Создание векторных конструкций, содержащих гены фунгицидно-бактерицидных пептидов, и анализ полученных с их помощью трансгенных растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Сердобинский, Леонид Александрович

• Сердобинский, Леонид Александрович
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сердобинский, Леонид Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Плазмиды Agrobacterium как векторная система для введения гетерологичных генов в высшие растения.

1.1. Плазмиды агробактерий и опухолеобразование у высших растений.

1.2. Процесс переноса Т-ДНК из агробактерии в растительную клетку.

1.3. Интеграция Т-ДНК в геном растения.

1.4. Конструирование бактериальных векторов для введение генов в растения.

1.4.1. Т-ДНК как природный экспрессионный вектор.

1.4.2. Коинтегративные векторы и бинарные векторы.

1.4.3. Маркерные гены.

1.4.4. Промоторы.

Глава 2. Антимикробные белки и их использование для защиты растений.

2.1. Классификация антимикробных белков.

2.2. Растительные дефензины.

2.2.1. Структура растительных дефензинов.

2.2.2. Экспрессия дефензинов в органах растений.

2.2.3. Антимикробные свойства растительных дефензинов.

2.2.4. Механизм действия растительных дефензинов.

2.3. Антимикробные белки амаранта.

2.3.1. Структура хитинсвязывающих белков амаранта.

2.3.2. Антимикробная активность белков амаранта.

2.4. Получение трансгенных растений с генами антимикробных белков.

2.4.1. Трансгенные растения, устойчивые к патогенным бактериям.

2.4.2. Трансгенные растения, устойчивые к грибным патогенам.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Материалы и методы.

3.1. Методы молекулярного клонирования в бактериях.

3.1.1. Бактериальные штаммы и используемые среды.

3.1.2. Клонирование плазмидной ДНК в агробактериях.

3.1.3. Анализ клонированных генов.

3.2 Методика получения трансгенных растений табака.

3.3. Методы анализа трансгенных растений.

3.3.1 Выделение растительной геномной ДНК.

3.3.2. Полимеразная цепная реашщя (ПЦР).

3.3.3. Блот-гибридизация растительной ДНК (по Саузерну).

3.3.4. Реакция обратной транскрипции с последующей ПЦР (ОТ-ПЦР).

3.3.5. Иммуноферментный анализ (Вестерн-блоттинг) трансгенных растений с геном rs-ap.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 4. Создание векторных конструкций с генами антимикробных белков.

4.1. Создание векторной конструкции с геном амаранта ас-ар.

4.2. Создание векторных конструкций с геном редьки rs-ap.

Глава 5. Анализ полученных трансгенных растений табака с генами антимикробных белков редьки и амаранта.

5.1. Определение эффективности трансформации табака при помощи созданных векторных конструкций с генами антимикробных белков редьки и амаранта.

5.2. Изучение наследования генов rs-ap и ас-ар в поколении Ti трансгенных растений табака.

5.3. Изучение транскрипции и трансляции встроенных генов rs-ap и ас-ар в поколениях Т0 и Ti трансгенных растений табака.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание векторных конструкций, содержащих гены фунгицидно-бактерицидных пептидов, и анализ полученных с их помощью трансгенных растений»

В сельском хозяйстве остро стоит проблема потери урожая вследствие заражения культурных растений бактериальными и грибными патогенами и до недавнего времени она была трудно разрешима. Новые возможности в решении этих вопросов были получены благодаря активному изучению механизмов защиты растений против фитопатогенов и выявлению важной роли белков в этом процессе. Интенсивное изучение структуры и функций антимикробных пептидов, исследование их генетической обусловленности может помочь в создании методами генной инженерии трансгенных культурных растений, устойчивых к различным заболеваниям.

Создание трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам, является в последние годы одним из главных направлений генной инженерии культурных растений. Это достигается главным образом путем введения в них чужеродных генов, кодирующих защитные белки, накопление которых в тканях растений губительно для патогенов. Однако большинство известных защитных генов могут придавать устойчивость к одному или нескольким патогенам. В связи с этим, для защиты растений от патогенных грибов и бактерий очень перспективны гены, отвечающие за синтез пептидов, обладающих широким спектром фунгицидно-бактерицидного действия. К таким белкам принадлежат короткие цистеин-богатые белки, получившие название дефензины (от англ. defense - защита), а также - хитинсвязывающие белки.

В растениях дефензины были открыты в 1990 году [Colilla et al, 1990, Mendez et al.,1990]. Дефензины обнаружены у многих представителей таких важных для сельского хозяйства семейств, как Злаки, Крестоцветные, Сложноцветные, Бобовые, Пасленовые и других. Растительные дефензины -новый класс антимикробных пептидов, проявляющих структурную и функциональную гомологию с их двойниками у животных - дефензинами насекомых и млекопитающих, чье участие в защите организма хорошо установлено. Ряд доказательств подтверждают представление о том, что растительные дефензины - важные компоненты защитной системы растений: во-первых - нахождение на периферии различных органов, во-вторых - их производство в случае заражения патогеном, в-третьих - трансгенные растения, конститутивно экспрессирующие эти белки, обладают повышенной устойчивостью к заболеваниям. Для хитинсвязывающих белков также показана ингибирующая активность по отношению к патогенным микроорганизмам, а также - насекомым. Положительным моментом в характеристике этих белков является то, что они воздействуют на патогены в микромолярных количествах (10-40 мкг/мл). Среди известных на сегодняшний момент растительных дефензинов высокой антимикробной активностью обладают дефензины редьки (в частности - Rs-AFP2, R.S-AFP3), а среди хитинсвязывающих белков - белки амаранта (Ас-АМР2) [Broekaert et al., 1992а; Terras et al., 1995].

Поскольку эти пептиды короткие и состоят из 30-50 а.к., кодирующие их гены также обладают небольшими размерами (200-400 н.п.). Такая организация значительно облегчает процессы клонирования этих генов и трансформации ими растений.

В последнее время достаточно остро стоит вопрос биобезопасности в отношении получаемых генетически модифицированных организмов (ГМО): будут ли данные организмы опасны при попадании в окружающую среду и в качестве пищи для человека? В связи с этим необходимо отметить, что отличительной особенностью дефензинов редьки и антимикробных белков амаранта является то, что они не проявляют токсического действия на клетки животных и человека [Broekaert et al, 1992а, 1993].

Все выше сказанное о белках из редьки и амаранта предполагает возможность эффективного, а главное - безопасного применения генов этих белков для трансгеноза важнейших сельскохозяйственных культур.

Агробактериальная трансформация известна как наиболее оптимальный способ введения чужеродных генов в двудольные растения. В связи с этим, достаточно актуальна проблема создания генетических конструкций, обеспечивающих высокий уровень трансформации и экспрессии целевого гена. 7

От патогенов в большей степени страдают вегетативные органы растений. Поэтому экспрессия в них генов антимикробных белков, особенно -обладающих более высокой физиологической активностью пептидов из других растений, должна способствовать появлению необходимой устойчивости к патогенам у всего растения.

Нужно отметить, что несмотря на достаточную изученность строения и свойств антимикробных белков редьки и амаранта, в настоящее время насчитывается небольшое количество работ по получению растений экспрессирующих эти белки [Terras et al., 1995, De Bolle et al., 1996, De Bondt et al, 1998].

В связи с вышеизложенным, настоящая работа посвящена анализу полученных при помощи ПЦР амплификации в лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ геномных копий ас-ар и rs-ap, кодирующих хитинсвязывающий белок амаранта и дефензин редьки соответственно, созданию векторных конструкций с этими генами для проведения агробактериальной трансформации растений, а также - изучению на модельном растении табаке (Nicotiana tabacum) интеграции в геном и функционирования этих генов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Сердобинский, Леонид Александрович

ВЫВОДЫ

1. Впервые проклонйрованы геномные копии ас-ар и rs-ap, кодирующие хитинсвязывающий белок амаранта Ас-АМР2 и дефензин редьки Rs-AFP3, соответственно, определены их нуклеотидные последовательности, в том числе - нуклеотидная последовательность интрона гена rs-ap. Определена нуклеотидная последовательность гена rs, гомологичного кДНК дефензина редьки Rs-AFP2, и содержащегося в нем интрона. Выявлено, что интрон гена rs-ap состоит из 91 н.п., а интрон гена rs - из 100 н.п. и последовательности данных интронов не гомологичны.

2. Созданы векторные конструкции pK22rs, рК22ас, pPCV002rs, содержащие гены ас-ар и rs-ap антимикробных пептидов из амаранта и редьки под контролем конститутивного 358-промотора и терминатора гена VI ВМЦК, а также маркерный ген nptll. Показано, что данные конструкции позволяют осуществлять эффективный перенос генов антимикробных белков амаранта и редьки в геном двудольных растений.

3. Установлено, что использование конструкции pK22rs, созданной на основе вектора рН22Кпео, позволяет осуществлять более эффективную трансформацию растений геном rs-ap, по сравнению с конструкцией, созданной на основе стандартного бинарного вектора pPCV002.

4. Показано, что в поколении Т0 трансгенных растений табака ген rs-ap экспрессируется, в результате чего образуется соответствующий Rs-AP белок, а в поколении Ti экспрессии этого гена не наблюдается. Гены ас-ар и rs-ap транскрибируются в трансгенных растениях семенного поколения Ть

5. Выявлено, что в геноме растений табака семенного поколения Ть полученных путем самоопыления от трансгенных растений с генами ас-ар и rs-ap, данные гены представлены одной копией. Путем проведения сегрегационного анализа установлено, что гены антимикробных белков амаранта и редьки ас-ар и rs-ap стабильно наследуются согласно законам Менделя.

6. Создана система комплексной молекулярно-генетической оценки трансгенных растений с генами ас-ар и rs-ap антимикробных белков из амаранта и редьки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что введение в геном растений гетерологичных генов устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам может приводить к значительному положительному результату. Среди генов устойчивости представляют практический интерес гены, кодирующие короткие цистеин-богатые белки из амаранта и редьки. Структура данных белков хорошо изучена, показана их антимикробная активность к широкому кругу бактериальных и грибных патогенов растений in vitro. Также были получены трансгенные растения при помощи векторных конструкций содержащих кДНК антимикробных белков из семян амаранта Ас-АМР2 и редьки Rs-AFP2 [Broekaert et al., 1992,1995].

В связи с этим проведена работа по анализу и клонированию геномных копий кодирующих хитинсвязывающий белок амаранта Ас-АМР2 и дефензина из листьев редьки Rs-AFP3, При этом впервые были определены нуклеотидные последовательности и размеры интронов геномных копий дефензинов редьки RS-AFP2 и RS-AFP3.

Гены из амаранта (ас-ар) и редьки {rs-ap) были получены при помощи ПЦР в лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ. Затем ген rs-ap под контролем 325S промотора и терминатора ВМЦК был клонирован в бинарных векторах pPCV002 и рН22Кпео, а ген ас-ар под контролем тех же регуляторных элементов - в рН22Кпео. Вектор рН22Кпео, созданный в лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ, осуществляет перенос целевых генов за счет MobA-OriT системы плазмиды RSF1010, что отличает ее от стандартных бинарных векторов (в частности - от вектора pPCV002).

При помощи созданных конструкций была проведена агробактериальная трансформация растений табака, анализ которой показал, что перенос гена rs-ap в растения осуществляется более эффективно при помощи конструкции, созданной на основе рН22Кпео, Подобные результаты были получены и другими исследователями [Парашина 1999, Лебедев 2000].

81

Полученные векторные конструкции рК22ас, pK22rs, pPCV002rs нашли применение для агробактериальной трансформации растений таких сельскохозяйственных культур как томаты, картофель, капуста, малина, рапс, клевер, люцерна, кукуруза, свекла, яблоня, груша, земляника, морковь.

От трансгенных растений табака с генами rs-ap и ас-ар путем самоопыления было получено семенное поколение Ть растения которого были подвергнуты комплексному молекулярному анализу (ПЦР, ОТ-ПЦР, Саузерн- и Вестерн-блоттинг).

Изучение наследования генов rs-ap и ас-ар показало, что оно происходит согласно законам Менделя и гены присутствуют в геноме растений в виде единичных копий.

Экспрессия гена rs-ap, обнаруженная у двух трансгенных растений табака, в поколении этих растений не сохранялась, что можно объяснить за счет явления «замолкания » генов в семенном поколении трансгенных растений. Для гена ас-ар в поколении Ti линии 3850ас-1 и для гена rs-ap в поколении Tj линии 4404rs-l показано наличие транскрипции.

Таким образом, была создана система комплексной молекулярно-генетической оценки трансгенных растений с генами ас-ар и rs-ap. Данная система в настоящее время широко используется для анализа трансгенных растений различных культур с генами антимикробных белков амаранта и редьки.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сердобинский, Леонид Александрович, 2002 год

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки /М.: Мир, 1994, Т.2. С. 15-16.

2. Дрейпер Дж„ Скотт Р., Кумар А. и др. Генная инженерия растений. / Под ред. А. М. Колчинского. М,: Мир, 1991, С, 262,277-303.

3. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская А.А. и др. Нестабильность экспрессии маркерного гена nptll у трансгенных растений табака// Физиология растений. 2000. - Т. 47. - №3. - С. 446-452.

4. Зверева С.Д., Романов Г,А. Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования// Физиология растений. 2000, - Т, 47, - №3. - С. 479-484.

5. Клонирование ДНК. Методы,/ Под ред, Гловера Д. М.: Мир,- 1988.-С.144-147, 317-345, 363.

6. Лебедев В.Г. Генно-инженерные методы в селекции груши обыкновенной на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам.// Автореф. канд. дисс., 2000.

7. Левенко Б. Генная инженерия растений/ М.: Школьник, 2000.

8. Ли А,, Тинланд Б, Интеграция Т-ДНК в геном растений: прототип и реальность, // Физиология растений. 2000. - Т. 47. - №3. - С. 354-359,

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование,/ Под ред. Баева А. А. и Скрябина К. Г. М.: Мир, 1984.

10. Ю.Молекулярная клиническая диагностика. Методы./ Под редакцией С. Херрингтона и Дж, Макли, М,: Мир, 1999, С. 354-357.

11. П.Парашина Е.В. Создание и характеристика трансгенных форм томатов, экспрессирующих ген дефензина редьки Rs-AFP2// Автореф. канд. дисс., 1999.

12. Пирузян Э.С., Адрианов В.М. Плазмиды агробактерий и генетическая инженерия растений./М.:Наука, 1985, С.62-73.

13. Рыбчин В.Н, Основы генетической инженерии/СПб,: СПбГТУ, 1999, С.372-380.

14. Современные методы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. Методические рекомендации ВНИИСБ/М,;МСХА, 1998.-С. 59-66, 71-75.

15. Шаденков А. А., Ковалёва М. В., Кузьмин Е. В. и др. Vir D2 независимый, но Mob-A зависимый перенос ДНК плазмиды широкого круга хозяев RSF 1010 из агробактерии в ядро растительной клетки. // Молекулярная биология. 1996. - Т. 30. - Вып. 2. - С. 458-464.

16. Alexander D., Goodman R.M., Gut-Rella М. et al. Increased tolerance to two Oomycete pathogens in transgenic tobacco expressing pathogenesis-related protein la// Proc. Natl. Acad.Sci.USA.- 1993.-V.90.- P.7327-7331.

17. Allen A.K., Neuberser A, and Sharon N. The purification composition and specificity of wheat-germ agglutinin// Biochem, J.-1973.- V.131.- P.155-162.

18. An G., Ebert P.R., Mitra A., Ha S.B. Binary vectors.// Plant molecular biology manual. Ed. Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Verma D.P.S. Dodrecht: Kluwer Acad. Publ.-1988.-P.l-19.

19. Barrell P.; Conner A.; Hickford J. Transformation of potato (Solarium tuberosum L) with magainin II/ Abstracts of the 9th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, Amsterdam, 1999.- P. 194-195.

20. Benfey, P.N. & Chua, N.H. The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial regulation of transcription in plants// Sci.- 1990.- V. 250.-P. 959-966.

21. Benfey, P.N., Ren, L. & Chua, N.H. Tissue-specific expression from CaMV35S enhancer subdomains in early stages of plant development// European Molecular Biology Organization Journal.- 1990a.- V.9.- P.1677- 1684.

22. Benfey, P.N., Ren, L. & Chua, N.H. Combinatorial and synergistic properties of CaMV 35S enhancer subdomains.// European Molecular Biology Organization Journal.- 1990b.-V. 9.-P. 1685- 1696.

23. Bevan M.V. Binary agrobacterium vectors for plant transformation,// Nucl. Acids Res. 1984. V.22. P. 8711-8712.

24. Binns A.N., Thomashow M.F. Cell biology of Agrobacterium infection and transformation of plants// Ann. Rev, Microbiol.- 1988.- V.42.- P.575-606,

25. Bloch C., Richardson M. A new family of small (5kDa) protein inhibitors of insect a-amylases from seeds of sorghum (Sorghum bicolor (L) Moench) have sequence homologies with wheat y-purothionins// FEBS Lett.- 1991.-V.279,-P. 101-104.

26. Bohlmann H., Apel K. Thionins// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.-1991.-V.42.-P.227-240.

27. Boman H.G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity// Annu Rev Immunol.- 1995.- V.13.- P.61-92.

28. Broekaert W. F. et al. Biocidal Proteins.// WO 92/21699 1992.a

29. Broekaert W, F„ Marien W., Terras F. R, G. et al. Antimicrobial Peptides from Amaranthus caudatus Seeds with Sequence Homology to the Cysteine/Glycine-Rich Domain of Chitin- Binding Proteins//Biochemistry.- 1992b.- V.31.-P.4308-4314.

30. Broekaert W. F. et al. Biocidal Proteins.// WO 93/05153 1993.

31. Broekaert W. F. et al. Biocidal Chitin-Binding Proteins.// WO 94/11511 1994.

32. Broekaert W. F., Terras F. R. G., Cammue B. P. A., Osborn R. W. Plant Defensins: Novel Antimicrobial Peptides as Components of the Host Defense System, // Plant Physiol. 1995. - V. 108. - P. 1354-1358.

33. Broekaert W. F,, Cammue B,P,A. et al. Antimicrobial Peptides from Plants// Critical Reviews in Plant Sciences.- 1997.- V.16.- №3,- P.299-308, 312-315.

34. Broglie K., Chet I., Holliday M. et al. Transgenic Plants with Enhanced resistance to the Fungal Pathogen Rhizoctonia solani// Science.- 1991.- V.254.-P.l 194-1197.

35. Broglie K., Biddle P., Broglie R.Functional analysis of DNA sequences responsible for ethylene regulation of a bean chitinase gene in transgenic tobacco/ZPlant Cell- 1989.- V.I.- P.599-607.

36. Buchanon-Wollaston V., Passiatore J.E., Cannon F. The mob and oriT mobilizsation functions of a bacterial plasmid promote its transfer to plants// Nature- 1987.- V.328.- P.172-175.

37. Callis J., Fromm M., Walbot V. Introns increase gene expression in cultured maize cells// Genes and Development.- 1987.- V.I.- P. 1183-1200.

38. Cammue B.P.A., Thevissen K., Terras F. R. G. et al. Isolation and characterization of a novel class of plant antimicrobial peptides from Mirabilis jalapa L. seeds// J. Biol. Chem.-1992.-V.267.-P.2228-2233.

39. Carmona M.J., Molina A., Fernandez J.A., Lopez-Fando J,J„ Garcia-Olmedo F. Expression of the alpha-thionin gene from barley in tobacco confers enhanced resistance to bacterial pathogens,// Plant J. 1993. V.3. P.457-62.

40. Cheysen G., Villarroel R,, van Montagu M. Illegitimate Recombination in Plants: a Model for T-DNA integration// Genes Dev.-1991.- V.5.- P.287-297.

41. Chiang M.M., Hadwiger L.A., Horovitz D.Molecular characterization of a pea beta-l,3-glucanase induced by Fusarium solani and chisan chellenge// Plant Molecular Biology.-1992.-V.20,№4.- P.609-618.

42. Chiang M.M., Hadwiger L.A. The Fusarium solani-mdnced exspressionof a pea gene family encoding high cysteine content proteins.// Mol. Plant Microbe Interact-1991.- V.4.- P.324-331.

43. Collila F.J., Rocher A., Mendez E. Gamma-purothionins: amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm// FEBS Lett.-1990.-V.270.-P. 191 -194.

44. Comczynskiy P. A reagent for the single-step simultaneosus isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples// Biotechniques,- 1993.- V.15.-№3.- P.532-534, 536-537.

45. Cutt J.R., Harpster M.H., Dixon D.C. et al. Desease response to tobacco mosaic virus in transgenic tobacco plants that constitutively express the pathogenesis-related PR-lb gene//Virology.- 1989.-V.173.-P.89-97.

46. De Bolle, M.F.C., David K.M.M., Rees S.B. et al. Cloning and characterization of a cDNA clones encoding an antimicrobial chitin- binding proteins from amaranth, Amaranthus caudatus//V\mX Mol. Biol.- 1993.- V.22.- P.l 187-1190.

47. De Bolle, M.F.C., Osborn R. W,, Goderis I.J. et al. Antimicrobial peptides from Mirabilis jalapa and Amaranthus caudatus: expression, processing, localization and biological activity in transgenic tobacco// Plant Mol. Biol.- 1996.- V.31.-P.993-1008.

48. Derbyshire K.M., Willetts N. Mobilization of the nonconjugative plasmid RSF1010: a genetic analysis of its origin of transfer// Mol. Gen. Genet- 1987.-V.206.- P.l 54-160.

49. De Samblanx G.W., Goderis I.J. Mutational analysis of a plant defensin from radish (Raphanus sativus L.) reveals two adjacent sites important for antifungal activity,// J, of Biological Chemistry.- 1997,- V.272.- №2.- P.l 171-1179.

50. Douglas C.J., Staneloni R.J., Rubin R.A, and Nester E.W, Identification and genetic analysis an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence region// J. Bacterid.- 1985.- V.161.- P.850-860.

51. During, K.; Porsch, P.; Fladung, M.; Lorz, H. Transgenic potato plants resistant to the phytopathogenic bacterium Erwinia carotovorai! Plant Journal.- 1993.-V.3.- P. 587-598.

52. Edwards K., Johnstone C., Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.// Nucleic Acids Res. 1991. V.19. P.l349.

53. Epple P., Apel K., Bohlmann H. An Arabidopsis thaliana thionin gene is inducible via a signal transduction pathway different from that for pathogenesis-related proteins// Plant Physiology.- 1995.- V.109.- P.813-820.

54. Fischer W,, Christ U„ Baumgartner M., Erismann K.H., Mosinger E. Pathogenesis-related proteins of tomato. Biochemical and immunological characterization// Physiol. Mol. Plant Pathol.- 1989.- V.35.-P.67-83.

55. Flor H.H. Current status of the gene-for-gene concept.// Ann. Rev. Phytopathol. 1971. V.9. P.275-296.

56. Garbe T.R., Barathi J., Barnini S,, Zhang Y„ Abou-Zeid C,, Tang D., Mukherjee R., Young D.B. Transformation of mycobacterial species using hygromycin resistance as selectable marker.// Microbiology. -1994. -V.140.-P.133-138.

57. Garcia-01medo F„ Molina A., Segura A., Moreno M. The defensive role of nonspecific lipid-transfer proteins in plants// Trends in Microbiology.- 1995.-V.3.- P. 72-74.

58. Ganz Т., Lehrer R.I. Defensins// Curr Opin Immunol.- V.6.- P. 584-589,

59. Gatz C., Lenk I.Promoters that respond to chemical inducers// Trend Plant Sci.-1998.- V.3.- P.352-358.

60. Gao A.-G., Hakimi S, M., Mittanck C. A, et al. Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide. // Nature biotechnology. -2000.-V. 18.-P. 1307-1310.

61. Green P.J., Mun-Heng Y., Cuozzo M. et al. Binding site requirement for pea nuclear protein factor GT-1 correlate with sequences required for light-dependent transcriptional activation of the rbcS-ЗА gene// EMBO J.- 1988.-V.7.- №13.- P.4035-4044

62. Goldman MHS, Goldman G.H. Trichoderma harzianum transformant has high extracellular alkaline proteinase expression during specific mycoparasitic interactions// Genetics and Mol. Biolgy.- 1998.- V.21.- P.329-333,

63. Gu Q,, Kamata E.E., Morse M,J. Wu H.M., Cheung A.Y. A flower-specific c-DNA encoding a novel thionin in tobacco// Mol. Gen. Genet.- 1992.- V.234.-P.89-96.

64. Hammond-Kosack K.E., Jones J.D.G. Resistance Gene-Dependent Plant Defense Responses.// Plant Cell,- 1996,- V. 8.-P.1773-1791.

65. Haran S., Schickler H,, Chet I. Molecular mechanisms of lytic enzymes involved in the biokontrol activity of Trichoderma harzianum!I Microbiology.-1996.- V.142.- P.2321-2331.

66. Heberle-Bors E., Charvat В., Thompson D. et al. Genetic analysis of T-DNA insertions into tobacco genome // Plant Cell Rept,-1988.- V.7.- P.571-574.

67. Herrera-Estrella L., Depicker A., Van Montagu M,, Schell J. Expression of chimaeric genes transferred into plants cells using a Ti-plasmid-derived vector// Nature.-1983.- V. 303.- P.209-213.

68. Hoekema A., Hooykaas P., Schilperoort R. Transfer of octopine T-DNA segment to plant cells mediated by different types of Agrobacterium tumor- orroot-inducing plasmids: generality of virulence systems// J, Bact- 1984.-V.158.- P.383-385.

69. Hoffmann J.A., Hetru C. Insect defensins: inducible antibacterial peptides.// Immunol. Today.- 1992.- V.13.- P.411-415.

70. Hooykaas P.J.J., Den Dulk-Ras H., Schilperoort R.A, The Agrobacterium tumefaciens T-DNA gene 6b is an one gene.// Plant. Mol. Biol.- 1988.- V.ll.-P.791-794.

71. Hooykaas P.J.J, Beijersbergen AGM. The virulence system of Agrobacterium tumefaciens// Ann. Rev. Phytopathol.- 1994.- V. 32.- P. 157179.

72. Jung J.L., Friting В., Hahne G. Sunflower (Helianthus annuus L.) pathogenesis-related proteins// Plant Physiol.- 1993.- V.101, №3.- P.873-880.

73. Malik V.S., Saroha M,K. Marker gene controversy in transgenic plants// J. Plant Biochem. Biotechnol.- 1999.- V.8.- P.l-13.

74. Mannerlof M., Terming P. Variability of Gene Expression in Transgenic Tobacco// Euphytica.-1997.-V.98.-P. 133-139.

75. Martini N., Egen M,, Runtz I., Strittmatter G. Promoter sequences of a potato pathogenesis related gene madiate transcriptional activation selectively upon fungal infection//Mol. Gen. Genet.- 1993.- V.236.- №2.- P.179-186.

76. Mascarenhas D., Mettler I.J., Pierce D. Lowe H. Intron-mediated enchancement of geterologous gene expression in maize// Plant Mol. Biol.- 1990.- V.15.-P.913-920.

77. Meyer P., Heidmann I. Epigenetic Variants of Transgenic Petunia Line Show Hypermethylation in Transgene DNA: an Inactivation for Specific Recognition of Foreign DNA Transgenic Plants//Mol. Gen. Genet-1994.-V.243.-P.390-399.

78. Mitra A,, Zhang Z. Expression of a human lactoferrin cDNA in tobacco cells produces antibacterial protein(s).//Plant Physiol.- 1994.- V.106.-№3.-P.977-981.

79. Molano J., Polasheck I., Duran A., Cabib E. An endochitinase from wheat germ. Activity on nascent and preformed chitin.// J. Biol. Chem.- 1979.-V.254.- P. 4901-4907.

80. Molina A., Segura A., Garcia-Olmedo F, Lipid-transfer proteins (nsLTPs) from barley and maize leaves are potent inhibitors of bacterial and fungal plant pathogens// FEBS Lett.- 1993.- V.316.- P. 119-122.

81. Moreno M., Segura A., Garcia-Olmedo F. Pseudothionin-Stl, a potato peptide active against potato pathogens// Eur. J. Biochem.-1994.- V.223,-P.135-139.

82. Moiseyev G.P., Fedoreyeva L.I,, Zhuravlev Y.N, et al. Primary structures of two ribonucleases from ginseng calluses. New members of the PR-10 family of intracellular pathogenesis-related plant protein// FEBS Lett.-!997.- V.407.- P.207-210.

83. Murashige T, and Skoog F. A revised medium of rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiologia Plantarum. 1962. - V. 15.-P. 473-497.

84. Murdock L.L., Huesing J.E., Nielsen S.S., Pratt R.C., Shade R.E. Biological effects of plant lectins on the cowpea weevil.// Phytochemistry.-1990.-V.-29.- P.85-89.

85. Nakaya K., Omata K., Okahashi I,, Nakamura Y. et al. Amino acid sequence and disulfide bridges of an antifungal protein isolated from Aspergillus giganteus.//Eur J Biochem.- 1990.- V.193.- P.31-38.

86. Nap J.P., Bijvoet J., Stiekema W.J. Biosafety of kanamycin-resistant transgenic plants.// Transgenic Res, 1992 . V.6. P.239-249.

87. Osborn R. W., De Samblanx G. W., Thevissen K. et al. Isolation and characterisation of plant defensins of Asteracea, Fabacea, Hippocastanacea and Saxifragacea. I I FEBS Lett. 1995. - V. 368. - P. 257-262.

88. Penninckx I.A.M.A,, Eggermont K„ Terras F.R.G. et al. Pathogen-induced systemic activation of a plant defensin gene in Arabidopsis follows a salicylic acid-independent pathway// Plant Cell.-1996.-V.8.-P.2309-2323.

89. Stinissen H.M., Carlier A.R.Isolation and partial characterization of wheat-germ-agglutinin-like lectins from rye (Secale cereale) and barley (Hordeum vulgare) embryos// Biochem J.- 1982 V.203 (1).- P.239-243.

90. Peumans W.J., Van Damme E.G.M. Lectins as plant defense proteins// Plant Physiol.- 1995,- V.109.- P.347-352.

91. Raikhel N.V., Lee H.I., Broekaert W. F, Structure and function of chitin-binding proteins.// Annu.Rev.Plant Physiol. Plant Mol. Biol.-1993.-V.44.-P.591-615.

92. Rommens C.M., Salmeron J.M., Baulcombe D, et al, Intergeneric transfer and functional expression of the tomatodisease resistance gene Ptoll Plant Cell.- 1995,- V.7.- №10,- P.1537-1544.

93. Rossi L., Hohn В., Tinland B. The VirD2 protein of Agrobacterium tumefaciens carries nuclear localization signals important for transfer of T-DNA to plants// Mol. Gen. Genet.- 1993.- V.239.- P.345-353.

94. Rossi L., Hohn В., Tinland B.Integration of Complete Transferred DNA Units Is Dependent on the Activity of Virulence E2 Protein of Agrobacterium tumefaciens//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1996.-V.93.- P.126-130.

95. Roth D.B., Wilson J. Nonhomologous Recombination in Mammalian Cells: Role for Short Sequence Homologies in the Joining Reaction// Mol. Cell. Biol.- 1986.- V.6.- P. 4295-4304.

96. Ryan C. Protease inhibitors in plants: genes for improving defenses against insects and pathogens// Annu. Rev. Phytopathol.- 1990.- V.28.- P.425-449.

97. Salter M.G., JA Paine, KV Riddell, I Jepson, AJ Greenland, MX Caddick and AB Tomsett, Characterisation of the ethanol-inducible ale gene expression system for transgenic plants// The Plant Journal.- 1998,- V. 16,- P. 127-132.

98. Shagger H. and von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.// Anal. Biochem.- 1987.- V.166.- №2.- P.368-375.

99. Schlumbaum A„ Mauch F,, Vogeli U,, Boiler T. Plant chitinase inhibitor of fungal growth//Nature.- 1986,- V.324,- P.365-367.

100. Shibuya N„ Goldstein U,, Peumans W,J,, Broekaert W. F. Carbohydrate binding properties of the stinging nettle (Urtica dioica) rhizome lectin// Arch Biochem Biophys.- 1986.- V.249(l).- P.215-224.

101. Shinshi, H., D, Mohnen and F. Meins. Regulation of plant pathogenesis-related enzyme: Inhibition of chitinase and chitinase mRNA accumulation in cultured tobacco tissues by auxin and cytokinin// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1987.-V. 84.-P.89-93.

102. Singh N.K., Nelson D,E., Kuhn D., Hasegawa P.M, Bressan R.A. Molecular cloning of osmotin and regulation of its expression by ABA and adaptation to low water potential// Plant Physiol.- 1989,- V.90.- P. 1096-1101.

103. Stachel S.E., Nester E.W., Zambryski P. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression// Proc.Natl. Acad.Sci.USA.-1986.- V.83.- p.379-383,

104. Sweetman J. Chengcai Chu, Nan Qu, Andrew J. Greenland, Uwe Sonnewald and Ian Jepson. Ethanol Vapor Is an Efficient Inducer of the ale Gene Expression System in Model and Crop Plant Species// Plant Physiology. -2002.- V.-129.- P. 943-948.

105. Su, P. H„ S. M. Yu and Chen C. S. Spatial and temporal expression of a rice prolamin gene RP5 promoter in transgenic tobacco and rice.// J, Plant Physiol,-2001.- V, 158,-P. 247-254.

106. Terras F. R. G., Eggermont K., Kovaleva V. et al. Small Cysteine-Rich Antifungal Proteins from Radish: Their Role in Host Defense. // Plant Cell. -1995.-V. 7.-P. 573-588.

107. Terras F. R. G., Schoofs H. M. E„ De Bolle M. F. C. et al. Analysis of two novel classes of antifungal proteins from radish ( Raphanus sativus L.) seeds. //J. Biol. Chem. 1992. -V. 267. - P. 15301-15309.

108. Terras F. R. G., Torrekens S., Van Leuven F. et al. A new famili of basic cysteine-rich plant antifungal proteins from Brassicae-species. // FEBS Lett. -1993.-V. 316.-P. 233-240.

109. Terras F. R. G., Penninckx I.A.M.A., Goderis I.J., Broekaert W.F. Evidence that the role of plant defensins in radish defense responses is independent of salicylic acid// Planta.- 1998,- V.206.- P.l 17-124.

110. Tinland В., Hohn B. Recombination between Prokaryotic and Eukaryotic DNA: Integration of T-DNA into Plant Genome// Genetic Engineering,- 1995.- V.17.- P.209-229.

111. Thevissen K., Ghazi A,, De Samblanx G. W, et al. Fungal membrane responses induced by plant defensins and thionins, // The journals of Biological Chemistry. 1996. - V. 271. - № 25 - P. 15018-15025.

112. Thevissen K., Terras F. R., Broekaert W, F. Permeabilization of fungal membranes by plant defensins inhibits fungal growth. // Appl. Environ Microbiol. 1999. -V. 65. - №12. - P. 5451-5458.

113. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from acrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some application. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. - P. 4350-4354.

114. Tsuda M. Purification and characterization of a lectin from rice bran.//J Biochem.-1979.- V.86 (5).- 1451-1461.

115. Van Loon L.C., Gerrittsen Y.A.M., Ritter C.E. Identification, purification and characterization of pathogenesis-related proteins from virus-infected Samsun NN tobacco leaves// Plant Mol.Biol.-1987.-V.9.-P.593-609.

116. Van Loon L.C., Pierpoint W.S., Boiler Т., Conejero V. Recommendations for naming plant pathogenesis-related proteins// Plant Mol. Biol. Reporter.- 1994,- V.12.- P.245-264.

117. Van Loon L.C., Van Strien. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins.// Physiological and Molecular Plant Pathology.- 1999.- V.55.- P.85-97.

118. Van Parijs J., Broekaert W.F., Goldstein I.J., Peumans W.J. Hevein: an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex//Planta.- 1991.-V.183.- P.258-264.

119. Vaucheret H., Beclin C., Elmayan T. et al. Transgene-induced gene silencing in plants// The Plant Journal.- 1998.- V.16.- №6.-652-653

120. Vigers A.J., Roberts W.K., Selitrennikoff C.P. A new family of plant antifungal proteins// Mol. Plant Microbe Interact,-1991.- V.4.- P.315-323.

121. Vigers A.J., Wiedemann S,, Roberts W.K. et al. Thaumatin-like pathogenesis-related proteins are antifungal// Plant Sci.- 1992.- V.83.- P.155-161.

122. Wang Y., Nowak G., Culley D, et al. Constitutive expression of pea defense gene DRR206 confers resistance to blackleg {Leptosphaeriamaculans) disease in transgenic canola (Brassica napus)// Mol. Plant-Microbe Interact.-1999.-V.12.-P.410-418

123. Woloshuk C.P., Meulenhoff J.S., Sela-Buurlage M.B. et al. Pathogen-induced proteins with inhibitory activity toward Phytophthora infestansll Plant Cell.- 1991.-V.3.- P.619-628.

124. Wu G,, Shortt B.J., Lawrence E.B. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding HbCVgenerating glucose oxidase in transgenic potato plants.// Plant Cell.- 1995.- V.7.- P.1357-1368.98

125. Zambryski P., Joos H,, Genetello C. et al. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capaciti// EMBO J.-1983.-P.2143-2150.

126. Zhu B.s Chen T.H.H., Li P.H. Activation of two osmotin-like protein genes by abiotic stimuli and fungal pathogen in transgenic potato plants// Plant Physiol.- 1995.- V.108.- P. 929-937.

127. Zhu В., Chen T,H,H., Li P.H.Expression of an ABA-responsive osmotin-like gene during the induction of freezing tolerance in Solanum commersonii//Plant Mol. Biol.- 1993.- V.21.- P.729-735

128. Zupan J.R., Zambryski P. Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the Plant Cell// Plant Physiol. 1995.- V.107.- P. 1041-1047,