Экспериментальное изучение фармакокинетики и биотрансформации нового дипептидного ноотропа ноопепта тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.25, кандидат биологических наук Коротков, Сергей Анатольевич

• Коротков, Сергей Анатольевич
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Коротков, Сергей Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Аналитические методы определения фармакологически активных пептидов в биологическом материале.

1.1.1. Хроматографические методы анализа пептидных соединений.

1.1.1.1. Обращенно-фазный вариант метода ВЭЖХ в пептидном анализе.

1.1.1.2. Эксклюзионная хроматография в пептидном анализе.

1.1.2. Электрофоретические методы анализа пептидов.

1.1.3. Методы хромато-масс-спектрометрии в пептидном анализе.

1.1.4. Иммунохимические методы анализа пептидных соединений.

1.2. Фармакокинетика лекарственных веществ пептидной природы.

1.2.1. Фармакокинетика лекарственных веществ пептидной природы при внутривенном и подкожном путях введения.

1.2.2. Биологическая доступность пептидных препаратов, принимаемых через слизистые оболочки.

1.2.2.1. Назальный путь введения.

1.2.2.2. Букальный, сублингвальный пути введения.

1.2.2.3. Окулярный путь введения пептидов.

1.2.2.4. Через легкие.

1.2.2.5. Оральный путь введения пептидов.

1.2.2.5.1. Анатомические барьеры желудочно-кишечного тракта.

1.2.2.5.2. Метаболические барьеры желудочно-кишечного тракта.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

4 2.2. Методы.

2.2.1. Способы введения ноопепта экспериментальным животным.

2. 2. 2. Метод количественного определения ноопепта и его метаболитов в биологическом материале.

2.2.2.1. Подбор условий хроматографирования.

2.2.2.2. Выбор детектирования.

2.2.3. Метод УФ-спектрос копии.

2.2.4. Хроматографический анализ ноопепта и его метаболитов.

2.2.5. Метрологические характеристики методик определения ноопепта и его метаболитов в биологическом материале.

2.2.6. Статистическая обработка результатов анализа.

2.2.7. Подготовка биологического материала к хроматографическому анализу.

2.2.7.1. Экстракция из плазмы крови экспериментальных животных.

2.2.7.2. Экстракция из ткани мозга.

2.2.8. Метод газо-жидкостной хроматографии циклопролилглицина.

2.2.9. Масс-спектрометрический анализ эндогенного циклопролилглицина.

2.2.10. Газ-хроматография-масс-спектрометрия.

2.2.11. Расчет основных фармакокинетических параметров ноопепта и его активных метаболитов и биологической доступности ноопепта.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. УФ-спектроскопия.

3.2. Изучение биотрансформации и фармакокинетики ноопепта и его основных метаболитов.

3.2.1. Предполагаемый метаболизм ноопепта.

3.2.2. Изучение экскреции ноопепта и его основных метаболитов с мочой у крыс.

3.2.3. Фармакокинетика ноопепта и его метаболитов в плазме крови крыс после внутривенного введения ноопепта.

3.2.4.Фармакокинетика ноопепта у крыс после орального введения субстанции ноопепта.

3.3. Фармакокинетика неизмененного ноопепта и его метаболитов в мозге крыс.

3.4. Оценка абсолютной и относительной биологической доступности субстанции и таблеток ноопепта.

3.4.1. Фармакокинетика ноопепта в плазме крови кроликов х после внутривенного введения.

3.4.2. Фармакокинетика ноопепта у кроликов после орального введения субстанции ноопепта.

3.4.3. Фармакокинетика ноопепта у кроликов после введения таблеток.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальное изучение фармакокинетики и биотрансформации нового дипептидного ноотропа ноопепта»

Разнообразие и часто уникальность фармакологических эффектов эндогенных пептидов и их синтетических аналогов в сочетании с высокой активностью делают эти соединения перспективными в качестве потенциальных фармакологических средств. Современные достижения в создании лекарственных форм пептидов, позволившие в значительной степени преодолеть такие негативные характеристики этих соединений, как низкую устойчивость к протеолитическим ферментам, плохую всасываемость и низкую проницаемость через различные барьеры организма, в соединении с улучшенными методами производства привели к возрождению интереса фармацевтической промышленности к пептидным соединениям [1].

На сегодняшний день фармацевтический рынок пептидов насчитывает свыше 40 препаратов различных фармакологических групп, вакцин и диагностических продуктов [1]. Среди наиболее коммерчески успешных препаратов пептидной структуры, выпускаемых за рубежом, следует отметить аналоги люлиберина леупролид (leuprolide (Lupron®)) и госерелин (goserelin (Zoladex®)), ингибитор ангиотензин-конвертирующего фермента лизиноприл (lisinopril (Zestril® и Prinivil®)). В нашей стране также был создан ряд препаратов пептидной структуры. Это созданный в ВКНЦ АМН СССР под руководством академика Е.И. Чазова структурный аналог Leu-энкефалина противоязвенный препарат даларгин, разработанный под руководством академика И.П. Ашмарина на основе фрагмента АКТГ4.10 ноотропный препарат семакс и созданный под руководством академика В.И. Покровского на основе тимопоэтина иммуномодулятор имунофан.

Лекарственные средства пептидной природы интересны в качестве потенциальных ноотропов, поскольку в регуляции когнитивных функций основную роль играют нейропептиды [2]. В связи с большим количеством состояний, сопровождающихся нарушениями когнитивных функций таких как травма мозга, инсульты, хроническая церебро-васкулярная недостаточность и т.п., представляется необходимым разработка и внедрение в клиническую практику новых ноотропных препаратов пептидной структуры, поскольку в большинстве случаев пептидные препараты более эффективны, чем препараты из других химических групп [3].

Несмотря на значительный прогресс в создании лекарственных форм пептидных соединений, поиск пептидов, сохраняющих активность после приема внутрь, остается актуальным, поскольку именно этот путь введения предпочтителен при коррекции многих когнитивных нарушений, требующих проведения длительной терапии.

В ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН в результате целенаправленного создания лекарственных средств дипептидной природы на основе структуры известных непептидных препаратов [4], был создан оригинальный дипептид ноопепт, который имеет ноотропную активность, качественно и количественно превышающую активность классического ноотропа пирацетама [5], и при этом сохраняющий активность после приема внутрь [6].

Общеизвестно, что экспериментальное изучение фармакокинетики позволяет выявить закономерности концентрационных изменений лекарственного вещества в организме. Знание этих закономерностей способствует пониманию процессов всасывания, распределения и элиминации лекарственных средств, выяснению фармакокинетической составляющей биологической активности, идентификации и оценки основных метаболитов, выбору оптимальной лекарственной формы и пути введения. В конечном счете, изучение экспериментальной фармакокинетики направлено на решение главной задачи доклинических испытаний, заключающейся в обеспечении безопасного и эффективного использования лекарственных препаратов в клинике [7].

Актуальность темы.

Актуальность исследования определяется тем, что доклиническое щ изучение фармакокинетики и путей биотрансформации ноопепта является необходимым этапом на пути внедрения этого оригинального препарата в клиническую практику.

Целью настоящего исследования является изучение фармакокинетики и биотрансформации ноопепта в эксперименте на двух видах животных. Задачи исследования.

1. Разработать методики качественного и количественного анализа ноопепта и его предполагаемых метаболитов в биологическом материале.

2. Изучить фармакокинетику ноопепта после внутривенного и орального введения у крыс и кроликов.

3. Установить пути биотрансформации ноопепта после его внутривенного введения у крыс.

4. Оценить способность ноопепта проникать через гематоэнцефалический барьер.

5. Изучить фармакокинетику и определить относительную биологическую доступность таблетированной лекарственной формы ноопепта у кроликов.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Установлены два параллельных пути биотрансформации ноопепта: путь с расщеплением пептидной связи и путь с дезацилированием, в результате которых образуются: N-фенилацетилпролин, фенилуксусная кислота и циклопролилглицин.

2. Абсолютная биологическая доступность составляет у крыс около 7 %, а у кроликов в среднем 10 %.

3. Ноопепт проникает через гематоэнцефалический барьер и его концентрация в мозге выше, чем в плазме. Тканевая доступность ноопепта для мозга составила 161 % .

4. Выявлены различия во времени всасывании ноопепта в системный кровоток после введения кроликам таблеток и вводимой внутрь субстанцией. Вспомогательные вещества, входящие в таблетированную лекарственную форму, не влияют на скорость и степень всасывания ноопепта. Относительная биологическая доступность таблеток ноопепта составила в среднем 99.7 %

Научная новизна работы.

В настоящем исследовании впервые изучено фармакокинетическое поведение и основные пути биотрансформации ноопепта у крыс и кроликов при разных путях введения субстанции и после введения таблеток ноопепта у кроликов. Показано, что при внутривенном пути введения неизмененный ноопепт регистрируется в плазме крови крыс в течение 25 мин и за это время происходит его биотрансформация с образованием трех метаболитов - N-фенилацетилпролина, фенилуксусной кислоты и циклопролилглицина. Выявлено, что процесс элиминации ноопепта у кроликов протекает менее интенсивно, что обуславливает его более длительную циркуляцию в плазме крови у этого вида животных. Показано, что ноопепт способен проникать через гематоэнцефалический барьер и его количественное содержание в мозге превышает его содержание в плазме крови. Установлено, что в мозге, помимо ноопепта, регистрируются два его метаболита — фенилуксусная кислота и циклопролилглицин. Эти метаболиты являются идентичными соответствующим эндогенным соединениям, причем идентификация циклопролилглицина в качестве эндогенного соединения проведена впервые. Показано на двух видах животных, что ноопепт после введения внутрь подвергается "эффекту первого прохождения". Впервые проведена оценка относительной биологической доступности таблеток ноопепта у кроликов.

Практическая значимость работы.

Данные о фармакокинетике и биотрансформации ноопепта вошли в материалы, представленные в Фармакологический комитет РФ для получения разрешения на клинические испытания таблеток ноопепта. Данные настоящего исследования могут быть полезными при разработке новых лекарственных форм ноопепта.

Связь темы диссертации с планом научно-исследовательских работ ГУ НИИ фармакологии РАМН.

Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР НИИ фармакологии РАМН "Изучение молекулярных и клеточных механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций ЦНС, создание нейрохимических основ для разработки новых оригинальных нейротропных средств" и с подпрограммой "Создание лекарственных средств методами химического и биологического синтеза" ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники".

Апробация работы.

Основные результаты работы доложены на VIII Российском национальном конгрессе "Человек и Лекарство", а также на 3-й Международной Конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам".

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 136 страницах и иллюстрированы 20 таблицами и 14 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, заключения и выводов. Библиография представлена 25 отечественными и 130 зарубежными работами.

Заключение диссертации по теме «Фармакология, клиническая фармакология», Коротков, Сергей Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика количественного определения ноопепта и его основных метаболитов в биологическом материале с использованием ВЭЖХ.

2. Установлены два параллельных пути биотрансформации ноопепта в плазме крови: первый - расщепление пептидной связи с образованием N-фенилацетилпролина, второй - дезацилирование с образованием фенилуксусной кислоты и циклопролилглицина, совпадающих с соответствующими эндогенными соединениями. В мозге обнаружены метаболиты, образующиеся только по второму пути.

3. Период полувыведения ноопепта после его внутривенного введения в 2-3 раза продолжительнее периода полувыведения незамещенных ди- и трипептидов.

4. После введения ноопепта внутрь препарат быстро всасывается и поступает в системный кровоток; при этом его абсолютная биодоступность составляет более 7 %.

5. Ноопепт проникает через гематоэнцефалический барьер и его концентрация в мозге крыс, начиная с 10-минутного интервала после внутривенного введения значительно превышает его уровень в плазме.

6. Разработанная в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН таблетированная лекарственная форма ноопепта обладает высокой относительной биодоступностью и рекомендована для клинических исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что интенсивность фармакологического эффекта зависит от фармакодинамических и фармакокинетических характеристик лекарственного средства. Другими словами, фармакокинетические свойства лекарственного средства, характеризующие процессы его всасывания, распределения и элиминации являются необходимыми факторами биологической активности. С этой точки зрения представляется важным, во-первых, выяснение взаимосвязи концентрации лекарственного средства, регистрируемого в изучаемом биоматериале, с выраженностью фармакологического эффекта, и, во-вторых, выявления таких фармакокинетических характеристик лекарственного средства, которые являлись бы определяющими в реализации активности.

Принимая во внимание выраженную зависимость эффекта ноопепта от дозы [5, 6, 147], можно предположить, что определяющим фармакокинетическим фактором, обусловливающим реализацию эффекта этого ноотропа будет площадь под фармакокинетической кривой или значение максимальной концентрации. Вместе с тем, интенсивная элиминация ноопепта предопределяет его низкий концентрационный уровень в плазме крови, следствием чего явилась необходимость использовать в фармакокинетическом исследовании дозы, значительно превышающие эффективные. В связи с этим представляется затруднительным оценка минимально эффективной площади под фармакокинетической кривой, то есть такой величины AUC, которая была бы способна реализовать фармакологический эффект.

Во многих случаях, интенсивный метаболизм лекарственного средства приводит к снижению фармакологической активности или к её видоизменению. Для ноопепта следствием быстрого исчезновения из организма является расхождение во времени детектирования его в плазме крови или ткани мозга со временем регистрации ноотропной активности, то есть оцениваемые ноотропные эффекты ноопепта наблюдались уже после окончания циркуляции данного дипептида в организме. Несопоставимость во времени проявления эффекта, и профиля концентрационной кривой лекарственного средства в организме обычно подразумевает отсутствие корреляционной зависимости между эффектом и концентрацией. В этом случае, наиболее вероятными механизмами реализации эффекта представляется либо действие, опосредованное активными метаболитами, либо "запуск" ноопептом эндогенных механизмов, формирующих эффект. Если ноопепт является пролекарством, то предполагаемый активный метаболит должен, во-первых, проникать через гематоэнцефалический барьер после его введения, во-вторых, биологическая активность этого метаболита должны быть полностью сопоставима с фармакологическими эффектами исходного соединения.

Следовательно, для ответа на вышепоставленный вопрос необходимо сравнить биологическую активность метаболитов, способных к проникновению через гематоэнцефалический барьер, с фармакологическим эффектом исходного соединения.

В настоящем исследовании было установлено, что после внутривенного введения ноопепта в мозге определяются два метаболита - фенилуксусная кислота и циклопролилглицин.

По литературным данным, фенилуксусная кислота присутствует в организме человека и животных в мозге [146], в цереброспинальной жидкости [148], в плазме крови [149] и в моче [150]. Согласно результатам исследований последних лет, фенилуксусная кислота имеет высокую степень проникновения через гематоэнцефалический барьер, причем ее концентрация в мозге крыс регулируется не только за счет образования конъюгатов, но также и за счет транспорта из мозга [146]. В плазме крови крыс 90 % от всего содержания фенилуксусной кислоты находится в связанном состоянии в виде конъюгата с глютатионом, и только 10 % определяется в свободном виде [146].

Большое количество зарубежных публикаций, посвященных биологической активности фенилуксусной кислоты обусловлено её способностью подавлять рост опухолевых клеток различного происхождения без проявления общей токсичности [151]. Цитотоксическое действие фенилуксусной кислоты связано с подавлением генной экспрессии злокачественных клеток, причем независимо от фазы их клеточного цикла [152]. К настоящему времени, в США проходят клинические испытания этой кислоты в качестве противоопухолевого средства, используемого для лечения рака мозга и предстательной железы. Сообщалось [153] об изучении фармакокинетики фенилуксусной кислоты после внутривенного введения онкологическим пациентам. Было установлено, что фармакокинетика фенилуксусной кислоты имеет нелинейный характер, и что интенсивная элиминация является результатом быстрого образования конъюгата фенилуксусной кислоты, в виде которого она экскретируется с мочой в количестве 99 % от введенной дозы.

Вместе с тем, в доступной автору литературе, посвященной и эндогенной, и изучаемой после введения в условиях эксперимента и клиники фенилуксусной кислоты, отсутствуют сведения о ноотропной активности этого соединения.

Другим метаболитом, обнаруживаемым в ткани мозга крыс после введения ноопепта, является циклопролилглицин. Как и в случае с фенилуксусной кислотой, данный метаболит детектировался в биологических образцах опытных и контрольных животных. Это обстоятельство послужило основанием для предположения об эндогенной природе данного циклодипептида, что впоследствии и было подтверждено различными инструментальными методами. Всесторонний фармакологический анализ циклопролилглицина, выполненный в лаборатории психофармакологии ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН свидетельствует, во-первых, что циклопролилглицин имеет выраженную антиамнестическую активность, регистрируемую после внутрибрюшинного введения в дозах, сопоставимых с активными дозами ноопепта (0.1 — 1.0 мг/кг); во-вторых, что он обладает и значительной мнестической активностью [154]. Таким образом, циклопролилглицин, как и исходное соединение, обладает выраженным ноотропным эффектом. Однако при дальнейшем [147] изучении фармакологии циклопролилглицина, были отмечены различия во влияниях этого эндогенного циклодипептида и ноопепта на фазы памяти. В отличие от ноопепта, который способен облегчать все фазы памяти, включающие ввод информации, её консолидацию и извлечение, циклопролилглицин оказывает влияние только на начальные фазы. При этом, в отличие от ноопепта, влияние циклопролилглицина на извлечение информации напротив имеет тенденцию к торможению воспроизведения памятного следа [147].

Из приведенных данных следует, что ноотропный эффект ноопепта качественно отличается от сопоставляемого эффекта циклопролилглицина, и, следовательно, можно утверждать, что ноопепт не является пролекарством, хотя и возможен вклад этого метаболита в ноотропную активность ноопепта.

Другая возможность реализации эффекта ноопепта, отсроченного от времени его циркуляции в организме, может осуществляться по принципу "появился и исчез". Предполагается, что определенное количество ноопепта достигая клетку-мишень "запускает" эндогенные процессы, влияющие на формирование механизмов памяти. С фармакокинетической точки зрения, возможность реализация такого эффекта будет зависеть от минимального значения параметров Со или Стах (в зависимости от способа введения), которое бы обеспечило нахождение ноопепта в месте непосредственного приложения в количестве, достаточным для такого "запуска". Не рассматривая проблемы механизмов клеточного действия ноопепта на формирование памяти, можно предположить, что такой процесс, связанный с функциональными изменениями, будет продолжителен по времени и, следовательно, нахождение ноопепта в плазме крови и его действие будут разобщены во времени.

С предположениями, высказанными выше, согласуются данные о сохранении активности ноопепта после орального введения [6]. Во-первых, обычно пролекарство характеризуется изменением фармакологической активности после орального введения, что не наблюдалось у ноопепта, во-вторых, низкое значение биодоступности ноопепта при условии зависимости концентрации от эффекта предполагала бы отсутствие последнего.

В настоящее время предлагается [155] биофармацевтическая классификация лекарственных средств согласно их растворимости в воде и способности к проницаемости через биологические мембраны. Предполагается, что лекарственные средства, сгруппированные в один из 4 возможных классов по принципу отношения к вышеуказанным признакам, будут иметь сходное поведение при оценки биодоступности. Согласно этой классификации, ноопепт относится к группе И, в которую выделены лекарственные средства по таким признакам как низкая растворимость в воде и высокая проницаемость через биологические мембраны. Считается, что для этой группы фактором, ограничивающим биодоступность может выступать растворимость лекарственного средства в условиях in vivo, в связи с чем рекомендуется проводить тщательное изучение растворимости при физиологических значениях рН, в различных средах и по разным методикам.

По-видимому, растворимость ноопепта в условиях in vivo, не является причиной его низкой биодоступности (см. 3.4.4.). Можно утверждать, что низкая биодоступность ноопепта является результатом незначительной степени его всасывания в системный кровоток из-за интенсивной пресистемной биотрансформации, протекающей в кишечнике. А это означает возможность увеличения биодоступности с помощью биофармацевтических подходов без химической модификации исходного соединения.

Одной из задач настоящего исследования являлась оценка относительной биодоступности разработанной в опытно-технологическом отделе ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН лекарственной формы ноопепта — таблеток. В результате фармакокинетического изучения установлено, что таблетированная лекарственная форма ноопепта соответствуют по скорости всасывания из ЖКТ, и по степени достижения системного кровотока вводимому внутрь водному раствору ноопепта. Из этого следует, что вспомогательные вещества, входящие в таблетированную лекарственную форму, индифферентны в фармакокинетическом отношении.

Можно отметить, что с помощью использования вспомогательных веществ, возможно значительно снизить потери лекарственного вещества в желудочно-кишечном тракте. Поскольку, как указывалось выше, низкая биодоступность ноопепта является следствием именно биотрансформации, то в роли таких вспомогательных веществ должны выступать ингибиторы ферментов. В биофармацевтической практике в этом качестве, например, рассматривают: бестатин (bestatin); пепстатин (pepstatin); арфанамин (arphanamine) и ряд других специфических ингибиторов [10].

Возможно использование и других биофармацевтических подходов, реализуемых в настоящее время при создании препаратов на основе пептидов. Эти подходы позволяют преодолевать такие негативные характеристики этих соединений, как низкую устойчивость к протеолитическим ферментам, плохую всасываемость и их низкую проницаемость через различные барьеры организма включая слизистые оболочки. Наиболее успешной лекарственных формой для пептидов следует признать терапевтические системы с длительным высвобождением действующего начала, в частности, такой подход был реализован при создании нафарелина (nafarelin) и золадекса (zoladex) [1].

В заключение можно отметить, что современные достижения в области создания и производства пептидов обеспечили бурный рост количества препаратов этой группы в последние пять лет, и, возможно с началом использования проекта "геном человека" в терапии, пептидные соединения станут наиболее жизнеспособными кандидатам в фармакологические вещества.

117

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Коротков, Сергей Анатольевич, 2003 год

1. Verlander М. Striking progress in the development of peptides as drugs, in: Proc. 26 European Pept. Symp./ Eds. J. Martinez, J.-A. Fehrentz. Paris: EDK, 2001.-p. 103-105.

2. Воронина T.A. Роль синаптической передачи в процессах памяти, нейродегенерации и механизме действия нейротропных препаратов// Экспер. и клин, фармакол. 2003. - Т. 66, № 2. - с. 10-14.

3. Loffet A. Peptides as drugs: is there a market?// J. Pept.Sci. 2002. - V. 8, № l.-p. 1-7.

4. Островская Р.У., Гудашева Т.А., Воронина Т.А., Трофимов С.С., Бойко С.С., Жердев В.П., Середенин С.Б. ГВС-111 новый замещенный ацилпролил-дипептид с ноотропными свойствами// В сб. "Лекарства -Человеку", - М., 1997 . - т. 4. - с. 295-304.

5. Горьков В.А. Оптимизация фармакокинетических исследований новых лекарственных средств: дис. докт. биол. наук. М., 1987. - 300 с.

6. Dutta A.S. Small peptides: chemistry, biology, clinical studies. Amsterdam etc.: Elsevier, 1993. - 616 p.

7. Underberg W.J.M., Hoitink M.A., Reubsaet J.L.E., Waterval J.C.M. Separation and detection techniques for peptides and proteins in stability research and bioanalysis// J. Chromatogr. B. 2000. — V. 742, № 2 — p. 401409.

8. Handbook of HPLC for тне separation of amino acid, peptides and proteins/ Ed. W.S. Hancock, Ph.D. Florida USA: CRC Press. - 1984, V. I. - 489 p.

9. Yoshida T. Calculation of peptide retention coefficients in normal-phase liquid chromatography// J. Chromatogr. A. 1998. - V. 808, № 1-2. - p. 105112.

10. Nilsson C.L., Brodin E., Ekman R. J. Substance P and related peptides in porcine cortex: whole tissue and nuclear localization// J. Chromatogr. A. — 1998.-V. 800,№ 1. — p. 21-27.

11. Проблема белка. Том 1: химическое строение белка/ Е.М Попов, П.Д. Решетов и др.; под ред. В.М Липкина. М.: Наука, 1995. - 496 с.

12. Каширин Д.М., Сибилев А.В., Дейгин В.И., Прокофьева В.И. Применение метода ВЭЖХ в фармацевтическом анализе лекарственных средств пептидной природы// Хим.- фарм. журн. 2000. -Т. 34, №3.-с. 45-47.

13. Бидлингмейер Б., Фрайд Б., Хегнауер Г. Препаративная жидкостная хроматография. — М.: Мир, 1990.- 360 с.

14. Boppana V.K., Miller-Stein C. High-performance liquid chromatographic determination of peptide drugs in biological fluids by means of pre- andpost-column fluorescence derivatization techniques// Anal. Chim. Acta. -1997. V. 352, № 1.3. - p. 61-69.

15. Kai M., Miura Т., Ishida J., Ohkura Y. High-performance liquid chromatographic method for monitoring leupeptin in mouse serum and muscle by pre-column fluorescence derivatization with benzoin// J. Chromatogr. B. -1985. V. 345. - p. 259-265.

16. Nishikawa Т., Hayashi Y., Suzuki S., Kubo H., Ohtani H. Cis-trans isomerization of proline dipeptides during liquid chromatography: kinetic analysis of the elution profile// Anal. sci. 1996. - V. 12. - p. 561-564.

17. Porath J., Flodin P. Gel filtation: a method for desalting and group separation//Nature. 1959. - V. 183, № 4676. - p. 1657-1659.

18. Saelsen L., Andersen H.B., Bratholm P., Christensen N.J. Radioimmunoassay of plasma neuropeptide Y using HPLC for separation of related peptides and fragments// Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1994. - V. 54, № 3. - p. 207-214.

19. Stromqvist M. Peptide mapping using combinations of size-exclusion chromatography, reversed-phase chromatography and capillary electrophoresis//J. Chromatogr. B. 1995. - V. 667, № 2. - p. 304-310.

20. Michalski W.P., Shiell B.J. Strategies for analysis of electrophoretically separated proteins and peptides// Anal. Chim. Acta. — 1999. V. 383, № 1-2.-p. 27-46.

21. Hideyuki Kajiwara. Affinity capillary electrophoresis of proteins and peptides// Anal. Chim. Acta. 1999. - V. 383, № 1-2. - p. 61-66.

22. Jorgenson J.W., Lukacs K.D. Zone electrophoresis in open-tubular glass capillaries// Anal. Chem. 1981. - V. 53, № 8. - p. 1298-1302.

23. Kelly J.F., Ramaley L., Thibault P. Capillaiy zone electrophoresis-electrospray mass spectrometry at submicroliter flow rates: practical considerations and analytical// Anal. Chem. — 1997. V. 69, № 1. — p. 5160.

24. Карасек Ф., Клемент P. Введение в хромато-масс-спектрометрию. — М.: Мир, 1993.-236 с.

25. Caprioli R.M., Seifert W.E., Sutherland D.E. Polypeptide sequencing: use of dipeptidylaminopeptidase I and gas chromatography-mass spectrometry// Biochem. Biophys. Res. Commun. -1973.-V. 55, № l.-p. 67-75.

26. Liberato D.J., Heimer E.P., Fududa E.K., Ahmad M., Garland W.A. in: Proceedings of Am. Soc. Mass Spectrometry, San Francisco CA, June 5-10. -1988.-p. 433.

27. Cobb K.A., Novotny M.V. Peptide mapping of complex proteins at the low-picomole level with capillary electrophoretic separation// Anal. Chem.-1992. V. 64, № s. - p. 879-886.

28. Mehlis В., Kertscher U. Liquid chromatography/mass spectrometry of peptides of biological samples// Anal. Chim. Acta — 1997. — V. 352, № 1-3. -p. 71-83.

29. Kim H.Y., Pilosof D., Dyckes D.F., Vestal M.L. On-line peptide sequencing by enzymic hydrolysis, high performance liquid chromatography, and thermospray mass spectrometry// J. Am. Chem. Soc. — 1984. — V. 106, № 24.-p. 7304-7309.

30. Nilsson C.L., Brodin E., Ekman R. J. Substance P and related peptides in porcine cortex: whole tissue and nuclear localization// J. Chromatogr. A. -1998. V. 800, № 1. - p. 21-27.

31. Emson P.C., Arregui A., Clement-Jones V., Sandberg B.E., Rossor M. Regional distribution of methionine-enkephalin and substance P-like immunoreactivity in normal human brain and in Huntington's disease// Brain Res. 1980. - V. 199, № 1. - p. 147-160.

32. Csernus V.J., Szende В., Groot K., Redding T.W, Schally A.V. Development of radioimmunoassay for a potent luteinizing hormone-releasing hormone// Drug Res. 1990. - V. 40. - p.l 11-118.

33. Schwahn M., Romeis P., Peter G., Derendorf H., Herbst M. Absolute bioavailability and dose proportionality of CET, a novel LH-RH antagonist, in male and female rats// Arch. Pharmacol. 1997. - V. 355, № 4: R8.

34. Ueno H., Matsuo S. High-performance liquid chromatography followed by radioimmunoassay for the determination of luteinizing hormon-releasinghormone analogue, leuprorelin, and its metabolite// J. Chromatogr. B. — 1991.-V. 566, № 1. — p.57-66.

35. Butt W.R. The iodination of follicle-stimulating and other hormones for the radioimmunoassay// J. Endocrinol. 1972. - V. 55, № 2. - p. 453-454.

36. Behre H.M., Sandow J., Nieschlag E. Pharmacokinetics of the gonadotropin-releasing hormone agonist buserelin after injection of a slow-release preparation in normal men// Arzneimittelforschung. 1992. - V. 42, № 1. - p. 80-84.

37. Rao S., Ritschel W.A. Colonic drug delivery of small peptides// S.T.P. pharma sci. 1995. - V. 5, № 1. - p. 19-29.

38. Schafgen W., Grebe S.F., Schatz H. Pernasal versus intravenous administration of TRH: effects on thyrotropin, prolactin, triiodothyronine, thyroxine and thyroglobulin in healthy subjects// Horm. Metab. Res. 1983. -V. 15, № l.-p. 52-53.

39. Fink G., Gennser G., Liedholm P., Thorell J., Mulder J. Comparison of plasma levels of luteinizing hormone releasing hormone in men after intravenous or intranasal administration// J. Endocrinol. 1974. -V. 63,№2. -p.351-360.

40. Aungst B.J., Rogers N.J., and Shelter E. Comparison of nasal, rectal, buccal, sublingual and intramuscular insulin efficacy and the effects of a bile salt absorption promoter// J. Pharmacol. Exp. Ther. 1988. - V. 244, № 1. - p. 23 -27.

41. Potaman V.N., Antonova L.V., Dubynin V.A., Zaitzev D.A., Kamensky A.A., Myasoedov N.F., Nezavibatko V.N. Entry of the synthetic ACTH (410) analogue into the rat brain following intravenous injection// Neurosci. LETTER. 1991.-V. 127. - p.133-136.

42. Pihoker C., Kearns G.L., French D., Bowers C.Y. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of growth hormone-releasing peptide-2: a phase I studyin children// J. Clin. Endocrinol. Metab. 1998. - V. 83, № 4. - p. 11681172.

43. De Groot A.N.J., Vree T.B, Hekster Y.A., Pesman G.J., Sweep F.C.G., Van Dongen P.J.W., Van Roosmalen J. Bioavalability and pharmacokinetics of sublingual oxytocin in male volunteers// J. Pharm. Pharmacol. 1995. — V. 47.-p. 571-575.

44. Frystyk J., Hussain M., Skjaerbaek C, Porksen N, Froesch ER, Orskov H. The pharmacokinetics of free inslin-like growth factor-I in healthy subjects// Growth Horm. IGF Res. 1999. - V. 9, № 2. - p. 150-156.

45. Greco D.S., Behrend E.N., Browns S.A., Rosychuk R.A., Groman R.P. Pharmacokinetics of exogenous corticotropin in normal dogs, hospitalized dogs with non adrenal illness and adrenopathic dogs// J. Vet. Pharmacol. Ther. 1998. - V. 21, № 5. - p. 369-374.

46. Клуша B.E. Пептиды — регуляторы функций мозга. Рига: Зинатне, 1984.

47. Witkowska Е., Orlowska A., Sagan В., Smoluch М., Izdebski J. Trypsin hydrolysis of GH-RH analogues, in: Proc. 26 European Pept. Symp./ Eds. J. Martinez, Fehrentz J.-A.- Paris: EDK, 2001. p. 777-778.

48. RH antagonist, and testosteron in rats and dogs// Pharm. Res. 2000. - V. 17, №3.- p. 328-335.

49. Berger H., Heinrich N., Scha"fer H., Baeger I., Mehlis B. Gonadotropin-releasing hormone (GnRH) pharmacokinetics: peptide hormone pharmacokinetics needs clarification// Life Sci. -1988. V. 42. - p. 985-991.

50. Chu N.I., Chan R.L., Hama K.M., Chaplin M.D. Disposition of Narfarelin acetate, a potent luteinizing hormone-releasing hormonИ Drug Metab. Dispos. 1985. - V. 13, № 5. - p. 560-565.

51. Berger H., Heinrich N., Albrecht E., Kertscher U., Oehlke J. Gonadotropin -releasing hormone (GnRH) analogs: relationship between their structure, proteolytic inactivation and pharmacokinetics in rats// Regul. Pept. 1991. -V. 33.-p. 299-311.

52. Haviv F., Bush E.N., Knittle J., Greer J. LHRH Antagonists, in: Integration of pharmaceutical discovery and development, Borchard (eds.), New York: Plenum Press, 1998.

53. Schwahn M., Romeis P., Peter G., Derendorf H., Herbst M. Absolute bioavailability and dose proportionality of CET, LH-RH antagonist, in male and female rats//Arch. Pharmacol. 1997. - V. 355, № 4: R8.

54. Chan R.L., Ho W., Webb A.S., LaFargue J.A., Nerenberg C.A. Disposition of detirelix, a potent luteinising hormon-releasing hormone antagonist, in rats and monkeys// Pharm. Res. 1988. - V. 5, № 14. - p. 335-340.

55. Сеергева М.Г., Дмитриева О.Ф., Беспалова Ж.Д., Зайцев С.В., Сравнительное изучение радиорецепторным методом фармакокинетики опиатных лигандов морфина и даларгина// Бюлл. ВКНЦ АМН СССР. -1986.- вып. 2. с. 81-83.

56. Каленикова Е.И., Дмитриева О.Ф., Коробов Н.В. Жуковский С.В., Тищенко В.А. Виноградов В.А. Фармакокинетика даларгина// Бюлл. экспер. биол. мед. 1987. - Т. 103, № 1. - с. 75-83.

57. Азарян А.В. Пептидогидролазы ткани мозга. Ереван: Айастан, 1989 с. 207.

58. Заец Т.Я., Потапова А.А., Руднева В.В., Лобанова И.В. Применение препарата семакс в раннем восстановительном периоде ишемического инсульта// Кремлевская медицина. Клин, вестник. 2001.- № 2.-е. 1-3.

59. Mordenti J., Chen S.A., Moore J.A., Ferraiolo B.L., Green J.D. Interspecies scaling of clearance and volume of distribution data for five therapeutic proteins// Pharm. Res. 1991. - V. 8, № 11. - p. 1351-1359.

60. Muller S., Dunker R., Hochhaus G. Interspecies comparison of in vitro plasma degradation of dynorphin A 1-13// Pharmazie. 1996. - V. 51, № 8. -p. 581-585.

61. Venturelli F., Roscetti G., Possenti R., Vita F., Roda L.G. Peripheral enkephalin hydrolysis in different animal species: a comparative study// Neurochem. Res. 1985. - V. 10, № 3. - c. 333-342.

62. Sayani A.P. Chien Y.W. Systemic delivery of peptides and proteins across absorptive mucosae// Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1996. - V. 13, № 1-2.-p. 85-184.

63. Aungst В J., Wilmington D.E., Phenrg S. Metabolism of a neurotensin (813) analog by intestinal and nasal enzymes, and approaches to stabilize this peptide at these absorption on sites// Int. J. Pharm. 1995. - V. 117. - p. 95100.

64. Su K.S., Campanale K.M., Mendelsohn L.G., Kerchner G.A., Gries C.L. Nasal delivery of polypeptides I: nasal absorption of enkephalins in rats// J. Pharm. Sci. 1985. - V. 74, № 4. - p. 394-398.

65. Adjei A., Garren J. Pulmonary Delivery of Peptide Drugs: Effect of Particle Size on Bioavailability of Leuprolide Acetate in Healthy Male Volunteers// Pharm. Res. 1990. - V. 7, № 6. - p. 565 - 569.

66. Anik S.T., McRae G., Nerenberg C., Worden A., Foreman J., Hwang J.Y., Kushinsky S., Jones R.E., Vickery B. Nasal absorption of nafarelin acetate, the decapeptide D-Nal(2)6).LHRH, in rhesus monkeys// J. Pharm. Sci. -1984. V. 73, № 5. - p. 684-685.

67. Chien Y.W. Biopharmaceutics basis for transmucosal delivery// S.T.P. pharma sci. 1995. - V. 5, № 4. - p. 257-275.

68. Smith E.L., Hill R.L., Borman A. Activity of insulin degraded by leucine aminopeptidase// Biochim. biophys. Acta. 1958. - V. 29. - p. 207.

69. Xu H., Huang K., Zhu Y., Gao Q., Wu Q., Tian W., Sheng X., Chen Z ., Gao Z. Hypoglycaemic effect of a novel insulin buccal formulation on rabbits// Pharmacol. Res. 2002. - V. 46, № 5. - p. 459-467.

70. Chung V.B., Han K., Nishiura. Ocular absorption of Pz-Peptide and its effect on the ocular and systematic pharmacokinetics of topically applied drugs in the rabbit// Pharm. Res. 1998. - V. 15. - p. 1882 - 1887.

71. Beding-Barnekow В., Leander S., Ohlin M., Ninn-Pedersen K., Alkner U., Hakanson R. Systemic and intraocular uptake of spantide, a tachykinin antagonist, following topical application to the rabbit eye// Exp. Eye Res. -1990.-V. 50, №1.- p. 21-26.

72. Diaz-Llopis M., Menezo J.l. Penetration of 2% cyclosporin eye drops into human aqueous humour// Br. J. Ophthalmol. 1989. - V. 73, № 8. - p. 600603.

73. Higaki K, Yamashita S., Amidon G.L. Time-dependent oral absorption models// J. of Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2001. - V. 28, № 2.-p. 109-128.

74. Fahr A. Cyclosporin clinical pharmacokinetics// Clin. Pharmacokinet. -1993.-V. 24.-p.472-495.

75. Baraldo M., Pea F., Poz D., Furlanut M. Pharmacokinetics of two oral cyclosporin a formulations in clinically stable heart-transplant patients// Pharmacol. Res. 2001. - V. 43, № 6. - p. 547-551.

76. Flicker G., Drewe J. Current concepts in intestinal peptide absorption// J. Peptide Science. 1996. - V. 2. - p. 195-211.

77. Samanen J., Wilson G., Smith P.L., Lee C.P., Bondinell W., Ku Т., Rhodes G., Nichols A. Chemical Approaches to improve the oral bioavailability of peptidergic molecules// J. Pharm. Pharmacol. 1996. - V. 48. - p. 119-135.

78. Goodwin J., Мао В., Vidmar T.J., Conradi R.A., Burton P.S. Strategies toward predicting peptide cellular permeability from computed molecular descriptors// J. Peptide Res. 1999.- V. 53. - p. 355-369.

79. Felt O., Buri P., Gurny R. Chitosan: a unique polysaccharide for drug delivery// Drug Dev. Ind. Pharm. 1998.- V. 24, № 11. - p. 979-993.

80. Braun K., Kuhl P., Bernd M., Kutscher B. Stability of several LHRH antagonists against proteolytic enzymes and identification of degradation products by mass spectrometry// Pharmazie. 2001. - V. 56, № 1. - p. 45-49.

81. Hideyuki Т., Yasuharu E., Eri H. Susceptibility of insulin to proteolysis in rat lung homogenate and its protection from proteolysis by various protease inhibitors//Biol. Pharm. Bull. 1995. - V. 18,№6.-p. 929-931.

82. Reithmeier H.; Herrmann J.; Gopferich A. Development and characterization of lipid microparticles as a drug carrier for somatostatin// Int. J. Pharm. 2002. - V. 218, № 1-2. - p. 133-143.

83. Periti P., Mazzei Т., Mini E. Clinical Pharmacokinetics of Depot Leuprorelin// Clin. Pharmacokin. 2002. - V. 41, №. 7. - p. 485-504.

84. Rahavendran V.S., Karnes H.T. Visible diode laser-induced fluorescence detection of phenylacetic acid in plasma derivatized with nile blue and using precolumn phase transfer catalysis// Anal. Chem. 1997. - V. 69, № 15. - p. 3022-3027.

85. Государственная фармакопея СССР: вып. 1. Общие методы анализа/ МЗ СССР. 11 изд.- М.: Медицина, 1987. - 336 с.

86. Фирсов А.А., Пиотровский В.К. Фармакокинетические методы в биофармации: оценка биодоступности и пресистемной элиминации лекарственных средств// Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Фармакология. Химиотерапевтические средства 1984. - Т. 14.-е. 114224.

87. Алексеенко Л.П., Позднев В.П., Орехович В.Н. Цистил-аминопептидаза эритроцитов человека// Докл. АН СССР. 1987. - Т. 293, №3.- с. 728-731.

88. Reid J.L., Rubin Р.С., Whiting В. Lecture notes on Clinical Pharmacology. International Edition, 1996. - 422 p.

89. Houston J.B. Drug metabolite kinetics, in: Pharmacokinetics: Theory and Methodology./ Eds. M. Rowland, G.T. Tucker. U.K.: Pergamon Press, 1986.-p. 131-161.

90. Oliver R.E., Jones A.F., Rowland M. A Whole-body physiologically based pharmacokinetic model incorporating dispersion concepts: short and long time characteristics// J. Pharmacokin. Pharmacodyn. 2001. - V. 28, № 1. -p. 27-55.

91. Dyck L.E., Durden D.A., Boulton A.A. Conjugation of phenylacetic acid and m- and p-hydroxyphemylacetic acids in the rat striatum// Life Sci. — 1993. V. 53, № 11. - p. 901-909.

92. Gudasheva Т., Pearlman R., Voronina Т., Seredenin S. Neuropharmacological properties of main DVD-Ill metabolite, cycloprolylglycine coinciding with endogenous cyclopeptide// Pharmacologist.- 2001. V. 44, № 2 (suppl. 1). - p. A 44.

93. Elsworth J.D., Redmond D.E. Jr., Ruthven C.R., Sandler M. Phenylacetic acid production in dominant and non-dominant vervet monkeys// Life Sci. -1985. V. 37, № 18. - p. 1727 - 1730.

94. Harrison L.E., Wojciechowicz D.Z., Brennan M.F., Paty P.B. Phenylacetate inhibits isoprenoid biosynthesis and suppresses growth of human pancreatic carcinoma// Surgery. 1998. - V. 124, № 3. - p. 541-550.

95. Samid D., Hudgins W.R., Shack S., Liu L. Phenylacetate and phenylbytirate as novel, nontoxic differentiation inducers// Adv. Exp. Med. Biol. 1997. -400 A.-p. 501-505.

96. Venzon D.J., Sartor A.O. Phase I and pharmacokinetic study of intravenous phenylacetate in patients with cancer// Cancer Res. 1994. — V. 54. — p. 1690-1694.

97. Гудашева T.A., Сколдинов А.П. Стратегия создания дипептидных нейропсихотропных лекарственных препаратов// Экспер. и клин, фармакол. 2003. - Т. 66, № 2. - с. 15-19.

98. Marzo A. Open questions on bioequivalence: some problems and some solutions// Pharmacol. Res. 1999. - V. 40, № 4. - p. 359-368.