Экспериментальное обоснование, конструирование и оценка видоспецифической иммуноферментной тест-системы для определения иммуноглобулинов класса G к Chlamydia trachomatis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Есаев, Артем Леонидович

• Есаев, Артем Леонидович
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Есаев, Артем Леонидович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Классификации хламидий.

1.2. Общая характеристика хламидий.

1.3. Клиника и эпидемиология хламидийных инфекций.

1.4. Методы лабораторной диагностики урогенитальных хламидиозов.

1.5. Антигенная структура наружной мембраны С. trachomatis.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Биологические методы.

2.2.2. Серологические методы.

2.2.3. Физико-химические методы.

2.2.4. Физические методы.

2.2.5. Статистические методы.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ РАСТВОРИМЫХ АНТИГЕНОВ

С. TRACHOMATIS.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ПРИРОДНОГО ВИДОСПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИГЕНА С. TRACHOMATIS.

4.1. Изучение фосфолипидного состава природного видоспецифического антигена С. trachomatis.

4.2. Изучение углеводного состава природного видоспецифического антигена С. trachomatis.

4.3. Определение содержание аминокислот в составе природного видоспецифического антигена С. trachomatis.

4.4. Изучение фракционного состава белков природного видоспецифического антигена С. trachomatis.

ГЛАВА 5. КОНСТРУИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ КЛАССА G

К С. TRACHOMATIS.

5.1. Изучение специфичности разрабатываемой иммуноферментной тест-системы.

5.2. Оценка чувствительности и специфичности первоначального варианта иммуноферментной тест-системы с помощью сывороток стандартной панели ОСО 42-28-313-00 ГИСК им. Л.А. Тарасевича (серия 002).

5.3. Совершенствование комплектации иммуноферментной тест-системы и методики проведения иммуноферментного анализа.

5.4. Разработка критериев полуколичественной оценки активности исследуемых сывороток в иммуноферментном анализе.

5.5. Материалы по экспериментально-клинической оценке видоспецифической иммуноферментной тест-системы Хламивид ®.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальное обоснование, конструирование и оценка видоспецифической иммуноферментной тест-системы для определения иммуноглобулинов класса G к Chlamydia trachomatis»

Актуальность проблемы. В последние годы хламидийные инфекции приобрели особую актуальность. Значительная распространенность хламидиозов среди людей ставит их в разряд серьезных проблем национальных служб охраны здоровья во многих странах мира [15, 29]. Хламидийные инфекции представляют собой группу этиологически родственных инфекционных заболеваний антропонозной и зоонозной природы, которые характеризуются сходным патогенезом и выраженным полиморфизмом клинических проявлений [20, 42, 82]. Этиологическими агентами хламидийных инфекций являются хламидии - патогенные облигатные внутриклеточные грамотрицательные бактерии, объединенные в порядок Chlamydiales. Согласно современной классификации, порядок Chlamydiales представлен более чем 10 видами хламидий, способных поражать как человека, так и позвоночных и беспозвоночных животных [25, 155] Антропонозные хламидиозы характеризуются большим разнообразием нозологических форм, среди которых можно выделить следующие основные группы:

- заболевания, связанные с поражением слизистой оболочки глаза (трахома, паратрахома, различные виды конъюнктивитов);

- заболевания верхних дыхательных путей, бронхов и легких (ОРЗ, фарингиты, бронхиты, синуситы, гриппоподобные заболевания, пневмонии, бронхиальная астма);

- заболевания мочеполовой системы (цервицит, уретрит, сальпингит, простатит, эпидидимит, венерическая лимфогранулема и др.);

- заболевания, связанные с генерализацией и персистенцией хламидийной инфекции в организме больного и формированием аутоиммунного ответа на собственные ткани и органы (синдром Рейтера, эндокардит, коронарная болезнь, артрит).

Наиболее серьезный вред здоровью людей приносят хламидийные инфекции, передающиеся половым путем - урогенитальные хламидиозы, которые, как правило, вызываются хламидиями, относящимися к виду Chlamydia trachomatis [82, 94]. По данным ВОЗ, в 1995 г. в мире зарегистрировано 89 млн случаев урогенитальных хламидиозов. Отмечено, что ежегодно выявляется около 10 млн новых больных, страдающих этой инфекцией [137]. Анализ, проведенный А. А. Шаткиным (1983), показал, что в России скорость распространения урогенитальных хламидиозов составляет до 1 млн случаев в год. Урогенитальная хламидийная инфекция опасна своими последствиями как для здоровья отдельного индивидуума, так и благополучия всего человеческого общества. Последствия не выявленной и не леченой хламидийной инфекции наносят обществу значительный демографический ущерб. В настоящее время доказано, что широкая распространенность урогенитальной хламидийной инфекции в человеческой популяции, наряду с другими причинами, приводит к снижению уровня рождаемости в цивилизованных странах [94]. Хламидийная инфекция является также причиной высоких экономических затрат, обусловленных необходимостью лечения и медицинского обслуживания страдающих этой патологией людей. Экономические потери от урогенитальных хламидиозов в США оценены в 1 млрд долларов в год, а потери от не леченой хламидийной инфекции достигают 4 млрд долларов ежегодно [29]. Для решения проблемы урогенитальной хламидийной инфекции ВОЗ рекомендует создание федеральных программ по предупреждению инфекций, передаваемых половым путем, в том числе хламидиоза, при интеграции специалистов различных сфер медицинской деятельности, в частности, дерматологов и венерологов, акушеров-гинекологов и офтальмологов, артрологов и бактериологов, иммунологов; проведение научного поиска во всех аспектах проблемы хламидийных инфекций, особенно направленных на предупреждение развития постхламидийных осложнений [89].

Успех в лечении хламидийной инфекции и в предупреждении осложнений во многом обеспечивается своевременной и адекватной диагностикой. Характерной чертой клинических проявлений урогенитальных хламидиозов является отсутствие опорных симптомов, что значительно осложняет их клиническое распознавание. В силу указанных причин решающее значение в выявлении урогенитальной хламидийной инфекции имеют методы лабораторной диагностики [29, 35, 89]. В настоящее время в мире разработаны достаточно чувствительные и специфичные методы лабораторной диагностики хламидиозов, которые можно подразделить на две большие группы:

- методы, основанные на обнаружении в исследуемых образцах хламидий и их антигенов или фрагментов хламидийной ДНК;

- методы, основанные на определении специфических антител к С. trachomatis в сыворотках больных.

Методы первой группы при условии высокого качества их исполнения являются, несомненно, наиболее убедительными для постановки диагноза текущей хламидийной инфекции. Однако при хронических и генерализованных формах хламидиозов, сопровождающихся воспалительными процессами в малом тазе, при развитии постхламидийных осложнений обнаружение хламидий или их антигенов возможно далеко не всегда [4, 75, 77]. В подобных случаях успешно применяются методы определения противохламидийных антител (серодиагностика).

Учитывая, что до настоящего времени в мировой практике нет абсолютно

KJ W о 1 надежного метода диагностики урогенитальнои хламидиинои инфекции, лабораторная диагностика хламидиозов должна носить комплексный характер [29, 89]. Использование методов серодиагностики в сочетании с методами определения возбудителя в биосубстратах обеспечивает врача более достоверной информацией об этиологической природе инфекции у больного [77].

В последние годы в серодиагностике хламидиозов широкое распространение получил метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Указанный метод является достаточно надежным и позволяет с высокой степенью достоверности выявлять противохламидийные антитела в сыворотках больных [15, 77]. При этом для диагностики урогенитальных хламидиозов используются как родоспецифические, так и видоспецифические иммуноферментные тест-системы. В родоспецифических тест-системах сенситином для твердой фазы, как правило, служит хламидийный родоспецифический антиген - липополисахарид [77]. Родоспецифические иммуноферментные тест-системы позволяют констатировать факт наличия или отсутствия противохламидийных антител в сыворотках больных. В то же время, учитывая возможность перекрестных реакций, связанных с присутствием в сыворотках больных специфических антител к различным видам хламидий, для определения этиологической обусловленности заболевания возникает необходимость видоспецифической дифференциации иммунного ответа [15, 87]. В силу этих причин для диагностики урогенитальной хламидийной инфекции целесообразно использовать не только родо-, но и видоспецифические тест-системы. При разработке последних в качестве сенситина твердой фазы обычно используют различные синтетические или рекомбинантные варианты видоспецифических хламидийных антигенов. Однако искусственно полученные видоспецифические антигены, по-видимому, не могут содержать в полной мере весь спектр видоспецифических антигенных детерминант хламидий [194, 215]. Данное обстоятельство, несомненно, неблагоприятно отражается на диагностической эффективности таких тест-систем. В связи с этим, исследования по созданию иммуноферментной тестсистемы на основе природного хламидийного видоспецифического антигена, полученного из нативных С. trachomatis, представляются актуальными и перспективными.

Цель настоящего исследования - конструирование и оценка видоспецифической иммуноферментной тест-системы для определения иммуноглобулинов класса G к С. trachomatis на основе природного видоспецифического антигена С. trachomatis.

Основные задачи исследования:

1. Разработать метод получения природного видоспецифического антигена из овокультуры С. trachomatis.

2. Изучить специфическую активность выделенного антигена и выяснить его химическую природу.

3. Сконструировать видоспецифическую иммуноферментную тест-систему на основе альтернативного варианта природного видоспецифического антигена С. trachomatis.

4. Изучить чувствительность, специфичность, диагностическую ценность иммуноферментной тест-системы, сконструированной на основе альтернативного варианта природного хламидийного видоспецифического антигена.

Научная новизна. Разработан способ получения природного видоспецифического антигена из овокультуры С. trachomatis с помощью обработки инактивированной очищенной овокультуры хламидий анионными детергентами и простым эфиром моносахарида. Показано, что приготовленный антиген С. trachomatis представлен основным белком наружной мембраны хламидий с молекулярной массой 39,5 кДа и двумя минорными фракциями с молекулярной массой 67-70 кДа, а также фосфолипидами -фосфатидилинозитом, фосфатидилэтаноламином и фосфатидилсерином. Установлено, что полученный по разработанному способу антиген С. trachomatis как сенситин в иммуноферментной тест-системе обладает выраженными сенсибилизирующей активностью и видоспецифическими свойствами. Впервые на основе полученного природного видоспецифического антигена С. trachomatis сконструирована иммуноферментная тест-система для выявления видоспецифических иммуноглобулинов класса G к С. trachomatis, характеризующаяся высокой специфичностью и чувствительностью.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о методологических подходах к изучению антигенной структуры С. trachomatis, выделению видоспецифических антигенов хламидий и использованию их для видоспецифической диагностики хламидийных инфекций. Сконструирована иммуноферментная тест-система «Хламивид®», являющаяся эффективным тестом для выявления видоспецифических иммуноглобулинов класса G к С. trachomatis в сыворотках больных. На иммуноферментную тест-систему «Хламивид®» разработана Нормативно-техническая документация, одобренная Научно-техническим советом ФГУП «Пермское НПО «Биомед». Материалы диссертации внедрены в практику ФГУП «Пермское НПО «Биомед» для оценки уровня хламидийных антител в нормальном донорском иммуноглобулине, а также в учебный процесс на кафедре микробиологии и факультете усовершенствования подготовки врачей Пермской медицинской академии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Метод обработки анионными детергентами и простым эфиром моносахарида инактивированной очищенной взвеси овокультуры С. trachomatis обеспечивает получение хламидийного антигена, обладающего высокой сенсибилизирующей и серологической активностью, а также выраженными видоспецифическими свойствами.

2. Приготовленный антиген С. trachomatis представлен доминирующей белковой фракцией основного белка наружной мембраны хламидий с молекулярной массой 39,5 кДа и двумя минорными белковыми фракциями с молекулярной массой 67-70 кДа, а также фосфолипидами -фосфатидилинозитом, фосфатидилэтаноламином и фосфатидилсерином.

3. Иммуноферментная тест-система «Хламивид®» для определения иммуноглобулинов класса G, созданная на основе полученного природного видоспецифического антигена С. trachomatis, характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции, посвященной 95-летию Уфимского НИИВС им. И.И. Мечникова ГУП «Иммунопрепарат», 2000; Пленарном заседании Пермского филиала Всероссийского общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, 2001; Международной научной конференции «Перспективы развития естественных наук в высшей школе», Пермь, 2001. Диссертация апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета ФГУП «Пермское НПО «Биомед».

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 131 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц и 7 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 221 литературный источник, из них 128 отечественных и 93 иностранных авторов.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Есаев, Артем Леонидович

выводы

1. Впервые из инактивированной и очищенной овокультуры С. trachomatis методом солюбилизации анионными детергентами и обработкой простым эфиром моносахарида получен природный видоспецифический антиген С. trachomatis.

2. Показано, что полученный антиген С. trachomatis обладает выраженной видоспецифической, серологической и сенсибилизирующей активностью.

3. В составе природного видоспецифического антигена С. trachomatis идентифицированы доминирующая фракция основного белка наружной мембраны хламидий с молекулярной массой 39,5 кДа и две минорные белковые фракции с молекулярной массой 67-70 кДа, а также фосфолипиды - фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилинозит.

4. Разработана технология приготовления иммуноферментной тест-системы «Хламивид®» на основе природного видоспецифического антигена С. trachomatis.

5. Установлено, что разработанная иммуноферментная тест-система «Хламивид®» на основе природного видоспецифического антигена С. trachomatis характеризуется высокой чувствительностью (100%) и специфичностью (95%) при оценке ее с использованием ОСО 42-28-31300 ГИСК им. JI.A. Тарасевича.

6. Экспериментально-клиническая оценка разработанной иммуноферментной тест-системы «Хламивид®» выявила ее высокую диагностическую значимость для диагностики хламидийных инфекций, обусловленных С. trachomatis, у различных категорий больных.

На иммуноферментную тест-систему «Хламивид®» разработана Нормативно-техническая документация, одобренная Научно-техническим советом ФГУП «Пермское НПО «Биомед», ИФТС успешно прошла клинические испытания в ГИСК им JI.A. Тарасевича, НТД находится в стадии согласования и утверждения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы значительное распространение в популяции людей получили урогенитальные хламидийные инфекции (УХ) [29]. Наибольший вред здоровью людей приносят урогенитальные инфекции вызываемые хламидиями, относящимися к виду Chlamydia trachomatis [29, 55, 88].

При поражении С. trachomatis страдают прежде всего система органов размножения, что значительно нарушает выполнение репродуктивной функции больным организмом. В настоящее время доказано, что УХ являются существенной причиной снижения уровня рождаемости в цивилизованных странах.

Успех в лечении хламидийной инфекции и в предупреждении осложнений возможен только при своевременной и адекватной диагностики этого заболевания. Решающее значение в выявлении урогенитальной хламидийной инфекции имеют методы лабораторной диагностики, так как указанные инфекции, как правило, не имеют четко выраженных симптомов [29, 88]. Спектр разработанных современных лабораторных методов диагностики хламидиозов достаточно широк [35, 69]. Однако до сих пор в мире не создан абсолютно надежный метод диагностики УХ [29]. Вследствие этого, лабораторная диагностика хламидийных инфекций должна носить комплексный характер [77, 78]. Определение противохламидийных антител в сыворотках больных является существенной составляющей диагностических мероприятий направленных на выявления урогенитальных хламидийных инфекций.

Среди методов серодиагностике хламидиозов широкое распространение получил метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Указанный метод является достаточно надежным и позволяет с высокой достоверностью выявлять противохламидийные антитела в сыворотках больных [77]. В настоящее время для диагностики УХ используются как родоспецифические, так и видоспецифические иммуноферментные тест-системы (ИФТС). С помощью родоспецифических ИФТС невозможно видоспецифически дифференцировать иммунный ответ больного. Однако необходимость этого возникает из-за возможного присутствия в сыворотках больных специфических антител к хламидиям не относящихся к виду С. trachomatis [77, 78]. В силу этих причин для диагностики УХ вызванных С. trachomatis необходимо использовать видоспецифические тест-системы. При разработке последних в качестве сенситина твердой фазы обычно используют различные синтетические или рекомбинантные варианты видоспецифических хламидийных антигенов. Однако, искусственно полученные видоспецифические антигены, по-видимому, не могут содержать в полной мере весь спектр видоспецифических антигенных детерминант хламидий. Данное обстоятельство, несомненно, может неблагоприятно сказаться на диагностической эффективности таких тест-систем. В связи с этим, исследования по созданию ИФТС на основе хламидийного видоспецифического антигена, полученного из нативных С. trachomatis, представляются актуальными и перспективными. Таким образом, целью настоящего исследования было экспериментальное обоснование и разработка видоспецифической иммуноферментной тест-системы для определения иммуноглобулинов класса G к С. trachomatis, на основе природного хламидийного антигена. Нами был произведен анализ данных научной литературы, посвященной вопросом строения хламидийной оболочки, как структуры, из которой возможно выделение видоспецифического антигена.

Имеющиеся данные литературы свидетельствовали, что из всех основных хламидийных поверхностных структур только молекула основного белка наружной мембраны (МОМР) ответственна за видоспецифичность С. trachomatis. Следовательно, задача нашей работы на начальном этапе сводилась к получению из овокультуры С. trachomatis хорошо очищенной водорастворимой фракции МОМР. В настоящее время широкое распространение получил метод выделения из суспензии хламидийных телец чистой фракции МОМР, разработанный в 1981 г в лаборатории H.D.

Caldwell. Согласно указанному методу, очищенные хламидийные тельца последовательно обрабатывают умеренным анионным детергентом - N-лаурилсаркозинатом натрия (SARC), а затем сильным анионным детергентом додецилсульфатом натрия (SDS), вследствие чего МОМР переводится в растворимое состояние и затем выделяется с использованием специальных приемов. Однако указанный метод является лабораторным и рассчитан на получение небольших количеств хламидийного МОМР для экспериментальных исследований. Вследствие этого, метод предполагает использования дорогостоящих лабораторных процедур, применение которых при получении видоспецифического антигена в производственных условиях экономически не оправдано, так как приводит к высокой стоимости получаемого продукта. Поэтому, вначале мы применили метод H.D. Caldwell, однако попытались его существенно упростить. Всего по указанному методу было получено 5 экспериментальных серий хламидийного антигена.

На следующем этапе работы мы приступили к сравнительному изучению свойств полученного антигена. Приготовленный нами по методу H.D. Caldwell антиген, обладал высокой сенсибилизирующей и серологической активностью, однако, значительно уступал по видоспецифической активности рекомбинантному видоспецифическому антигену С. trachomatis, что свидетельствовало о проблематичности применения его для конструирования видоспецифической ИФТС. Мы предположили, что относительно низкая видоспецифичность приготовленного антигена была обусловлена тем, что указанный антиген содержит, как видо-, так и родоспецифические антигенные детерминанты. Следовательно, следующий этап нашей работы был посвящен модифицированию метода H.D. Caldwell с целью повышения видоспецифичности получаемого антигена.

Анализируя сущность метода H.D. Caldwell, мы пришли к заключению, что при использовании этого метода очистка МОМР от других фрагментов хламидий происходит на стадии обработки SARC, так как указанный детергент солюбилизирует широкий спектр хламидийных белков, оставляя при этом МОМР в нерастворенном состоянии. Однако, при обработке SARC хламидий, выделенных из овокультуры, по-видимому, в нерастворенном состоянии остается и часть молекул с родоспецифическими антигенными детерминантами. Последующая обработка нерастворимого осадка додецилсульфатом натрия, приводит к тому, что эти молекулы вместе с МОМР переходят в водорастворимую фазу и «загрязняют» видоспецифический антиген, сообщая ему некоторую родоспецифическую активность.

С целью максимально очистить нерастворимую в SARC фракцию от молекул, содержащих родоспецифические антигенные детерминанты, мы подвергли ее дополнительной обработке простым эфиром моносахарида, а затем оставшуюся очищенную нерастворимую фракцию обработали SDS. Таким образом, использованная нами модификация метода H.D. Caldwell заключалась в том, что полуфабрикат после обработки SARC дополнительно обрабатывался простым эфиром моносахарида.

Всего по модифицированному методу H.D. Caldwell из овокультуры С. trachomatis было получено 7 экспериментальных серий антигена.

На следующем этапе работы мы приступили к детальному изучению свойств антигена, полученного по модифицированному методу H.D. Caldwell

Оказалось, что приготовленный нами по модифицированному методу H.D. Caldwell антиген превосходил другие природные хламидийные антигены по сенсибилизирующей активности, а также по серологической активности и, что самое важное, его видоспецифичность оказалась сопоставимой с видоспецифичностью рекомбинантного видоспецифического антигена. Это позволило нам считать указанный антиген - видоспецифическим антигеном С. trachomatis и этот препарат был выбран в качестве альтернативного варианта антигена-сенситина при конструировании ИФТС для определения видоспецифических антител класса G к С. trachomatis.

После того, был выбран альтернативный вариант антигена, мы приступили к исследованию его химического природы. В рамках этой работы был изучен его фосфолипидный, углеводный, аминокислотный и белковый состав.

Результаты изучения химической природы видоспецифического антигена, приготовленного по модифицированному методу H.D. Caldwell, показали, что доминирующим специфическим компонентом полученного антигена, является основной белок наружной мембраны С. trachomatis (39,5кДа). Кроме того, в составе полученного антигена были определены фосфолипиды: фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилиназит.

Данные по сравнительному изучению химического состава полученного нами видоспецифического антигена С. trachomatis и контрольного антигена выделенного из интактных желточных мешков куриных эмбрионов свидетельствовали о том, что разработанный метод позволял получать антиген, хорошо очищенный от компонентов среды культивирования.

Изучив химическую природу природного видоспецифического антигена и экспериментально убедившись в его высокой специфической активности, мы приступили к конструированию на его основе видоспецифической ИФТС. В состав комплекта ИФТС был включен традиционный набор компонентов: сорбент - планшет, сенсибилизированный природным видоспецифическим антигеном С. trachomatis', контрольные сыворотки -положительная и отрицательная; конъюгат - моноклональные антитела против IgG человека, меченые пероксидазой хрена; хромоген - ОФД; буферные растворы для разведения компонентов реакции и промывания планшета, останавливающий раствор.

Результаты параллельного исследования сывороток больных людей в разрабатываемой видоспецифической ИФТС, в родоспецифической хламидийной ИФТС «ХламИм-G» (производства ФГУП «Пермское НПО «Биомед») и в рекомбинантной ИФТС на основе видоспецифического рекомбинантного антигена С. trachomatis (производства АО «Биоагромед») показали, что специфичность разрабатываемой нами ИФТС достоверно близка к специфичности рекомбинантной ИФТС и достоверно отличается от специфичности родоспецифической тест-системы.

На следующем этапе работы специфичности и чувствительности разрабатываемой ИФТС были изучены относительно стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих видоспецифические антитела к С. trachomatis ОСО 42-28-313-00 (сер. 002). Оказалось, что при исследовании в разрабатываемой ИФТС 20-ти отрицательных сывороток стандартной панели только 15 были оценены как отрицательные, а 5 - как ложноположительные. В то же время все 16 положительных сывороток стандартной панели были оценены как положительные. Следовательно, на данном этапе относительно стандартной панели сывороток разрабатываемая нами ИФТС имела 100% чувствительность и только 75% специфичность.

Для того чтобы выявить причины низкой специфичности разрабатываемой ИФТС ложоположительные сыворотки стандартной панели были параллельно протестированы в разрабатываемой видоспецифической и родоспецифической ИФТС «ХламИм-G». Указанное тестирование показало, что среди отрицательных сывороток стандартной панели было выявлено 5 сывороток, содержащих противохламидийные антитела. Использование, разработанного нами индекса видоспецифичности, позволило установить, что у 4-х из этих сывороток выявленные антитела не являются видоспецифичными к С. trachomatis, а их положительная реакция в видоспецифической ИФТС, по-видимому, объясняется некоторыми конструктивными недоработками разрабатываемой ИФТС. Поэтому на следующем этапе исследований мы попытались усовершенствовать разрабатываемую ИФТС с целью предотвращения ложноположительных реакций, обусловленных наличием в исследуемых сыворотках антител к другим видам хламидий.

Для повышения специфичности ИФТС нами был разработан специальный блокирующий раствор, которым, при постановке ИФА исследуемые сыворотки разводили в 10 раз. Для того, что бы при исследовании разведенных сывороток не произошло уменьшение чувствительности ИФТС, была увеличена соответствующим образом рабочая доза конъюгата.

Для оценки эффективности усовершенствованного варианта постановки ИФА он был испытан с сыворотками стандартной панели ОСО 42-28-313-00 (сер. 002). Испытание показало, что при использовании указанного блокирующего раствора из отрицательных сывороток стандартной панели в разрабатываемой тест-системе положительно реагировала лишь сыворотка № 20, содержащая, как было нами определено, видоспецифические IgG к С. trachomatis. Таким образом, в усовершенствованном варианте постановки ИФА из 20-ти отрицательных сывороток стандартной панели 19 (95%) были оценены как отрицательные, а все 16 положительных сывороток (100%) -как положительные.

Убедившись в высокой чувствительности и специфичности конструируемой нами ИФТС, мы приступили к более детальной разработке оценки результатов ИФА с указанной тест-системой при изучении активности исследуемых сывороток.

Исходя из результатов параллельного исследования сывороток людей в разработанной ИФТС и в РНИФ, были разработаны критерии полуколичественной оценки активности исследуемых сывороток. Согласно которым исследуемые сыворотки по степени их специфической активности стало возможным подразделять на отрицательные, сомнительные, слабоположительные, положительные и резкоположительные.

После того как нам удалось повысить специфичность ИФТС и разработать применительно к ней критерии полуколичественной оценки специфической активности исследуемых сывороток, мы приступили к испытанию усовершенствованного варианта тест-системы при титровании сывороток, полученных от различных групп здоровых и больных людей.

Для испытания усовершенствованного варианта разрабатываемой ИФТС были подобраны четыре группы сывороток людей. Первая группа в количестве 128 образцов была получена от доноров крови, вторая в количестве 135 образцов - от клиентов венерологических отделений, страдающих различными заболеваниями урогенитальной сферы. У женщин указанной группы наиболее часто отмечались вагинит, цистит, кольпит, сальпингит, аднексит, эндометрит; у мужчин - уретрит, простатит, эпидидимит. Из состава второй группы для отдельного изучения было выделено 30 сывороток от мужчин страдающих неспецифическим уретритом. Отдельную группу (четвертую) составили 35 сывороток от больных с различными поражениями суставов (реактивный артрит, синдром Рейтера, болезнь Бехтерева, подагра).

Испытание показало, что среди доноров крови специфические IgG к С. trachomatis выявлялись в 49 % случаев, что превышает средний показатель распространения антител к С. trachomatis среди практически здорового населения России (5 - 18,6 %) [29, 113]. По-видимому, указанное обстоятельство объясняется тем, что среди доноров крови в настоящее время велика доля социально неблагополучные лиц, многие из которых являются реконвалесцентами заболеваний, передающихся половым путем.

У лиц с заболеваниями суставов противохламидийные антитела обнаруживались в 44% случаев, что соответствует данным литературы о наличии хламидийной инфекции примерно у половины больных реактивным артритом и синдромом Рейтера [1,35].

Среди клиентов венерологических отделений антитела к С. trachomatis выявлялись в 63% случаев, что также соответствует данным литературы [82].

Среди мужчин, страдающих неспецифическим уретритом, антитела к С. trachomatis выявлялись наиболее часто - в 79% случаев. Аналогичные данные приводят другие исследователи, определяющие антитела к С. trachomatis у 40 - 80% мужчин с неспецифическим уретритом [29, 35].

Обращает на себя внимание, что, как и следовало ожидать, доля отрицательных и сомнительных результатов ИФА наиболее велика в группах доноров (57%) и больных с поражениями суставов (62%), тогда как у больных с урогенитальной патологией значительней чаще, чем у больных первых двух групп, отмечаются положительные и резкоположительные результаты ИФА (в частности у больных неспецифическим уретритом в 69% случаев).

Таким образом, результаты испытания разработанной ИФТС на разнообразном клиническом материале показали, что полученные нами данные совпадают с данными литературы и, следовательно, указанная тест-система обеспечивает достоверное выявление специфических IgG к С. trachomatis в сыворотках людей.

110

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Есаев, Артем Леонидович, 2003 год

1. Агабабова Э.Р., Сидельникова С. М., Шубин С.В. Урогенитальная инфекция при болезни Рейтера, ревматойдном артрите и болезни Бехтерева//Тер арт. 1980. №12. - С. 94-98.

2. Анкирская А.С. Проблемы хронической (персистирующей) хламидийной инфекции // Акуш. и гин.-1999. №3.-С. 8-10.

3. Анри-Сюше Ж. Хламидиозы в гинекологии // Актуальные микробиологические и клинические проблемы хламидийных инфекций: Сб. науч. тр. / НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР / Под ред. А.А. Шаткина, Ж. Орфилы. М.: НИИЭМ, 1990. - С 46-51.

4. Антигены хламидий (пситтаци и трахоматис) сухие для РНИФ // Экспериментально-производственный регламент №407-92, срок действия до 1.12.95./М.: ГИСК им. Л.А. Тарасевича .-1991.

5. Антоньев А.А., Баткаев Э.А., Масюкова Е.А., Боровик В.З., Антоньева Н.А. Сидоров А.В. К вопросу о диагностике и лечении урогенитального хламидиоза // Диагностика, терапия и профилактика ЗППП: Сб. науч. тр.- Свердловск, 1988. С. 120-128.

6. Аракелова О.Н., Данилов А.Ю., Панкратова В.Н. Хламидийные инфекции у женщин при бесплодии воспалительного генеза // Акуш. и гин.-1989. №10. С. 62-63.

7. Ахрем А.А., Кузнецова А.И. Тонкослойная хроматография. М.: Наука, 1964. - 175 с.

8. Ю.Ашмарин И.П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях.- JL: Медгиз, 1962.- 180 с.

9. П.Бартенева Н.С. Вопросы иммунитета при хламидийных инфекциях // Хламидийные инфекции: Сб. науч. тр. / Под ред. А.А. Шаткина. М., 1986. - С. 14-20.

10. Батыршина С.В., Щербинов А.Е. Бесплодие женщин и хламидийная инфекция // Актуальные вопросы диагностики и лечения хламидийных инфекций. Тез. докл. Всесоюзн. совещ. М.: НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР, 1990.-С. 13.

11. Бойцов А.Г., Ластовка О.Н., Порин А.А. Вопросы качества при лабораторной диагностике урогенитальных инфекций // Клин. лаб. диагн.-2001. №2.- С. 36-38.

12. Бойцов А.Г., Порин А.А., Ластовка О.Н., Рищук С.В., Шилова Е.А., Белоусова JI.E. Оценка эффективности серодиагностики хламидийных инфекций с помощью иммуноферментного анализа // Вестн. дерматол.-2002. №1.- С. 43-45.

13. Бортничук В.А. Хламидиоз свиней,- Киев: Урожай, 1991. 123 с.

14. Брагина Е.Е., Дмитриев Г. А., Кисина В.И. Структурно -функциональные особенности жизненного цикла хламидий // Вестн. дерматол.-1995. №6.- С. 18-20.

15. Брагина Е.Е., Орлова О.Е., Дмитриев Г.А. Некоторые особенности жизненного цикла хламидий. Атипичные формы существования (обзор литературы) // ЗППП -1998. №1.- С. 3-9.

16. Васильева М.М. Диагностика и лечение урогенитальных хламидийных инфекций // Росс. мед. журн. 2000. №8. - С. 25-31.

17. Гапарян М.О., Штыкунова Е.В. Актуальность проблемы хламидийной инфекции // Росс. мед. журн. 2000. №4. - С. 48-50.

18. Гасанова Т.А. Лабораторная диагностика инфекций передающихся половым путем, при хронических воспалительных заболеваниях репродуктивной системы. // Журн. микробиол. 2000. №2. - С.60-65.

19. Гасанова Т.А. Хламидийная инфекция и репродуктивная функция // Вестн. дерматол. 2001. №1. - СЛ1-18.

20. Гастон Дж. С.Х. Иммунологические аспекты реактивных артритов, вызванных хламидиями. // ИППП. 2001. №5. - С. 4-9.

21. Герасимова Н.М., Кунгуров Н.В., Бажин Ю.А. Новая классификация хламидий и ее значение для практики // ИППП. 2001. №1. - С. 14-17.

22. Глазкова Л.К., Акилов О.Е. Практические аспекты персистентной хламидийной инфекции// www.rusmedsery.com 1999.

23. Глазкова Л.К., Башмакова Н.В., Моторнюк Ю.И., Ремизова И.И. Особенности течения хламидийной инфекции у беременных. Совершенствование диагностики и лечения // ИППП. 2002. №2. - С. 15-20.

24. Глазкова Л.К., Герасимова Н.М. Клинико-иммунологические критерии развития нарушений репродуктивной функции у женщин с генитальной хламидийной инфекцией // 3111111.- 1997. №2. С. 18-20.

25. Глазкова Л.К., Герасимова Н.М. Урогенитальная хламидийная инфекция. В кн.: Кожный зуд. Акне. Урогенитальная хламидийная инфекция. Ст-Петербург: Сотис, 1998.- С.111-147.

26. Гольдин Р.В., Нуралова И.В. Перспективы совершенствования лабораторной диагностики хламидийных инфекций // Актуальные вопросы диагностики и лечения хламидийных инфекций. Тез. докл.

27. Всесоюзн. совещ. М.: НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР, 1990. -С. 42-43.

28. Гомберг М.А., Соловьев A.M., Некрасов А.В., Иванова А.С. Иммунотерапия при хроническом персистирующем урогенитальном хламидиозе// ЗППП.- 1997. №4.- С. 34-36.

29. Горовиц Э.С. Хламидиозы человека и животных (проблемы серологической диагностики): Автореф. дисс. .доктора мед. наук. -М., 1986.-30 с.

30. Гранитов В. М. Хламидиозы. М.: Медицинская книга, 2000. - 190.

31. Горовиц Э.С. Опыт серологической диагностики хламидиозов // Актуальные микробиологические и клинические проблемы хламидийных инфекций: Сб. науч. тр. / НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР / Под ред. А.А. Шаткина, Ж. Орфилы. М.: НИИЭМ, 1990. - С. 15.

32. Горовиц Э.С., Тимашева О.А. Использование реакции непрямой гемагглютинация для изучения орнитозной инфекции // Журн. микробиол. и эпидемиол. 1978. №2. - С. 68 -71.

33. Громыко Л.Г., Терских И.И. Применение иммуноферментного метода (ELISA) при хламидийных инфекциях // Вопр. вирусол. 1981. №2. - С. 245-248.

34. Делекторский В.В. и др. Роль хламидий в патологии урогенитального тракта//Вести. дерматол.-1984.№4. С. 28-35.

35. Делекторский В.В., Руковишникова В.М., Яшкова Г.Н., Хабаров В.А. Роль хламидий в патологии урогенитального тракта. // Вестн. дерматол.- 1984. №4.- С.28-35.

36. Дмитриев Г.А. Урогенитальная хламидийная инфекция. Подходы к диагностике и терапии. // И111111. 2002. №2. - С. 21-24.

37. Домейка М.А., Абрамова JI.H., Мальцева Н.Н., Терских И.И. Использование иммуноферментного метода для исследования антихламидийных сывороток // Вопр. вирусол .-1985.-№4.-С.474-477.

38. Евсюкова И.И. Хламидийная инфекция у новорожденных // Педиатрия.- 1997. №3.- С. 77-80.

39. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Медицина, 1991. - 286 с.

40. Егоров A.M., Сазыкин Ю.О. Хламидии. Молекулярная организация клетки и некоторые особенности патогенеза инфекции // Антибиотики и химиотерапия.-2000. №4. С. 45.

41. Иванова В.М., Калинина В.Н., Нешумова JI.A., Решетникова И.О. Математическая статистика. М.: Высш. школа, 1981.-371 с.

42. Иванова B.C., Сигунова Н.Н., Сухова А.П., Машеро В.В., Щербаков ВМ. Об опыте использования современных методов диагностики урогенитального хламидиоза // Вести дерматол. венерол. 1998. №5. -С. 62-63.

43. Иванова Р.Д., Савичева A.M., Устикина Т.И., Панкратова В.Н. Генитальный хламидиоз и бесплодие // Актуальные вопросы диагностики и лечения хламидийных инфекций. Тез. докл. Всесоюзн. совещ. М.: НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР, 1990. - С. 10-12.

44. Ильин И.И. Значение хламидийных инфекций в урогенитальной патологии. // Вестн. дерматол. 1977. №3. - С. 43-48.

45. Ильин И.И. Хламидии и урогенитальные хламидиозы. // Воен.-мед. журн.- 1986. №4. -С. 27-31.

46. Казанцев А. П. Орнитоз. Ленинград, 1973. - 216 с.

47. Казаренко Т.Д., Зуев С.Н., Мулер Н.Ф. Ионообменная хроматография аминокислот. Новосибирск: Наука, 1981. - 230 с.

48. Каталог штаммов. М.: ГИСК им. Л.А.Тарасевича МЗ СССР, 1962. -вып. 4.- 164 с.

49. Кирющенков А.П. О роли хламидий в заболеваниях мочеполовых органов // Фельдшер и акушерка. 1987. №2. - С. 47-48.

50. Киселев В.И., Латыпова М.Ф., Дмитриев Г.А., Бакалова Л.А., Бурцев О.А., Абудуев Н.К. Полимеразная цепная реакция в качестве критерия излеченности урогенитального хламидиоза. // Вестн. дерматол. 2001. №4. - С. 4-6.

51. Ковалев Ю.Н. Хламидийные инфекции мочеполовых органов при болезни Рейтера. // Вестн. дерматол. 1982. №12. - С. 38-41.

52. Козлова В.И., Пухнер А.Ф. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания М., 1995. - 224 с.

53. Колкова Н.И., Мартынова В.Р. К вопросам диагностики хламидийных инфекций // Клин. лаб. диагн.-1998. №2. С. 20-21.

54. Королюк A.M., Нуралова И.В., Медведев М.Л. Хламидийные инфекции // Воен.-мед. журн.-1993. №3. С. 32-36.

55. Кутовая В.В., Пустовойтова Л.М., Гончаренко В.В. К вопросу о диагностическом выделении хламидий при негонококковых воспалительных заболеваниях мочеполовых органов // Дерматология и венерология. Респ. Междувед. сб, 1987.-вып.22. С. 81-84.

56. Лабораторная диагностика хламидиозов: Метод, реком. М.: МЗ РФ, 1991.-43 с.

57. Лисеева З.А., Панкратова В.Н., Потапова Т.М., Баскаков В.В. Роль хламидийной инфекции в генезе бесплодия // Акуш. и гин. -1989. №7. С. 59-60.

58. Мавров Г.И. Диагностика урогенитальных хламидиозов с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (определение антител к хламидиям в сыворотке крови) // Дерматология и венерология: Респ. Междувед. сб., 1987. вып. 22. - С. 3-77.

59. Мавров И.И. Роль хламидий при воспалительных заболеваниях мочеполовых органов у женщин // Акуш. и гин. 1989. №7.- С. 59-60.

60. Манзенюк И.Н., Воробьева М.С. Chlamidya trachomatis Современные представления о возбудителе. Серодиагностика // www.mbu.ru. 2000.

61. Манзенюк И.Н., Воробьева М.С., Никитюк Н.М., Федосов С.А., Горбунов М.А., Гнедой С.Н., Лосев В.И., Кривенчук Н.А.

62. Серодиагностика хламидиозов. "Хлами-^О-ДС-Тг" — первая отечественная иммуноферментная рекомбинантная тест-система для выявления антител класса G к Chlamydia trachomatis II www.mbu.ru. 2000.

63. Манзенюк И.Н., Воробьева М.С., Хайдукова И.Л., Малахов В.Н., Федосов С.А., Лосев М.В. Стандартизация результатов иммуноферментного анализа в серодиагностике хламидийных инфекций // www.mbu.ru. 2000.

64. Манухин И.Б., Минкина Г.Н., Коптелова Н.В., Болотовский А.В. Хламидийная инфекция у больных с заболеваниями шейки матки // Акуш. и гинекол. 1991. №6. - С. 53-54.

65. Мартынова В.Р., Колкова Н.И., Шаткин А.А. Хламидии и хламидиозы: клиника, биология, диагностика // Росс. мед. вестн. 1997. №3. - С. 4955.

66. Мартынова В.Р., Машкиллейсон А.Л., Гомберг М.А., Еременко С.Н. Урогенитальная хламидийная инфекция. Диагностика и лечение. (Руководство для врачей). М.: НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН, 1996. -34 с.

67. Машкиллейсон, Гомберг М.А., Соловьев A.M. К проблеме урогенитального хламидиоза. 31111П. 1995. №5. - С. 28-33.

68. Медведев Б.И., Астахова Т.В. Диагностика хламидийной инфекции у женщин с трубно-перитонеальной и трубно-эндокринной формами бесплодия // Пути развития современной гинекологии. Тез докл. Всеросс. научн. конф. М., 1995. - С. 71.

69. Милтиньш А.П., Раджюс В.Д. Смешанные хламидийные инфекции урогениталий. // Вестн. дерматол. 1985. №7. - С. 18-20.

70. Митрофанов П.М. Клиника и патогенез хламидиоза II Ветеринария. -1980. №6.-С. 37-39.

71. Поздняк A.JL, Шестаев А.Ю., Нуралова Н.В., Михайлов Н.В., Сидорчук С.Н., Мудрицкий В.М., Яковлев А.О. Особенности лабораторной диагностики хламидиозов с системными проявлениями // Клин. лаб. диагн. 2002. №6. - С. 42-45.

72. Попов B.JL, Бескина С.П., Шаткин А.А. Авакян А.А. Ультраструктура начальных этапов взаимодействия гальпровий (хламидий) с клеткой-хозяином // Журн. микробиол. 1980. №8. - С. 28-33.

73. Попов B.JL, Кириллова Ф.М., Орлова О.Е. Строение поверхности элементарных телец хламидий // ЖМЭИ. 1984. №5. - С. 30-33.

74. Прохоренков В.И., Шапран М.В. О классификации урогенитального хламидиоза. // ИППП. 2002. №2. - С.З-б.

75. Ремезов А. П., Неверов В.А., Семенов Н.В. Хламидийные инфекции (клиника, диагностика, лечение). СПб., 1995. 43 с.

76. Рычнев В.Е., Пегусов С.М. Сравнительная иммунологическая характеристика различных клинических вариантов орнитоза // Хламидийные инфекции: Сб. науч. тр. / Под ред. А.А. Шаткина. М., 1986. - С. 96-99.

77. Савичева А. М., Пекер В.Е. Генитальный хламидиоз у беременных исходы беременности для матери и плода // Актуальные вопросы диагностики и лечения хламидийных инфекций. Тез. докл. Всесоюзн. совещ. М.: НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР, 1990. - С. 14-16.

78. Савичева A.M. Роль хламидийных инфекций в акушерской патологии // Акуш. и гин. 1985. №6. - С. 44-47.

79. Савичева A.M. Хламидии как возбудители генитальных и неонатальных инфекций // Акуш. и гин. 1982. №5. - С. 6-9.

80. ЮО.Савичева A.M., Милорадович В.М., Пекер В.Е., Башмакова М.А. Клиника, диагностика и лечение урогенитального хламидиоза // Акуш. и гин. 1989. №7.-С. 74-79.

81. Сидорович С.Ю., Латыпова М.Ф., Коликова Т.Г., Вахнина Т.Е., Киселев В.И. Сравнительный анализ методов лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза // Вестн дерматол. 2001. №1. - С. 9-10.

82. Скрипкин Ю.К., Кубанова А.А., Дмитриев Г.А. Киселев В.И., Вахнина Т.Е., Коликова Т.Г. Современные подходы к диагностике хламидиоза // Вестник дерматологии и венерологии. 1996. №4.-С.26-29.

83. Таха Т.В., Матушевская Е.В., Яцуха М.В., Нажмутдинова Д.К. Социально-поведенческие факторы, влияющие на распространение урогенитального хламидиоза и других инфекций, передаваемых половым путем, среди подростков. // Вестн. дерматол.-2002. №4.-С. 3742.

84. Терских И.И. Орнитоз и другие хламидийные инфекции. М.: Медицина, 1979.-229 с.

85. Ю7.Тимашева О. А., Горовиц Э.С., Петров В.Ф., Крошкина Н.И. Использование серологических тестов для диагностики хламидийных инфекций // Здоровье населения и среда обитания: Сб. науч. тр., 1996. №3. С. 10-13.

86. Тищенко М.С. Хламидийные инфекции: Рекомендации для врачей-Санкт-Петербург, 1998. 48с.

87. Фохридина Л.И., Чучупалов П.Д., Евдокимова Н.С. Диагностика и клинические проявления урогенитальных хламидийных инфекций у женщин // Здравоохранение Казахстана.- 1988. №9. С. 37-38.

88. ПО.Хазипов Н.З., Равилов А.З. Хламидиозы сельскохозяйственных животных. -М.: Колос, 1984. С.31-32.

89. Ш.Хамадеев Р.Х., Равилов А.З. Возбудитель хламидиозов сельскохозяйственных животных и патогенность их для человека // Журн. микробиол.-1997. №1. С. 99-101.

90. Хламидийные инфекции. 4-ый Европейский конгресс по хламидиям Европейского общества по изучению хламидий, 2000 // И111111. 2001. №2. - С. 32-36.

91. ПЗ.Хрянин А.А., Решетников О.В., Кривенчук Н.А. Эпидемиология хламидийной инфекции (Chlamydia trachomatis) в крупном промышленном центре Западной Сибири // ВДВ. 2001. №1. С. 8-10.

92. Шаткин А.А., Бескина С.Р., Мартынова В.Р. Усовершенствование метода культивирования гальпровий (хламидий) в культуре клеток // Журн. микробиол. и эпидемиол. 1981. №1. - С. 24-28.

93. Шаткин А.А., Мавров И.И. Урогенитальные хламидиозы. Киев: Здоровье, 1983.-200 с.

94. Пб.Шаткин А.А., Орлова О.Е., Попов B.JI. Персиетентная хламидийная инфекция в культуре клеток // Вестн. АМНСССР. 1985. №3. - С. 51-55.

95. Шаткин А.А., Орфила Ж., Панкратова В.Н. Серологические показатели хламидийных инфекций при бесплодии у женщин // Акуш. и гин.-1990. №2. С. 69-71.

96. Шаткин А.А., Церетели Э.К., Панкратова В.Н., Апробация прямого метода иммунофлуоресценции для диагностики трахомы, паратрахомы и других этиологически родственных инфекций // Здравоохр. Туркменистан. 1974. №8. - С. 37-42.

97. Шинский Г.Э. О путях усовершенствования профилактики урогенитально хламидиоза // Вестн. дерматол. 2002. №5. - С. 28-33.

98. Шинский Г.Э., Мерзляков В.А., Тимофеева С.Б. Эпидемиологические аспекты хламидийной инфекции // Вестн. дерматол.-1999. №1. С. 1113.

99. Штыхалюк В.Б. К вопросу об обнаружению хламидийных инфекций у больных с воспалительными заболеваниями мочеполовых органов // Патогенез, лечение и профилактика важнейших дерматозов и венерических заболеваний: Сб. научн. тр. Харьков, 1983. - С. 50-53.

100. Шубин С.В. Болезнь Рейтера и хламидийная инфекция: Обзор // Ревматология. 1983. №3. - С. 35-40.

101. Шуршунова М., Шварц В., Михалец Ч. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. М.: Мир, 1980. - 622 с.

102. Эдельштейн И.А. Фундаментальные изменения в классификации хламидий и родственных им микроорганизмов порядка Chlamydiales II

103. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 1999. -Т.1. №1. - С. 5-11.

104. Эйделынтейн И. А. Болезни и возбудители. // КМАХ. 1999. - №1. - С.

105. Allen J.E., Cerrone М.С., Beatty P.R., Stephens R. S. Cysteine-rich outer membrane proteins of Chlamydia trachomatis display compensatory sequence changes between biovariants // Mol. Microbiol. 1990. - Vol. 4. -P. 1543-1550.

106. Amann R. et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp II Appl. Environ. Microbiol. 1997. - Vol.63. - P. 115-121.

107. Balin B.J. et al. Identification and localization of Chlamydiae pneumoniae in the Alzheimer-s brain // Med. Microbiol. Immunol. 1998. - Vol. 187. - P. 23 -42.

108. Batteiger В. E., Newhall W. J., Terho P. Antigenic analysis of the major outer membrain protein of Chlamydia trachomatis with murine monoclonal antibodies // Infect Immun. 1986. - Vol. 53. - P. 530-533.

109. Batteiger B.E.et al. The major outermembrane protein of a singl Chlamydia trachomatis serovar can possess more than one serovar specific epitope // Infect.Immun. 1996. - Vol.64. - P.542-547.

110. Bavoil P.A., Schachter J. Role of disulfide bonding in outer membrane structure and permeability in Chlamydia trachomatis II Infect. Immun. -1984.-Vol. 44.-P. 479-485.

111. Beaher W. Zhang Y.Z., Joseph T. Mapping antigenic domains expressed by Chlamydia trachomatis major outer membrane protein genes // Proceedings of the National Academy of Science of the USA. 1988. - Vol. 85. - P. 40004004.

112. Birtles RJ.et al. Chlamydia like obligate parasite of free living amoebae // Lancet. 1997. - Vol. 349. - P. 925-926.

113. Bowie W.R., Treatment of chlamydial infection: Chlamidial infection. Proceedings of the Eighth International Symposium of Human chlamydial infections. Paris, 1994. - P. 621-630.

114. Brade H. Endotoxin in Health and Disease // Marcel Dekker, Inc. New York, 1999.-P. 452-456.

115. Brade L., Schramek S. Chemical, biological, and immunochemical properties of the Chlamydia psittaci lipopolysaccharide I I Infect Immun.-1986. Vol. 54. - P. 568-574.

116. Brunham R.C., Peeling R. W. Chlamydia trachomatis antigens: role in immunity and pathogenesis // Infect. Agents. Dis. 1994. - Vol. 3. - P. 218233.

117. Caldwell H. D., Judd C. R. Structural Analysis of Chlamydial Major Outer Membrane Proteins // Infection and Immunity. 1982. - Vol. 38. - P. 960968.

118. Caldwell H. D., Schachter J. Antigenic Analysis of the Major Outer Membrrane Protein of Chlamydia spp II Infection and Immunity. 1982. -Vol. 35.-P. 1024-1031.

119. Caldwell H.D., Kromhaut J., Schachter J. Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis II Infection and Immunity. 1981. - Vol. 44. - P. 111-116.

120. Caldwell H.D., Pery L.,J. Neutralization of Chlamydia trachomatis infectivity with antibodies to the major outer membrane protein // Infect. Immun. 1982. - Vol. 38. - P. 745-754.

121. Carter M.W., al-Machdawi S. A. H., Giles I. G. Nucleotid sequeince and taxonomic value of the major outer membrane protein gene of Chlamidya pneumoniae IOL -207 // Journal of General Microbiology. 1991. - Vol. 137.-P. 465-475.

122. Chopra I., Storey C. Antibiotics, peptidoglycan synthesis and genomics: the chlamydial anomaly revisted // Microbiology. 1988. - Vol. 144. - P. 26732678.

123. De Sa, Souriau C. A., Bernard F. An oligomer of the major outer membrane protein of Chlamydia psittaci is recognized by monoclonal antibodies which protect mice from abortion // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 49124916.

124. Dittmer J., Lester R. A simple specific spray for the detection of phospholipids on thin-layer cromatographs // J. of Lipid Research. 1964. -Vol. 5. -N. l.-P. 116-122.

125. Ellis R.W. Infection and coronary heart disease // J. Med. Microbiol. 1997. -Vol.46.-P. 535 -539.

126. Everett K. D., Hatch T. P. Architecture of the cell envelope of Chlamydia psittaci 6BC //Journal of Bacteriology. 1995. - Vol. 177. - P. 877-882.

127. Everett K.D.E, Hatch T.P. Sequence analysis and lipid modification of the cysteine-rich envelope proteins of Chlamydia psittaci 6BC // Journal of Bacteriology. 1991. - Vol. 173. - P. 3821-3830.

128. Everett K.D.E. et al. Rapid detection of the Chlamydiaceae and other families in the order Chlamydiales: three PCR tests // J. Clin. Microbiol. -1999.-Vol. 37.-P. 575-580.

129. Everett K.D.E. et al. The ribosomal intergenic spacer and domain I of the 23 S rRNA gene are phylogenetic markers for Chlamydia spp II Int. J. Syst. Bacterial. 1997. - Vol. 47. - P. 461-473.

130. Flip C.G., Fletcher J.L. Solubilization of the cytoplasmic membrane of Escherichia coli by the ionic detergent sodium lauril sarcosinat // J. Bacteriol. 1973. - Vol. 115. - P. 717-722.

131. Fox J.G. et al. Antigenic specificity and morphologic characteristics of Chlamydia trachomatis, strain SFPD, isolated from hamsters with proliferative ileitis // Lab. Anim. Sci. 1993. - Vol.43. - P. 405-410.

132. Guysen J.M., Goffin C. Lack of cell wall peptidoglycan versus penicillin sensitivity: new insights into the chlamydial anomaly // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol. 43. - P. 2339-2344.

133. Hackstadt T. W., Todd J., Caldwell H. D. Disulfide-mediated interaction of the chlamydial major outer membrane protein: role in the differentiation of chlamydiae //J. Bacteriol. 1985. - Vol. 161. - P. 25-31.

134. Halme S., Syrjala H., Bloigu A., et al. Lymphocyte answers in Chlamydia antigens in patients whits vena heart diseases // Eur. Heart J. 1997. - Vol.7. -P. 1095-1101.

135. Hatch Т. Developmental biology. Chlamydia: intracellular biology, pathogenesis and immunity. ASM Press Washington, 1999. - P. 29-68.

136. Hatch T. P., Vance D. W. Jr. Identification of a major envelope protein in Chlamydia spp II J. Bacteriol. 1981. - Vol.146. - P. 426-431.

137. Hatch T.P., Miceli M., Sublett J.E. Synthesis of disulfide-bonded outer membrane proteins during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis and Chlamydia psittaci И J. Bacteriol. 1986. - Vol. 165. - P. 379-385.

138. Hayman K. A., Ashley R. H. Structual features of a multisubstate cardiac mitoplasm anion channelineferences from singel-channel recording // J. Membran. Biol. 1993. - Vol.136. - P. 191-197.

139. Herring A.J.et al. Restriction endonuclease analysis of DNA from two isolates of Chlamydia psittaci obtained from human abortions // Brit. Med. J. 1987.-Vol. 295.-P. 1239.

140. Johansson M., Schon K., Ward M. Front line: Studies in knockout mice revel that anti-chlamydial protection requires TH1 cells producing IFN-gamma: is this true for humans?//Scandinavian Journal of Immunology. 1997. - Vol. 46.-P. 546-552.

141. Jorgensen D.M. Gestational psittacosis in a Montana sheep rancher // Emerg. Infect. Dis.-1997.-Vol. 3. P. 191-194.

142. Kahane S. et al. Description and partial characterization of a new chlamydia like microorganism // FEMS Microbiol. Lett. 1993. - Vol. 109. - P. 329334.

143. Karvonen H., Tuomilehto J., Pitkaniemi I. et al. The meaning of smouking for C. pneumonia seropositiviti // Int. J. Epidemial. 1994. Vol. 12. - P. 1315-1321.

144. Kates M. Techniques of lipidology. Isolation, analysis and identification of lipids. London/New York, 1972.

145. Knight S. C., Iqball S., Woods C. A peptide of Chlamydia trachomatis shown to be primary T-cell epitope in vitro induces cell-mediated immunity in vivo// Immunology. 1995. - Vol. 85. - P. 1334-1340.

146. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

147. Leinonen M. et al., Pathogenetic mechanisms and epidemiology of C. pneumonia // Eur. Heart J. 1993. - Vol. 12. - P. 57-61.

148. Lowry O.H., et al. Protein measurement with the Foin-phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.

149. Maclean I. W., Peeling R. W., Brunham R. C. Characterization of Chlamydia trachomatis antigens with monoclonal and polyclonal antibodies // Can. J. Microbiol 1988. - Vol. 34. - P. 141-147.

150. Mondesire R. R., Maclean I. W., Shewen P. E., Winston S. E. Identification of genus-specific epitopes on the outer membrane complexes of Chlamydia trachomatis and Chlamydia psittaci immunotypes 1 and 2 // Infect. Immun. -1989.-Vol. 57.-P. 2914-2918.

151. Moulder J.W. et al. Genus Chlamydia II Bergey-s Manual of Systematic Bacteriology. 1984. - Vol.1. - P. 729-739.

152. Mulder J.M. Why is Chlamydia sensitive to penicillin in the absence of peptidoglican? // Infect. Agents Dis. 1993. - Vol. 2. - P. 87-99.

153. Mygind P., Christiansen G., Birkelund S. Topological analysis of Chlamydia trachomatis L2 outer membrane protein 2 // Journal of Bacteriology 1998. -Vol. 180.-P. 5784-5787.

154. Mygind P., Christiansen G., Persson K., Birkelund S. Analysis of the humoral immune response to Chlamydia outer membrane protein 2 // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998. Vol. 5. - P 313-318.

155. Nano F. E., Caldwel H.D. Expression of the chlamydial genus-specific lipopolysaccharide epitope in Escherichia coli II Science 1985. - Vol. 228.-P. 742-744.

156. Newhall W. J. Biosynthesis and disulfide cross-linking of the outer membrane components during the grow of Chlamydia trachomatis II Infect. Immun.-1987. Vol. 55. P. 162-168.

157. Newhall W.J., Jones R. B. Disulfide-linked oligomers of the major outer membrane protein of chlamydiae // J. Bacteriol. 1983. - Vol. 154. - P. 9981001.

158. Nigg C. Unidentified virus which produces pneumonia and systemic infection in mice // Science. 1942. - Vol.95. - P. 49-50.

159. Nikaido H. Porins and specific channels of bacterial outer membranes // Mol. Microbiol 1992. - Vol. 6. - P. 435-442.

160. Nurminen M., Rietschel E.T., Brade H. // Infect. Immun. 1985. -Vol. 48. -P. 573-575.

161. Pal S., Theodor I., Peterson E. M., L.M. De La Maza. Immunization with an acellular vaccine consisting of the outer membrane complex of Chlamydia trachomatis induce protection against a genital challenge // Infect. Immun. -1997.-Vol. 65.-P. 3361-3369.

162. Pickett M. A., Ward M. E. Complete nucleotide sequence of the major outer membrane protein gene from Chlamydia trachomatis serovar LI // FEMS Microbiology Letters. 1987. - Vol. 42. - P. 185-190.

163. Pickett M. A., Ward M.E., Clarke I.N. High-level expression and epitope localization of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis serovar LI // Molecular Microbiology. 1988. - Vol. 2. - P. 681-685.

164. Rund S., Lindner B. Structural analysis of the lipopolysaccharide from Chlamydia trachomatis serotype L2 // J.Biol.Chem 1999. - Vol. 274. -P.16819-16824.

165. Salari S.H. Ward M.E. Polypeptide composition of Chlamydia trachomatis serovar L2// Journal of General Microbiology 1981. - Vol. 123. - P. 197205.

166. Sardinia L.M., Segal E., Ganem D. Developmental regulation of the cysteine-rich outer-membrane proteins of murine Chlamydia trachomatis II Journal of General Microbiology. 1988. - Vol.134. - P. 997-1004.

167. Schachter J. et al. Human infection with the agent of feline pneumonitis // Lancet. 1969. - Vol. 1. - P. 1063-1065.

168. Schiller I.et al. Polymerase chain reaction (PCR) detection of porcine Chlamydia trachomatis and ruminant Chlamydia psittaci serovar 1 DNA in formalin fixed intestinal specimens from swine // J. Vet. Med. Ser. B. 1997. -Vol. 44.-P. 185-191.

169. Sessa R., Latino M.A., Magliano E.M. et al Epidemiology of urogenital infections caused by Chlamydia trachomatis and outline of characteristic features of patient at risk // J. Med. Microbiol. 1994. - Vol. 41. - P. 168-172.

170. Sinner M. Non-corrosive dey reagent for detection of reducing sugar in borate complex ion-exchange chromatography // J.of Chromatogr. 1978. -P. 197-204.

171. Spackman D.H., Stein W.N., Moor S. // Europ. J. Biochem., 1982. - Vol. 124. - P 585-587.

172. Stagg A. J., Elsley W. A., Pickett M. A. Primary human T-cell respons to the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis // Immunology. -1993. -Vol.-79. P. 1-9.

173. Stephens R. S., Kuo C-C., Newport G. Molecular cloning and expression of Chlamydia trachomatis major outer mambrane protein antigents in Escherichia coli II Infect. Immun. 1985. - Vol. 47. - P. 713-718.

174. Stephens R. S., Mullenbach G., Sancher-Pescador R. Sequence analysis of the major outer membrane protein gene from Chlamydia trachomatis serovar L2 //Journal of Bacteriology. 1986. - Vol. 168. - P. 1277-1282.

175. Stephens R.S. Chlamydia. Intracellular Biology, Pathogenesis and Immunity. / ASM Press Washington, 1999. - P. 143 -146.

176. Stills H.F.et al. A «new» Chlamydia spp. strain SFPD isolated from transmissible proliferative ileitis in hamsters // Microbiol. Ecol. Health. Dis. -1991.-Vol.4.-P. 99-107.

177. Su H., Morrison R. P., Waltkins N. G., Caldwell H. D. Identification and characterization of T-cell epitopes of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis II Journal of Experimental Medicine. 1990. - Vol. 172. - P.203-212.

178. Szeredi L. et al. Intestinal Chlamydia in finishing pigs // Vet. Pathol. 1996. - Vol.33. -P.369-374.

179. Tan T.W., Harring A.I., Anderson I. E. Protection of sheep against Chlamydia psittaci infection with a subcellular vaccine containing the major outer membrane protein // Infect. Immun. 1990. - Vol. 58. - P. 3101-3108.

180. Tanzer R. J., Hatch T.P. Characterization of outer membrane proteins in Chlamydia trachomatis LGV serovar L2 // J.Bact. 2001. - Vol. 183. - P. 2686-2690.

181. Vertou E., Psarrou E., Spiliopoulou D. The role of lipopolysaccharide in the exposure of protective antigenic sites on the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis II J.Gen. Microbiol 1992. Vol. - 138. - P. 12211227.

182. Wyllie S., Richard H.A. Longbottom D.I. The major outer membrane protein of Chlamydia psittaci functions as a porin-like ion channel // Infect. Immun. -1998. Vol.- 66. P. 5202-5207.

183. Yuan Y, Zhang Y.X., Watkins N.G., Caldwell H.D. Nucleotide and deduced amino acide sequences for the four variable domains of the major outer membrane proteins of the 15 Chlamydia trachomatis serovars // Infect. Immun. 1989. - Vol.57. - P. 1040-1049.

184. Zahn I., Szeredi L. et al. Immunohistochemical determi nation of Chlamydia psittaci, Chlamydia ресогит and Chlamydia.trachomatis in the piglet gut // J.Vet.Med.Ser.B. 1995. - Vol.42. - P. 266-276.

185. Zhao Q. et al. Lack of allelic polymorphism for the major outer membrane protein gene of the agent of guinea pig inclusion conjunctivitis {Chlamydia psittaci) II Infect. Immun. 1993. - Vol. 61. - P. 3078 - 3080.

186. ГО С v Гf " Г1Г"' -;': 1"'бшшюзжл'