence-dependent effects in drug-DNA interaction: the crystal structure of Hoechst 33258 bound to the d(CGCAAATTTGCG)2 duplex. //Nucleic Acids Res. 1994. V.l 1. N.22. P. 1607-12.

381. Stamm C., Westphal В., Kleine H.D., Petzsch M., Kittner C., Klinge H., Schumichen C., Nienaber C.A., Freund M., Steinhoff G. Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration. //Lancet. 2003. V.361. P.45-6.

382. Stewart C.E.H., Rotwein P. Insulin-like growth factor-II is an autocrine survival factor for differentiating myoblasts. //The Journal of Biological Chemistry. 1996. V. 271.N.19. P.l 1330-11338.

383. Straub V., Rafael J.A., Chamberlain J.S., Campbell K.P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. // J Cell Biol. 1997.V.139 P. 375-85.

384. Strauer B.E., Brehm M., Zeus Т., Kostering M., Hernandez A., Sorg R.V., Kogler G., Wernet P. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. //Circulation 2002. V.106. P.1913-1918.

385. Strehler B.L. Deletional mutations are the basic cause of aging: historical perspectives. //Mutat. Res. 1995. V. 338. P.3-17.

386. Stvolinsky S., Kukley M., Dobrota D., Vachova M., Tkac I., and Boldyrev A. Carnosine: an endogenous protector in the ischemic brain. //Cell. Molec. Neurobiol. 1999. V.l9. P.45-56.

387. Sumariwalla V.M., Klein W.H. Similar myogenic functions for myogenin and MRF4 but not MyoD in differentiated murine embryonic stem cells. //Genesis. 2001. V.30.N.4. P.239-249.

388. Suzuki N., Withers H.R. Exponential decrease during aging and random lifetime of mouse spermatogonial stem cells. //Science. 1978. V.202. P.1314-1315.

389. Svendsen C.N. Stem cells: hype or hope? //Drug Discov Today. 2002. V.7. P.455-456.

390. Svendsen C.N., Caldwell M.A., Ostenfeld T. Human neural stem cells: isolation, expansion and transplantation. //Brain Pathol. 1999. V.9. N.3. P.499-513.

391. Szilard L. On the nature of the aging process. //PNAS. 1959. V.45. P.30-45.

392. Tahara S., Matsuo M., and Kanako T. Age related changes in oxidative damage to lipids and DNA in rat skin. //Mech. Ageing Dev. 2001. V.l22. P.415-426.

393. Takahashi Т., Kalka C., Masuda H., Chen D., Silver M., Kearney M., Magner M., Isner J.M., Asahara T. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. //Nat Med. 1999. V.5. P.434-8.

394. Takeda Т., Hosokawa M., Higuchi, K. J. Senescence-accelerated mouse (SAM): a novel murine model of senescence. //Am. Geriatrics Soc. 1991. V.39, P.911-919.

395. Takeda Т., Hosokawa M., Higuchi K. Senescence Accelerated Mice. A novel murine model of aging. In: The SAM Model of Senescence (T. Takeda Ed.). //Excerpta Medica, Amsterdam. 1994. P.15-23.

396. Takeda Т., Hosokawa M., Higuchi К. Senescence-Accelerated Mouse (SAM): A novel murine model of accelerated senescence. //JAGS. 1991. V.39. P.911-919.

397. Takeda Т., Hosokawa M., Higuchi K. Senescence-accelerated mouse (SAM): A novel murine model of senescence. //Exp. Gerontol. 1997. V.32. P. 105-109.

398. Takeda Т., Hosokawa M., Huguchi K. Senescence-accelerated mouse (SAM). A novel murine model of aging// In: The SAM model of senescence. Eds: Takeda T. //Amsterdam-London-New. York-Tokyo, Excerpta Medica. 1994. P. 15-22.

399. Takeda Т., Hosokawa M., Takeshita S., et al. A new murine model of accelerated senescence. //Mech. Aging Dev. 1981. V. 17. P. 183-194.

400. Takeda Т., Matsushita Т., Kurozumi M., et al. Pathobiology of the senescence-accelerated mouse (SAM). // Exp. Gerontol. 1997. V.32. P.l 17-127.

401. Takeshita S., Isshiki Т., Sato T. Increased espression of direct gene transfer into skeletal musclesafterischemic injury in rats. // Lab. Invest. 1996. V. 74. P. 10611065.

402. Takeshita S., Isshiki Т., Sato T. Increased expression of direct gene transfer into skeletal muscles observed after acute ischemic injury in rats. // Lab Invest. 1996. V.74. P.1061-1065.

403. Tang J.Y., Hwang B.J., Ford J.M., Hanawalt P.C., Chu G. Xeroderma pigmentosump48 gene enhances global genomic repair and suppresses UV-induced mutagenesis. //Mol Cell. 2000. V.5. P.737-744.

404. Taylor D.A., Hruban R., Rodriguez E.R., Goldschmidt-Clermont P.J. Cardiac chimerism as a mechanism for self-repair: does it happen and if so to what degree? //Circulation. 2002. V.l06. P.2-4.

405. Taylor M.V. Muscle differentiation: signalling cell fusion. //Curr Biol. 2002 V.l2. N6. P.224-8

406. Terada N., Hamazaki Т., Oka M., Noki M., Mastalerz D.M., Nakano Y., Meyer E.M., Morel L., Petersen B.E., Scott E.W. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion //Nature. 2002. V.416, N.4. P.542-545.

407. Terman A. Catabolic insufficiency and aging. //Ann N Y Acad Sci. 2006 V.l067. P.27-3.

408. Terranova R., Pereira C.F., Roure C., Merkenschlager M., Fisher A.G. Acquisition and extinction of gene expression programs are separable events in heterokaryon reprogramming. //Journal of Cell Science. 2006. V.l 19. P.2065-2072.

409. Thepot D, Weitzman JB, Barra J et al. Targeted disruption of the murine junD gene results in multiple defects in male reproductive function. //Development. 2000. V.127, P.143-153.

410. Thioudellet C., Blot S., Squiban P et al. Current protocol of a research phase I clinical trial of full-length dystrophin plasmid DNA in Duchenne/Becker muscular dystrophies. Part I: rationale. // Neuromuscul Disord. 2002. Suppl 1. P. S49-51.

411. Thomas E.L. Evidence for a role of taurine in the vitro oxidative toxicity of neutrophils toward erythrocytes. //J. Biol. Chem. 1985. V.260. P.3321-3329.

412. Till J.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mous bone marrow cells. //Rad. Res. 1961. V.l4. P.213-222.

413. Toma J.G., Akhavan M., Fernandes K.J., Barnabe-Heider F., Sadikot A., Kaplan D.R., Miller F.D. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. //Nat Cell Biol. 2001. V.9. P.778-784.

414. Tosh D., Slack J.M. How cells change their phenotype. //Nat Rev Mol Cell Biol. 2002. V.3. P. 187-94

415. Traber M.G. Determinants of plasma vitamin E concentrations. //Free Rad. Biol. Med. 1994. V.l6. P.229-239.

416. Trapani J.A. and Jans D.A. Lymphocyte-mediated cytolisis: dual apoptotic mechanisms with overlapping cytoplasmic and nuclear signaling pathways. In: Apoptosis: Biology and Mechanisms. //Kumar S. (Ed). Springer. 1999. P.77-94.

417. Tribollet E, Raufaste D, Maffrand J, Serradeil-Le Gal С Binding of the non-peptide vasopressin Via receptor antagonist SR-49059 in the rat brain: an in vitro and in vivo autoradiographic study.//Neuroendocrinology. 1999. V.69. P.l 13-20.

418. Tsay H.J., Wang P., Wang S.L., and Ku H.H. Age-associated changes of superoxide dismutase and catalase activities in the rat brain. // J. Biomed. Sci. 2000. V.7. P.466-474.

419. Tse H.F., Kwong Y.L., Chan J.K.F., Lo G., Ho C.L., Lau C.P. Angiogenesis in ischaemic myocardium by intramyocardial autologous bone marrow mononuclear cell implantation. //Lancet 2003. V.361. P.47-9.

420. Turner D.R., Dreimanis M., Holt D., Firgaira F.A., Morley A.A. Mitotic recombination is an important mutational event following oxidative damage.//Mutat Res. 2003. V.522. P.21-26.

421. Ueki Т., Kaneda Y., Tsutsui H., Nakanishi K., Sawa Y., Morishita R., Matsumoto K., Nakamura Т., Takahashi H., Okamoto E., Fujimoto J. Hepatocyte growth factor gene therapy of liver cirrhosis in rats. //Nat Med. 1999. V.5. V.226-30.

422. Richardson J.A., Klein W.H., Olson E.N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. //Dev Biol. 2000. V. 219. N2. P.287-298.

423. Van Blerkom J. Mitochondria in human oogenesis and preimplantation embryogenesis: engines of metabolism, ionic regulation and developmental competence. //Reproduction. 2004. V.128. N.3. P.269-80

424. Van Blerkom J., Davis P., Alexander S. A microscopic and biochemical study of fragmentation phenotypes in stage-appropriate human embryos. //Hum Reprod.2001. V.16. N.4. P.719-29.

425. Vassilopoulos G., Wang P-R., Russel D.W. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion. //Nature. 2003. V.422. N.21. P.901-904.

426. Verfaillie C.M. Adult stem cells: assessing the pluripotency. //Trends in Cell Biol.2002. V.12. P.502-508.

427. Vignery A. Osteoclasts and giant cells: macrophage-macrophage fusion mechanism. //Int J Exp Pathol. 2000 V.81. N.5. P.291-304.

428. Vijg J. Somatic mutations and aging: a re-evaluation. //Mutat. Res. 2000. V.447. P.117-135.

429. Volonte D., Peoples A.J., Galbiati F. Modulation of myoblast fusion by caveolin-3 in dystrophic skeletal muscle cells: implications for Duchenne muscular dystrophy and limb-girdle muscular dystrophy-lC. //Mol Biol Cell. 2003. V.14. N.10. P.4075-88.

430. Wakitani S., Saito Т., Caplan A.I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. //Muscle Nerve. 1995. V.l8. N.12. P.1417-26.

431. Wang J., Silva J. P., Gustafsson С. M., Rustin P., and Larson N. G. Increased in vivo apoptosis in cells lacking mitochondrial DNA gene expression. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V.98. P.4038-4043.

432. Wang X., Willenbring H., Akkari Y., Torimaru Y., Foster M., Al-Dhalimy M., Lagasse E., Finegold M., Olson S., Grompe M. Cell fusion is the principal source of bone-marrow-derived hepatocytes. //Nature. 2003. V.422. N.21. P.897-901.

433. Warner H.R. and Starke-Reed P. Oxidative stress and aging. In: Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function. //Clerch L. B. and Massaro D. J. (Eds.). Marcel Dekker, NY., a. o. 1997. P. 139-167.

434. Warner H.R., Sierra F. Models of accelerated ageing can be informative about the molecular mechanisms of ageing and/or age-related pathology. //Mechanisms of Ageing and Development. 2003. V.124. P.581-587.

435. Washabaugh C.H., Ontell M.P., Ontell M. Nonmuscle stem cells fail to significantly contribute to regeneration of normal muscle. // Gene Therapy 2004. V. 11. P. 1724-8.

436. Watkins SC, Cullen MJ, Hoffman EP, Billington L. Plasma membrane cytoskeleton of muscle: a fine structural analysis. // Microsc Res Tech. 2000 Feb 1-15;48(3-4): 131-41.

437. Watson A.J., Natale D.R., Barcroft L.C. Molecular regulation of blastocyst formation.//Anim Reprod Sci. 2004. V.82-83. P.583-92.

438. Wei Y.H, Lu C.Y., Wei C.Y., Ma Y.S., and Lee H.C Oxidative stress in human aging and mitochondrial disease-consequences of defective mitochondrial respiration and impaired antioxidant enzyme system. //Chin. J. Physiol. 2001. V.31. P.l-11.

439. Weimann J.M., Charlton G.A., Brazelton T.R., Hackman R.C., Blau H. Contribution of transplanted bone marrow cells to Purkinje neurons in human adult brains. // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. V.100. P.2088-93.

440. Weiss S. J. Tissue destruction by neutrophils. //N. Engl. J. Med. 1989. V.320.-P.365-376.

441. Weissman I.L. Translating stem and progenitor cells to the clinic: barriers and opportunities//Science. 2000. V.287. N.25. P.1442-1446.

442. Wells D.J., Wells K.E. Gene transfer studies in animals: what do they really tell us about the prospects for gene therapy in DMD? // Neuromuscul Disord. 2002. Suppl 1. P. SI 1-22.

443. White J.D., Bower J.J., Kurek J.В., Austin L. Leukemia inhibitory factor enhances regeneration in skeletal muscles after myoblast transplantation. //Muscle Nerve. 2001. V.24. P.695-697.

444. Wirobek A., Bruce W. The induction of sperm-shape abnormalities in mice and humans //Chemical mutagens., Plenum press, N. Y. London. 1978. V.5. P.258-286.

445. Woolveridge I., de Boer-Brouwer M., Taylor MF et al. Apoptosis in the rat spermatogenic epithelium following androgen withdrawal: changes in apoptosis-related genes. //Biol Reprod. 1999. V.60. P.461^170.

446. Wright W.E. and Shay J.W. Telomere dynamics in cancer progression and prevention: fundamental differences in human and mouse telomere biology. //Nat Med 2000. V.6. P.849-851

447. Wu K., Lund M., Bang K., Thestrup-Pedersen K. Telomerase activity and telomere length in lymphocytes from patients with cutaneous T-cell lymphoma.//Cancer. 1999. V.86. P. 1056-63

448. Xia C., Higuchi K., Shimizu M., Matsushita T, Kogishi K, Wang J, Chiba T, Festing MF, Hosokawa M. Genetic typing of the senescence-accelerated mouse (SAM) strains with microsatellite markers. //Mamm Genome. 1999. V.10. P.235-238.

449. Yao S.N., Kurachi K. Implanted myoblasts not only fuse with myofibers but also survive as muscle precursor cells. //J. Cell Biol. 1993. V.105. P.975-963.

450. Yegogov Y.E., Semenova I.V., Karatchentsev D.V., Semenova M.L., Akimov S.S., Yegorova I.N., Zelenin A.V. Senescence-accelerated mouse (SAM): A model that binds in vivo and in vitro aging. //Journal of anti-aging medicine. 2001. V.4. N.l. P.39-47.

451. Yin Y., Dewolf W.C., Morgentaler A. Experimental cryptorchidism induces testicular germ cell apoptosis by p53-dependent and -independent pathways in mice. //Biol Reprod, 1998. V.58. P.492^196.

452. Yoo K.J., Li R.K., Weisel R.D. Aytologous smooth muscle cell transplantation improved heart function in dilated cardiomyopathy. //Ann Thorac Surg. 2000. V.70. P.859-865.

453. Yoshino K., Komura S., Okada Т., Ohishi N., and Yagi K. Skin lipid peroxide level of the senescence accelerated mouse. In: The SAM Model of Senescence (T. Takeda Ed.). //Excerpta Medica. Amsterdam. 1994. P. 145-148.

454. Yu B.P., Kang C.M., Han J.S., Kim D.S. Can antioxidant supplementation slow the aging process? //Biofactors. 1998. V.7. P.93-101.

455. Yuan L., Liu J.G., Zhao J. et al. The murine SCP3 gene is required synaptonemal complex assembly, chromosome synapsis, and male fertility. //Mol. Cell. 2000. Vol.5. P.73-83.

456. Yuneva M.O., Bulygina E.R., Gallant S.C., Kromaranko G.G., Stvolinsky S.L., Semyonova M.L., Boldyrev A.A. Effect of carnosine on age-induced changes in senescence-accelerated mice. //Journal of anti-aging medicine. 1999. V.2. N.4. P.337-342.

457. Zafon С. Jekyll and Hyde, the p53 protein, pleiotropics antagonisms and the thrifty aged hypothesis of senescence. //Med Hypotheses. 2006 Dec 11; Epub ahead of print.

458. Zakeri Z., Lockshin R.A., Criado-Rodriguez L.M., Martinez-A. C. A generalized caspase inhibitor disrupts early mammalian development. //Int J Dev Biol. 2005. V.49. N.l. P.43-7

459. Zelenin A.V., Alimov A.A., Zelenina I.A., Semenova M.L., Rodova M.A., Chernov B.K., Kolesnikov V.A. Transfer of forein DNA into the cells of developing mouse embryos by microprojective bombardment. //FEBS Letters. 1993. V.315.P.29-32.

460. Zelenin A.V., Kolesnikov V.A., Alimov A.A., Zelenina I.A., Semenova M.L. Ballistic transfection and genetic transformation of animal cells in vitro and in vivo. //Ontogenesis. 1994. V.25. N.4. P.88-90.

461. Zelenin A.V., Titomirov A.V., Kolesnikov V.A. Genetic transformation of mouse cultured cells with the help of high-velocity mechanical DNA injection. //FEBS Lett. 1989. V.244. N.l.P.65-7

462. Выражаю благодарность всем, принимавшим участие в исследованиях, результаты которых позволили мне написать эту работу:моим учителям и наставникам,моим коллегам, моим ученикам и помощникам.

463. Отдельно хочу поблагодарить Владимира Александровича Голиченкова Зелениных Инессу Александровну и Александра Владимировича Болдырева Александра Александровича Сабурину Ирину Николаевну Шафеи Рамина Ахмедовича