Молекулярно-генетическая характеристика хламидий и экспресс-диагностика хламидиоза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, доктор биологических наук Обухов, Игорь Леонидович

• Обухов, Игорь Леонидович
• доктор биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации доктор биологических наук Обухов, Игорь Леонидович

ВВЕДЕНИЕ.4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.15

1.1. Свойства и цикл развития хламидий. Взаимодействие с клеткой-хозяином.15

1.2. Хламидиоз кошек и собак.50

1.3. Антигенная структура хламидий и получение антихла-мидийных моноклональных антител.55

1.4. Молекулярно-генетический подход в диагностике хла-мидиозов животных и птиц на основе полимеразной цепной реакции.60-75 >

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.77

2.1. Материалы и методы.77

2.2. Методы исследований.83

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.108

3.1. Выделение хламидий в развивающихся куриных эмбрионах.108

3.2. Выделение хламидий в культуре клеток McCoy.117

3.3. Ультраструктурная характеристика С.psittaci.122

3.4. Изучение патогенности штаммов К-1 и С-1.137

3.5. Изучение длительности хранения хламидийного штамма К-1.151

3.6. Изучение чувствительности куриных эмбрионов различного возраста к штаммам К-1 и С-1.156

3.7. Выращивание возбудителя хламидиоза в клеточных культурах.159

3.8. Получение, характеристика и применение моноклональных антител к С. psittaci.162

3.9. Характеристика гибридомы Хла-К-1 -ДЕП.173

3.10. Технологический процесс получения диагностического препарата для выявления антигенов хламидий у животных методом прямой иммунофлюоресценции (ПИФ).182

3.11. Сравнение чувствительности и специфичности экспериментального диагностикума на основе флюоресцирующих моноклональных антител с зарубежными и отечественными аналогами.202

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗА И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИДОВ

C.PSITTACI И C.PECORUM.218

4.1. Детектирование и видовая дифференциация хламидий методом ПЦР.218

4.2. Выбор методики выделения ДНК.224

4.3. Определение аналитической специфичности и чувствительности ПЦР.228

4.4. Внутривидовая дифференциация штаммов С.рэМаа методом рестрикционного анализа.235

4.5. Сравнительная оценка методов лабораторной диагностики офтальмохламидиоза у кошек.245

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетическая характеристика хламидий и экспресс-диагностика хламидиоза»

Актуальность темы. Хламидиозная инфекция широко распространена среди практически всех видов млекопитающих и птиц, наносит существенный экономический ущерб различным отраслям животноводства и птицеводства, вызывая гибель животных, патологию их воспроизводительных органов, аборты, рождение мертвого или нежизнеспособного приплода. Больные животные часто становятся источником инфекции работников животноводческих хозяйств. Распространенность возбудителей хламидиоза в природе среди диких животных и особенно птиц представляет постоянную угрозу спорадических заболеваний для людей, профессионально не занятых в сельском хозяйстве (18; 43; 44; 47; 50; 51; 64; 69; 71; 72; 233; 324; 351).

Особенностью хламидиозной инфекции, значительно усложняющей эпизоотологический контроль за ней, является часто хроническое, со стертой клинической картиной или латентное течение (52; 53; 56; 57; 58; 63; 64). Поэтому, в системе проведения ветеринарно-санитарных мероприятий по своевременной профилактике, а также специфическому лечению хламидиозов животных и людей важное значение имеет как можно более раннее и достоверное обнаружение возбудителя при разных формах заболевания. С этой целью на протяжении последних лет был разработан целый ряд лабораторных методов прямой и косвенной диагностики хламидиозов.

В настоящее время общепризнанным эталоном для прямых методов выявления хламидий считается выделение возбудителя в культуре клеток. Однако этот метод имеет недостатки, существенно затрудняющие его широкое использование в практической ветеринарии. Прежде всего, это высокий риск инфицирования персонала и необходимость проведения работ по выделению возбудителя в специальной лаборатории. Кроме того, культуральный метод трудоемок и занимает много времени. Несмотря на то, что для высева патогена подходит практически любой материал от инфицированного животного, успех исследования во многом зависит от скорости транспортировки проб в лабораторию и соблюдения условий доставки образцов (специальные транспортные среды, охлаждение, добавление антибиотиков, предварительная очистка материала от токсичных для клеток веществ и т.д.) (12; 92; 174; 351).

В связи с этим предпринимаются попытки заменить метод культурального выделения хламидий другими методами их прямого обнаружения. Так, в последние годы большое значение приобрел подход, основанный на выявлении антигенов С.рвМаа методом иммуноферментного анализа (ИФА), имеющий по сравнению с культуральным следующие достоинства: возможность одновременного анализа большого числа образцов, быстрота (продолжительность анализа составляет 4 часа) и безопасность для персонала. Однако для ИФА-детекции антигенов так же, как и для культурального метода, характерны не высокая чувствительность в связи с низкой концентрацией возбудителя в пробе, особенно при латентном течение инфекции (92; 116; 152; 291).

Проблема низкой чувствительности рассмотренных выше подходов была решена с введением в схему анализа методов прямой и непрямой иммунофлюоресценции. Методы иммунофлюоресценции не требуют много времени для исследования, а также наличия живого возбудителя в пробе; позволяют выявлять не только корпускулярные антигены, входящие в состав морфологических структур возбудителя, но и растворимые, содержащиеся во включениях. (79; 118; 126; 130; 174). Поэтому, получение методом гибридомной технологии моноклональных антител к С.рэМаа и разработка на их основе диагностикумов для внедрения в практику - является актуальной задачей отечественной ветеринарии.

При сопоставлении результатов полученных с помощью серологических методов и прямых методов детекции хламидий, как правило, наблюдается высокий процент дискордантных результатов (151; 152; 174). Поэтому, наличие специфичных антител у животных, не является доказательством активного инфекционного процесса и требует обязательного подтверждения каким-либо прямым методом (92; 151; 276; 351; 352).

Однако общепринятые методы диагностики и типирования хламидий, основанные на фенотипическом выражении биологических свойств, не всегда дают объективную характеристику циркулирующих штаммов (134; 293).

В настоящее время в микробиологии получили широкое применение молекулярно-генетические методы, характеризующие возбудителей инфекционных заболеваний по особенностям их генетической структуры. Их применение для характеристики хламидий позволяет устанавливать внутривидовые различия между штаммами микроорганизмов по особенностям нуклеотидного состава ДНК, характеризовать штаммовый состав популяции и следить за распространением инфекции (134; 175; 179; 233; 376).

Одним из наиболее перспективных методов прямой диагностики инфекций следует считать специфическую амплификацию нуклеиновых кислот in vitro и, в частности, наиболее разработанный вариант этой амплификации - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Уже в первых работах, посвященных применению ПЦР для обнаружения хламидий, отмечены чрезвычайно важные для диагностики хламидиозов особенности этого метода: высокая чувствительность и специфичность, способность идентифицировать виды хламидий (119; 134; 192; 193; 234; 270; 276; 293).

Дополнительная информация о разновидности возбудителя, легко получаемая методом ПЦР, позволяет проводить эпизоотологический контроль и предотвращать распространение опасных штаммов хламидий. Однако завышенная стоимость импортных ПЦР-наборов не позволяет широко использовать данный метод в практике. Поэтому создание недорогих и качественных отечественных тест-систем для обнаружения хламидий является актуальной задачей (50; 304; 317; 324; 363).

Цель и задачи исследований. Цель исследований -изучить биологические свойства хламидий, разработать тест-системы для экспресс-диагностики хламидиоза и определить внутривидовые различия между штаммами хламидий.

Основные задачи исследования:

• Выделить штаммы возбудителей хламидиоза кошек и собак, изучить их биологические свойства;

• Провести электронно-микроскопические исследования ультраструктуры C.psittaci и изучить характер взаимодействия возбудителя с культурой клеток McCoy и с развивающимися куриными эмбрионами;

• Получить моноклональные антитела к различным антигенным детерминантам C.psittaci и изучить их биологические свойства;

• Разработать на основе моноклональных антител, меченных флуоресцеинизотиоцианатом экспериментальный диагностический препарат для выявления хламидий методом прямой иммунофлюоресценции;

• Сравнить эффективность полученного диагностикума с аналогичным коммерческим препаратом зарубежного производства;

• Разработать тест-систему методом ПЦР для диагностики хламидиоза у животных;

• Разработать тест-систему методом ПЦР для диагностики и идентифицикации C.psittaci в клиническом материале от разных видов сельскохозяйственных животных и птиц;

• Разработать тест-систему методом ПЦР для диагностики и идентифицикации C.pecorum в клиническом материале от разных видов сельскохозяйственных животных;

• Адаптировать метод генотипирования рестрикционный анализ и изучить возможности его применения для внутривидовой дифференциации хламидий.

Положения, выносимые на защиту:

1. Выделение и идентификация штаммов возбудителей хламидиоза кошек и собак в куриных эмбрионах и культуре клеток;

2. Получение гибридомы - продуцента моноклональных антител к антигенам C.psittaci и разработка диагностического набора методом прямой иммунофлюоресценции;

3. Разработка тест-систем для диагностики хламидиоза и идентификации C.psittaci и C.pecorum у разных видов сельскохозяйственных животных и птиц;

4. Внутривидовое генотипирование хламидий с помощью рестрикционного анализа.

Научная новизна. Впервые в РФ выделены и идентифицированы штаммы возбудителей хламидиоза кошек и собак (К-1; С-1), изучены их биологические свойства. Новизна исследований подтверждена получением патента "Штамм Chlamydia psittaci, используемый для изготовления инактивированной вакцины против хламидиоза кошек и пушных зверей" № 2122579 от 27.11.1998 г.

Получены лимфоцитарные гибридомы, стабильно секретирующие моноклональные антитела, направленные к родоспецифическим детерминантам C.psittaci, являющиеся основой для создания в РФ современной иммунодиагностики хламидиозов животных.

Выявлены моноклональные антитела, обладающие наибольшей эффективностью при обнаружении хламидийных антигенов в биологическом материале - Хла-К-1 (lgG1), направленные к консервативным эпитопам основного белка внешней мембраны хламидий (МОМР) и обладающие высокой чувствительностью (100 м.к./мл) и 100% специфичностью.

На «Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus L., используемый для получения моноклональных антител к Chlamydia» получено положительное решение о выдаче патента на изобретение № 98123923/13 от 25.01.2000 г.

Впервые в РФ на молекулярно-генетическом уровне изучены и типированы штаммы и изоляты хламидий, выделенные от животных. На основе анализа 26 последовательностей ДНК гена МОМР хламидий выбраны оригинальные праймеры, позволяющие дифференцировать виды C.psittaci и C.pecorum методом ПЦР. Чувствительность реакции составила 10 геномов бактерий в пробе при фоновой нагрузке ДНК быка, взятой в количестве, эквивалентном 100000 клеток.

Адаптирован метод генотипирования - рестрикционный анализ с применением ПЦР и определены возможности его применения для внутривидовой дифференциации хламидий.

Показано, что популяция хламидийной инфекции у животных гетерогенна по генетической структуре.

Практическая значимость работы. Предложена и внедрена в ветеринарную практику инактивированная культуральная вакцина против хламидиоза кошек, собак и пушных зверей, изготовленная на основе штаммов, выделенных нами от естественно зараженных кошек и собак (ТУ и наст, по применению утв. Департаментом ветеринарии в 1999 г.). Штаммы депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве "Chlamydia psittaci К-1 ДЕП" № 87/274 от 22.01.1996 г. и "Chlamydia psittaci С-1 ДЕП" № 86/274 от 22.01.1996 г.

Разработан и впервые внедрен в ветеринарную практику отечественный диагностикум для выявления антигенов хламидий методом прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) в патологическом материале от сельскохозяйственных животных и птиц (ТУ и наст, по применению утв. Департаментом ветеринарии в 1999 г.). Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus L. - продуцент моноклональных антител к Chlamydia депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве с присвоением наименования «Штамм гибридомы Хла-К-1-ДЕП» от 15.04.1996 г.

Впервые в РФ разработаны и внедрены в ветеринарную практику ПЦР-тест-системы для диагностики и идентификации разных видов хламидий, обладающие высокой таксономической специфичностью (ТУ и наст. по применению утв. Департаментом ветеринарии в 1999 г.).

Детекция хламидий методом ПЦР в патологическом материале впервые включена в «Наставление по диагностике орнитоза (хламидиоза) у птиц», утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года и «Методические указания по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных», утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 июня 1999 года.

Использование методов ПИФ и ПЦР в диагностических ветеринарных лабораториях, дает возможность быстро и надежно установить диагноз на хламидиоз, что приведет к своевременной эффективной терапии и научно обоснованной профилактике этого заболевания.

Метод рестрикционного анализа с применением ПЦР позволяет получать дополнительную информацию о разновидности возбудителя, проводить эпизоотологический контроль и предотвратить распространение опасных штаммов хламидий на территории РФ.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на: 2-ой Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции" (Москва, 1997); Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растеневодстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 1996); Всероссийской научной конференции "Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных" (Москва, 1996); VIII Международном симпозиуме по ветеринарной лабораторной диагностике (Иерусалим, 1996); Всероссийской научной конференции "Актуальные вопросы ветеринарно-санитарного обеспечения в мясной отрасли" (Москва, 1997); Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных" (С.Петербург, 1997); 2-ой Всероссийской конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний" (Москва, 1998);

2-ой Международной конференции "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" (С.-Петербург, 1998); Методических советах по вирусологии ВГНКИ (Москва, 1993-1998); Межлабораторном совещании сотрудников ВГНКИ (Москва, 1999),

3-ей Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине" (Москва, 2000).

Диагностические препараты экспонировались в павильонах "Ветеринария" и "Микробиология" ВДНХ РФ и отмечены золотыми медалями.

Публикации по теме работы. По теме диссертации опубликовано 47 статей, в том числе монография "Хламидиоз кошек" (Москва, 1994, 5,4 п.л.). Получены один патент и одно положительное решение о выдаче патента на изобретение. Разработаны 5 наставлений по применению, 5 технических

14 условий, 8 методических указаний, наставление по диагностике орнитоза и правила по профилактике и борьбе с орнитозом.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Обухов, Игорь Леонидович

ВЫВОДЫ

1. Методы диагностического выделения хламидий в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов и в перевиваемой линии клеток McCoy могут быть использованы для постановки диагноза "хламидийный конъюнктивит" у кошек и собак. Метод выявления цитоплазматических включений в эпителиальных клетках конъюнктивы, окрашиваемых по Романовскому-Гимзе, обладает низкой чувствительностью и специфичностью при конъюнктивитах и уретритах хламидийной этиологии.

2. Штаммы хламидий, выделенные от кошек и собак, способны вызывать заболевание и гибель естественных хозяев, у которых возникают аборты и рождение ослабленного, больного хламидиозом потомства, а также у морских свинок и белых мышей.

3. Электронно-микроскопические исследования ультраструктуры C.psittaci и изучение характера взаимоотношений возбудителя с культурой клеток McCoy и с развивающимися куриными эмбрионами показали, что внутриклеточные включения хламидий характеризуются неоднородностью по форме включений и по упаковке C.psittaci в них. Указанная закономерность, является характерной для хламидий и не отражает многообразие штаммов хламидий, циркулирующих в природе.

4. Определены условия хранения штаммов К-1 и С-1 в нативном и лиофилизированном состоянии. Инфекционная активность штаммов сохраняется на высоком уровне с титром 6,5 lg ЭЛД50/0,3 мл, при использовании в качестве стабилизатора фосфатно-буферного раствора с 7% сахарозы или фосфатно-буферного раствора с 2% пептоном.

5. Методом соматической гибридизации клеток мышиной лимфоцитарной гибридомы ЫБО и спленоцитов мышей линии ВА1В/с, иммунизированных антигеном из штамма К-1, получена панель из 12 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела различного изотипа. Установлено, что моноклональные антитела Хла-К-1 изотипа 01 реагируют с консервативными эпитопами белка внешней мембраны (МОМР) различных штаммов хламидий, изолированных от разных видов животных.

6. На основе родоспецифических моноклональных антител получены первые экспериментальные серии отечественного диагностического препарата для выявления антигенов С.рэ^аа прямым иммунофлюоресцентным методом, который по своей чувствительности и специфичности не уступает зарубежным коммерческим аналогам и позволяет поставить диагноз на хламидиоз в течение 35-45 минут после взятия клинического материала.

7. С целью диагностики хламидиоза и идентификации С.рэМаа и С.ресогит предложен метод ПЦР. Выбранные праймеры, располагающиеся в консервативных областях гена МОМР, обладают высокой чувствительностью (10-30 м.к./мл) и 100% специфичностью при детекции хламидий в патологическом материале.

8. Для выделения и очистки исследуемой ДНК наиболее оптимальной является схема однопробирочной процедуры ее выделения из клинического материала с помощью лизиса

277 клеток гуанидинтиоцианатом с последующей сорбцией ДНК на частицах силикагеля размером 0,5-10 мкм.

9. Применение рестрикционного анализа с использованием ПЦР для изучения внутривидовых различий между штаммами хламидий при использовании специфических эндонукпеаз А1и1, ВбШ! и Сйэ1, показало, что популяция С.рэ^аа гетерогенна по генетической структуре. Определено, что рестрикционный анализ является одним из необходимых инструментов для внутривидового типирования хламидий для получения объективной оценки циркулирующих штаммов. 10. Эффективность прямых методов диагностики при офтальмохламидиозе по сравнению с ПЦР показывает, что чувствительность ПИФ составляет 93%, культуры клеток - 67% и окраски по Романовскому-Гимзе - 40%. Установлено, что ПЦР-анализ необходимо использовать не только в целях ранней экспресс-диагностики хламидиоза, но и для экспертизы сомнительных результатов, полученных традиционными методами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1) Санитарные и ветеринарные правила по профилактике и борьбе с орнитозом (утверждены Госкомсанэпиднадзором России от 31 мая 1996 года и Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России от 18 июня 1996 года);

2) Методические указания по выявлению антигенов рода Chlamydia у животных методом прямой иммунофлуоресценции (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 20 ноября 1997 года);

3) Методические указания по индикации Chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 20 ноября 1997 года);

4) Методические указания по индикации Chlamydia pecorum методом полимеразной цепной реакции (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 20 ноября 1997 года);

5) Методические указания по выявлению хламидиоза методом полимеразной цепной реакции (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 20 ноября 1997 года);

6) Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод ПЦР. Основные положения (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 27 января 1997 года);

7) Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных методом полимеразной цепной реакции (под ред. А.А.Гусева, А.Н.Панина - Владимир - 1998 год);

8) Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом (под ред. А.А.Гусева, А.Н.Панина - Владимир -1998 год);

9) Наставление по применению вакцины против хламидиоза пушных зверей, кошек и собак инактивированной ХламиКон (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

10) Технические условия на вакцину против хламидиоза пушных зверей, кошек и собак инактивированную ХламиКон (ТУ 9384-184-00494189-99);

11) Наставление по применению набора "ХламиОрн" для выявления родоспецифического антигена хламидий методом прямой иммунофлюоресценции у животных и птиц (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 5 мая 1999 года);

12) Технические условия на набор "ХламиОрн" для выявления родоспецифического антигена хламидий методом прямой иммунофлюоресценции у животных и птиц (ТУ 9388-18900494189-99);

13) Наставление по применению тест-системы «ХЛА-ПСИТ» для выявления возбудителя хламидиоза Chlamydia psittaci методом ПЦР (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

14) Технические условия на тест-систему «ХЛА-ПСИТ» для выявления возбудителя хламидиоза Chlamydia psittaci методом ПЦР (ТУ 9388-185-00494189-99);

15) Наставление по применению тест-системы «ХЛА-ПЕК» для выявления возбудителя хламидиоза Chlamydia pecorum методом ПЦР (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

16) Технические условия на тест-систему «ХЛА-ПЕК» для выявления возбудителя хламидиоза Chlamydia pecorum методом ПЦР (ТУ 9388-186-00494189-99);

17) Наставление по применению тест-системы «ХЛА-КОМ» для диагностики хламидиоза животных и птиц методом ПЦР (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

18) Технические условия на тест-систему «ХЛА-КОМ» для диагностики хламидиоза животных и птиц методом ПЦР (ТУ 9388-180-00494189-99);

19) Наставление по диагностике орнитоза (хламидиоза) у птиц (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

20) Методические указания по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 июня 1999 года).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние десятилетия инфекции, вызываемые хламидиями, характеризуются повсеместным распространением, кпинико-эпидемиологическим многообразием и значительным влиянием на уровень здоровья человека и продуктивность животноводства.

Несмотря на то, что средства диагностики и терапии в последние годы стали более эффективными, распространенность хламидийных инфекций и вызываемые ими осложнения продолжают увеличиваться. На сегодняшний день в эпизоотической цепи хламидиоза вакцинопрофилактикой не охвачены такие животные, как кошки и собаки, которые выделяя хламидии через органы дыхания, конъюнктивальную слизь, желудочно-кишечный тракт и мочеполовую систему контаминируют окружающую среду и создают природные очаги этой инфекции. За счет этого возникает прямая угроза здоровью человека. Следовательно, актуальной задачей является выделение штаммов от этих животных и их использование для разработки специфической профилактики данной болезни, что явилось одним из основных направлений нашей работы.

Кроме того, возбудители хламидиозов, вызывая сходную клиническую картину у разных животных, представляют собой крайне полиморфную группу. И наоборот, один и тот же возбудитель может вызывать разные формы инфекции как у птиц, так и у млекопитающих. Поэтому, важнейшим этапом в системе проведения ветеринарно-санитарных мероприятий для своевременной профилактики, а также специфического лечения хламидиозов животных и людей является не только максимально ранняя и точная лабораторная диагностика возбудителя при разных формах течения инфекции, но и одновременное определение вида и типа хламидий.

До недавнего времени основные принципы диагностики хламидиозов сводились к выделению хламидий в культуре клеток, непосредственному выявлению специфических включений, микробных клеток или антигенов хламидий в пораженных органах и тканях, а также определению специфических антител в сыворотках больных особей. Диагностическое выделение хламидий в культуре клеток считалось до настоящего времени "золотым стандартом" и рассматривалось как самый специфичный и чувствительный метод диагностики.

Однако данный подход имеет целый ряд недостатков существенно затрудняющих его широкое использование. Прежде всего, это необходимость проведения работ по выделению живого возбудителя только в специальной режимной лаборатории, что связано с высоким риском инфицирования персонала. Метод культивирования трудоемок и занимает много времени - около 6-10 дней. Несмотря на то, что для анализа подходит практически любой материал от инфицированного животного, успех исследования во многом зависит от того, как скоро данная проба была доставлена в лабораторию.

Кроме того, для транспортировки необходимы также специальные транспортные среды и часто трудно соблюдаемые условия транспортировки образцов (охлаждение, добавление антибиотиков, предварительная очистка материала от токсичных для клеток веществ и т.д.).

Поэтому необходимость в усовершенствовании метода культуры клеток уже возникла после работ Grayston и Campbell, которые проводили исследования по характеристике и эпидемиологии штаммов TWAR (107; 158). В настоящее время данные штаммы выделены в вид С.pneumoniae. Представители этого вида плохо репродуцируются как в куриных эмбрионах, так и в культуре клеток. Авторы проводили выделение штаммов TWAR в клетках HeLa-229 с применением центрифугирования, ДЕАЕ-декстрана и циклогексимида. Эффективным методом окраски было признано использование флуоресцирующих родоспецифических или TWAR-специфичных монокпональных антител (158). Вследствие этого, в последние десятилетия большое распространение получили быстрые иммунологические методы определения хламидий непосредственно в патологическом материале, которые основываются на технике иммунофлюоресценции или на иммуноферментном анализе с применением высокоспецифичных моноклональных антител и не требуют наличия в пробе жизнеспособного микроорганизма.

На сегодняшний день зарубежные и отечественные фирмы выпускают большое количество разных комерческих наборов, в составе которых используются монокпональные антитела, предназначенные для диагностики урогенитальных хламидиозов у человека, вызываемых С.trachomatis. Однако аналогичные диагностические тесты в нашей стране для сельскохозяйственных животных и птиц до настоящего времени не были разработаны.

Поэтому, получение методом гибридомной технологии моноклональных антител к C.psittaci и конструирование на их основе диагностикума для внедрения в ветеринарную практику -является вторым основным направлением нашей работы.

Совершенствование методов молекулярной биологии дало возможность расширить диапазон применяемых диагностических методов. Так, шестнадцать лет назад сотрудник компании "Cetus Corporation" Кэри Б. Мюллис реализовал идею, высказанную 30 лет назад двумя Нобелевскими лауреатами А. Кронбергом и Дж. Ледербергом и открыл принцип избирательного умножения нуклеотидных последовательностей - метод ПЦР, который поднял генодиагностику на принципиально новый уровень в связи с очень высокой чувствительностью (до 10~17 г ДНК), специфичностью и быстротой получения конечного результата. В связи с тем, что ПИФ, ИФА и другие методы ориентированы на выявление микроорганизма на основании его фенотипических признаков, проявление которых зависит от экспрессии генов, молекулярно-биологические технологии позволяют определить непосредственно генотипическую принадлежность бактерии или вируса. Также многие бактерии и вирусы могут длительно находиться в латентной форме и присутствовать в столь малых количествах, что их не удается обнаружить ни одним из традиционных методов. Высокая специфичность, но недостаточная чувствительность ПИФ-метода при обследовании популяций с отсутствием симптоматики (при уровне инфицированности ниже 10%) несколько снижает его диагностическую ценность. Кроме того, антигенные свойства микроорганизмов могут меняться под давлением защитных сил иммунитета и даже единичные мутации в их геноме иногда сопровождаются существенным снижением взаимодействия диагностических антител с антигенными детерминантами инфекционных агентов (13). Вследствие этого, работ, посвященных использованию ПЦР для идентификации инфекционных агентов вполне достаточно, чтобы представить необходимость применения метода ПЦР для создания диагностических тест-систем, в частности для диагностики и типирования хламидиозов животных и людей. Поэтому, проблемы связанные с контролем за распространением хламидийных инфекций являются следствием несовершенства и трудоемкости традиционных методов выявления хламидий.

В связи с этим третьим основным направлением нашей работы являлась разработка родо- и видоспецифичных праймеров для ПЦР-детекции видов С-рэМаа и С.ресогит, которые представляют наибольшую актуальность для сельского хозяйства. Дополнительная информация о разновидности возбудителя получаемая методом ПЦР, позволит проводить эпидемиологический контроль и предотвращать распространение опасных штаммов. Вследствие этого был использован рестрикционный анализ для определения штаммовых различий хламидий внутри вида, которые определяли по характеру расщепления ампликонов специфическими эндонуклеазами, имеющими строго определенные сайты узнавания.

Первый этап исследования заключался в выделении возбудителей хламидиоза кошек и собак, изучении их биологических свойств и адаптирование возбудителей к перевиваемой культуре клеток.

Для первичного выделения хламидий были использованы развивающиеся куриные эмбрионы 6-7-дневного возраста. В качестве инфекционного материала мы использовали соскобы с конъюнктивы больных кошек и собак.

Для получения мазков-отпечатков желточной оболочки куриные эмбрионы с признаками их малой подвижности или гибели не ранее, чем через 3 суток после заражения, вскрывали, извлекали желточный мешок и готовили препараты для окраски по Романовскому-Гимзе. Также делали мазки-отпечатки с желточной оболочки отдельных живых, подвижных эмбрионов, вскрытых в более поздние сроки после заражения (10-12 суток). При отсутствии признаков наличия хламидий проводили слепые пассажи желточного материала, в которых повторяли данную процедуру. При выявлении морфологических структур или антигенов хламидий, наличие которых обычно сочеталось с летальностью куриных эмбрионов, устанавливался положительный результат диагностического выделения. При отсутствии этих показателей на протяжении 2-3 слепых пассажей, опыт прекращали и результаты оценивали, как отрицательные.

Для адаптации эмбрионального штамма к культуре клеток и создания оптимальных условий культивирования с целью повышения чувствительности клеток к хламидиям, для лучшей адсорбции и проникновения хламидий в клетку хозяина проводили предварительное центрифугирование используемого материала на монослой выращенных клеток. Позитивные результаты диагностического выделения, определялись суммарными показателями индикации цитоплазматических включений в клетках культуры, выявляемых методом обнаружения морфологических структур при окраске по Романовскому-Гимзе.

Широкий спектр патогенности хламидий и глобальная распространенность хламидиозов, объясняют необходимость изучения закономерностей их внутриклеточного способа существования. Изучение ультраструктуры хламидий с помощью электронного микроскопа началось еще с конца 40-х годов, когда были опубликованы первые электронограммы ЭТ возбудителей пситтакоза, кошачьей пневмонии и венерической лимфогранулемы.

При изучении кошачьего штамма К-1 в куриных эмбрионах и в культуре клеток McCoy четко различались вегетативные, спороподобные и переходные формы. На ультратонких срезах инициальные тельца представляли собой кокки, ограниченные двухконтурной цитоплазматической мембраной и содержащие большое количество рибосом. Отдельные кокки имели электронно-плотную зону - нуклеоид. Размер инициальных телец C.psittaci колебался от 0,5 до 0,7 мкм.

Элементарные тельца (спороподобные формы) имели меньший размер (поперечник около 0,3 мкм) без жгутиков, фимбрий и пилей. Цитоплазма их более компактна и отнесена к периферии электронно-плотным нуклеоидом.

Первые включения хламидий, видимые в световом или люминесцентном микроскопе появлялись в инфицированных клетках, как правило, через 10-12 часов после заражения. На этих сроках методом ПИФ в цитоплазме отдельных клеток вблизи ядра выявлялись небольшие светящиеся зоны. При массивном заражении (обычно применяющемся в электронно-микроскопических экспериментах) в одной клетке может сначала образоваться несколько включений, которые затем часто сливаются в одно.

Зрелые включения у штамма К-1 С.райаа, заполняли обычно большую часть цитоплазмы клетки-хозяина. При этом ее ядро не претерпевает существенной деформации. Цитоплазма, окружающая зрелое включение, имела вид узкого ободка уже через 48 часов после заражения и сохранялась в виде достаточно широких зон.

Форма включения была достаточно разнообразной: от неправильной, разветвленной и как бы дольчатой, до округлой или овальной с извилистыми или ровными краями.

В зрелых включениях С.рвМаа, наблюдаемых в ультратонких срезах, отдельные клетки хламидий упакованы достаточно плотно. Плотность упаковки хламидий во включении у штамма К-1, как правило, не менялась в зависимости от срока инфекции. Тем не менее, на одном и том же сроке инфекции (как по сроку после заражения, так и по соотношению РТ, ПТ и ЭТ) плотность хламидий во включении варьировала от очень плотной упаковки до достаточно свободной.

Через 48-72 часов после заражения видно, что мембрана окружающая включение штамма К-1 C.psittaci, часто не выявляется, однако включение при этом сохраняет свою морфологическую целостность. Разрыв мембраны включения происходил в наших опытах только непосредственно перед выходом хламидий из клетки, на самых поздних стадиях их цикла развития.

Результаты нашего исследования показали, что форма включения и упаковка кошачьих хламидий по включениях C.psittaci, являются характерными для данного вида хламидий.

Таким образом, исследования, проведенные на модельных системах in vitro в условиях, исключающих неконтролируемые воздействия организма хозяина, подтверждают и устанавливают ряд общих морфо-функциональных закономерностей внутриклеточного паразитизма хламидий, которые позволят более детально изучить внутриклеточный паразитизм на органном и организменном уровне развития.

Выделенные нами штаммы хламидий К-1 и С-1 от больных хламидиозом кошек и собак, были депонированы в Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) в качестве производственных штаммов для изготовления вакцины против хламидиоза кошек, собак и пушных зверей. Новизна исследований подтверждена получением патента "Штамм Chlamydia psittaci, используемый для изготовления инактивированной вакцины против хламидиоза кошек и пушных зверей" № 2122579 от 27.11.1998 г.

Несмотря на то, что средства профилактики и терапии в последние годы стали более эффективными, распространенность хламидиоза среди животных, продолжает увеличиваться в связи с наличием неконтролируемого резервуара инфекции в природе. Данная ситуация осложняется отсутствием в ветеринарных лабораториях надежных и простых диагностических тест-систем, что затрудняет этиологическую диагностику и эпидемиологический надзор за хламидийными инфекциями.

Исследования последних лет показали высокую эффективность выявления антигенов микроорганизмов с помощью реакции прямой иммунофлюоресценции и иммуноферментного метода, с использованием высокоспецифичных м-АТ. Поэтому одним из главных направлений нашей работы было получение монокпональных антител к антигенам С.рвИаа и разработка диагностической тест-системы методом прямой иммунофлюоресценции, предназначенной для выявления хламидий у животных.

Первый этап исследования заключался в получении серии гибридом, стабильно секретирующих м-АТ к различным антигенам С.рэ^аа, в первую очередь к родо- и видоспецифическим детерминантам антигенного комплекса микроорганизма. Немаловажным условием для получения гибридом, стабильно продуцирующих антитела нужной специфичности, является иммунизация мышей- доноров спленоцитов, вырабатывающих специфические антитела. С этой целью нами использованы штамм К-1 C.psittaci, в антигенной структуре которого наиболее широко представлены родо- и видоспецифические детерминанты, ответственные за серологический перекрест со всеми остальными сероварами C.psittaci, а также с видами C.pecorum и С.trachomatis. Выраженный иммунный ответ у животных был получен при введении антигена в дозе 100 мкг белка на инъекцию в полном адъюванте Фрейнда внутрибрюшинно, двукратно, с двухнедельным интервалом. Бустерную иммунизацию проводили через 1 месяц за три дня до слияния, используя ту же дозу антигена в физиологическом растворе. Антиген инъецировали в интраорбитальный венозный синус в объеме 0,1 мл и внутрибрюшинно - 0,2 мл.

При скрининге в ИФА 215 выращенных гибридных клонов, 12 клонов (5,6%) продуцировали м-АТ, реактивные только в отношении специфического антигена, 11 клонов (5,1%) продуцировали м-АТ, которые связывались с обоими антигенами и м-АТ 5 клонов (2,3%) были реактивны только в отношении "нормального" антигена. Определение субклассовой принадлежности м-АТ показало, что 10 клонов (Хла-К-1, Хла-К-2, Хла-К-3, Хла-К-4, Хла-К-5, Хла-К-6, Хла-К-7, Хла-К-8, Хла-К-9, Хла-К-10) продуцировали антитела lgG1 субкласса, один клон (Хла-К-11) - lgG2b субкласса и один клон (Хла-К-12) - антитела lgG3 субкласса. Все м-АТ не обладали комплементсвязывающей активностью. м-АТ были активны в ИФА (титр варьировал от 1:80 до 1:2000), РНИФ и не преципитировали специфические антигены. Три гибридомы -Хла-К-1, Хла-К-11 и Хла-К-12 были клонированы методом предельного разведения, выращены в массовую культуру в большом объеме и использованы для получения асцитической жидкости на сенсибилизированных пристаном мышах линии BALB/c 2-2,5-месячного возраста.

М-АТ эффективно конъюгировались с пероксидазой хрена. Активность пероксидазных конъюгатов на основе МКА коррелировала с активностью немеченых м-АТ. В качестве антигенов исследованы инфицированные различными штаммами C.psittaci и С.trachomatis неочищенные желточные оболочки КЭ. Получена высокая активность и специфичность пероксидазного конъюгата как в отношении штаммов C.psittaci, так и С.trachomatis.

Далее представляло интерес изучить возможность использования м-АТ и м-АТ - конъюгатов для выявления хламидийного антигена при постановке ИФА в прямом "сэндвич" варианте. Установлено, что концентрация м-АТ, равная 1 мкг на лунку, была более оптимальной для "захватывания" антигена по сравнению с дозой 10 мкг на лунку. Наиболее эффективно "захватывали" антиген м-АТ Хла-К-2 и Хла-К-3, т.е. позволяли обнаруживать антигены даже в концентрации 0,05 мкг или 50 нг. Однако независимо от использованных «захватывающих» м-АТ пероксидазный м-АТ-конъюгат Хла-К-1 лучше выявлял иммунный комплекс.

При постановке ИФА и РНИФ с целью определения хламидийного антигена в органах экспериментально инфицированных животных для ИФА использовали м-АТ Хла-К-1 - пероксидазный конъюгат в рабочем разведении 1:800, а для РНИФ очищенные м-АТ Хла-К-1 в разведении 1:50. Результаты этих опытов, показали, что при помощи м-АТ можно выявить хламидийный антиген в патологическом материале в ИФА (титр антигенов варьирует от 1:5120 до 1:20480) и РНИФ.

При испытании м-АТ в ИФА с КА, обработанным протеина-зой К и периодатом натрия выявлено, что м-АТ Хла-К-1, Хла-К-11 и Хла-К-12 направлены к детерминантам чувствительным к протеиназе К и резистентным к периодату натрия, что подтверждает их белковую природу.

Для приготовления экспериментального диагностического препарата, выявляющего хламидии прямым иммунофлюорес-центным методом были отобраны м-АТ, обладающие широким спектром специфичности - м-АТ Хла-К-1 (lgG1), направленные к консервативным эпитопам МОМР. Полученные м-АТ предварительно были тестированы в ИФА и РНИФ с антигенами других видов микроорганизмов. М-АТ Хла-К-1 не взаимодействовали с ЛПС Mycoplasma pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Brucella abortus и реагировали с использованными в работе штаммами видов C.psittaci и C.pecorum.

При исследовании клинических препаратов экспериментальным иммунофлюоресцентным диагностикумом ХламиОрн и коммерческим иммунофлюоресцентным набором JMAGEN Chlamydia (Англия) совпадение результатов наблюдали в 100% случаев.

Для сравнения чувствительности и специфичности экспериментального диагностикума ХламиОрн с аналогичными зарубежным и отечественным препаратами исследовали биологический материал от больных животных с использованием наборов JMAGEN Chlamydia (Англия) и ХламиСкан (Россия).

При исследовании патологического материала диагностикумом ХламиОрн и коммерческим набором JMAGEN Chlamydia совпадение результатов наблюдали в 100% случаев. При исследовании препаратов диагностикумом ХламиОрн и отечественным коммерческим набором ХламиСкан результаты совпадали только в 80% случаев. В остальных 4 (20%) случаях ХламиОрн также выявил хламидии, ХламиСкан показал отрицательные результаты.

Следовательно, полученная нами серия м-АТ к C.psittaci обладает способностью связывать хламидийные антигены в инфицированных клетках и тканях, что позволяет обнаруживать иммунный комплекс при иммунофлуоресцентном анализе. Это свойство м-АТ было использовано для прямого обнаружения хламидий в биологических материалах. Этот метод позволяет обнаружить вне- и внутриклеточно расположенные элементарные и ретикулярные тельца и включения хламидий в инфицированных клетках. Скрининг антихламидийных м-АТ ФИТЦ-конъюгатов выявил, что наиболее эффективным по способности выявлять хламидийные антигены в биоматериалах оказались м-АТ Хла-К-1. На основе м-АТ Хла-К-1 было создано несколько серий диагностического препарата и исследовано уже более 1000 образцов от больных животных. Было показано, что м-АТ ФИТЦ-конъюгатов являются высоко чувствительными и специфичными.

Таким образом, разработана технологическая схема получения диагностикума «ХламиОрн», заключающаяся в следующем:

1. Получение м-АТ: а) Восстановление гибридом из замороженного состояния; б) Получение асцитической жидкости; в) Выделение м-АТ; г) Контроль активности м-АТ.

2. Конъюгация м-АТ с флуорохромом: а) Очистка м-АТ; б) Добавление флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) к м-АТ; в) Очистка ФИТЦ-конъюгата от несвязавшегося красителя; г) Определение активности и специфичности флуоресцирующих м-АТ.

3. Лиофилизация флуоресцирующих м-АТ: а) Розлив препарата; б) Лиофилизация препарата.

4. Приготовление вспомогательных ингтедиентов: а) Приготовление растворителя; б) Приготовление жидкости для заключения препарата; в) Маркировка и упаковка препарата.

Этот диагностикум рекомендуется для использования в ветеринарных диагностических лабораториях, оснащенных люминесцентным микроскопом. На данный диагностикум разработана и утверждена научно-техническая документация (ТУ 9388-189-00494189-99). Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L., используемый для получения монокпональных антител к Chlamydia имеет решение о выдаче патента на изобретение № 98123923/13 от 25.01.2000 г.

Эффективная профилактика и лечение хламидиоза животных зависит от постановки своевременного диагноза. Поэтому лабораторная диагностика хламидийной инфекции имеет важное значение и обеспечивает проведение этиотропной терапии и научно-обоснованных противоэпизоотических мероприятий.

Традиционные (вирусологические и бактериологические) методы диагностики возбудителей инфекций характеризуются значительной продолжительностью исследования, большой трудоемкостью, высокой себестоимостью и не всегда надежны.

Однако рост заболеваемости хламидиозом животных и человека в настоящее время требует применения принципиально новых ускоренных высокочувствительных и специфичных методов диагностики, позволяющих проводить раннее выявление инфекционного агента.

На сегодняшний день современные требования к лабораторной диагностике возбудителей инфекций следующие:

1. Абсолютная специфичность;

2. Чувствительность, гарантирующая обнаружение единичных копий микроорганизма;

3. Возможность количественного определения возбудителя инфекции в исследуемом материале;

4. Получение результата в течение одного рабочего дня;

5. Сравнительная простота подготовки исследуемого материала и проведение анализа с возможностью полной их автоматизации;

6. Низкая стоимость анализа;

7. Исключение возможности инфицирования персонала в процессе проведения анализа.

Вышеперечисленным требованиям наиболее полно отвечает метод диагностики, основанный на использовании ПЦР. Современными характеристиками которого в лабораторной диагностике инфекций является его быстрота, непревзайденная чувствительность и высокая специфичность, что позволяет надежно и к тому же количественно обнаруживать микроорганизмы, присутствующие в очень малом количестве (1-10 бактерий в пробе).

Несмотря на большое количество публикаций по применению метода ПЦР для детекции возбудителей инфекционных болезней и его очевидные достоинства, данный подход пока не нашел заслуженного практического применения. Общепринятым лидером, имеющим монопольный патент, по производству диагностических наборов методом ПЦР, является фирма Хоффман-Ля Рош. Однако завышенная стоимость разработанных ПЦР-наборов (цена набора на 96 исследований в зависимости от инфекции от 1800 до 3000 $) не позволяет широко использовать данный метод в практике. Поэтому создание недорогих и качественных отечественных тест-систем для обнаружения различных микроорганизмов является актуальной задачей.

ПЦР благодаря высокой чувствительности и быстрой детекции без этапа культивирования, позволяет преодолеть традиционные трудности при лабораторной диагностике хламидиоза. Выбор оптимальной подготовки образца для ПЦР является не единственным условием для получения достоверных результатов. Вследствие этого для повышения чувствительности и специфичности реакции необходимо оптимизировать условия амплификации, включающие: выбор наиболее специфичных праймеров, реагентов реакционной ПЦР-смеси и их концентрации, подбор оптимального температурного режима выполнения реакции.

В связи с этим, теоретическая специфичность предложенных праймеров была изучена с помощью компьютерных систем FASTA и BLASTA on line. В результате этой работы была показана гомология выбранных олигонуклеотидов с геном МОМР и не обнаружено их значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями других групп вирусов, бактерий или последовательностями эукариот. Таким образом, предложенные праймеры, исходя из теоретических расчетов, должны обладать 100% специфичностью. Необходимо отметить, что праймеры были выбраны на столь удаленном расстоянии друг от друга не случайно. При сравнительном анализе четырех консервативных областей мы остановили свой выбор на наиболее удаленных друг от друга последовательностях для того, чтобы в результате ПЦР получать фрагмент гена МОМР максимальной длины - удобной для последующего рестрикционного типирования.

Согласно разработанной схеме ПЦР-детекции, после первой стадии ПЦР-амплификации с родоспецифичными праймерами проводится амплификация с одним общим и по отдельности с каждым из видоспецифичных праймеров. Длина амплифицируемых фрагментов гена МОМР составляла для С.рв^аа - 1033 п.н., а для С.ресогит - 1036 п.н.

При оптимизации ПЦР в экспериментах с препаратами ДНК и штаммами хламидий, а также с клиническим материалом от кошек и птиц, выбранные праймеры обеспечивали выявление порядка 0,1 пг ДНК или 10-100 хламидийных телец/мл. Следовательно, праймеры на основе МОМР обеспечивают высокую чувствительность реакции. Этот вывод совпадает с мнением ряда авторов, таких как РавтиБвеп Б.и. е1 а1., 1991; В.КаКепЬоеск а1., 1992; 1993; ГМ.ЭЬееЬу е! а!., 1996 и т.д. (191; 192; 193; 275)

В настоящее время ПЦР применяется для детекции большей части патогенных микроорганизмов. Однако при работе с клиническим материалом исследователь сталкивается с рядом сложностей, которые заключаются в наличии веществ, ингибирующих реакцию и повреждающих ДНК-мишень.

Поэтому следующая задача заключалась в выборе и оценке соответствующих способов подготовки проб на штаммах и клиническом материале, т.к. чувствительность ПЦР-анализа при установленных оптимальных параметрах реакции зависит от процедуры подготовки исследуемого материала, включающей экстракцию ДНК-мишени и очистку пробы от веществ, ингибирующих ДНК-полимеразу (182). Для этого были выбраны несколько принципиально отличительных подходов, используемых в настоящее время различными исследователями для очистки тестируемого материала и выделения ДНК: 1) щелочной лизис с фенол-хлороформовой экстракцией и осаждением ДНК этанолом; 2) лизис неионными детергентами с протеиназой К; 3) лизис гуанидинтиоционатом с нуклеосорбцией на силикагеле.

После тестирования пяти штаммов С.рвМаа и С.ресошт было сделано заключение, что все указанные выше способы подготовки проб обеспечивают одинаковый уровень чувствительности - 10 м.к./см3. Однако, чтобы иметь полное представление об эффективности данных методов очистки ДНК-матриц необходимо было исследовать хламидии в патологическом материале. ПЦР проводили с праймерами ОЫ-ОЬЗ. При сравнивании различных способов подготовки клинических проб (соскобы со слизистой глаза и клоаки), наилучшие результаты получены при использовании методов нуклеосорбции с гуанидинтиоционатом. Однако при использовании нукпеосорбента с частицами силикагеля размером 0,5-10 мкм (II) чувствительность метода наиболее высокая, а при использовании нукпеосорбента с частицами силикагеля размером 2-10 мкм (I) - гораздо ниже. Следовательно, это свидетельствует о неодинаковой сорбционной активности испытанных марок силикагеля в отношении фрагмента гена МОМР, являющийся в данном случае ДНК-мишенью. Поэтому, очевидно, что нуклеосорбент (II) обеспечивает лучшую сорбцию за счет более оптимального размера частиц (0,5-10 мкм). Способ подготовки проб с помощью фенол-хлороформовой экстракции и осаждения нуклеиновых кислот этанолом был недостаточно эффективным, что наблюдалось в получении трех ложноотрицательных результатах, видимо вследствие возможности ингибирования реакции остатками фенола и потере ДНК на этапе преципитации. Также в одном случае способ подготовки проб, основанный на применении лизирующих буферов с протеиназой К, оказался неэффективным.

Таким образом, в результате тестирования известных способов подготовки биологического материала для ПЦР, исследуемого на наличие C.psittaci, было установлено, что при обработке соскобов с конъюнктивы у кошек и клоаки у птиц наилучшие результаты были получены при использовании гуанидинтиоционата с нуклеосорбентом (II).

В процессе выполнения настоящей работы, исследование материала от животных проводили методом ПЦР в сравнении с традиционными подходами: культуральным методом, методом ПИФ, окраской по Романовскому-Гимзе и РСК. Полученные результаты позволили охарактеризовать диагностическую чувствительность и специфичность данных подходов. Так, чувствительность морфологического метода составила - 40%, культурального - при первичном высеве 67%, иммунологического - 93%, РСК - 29% и ПЦР -100%. Наши результаты совпадают с данными по изучению чувствительности и специфичности различных диагностических тестов, полученными такими авторами как П. Вяянанен, 1987; C.M.Black, 1997 и т.д. (12; 92)

Таким образом, впервые в РФ проведен ПЦР-анализ по выявлению хламидийной инфекции у животных, обладающий более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с другими общепринятыми методами. Подобранные праймеры, оптимизация условий ПЦР и этап подготовки проб взяты за основу при конструировании диагностических ПЦР-тест-систем для детекции Chlamydia и идентификации C.psittaci, C.pecorum.

Использование данных препаратов в ветеринарной лабораторной практике даст реальную возможность в короткие сроки (всего за 3-4 часа) при относительно не сложной методике обнаруживать наличие ДНК хламидий в исследуемом материале. Широкое распространение, разнообразие хламидийных инфекций, возможность носительства и длительное персистирование возбудителя инфекции определяют необходимость проведения мониторинга за различными штаммами разных видов хламидий, включающее их типирование с целью определения путей распространения инфекции и прогнозирования потенциальной опасности для человека и животных. Общепринятые методы диагностики и типирования хламидий, основанные на фенотипическом выражении биологических свойств, не всегда дают объективную характеристику циркулирующих в природе штаммов. Так, например серотипирование часто не позволяет проводить внутривидовую дифференциацию штаммов C.psittaci и C.pecorum по ряду причин. Серотип определяется поверхностными антигенами, подверженными изменчивости. Смена антигенного состава приводит к появлению штаммов, для которых не разработаны серотиповые сыворотки, поэтому современная микробиология использует специфические методы молекулярной биологии, которые могут по-новому раскрыть структурные особенности клетки и механизмы распространения патогенных микроорганизмов. В связи с этим, в диагностике и наблюдении за рядом инфекций широкое распространение получили молекулярно-генетические методы, характеризующие возбудителей инфекционных заболеваний по особенностям нуклеотидного состава ДНК, вне зависимости от проявления биологических свойств. Поэтому наши дальнейшие исследования заключались в адаптации метода генотипирования - рестрикционного анализа ампликонов, полученных в результате проведения ПЦР и изучения возможности его применения для внутривидовой дифференциации штаммов хламидий.

В рестрикционном анализе штаммовые различия определяли по характеру расщепления продуктов ПЦР специфическими эндонуклеазами, специально подобранными для этих целей. Генотипирование с помощью рестрикционного анализа штаммов С.рв^аа, выделенных от разных видов животных показало, что полученные рестрикты не всегда совпадали с построенными теоретическими рестрикционными картами и имели отличия. Так, штаммы К-8 и Калининский, были близки к теоретической карте штамма В 577, однако отличались отсутствием нескольких полос на уровне 100-50 п.н.

Также были исследованы штаммы К-1 и Рерп. При тестировании этих штаммов С.рв^аа получены гомологичные рестриктные карты.

При рестрикции шести штаммов хламидий (66Р130, 171 OS, L71, Fepn, В577, 6ВС) показано, что популяция С.psittaci гетерогенна по генетической структуре.

Полученные результаты согласуются с данными других авторов (193, 295) и свидетельствуют, что рестрикционный аназиз в целом отражает структуру генома бактериальной клетки и является одним из необходимых инструментов для внутривидового типирования для получения объективной оценки за циркулирующими штаммами микроорганизмов.

В заключение, хотелось бы отметить, что внедрение в лабораторную практику молекулярно-биологических методов диагностики и типирования даст возможность микробиологам изучать и другие инфекционные агенты. Метод уже получил широкое распространение и успешно зарекомендовал себя в ветеринарной практике при обнаружении Mycobacterium bovis и tuberculosis, Brucella sp., Listeria monocitogenes, Mycoplasma sp. и т.д. Использование ПЦР-анализа в диагностических ветеринарных лабораториях обеспечит быструю и объективную постановку диагноза, что приведет к своевременной и эффективной терапии и научно-обоснованной профилактике разных инфекционных заболеваний. Не вызывает сомнения, что в ближайшем будущем молекулярно-биологические методы займут одно из ведущих мест в диагностике инфекционных заболеваний и в системе эпизоотологического надзора.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Обухов, Игорь Леонидович, 2000 год

1. Абрамова Л.Н., Оболадзе Д.Б., Терских И.И. Характеристика хламидий, выделенных от домашних животных. - Вопр. вирус. 1975, 6, 727-739

2. Андерсон Т. Метод негативного контрастирования и его использование при изучении вирусов и их серологических реакций. - В кн.: Ультраструктура и функция клетки. - М., Мир, 1965, 143 стр.

3. Бабич М.А. Физико-химические методы контроля ингредиентов, питательных сред и биопрепаратов. - М., 1970, 128-129

4. Болотовский В.М, Ратушкина Л.С. Сравнительное действие некоторых антибиотиков на вирус орнитоза в опытах на животных. - Вопр. вирусол., 1959, 6, 710-713

5. Болотовский В.М. Устойчивость вирусов орнитоза - пситтакоза к действию физико - химических агентов. - Вопросы вирусологии, 1959, 1, 63-67

6. Бортничук В.А. Хламидиоз свиней. - Киев, 1991, 191 стр.

7. Брагина Е.Е., Орлова O.E., Дмитриев Г.А. Некоторые особенности жизненного цикла хламидий. Атипичные формы существования (обзор литературы). - Заболевания, передающиеся половым путем, 1998, 1, 3-9

8. Валентайн Р., Хорн Р. Негативное конструирование как метод выявления ультраструктуры. - В кн.: Ультра структура и функция клетки. - М., Мир, 1965, 150 стр.

9. Вишнякова Л.А. Орнитоз. - В кн.: Лабораторные исследования в эпидемиологической практике: (зооантропонозы). - Л., 1976, 86-100

10. Вустина У.Д. Анализ заболеваемости пушных зверей в хозяйствах Казахского потребсоюза. - В кн.: Биология и патология пушных зверей. Петрозаводск, 1981, 263 стр.

11. Вустина У.Д., Воробьева В.Я. Источники инфекции клеточных пушных зверей. - В кн.: Экспресс-информация Казахского НИИНТИ. - Алма-Ата, 1979, 1-10

12. Вяянанен П. Диагностика хламидийных инфекций. - В сб: Диагностика и лечение хламидийных инфекций. - М., 1987, 9-19

13. Глазкова Л. К. Совершенствование методов терапии женщин, больных урогенитальным хламидиозом, на основании изучения патогенетической роли нарушений в универсальных системах регуляции. - Автореф. докт. дисс., М., 1992

14. Голубев Д.Б., Сомина A.A. Руководство по применению культур клеток в вирусологии. - Л., Медицина, 1976, 17-30

15. Дзагуров С.Т. Пути совершенствования средств специфической профилактики инфекционных болезней в связи с проблемой биологической стандартизации. Стандарты, штаммы и методы контроля вирусных бактерийных препаратов и аллергенов. - М., Медицина, 1975, 3-10

16. Калугина И.А. Дис. кандидата биологических наук, 1992.

17. Калугина И.А., Караваев Ю.Д., Кекух И.Г. Адаптация хламидий к различным клеточным культурам. - Бюлл. ВИЭВ, 1991, 77-78, 31-33

18. Караваев Ю.Д. Хламидиозный аборт овец (этиология, диагностика и специфическая профилактика). - Автореф. докт. дисс., М., 1987

19. Караваев Ю.Д., Налетов Н.И., Калугина И.А. Хламидиозы -меры борьбы и профилактика. - Вет. Газета, 1994, 26, 4

20. Ковалев В.Л., Андреева Р., Степанова С. Дикие животные -резервенты возбудителей хламидий. - В кн.: Вопросы природной очаговости болезней. - Алма-Ата, 1978, 9, 139- 143

21. Кротов С.А., Кротова В.А., Юрьев С.Ю. Хламидиозы: эпидемиология, характеристика возбудителя, методы лабораторной диагностики, лечение генитального хламидиоза. -Реферативное сообщение, Кольцово, 1998, 63 стр.

22. Мейер К., Беди Б. Группа пситтакоза - венерической лимфогранулемы. - М., Медицина, 1964, 603-639

23. Митрофанов П.М. Клиника и патогенез хламидиоза. -Ветеринария, 1980, 6, 37

24. Оболадзе Д.Б. Инструктивно - методические указания по профилактическим и эпизоотологическим мероприятиям при хламидийных инфекциях. - Сабчота Сакартвело, Тбилиси, 1981

25. Обухов И.Л. Диагностика хламидийных инфекций у кошек. -Ветеринария, 1996, 5, 49-50

26. Обухов И.Л. Лабораторные исследования конъюнктивальной флоры у кошек с конъюнктивитами. -Сборник научных трудов ВГНКИ, 1995, 57, 51-56

27. Обухов И.Л. Молекулярный механизм паразитизма хламидий и их внутриклеточное развитие (обзор иностранной литературы). - Сельскохозяйственная биология, 1997, 2, 86-98

28. Обухов И.Л. Обнаружение Chlamydia psittaci при конъюнктивитах у собак. - Сборник научных трудов ВГНКИ, 1995, 57, 45-51

29. Обухов И.Л. Перитональные хламидийные болезни у кошек. - Сборник научных трудов ВГНКИ, 1996, 59, 18-21

30. Обухов И.Л. Хламидийные инфекции у животных и птиц. -Ветеринария, 1996, 10, 19-26

31. Обухов И.Л. Хламидиоз кошек. - М., 1994, 95 стр.

32. Обухов И.Л. Хламидиоз кошек: этиология, клиническая картина, диагностика, лечение и профилактика. - Сб. материалов конференции: "Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных". -С-Петербург, 1997, 13-21

33. Обухов И.Л., Панин А.Н., Груздев К.Н. Механизмы иммунитета при хламидийных инфекциях. Сельскохозяйственная биология, 1997, 4, 103-116

34. Обухов И.Л., Шипулин ПА., Груздев К.Н., Панин А.Н. -Использование полимеразной цепной реакции для определения видов хламидий. Доклады РАСХН, 1997, 1, 44-45

35. Обухов И.Л., Груздев К.Н., Кумалагова К.И. Штамм Chlamydia psittaci, используемый для изготовления инактивированной вакцины против хламидиоза кошек и пушных зверей. - Патент РФ № 2122579 от 27.11.1998 г.

36. Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекторский В.В. -Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. М., Медицина, 1987, 269 стр.

37. Оболадзе Д.Б. Инструктивно - методические указания по профилактическим и эпизоотологическим мероприятиям при хламидийных инфекциях. - Сабчота Сакартвело, Тбилиси, 1981

38. Огнянов П. Принос проучзане при вирусния аборт по овцете у нас. - Цент. НИИ ветер, инстр. по вирус., 1960, 2, 31-34

39. Осидзе Д.Ф. Получение культур клеток из тканей животных и их использование в вирусологии. - М., 1975

40. Орлова O.E., Шаткин A.A. Модели персистентной хламидийной инфекции в культурах клеток L-929 и McCoy. -Хламидийные инфекции. - М., 1986, 20-26

41. Панкратова В.Н. Хламидиозы человека и животных. - М., 1979, 1, 47-49

42. Покровский В.И., Гнутов И.Н. О генерализованной форме хламидиоза зоонозной природы у людей. - В сб.: Хламидии (гальпровии) и хламидиозы, под ред. Шаткина A.A. - М., 1982, 23-25

43. Попов В.Л. Облигатный внутриклеточный паразитизм прокариотов. - Автореф. дис. докт. биол. наук, М., 1995

44. Попов Г. Метод заполучоване на концентриране и пречистенавакцина срежу хламедфйния аборт на овцецете и приложениете и на морски свинчета. - Ветеринарно-медицински науки, 1983, 20, 1, 9-16

45. Равилов Р.Х. Хламидиоз пушных зверей. - Актуальные проблемы интенсификации животноводства в исследованных мол. уч. - Троицк, 1991, 28

46. Равилов Р.Х. Химиотерапевтическая активность антибиотиков тетрациклинового ряда и сульфаниламидов, при экспериментальном хламидиозе пушных зверей. - Научные основы технологии промышленного производства вет. биол. препаратов. - Щелково, 1996, 151-152

47. Равилов Р.Х. Хламидийные инфекции домашних плотоядных. - Материалы 2 респ. научной конференции молодых ученых и специалистов. - Казань, 1996. 2, 54

48. Равилов Р.Х. Хламидиоз плотоядных животных. -Автореферат диссертации на соскание ученой степени доктора ветеринарных наук. - Казань, 1999

49. Равилов Р.Х. Хламидиоз пушных зверей. - Актуальные проблемы вет. мед. мелких домашних животных на Северном Кавказе. - Персиановский, 1998, 46-47

50. Равилов Р.Х. Экспериментальная хламидийная инфекция у норок. - Материалы научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. - Казань, 1996, 30

51. Равилов Р.Х., Хамадеев Р.Х., Алимов A.M. Противоэпизоотические мероприятия при хламидиозахклеточных пушных зверей. Актуальные вопросы ветеринарной медицины и экологии. - Калининград, 1998

52. Равилов Р.Х., Хамадеев Р.Х., Хусаинов Ф.М. Специфическая профилактика хламидийных инфекций плотоядных. Актуальные проблемы вет. мед. мелких домашних животных на Северном Кавказе. - Персиановский, 1998, 25-26

53. Равилов Р.Х., Шафикова P.A., Бобрышев К.П. Изучение эксперементального хламидиоза серебристо-черных лисиц. -Теоретические и практические вопросы ветеринарии и зоотехнии. - Казань, 1989, 5-6

54. Равилов Р.Х., Шафикова P.A., Бобрышев К.П. -Хламидиозный аборт пушных зверей. Эпизоотология, эпидимиология, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней общих для человека и животных. - Львов, 1988, 118-119

55. Равилов Р.Х., Шафикова P.A., Равилов А.З., Сафин М.А. -Хламидиозный аборт серебристо-черных лисиц Ветеринария, 1994, 4, 22-26

56. Равилов Р.Х., Бобрышев К.П., Хазипов Н.З. Хламидиоз серебристо-черных лисиц. - Профилактика туберкулеза крупного рогатого скота. - Казань, 1984, 93-95

57. Равилов Р.Х., Садриев А.Р. Хламидиоз домашних плотоядных. - Актуальные проблемы вет. мед. мелких домашних животных на Северном Кавказе. - Персиановский, 1998, 13-14

58. Равилов Р.Х., Садриев А.Р. Хламидиоз собак и кошек. -Материалы юбилейной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 1998, 417-418

59. Равилов Р.Х., Хамадеев Р.Х., Хусаинов Ф.М. Разработка полиштаммовой вакцины для специфической профилактики хламидиозов плотоядных. - Материалы научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. - Казань, 1997, 40

60. Ременцова М.М., Постричева О.В., Рыбалко С.И. -Антропозоонозы в звероводческих хозяйствах. Алма-Ата, Наука, 1983, 92-96

61. Руководство по зоонозам. Под ред. Покровского В.И. - Л., 1983, 134-140

62. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. -Под ред. В.И.Покровского. М., 1993, 1, 357-366

63. Савичева A.M., Башмакова М.А. Урогенитальный хламидиоз у женщин и его последствия. - Под ред. Э.К.Айламазяна. - Н.Новгород, НГМА, 1998, 182 стр.

64. Сюрин В.Н. Устойчивость вирусов к физико-химическим воздействиям и принципы изготовления инактивированных вакцин. - М., Московская ветеринарная академия, 1968, 68

65. Терских И.И. Орнитоз в СССР (этиология и эпидемиология). - Автореф. докт. дисс. - М.,1957

66. Терских И.И. Орнитоз и другие хламидийные инфекции. -М., 1979, 223 стр

67. Терских И.И., Заде М.Д. Роль хламидий при хронических почечных и урогенитальных заболеваний человека. - Вопр. Вирусологии, 1976, 3, 345-349

68. Хазипов Н.З., Равилов А.З. Хламидиозы сельскохозяйственных животных. - М., Колос, 1984, 223 стр.

69. Шаткин А.А. Исторические и эпидемиологические аспекты хламидийных инфекций в СССР. - Актуал. микробиол. и клин, пробл. хламидийных инфекций, 1990, 5-8

70. Шаткин А.А. Основные принципы лабороторной диагностики гальпровиозов (хламидиозов). - В сб.: Гальпровиозы (хламидиозы) человека и животных. - М., 1979, 1, 26-35

71. Шаткин А.А. Трахома. Этиология и этиотропное лечение. -П., Медицина, 1965

72. Шаткин А.А. Хламидии и хламидиозы. - Медицина, 1982, 78

73. Шаткин А.А., Мавров И.И. Урогенитальные хламидиозы. -Киев, 1983, 217 стр.

74. Эб Ф. Антигены Chlamydia trachomatis. - Актуальные микробиологические и клинические проблемы хламидийных инфекций. - Сб. трудов под ред. Шаткина А.А., Орфиды Ж.-М., 1990, 26-27

75. Alexander J. Separation of protein synthesis in meningopneumonitis agent from that in L cells by differential susceptibility to cycloheximide. - J.Bact., 1968, 95, 327-332

76. Andersen A.A. Serotyping of Chlamydia psittaci isolated using serovar-specific monoclonal antibodies with themicroimmunofluorescence test, J.CIin.Vicrobiol., 1991, 29, 707711

77. Arizmendi F., Grimes. J. , Relford. R. J.Vet.Diagnostic Investigation, 1992, 4, 460

78. Bader J.P., Morgan H.R. Latent viral infection of cells in tissue culture: Abortive infection with psittacosis virus. Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 1961, 106, 311-313

79. Bader J.P., Morgan H.R. Latent viral infection of cells in tissue culture: Role of water-soluble vitamins in psittacosis virus propagation in L cells. - J.Exp.Med., 1961, 113, 271-281

80. Baehr W., Zhang Y.-x., Joseph T., Su H., Nano F.E., Everett K.D.E., Caldwell H.D. Mapping antigenic domains expressed by Chlamydia trachomatis major membrane protein genes. -Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1988, 85, 4000-4004

81. Baker J.A. Virus obtained from pneumonia of cats and its possible relation to cause of atypical pneumonia in man. - Science, 1942, 96, 475

82. Bankowski R.A. Chlamydiosis. - Proc.Us Anim Health Assoc., 1986, 90, 293-303

83. Banks J., Eddie B., Schachter J., Meyer K.F. Plaque formation by Chlamydia in L cells. - Infect.Immun., 1970, 1, 259-262

84. Barron A.L., White H.J., Rank R.G., Soloff B.L. Target tissues associated with genital infection of female guinea pigs by the chlamydial agent of guinea pig inclusion conjunctivitis. -J.lnfect.Dis., 1979, 139, 60-68

85. Batteirger B.E., Wilbert J.N., Robrt B.J. Differences in outer membrane proteins of lymphogranuloma venereum and trachomabiovar of Chlamydia trachomatis. Infect.Immun., 1985, 50, 488494

86. Bavoil P., Ohlin A., Schachter J. Role of disulfide bonding in outer membrane structure and permeability in Chlamydia trachomatis. - Infect.lmmun., 1984, 44, 479-485

87. Becker Y., Asher Y. Obligate parasitism of trachoma agent: Lack of trachoma development in ethidium bromide-treated cells. -Antimicrobiol.Agents Chemother., 1972, 1, 171-173

88. Black C.M. Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections. - Clin.Microbiol.Reviews, 1997, 160-184

89. Blake F.G., Howard M.E. Felain pneumonitis and its possible relation to some cases of primary atypical pneumonia in man. - Yale J.Biol.Med., 1942, 15, 139-166

90. Bland J.O.W., Canti G. The growth and development of psittacosis virus in tissue culture. - J.Pathol.Bact., 1935, 40, 231241

91. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M. et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. - J.Clin.Microbiol., 1990, 28, 495-503

92. Brade H., Brade L., Nano F.E. Chemical and serological investigations on the genus-specific lipopolysaccharide epitope of Chlamydia. - Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1987, 84, 2508-2512

93. Brade H., Bruner H. Serological crossreactions between Acinetobacter calcoaceticus and Chlamydia. - J.Clin.Microbiol., 1979, 10, 819-822

94. Brade L., Schramek S., Shade U., Brade H. Chemical, biological, and immunological properties of the Chlamydia psittaci lipopolysaccharide. - Infect.lmmun., 1986, 54, 568-574

95. Brenner S., Home R.W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. - Biochem.et Biophys.Acta, 1959, 34, 103

96. Burch G.R.,York D.C., Johpston P., Maer K. Feline Pneumonitis Vaccine. - Allied Vet., 1958, 29, 4-7

97. Burnet F.H., Rountree P. M. Psittacosis in the developing egg. -Path.Bact., 1935, 40, 471-481

98. Bushell A.C., Hobson D. Effect of Cortisol on the growth of Chlamydia trachomatis in McCoy cells. - Infect.lmmun., 1978, 21, 946-953

99. Byrne G.I. Host cell relationships. - In: Microbiology of Chlamydia. - A.L.Barron (Ed.), CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1988, 135-150

100. Caldwell H.D., Hitchcock P.J. Monoclonal antibody against a genus-specific antigen of Chlamydia species: Location of the epitope on Chlamydia lypopolysaccaride. - Infect.lmmun., 1984, 44, 306-309

101. Caldwell H.D., Kromhout J., Schachter J. Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. - Infect.lmmun., 1981, 31, 1161-1176

102. Caldwell H.D., Kuo C.-c. Purification of a Chlamydia trachomatis specific antigen by immunoadsorbtion with monospecific antibody. - J.Immunol., 1977, 118,437-441

103. Campbell L.A., Kuo C.-c., Grayston J.T. Characterization of the new Chlamydia agent, TWAR, as a unique organism by restriction endonuclease analysis and DNA-DNA hybridization.

104. J.Clin.Microbiol., 1987, 25, 1911-1916

105. Carter M.W., Al-Mandawi S.A.H., Giles I.G., Treharne J.D., Ward M.E., Clarke I.N. Nucleotide sequence and toxonomic value of the major outer membrane protein gene of Chlamydia pneumoniae IOL-207. - J.Gen.Microbiol., 1991, 137, 465-475

106. Cello R. M. Microbiological and immunologic aspects of feline pneumonitis. - J.Am.Vet.Med.Assoc., 1971, 158, 932-938

107. Cello R. M. Ocular infection in animals with PLT (Bedsonia) group agents. - Am.J.Ophthalmol., 1967, 63, 1270-1273

108. Cello R.M. Association of pneumonia - like organisms with conjunctivitis of cats. - Am.J.Ofhthal., 1957, 43, 296-299

109. Cello R.M., Mauris C. A Controlled Study of the Efficacy of a Commercial Feline Pneumonitis Vaccine. - University of California, Dauis, Calif., Unpublished data, 1970

110. Cerrone M.C., Ma J.J., Stephens R.S. Cloning and sequence of the gene for heat shock protein 60 from Chlamydia trachomatis and immunological reactivity of the protein. - Infect.Immun., 1991, 59, 79-90

111. Chang J.-j., Leonard K., Arad T., Pitt T., Zhang Y.-x., Zhang L.-h. Structural studies of the outer envelope of Chlamydia trachomatis by electron microscopy. - J.Mol.Biol., 1982, 161, 579-590

112. Chanock R.M., Murphy B.R. Live viral vaccines for respiratory and enteric tract diseases. - Vaccine, 1988, 6, 129-133

113. Chernesky M.A., Mahony J.B., Castriciano S. et al. Detection of Chlamydia trachomatis antigens by enzyme immunoassay and immunofluorescence in genital specimens from symptomatic and asymptomatic men and women. - J.lnfect.Dis., 1986, 154, 141-148

114. Chi E.Y., Kuo C.-c., Grayston J.T. Unique ultrastructure in the elementary body of Chlamydia sp. strain TWAR. - J.Bacterid., 1987, 169, 3757-3763

115. Cles L.D., Bruch K., Stamm W.E. Staining characteristics of six commersially available monoclonal immunofluorescence reagent for direct diagnosis of Chlamydia trachomatis infections.

116. J.Clin.Microbiol., 1988, 26, 1735-1737

117. Corcish J.D., Bevan B.J. Diagnosis of psittacosis. - Vet.Res., 1991, 12, 42-43

118. Costerton J.W., Poffenroth L., Wilt J.C., Kordova N. -Ultrastructural studies of the nucleoids of the pleiomorphic forms of Chlamydia psittaci 6BC: A comparison with bacteria. Can.J.Microbiol., 1975, 22, 16-28

119. Cox R.L., Kuo C.-c., Grayston J.T., Campbell L.A. -Deoxyribonucleic acid relatedness of Chlamydia sp. strain TWAR to Chlamydia trachomatis and Chlamydia psittaci. Int.J.Syst.Bacterid., 1988, 38, 265-268

120. Cutting J.A. Chlamydiosis in the cat: antibodies and immunity. -Veterinary Reports, published by Solvay Animal Health, 1990, 5, 35

121. Danilition S.L., Maclean I.W., Peeling R., Winston S., Brunham R.C. The 75 kD protein of Chlamydia trachomatis', a member of the heat shock protein 70 family. - Infect.lmmun., 1990, 58, 189-196

122. Darougar S. M., Monnickendam M. A., El-Sheikh H., Treharne J. D. Animal model for the study of chlamydial infection of the eye and genital tract. - Am.Society for Microbiology, 1977, 186-198

123. Daugharty H., Messmer T.O., Fields B.S. ELISPOT assay for chlamydia-specific, antibody-producing cells correlated with conventional complement fixation and microimmunofluorescence. -J.Clin.Lab.Anal., 1997, 11, 45-52

124. Dennis M.W., Storz J. Infectivity enhancement of Chlamydia psittaci of bovine and ovine origin for cultured cells. -Am.J.Vet.Res., 1982, 43, 1897-1901

125. Dhir S.P., Kenny G.E., Grayston J.T. Characterization of the group antigen of Chlamydia trachomatis. - Infect.lmmun., 1971, 4, 725-730

126. Dickie C.W., Sniff E.S. Chlamydia infection associated with peritonitis in a cat. - J.Am.Vet.Met.Assoc., 1971, 176, 2, 1256-1259

127. Doughri A.M., Altera K.P., Storz J. Host cell range of chlamydial infection in the neonatal bovine gut. - J.Comp.Path., 1973, 83, 107114

128. Engel J.N., Ganem D. A polymerase chain reaction-based approach to cloning sigma factors from eubacteria and its application to isolation of a sigma-70 homolog from Chlamydia trachomatis. - J.Bacterid., 1990, 172, 2447-2455

129. Engel J.N., Ganem D. Chlamydial rRNA operons: gene organization and identification of putative tandem promoters. -J.Bacterid., 1987, 169, 5678-5685

130. Everett K.D.E., Hatch T.P. Sequence analysis and lipid modification of the cystein-rich envelope proteins of Chlamydia psittaci 6BC. - J.Bacterid., 1991, 173, 3821-3830

131. Fan V.S.C., Jenkin H.M. Biosynthesis of phospholipids and neutral lipids of monkey kidney cells (LLC-MK-2) infected with Chlamydia trachomatis strain lymphogranuluma venereum. -Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 1975, 148, 351-358

132. Fernando N.V., Erkel C.A., Movat H.Z. The fine structure of connective tissues. - Exp.Mol.Path., 1964, 3, 535

133. Francis T., Jr., Magill T.P. An unidentified virus producing acute meningitis and pneumonitis in experimental animals. - J.Exp.Med., 1983, 68, 147-160

134. Fraser G., Norval J., Withers A., Gregor W. Vet.Rec., 1969, 85, 54

135. Friis R.R. Interaction of L cells and Chlamydia psittaci: Entry of the parasite and host responses to its development. - J.Bacterid., 1972, 110, 706-721

136. Fu F., Baumann M., Kosma P., Brade L., Brade H. A synthetic glycoconjugate representing the genus-specific epitope of chlamydial lipopolysaccharide exhibits the same specificity as its natural counterpart. - Infect.Immun., 1992, 60, 1314-1321

137. Fukuchi H., Ogawa H., Ninamoto N., Hashimoto N., Yagami K., Tamura H., Shimakura S., Hirai K. Seroepidemiological surveillance of C. Psittaci in cats and dogs in Japan. - Vet.Rec., 1985, 117, 19, 503-504

138. Fukushi H., Hirai K. Genetic diversity of avian and mammalian Chlamydia psittaci strains and relation to host origin. - J.Bacteriol., 1989, 171, 2850-2855

139. Fukushi H., Hirai K. Immunochemical diversity of the major outer membrane protein of avian and mammalian Chlamydia psittaci. - J.Clin.Microbiol., 1988, 26, 675-680

140. Fukushi H., Hirai K. Proposal of Chlamydia pecorum sp. nov. for Chlamydia strains derived from ruminants. - Int.J.Syst.Bact., 1992, 42, 306-308

141. Fukushi H., Nojiri K., Hirai K. Monoclonal antibody typing of Chlamydia psittaci strains derived from avian and mammalian species. - J.Clin.Microbiol., 1987, 25, 1978-1981

142. Gallard E.T., Hargis A.M., Prieur D.J., Evermann J.F., Dhillon P.S. Pathogenesis of feline gastric chlamydial infection. - Am.J. Vet.Res., 1984, 49, 11, 2314-2321

143. Gaskell R.M. An update on feline upper respiratory disease (URD). - Vet.Annual., 1986, 26, 318-323

144. Gaskell R.M. Vaccination of the young kitten. - J.Vet.Res., 1989, 30, 618-624

145. Gerbermann H., Jakoby J.R., Kosters J. Chlamydienbefunde aus einer gröberen Geifvogelhaltung. - J.Vet.Med., 1990, 37, 738739

146. Gerbermann H., Janeczek F. Chlamydiose bei Vogein: gegenwartige Situation und alternativen der Diagnose und Bekämpfung. - Pract.Tierarzt, 1991, 6, 521-528

147. Gethings P.M., stephens G.L., Wills J.M., Howard P., Dalfour A.H., Wright A.J., Morgan K.L. Prevalence of Chlamydia, Toxoplasma, Toxocara and Ringworm in farmcats in south-west England. - Vet.Ree., 1987, 5, 213-216

148. Gonnert R. Die Bronchopneumonie, eine neue Viruskrankheit der Maus. - Zentbl.Bakt.l.Orig., 1941, 147, 161-174

149. Gordon F.B., Dressler H.R., Quan A.L., McQuilkin W.T., Thomas J.l. Effect of ionizing irradiation on susceptibility of McCoy cell cultures to Chlamydia trachomatis. - Appl.Microbiol., 1972, 23, 123129

150. Gordon F.B., Quan A.L. Occurrence of glycogen in inclusions of the psittacosis lymphogranuloma venereum-trachoma agents. -J.Infect.Dis., 1965, 115, 186-196

151. Grayston J.T., Kuo C.-c., Campbell L.A., Wang S.-p. Chlamydia pneumoniae sp. nov. for Chlamydia sp. strain TWAR. -Int.J.Syst.Bacterid., 1989, 39, 88-90

152. Grayston J.T., Kuo C.-c., Wang S.-p., Altman J. A new Chlamydia psittaci strain, TWAR, isolated in acute respiratory tract infections. - N.Engl.J.Med., 1986, 315, 161-168

153. Grayston J.T., Wang S.P. New knowledge of Chlamydiae and the diseases they cause. - J.lnf.Dis., 1975, 132, 87-105

154. Gregory W.W., Byrne G.I., Gardner M., Moulder J.W. -Cytochalasin B does not inhibit ingestion of Chlamydia psittaci by mouse fibroblasts (L cells) and mouse peritoneal macrophages. -Infect.Immun., 1979, 25, 463-466

155. Gresham A. C. J., Dixon C. E., Bevan B. J. Domiciliary outbreak of psittacosis in dogs: potential for zoonotic infection. -Veterinary Record, 1996, 138, 622-623

156. Hackstadt T., Baehr W., Ying Y. Chlamydia trachomatis developmental^ regulated protein is homologous to eukaryotic histone H1. - Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1991, 88, 3937-3941

157. Hanelaer J.R., Derore A., Boucherie P., Mattheeuws D. -Demonstration of Chlamydia psittaci in feline conjunctivitis cases in Bekgium. Vlaams Diergeneeskg.Tijdschr., 1989, 58, 165- 168

158. Hanna I., Dawon C., Briones O., Thygeson P., Jawetz E. -Latency in human infections with the TRIC agents. J.lmmun., 1968, 101, 43-50

159. Harrison M.J. Enhancing effect of DEAE-dextran on inclusion counts of an ovine Chlamydia (Bedsonia) in cell culture. -Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci., 1970,48, 207-213

160. Harshbarger J.C., Chang S.C., Otto S.V. Chlamydiae (with phages), mycoplasmas, and rickettsiae in Chesapeake Bay bivalves. - Science, 1977, 196, 666-668

161. Hatch T.P. Competition between Chlamydia psittaci and L cells for host isoleucine pools: A limiting factor in chlamydial multiplication. - Infect.lmmun., 1975, 12, 211-220

162. Hatch T.P. Utilization of L-cell nucleoside triphosphates by Chlamydia psittaci for ribonucleic acid synthesis. - J.Bacteriol., 1975, 122, 393-400

163. Hatch T.P., Al-Hossainy E., Silverman J.A. Adenine nucleotide and lysine transport in Chlamydia psittaci. - J.Bacteriol., 1982, 150, 662-670

164. Hatch T.P., Allan I., Pearce J.H. Structural and polypeptide differences between envelopes of infective and reproductive life cycle forms of Chlamydia spp. - J.Bacteriol., 1984, 157, 13-20

165. Hatch T.P., Dale W.V., Alhossainy E. Identification of a major envelope protein in Chlamydia spp. - J.Bacteriol., 1981, 146, 426429

166. Hatt C., Ward M.E., Clarke I.N. Analysis of the entire nucleotide sequence of the cryptic plasmid of Chlamydia trachomatis serovar L1. Evidence for involvement in DNA replication. - Nucleic Acids Res., 1988, 16, 4053-4067

167. Herring A.J. Typing Chlamydia psittaci - a review of methods and recent findings. - Br.Vet.J., 1993, 149, 455-475

168. Hewinson R.G., Griffiths P.C., Rankin S.E.S. Towards a differential polymerase chain reaction test for Chlamydia psittaci. -Vet.Tec., 1991, 128, 381-382

169. Higashi N., Tamura A. A plaque assay for meningopneumonitis virus in monolayers of strain L cells. - Virology, 1960, 12, 578-588

170. Hill B.J., Brien S. Feline Viralupper reapiratory deseases. - Iowa state Univer.Veter., 1984, 46, 97-100

171. Hodinka R.L., Wyrick P.B. Ultrastructural study of mode of entry of Chlamydia psittaci into L-929 cells. - Infect.Immun., 1986, 54, 855-863

172. Holland S.M., Gaydes C.A., Quinn T.C. Detection and differention of Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae by DNA amplification. - J.Infect.Dis., 1990, 162, 984-987

173. Holzworth J. Naturally occuring upper respyratory infection cats. - J.Am.Vet.Med.Assoc., 1971, 158, 964-968

174. Hoover E.A., Kahn D.E., Langloss J.M. Experimentally induced feline chlamydial infection. - Am.J.Vet.Res., 1978, 39, 14, 541- 547

175. Innis M.A. et a\. PCR-protocols. - Academic Press, Inc, N.Y., 1990

176. Jawetz B. Seasonal insuoceptility of embriiionated eggs to viruses of Trachoma and Inclusion conyunctivitis. - Annals of the New York Academy, Sciences, 1962, 98, 31-37

177. Johnson F.W. Isolation of Chlamydia psittaci from nasal and conjunctival axudate of a domestic cat. - Vet.Res., 1984, 114, 342344

178. Johnson F.W.A. Chlamydiosis. - Brit.J.Vet, 1983, 139, 93

179. Joseph T., Nano F.E., Garon C.F., Caldwell H.D. Molecular characterization of Chlamydia trachomatis and Chlamydia psittaci plasmids. - Infect.Immun., 1986, 51, 699-703

180. Joseph T.D., Bose D.K. A heat-labile protein of Chlamydia trachomatis binds to HeLa cells and inhibits the adherence of chlamydiae. - Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1991, 88, 4054-4058

181. Judson B.A., Lambert P.P. Improved Syva MicroTrak Chlamydia trachomatis direct test method. - J.Clin.Microbiol., 1988, 26, 2657-2658

182. Kahn D.E., Hoover E.A. Infection respiratory diseases of cats. -Vet.Clin. of North Am., 1976, 6, 339-413

183. Kaltenboeck B., Kousoulas K.G., Storz J. Detection and strain differentiation of Chlamydia psittaci mediated by a two-step polymerase chain reaction. - J.Clin.Microbiol., 1991, 29, 1969-1975

184. Kaltenboeck B., Kousoulas K.G., Storz J. Structure and allelic diversity and relationships among the major outer membrane protein (omp A) genes of the four chlamydial species. - J.Bacterid., 1993, 175, 431-437

185. Kaltenboeck B., Kousoulas K.G., Storz J. Structures and allelic diversity and relationships among the major outer membrane protein (ompA) genes of the four chlamydial species. - J.Bacterid., 1993, 175, 487-502

186. Kaltenboeck B., Kousoulas K.G., Storz J. Two-step polymerase chain reaction and restriction endonuclease analyses detect and differentiate ompA DNA of Chlamydia spp. - J.Clin.Microbiol., 1992, 30, 1098-1104

187. Kaltenboeck B., Storz J. Biological properties and genetic analysis of the ompA locus in chlamydiae isolated from swine. -Am.J.Vet.Res., 1992, 9, 1482-1487

188. Kaul R., Wenman W.M. Cyclic AMP inhibits developmental regulation of Chlamydia trachomatis. - J.Bacteriol., 1986, 168, 722727

189. Kellner S.G. Augenveranderungen bei Katzen durch Chlamydia psittaci. - Kleintierpraxis, 1988, 33, 157-160

190. Kikuta L.C., Puolakkainen M., Kuo C.-c., Campbell L.A. -Isolation and sequence analysis of the Chlamydia pneumoniae GroE operon. Infect.lmmun., 1991, 59, 4665-4669

191. Kingsbury D.T. Estimate of the genome size of various microorganisms. - J.Bacteriol., 1969, 98, 1400-1401

192. Koehler J.E., Burgess R.R., Thompson N.E., Stephens R.S. -Chlamydia trachomatis RNA polymerase major subunit. -J.Biol.Chem., 1990, 265, 13206-13214

193. Koehler J.E., Stephens R.S. Characterization of Chlamydia trachomatis RNA polymerase ß' subunit. - In: Chlamydia Infections. Bowie W.R. et al. (Eds). - Cambridge University Press, 1990, 48-51

194. Kohler G., Mitstein I. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. - Nature, 1975, 256, 495-497

195. Kolar S.G., Rude T.A. Clinical evalution of a commercial feline pneumonitis vaccine. - Feline Practice, 1977, 7, 1, 417-450

196. Kolar S.G., Rude T.A. Duration of immunity in cats inoculated with a commercial feline pneumonitis vaccine. - Vet.Med.Small Anim. Clinical., 1981, 1171-1173

197. Kordova N., Wilt J.C., Sadig M. Lysosomes in L ceils infected with Chlamydia psittaci 6BC strain. - Can.J.Microbiol., 1971, 17, 955-959

198. Kraft W., Durr U.M. Katzenkrankheiten, Klinik und Therapie 2. -Auflage, Verlag M. Schaper H. (Eds.). - Hannover, 1985

199. Kraus H., Schmeer N., Wittenbrink M. FRG Proceedings of the European Society on Chlamydial Research. - Bologna, Italy, 1988, 65

200. Krauss H. Die Bedeutung von Rickettsien und Chlamydien bei kleinen haustieren als Erregen von Zoonosen. - Berl.Munch. Tierarztl.Wschr., 1982, 95, 24, 480-483

201. Kuo C.-c., Chi E.Y., Grayston J.T. Ultrastructural study of entry of Chlamydia strain TWAR into HeLa cells. - Infect.Immun., 1988, 56, 1668-1672

202. Lamont H.C., Nichols R.L. In: Immunol.Hum.Infect. - N.Y.-L., 1981, 1, 441-474

203. Lazarowicz M. A serological survey in cats for antibodies to respiratory viruses and Chlamydia. - Z.Versuchstierkd., 1977, 19, 325

204. Lazarowicz M., Steck F., Kihm U., Moehi H. Respiratory infections of the cat. A serological survey in different populations. -Ztrbl.Vet.Med., 1982, 29, 10, 769-775

205. Lepinay A., Robineaux R., Orfilla J., Orme-Rosselli L., Boutry J.M. Ultrastrructute et cytochimie ultrastructurale des membranes de Chlamydia psittaci. - Archiv fur die ges. Virusfersch., 1971, 33, 3-4, 271-280

206. Levitt D., Danen R., Levitt P. Selective infection of astrocytes by Chlamydia trachomatis in primary mixed neuron-glial cell cultures. - Infect.Immun., 1986, 54, 913-916

207. Lin H.-S., Moulder J.W. Patterns of response to sulfadiazine, D-cycloserine and D-alanine in members of the psittacosis group. -J.Infect.Dis., 1966, 116, 372-376

208. Louis C., Nicolas G., Eb F., Lefebvre J., Orfila J. Modifications of the envelope of Chlamydia psittaci during its developmental cycle: Freeze-fracture study of complementary replicas. -J.Bacterid., 1980, 141, 868-875

209. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.G. Protein measurement with the Folin fenol reagent. - J.Biol.Chem., 1951, 193, 265-275

210. Lusher M., Storey C.C., Richmond S.J. Plasmid diversity within the genus Chlamydia. - J.Gen.Microbiol., 1989, 135, 1145-1151

211. MacDonald A.B., Stuart E.S., Jons W.E., Branchard T.G. A possible anti-idiotipe vaccine using a monoclonal antiboby to Chlamydia group antigen. - Proc.Europ.Soc. of Chlamydia Research, Bologna, Italy, 1988, May 30-June 1, 140

212. Martin C.L. Feline oftalmologic diseases. Conjunctivitis diseases. - Mod.Vet.Pract., 1981, 62, 12, 929-933

213. Matsumoto A. Electron microscopic studies on the structure of the envelopes of Chlamydia psittaci. - J.Electron Microsc., 1976, 25, 51-52

214. Matsumoto A. Fine structures of ce!! envelopes of Chlamydia organisms as revealed by freeze-etching and negative staining techniques. - J.Bacterid., 1973, 116, 1355-1363

215. Matsumoto A. Isolation and electron microscopic observations of intracytoplasmic inclusions containing Chlamydia psittaci. -J.Bacteriol., 1981, 145, 605-612

216. Matsumoto A. Modern Medicine. - Jpn., 1985, 31, 6, 227-245

217. Matsumoto A. Morphology of Chlamydia psittaci elementary bodies as revealed by electron microscopy. - Kawasaki Med.J., 1982, 8, 149-157

218. Matsumoto A. Structural characteristics of chlamydial bodies. -In: Microbiology of Chlamydia, Barron A.L. (Ed.). - CRC Press, Boca Raton, FL, 1988, 21-45

219. Matsumoto A., Manire G.P. Electron microscopic observations on the effects of penicillin on the morphology of Chlamydia psittaci. - J.Bacteriol., 1970, 101, 278-285

220. Matsumoto A., Higashi N. Morfology of the envelopes of Chlamydia organisms as revealed by freese-etching technique and scanning electron micriscopy. - Ann.Rept.lnst.Virus Res., Kyoto, Univ., 1975, 18, 51-61

221. McEwen A.D., Stamp Y.T. Immunizations and infection experements. - Vet.Res., 1951, 63, 197-201

222. McClelland M., Jones R., Pate Y., Nelson M. Restriction endonucleases for pulsed field mapping of bacterial genoms. -Nucleic Acids Res., 1987, 15, 5985-6005

223. McKenna T.J., Steele J.H. Human eye infection due to filane virus. - J.Am.Med.Assoc., 1970, 212, 2271

224. McKercher D.G., Feline pneumonitis. I. Immunization studies in kittens. - Am.J.Res., 1952, 13, 50-60

225. MessmerT.O., Skelton S.K., Moroney J.F., Daugharty H., Field B.S. Application of a nested, multiplex PCR to psittacosis outbreaks. - J.Clin.Microbiol., 1997, 28, 2043-2046

226. Millonig G. A modified procedure for lead staining of thin section. - J.Biophys.Biochem.Cytol., 1961, 11,736

227. Mitzel J.R., Strating A. Vaccinations against feline pneumonitis. - Am.J.Vet.Res., 1977, 38, 1361-1363

228. Mollenhauer H.H. Plastic embedding mixtures for use in electron microscopy. - Stain Technol., 1964, 39, 111

229. Moorman D.R., Sixbey J.W., Wyrick P.B. Interaction of Chlamydia trachomatis with human genital epithelium in culture. -J.Gen.Microbiol., 1986, 132, 1055-1067

230. Moos B., Flexner C. Roles of vaccina virus in the development of new vaccines. - Vaccine, 1988,6, 161-163

231. Morre S., Ossrwaarde J., Lan J. Serotyping and genotyping of genital Chlamydia trachomatis isolates reveal variants of serovars Ba, G and J as confirmed by omp1 nucleotide sequence analysis. -J.Clin.Microbiol., 1998, 2, 345-351

232. Morrison R.P., Belland R.J., Lyng K., Caldwe!! H.D. Chlamydial disease pathogenesis. The 57 kD chlamydial hypersensitivity antigen is a stress response protein. - J.Exp.Med., 1989, 170, 12711283

233. Morrison R.P., Lyng K., Caldwell H.D. Chlamydial disease pathogenesis. Ocular hyposensitivity elicited by a genus specific 57 kD protein. - J.Exp.Med., 1989, 169, 663-675

234. Morrison S.J., Jenkin H.M. Growth of Chlamydia psittaci strain meningopneumonitis in mouse L cells culticated in a defined medium in spinner cultures in vitro. - J.Exp.Med, 1972, 8, 94-100

235. Moulder J.W.- Characteristics of chlamydiae. In: Microbiology of Chlamydia. Barron A.L. (Ed.). - CRC Press, Inc., Boca Raton, FL., 1988, 3-20

236. Moulder J.W. Inhibition of onset of overt multiplication of Chlamydia psittaci in persistently infected mouse fibroblasts (L cells). - Infect.lmmun., 1983, 39, 898-907

237. Moulder J.W. Interaction of chlamydiae and host cell in vitro. -Microbiol.Rev., 1991, 55, 143-190

238. Moulder J.W. Looking at chlamydiae without looking at their hosts. - ASM News., 1984, 50, 353-362

239. Moulder J.W., Hatch T.P., Kuo C.-c., Schachter J., Storz J. -Genus Chlamydia Jones, Rake and Stearns 1945, 55AL. In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Krieg N.R., Holt J.G. (Eds.). - Williams and Wilkins, Baltimore, 1984, 1, 729-739

240. Moulder J.W., Levy N.J., Schulman L.P. Persistent infection of mouse fibroblasts (L cells) with Chlamydia psittaci'. Evidence for a cryptic chlamydial form. - Infect.lmmun., 1980, 30, 874-883

241. Moulder J.W., Levy N.J., Zeichner S.L., Lee C.K. Attachment defect in mouse fibroblasts (L cells) persistently infected with Chlamydia psittaci. - Infect.lmmun., 1981, 34, 285-291

242. Murray E.S. Guinea pig inclusion conjunctivitis virus. Isolation and identification as a member of the psittacosis-lymphogranuloma-trachoma group. - J.lnfect.Dis., 1964, 114, 1-12

243. Nabii B., Tarisso M. Coloration des micro-organisms du group PLT par la metode de Gimenes modiiiifee. - Bull. World Helth Org. -1967, 7, 153-154

244. Nano F.E., Caldwell H.D. Expression of the chlamydial genus-specific lipopolysaccharide in Escherichia coli. - Science, 1985, 228, 742-744

245. Newcomer C.E., Anver M.R., Simmons J.L., Wilcke B.W., Nace G.W. Spontaneous and experimental infections of Xenopus laevis with Chlamydia psittaci. - Lab.Anim.Sci., 1982, 32, 680-686

246. Nigg C. Unidentified virus which produces pneumonia and systemic infection in mice. - Science, 1942, 95, 49-50

247. Ogra P.L., Chiba Y. Vaccination by non-parenteral routes: characterization of immune response. - Dev.Biol.Stand., 1976, 30, 427-430

248. Oriel J.D., Ridgway G.L. Genital infection by chlamydia trachomatis. - Edward Arnold, 1982

249. Oster H.B., Schachter J., Dawson C. Acute follicular conjunctivitis of epizootic origin - feline pneumonitis. - Archives of Ophtalmology, 1969, 82, 587-591

250. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gel. IV. Types of reaction in coordinated systems of diffusion. - Acta Path.Microbiol.Scand., 1953, 32, 231-240

251. Page L.A. Influence of temperature on the multiplication of chlamydiae in chicken embryos. - In: Trachoma and related disorders caused by Chlamydial agents. - R.L.Nichols (Ed.), 1971, 40-51

252. Palmer L., Falkow S. A common plasmid of Chlamydia trachomatis. - Plasmid., 1986, 16, 52-62

253. Perara E., Ganem D., Engel J.N. A developmental^ regulated chlamydial gene with apparent homology to eukaryotic histone H1. -Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1992, 89, 2125-2129

254. Perez-Martinez J.A., Storz J. Persistent infection of L cells with an ovine abortion strain of Chlamydia psittaci. - Infect.Immun., 1985, 50, 453-458

255. Perez-Martinez J.A., Storz J. Propagation of ovine and bovine abortion strains of Chlamydia psittaci in suspension cultures of L-cells. - J.Vet.Med., 1986, 33, 346-353

256. Peterson E.M., Markoff B.A., Schachter J., de la Maza L.M. The 7.5-kb plasmid present in Chlamydia trachomatis is not essential for growth of this microoganism. - Plasmid., 1990, 23, 144-148

257. Pickett M.A., Everson J.S., Clarke I.N. Chlamydia psittaci ewe abortion agent:. Complete nucleotide sequence of the major outer membrane protein gene. - FEMS Microbiol.Lett., 1988, 55, 229-234

258. Piraino F., Abel C. Plaque assay for psittacosis virus in monolayers of chick embryo fibroblasts. - J.Bacteriol., 1964, 87, 1502-1511

259. Plaunt M.R., Hatch T.P. Protein synthesis early in the developmental cycle of Chlamydia psittaci. - Infect.Immun., 1988, 56, 3201-3205

260. Plommet M., Bosseray N. Simultaneous vaccination by three living attenuated strains of brucella, salmonella and chlamydia in mice. - Vaccine, 1987, 5, 27-32

261. Pollard D.R., Tyler S.D., Ng C.W., et al. A polymerase chain reaction (PCR) protocol for the specific detection of Chlamydia spp. - Mol.Cel.Probes, 1989, 3, 383-389

262. Pollard M., Sharon N. Induction of prolonged latency in pcittacosis infected cells by aminopterin. - Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 1963, 112, 51-54

263. Puy H., Fuentes V., Eb F., Orfila J. Immunological specificity of monoclonal antibodies of Chlamydia psittaci ovine abortion strain. -Immunol.Lett., 1990, 23, 217-222

264. Rake G., Jones H.P. Studies on lymphogranuloma venereum. I. Development of the agent in the yolk sac of the chicken embryo. -J.Exp.Med., 1942, 75, 323-338

265. Rasmussen S.J., Douglas F.P., Timms P. PCR detection and differentiation of Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis. - Mol.Cell.Probes, 1992, 6, 389-394

266. Rasmussen S.J., Smith-Vaughan H., Nalson M., et al. -Detection of Chlamydia trachomatis in urine enzyme immunoassay and DNA amplification. Mol.Cell.Probes., 1993, 7, 425-430

267. Rasmussen S.J., Timms P. Detection Chlamydia psittaci using DNA probes and the polymerase chain reaction. - FEMS Microbiol.Lett., 1992, 77, 169-174

268. Reed S.I., Anderson L.A., Jenkin H.M. Use of cycloheximide to study independent lipid metabolism of Chlamydia trachomatis cultivated in mouse L cells grown in serum-free medium. -Infect.Immun., 1981, 31, 668-673

269. Regan R.G., Dathan R.E. Infective endocarditis with glomeruloneeeephritis associated with cat Chlamydia (Chlamydia psittaci) infection. - Br.Heart J., 1979, 42, 349-352

270. Reik L.M., Maines S.L., Ryan D.E. et al. A simple nonchromatographic purification procedure for monoclonal antibodies. - J.immunol.Meth.,1987, 100, 123-130

271. Reynolds D.J., Pearce J.H. Characterization of the cytochalasin D-resistant mechanisms of endocytosis utilized by chlamydiae. -Infect.Immun., 1990, 58, 3208-3216

272. Reynolds E.S. The use of lead citrare at high pH as an electronopaque strain in electron microscopy. - J.Cell.Biol., 1963, 17, 208

273. Rice C.E. The carbohydrate matrix of the epithelial-cell inclusion in trachoma. - Am.J.Ophtal., 1936, 19, 1-8

274. Richmond S.J., Stirling P. Localization of group antigen in McCoy cell monolayers infected with Chlamydia trachomatis or Chlamydia psittaci. - Infect.lmmun., 1981, 34, 2561-2570

275. Richmond S.J., Stirling P., Ashley C.R. Virus infecting the reticulate bodies of an avian strain of Chlamydia psittaci. - FEMS Microbiol.Lett., 1982, 14, 31-36

276. Rodolakis A. Use of a live temperature sensitive vaccine in experimental and natural infections. - In: Chlamydial diseases of ruminants, Aitken (Ed.). - Brussels, Luxembourg: Commiccion of the European Communities, 1986, 71-77

277. Roger A. Contribution microscopique a letute cytologique des virus du gruop trachoma psitacose - limphogranulomatose. - Bui. Soc.Pat.Exot., 1958, 51,4, 408-484

278. Rosenkranz H.S., Gutter B., Becker Y. Studies on the development cycle of Chlamydia trachomatis-. Selective inhibition by hydroxyurea. - J.Bacterid., 1973, 115, 682-690

279. Rothermal C.D. In: Chlamydial infections. - Cambridge Univ.Press, 1986, 437-440

280. Rothermel C.D., Rubin B.Y., Jaffe E.A., Murray H.W. Oxyge-independent inhibition of intracellular Chlamydia psittaci growth by human monocytes and interferon-activated macrophages. -J.Immunol., 1986, 137, 689-692

281. Rothermel C.D., Rubin B.Y., Murray H.W. Gamma-interferon is the factor in lymphokine that activates human macrophages to inhibit intracellular Chlamydia psittaci replication. - J.Immunol., 1983, 131, 2542-2544

282. Rouhan D., LeNoc P. Detection de Chlamydia trachomatis dans divers produits pathologiques. Comparaison entre IF directe -Chlamydiazyme et cultures cellulaires. - Ann.Biol.Clin., 1987, 45, 160-164

283. Rude T.A. Feline Chlamydiosis (feline pneumonitis). - Feline Practice, 1986, 16, 3, 31-35

284. Sabatini D., Bensch K., Barnett R. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. - J.Cell.Biol., 1963, 17, 19

285. Saiki R.K., Sharf S., Faloona F., et a!. Enzymatic amplification of ß-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. - Science, 1985, 230, 1350-1354

286. Sardinia L.M., Segal E., Ganem D. Developmental regulation of the cysteine-rich outer membrane proteins of murine Chlamydia trachomatis. - J.Gen.Microbiol., 1988, 134, 997-1004

287. Sarov I., Becker Y. Trachoma agent DNA. - J.Mol.Biol., 1969, 42, 581-589

288. Schachter J., Caldwell H.D. Chlamydiae. - A.Rev.Microbiol., 1980, 34, 285-309

289. Schachter J., Dawson C.R. Human chlamydial infections. -PSG Publishing Co., Inc., Littleton, MA, 1978

290. Schechter E.M., Tribby I.I.E., Moulder J.W. Nucleic acid metabolism in L cells infected with a member of the psittacosis group. - Science, 1964, 145, 819-821

291. Schechter M. Synthesis of nucleic acid and protein in L cells infected with the agent of meningopneumonitis. - J.Bacteriol., 1966, 91, 2069-2080

292. Schiefer H.G., Krauss H., Schummer U. Anionic sites on Chlamydia membranes. - FEMS Microbiol.Lett., 1982, 15, 41-44

293. Scheer N., Shjrr K., Storz J., Perez-Martinez J. et al. Specific interaction of bovine lgG1 and lgG2 subclasses with different Chlamydia antigens. - Zbl.Bact.Hyd., 1987, 266, 305-315

294. Schmeer N., Jann J.J., Bialasiewicz A., Weber A. Die Katze als mougliche infectionsquelle fuer Chlamydia psittaci - bedingte Kerakonjunctivitis beim Menschen. - Tierarztliche Praxis., 1987, 19, 201-204

295. Schmeer N., Shnorr K., Storz J., Perez-Martinez J. et ai. -Specific interaction of bovine lgG1 and !gG2 subclasses with different Chlamydia antigens. J.Bact.Hyd., 1987, 266, 305-315

296. Schmiel D.H., Knight S.T., Haulston J.E., Choong J., Davis C.H., Wyrick P.B. Recombinant Escherichia coli clones expressing Chlamydia trachomatis gene products attach to human endometrial epithelial cells. - Infect.lmmun., 1991, 59, 4001-4012

297. Shewen P.E. Chlamydial infection in animals: a review. -Can.Vet.J., 1980, 21, 2-11

298. Shewen P.E., Pouey R.C., Wilson M.R. A comparison of the afficacy of a live and four inactivated vaccine preparations for the protection of cats against experimental challenge with Chlamydia psittaci. - Can.J.Comp.Med., 1980, 44, 244-251

299. Shewen P.E., Pouey R.C., Wilson M.R. Feline chlamydial infection. - Can.Vet.J., 1978, 19, 289-292

300. Shewen P.E., Povey R.C., Wilson M.R. A survey of the conjunctival flora of clinically normal cats and cats with conjunctivitis. - Can.Vet.J., 1980, 21, 231-233

301. Serateanu D. Stud.Cerc.lnformicrobiol. - Acad. (RSR), 1963, 14, 2, 213-216

302. Soloff B.L., Rank R.G., Barron A.L. Ultrastructural studies of chlamydial infection in guinea-pig urogenital tract. - J.Comp.Path., 1982, 92, 547-558

303. Spears P., Storz J. Biotyping of Chlamydia psittaci based on inclusion morphology and response to diethylaminoethyi-dextran and cycloheximide. - Infect.lmmun., 1979, 24, 224-232

304. Spears P., Storz J. Chlamydia psittaci: Growth characteristics and enumeration of serotypes 1 and 2 in culterd cells. -J.Infect.Dis., 1979, 140, 959-967

305. Spurr A.R. A low-viscosity epoxyresin embedding medium for electron microscopy. - J.Vet.Res., 1969, 26, 31

306. Sriprakash K.S., MacAvoy E.S. Characterization and sequence of a plasmid from the trachoma biovar of Chlamydia trachomatis. -Plasmid, 1987, 18, 205-214

307. Stephens R.S. Chlamydia: Intracellular biology, pathogenesis and immunity. - University of California, Berkeley, 1999, 346 p.

308. Stephens R.S. Molecular genetics of chlamydia. - In: Chlamydial Infections. Bowie W.R. et al. (Eds.). - Cambridge University Press, 1990, 63-72

309. Stephens R.S., Mullenbach G., Sanchez-Pescador R., Agabian N. Sequence analysis of the major outer membrane protein gene from Chlamydia trachomatis serovar L2. - J.Bacteriol., 1986, 168, 1277-1282

310. Stephens R.S., Wagar E.A., Schoolnic G.K. High-resolution mapping of serovar-specific and common antigenic determinants of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. -J.Exp.Med., 1988, 167, 817-831

311. Storey C.C., Lusher M., Richmond S.J. Analysis of complete nucleotide sequence of Chpl, a phage which infects avian Chlamydia psittaci. - J.Gen.Virol., 1989, 70, 3381-3390

312. Storz J. Chlamydia and Chlamydia - induced disease. -Springfield, llinois, Charles C.Thomas Publish., 1971

313. Storz J., Kaltenboeck B. The Chlamydiales.

314. Storz J. Overview of anima! diseases. - !n: Microbiology of Chlamydia, A.L.Barron (Ed.). - CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1988, 167-192

315. Storz J., Spears P. Chlamydiales: Properties, developmental cycle, and effect on eukaryotic host cells. - Curr.Topics Microbiol., 1977, 76, 165-212

316. Storz J., Todd W.J., Schnorr K.L. Chlamydial infections: Breach of host cellular barriers. - In: Virulence Mechanisms of Veterinary Bacterial Pathogens, Roth J.A. (Ed.). - ASM Publishing Co., 1988, 161-199

317. Striprakash K.S., Macavoy S. Characterization and sequence of a plasmid from the trachoma biovar of Chlamydia trachomatis. -Plasmid, 1987, 18, 205-214

318. Stuart E.S., MacDonald A.B. Some characteristics of secreted chlamydial antigen recognized by IgG from C.trachomatis patient sera. - Immunol., 1989, 65, 469-473

319. Studdert M.J., Studdert V.P., Wirth H.J. Isolation of Chlamydia psittaci from cats with conjunctivitis. - Aust.Vet.J., 1981, 57, 515 -517

320. Sturgess C. P., Gruffydd Jones T. J., Haarbour D. A., Feilden H. R. - Studeis on the safety of Chlamydia psittaci vaccination in cats. - Veterinary Record, 1995, 137, 668-669

321. Su H., Morrison R.P., Watkins N.G., Caldwell H.D. Identification and characterization of T helper cell epitopes of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. - J.Exp.Med., 1990, 172, 203-212

322. Su H., Watkins N.G., Zhang Y.-x., Caldwell H.D. Chlamydia trachomatis-hos{ cell interactions: Role of the chlamydial majorouter membrane protein as an adhesin. Infect.Immun., 1990, 58, 1017-1025

323. Swanson J., Eschenbach D.A., Alexander E.R., Holmes K.K. -Light and electron microscopic study of Chlamydia trachomatis infection of the uterine cervix. J.Infect.Dis., 1975, 131, 678-687

324. Takahashi T., Masuda M., Tsuruno T., Mori Y., Takashima I., Hiramure T., Kikuchi N. Phylogenetic analyses of Chlamydia psittaci strains from birds based on 16S rRNA gene sequence. -J.Clin.Microbiol., 1997, 2908-2914

325. Tamura A, Matsumoto A., Manire G.P., Higashi N. Electron microscopic observations on the structure of the envelopes of mature elementary bodies and developmental reticulate forms of Chlamydia psittaci. - J.Bacteriol., 1971, 105, 355-360

326. Tamura A. Biochemical studies on the mechanism of infection of meningopneumonitis agent. - A.Rep.Inst.Virus Res., Kyoto Univ., 1964, 7, 1-13

327. Tamura A., Manire G.P. Effect of penicillin on the multiplication of meningopneumonitis organisms (Chlamydia psittaci). J.Bacteriol., 1968, 96, 875-880

328. Tanami Y., Pollard M., Starr T.J. Replication pattern of psittacosis virus in a tissue culture system. - Virology, 1961, 15, 2229

329. T'ang F.F., Chang H.L., Huang Y.T., Wang K.C. Studies on the etiology of trachoma with special reference to isolation of the virus in chick embryo. - Medicine, 1957, 75, 429-446

330. Tao S., Kaul R., Wenman W.M. Identification and nucleotide sequence of a developmental^ regulated gene encoding aeukarvotic histone H1 -like protein from Chlamydia trachomatis. -J.Bacteriol., 1991, 173, 2818-2822

331. Taubman M.A, Smith D.J. Adjuvants for secretory immune responses. - Ann. N.-Y. Acad.Sci., 1983, 403, 637-648

332. Taylor H.R., Young E. Oral immunization against chlamydial eye infection. - Invest.Ophthalmol.Vis.Sci., 1987, 28, 248-258

333. Timms P., Eaves F.W., Hugall A.F., Lavin M.F. Plasmids of: Cloning and comparison of isolated by Southern hybridisation. -FEMS Microbiol.Lett., 1988, 51, 119-124

334. Todd W.J., Caldwell H.D. The interaction of Chlamydia trachomatis with host cells: Ultrastructural studies of the mechanism of release of biovar II strain from HeLa 229 cells. - J.Infect.Dis., 1985, 151, 1037-1044

335. Todd W.J., Doughri A.M., Storz J. Ultrastructural changes in host cellular organelles in the course of the chlamydial developmental cycle. - Zentbl.Bakt.l.Orig., 1976, 236, 359-373

336. Todd W.J., Storz J. Ultrastructural cytochemical evidence for activation of lysosomes in the cytocidal effect of Chlamydia psittaci. - Infect.lmmun., 1975, 12, 638-646

337. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. - Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1979, 76, 4350-4354

338. Tribby I. Cell wall synthesis by Chlamydia psittaci in L cells. -J.Bacteriol., 1970, 104, 1176-1188

339. Truant A.I., Wong K.H. Persistent infection of HeLa 229 cells with Chlamydia trachomatis. - Curr.Microbiol., 1981, 5, 105-109

340. Valder W. A. Unterrsuchungen sur Wirksamkeit der Vaksination gegen der Chlamydia abort des Schhhafec. - Deutach.Tieraarstl. Wschr., 1975, 82, 221-225

341. Vanrompay D., Ducattelle R., Haesebrouck F. Chlamydia psittaci infections: A review with emphasis on avian chlamydiosis. -Vet.Microbiol., 1995, 45, 93-119

342. Vanrompay D., Van Nerom A., Ducattelle R., Haesebrouck F. -Evaluation of five immunoassayas for detection of Chlamydia psittaci in cloacal and conjunctival specimens from turkeys. -J.Clin.Microbiol., 1994, 32, 1470-1474

343. Vits-Terberger R. Feline Chlamydiose. - Der praktische Tierarzt., 1990, 12, 24-31

344. Wagar E.A., Stephens R.S. Developmental form-specific DNA-binding proteins from Chlamydia spp. - Infect.Immun., 1988, 56, 1678-1684

345. Wang S.-P., Grayston J.T. Serotyping of Chlamydia trachomatis by inderect fluorescent-antibody staining of inclusions in cell culture with monoclonal antibodies. - J.Clin.Microbiol., 1991, 29, 1295-1298

346. Ward M.E., Murray A. Control mechanisms govering the infectivity of Chlamydia trachomatis for HeLa cells: Mechanisms of endocytosis. - J.Gen.Microbiol., 1984, 130, 1765-1780

347. Warren H.S., Vogel F.R. Current status of immunological adjuvants. - Ann.Rev.Immunol., 1986, 4, 369-388

348. Weisburg W.G. Polyphyletic origin of bacterial parasites. - In: Intracellular Parasitism, Moulder J.W. (Ed.). - CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1989, 1-15

349. Weisburg W.G., Hatch T.P., Weese C.R. Eubacteria! origin of chlamydiae. - J.Bacteriol., 1986, 167, 570-574

350. Weiss E., Dressler H. Centrifugation of rickettsiae and viruses onto cells and its effect on infection. - Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 1960, 103, 691-695

351. Werner G. The Bedsonia Group of Agents. - In: Basic Medical Virology, Prier J.E. (Ed). - Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md., 1966

352. Werth D. Vorkommer und Bedentung von Chlamydia psittaci und Coxiella burnetti bei Hund und Katze. Berl. Munch.Tierarztl.Wschr., 1989, 102, 156-161

353. Werth D., Scmeer N., Muller H.,Karo M., Krauss H. Nachweis von Antikörpern gegen Chlamydia psittaci. - J.Vet.Med., 1987, 34, 165

354. Wilkes R.D. Infection diseases of neonatal cat. - Florida Vet.J., 1981, 10, 4, 11-14

355. Wills J. M., Timothy J.Gruffydd Jones., Richmond S. J., Gaskel R. M., Bourne F. J. - Effect of Vaccination on Feline Chlamydia psittaci Infection. - Infect.lmmun.Nov., 1987, 2653-2657

356. Wills J. M., Timothy J.Gruffydd Jones., Richmond S. J., Paul I.D. - Isolation of Chlamydia psittaci from cases of conjunctivitis in colony of cats. - Vet.Rec., 1984, 114, 344-346

357. Wills J.M. Chlamydial infection in the cat. - Thesis submitted to the University of Bristol., 1986

358. Wills J.M., Millard W.G. Evalution of a monoclonal antibody based Elisa for detection feline Chlamydia psittaci. - Vet.Rec., 1986

359. Wyrick P.B., Brownridge E.A. Growth of Chlamydia psittaci in macriphages. - Infect.lmmun., 1978, 19, 1054-1060

360. Yuan Y., Zhang Y.-x., Manning D.S., Caldwell H.D. Multiple tandem promoters of the major outer membrane protein gene (■omp1) of Chlamydia psittaci. - Infect.Immun., 1990, 58, 2850-2855

361. Yuan Y., Zhang Y.-x., Watkins N.G., Caldwell H.D. Nucleotide and deduced amino acid sequences for the four variable domains of the major outer membrane proteins of the 15 Chlamydia trachomatis serovars. - Infect.Immun., 1989, 57, 1040-1049

362. Zeichner S.L. Isolation and characterization of macrophage phagosomes containing infectious and heat-inactivated Chlamydia psittaci. Two phagosomes with different intracellular behaviors. -Infect.Immun., 1983, 40, 956-966

363. Zhang Y.-x., Morrison S.G., Caldwell H.D., Baehr W. Cloning and sequence analysis of the major outer membrane protein genes of two Chlamydia psittaci strains. - Infect.Immun., 1989, 57, 16211625

364. Zhang Y.-x., Watkins N.G., Stewart S., Caldwell H.D. The low-molecular-mass, cystein-rich outer membrane protein of Chlamydia trachomatis possesses both biovar and species-specific epitopes. -Infect.Immun., 1987, 55, 2570-2573