Эколого-генетическая характеристика гадюковых змей (Reptilia, viperidae) в Нижнем Поволжье и на сопредельных территориях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.16, кандидат биологических наук Ефимов, Роман Вячеславович

• Ефимов, Роман Вячеславович
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ефимов, Роман Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ В ЭКОЛОГИИ И СИСТЕМАТИКЕ ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ (обзор литературы).

1.1 Эколого-морфологическая характеристика гадюки Никольского.

1.2 Цитологическая и молекулярно-биологическая характеристика гадюковых змей.

1.3 Развитие систематики от морфологии до молекулярной биологии.

1.4 Методы молекулярной биологии, используемые для определения таксономического статуса и выяснения родственных отношений.

1.4.1 Биохимические маркеры.

1.4.2 Г^Р-анализ.

1.4.3 Методы, основанные на полимеразой цепной реакции.

1.4.3.1 ЯАРБ, АРЬР-анализ.

1.4.3.2 Анализ полиморфизма повторяющихся последовательностей.

1.4.3.3 Анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы и реактивы.

2.2 Приборная база.

2.3 Методы исследования.

2.3.1 Выделение ДНК.

2.3.2 Проведение полимеразной цепной реакции.

2.3.3 Проведение электрофореза в агарозном геле.

2.3.4 Экстракция ДНК из агарозного геля.

2.3.5 Секвенирование ПЦР продуктов по Сенгеру.

2.3.6 Фрагментный анализ микросателлитных локусов.

2.3.7 Анализ нуклеотидных последовательностей и микросателлитных локусов.

Глава 3 ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РОДСТВА ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК.

3. 1 Обоснование выбора молекулярно-генетических маркеров для исследования генетического родства гадюк.

3.2 Подбор олигонуклеотидных праймеров для амплификации, митохондриальных генов.

3.3 Исследование генетического родства гадюк с использованием митохондриального гена НАДН-дегидрогеназы (Субъединицы 2 -N02).

3.4 Исследование генетического родства гадюк с использованием митохондриального гена цитохром с оксидазы (Субъединицы 3 — СО III).

3.5 Исследование генетического родства гадюк с использованием митохондриального гена 12Б рибосомной РНК.

Глава 4 ВНУТРИВИДОВАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ СЕГРЕГАЦИЯ ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ.

4.1 Исследование внутривидовой вариабельности гадюки Никольского и обыкновенной гадюки с использованием микросателлитных локусов.

4.2 Разработка сценария расселения и формирования ареалов гадюки

Никольского и обыкновенной гадюки.

Глава 5 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ.

5.1 Подбор олигонуклеотидных праймеров для генотипирования гадюковых змей.

5.2 Экспериментальная проверка работоспособности технологии генотипирования гадюковых змей.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эколого-генетическая характеристика гадюковых змей (Reptilia, viperidae) в Нижнем Поволжье и на сопредельных территориях»

Одним из важнейших событий в науке XX в. было открытие двойной спирали ДНК. В последствии это привело к интенсивному развитию такого направления как молекулярная генетика. Особое значение в молекулярно-генетических исследованиях приобрел разработанный в 1975 г. метод секвенирования ДНК, который привел к молекулярно-биологическому пониманию сущности гена, его структуры и функции. Логическим развитием молекулярной генетики становится Международная научная программа «Геном человека», позволившая вывести науку на новый уровень развития. Начинают появляться отдельные направления в генетике, такие как генная диагностика, генная терапия, генная систематика, генная инженерия и др., вышедшие на первый план в медицине и в биологии (Горбунова и др., 1997; Чемерис и др., 1999; Venter et al., 2001).

Особое значение молекулярная генетика приобрела в медицине. Происходит более глубокое понимание вопросов этиологии и патогенеза большинства заболеваний. Широкое распространение приобретает диагностика заболеваний, имеющих в своей основе наследственный компонент. Появляется новое направление — предиктивная диагностика, позволяющая предсказать вероятность развития заболевания, и соответственно принять меры по его профилактике. И как логичное продолжение этого направления - разрабатываются современные лекарственные препараты, воздействующие на генетический аппарат, позволяющие лечить до настоящего времени неизлечимые заболевания (Горбунова и др., 1997).

Современные разработки молекулярной генетики находят применение в судебно-медицинской экспертизе. Результаты ДНК-анализа являются доказательной базой в большинстве судебных процессов. Во многих странах уже существуют банки ДНК, позволяющие быстро идентифицировать человека. 5

Аналогичная технология используется и при доказательстве биологического отцовства (Пименов и др., 2001).

Развитие молекулярной генетики послужило мощным импульсом для развития биотехнологии. В основе данного направления лежит создание нового продукта или получение уже известного продукта путем переноса генетического материала. В настоящее время биотехнология получила широкое применение в промышленном производстве различных биологически активных веществ (Гловера, 1988; Горбунова и др., 1997; Глик и др., 2002).

Следует отметить, что молекулярная генетика позволила углубить представления о механизмах наследования и об эволюции организмов, заложив тем самым основы филогенетики и генной систематики. По результатам сравнения генов и геномов делается заключение о генетическом родстве организмов. Чем больше имеется отличий в нуклеотидных последовательностях сравниваемых генов, тем дальше в генетическом родстве находятся организмы (Антонов, 2005).

Особое значение генная систематика приобрела при решении спорных вопросов относительно таксонов, систематический статус которых до конца не установлен. С данной проблемой часто сталкиваются исследователи, когда невозможно при использовании традиционных методов морфологического анализа оценить таксономическое положение организма. Принимая во внимание тот факт, что все морфологические признаки закодированы в последовательности ДНК, использование для систематики генетического материала позволяет более глубоко понять процессы эволюции и на их основе сделать заключение о систематическом положении. Важную роль в таксономии рептилий в последнее время приобрело сравнение нуклеотидных последовательностей ми-тохондриальных генов. Особенно интенсивно данное направление развивается в отношении змей, ящериц и черепах. Географические популяции пресмыкающихся зачастую характеризуются сходными морфологическими метрическими и меристическими признаками, когда без применения методов молекулярной генетики решение спорных вопросов их систематики становится затруднительным (Калябина-Хауф и др., 2004; Семенова и др., 2004; Garrigues et al., 2005; Ursenbacher et al., 2006; Huang et al., 2007).

К группе рептилий, вопросы филогенетического родства, систематики и распространения которых остаются до конца не выясненными, относятся га-дюковые змеи (Viperidae). На современном этапе развития эколого-таксоно-мических исследований повышенный интерес среди этих животных проявляется к гадюке Никольского (Vípera (Pelias) nikolskii Vedmederja, Grubant, Rudaeva, 1986), которая широко распространена в Европе. В настоящее время не существует единого мнения в отношении ее таксономического статуса. Некоторые авторы выделяют гадюку Никольского в качестве самостоятельного вида, другие рассматривают на уровне подвида обыкновенной гадюки или включают ее в состав комплекса «Vípera berus» в качестве черной морфы (Ведмедеря и др., 1986; Кудрявцев и др., 1998; Бакиев и др., 2004; Grubant et al., 1973; Joger at al., 1997; Milto et al., 2005; Zinenko et al., 2005; Kotenko, 2006).

Во многих работах, выполненных в последнем десятилетии, отсутствует стройная аргументация в подтверждение той или иной точки зрения. Более того, зачастую даже невозможно определить, какую же позицию занимает тот или иной исследователь, не признающий видовой самостоятельности Vípera nikolskii, в отношении статуса «черных гадюк» вообще и изучаемых локальных географических группировок в частности.

Гадюка Никольского занесена в Красную книгу России и Украины как малоизученный вид. Сведения о состоянии ее популяций в Нижнем Поволжье ограничены: не известен таксономический статус окраинных поселений, поэтому с приемлемой точностью не выявлены границы распространения змей. Отсутствуют достоверные данные о возможности гибридизации близкородственных видов гадюк в природе и их экологической сегрегации в зонах симпат-рического обитания. Не разработаны методы оперативной диагностики видовой принадлежности рептилий в природе и лабораторных условиях. Указанные проблемы не позволяют определить категорию редкости и природоохранный статус вида, приступить к разработке действенных мероприятий по сохранению популяций этих животных, особенно на периферии ареала.

Использование только морфологических, экологических и кариологиче-ских методов не позволяет дать однозначные ответы на поставленные вопросы (Бакиев и др., 2004; Кайбелева и др., 2005). В связи с этим на современном этапе большое значение приобретают эколого-таксономические приемы и подходы, основанные на анализе молекул ДНК. Использование данных методов позволяет уточнить таксономический статус некоторых видов гадюковых змей, а значит значительно приблизиться к пониманию процессов и явлений их морфологической изменчивости под действием комплекса абиотических факторов среды. На основе применения молекулярно-генетического анализа возможно также установление генетической структуры популяций гадюк, а также выявление механизмов, лежащих в основе эволюции изучаемых змей.

Целью работы явилось выявление распространения и экологической сегрегации гадюковых змей в Нижнем Поволжье, определение таксономического статуса их популяций с использованием молекулярно-генетических маркеров. В ходе реализации цели исследования решались следующие задачи:

- оценка таксономического статуса гадюки Никольского (Vípera nikolskií) в Нижнем Поволжье и на сопредельных территориях на основе анализа нук-леотидных последовательностей митохондриальных генов;

- установление генетической структуры популяций гадюк Никольского и обыкновенной с использованием анализа микросателлитных локусов, выявление факторов внешней среды, участвующих в ее формировании;

- определение границ ареала гадюки Никольского на территории Нижнего Поволжья и на сопредельных территориях;

- выявление механизмов экологической сегрегации гадюк Никольского и обыкновенной в зонах симпатрии, уточнение гипотетической модели дивергенции и пространственного распространения видов рода Vípera-,

- разработка экспресс-технологии идентификации популяций гадюковых змей (V. berus и V. nikolskii), таксономическое положение которых по комплексу морфологических и биохимических признаков затруднено.

Для оценки таксономического статуса гадюки Никольского предлагается использовать сравнение нуклеотидных последовательностей митохондриаль-ных генов. Сравнение необходимо проводить с обыкновенной гадюкой, являющейся наиболее таксономически близким животным. Для этого выбираются митохондриальные гены, которые наиболее оптимально позволят выявить генетические различия между данными таксонами. Далее определяется первичная структура данных генов и с использованием пакета прикладных программ оценивается таксономическое положение гадюк (Joger at al., 1997).

Для установления генетической структуры популяций гадюк предлагается использовать анализ микросателлитных локусов гадюк. Для этого все использованные в анализе гадюки целесообразно разбивать по отдельным популяциям, после чего выявляются индивидуальные аллели, характерные для каждой популяции в отдельности. На основе результатов микросателлитного анализа делается заключение о различиях между исследованными популяциями, и выявляются вероятные экологические факторы, вызывающие данные различий (Villarreal et al., 1996; McCracken et al., 1999, Carlsson et al., 2004; Manier et al., 2005).

Для определения границ распространения гадюки Никольского предлагается использовать результаты сравнения нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов, как гадюки Никольского, так и обыкновенной гадюки с различных мест обитания. В этом случае важное значение приобретает анализ гадюк с территорий, где вероятно обитают оба вида.

Для выявления механизмов экологической сегрегации гадюк Никольского и обыкновенной в зонах симпатрии, уточнение гипотетической модели дивергенции предлагается использовать результаты анализа микросателлитных локусов. Вместе с этим, анализ нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов позволяет определять вероятное время дивергенции видов и соответственно разрабатывать сценарии распространения организмов в связи с событиями четвертичного периода.

Для разработки универсальной технологии идентификации гадюк предлагается использовать возможности полимеразной цепной реакции. Данная технология основана на использовании аллель-специфичной ПЦР к мутациям, отличающим гадюку Никольского от обыкновенной гадюки, выявленным при секвенировании митохондриального гена 12Б рибосомной РНК. Данная технология позволит за более короткое время и без использования дорогостоящего секвенирования проводить идентификацию спорных экземпляров гадюк (Ко-фиади и др., 2006).

В данной работе предполагается провести комплексную оценку эколого-таксономического статуса гадюки Никольского, а также определение границ ее распространения с использованием анализа нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов гадюк. Для выявления генетических особенностей популяций гадюки Никольского и обыкновенной гадюки будет проведен анализ микросателлитных локусов, проявляющих высокий уровень полиморфизма. Будет разработана технология идентификации популяций гадюко-вых змей (К Ъегш и V. ткоЬки), таксономическое положение которых по комплексу морфологических и биохимических признаков затруднено.

Заключение диссертации по теме «Экология», Ефимов, Роман Вячеславович

выводы

В результате осуществленных эколого-генетических исследований выявлены экологические факторы, определяющие распространение и участвующие в формировании эпигенетического ландшафта географических популяций змей; впервые секвенированы нуклеотидные последовательности митохондри-альных генов 12S рРНК, НАДН-дегидрогеназы и цитохром с оксидазы для гадюки Никольского (Vípera nikolskií)\ для обыкновенной гадюки (Vípera berus) определена нуклеотидная последовательность митохондриальных генов 12S рРНК и цитохром с оксидазы, что позволило сделать следующие выводы:

1. Подтверждена видовая самостоятельность популяций гадюки Никольского, приуроченных в своем обитании к основной части ее ареала. Сравнительный анализ митохондриальных генов 12S рибосомной РНК, НАДН-дегидрогеназы и цитохром с оксидазы указывает на отличия нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов у гадюковых змей Среднего Поволжья, что позволяет отнести их к меланистической форме обыкновенной гадюки. Вероятное время дивергенции рода Vípera в отношении гадюк Никольского и обыкновенной приходится на средний плейстоцен (около 700 тыс. лет назад).

2. Область распространения гадюки Никольского в Поволжье простирается в волжской долине на север до нижней зоны Саратовского водохранилища (южнее г. Хвалынска Саратовской области); в западном направлении граница ареала проходит по территории южных административных районов Пензенской области; волжская долина является восточным пределом распространения вида.

3. Выявлено наличие на территории Поволжья (северные районы

Правобережья Саратовской области) популяций гадюковых змей, результаты

122 анализа нуклеотидных последовательностей митохондриального гена 12Б рибосомной РНК и микросателлитного локуса 7-87 которых указывают на гибридогенный характер их происхождения (V. Ьегш х V. ткоккИ). Это свидетельствует о возможности перекрывания пространственных ниш гадюк в зоне их симпатрического обитания.

4. Определены признаки (аллель 152 п.н.), позволяющие диагностировать популяции гадюки Никольского в основной части ареала. В зонах гибридизации гадюковых змей проявляются высокие адаптивные возможности гадюки Никольского, способствующие ее расселению. Определена межпопуляционная клинальная изменчивость в пределах ареала обыкновенной гадюки по микросателлитному локусу 7-87, проявляющаяся в северо-восточном направлении в отношении увеличения длины аллелей.

5. Разработана экспресс-технология (на основе результатов сравнения нуклеотидной последовательности митохондриального гена 128 рРНК) идентификации популяций гадюковых змей (V. Ьегш и V. ткоЬки), таксономическое положение которых по комплексу морфологических и биохимических признаков затруднено. Предлагаемая методика основана на детекции единичных мутаций с использованием аллель-специфичной полимеразной цепной реакции.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ефимов, Роман Вячеславович, 2008 год

1. Абрамсон, Н.И. Филогеография: итоги, проблемы, перспективы / Н.И. Абрамсон // Вестник ВОГиС. 2007. - Т. - № 2. - С. 307-331.

2. Ананьева, Н.Б. Земноводные и пресмыкающиеся: Энциклопедия природы России. / Н.Б. Ананьева, Л.Я. Боркин, И.С. Даревский, Н.Л. Орлов М.: Изд-во «ABF». - 1998. - 576 с.

3. Антонов, A.C. Геномика и геносистематика /A.C. Антонов // Природа. -1999.-№6.-С. 19-26.

4. Антонов, A.C. Геносистематика: от Э. Чаргаффа и А.Н. Белозерского до наших дней / A.C. Антонов // Молекулярная биология. 2005. - Т. 39. - № 4. -С. 581-589.

5. Бакиев, А.Г. Змеи Волжско-Камского края / А.Г. Бакиев, В.И. Гаранин, H.A. Литвинов, A.B. Павлов, и др. Самара: Издательство Самарского научного центра РАН. - 2004. - 192 с.

6. Белозерский, А.Н. Биохимия нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов / А.Н. Белозерский. -М.: Наука. 1959. - 372 с.

7. Белозерский, А.Н. Состав нуклеиновых кислот и систематика / А.Н. Белозерский, A.C. Спирин // Известия АН СССР (сер. биол.). 1960. -№ 1. - С. 64-81.

8. Ведмедеря, В.И. К вопросу о названии черной гадюки лесостепи Европейской части СССР / В.И. Ведмедеря, В.Н. Грубант, A.B. Рудаева // Вестник Харьковского ун-та. Харьков. 1986. - № 288. - С. 83-85.

9. Беликов, В.А. Генетическая дивергенция некоторых видов гадюк

10. Reptilia: Viperidae, Vípera) по результатам секвенирования генов НАДНдегидрогеназы и 12S рибосомальной РНК / В.А. Беликов, Р.В. Ефимов,124

11. Е.В. Завьялов, П.Е. Кузнецов и др. // Современная герпетология. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та. 2006. - Т. 5/6. - С. 41-49.

12. Глик, Д. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. М.: Мир. - 2002. - 589 с.

13. Гловера, Д. Клонирование ДНК. Методы / Д. Гловера. М.: Мир.- 1988. -538 с.

14. Горбунова, В.Н. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний / СПб.: «Специальная литература». 1997. — 287 с.

15. Завьялов, Е.В. Распространение и особенности биологии Vipera nikolskii в северной части Нижнего Поволжья / Е.В. Завьялов, В.Г. Табачишин // Проблемы общей биологии и прикладной экологии. Саратов: СГУ. 1997. - № 1. — С. 168-170.

16. Завьялов, Е.В. Пресмыкающиеся Энциклопедия Саратовского края / Е.В. Завьялов, В.Г. Табачишин, Г.В. Шляхтин. Саратов: Приволж. кн. изд-во. -2002.-С. 191-193.

17. Зиненко, А.И. Гибриды первого поколения между гадюкой Никольского, Vipera Nikolskii, и обыкновенной гадюки, Vipera berus (Reptilia, Serpentes, Viperidae) / А.И. Зиненко // Vestnik zoologii. 2003. - № 37 (1). - С. 101-104.

18. Иванов, В.И. Генетика. Учебник для вузов / Под ред. академика РАМН В.И. Иванова. М.: ИКЦ «Академкнига». - 2006. - 638 с.

19. Иванов, В.И. Геномика-медицине. Научное издание / Под ред. академика РАМН В.И. Иванова и академика РАН JI.JI. Киселева. М.: ИКЦ «Академкнига». - 2005. - 392 с.

20. Иванов, П.Л. Индивидуализация человека и идентификация личности: молекулярная биология в судебной экспертизе / П.Л. Иванов // Вестник российской академии наук. 2003. - № 12. - Т. 73. - С. 1085-1097.

21. Ковеза, О.В. Выявление и картирования полиморфных RAPD-маркеров генома гороха (Pisum Sativa L.) / O.B. Ковеза, З.Г. Кокаева, Ф.А. Коновалов, С.А. Гостимский // Генетика. 2005. - Т. 41. - № 3. - С. 341-348. (1)

22. Ковеза, О.В. Создание и изучение SCAR-маркеров у гороха {Pisum Sativa L.) / О.В. Ковеза, С.А. Гостимский // Генетика. 2005. - Т. 41. - № 11.— С. 1522-1530. (2)

23. Кофиади, И.А. Методы детекции олигонуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфичная ПЦР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой / И.А. Кофиади, Д.В. Ребриков // Генетика. 2006. - Т. 42. - № 1. - С. 22-32.

24. Кубанцев, Б.С. Распределение и численность пресмыкающихся в северных районах Нижнего Поволжья / Б.С. Кубанцев, H.H. Колякин // Всесоюзное совещание по проблемам кадастра и учета животного мира: Тезисы докладов. Уфа. 1989. - Вып. 3. - С. 280-282.

25. Кудрявцев, C.B. Ядовитые змеи: доступно о самом главном / C.B. Кудрявцев, C.B. Мамет. — М.: «Книжный дом «Университет». — 1998. — 44 с.

26. Кузнецова, М.В. Молекулярная филогения оленьих / М.В. Кузнецова, М.В. Холодова, A.A. Данилкин // Генетика. 2005. - Т. 41. - № 7. - С. 910918. (1)

27. Кузнецова, О.И. Исследование растений-регенерантов гороха (Pisum sativum L.) с помощью молекулярных RAPD и маркеров ISSR-маркеров / О.И. Кузнецова, O.A. АШ, Г.А. Хартина, С.А. Гостимский // Генетика. 2005. — Т. — 41.-№1.-С. 71-77. (2)

28. Лазебная, И.В. Генетическая изменчивость ядерной рибосомной ДНК насекомых отряда тараканы (Blattaria): филогенетический анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов / И.В. Лазебная, Д.В. Муха // Генетика. 2003. - Т. 39. - С. 474-477.

29. Ленинджер, А. Основы биохимии / А. Ленинджер. — М.: Мир. 1985.Т. 2.- 368 с.

30. Майр, Э. Принципы зоологической систематики / Э. Майр. М.: Мир. -1971.-456 с.

31. Олейник, А.Г. Дифференциация мальмы Salvelinus malma Азии и северной Америки по данным ПЦР-ПДРФ-анализа митохондриальной ДНК / А.Г. Олейник, Л.А. Скурихина, В.А. Брыков, П.А. Крейн, Д.К. Венбург // Генетика. 2005. - Т. 41. - № 5. - С. 626-634.

32. Орлова, В.Ф. Природа России: жизнь животных. Земноводные и пресмыкающиеся. / В.Ф. Орлова, Д.В. Семенов. М. - 1999. - 480 с.

33. Пименов, М.Г. Научные и практические аспекты криминалистического ДНК-анализа: Учебное пособие. М.: ГУ ЭКЦ МВД России. - 2001. - 144 с.

34. Радченко, O.A. Изменчивость нуклеотидных последовательностей гена цитохрома b митохондриальной ДНК гольцов рода Salvelinus / O.A. Радченко // Генетика. 2004. - Т. 40. № 3. - С. 320-333.

35. Ратнер, В.А. Молекулярная эволюция / В.А. Ратнер // Соросовский образовательный журнал. 1998. - № 3. С. 41-47.

36. Салменкова, Е.А. Генетическая дивергенция гольцов рода Salvelinus Кроноцкого озера (полуостров Камчатка) / Е.А. Салменкова, В.Т. Омельченко, O.A. Радченко, Н.В. Гордеева и др. // Генетика. 2005. - Т. 41. - № 8. - С. 1096-1107.

37. Семенова, С.К. RAPD-изменчивость средиземноморской черепахи Testudo graecaL. (Testudinidae) / C.K. Семенова, A.B. Корсуненко, В.А. Васильев, C.JI. Перешкольник и др. // Генетика. 2004. - Т. 40. - № 12. - С. 16281636.

38. Сингер, М. Гены и геномы: в 2 т. / М. Сингер, П. Берг. М.: Мир. - 1998. -2 т. —391 е.: ил.

39. Спирин, A.C. А.Н. Белозерский и становление молекулярной биологии / A.C. Спирин // Молекулярная биология. 2005. - Т. 39. - № 4. - С. 532-537.

40. Спирин, A.C. Изучение видовой специфичности нуклеиновых кислот у бактерий / A.C. Спирин, А.Н. Белозерский, Н.В. Шугаева, Б.Ф. Ванюшин // Бихимия. 1957. - № 22. - С. 744-754.

41. Табачишин, В.Г. Современное распространение и некоторые аспекты экологии гадюки Никольского на севере Нижнего Поволжья / В.Г. Табачишин, И.Е. Табачишина, Е.В. Завьялов // Поволж. экол. журн. 2003. - № 1. - С. 82 — 86.

42. Фортэ, A.B. Филогения видов яблони рода Malus на основе оценки морфологических признаков и молекулярного анализа ДНК / A.B. Фортэ, А.Н. Игнатов, В.В. Пономаренко, Д.Б. Дорохов, Н.И. Савельев // Генетика. 2002. - Т. 38.-№ 10.-С. 1357-1369.

43. Хедрик, Ф. Генетика популяций / Ф. Хедрик. М.: Техносфера. - 2003.592 с.

44. Чемерис, A.B. Секвенирование ДНК/ A.B. Чемерис, Э.Д. Ахунов, В.А. Вахитов. М.: Наука. - 1999. - 429 с.

45. Шляхтин, Г.В. Методика полевых исследований экологии амфибий и рептилий / Г.В. Шляхтин, В.Л. Голикова Саратов: Изд-во Сарат. ун-та. —1986.-78 с.

46. Шляхтин, Г.В. Животный мир Саратовской области. Кн. 4. Амфибии и рептилии. / Г.В. Шляхтин, В.Г. Табачишин, Е.В. Завьялов, И.Е. Табачишина -Саратов: Изд-во Сарат. ун-та. 2005. - 116 с.

47. Шляхтин, Г.В. Распространение пресмыкающихся ceM.Viperidae и Colubridae на территории Саратовской области / Г.В. Шляхтин, В.Г. Табачишин, Е.В. Завьялов // Тезисы докладов: Первой конференции герпетологов Поволжья. 1995. - Тольятти. - С. 61-63.

48. Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия: Учебно-справочное пособие. — 2-е изд., испр. и доп. / С.Н. Щелкунов. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во. — 2004.-496 с.

49. Avise, J.C. A comparative summary of genetic distances in the Vertebrates // J.C. Avise, C.F. Aquadro, M.K. Hecht, B. Wallace, et al. / Evolutionary Biology. New York-London.-1982. V. 15.-P. 151-185.

50. Botstein, D. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms / D. Botstein, R.L. White, M. Skolnick, R.W. Davis // The American Journal of Human Genetics. 1980. - № 32. - P. 314-331.

51. Buntjer, J.B. Phylogeny of bovine species based on AFLP fingerprinting / J.B. Buntjer, M. Otsen, I.J. Nijman, M.T.R. Kuiper and J.A. Lenstra // Heredity. -2002.-№88.-P. 46-51.

52. Ferquel, E. Reappraisal of Vipera aspis Venom Neurotoxicity / E. Ferquel, L. Haro, V. Jan, I. Guillemin, S. Jourdain et al. // PLoS ONE. 2007. - № 11. - P. 118.

53. Glazko, G. Eighty percent of proteins are different between humans and chimpanzees / G. Glazko, V. Veeramachaneni, M. Nei, W. Makalowski // Gene. -2005.-№14.-P. 215-219.

54. Groot, T.V.M. Molecular genetic evidence for parthenogenesis in the Burmese python, Python molurus bivittatus / T.V.M. Groot, E. Bruins, J.A.J. Breeuwer // Heredity. 2003. - № 90. - P. 130-135.

55. Herrmann, H. Molecular phylogeny and systematics of viperine snakes I. General phylogeny of European vipers {Vipera sensu stricto) / H. Herrmann, U. Joger, G. Nilson // Proc. Syxth Ord. Gen. Meet. S. E. H., Budapest 1991. - P. 219224.

56. Hille, A. Heterologous amplification of microsatellite markers from colubroid snakes in European natricines (Serpentes: Natricinae) / A. Hille, A.W. Janssen,

57. S.B.J. Menken, M. Schlegel et al. // The Journal of Heredity. 2002. - № 93(1). -P. 63-66.

58. Huang, S. Molecular phylogeography of endangered sharp-snouted pitviper (Deinagkistrodon acutus; Reptilia, Viperidae) in Vainland China // S. Huang, S. He, Z. Peng, K. Zhao, E. Zhao // Molecular phylogenetics and evolution. 2007. - № 44. - P. 942-952.

59. Hubby, J.L. A molecular approach to the study of genie heterozygosity in natural populations. I. The number of alleles at different loci in Drosophila pseudoobscura / J.L. Hubby, R.C. Lewontina // Genetics. № 54. - 1966. - P. 577594.

60. Joger, U. The phylogenetic position of Vipera barani and V. Nikolskii within the Vipera berus complex / U. Joger, P. Lenk, I. Baran, W. Böhme et al. // Herpetologia bonnensis. 1997. - P. 185-194.

61. Kellog, E.A. The structure and function of Rubisco and their implications for systematic studies / E.A. Kellog, N.D. Juliano // American journal of botany. 1997. -V. 84(3).-P. 413-428.

62. Kocher, T.D. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: Ampliphication and sequencing with conserved primers / T.D. Kocher, W.K. Thomas, A. Meyer, S.V. Edwards et al. // Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 1989. -V. 86.-P. 6196-6200.

63. Manier, M. K. Population genetic analysis identifies source-sink dynamics for two sympatric garter snake species (Thamnophis elegans and Thamnophis sirtalis) / M.K. Manier, S. J. Arnold // Molecular Ecology. 2005. - № 14. - P. 3965-3976.

64. Martin, P.G. Angiosperm taxonomy studied using sequences of five macromolecules / P.G. Martin, D. Boulter, D. Penny // Taxon. 1985. № 34. - P. 393-400.

65. McCracken, G. F. Microsatellite markers and multiple paternity in the garter snake Thamnophis sirtalis / G.F. McCracken, G.M. Burghardt, S.E. Houts // Molecular Ecology. 1999. -№ 8. - P. 1475-1479.

66. Milto, K.D. Distribution and morphological variability of Vipera berus in Eastern Europe. / K.D. Milto, O.I. Zinenko // In: Herpetologia Petropolitana, Ananjeva, N., Tsinenko, O., Eds, Saint-Petersburg. -2005. P. 64-73.

67. Nedospasov, A.A. Age changes of Vipera berus venom amidolytic activity / A.A. Nedospasov, E.V. Rodina// Toxicon. V. 30. - № 11. - P. 1505-1508.

68. Nilson, G. Vipera nikolskii Vedmederja, Grubant et Rudaeva, 1986 / G. Nilson., C. Andren // Atlas of Amphibians and Reptiles in Europe / Muséum National d'Histoire Naturelle. Paris. 1997. - P. 396 - 397.

69. Sambrook, J. Molekular cloning: A laboratory Manual / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis // Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. - 381 p.

70. Sanger, F. DNA Sequencing with chain-termination inhibitors / F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 74. - P. 54365467.

71. Tabatschischin, W.G. Zur präzisierung der südlichen Grenze des Verbreitungsareals der Waldsteppenotter (Vípera nikolskii) im europäischen Teil Russlands / W.G. Tabatschischin, E.W. Sawjalow // Mauritiana (Altenburg). 2004. Bd. 19, heftl.P.83-85.

72. Tamura, K. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) Software Version 4.0 / K. Tamura, J.l. Dudley, M. Nei and S. Kumar // Molecular biology and evolution. 2007. - № 24(8). - P. 1596-1599.

73. Tegelstrom, H. Paternity Determination in the Adder (Vípera berus) DNA Fingerprinting or Random Amplified Polymorphic DNA? / H. Tegelstrom, M. Hoggren // Biochemical Genetics. - 1994. - Vol. 32. - Nos. 7/8. - P. 132-137.

74. Venter, J. C. The Sequence of the Human Genome / J. C. Venter, M. D. Adams, E. W. Myers et al., // Science. -2001. V. 291. - P. 1304-1351.

75. Vos, P. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting / P. Vos, R. Hohers, M. Bleeker, M. Reijans // Nucleic acids research. 1995. - V. - 23. - № 21. P.4407-4414.

76. Welsh, J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers / J. Welsh, M. McClelland // Nucleic Acids Research. 1990. V. 18. - № 24. - P. 7213-7218.

77. Williams, J.G.K. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J.G.K. Williams, A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski and S.V. Tingey // Nucleic Acids Research. 1990. V. 18. - № 22. - P. 6531-6535.

78. Wilson, A.C. Mitochodnrial DNA and two perspectives on evolutionary genetics / A.C. Wilson, R.L. Cann, S.M. Carr // Biol. J. Linn. Soc. 1985. - V. 26. -P. 375-400.

79. Woese, C.R. Bacterial evolution / C.R. Woese // Microbiological reviews. — 1987. -№51. -P. 221-271.