Диагностическое значение цитоморфологических, культуральных и иммуногенных свойств Trichomonas vaginalis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.46, кандидат биологических наук Раздольская, Наталья Владимировна

• Раздольская, Наталья Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Раздольская, Наталья Владимировна

Страница

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА Т. VAGINALIS И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ТРИХОМОНИАЗА (обзор литературы).

1.1. Общебиологические и структурно-функциональные характеристики паразитического простейшего Т. vaginalis.

1.2. Антигенные свойства Т. vaginalis.

1.2.1. Особенности иммунного ответа макроорганизма при урогенитальном трихомоииазе.

1.3. Патогенез и клиника заболевания.

1.3.1. Цитопатогенность Т. vaginalis.

1.4. Лабораторная диагностика трихомониаза.

1.4.1. Микроскопические методы исследования в диагностике трихомониаза.

1.4.2. Культуральная диагностика трихомониаза.

1.4.3. Серологическая диагностика трихомониаза.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 .Trichomonas vaginalis.

2.2. Клеточные культуры.

2.3. Характеристика обследованных пациентов и панели сывороток крови больных.

2.4. Методы культивирования и хранения.

2.4.1. Состав питательных сред для культивирования Т. vaginalis.

2.4.2. Метод получения накопительных культур.

2.5. Криоконсервация штаммов Т. vaginalis.

2.6. Моделирование инфекции in vitro.

2.6.1. МТТ-тест.

2.7. Методы микроскопии и приготовление препаратов.

2.7.1. Микроскопия клинического материала.

2.7.2. Световая микроскопия лабораторных культур.

2.7.3.Электронная микроскопия.

2.7.3.1. Метод ультратонких срезов.

2.7.3.2. Позитивное контрастирование.

2.8. Методика изучения фагоцитарной активности Т. vaginalis.

2.9. Методы получения трихомонадных антигенов.

2.9.1. Процедуры постановки ИФА в модифицированном варианте и с использованием коммерческой тест-системы.

2.10. Иммуноблоттинг.

2.11. Статистическая обработка результатов исследований.

Глава 3. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ

МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ФОРМ Т. VAGINALIS.

3.1. Световая микроскопия витальных препаратов Т. vaginalis.

3.2. Световая микроскопия окрашенных препаратов.

3.3. Фазово-контрастная микроскопия и дифференциально-интерференционный контраст Т. vaginalis.

3.4. Комбинированная (фазово-конграстная и флюоресцентная) микроскопия нативных препаратов Т. vaginalis.

3.5. Электронно-микроскопические особенности морфотипов Т. vaginalis.

Глава 4. АНАЛИЗ ПАРАМЕТРОВ РОСТА Т. VAGINALIS IN VITRO, МОДЕЛИРОВАНИЕ ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА И СОЗДАНИЕ

БАНКА ШТАММОВ.

4.1. Оптимизация питательной среды TYM.

4.2. Оптимизация условий культивирования Т. vaginalis при моделировании инфекционного процесса.

4.2.1. Оценка эффективных концентраций

Т. vaginalis при моделировании инфекционного процесса in vitro.

4.3. Анализ цитоморфологических изменений Т. vaginalis при контакте с клеточными линиями.

4.4. Изучение фагоцитарной активности у различных морфотипов Т. vaginalis.

4.5. Криоконсервация штаммов Т. vaginalis.

Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ ИНФОРМАТИВНОСТИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ

ДИАГНОСТИКИ ТРИХОМОНИАЗА.

5.1. Оптимизация концентрации трихомонадных антигенов для проведения ИФА.

5.2. Изучение чувствительности ИФА в модифицированном варианте при обследовании больных трихомониазом.

5.3. Изучение уровня противотрихомонадных IgG-антител у больных трихомониазом.

5.4. Изучение подклассов специфических противотрихомонадных IgG-антител у больных трихомониазом.

5.5. Иммуноблоттинг.

5.5.1. Оптимизация условий постановки иммуноблоттинга.

5.5.2. Постановка иммуноблоттинга в оптимальных условиях.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Диагностическое значение цитоморфологических, культуральных и иммуногенных свойств Trichomonas vaginalis»

Актуальность проблемы. Trichomonas vaginalis является возбудителем одного из широко распространенных заболеваний урогенитального тракта -трихомониаза (Клименко Б.В. и др., 2001; Дмитриев Г.А., 2003; Healy G.R., Smith J.W., 1991). Высокий уровень заболеваемости трихомониазом в Российской Федерации и в мире, преобладание вялотекущих, малосимптомных форм со стертой клинической картиной заболевания, а также возможные разночтения результатов клинико-лабораторных исследований создают проблемы при постановке диагноза и лечении.

На протяжении многих десятилетий исследователи занимались изучением структурно-функциональных характеристик Т. vaginalis типичной грушевидной формы (Беднова В.Н., 1989; Овчинников Н.М., Делекторский В.В., 1986; Benchimol М., 2004). Другие нетипичные морфологические формы Т. vaginalis до сих пор описаны и изучены недостаточно полно. Сложность лабораторно-диагностических процедур при трихомониазе связана с идентификацией нетипичных округлых форм простейшего в клиническом материале, а также с их дифференцировкой от других клеточных элементов (Дмитриев Г.А., 2003; Pelrin D. et al., 1998; Krieger J.N. et al., 1999). Парадоксально, но, несмотря на то, что исследователи признают наличие различных форм простейшего, нормативные документы РФ по лабораторной диагностике урогенитального трихомониаза регламентируют дифференцировку исключительно типичных, грушевидных форм Т. vaginalis. Крайне важным в существующей ситуации является получение детальных описаний цитоморфологических характеристик всех морфотипов трихомонад необходимых для идентификации возбудителя различными методами микроскопии. Актуальным является изучение цитоморфологического полиморфизма клеток Т. vaginalis и его биологического смысла, оценка их жизнеспособности в условиях культивирования и в модели инфекции in vitro.

В связи с широким использованием в лабораторной практике дополнительных видов световой микроскопии, перспективно их внедрение в лабораторную диагностику трихомониаза. Однако до сих пор многие микроскопические подходы не апробированы на практике.

Предпочтительным методом диагностики трихомониаза является их культивирование на питательных средах (Сюч Н.И., 2000; Дмитриев Г.А. и др., 2001; Poch F., 1996). На сегодняшний день крайне ограничены сведения о метаболизме вирулентных форм, которые не удается поддерживать в периодических культурах длительное время. Составы сред не оптимальны, практически не изучено влияние условий культивирования на цигоморфологические свойства простейших. В связи с этим необходима дополнительная работа по изучению роста возбудителя in vitro.

Серологические методы исследования используются исключительно в качестве вспомогательных. Сложности интерпретации результатов иммуноферментного анализа возникают из-за отсутствия экспериментальных данных по его использованию.

Эпидемиологические исследования и изучение биологических свойств Т. vaginalis невозможно без создания коллекции вирулентных штаммов. При невозможности длительного культивирования единственным способом является криоконсервирование (Habib F.S., 2004; Malsuo А., 2007). До сих пор отсутствует методика по длительному криосохраиению Т. vaginalis, а также оценки выживаемости на разных сроках.

Знание особенностей жизненного цикла Т. vaginalis, совершенствование культивирования и хранения штаммов, апробация новых микроскопических методик и разработка подходов иммуноферментного анализа позволят значительно повысить эффективность диагностических процедур.

Цель работы: определить диагностическое значение цитоморфологических, культуральных и иммуногенных свойств Trichomonas vaginalis и обосновать рекомендации по повышению эффективности лабораторной диагностики трихомониаза.

Задачи исследования:

1. Изучить цитоморфологический полиморфизм и дать характеристики клинических изолятов Т. vaginalis с использованием различных методов микроскопии.

2. Охарактеризовать полиморфизм Т. vaginalis на культуре клеток в модели инфекционного процесса in vitro.

3. Изучить влияние условий культивирования на цитоморфологические свойства Т. vaginalis.

4. Оценить фагоцитарную активность различных цитоморфологических форм Т. vaginalis.

5. Оптимизировать методику криоконсервации Т. vaginalis, оценить ее эффективность и сформировать банк штаммов трихомонад.

6. Получить трихомонадные антигены и изучить в иммуноферментном анализе уровень и частоту обнаружения положительных результатов при выявлении противотрихомонадных IgG-антител у больных трихомониазом.

7. Оптимизировать процедуру проведения иммуноблоттинга с лизатом чистой культуры Т. vaginalis и выявить наиболее иммуногенные антигены.

Научная новизна исследования.

Впервые разработаны критерии идентификации нетипичных цитоморфологических форм клинических изолятов Т. vaginalis, выявляемых при микроскопической диагностике трихомониаза. На основе фагоцитарной активности доказана жизнеспособность нетипичных морфологических форм трихомонад. В модели инфекционного процесса in vitro установлены закономерности полиморфизма Т. vaginalis в различные стадии взаимодействия с культурами клеток. Для культуральной диагностики трихомониаза определен оптимальный состав питательной среды на основе клеточной линии MDCK с внесением сыворотки крови, позволяющей выявлять нетипичные морфотипы трихомонад на ранних сроках культивирования.

Практическая значимость.

Показано, что при микроскопической и культуральной диагностике трихомониаза наиболее часто выявляются нетипичные округлые и амебоидные цитоморфологические формы Т. vaginalis. Описанные формы трихомонад жизнеспособны, и в связи с этим они должны учитываться при лабораторной диагностике трихомониаза.

Экспериментально обоснованные оптимальные составы питательной среды TYM с внесением сыворотки крупного рогатого скота, а также клеточной линии MDCK, позволяют накапливать максимальные концентрации Т. vaginalis округлого морфотипа на ранних сроках культивирования, что повышает чувствительность лабораторной диагностики трихомониаза.

Разработанная оригинальная методика криоконсервации может быть использована для создания банка референс-штаммов Т. vaginalis, необходимого для оценки качества лабораторных исследований. Сконструированная иммуноферментная тест-система для обнаружения противотрихомонадных IgG-антител может использоваться в дополнение к существующим диагностическим подходам. Установлено, что трихомонадный антиген с молекулярной массой 50 кДа является наиболее иммуногенным и перспективен для создания его искусственного аналога с целью стандартизации серологической диагностики трихомониаза.

Личное участие автора в получении результатов.

Данные, представленные в работе, получены лично автором. Автором выполнены все микроскопические исследования, включая электронную микроскопию; создана база микрофотографий; проведено культивирование штаммов Т. vaginalis и поддержание их в состоянии глубокой заморозки; поддерживались клеточные линии, и осуществлялось моделирование инфекционного процесса; выполнен весь комплекс серологических исследований.

Автором лично планировались исследования, формировалась база данных и проводилась статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Нетипичные округлые и амебоидные цитоморфологические формы Т. vaginalis являются жизнеспособными, участвуют в развитии инфекционного процесса и должны учитываться в лабораторной диагностике трихомониаза.

2. Охарактеризованные цитоморфологические и ультраструктурные признаки нетипичного округлого морфотипа Т. vaginalis с применением различных методов микроскопии позволяют дифференцировать их от других клеточных элементов, что является необходимым критерием для повышения эффективности микроскопической диагностики трихомониаза.

3. Разработанная модель инфекционного процесса in vitro с использованием клеточных культур и оптимизация питательной среды позволяет изучать механизм патогенеза и особенности цитоморфологической изменчивости Т. vaginalis.

4. Серологическая диагностика трихомониаза носит вспомогательный характер. Наибольшей иммуногенностыо обладает белковый антиген Т. vaginalis с молекулярной массой 50 кДа. Данный белок является перспективным для создания иммуноферментной тест-системы для выявления противотрихомонадных IgG-антител.

5. Создание криобанка штаммов Т. vaginalis способствует стандартизации и воспроизводимости результатов лабораторной диагностики трихомониаза.

Реализация и внедрение результатов исследования.

Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу Научно-исследовательского отдела передовых медико-биологических технологий НИЦ, кафедры и клиники кожных и венерических болезней, кафедры микробиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, ГУЗ «КВД №4» и ГУЗ «Ленинградского областного КВД» (С.Петербург).

Апробация и публикация материалов исследования.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 40-й научно-практической конференции дерматовенерологов и врачей смежных специальностей Санкт-Петербурга «Актуальные проблемы дерматовенерологии. Контроль и профилактика инфекций, передающихся половым путем» (С.-Петербург, 2005); Научно-практической конференции

Актуальные вопросы дерматовенерологии» (С.-Петербург, 2006); заседаниях Санкт-Петербургского общества дерматовенерологов им. В.М. Тарновского (С.Петербург, 2006, 2008) и Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им И.И. Мечникова (С.-Петербург, 2007); XI Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С.-Петербург, 2007), V Европейском конгрессе по протистологии и XI Европейской конференции по биологии беспозвоночных (С.-Петербург, 2007), Научно-практической конференции «Актуальные вопросы этиологической диагностики инфекционных заболеваний» (Екатеринбург, 2008); Международном научно-практическом семинаре «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем» (С.-Петербург, 2008); Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология' и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009); 1-ом Евразийском конгрессе дерматовенерологии, косметологии и эстетической медицины (Астана, Казахстан, 2009).

По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том числе 36 - в сборниках материалов конференций, 4 статьи в журналах по перечню ВАК Минобразования и науки Российской Федерации.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения собственных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 139 источников, в том числе 50 отечественных и 89 зарубежных. Текст содержит 18 таблиц, 1 формулу и 31 рисунок.

Заключение диссертации по теме «Клиническая лабораторная диагностика», Раздольская, Наталья Владимировна

1. Результаты исследования предназначены для использования специалистами в области клинической лабораторной диагностики, микробиологии и дерматовенерологии в медицинских учреждениях.

2. Грушевидные, округлые и амебоидные морфотипы жизнеспособны и являются стадиями инфекционного процесса. При микроскопической диагностике трихомониаза необходимо учитывать все морфологические формы Т. vaginalis

3. Для культуральной диагностики трихомониаза предпочтительно использовать питательную среду TYM, обогащенную сывороткой крупного рогатого скота, в связи с длительным поддержанием на ней округлых морфотипов.

4. Для повышения диагностической эффективности культуральной диагностики трихомониаза по выявлению нетипичных цитоморфологических форм Т. vaginalis необходимо применять комбинацию клеточной линии MDCK и среды TYM с сывороткой крупного рогатого скота.

5. Криоконсервацию Т. vaginalis целесообразно проводить при следующих условиях: очистка штаммов смесью антибиотиков (бензилпенициллина, стрептомицина, канамицина, линкомицина, гентамицина и амфотерицин В); многократное пассирование на монослое; помещение в криозащитную среду (30% сыворотки КРС, 5-7% ДМБО и 5% ростовой среды для культур клеток), стадийное замораживание от +20°С до —» -70°С —> -196°С и размораживание при +40.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Раздольская, Наталья Владимировна, 2009 год

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адаме. М.: Мир, 1983.-262 с.

2. Ашакова Л.М. Изучение биологических свойств Trichomonas vaginalis и совершенствование лабораторной диагностики трихомониаза: Автореф. дис.канд. биол. наук / Л.М. Ашакова Алмата-Ата, 1999. - 13 с.

3. Баткаев Э.А. Урогенитальный трихомониаз / Э.А. Баткаев, Д.В. Рюмин // Лечащий врач. 2002. - №12. - С. 1-7.

4. Беднова В.Н. Определение чувствительности влагалищных трихомонад к препаратам группы нитроимидазола с использованием плотных питательных сред / В.Н. Беднова, М.М. Васильев // Вестн. дерматологии и венерологии. -1982. -№11. С. 19-21.

5. Беднова В.Н. Ускоренная РИФ-40 в диагностике мочеполового трихомоноза / В.Н. Беднова, С.Л. Зильман, В.Е. Павловская и др. // Вестн. дерматологии и венерологии. 1981. - №7. - С. 19-21.

6. Беднова В.Н. Новый краситель для бактериоскопической диагностики гонореи и трихомониаза / В.Н. Беднова, Т.Н. Данилова, Т.Е. Вахнина // Вестн. дерматологии и венерологии. 1983. - №2. - С. 32-43.

7. Беднова В.Н. Методы получения чистой культуры влагалищных трихомонад / В.Н. Беднова, М.М. Васильев // Вестн. дерматологии и венерологии. 1985. - №12. - С. 22-25.

8. Беднова В.Н. Сухая питательная среда из ферментативных гидролизатов биомассы микроорганизмов для выделения влагалищных трихомонад / В.Н. Беднова, Т.Е. Вахнина, Г.П. Головкина и др. // Вестн. дерматологии и венерологии. 1988. - №10. - С. 13-16.

9. Беднова В.Н. Ультрацитохимическое изучение гидрогеносом Trichomonas vaginalis / В.Н. Беднова, Е.Е. Брагина, Г.А. Дмитриев // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1989. - №11. - С. 13-16.

10. Беднова В.Н. Выявление антигенов поверхности влагалищных трихомонад с помощью сканирующего электронного микроскопа / В.Н. Беднова, Е.Е. Брагина, Г.С. Капцева // Вестн. дерматологии и венерологии. -1990. №5.-С. 19-23.

11. Вагорас А. Основы микроскопии мазков мочеполового тракта / А. Вагорас, А. Савичева, А. Гален и др. Каунас.: Издательство студия КАТА, 2001.-42 с.

12. Васильев М.М. Влияние оротовой кислоты, гипоксантина и солянокислого аргинина на развитие культуры влагалищных трихомонад / М.М. Васильев, В.Н. Беднова // Вестн. дерматологии и венерологии. 1980. -№7. - С. 32-34.

13. Васильев М.М. Диагностика мочеполового трихомоноза с использованием сухой питательной среды из кровезаменителей: Автореф. дис. . к-та мед. наук / М.М. Васильев. М., 1980. - 22 с.

14. Васильев М.М. Морфология и биологическая активность влагалищных трихомонад, выращенных на различных питательных средах / М.М. Васильев, В.Н. Беднова, В.Н. Брагина и др. // Вестн. дерматологии и венерологии. 1988.- №8. С. 22-26.

15. Галактионов В.Г. Иммунология / В.Г. Галактионов. М.: РИЦ МДК, 2000.- 488 с.

16. Дмитриев Г. А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций / Г.А. Дмитриев. Н. Новгород: Издательство НГМА, 2003. - 336 с.

17. Дмитриев Г.А. Морфофункциональные особенности устойчивого к мегронидазолу штамма Trichomonas vaginalis / Г.А. Дмитриев, Е.Е, Брагина, В.И. Кисина и др. // Вестн. дерматологии и венерологии. 1994. - №4. - С. 1215.

18. Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика урогенитального трихомониаза / Г.А. Дмитриев, Н.И. Сюч, М.Ф. Латыпова и др. // ИППП. 2001. - №6. - С. 22-25.

19. Дмитриев Г.А. Клинико-лабораторная оценка давности заболевания урогенитальным трихомониазом / Г.А. Дмитриев, Н.И. Сюч, О.П. Сосновцева // Клин, дерматология и венерология. 2004. - №4. - С. 61-64.

20. Дмитриев Г.А. Мочеполовой трихомониаз / Г.А. Дмитриев, Н.И. Сюч -М.: Медицинская книга, 2005. 128 с.

21. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферменгного анализа / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев и др.- М.: Медицинская книга, 1991. 288 с.

22. Ермоленко Д.К. Урогенитальный трихомониаз / Д.К. Ермоленко, В.А. Исаков, С.Б. Рыбалкин и др. Пособие для врачей. Санкт-Петербург -Великий Новгород: Тактик-Студио. - 2007. - 96 с.

23. Зильман С. J1. О сроках микроскопирования посевов влагалищной трихомонады / С.Л. Зильман // Лабораторное дело. 1979. - №3. - С. 167-169.

24. Ильин И.И. Негонококковые уретриты у мужчин / И.И. Ильин. М.: Медицина, 1991. - С. 44-199.

25. Карпов С.А. Строение клетки протестов / С.А. Карпов. СПб.: ТЕССА, 2001.- 382 с.

26. Кисина В.И. Урогенитальный трихомониаз: проблемы и пути их решения /В.И. Кисина//ИППП. -2001. №6. - С. 14-17.

27. Клименко Б.В. Трихомониаз мужчин, женщин и детей / Б.В. Клименко, Э.Р. Авазов, В.Б. Барановская и др. СПб.: Издательство Сюжет, 2001. - 183 с.

28. Климович В.Б. Моноклональные антитела против иммуноглобулинов человека: Автореф. дис. . д-ра мед. наук / В.Б. Климович. Санкт-Петербург, 1996.- 36 с.

29. Козловская Л.В. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования / Л.В. Козловская, М.А. Мартынова. М.: Медицина, 1975. - С. 12-14.

30. Козлюк А.С. Цитоморфологическая диагностика урогенитального трихомониаза / А.С. Козлюк, В.А. Козлюк // ИППП. 2001. - №6. - С. 26-29.

31. Культура животных клеток. Методы. / Под ред. Р. Фрешни. М.: Мир, 1989.-333 с.

32. Курашвили Н.В. Изучение некоторых биологических свойств Т. vaginalis и иммунологических сдвигов у больных трихомониазом: Автореф дис. . канд. биол.наук / Н.В. Курашвили. Тбилиси, 1989. 21 с.

33. Методы культивирования клеток / Под ред. Г.П. Пинаева, М.С. Богдановой. СПб.: Изд-во политехи, ун-та, 2008. - 278 с.

34. Михайлов А.В. Распространенность урогенитального трихомониаза и особенности его лабораторной диагностики у женщин с хроническими заболеваниями органов малого таза / А.В. Михайлов, Т.А. Гасанова // ИППП. -2000. №2. - С. 26-29.

35. Овчинников Н.М. Ультраструктура возбудителей венерических заболеваний и ее клиническое значение / Н.М. Овчинников, В.В. Делекторский. М.: Медицина, 1986. - 224 с.

36. Овчинников Н.М. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем / Н.М. Овчинников, В.Н. Беднова, В.В. Делекторский. М.: Медицина, 1987. - С. 255-267.

37. Панкратов В.В. Роль комбинации системного и местного лечения при трихомониазе / В.В. Панкратов // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2003. - №2. - С. 85-88.

38. Райков И.Б. Ядро простейших, морфология и эволюция / И.Б. Райков. Л.: Наука, 1978. - 382 с.

39. Ресурсы и деятельность кожно-венерологических учреждений. Заболеваемость за 2002-2003 годы // Статистический материал. М.: Медицинская книга, 2005. - 124 с.

40. Суханова К.М. Класс Parabasalea: В кн. Протисты. Часть 1. Руководство по зоологии / К.М. Суханова СПб. 2000. С. 357-368.

41. Савичева A.M. Краткое руководство по микроскопической диагностике инфекций, передаваемых половым путем / A.M. Савичева, Е.В. Соколовский, М. Домейка. СПб.: Издательство Фолиант, 2004. - 125 с.

42. Сюч Н.И. Актуальные вопросы лабораторной диагностики мочеполового трихомониаза / Н.И. Сюч // ИППП. 2000. - Т.З. - С. 4-6.

43. Танрыбердыева М.О. К вопросу об использовании метода иммунофлуоресценции в диагностике трихомоноза у мужчин: Автореф. дис.канд. мед. наук / М.О. Танрыбердыева. Москва, 1976. - 25с.

44. Халдин А.А. Урогенитальный трихомониаз: вопросы антибактериальной терапии / А.А. Холдин, К.М.Ломоносов, И.М. Изюмова и др. // Рос. журн. кожных и венерических болезней. 2006. - №1. - С. 1-4.

45. Черепович B.C. Оптимизация критических параметров МТТ-теста для оценки клеточной и лекарственной цитотоксичности / В. С. Черепанов, Е.В. Волочник, Е.В. Антоненко // БМЖ. 2006. - Т.2, №16. - С. 44-46.

46. Шпакова А.П. МТТ-колориметрический метод определения цитотоксической активности естественных киллерных клеток / А.П. Шпакова, К.С. Павлова, Т.И. Булычева // Клин. лаб. диагн. 2000. - №2. - С. 20-23.

47. Юнкеров В.И. Основы математико-статисгического моделирования и применения вычислительной техники в научных исследованиях / Под ред. В.И. Кувакина. Спб.: Издательство ВМедА, 2000. - 140 с.

48. Яцуха М.В. Приготовление и применение питательных сред для диагностики трихомониаза / М.В. Яцуха, Г.М. Засыпкина // Лаб. дело. 1977. -№5. - С. 293-295.

49. Яцуха М.В. Лабораторная диагностика мочеполового трихомоноза в кожно-венерологических диспансерах / М.В. Яцуха, Р.П. Шкляр, Г.М. Засыпкина и др. // Вестн. дерматологии и венерологии. 1982. - №8. - С. 19-22.

50. Яцуха М.В. Диагностическая значимость культурального исследования при выявлении больных трихомониазом / М.В. Яцуха // Вестн. дерматологии и венерологии. 1989. - №10. - С. 63-67.

51. Abonyi A. Examination of nonflagellate and flagellate round forms of Trichomonas vaginalis by transmission electron microscopy / A. Abonyi // Appl. Parasitol. 1995. - Vol.36, №4. - P. 303-310.

52. Ackers J.P. Antitrichomonal antibodies in the vaginal secretions of women infected with Trichomonas vaginalis / J.P. Ackers, W.H.R. Lumsden, R.D. Catterall et al. // Brit. J. Vener. Dis. 1975. - Vol.51. -P. 319-323.

53. Addis M.F. Identification of Trichomonas vaginalis a-actinin as the most common immunogen recognized by sera of woman exposed to the parasite / M.F. Addis, P. Rappelli, A. Andtade et al. // JID. 1999. - Vol.180. - P. 1727-1730.

54. Alderete J.F. Identification of immunogenic and antibody-binding membrane proteins of pathogenic Trichomonas vaginalis / J.F. Alderete // J. Infect. Immun. -1983. Vol.40, №1. - P. 284-291.

55. Alderete J.F. Pathogenic Trichomonas vaginalis cytotoxicity to cell culture monolayers / J.F. Alderete, E. Pearlman // Br. J. Vener. Dis. 1984. - Vol.60. - P. 99-105.

56. Alderete J.F. Specific nature of Trichomonas vaginalis parasitism of host cell surface / J.F. Alderete, G. Garza // J. Infect. Immun. 1985. - Vol.50, №3. - P. 701708.

57. Alderete J.F. Monoclonal antibody to a major glycoprotein immunogen mediates differential complement-independent lyses of Trichomonas vaginalis / J.F. Alderete, L. Kasmala // J. Infect. Immun. 1986. - Vol.53, №3. - P. 697-699.

58. Alderete J.F. Specific parasitism of purified vaginal epithelial cells by Trichomonas vaginalis / J.F. Alderete, P. Demes, A. Gombosova et al. // J. Infect. Immun. 1988. - Vol.56, №10. - P. 2991-2997.

59. Arroyo R. Trichomonas vaginalis surface proteinase activity is necessary for parasite adherence to epithelial cells / R. Arroyo, J.F. Alderete // J. Infect. Immun. -1989.-Vol.57.-P. 2991-2997.

60. Arroyo R. Signalling of Trichomonas vaginalis for amoeboid transformation and adhesion synthesis follows cytoadherence // R. Arroy, A. Gonzalez-Robles, A. Martinez-Palomo et al. // Molec. Microbiol. 1993. - Vol.7, №2. - P. 299-309.

61. Beal C. The plastic envelope method, a simplified technique for culture diagnosis of trichomoniasis / C. Beal, R. Goldsmith, M. Kotby et al. // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol.30. - P. 2265-2268.

62. Benchimol M. Trichomonads under microscopy / M. Benchimol // Microsc. Microanal. 2004. - V. 10. - P. 528-550.

63. Benchimol M. Hydrogenosome morphological variation induced by fibronectin and other drugs in Trichomonas vaginalis and Trichomonas foetus / M.Benchimol // J. Parasitol. Res. 2001. - Vol.87. - P. 215-222.

64. Benchimol M. Trichomonas vaginalis: observation of coexistence of multiple viruses in the same isolate / M. Benchimol, T.-H. Chang, J.F. Alderete // FEMS Microbiol. Letter. -2002. Vol.215. - P. 197-201.

65. Beverly A.L. Viability of Trichomonas vaginalis in transport medium / A.L. Beverly, M. Venglarik, B.Cotton et al. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol.37, №11. -P. 3749-3750.

66. Boggild A.K. Localization of post-translationally modified a-tubulin and pseudocyst formation in tritrichomonads / A.K. Boggild, C.A. Sundermann, B.H. Estridge // Parasitol. Res. 2002. - Vol.88. - P. 468-474.

67. Cavalier-Smith T. Molecular diversity of the free-living archezoan Trepomonas agilis and the nature of the first eukaryote / T. Cavalier-Smith, E.E. Chao // J. Mol. Evol. 1996. - Vol.43. - P. 551-563.

68. Chipperfield E.J. The influence of local infection on immunoglobulin formation in the human endocervix / E.J. Chipperfield, B.A. Evans // Clin. Exp. Immunol. -1972.-Vol.ll.-P. 219-223.

69. Clark C.G. Methods for cultivation of luminal parasitic protists of clinical impotance / C.G. Clark, L.S. Diamond // J. Clin. Microb. Rev. 2002. - Vol.15, №3. - P. 329-341.

70. Cogne M. Detection and characterization of serum antitrichomonal antibodies in urogenital trichomoniasis / M. Cogne, P. Brasseur, J.J. Ballet // J. Clin. Microb. -1985. Vol.21, №4. - P. 588-592.

71. Connelly R.J. Identification of a surface antigen of Trichomonas vaginalis / R.J. Connelly, B.E. Torian, Н.Ы. Stibbs // J. Infect. Immun. 1985. - Vol.49, №2. - P. 270-274.

72. Cristian R.T. A study of Trichomonas vaginalis cell culture / R.T. Cristian, D. Norman, F. Miller//Am. J. Obst. Gynecol. 1963. - Vol.85, №7. - P. 947-954.

73. Crouch M.L. Trichomonas vaginalis interactions with fibronectin and laminin / M.L. Crouch, J.F. Alderete // Microbiol. 1999. - Vol.145. - P. 2835-2843.

74. Daly J. Survival of Trichomonas vaginalis in human semen / J.J. Dali, J.K. Sherman, L. Green et al. // Genitourin Med. 1989. - Vol.65. - P. 106-108.

75. Davis-Hayman S.R. Antigenicity of Trichomonas vaginalis heat-shock proteins in human infections / S.R. Davis-Hayman, P.H. Shah, R.W. Finley et al. // J. Parasit. Res. 2000. - Vol.86. - P. 115-120.

76. Davis-Hayman S.R. Trichomonas vaginalis: analysis of the cytosolic heat-shock protein 70 multigene family / S.R. Davis-Hayman, P.H. Shah, R.W. Finley et al. //J. Parasit. Res. 2000. - Vol.86. - P. 608-612.

77. Diamond L.S. The establishment of various trichomonads of animas and man in axenic cultures / L.S. Diamond // J. Parasitol. 1957. - Vol.43. - P. 488-490.

78. Engwall E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): quantitative assay of immunoglobulin G / E. Engwall, P. Perlmann // Immunochemistry. 1971. -Vol.8, №9. - P. 671-674.

79. Furtado M.B. Observation of membrane fusion on the interaction of Trichomonas vaginalis with human vaginal epithelial cells / M.B. Furtado, M. Benchimol // Parasitol Res. 1998. - Vol.84. - P. 213-220.

80. Garber G.E. Immunogenic proteins of Trichomonas vaginalis as demonstrated by the immunoblot technique / G.E. Garber, E.M. Proctor, W.R. Bowie // J. Infect. Immun. 1986. - Vol.51, №1. - P. 250-253.

81. Garcia-Tamayo J. An electron microscopic investigation on the pathogenesis of human vaginal trichomoniasis / J. Garcia-Tamayo, J.T. Nunez-Montiel, P. Haydee // Acta Cytol. 1978. - Vol.22, №5. - P. 447-445.

82. Gelbart S.M. Comparison of Diamond medium modified and Kupferberg medium for detection of Trichomonas vaginalis / S.M. Gelbart, J.L. Thomason, P.J. Osypowski et al. // J. Clin. Microbiol. 1989. - Vol.27, №5. - P. 1095-1096.

83. Gelbart S.M. Growth of Trichomonas vaginalis in commercial culture media / S.M. Gelbart, J.L. Thomason, P.J. Osypowski et al. // J. Clin. Microbiol. 1990. -Vol.28, №5. - P. 962-964.

84. Gentry G.A. Isolation and differentiation of herpes simplex virus and Trichomonas vaginalis in cell culture / G.A. Gentry, N. Lawrence, W. Lushbaugh // J. Clin. Microbiol. 1985. - Vol.22. - P. 199-204.

85. Gilbert R.O. Cytopathogenic effect of Trichomonas vaginalis on human vaginal epithelial cells cultured in vitro / R.O. Gilbert, G. Elia, D.H. Beach et al. // J. Infect. Immun. 2000. - Vol.68, №7. - P. 4200-4206.

86. Habib F.S. Cryopreservation of Trichomonas vaginalis: a trial of using four different cryoprotectants / F.S. Habib, D.M. Metwally., K.S. Habib // J. Egyp. Soc. Parasitol. 2004. - Vol.34, №3. - P. 931-940.

87. Healy G.R. Intestinal and urogenital protozoa / G.R. Healy, J.W. Smith // In: Manual of clinical microbial., 5th ed. American Society for microbial., Washington, 1991.-P. 751-782.

88. Honingberg B.M. Trichomonads parasitic in human / B.M. Honingberg. -Berlin.: Springer, 1990. 680 p.

89. Honingberg B.M. Structure of Trichomonas vaginalis Donne / B.M. Honingberg, V.M. King // J. Parasitol. 1964. - Vol.50, №3. - P. 345-364.

90. Jemilohum P.F. Isolation and characterization of flagella from Trichomonas vaginalis / P.F. Jemilohum // Parasitol. Res. 1998. - Vol.84. - P. 800-805.

91. Krieger J.N. Trichomonas vaginalis and trichomoniasis / J.N. Krieger, J.F. Alderete, S.P. Holmes et al. // Sexually transmitted diseases. New York.: McGraw-Hill, 1999.-P.589-591.

92. Lawing L.F. Detection of trichomonosis in vaginal and urine specimens from women by culture and PCR / L.F. Lawing, S.R. Hedges, J.R. Schwebke // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol.38, №10. - P. 3585-3588.

93. Lehker M.W. The regulation by iron of the synthesis of adhesions and cytoadherence levels in the protozoan Trichomonas vaginalis / M.W. Lehker, Arroyo R., J.F. Alderete // J. Exp.Med. -1991,- Vol. 174. P. 311 -318.

94. Lisi P.J. Monoclonal-antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for Trichomonas vaginalis / P.J. Lisi, R.S. Dondero, D. Kwiatkoski et al. // J. Clin. Microbiol. 1988. - Vol.26, №9. - P. 1684-1686.

95. Lopez L.B. Strategies by which some pathogenic Trichomonads integrate diverse signals in the decision-making process / L.B. Lopez, M. Bandeira de Melo Braga, J.O. Lopez et al. // An. Acad. Bras. Ci. 2000. - Vol.72, №2. - P. 173-186.

96. Lopes L.C. Immunolocalisation of tubulin isoforms and post-translational modifications in the protist Tritrichomonas foetus and Trichomonas vaginalis / L.C. Lopes, K.C. Ribeiro, M. Benchimol // Histochem. Cell. Biol. 2001. - Vol.116. - P. 17-29.

97. Madico G. Diagnosis of trichomonal vaginalis infection by PCR using vaginal swab samples / G. Madico // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol.36, №11. - P. 32053210.

98. Mason P.R. Serodiagnosis of Trichomonas vaginalis infection by the indirect fluorescent antibody test / P.R. Mason // J. Clin. Pathol. 1979. - Vol.32. - P. 12111215.

99. Mathews H.M. Evaluation of two serological tests for Trichomonas vaginalis infection / H.M. Mathews, G.R. Healy // J. Clin. Microbiol. 1983. - Vol.17, №5. -P. 840-843.

100. Matsuo J. A simple and rapid method for cryopreservation of Trichomonas vaginalis // J. Matsuo // J. Parasitil. Res. 2007. - Vol.101, №4. - P. 907-911.

101. Marianter R.M. Trirtichomonas foetus pseudocysts adhere to vaginal epithelial cells in a contact-dependent manner / R.M. Marianter, L.C. Lopes, M. Benchimol // Parasitol. Res. 2004. - Vol.92. - P. 303-31.

102. Martinotti M.G. Adherence of Trichomonas vaginalis to cell culture monolayers / M.G. Martinotti, P. Martinetto, D. Savoia // Eur. J. Clin. Microbiol. -1986.-Vol.5.-P. 320-323.

103. McCann J.S. Comparison of direct microscopy and culture in the diagnosis of trichomoniasis / J.S. McCann // Brit. J. Vener. Dis. 1974. - Vol.50. - P. 450-452.

104. Mirhaghani A. An electron microscope study of the interaction between Trichomonas vaginalis and epithelial cells of the human amnion membrane / A. Mirhaghani, A. Warton // J. Parasitol. Res. 1996. - Vol.82. - P. 43-47.

105. Miyake Y. Cryopreservation of protozoan parasites / Y. Miyake, P. Karanis, S. Uga // Cryobiol. 2004. - Vol.48, № 1. - P. 1-7.

106. Nielsen M.H. The size, density and relative area of chromatin granules ("hydrogenosomes") in Trichomonas vaginalis Donne from cultures in logarithmic and stationary growth / M.H. Nielsen, N.H. Diemer // Cell Tissue Res. 1976. -Vol.176.-P. 461-467.

107. Niks M. Towards an optimized MTT assay / M. Niks, M. Otto // J. Immunol, meth.- 1990.- Vol.130, №1,- P. 149-151.

108. Noel C. Morphogenesis during division and griseofulvin-induced changes of the microtubular cytoskeleton in the parasitic protist, Trichomonas vaginalis / C. Noel, D. Gerbod, P. Delgado-Viscogliosi et al. // Parasitol. Res. 2003. - Vol.89. -P. 487-494.

109. Read S.P. Comparativa studies on the physiology of Trichomonas vaginalis / S.P. Read// J. Parasitol. 1957. - Vol.43. - P. 385-394.

110. Pereira-Neves A. Pseudocysts in trichomonads-new insights / A. Pereira-Neves, K.C. Ribeiro et al. // Protist. 2003. - Vol.154. - P. 313-329.

111. Pereira-Neves A. Phagocytosis by Trichomonas vaginalis: new insights / A. Pereira-Neves, M. Benchimol // Biol. Cell. 2007. - Vol.99, №2. - P.87-101.

112. Pindak F.F. Growth and cytopathogenicity of Trichomonas vaginalis in tissue culture / F.F. Pindak, W.A. Gardner, M. de Pindak // J. Clin. Microbiol. 1986. -Vol.23.-P. 672-678.

113. Poch F. Modified thioglycolate medium: a simple and reliable means for detection of Trichomonas vaginalis / F. Poch, D. Levin, S. Levin et al. // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol.34, №10. - P. 2630-2631.

114. Provanzano D. Analysis of human immunologlobulin-degrading cysteine proteinases of Trichomonas vaginalis / D. Provanzano, J.F. Alderete // J. Infect. Immunol. 1995. - Vol.63, №9. - P. 3388-3395.

115. Ribeiro K.C. Contributions of the axostyle and flagella to close mitosis in the protists Tritrichomonas foetus and Trichomonas vaginalis / K.C. Ribeiro, L.H. Monteiro-Leal, M. Benchimol // J. Eukaryot. Microbiol. 2000. - Vol.47, №5. - P. 481-492.

116. Ribeiro K.C. The mitotic spindle and associated membranes in the closed mitosis of trichomonads / K.C. Ribeiro, A. Pereira-Neves, M. Benchimol / Biol. Cell.-2002.-Vol.94.-P. 157-172.

117. Riley D.E. Development of a polymerase chain reaction-based diagnosis of Trichomonas vaginalis / D.E. Riley, M.C. Roberts, T. Takayama et al. // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol.30, № 2. - P. 465-472.

118. Rojas L. Use of in vitro cytoadherence assays in the comparative study of the virulence of Trichomonas vaginalis / L. Rojas, I. Sariego, J. Fraga et al. // Parasitol. Res. 2004. - Vol.93. - P. 332-337.

119. Roitman I. Lipid synthesis by Trichomonas vaginalis / I. Roitman, P.G. Hey worth, W.E. Gutteridge // Trop. Med. Parasitol. 1978. - Vol.72. - P. 583-585.

120. Schmid G.P. Evaluation of six media for the growth of Trichomonas vaginalis from vaginal secretions / G.P. Schmid, L.C. Matheny, A.A. Zaidi et al. // J. Clin. Microbiol. 1989. - Vol.27, №6. - P. 1230-1233.

121. Stary A. Detection of Trichomonas vaginalis on modified Columbia agar in the routine laboratory / A. Stary, A. Kuchinka-Koch, L. Teodorowicz // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol.40, №9. - P. 3277-3280.

122. Street D.A. Evaluation of an enzyme-linked assay for the detection of antibody to Trichomonas vaginalis in sera and vaginal secretions / D.A. Street, D. Taylor-Robinson, J.P. Ackers et al. // Brit. J. Vener. Dis. 1982. - Vol.58. - P. 330-333.

123. Su K.E. Antibody to Trichomonas vaginalis in human cervicovaginal secretions / K.E. Su // Infect. Immun. 1982. - Vol.17, №3. - P. 852-857.

124. Vahab A. Current therapeutics, their problems, and sulfur-containing-amino-acid metabolism as a novel target against infections by amitochomndriate protozoan parasites / A. Vahab, N. Tomoyoshi // Clin. Microbiol. Rew. 2007. - Vol.20, №1. -P. 164-187.

125. Watt R.M. Rapid assay for immunological detection of Trichomonas vaginalis / R.M. Watt, P. Abraham, S.M. Wos et al. // J. Clin. Microbiol. 1986. - Vol.24, №4. -P. 551-555.

126. Wos S.M. Immunoglobulin isotypes of anti-Trichomonas vaginalis antibodies in patients with vaginal trichomoniasis / S.M. Wos, R.M. Watt // J.Clin. Microbiol. -1986. Vol.24, №5. - P. 790-795.

127. Yap E.H. Serum antibodies to Trichomonas vaginalis in invasive cervical cancer patients / E.H. Yap, Т.Н. Ho, Y.C. Chan et al. // Genitourin. Med. 1995. -Vol.71.-P. 402-404.

128. Yuh Y.S. Chromosome number of Trichomonas vaginalis / Y.S. Yuh, J.Y. Lie, M.F. Shaio //J. Parasitol. 1997. - Vol.83, №3. - P. 551-553.

129. Yulr A. Detection of Trichomonas vaginalis antigen in women by enzyme immunoassay / A. Yulr, M.C.A. Gellan, J. Packers // J. Clin. Pathol. 1987. -Vol.40. - P. 566-568.

130. Zhordaniia Т.К. Studies on interaction between trichomonads of the man and cell culture / Т.К. Zhordaniia, V.I. Bakhutashshvili // Med. Parazit. 1974. -Vol.43.-P. 647-650.

131. Стандартные условия культивирования

132. Среда Игла-MEM с 5-10% сыворотки крупного рогатого скота, гентамицин200 ЕД/мл), пенициллин (1001. ЕД/мл), стрептомицин (100

133. ЕД/мл), амфотерицин В (5 ЕД/мл); субкультивирование на 3-10 сутки, кратность рассева 1:4-1:8; метод снятия 0,04% раствор версена

134. Среда Игла-MEM с 10% сыворотки крупного рогатого скота, гентамицин (200 ЕД/мл), пенициллин(100 ЕД/мл), стрептомицин (100 ЕД/мл), амфотерицин В (5 ЕД/мл); субкультивирование на 3-10 сутки, кратность рассева 1:4-1:6; метод снятия 0,04% раствор версена

135. Среда DMEM с 10% эмбриональной бычьей сыворотки,гентамицин (200 ЕД/мл), пенициллин

136. ЕД/мл), стрептомицин (100 ЕД/мл), амфотерицин В

137. ЕД/мл); субкультивирование на 3-10 сутки, кратность рассева 1:3-1:10; метод снятия раствор: трипсин (0,25%) -версен (0,02%) 1:3

138. Среда ЕМЕМ с 10% эмбриональной бычьей сывороткиили КРС, гентамицин (200 ЕД/мл), пенициллин100 ЕД/мл), стрептомицин (100

139. ЕД/мл), амфотерицин В (5 ЕД/мл); субкультивирование на 3-10 сутки, кратность рассева 1:3-1:5; метод снятия раствор версен 0,04%

140. Характеристика Наименование линии

141. Нер-2 L-41 MDCK (NBL-2) МА-104

142. Контроль контаминации бактерии, грибы, микоплазмы не обнаружены бактерии, грибы, микоплазмы не обнаружены бактерии, грибы, микоплазмы не обнаружены бактерии, грибы, микоплазмы не обнаружены

143. Контроль видовой идентичности подтверждено кариологическим и изоферментным методом подтверждено кариологическим методом подтверждено кариологическим методом подтверждено кариологическим и изоферментным методом

144. Кариология модальное число хромосом 68-70 (72%) модальное число хромосом 62 модальное число хромосом 78-80 модальное число хромосом 1001. БЛАГОДАРНОСТИ

145. Благодарю сотрудников НИИ гриппа к.б.н. Л.Ф. Литвинчук и к.б.н. А.К. Сироткина за обучение методам культивирования клеток и передачу "know how" при электронной микроскопии.

146. Я испытываю глубокую признательность к сотрудникам кафедры микробиологии Санкт-Петербургского государственного университета (заведующий кафедрой -д.б.н., профессор А.В. Пиневич), моей Alma Mater, за уважение к научному труду и любовь к творчеству.

147. Благодарю всех участников работы, чей вклад адекватно отражен в совместных публикациях.