Разработка препаратов для выявления и идентификации Trichomonas vaginalis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Махлай, Наталья Сергеевна

• Махлай, Наталья Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Махлай, Наталья Сергеевна

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений, используемых в тексте

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРИХОМОНИАЗА

1.1. Трихомониаз в структуре ИППП

1.2. Характеристика возбудителя

1.2.1. Историческая справка, таксономическое положение

1.2.2. Морфология и жизненный цикл клетки

1.2.3. Структура поверхностных белков Т. vaginalis

1.2.4. Метаболизм и культуральные свойства

1.3. Сравнительный анализ лабораторных методов диагностики трихомониаза

1.3.1. Роль микроскопического метода при постановке диагноза

1.3.2. Питательные среды для культурального исследования

1.3.3. Методы, основанные на выявлении антигенов

1.3.4. Диагностическая ценность серологического метода

1.3.5. Методы, основанные на выявлении нуклеиновых кислот

1.4. Лечение трихомонадной инфекции

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты

2.1.1. Культуры микроорганизмов

2.1.2. Антигены для иммунизации

2.1.3. Экспериментальные животные

2.2. Микробиологические методы исследования

2.2.1. Определение количества клеток Т. vaginalis

2.2.2. Определение минимальных трихомоноцидных концентраций противопротозойных препаратов

2.2.3. Определение срока годности при повышенной температуре

2.3. Физико-химические методы исследования

2.3.1. Определение хлорид ионов

2.3.2. Определение концентрации белка

2.3.3. Определение аминного азота

2.3.4. Определение общего азота

2.3.5. Определение идентичности субстанций противопротозойных препаратов

2.3.6. Дезинтеграция клеточной массы Т. vaginalis

2.4. Иммунохимические методы исследования

2.4.1 Получение специфических гипериммунных сывороток

2.4.2. Выделение общеглобулиновых фракций из кроличьих сывороток к трихомонадным антигенам

2.4.3. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе

2.4.4. Получение ФИТЦ-конъюгатов

2.5. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА СЕЛЕКТИВНОЙ БЕССЫВОРОТОЧНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Т. VAGINALIS

3.1. Питательная основа, ее физико-химические свойства и использование для приготовления среды

3.2. Конструирование оптимальной жидкой питательной среды для Т. vaginalis

3.2.1. Влияние дрожжевого экстракта в питательной среде на рост Т. vaginalis

3.2.2. Влияние аминопептида в питательной среде на рост Т. vaginalis

3.2.3. Влияние лизата клеток L-41 в питательной среде на рост Т. vaginalis

3.2.4. Оптимизация состава жидкой питательной среды

3.2.5. Влияние рН на рост Т. vaginalis в жидкой питательной среде

3.2.6. Оптимизация селективной добавки в жидкой накопительной питательной среде

3.3. Оценка ростовых и селективных свойств разработанной питательной среды

3.4. Определение срока годности селективной питательной среды для Т. vaginalis

3.5. Результаты испытания разработанной селективной питательной среды для Т. vaginalis

3.6. Схема приготовления и контроля разработанной питательной среды для выявления Т. vaginalis

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ ФИТЦ-КОНЪЮГАТА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Т. VAGINALIS

4.1. Получение кроличьих гипериммунных сывороток к трихомонадным белкам

4.2. Выделение иммуноглобулинов

4.3. Маркировка иммуноглобулинов флуоресцеином изотиоцианатом (ФИТЦ)

4.4. Чувствительность и специфичность полученных ФИТЦ-конъюгатов

4.5. Чувствительность метода ПИФ в сравнении с другими методами

выявления Т. vaginalis

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ Т. VAGINALIS К АНТИПРОТОЗОЙНЫМ ПРЕПАРАТАМ

5.1. Культивирование Т. vaginalis в планшете

5.2. Критерий оценки жизнеспособности клетки Т. vaginalis

5.3. Определение минимальных трихомоноцидных концентраций противопротозойных препаратов

5.4. Фиксация противопротозойных препаратов в лунках полистироловых планшетов

5.5. Устройство для микробиологических исследований

5.6. Конструирование набора

5.7. Апробация набора для определения чувствительности Т. vaginalis к -противопротозойным препаратам

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка препаратов для выявления и идентификации Trichomonas vaginalis»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Урогенитальный трихомониаз - паразитарное заболевание мочеполовой системы мужчин и женщин, вызываемое простейшим одноклеточным паразитом Trichomonas vaginalis. За последние 5 лет заболеваемость трихомониазом в РФ составила около 200 случаев на 100 тыс. населения [17]. Это самый высокий показатель в структуре инфекций, передающихся половым путем (ИППП). При этом прослеживается положительная тенденция к снижению уровня заболеваемости трихомониазом, но отмечается рост скрытых и малосимптомных форм со стертой клинической картиной заболевания, затрудняющей своевременную диагностику и лечение [12].

В связи с тем, что клинические симптомы довольно часто не отражают реальной картины заболевания и в соответствии с протоколом ведения больных урогенитальным трихомониазом (утв. МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РФ 14.01.2005) основными методами обнаружения трихомонад являются микроскопический и культуральный [28]. При этом сложилась парадоксальная ситуация: при высоком уровне заболеваемости трихомониазом в России отсутствует производственный выпуск стандартных, разрешенных к применению отечественных питательных сред для культуральной диагностики данного заболевания. В клинико-диагностических исследованиях используют не зарегистрированные или зарубежные среды, что в первом случае влияет на достоверность и воспроизводимость результатов, а во втором случае - на стоимость исследований.

Использование методов амплификации нуклеиновых кислот, в частности ПЦР, может иметь большое практическое значение [20], но поскольку регламентированными являются микробиологические методы диагностики, их совершенствование по-прежнему актуально.

В сложившихся условиях микроскопия нативного и окрашенного

препаратов, несмотря на низкую чувствительность метода (38% - 82%), широко используется в лабораторной диагностике трихомониаза [1,16,41,103]. Повышение чувствительности и объективности данного метода может быть достигнуто за счет специфического окрашивания клеток, в частности с использованием флуоресцеинмеченных антител. Показано, что метод ПИФ менее чувствителен, чем культуральное исследование, но более -чем микроскопия нативного препарата [72,94], что метод прямой иммунофлуоресценции (ПИФ) менее чувствителен, чем культуральное исследование, но более чувствителен, чем микроскопия нативного препарата. Неоспоримым преимуществом ПИФ являются скорость постановки реакции и отсутствие строгих температурных требований при проведении исследования. В связи с этим разработка метода ПИФ для выявления Т. vaginalis может иметь практическое значение. Необходимо отметить, что в настоящее время отечественных, зарегистрированных коммерческих тест-систем для выявления Т. vaginalis методом ПИФ не существует. Вероятно, это обусловлено тем, что трихомонады являются труднокультивируемыми простейшими, и это существенно осложняет стадию получения материала для иммунизации.

Традиционная специфическая терапия трихомониаза заключается в применении препаратов группы 5-нитроимидазола (5-НИМЗ), обладающих высокой активностью в отношении Protozoa [23]. В последние годы актуальна также другая группа этиотропных средств - препараты 5-нитрофурана (5-НИТФ), в частности нифуратель. Нитрофураны в качестве монотерапии обычно используют в тех случаях, когда лечение 5-нитроимидазолами невозможно, например, в случаях имеющейся гиперчувствительности.

Первые случаи резистентности Т. vaginalis к метронидазолу были зарегистрированы в 1962 г [101]. По оценке CDC, 5% клинических изолятов Т. vaginalis устойчивы к метронидидазолу [32]. В настоящее время в мире не

существует стандартных методик лечения трихомониаза, обусловленного

7

метронидазолрезистентными штаммами Т. vaginalis, хотя сообщения о выделении таких штаммов продолжают появляться [76,93]. Неэффективность терапии урогенитального трихомониаза может быть обусловлена целым рядом факторов, связанных с особенностями как макро-, так и микроорганизмов. К числу наиболее частых причин неэффективности лечения большинство авторов относят недостаточно высокую комплаентность пациентов и реинфекцию, хотя в отдельных статьях ведущее место отводится резистентности Т. vaginalis к метронидазолу [4]. Для определения чувствительности Т. vaginalis in vitro к различным лекарственным средствам используют метод серийных разведений, разработанный-в 1978 году [83]. Однако его использование для рутинной диагностики является трудоемкой процедурой, поэтому применяется лишь в исследовательских целях.

Таким образом, в связи с отмеченной медицинской и социальной значимостью заболевания, обусловленного Т. vaginalis, разработка новых диагностических препаратов представляет важную задачу.

Цель исследования - разработать тест-системы для выявления и идентификации Т. vaginalis и для определения чувствительности трихомонад к противопротозойным препаратам.

Задачи исследования

1. Разработать бессывороточную селективную накопительную питательную среду для выявления возбудителя трихомониаза.

2. Разработать препарат для идентификации Т. vaginalis методом прямой иммунофлоресценции.

3. Провести сравнительное изучение методов лабораторной диагностики трихомониаза в модельном эксперименте.

4. Разработать набор для определения чувствительности Т. vaginalis к противопротозойным препаратам.

Научная новизна работы

Разработана рецептура и методика приготовления бессывороточной

8

селективной накопительной питательной среды, обладающей высокими ростовыми свойствами для простейшего вида Т. vaginalis и не уступающей коммерческой среде Vagicult (Orion Diagnostica, Финляндия), что способствует повышению качества лабораторной диагностики трихомониаза. Увеличение ростовых свойств достигнуто за счёт введения в плацентарный бульон лизата клеток L-41, как наиболее эффективного стимулятора роста. Разработаны и экспериментально обоснованы требования к основным показателям качества питательной среды при её серийном выпуске.

Показана возможность конструирования ФИТЦ-конъюгата на основе смеси IgG к комплексу антигенов лизированных клеток Т. vaginalis и рекомбинантному белку АР65 для выявления Т. vaginalis методом ПИФ. Предложено применять ФИТЦ-конъюгат после культивирования с целью увеличения специфичности исследования за счет иммунохимического связывания конъюгата с антигенами возбудителя.

В результате проведенного модельного эксперимента с использованием клинического образца дана сравнительная оценка существующих методов лабораторной диагностики трихомониаза и установлено, что культуральный метод позволяет выявлять возбудителя при

•7

наличии в исследуемом материале не менее чем 10 кл/мл, что в 100 раз превышает чувствительность метода световой микроскопии.

Впервые разработана тест-система для определения чувствительности Т. vaginalis к производным 5-нитроимидазола, 5-нитрофурана и предложен критерий определения жизнеспособности клетки Т. vaginalis на основе использования витальной окраски нативных препаратов, который позволяет сократить время при учете результатов исследования.

Практическая значимость

Применение разработанной и усовершенствованной стандартной сухой

питательной среды (СВТ), обеспечивающей регистрируемый рост

возбудителя при посевной дозе 103 клеток Т. vaginalis и отсутствие роста

грамположительной и грамотрицательной микрофлоры, а также грибов рода

9

Candida, повысило стабильность микробиологических исследований. Сконструированная питательная среда, выпускаемая в обезвоженном виде с длительным сроком годности (срок наблюдения более 2 лет), для практического применения готовится путем растворения сухой среды в дистиллированной воде при температуре 25 °С (время приготовления - 1-2 мин). Среда стандартна, не требует фильтрации, корректировки рН, стерилизации, добавления ex tempore ингредиентов, чувствительна, обеспечивает обильный рост с характерной морфологией при оптимальном физиологическом состоянии простейшего.

Отработана методика приготовления и использования смеси ФИТЦ-антител к комплексу антигенов Т. vaginalis для идентификации трихомонад методом ПИФ и определено место данного метода в структуре других лабораторных методов идентификации Т. vaginalis.

Предполагаемый серийный выпуск и внедрение в практику здравоохранения разработанной тест-системы для определения чувствительности Т. vaginalis к противопротозойным препаратам (СВТ-АЧ) существенно сократит время и трудоемкость микробиологического исследования по сравнению с классическим методом и позволит проводить своевременную адекватную терапию.

Проведено депонирование трех штаммов Т. vaginalis в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» с присвоением следующих коллекционных номеров: В-7140, В-7141, В-7142. Штаммы используются в контроле при производстве питательной среды СВТ.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. Разработанная питательная среда позволяет проводить лабораторную диагностику трихомониаза культуральным методом, не уступая по ростовым и селективным свойствам среде Vagicult (Финляндия), зарегистрированной в РФ.

2. ФИТЦ-конъюгат, представляющий собой смесь антител к комплексу

10

антигенов лизированных клеток Т. vaginalis и рекомбинантному мембранному белку АР65 в соотношении 1:1.5, соответственно, позволяет идентифицировать Т. vaginalis по специфическому свечению поверхностных и внутриклеточных антигенов.

3. В модельном эксперименте чувствительность методов микроскопии для

С "У

выявлении Т. vaginalis составляет 10 кл/мл, культурального метода - 10 кл/мл, ПЦР - менее 10 кл/мл.

4. Разработанный набор для определения чувствительности Т. vaginalis к противопротозойным препаратам позволяет идентифицировать штаммы Т. vaginalis с трихомоноцидными концентрациями метронидазола более или равными 5 мкг/мл, тинидазола - 1,25 мкг/мл, секнидазола - 2,5 мкг/мл, ниморазола - 1,25 мкг/мл, орнидазол - 2,5 мкг/мл, клотримазола - 15 мкг/мл, нифурателя - 1,25 мкг/мл.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 2 - в периодических изданиях, 9 - в материалах конференций, 2 - в сборниках научных трудов, 1 -патент на изобретение РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 106 источников, в том числе, 43 отечественных и 63 иностранных авторов. Диссертация содержит 10 таблиц и 33 рисунка.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Махлай, Наталья Сергеевна

Результаты исследования предназначены для использования специалистами в области клинической лабораторной диагностики, микробиологии и дерматовенерологии в медицинских учреждениях.

Разработанные препараты, включающие селективную накопительную питательную среду, ФИТЦ-конъюгат на основе поликлональных антител к Т. vaginalis и тест-систему для определения чувствительности возбудителя к противопротозойным препаратам позволят проводить комплексную диагностику трихомониаза от этапа выявления заболевания до определения чувствительности Т. vaginalis к препаратам лечения.

Штаммы Т. vaginalis В-7140, В-7141, В-7142, депонированные в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур могут быть использованы в качестве эталонных культур в качестве тест-штаммов для идентификации Т. vaginalis при культуральном исследовании на питательных средах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Махлай, Наталья Сергеевна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Адаскевич В. П. Инфекции, передаваемые половым путем // М.: Медицинская книга. - 1999. - 416 с.

2. Баткаев Э. А., Рюмин Д. В. Урогенитальный трихомониаз // Лечащий врач. -2002.-№12.-С. 1-7.

3. Беднова В. Н., Васильев М. М. Методы получения чистой культуры влагалищных трихомонад // Вестн. дерматологии и венерологии. - 1985. - № 12. - С. 22-25.

4. Белькова Ю. А., Козлов С. Н. Общие подходы к терапии инфекции, вызванной резистентными к метронидазолу штаммами Т. vaginalis // Фарматека. - 2007. - №.10. - С. 60-63.

5. Боровкова Л. В., Челнокова Е. В. Современные методы диагностики и лечения инфекций, передающихся половым путем // Журн. Медицинский альманах. - 2010. - №2. - С. 150 -155.

6. Васильев М. М. Особенности клиники мочеполового трихомониаза, совершенствование диагностики и лечения (клинико-экспериментальное исследование).: автореф. дис.: д-ра мед. наук // М. - 1990. - 40с.

7. Вязова О. Е. Лабораторные методы исследования в неинфекционной иммунологии // М.: Медицина. - 1967. - 355 с.

8. Градова Н. Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии // М.: Медицина. - 2004. - 144 с.

9. ГОСТ 20729-75 Питательные среды. Вода мясная (для ветеринарных целей) //Издательство ствндартов. - 1975. - 18 с.

Ю.Дмитриев Г. А., Сюч Н. И. Мочеполовой трихомониаз // М.: Медицинская книга. - 2007. - 320 с.

11. Ермоленко Д. К., Исаков В. А., Рыбалкин С. Б., Смирнова Т. С., Захаркив Ю. Ф. Урогенитальный трихомониаз: Пособие для врачей // СПб. - 2007. - 96 с.

12. Иванова М. А. Анализ заболеваемости населения Российской Федерации инфекциями, передаваемыми половым путем, за период с 1997 по 2008 гг // Социальные аспекты здоровья населения. - 2009. - №3.

13. Ильин И. И. Негонококковые уретриты у мужчин // М.: Медицина. - 1991. -228 с.

14. Инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения» при повышенной температуре / Мин-во здравоохранния СССР. - Москва. - 1983.

- 13 с.

15. Козлюк А. С., Козлюк В. А. Цитоморфологическая диагностика урогенитального трихомониаза // Инфекции передаваемые половым путем. -2001.-№6.-С. 26-29.

16. Копылов В. М., Бочкарев Е. Г., Говорун В. М. Урогенитальный трихомониаз. Актуальные вопросы диагностики и лечения (пособие для врачей)//М.-2001.-41 с.

17. Кубанова А. А., Лесная И. Н., Кубанов А. А., Мелехина Л. Е., Каспирович М. А. Анализ эпидемиологической ситуации и динамика заболеваемости инфекциями, передаваемыми половым путем, и дерматозами на территории Российской Федерации // Вестник дерматологии и венерологии. - 2010. - № 5.-С. 4-21.

18. Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследования // М: Медицина. - 1978. - 394 с.

19. Молочков В. А. Урогенитальный трихомониаз и ассоциированные уроге-нитальные инфекции (эпидемиология, клиника, диагностика, лечение, профилактика) // Российский журнал кожных и венерических болезней. -2000. -№3. -С.48-56.

20. Мустафина Г. Р. Информативность методов диагностики урогенитального трихомониаза и обоснование показаний к применению ПЦР в реальном времени.: автореф. дис.: канд. мед. наук // Уфа. -2010.-24 с.

21. Овчинников M. H., Беднова H. В., Делекторский В. В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем // М.: Медицина. -1987. - 303 с.

22. Павлов С. Т., Шапошников О. К., Самцов В. И. Кожные и венерические болезни // М.: Медицина. - 1985. - 375с.

23. Падейская Е. Н. Препараты группы 5-нитроимидазола для лечения анаэробных и протозойных инфекций. Обзор // Инфекции и антимикробная терапия. - 2000. - №2. - С. 110-116.

24. Петров П. П. Серологическое изучение мочеполового трихомонадоза: Автореф. дис. канд. мед. наук // Москва. - 1969. - 20 с.

25. Поздеев О. К. Медицинская микробиология // Москва: ГЭОТАР - МЕД. -2001.- 534 с.

26. Приказ Минздрава СССР № 755 от 12 августа 1977 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Москва. - 1977.

27. Приказ Минздрава СССР № 1179 от 10 октября 1983 г. Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения. - Москва. - 1983.

28. Протокол ведения больных урогенитальным трихомониазом. Утв. МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РФ 14.01.2005.

29. Раводин Р. А. Информативность лабораторных методов диагностики трихомониаза.: автореф. дис.: канд. мед. наук // Спб. - 2005. - 36 с.

30. Раз дольская Н. В. Диагностическое значение цитоморфологических, культуральных и иммуногенных свойств Т. vaginalis.-, автореф. дис.: канд. биол. наук // Спб. - 2009. - 23 с.

31. Раздольская Н. В., Гаврилова О. В., Теличко И. Н., Иванов А. М., Криворучко А. Б. Изучение ультраструктурной организации вирулентных

форм Trichomonas vaginalis // Рос. биомед. журн. Medline.ru. - 2007. - № 7. -С. 283-291.

32. Рахматулина М. Р. Современные подходы к терапии ассоциированных урогенитальных инфекций - эффективность, комплаентность, экономичность // Клин, дерматология и венерология. - 2009. - №5. - С. 36-42.

33. Рюмин Д. В. Проблемы этиологии и патогенеза смешанной (сочетанной) урогенитальной инфекции // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2009. - №2. - С. 37-71.

34. Рыжих П. Г., Гущин Ю. А., Савочкина А. Е. Сравнительная оценка аналитической чувствительности методов микроскопии (нативного и окрашенного препаратов) и амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и НАСБА в реальном времени) при обнаружении Trichomonas vaginalis II Клин дерматол и венерол. - 2011. - № 2. - С. 25-31.

35. Сборник инструкций по общим методам контроля стерильности, физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих агентов и токсичности медицинских иммуно-биологических препаратов // Мин-во здравоохранения СССР Москва. - 1983. - 77 с.

36. Серавин Л. Н. Простейшие... Что это такое? // Л.: Наука. - 1984. - 16 с.

37. Слюсаренко Т. П. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых производств // М.: Легкая пищевая промышленность. - 1984. - 207 с.

38. Скрипкин Ю. К. Кожные и венерические болезни // М.: «Триада-фарм». -1995. - 688 с.

39. Справочник по венерическим болезням // под ред Н. 3. Яговдика. - Минск: Беларуська навука. - 1998. - 285 с.

40. Теличко И. Н., Иванов А. М., Раздольская Н. В., Раводин Р. А., Базолина Е. А. Перспективы серологической диагностики трихомониаза // Медицинская иммунология. - 2007. - № 2-3. - С. 249-250.

41. Юнусова Е. И. Диагностика урогенитального // Журн. Практическая Медицина. - 2009. - №5. - С. 43-46.

42. Якимээс X. П. РСК и внутрикожная проба при трихомониазе урогенитального тракта.: автореф. дис.: канд. мед. наук // Таллин. - 1965. - 21 с.

43. Яцуха М. В. Некоторые аспекты эпидемиологии трихомониаза // Вестник дерматологии и венерологии. - 1989. - №1. - С. 9-36.

44. Abonyi A. In vivo observations of the division of the oversized round forms of Trichomonas vaginalis in culture // Angew Parasitol. - 1992. - Vol. 33, №2. - P. 65-68.

45. Abonyi A. Examination of nonflagellate and flagellate round forms of Trichomonas vaginalis by transmission electron microscopy // Appl. Parasitol. -1995. - V. 36, №1. - P. 303-310.

46. Alderete J. F., Newton E., Dennis C., Neale K.A. Antibody in sera of patients infected with Trichomonas vaginalis is to trichomonad proteinases // Genitourin Med. - 1991. - Vol. 67. - P. 331-334.

47. Anaokar S., Garry P. J. Solid-phase enzyme immunoassay for serum ferritim // Clin. Chem. - 1979. - Vol. 25. - P. 1426-1431.

48. Arroyo R., Engbring J., Alderete J. F. Molecular basis of host epithelial cell recognition by Trichomonas vaginalis // Mol. Microbiol. - 1992. - Vol.6. - P. 853862.

49. Bogitsh B. J., Carter С. E., Oeltmann T. N. Human parasitology // Academic Press. - 2005 p. 459.

50. Bonilha V. L., Ciavaglia M., de Souza W., Costa e Silva Filho F.. The involvement of terminal carbohydrates of the mammalian cell surface in the cytoadhesion of trichomonads / Parasitol. Res. - 1995. - Vol. 81. - P. 121-126.

51. Borchardt K.A., Smith R.F. An evaluation of the In Pouch TV culture for diagnosing Trichomonas vaginalis infection // Genitourin. Med. - 1991. - Vol. 67. - P.149-152.

52.Borchardt K., Zhang M., Shing H. A comparison of the sensitivity of the InPouch TV, Diamond's and Trichosel media for detection of Trichomonas vaginalis II Genitourin Med. - 1997. - Vol. 4. - P. 297-298.

53. Bottone E. J. An Atlas of the Clinical Microbiology of Infectious Diseases: Viral, fungal, and parasitic agents // Taylor & Francis. - 2006. - p. 240.

54. Carlton J. M., Hirt R. P., Silva J. C., Delcher A. L. Draft genome sequence of the sexually transmitted pathogen Trichomonas vaginalis II Science. - 2007. - Vol. 12. -P. 207-212.

55. Cohen M. S. Sexually transmitted diseases enhance HIV transmission: no longer a hypothesis // J. Lancet. - 1998. - Vol. 3. - P. 5-7.

56. Cotch M. F. Trichomonas vaginalis associated with low birth weight and preterm delivery // Sex. Transm. Dis. - 1997. - Vol. 24. - P. 353-360.

57. Crucitti T., Van Dyck E., Tehe A. Comparison of culture and different PCR assays for detection of Trichomonas vaginalis in self collected vaginal swab specimens // Sex. Transm. Infect. - 2003. - Vol. 79. - P. 393-398.

58. Cudmore S.L., Delgaty K. L., Hayward-McClelland S. F. Treatment of infections caused by metronidazole-resistant Trichomonas vaginalis // Clin. Microbiol. Rev. - 2004. - Vol. 17, №4. - P. 783-793.

59. Diamond L. S. In vitro cultivation of the Trichomonadidae: a state of the art review // Acta Univ. Carol.-Biol. - 1986. - Vol. 30. - P. 221-228.

60. Dunne R. L., DunnL. A., Upcroft P. Drug resistance in the sexually transmitted protozoan Trichomonas vaginalis // Cell Res. - 2003. - Vol. 13. - P. 239-249.

61. Engbring J. A., O'Brien J. L., Alderete J. F. Trichomonas vaginalis adhesins display molecular mimicry to metabolic enzymes // Adv.Exp. Med. Biol. - 1996. -Vol. 408.-P. 207-223.

62. Garcia A. F., Alderete J. F. Characterization of the Trichomonas vaginalis surface-associated AP65 and binding domain interacting with trichomonads and host cells // BMC Microbiology. - 2007. - Vol. 7. - P. 116-126.

63. Grodstein F., Goldman M., Cramer D. Relation of tubal infertility to a history of sexually transmitted diseases // Am. J. Epidemiol. - 1993. - Vol. 137. - P. 577-584.

64. Gulmezoglu A. M. Interventions for trichomoniasis in pregnancy // Cochrane Database Syst. Rev. - 2000. - Vol. 2. - CD000218.

65. Fouts A., Kraus S. Trichomonas vaginalis: réévaluation of its clinical presentation and laboratory diagnosis // J. Infect. Dis. - 1980. - Vol. 141. - P. 137143.

66. Harris D. I., Beechey R. B., Linstead D., Barrett J. Nucleoside uptake by Trichomonas vaginalis // Mol. Biochem. Parasitol. - 1988. - Vol. 29. - P. 105-116.

67. Hirt R. P., Noel C.J., Sicheritz-Ponten T., Tacheze J., Fiori P. L. Trichomonas vaginalis surface proteins: view from the genome // Trends in Parasitology. -2007. - Vol. 23, №11. -P. 540-547.

68.Kaur S., Khurana S., Bagga R., Wanchu A., Malla N. Antitrichomonas IgG, IgM, IgA, and IgG subclass responses in human intravaginal trichomoniasis // Parasitol. Res. - 2008. - Vol. 103. - P. 305-312.

69. Kharsany A. B., Hoosen A. A., Moodley J., Bagaratee J., Gouws E. The association between sexually transmitted pathogens and cervical intra-epithelial neoplasia in a developing community // Genitourin. Med. - 1993. - Vol. 69. - P. 357-360.

70. Kjellsson B. An ELIS A method for quantification of Tamm-Horsfall protein using monoclonal antibodies / B. Kjellsson, T. Sôderstrôm, L. A. Hanson // J Immunol Methods. - 1987. - Vol. 98, №2. - P. 105-111.

71. Kingston M. A., Bansal D., Carlin E. M. "Shelf life" of Trichomonas vaginalis II Int. J. of STD and AIDS. - 2003. - Vol. 14. - P. 28-29.

72. Krieger J. N., Holmes K. K., Spence M. R., Rein M. F., McCormack W. M. Geographic variation among isolates of Trichomonas vaginalis: demonstration of antigenic heterogeneity by using monoclonal antibodies and the indirect immunofluorescence technique // J. Infect. Dis. - 1985. - Vol. 152. - P. 979-984.

73. Kuberski T. Evaluation of the indirect hemagglutination technique for study of Trichomonas vaginalis infections, particularly in men // Sex. Transm. Dis. - 1978. -Vol. 5.-P. 97-102.

74. Kuile T., Muller M. Maltose utilization by extracellular hydrolysis followed by glucose transport in Trichomonas vaginalis // Parasitology. - 1995. - Vol. 110. - P. 37-44.

75. Lewis D. A., Habgood L., White R., Barker K. F., Murphy S. M.Managing vaginal trichomoniasis resistant to high-dose metronidazole therapy // Int J. STD AIDS. - 1997. - Vol. 8. - P. 780-784.e

76. Lewis D. A. Trichomoniasis // Vaginal infections. - 2010. - Vol. 3. - P. 291-292.

77. Lindmark D. G. Carbohydrate, energy and hydrogenosomal metabolism of Trichomonas foetus and Trichomonas vaginalis // J. Protozool. - 1989. - Vol. 36, №12.-P. 214-216.

78. Lisi P. J., Dondero R. S., Kwiatkoski D., Spence M. R., Rein M. F., Alderete J. F. Monoclonal-Antibody-Based Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Trichomonas vaginalis // J. Clin. Microbiol. - 1988. - Vol. 26. - P. 1684-1686.

79. Listead D. New defined and semi-defined media for cultivation of the flagellate Trichomonas vaginalis //Parasitology. - 1981. - Vol. 83. - P. 125-137.

80. Lynch K. M. Trichomoniasis of the Vagina and the Mouth. Cultivation of the Causative Organism and Experimental Infection // Am. J. rop. Dis. and Prevent. Med. - 1915. - Vol. 2. - P. 627-634.

81. Mason P. R. Serodiagnosis of Trichomonas vaginalis infection by the indirect fluorescent antibody test // J. Clin. Pathol. - 1979. - Vol. 32. - P. 1211-1215.

82. Mathews H.M., Healy G. R. Evaluation of two serological tests for Trichomonas vaginalis infection //J. Clin. Microbiology. - 1983. - Vol. 17. - P. 840-843.

83. Meingassner J. G., Havelec L., Mieth H. Studies on strain sensitivity of Trichomonas vaginalis to metronidazole // British Journal of Venereal Diseases. -1978. - №54. - P. 72-76.

84. Miller G. A., Klausner J. D., Coates T. J., Meza R., Gaydos C. A. Assessment of a rapid antigen detection system for Trichomonas vaginalis infection // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2003. - Vol. 10. - P. 1157-1158.

85. Nailor M. D., Sobel J. D. Tinidazole for the treatment of vaginal infections // Expert Opin. Investig. Drugs. - 2007. - Vol. 16, №5. - P. 743-751.

86.Passey M., Mgone C.S., Lupiwa S. Community based study of sexually transmitted diseases in rural women in the highlands of Papua New Guinea: prevelance and risk factors // Sex. Transm. Inf. - 1998. - Vol.74. - P. 120-127.

87. Petrin D., Delgaty K., Bhatt R., Garber G. Clinical and micribiological aspects of Trichomonas vaginalis // Clin. Microb. Reviews. - 1998. - Vol. 11. - P. 300-317.

88. Pommerville J. C. Alcamo's Fundamentals of Microbiology // 8th Edition Jones & Bartlett Learning. - 2010. - p. 805.

89. Riley D. E. Rapid and practical DNA isolation from Trichomonas vaginalis and other nuclease-rich protozoa // Mol. Biochem. Parasitol. - 1992. - Vol. 51. - P. 161-163.

90. Roederer M. Conjugation of monoclonal antibodies (August, 2004). http ://www.drmr. com/ abcon/

91. Ryu J. S., Chung H. L., Y Min D., Cho Y. H., Ro Y.S., Kim S. R. Diagnosis of trichomoniasis by polymerase chain reaction // Yonsei Med. J. - 1999. - Vol. 40. -P. 56-60.

92. Schmid G. P., Matheny L. C., Zaidi A. A., Kraus S. J. Evaluation of six media for the growth of Trichomonas vaginalis from vaginal secretions // J. Clin. Microbiol. - 1989.-Vol.27.-P. 1230-1233.

93. Schwebke J. R., Barrientes F. J. Prevalence of Trichomonas vaginalis Isolates with Resistance to Metronidazole and Tinidazole // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2006. - №12. - P. 4209-4210.

94. Smith R. F. Detection of Trichomonas vaginalis in vaginal specimens by direct immunofluorescence assay // J. Clin. Microbiol. - 1986. - Vol. 4. - P. 1107-1108.

95. Song H. O., Lim Y. S., Moon S. J., Ahn M. H., Ryu J. S. Delayed Human Neutrophil Apoptosis by Trichomonas vaginalis Lysate // Korean J Parasitol. -2010.-Vol. 48, № l.-P. 1-7.

96. Steinbüchel A., Muller M. Glycerol, a metabolic end product of Trichomonas vaginalis and Tritrichomonas foetus // Mol. Biochem. Parasitol. - 1986. - Vol. 20. -P. 45-55.

97. Street D.A., Taylor-Robinson D., Ackers J. P. Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibody to Trichomonas vaginalis II Br. J. Ven. Dis. - 1982. - Vol. 58. - P. 330-333.

98. Tawfeek G.M., Oteifa N. M., el-Gozamy B. R. Evaluation of an IgG cystatin capture enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of anti-cysteine proteinase antibodies in asymptomatic trichomoniasis patients // J. Egypt Soc. Parasitol. - 2003. - Vol. 33. - P. 67-83.

99. Torian B. E., Connelly R. J., Stephens R. S., Stibbs H. H. Specific and common antigens of Trichomonas vaginalis detected by monoclonal antibodies // Infect. Immun. - 1984. - Vol. 43. - P. 270-275.

100. Upcroft P. Anaerobic Protozoan Parasites Protist // Meeting report. - 2001. -Vol. 4. - P. 241-242.

101. Upcroft P., Upcroft J.A. Drug targets and mechanisms of resistance in the anaerobic protozoa // Clin. Microbiol. Rev. - 2001. - Vol. 1. - P. 150-164.

102. Wassmann C., Hellberg A., Tannich E., Bruchhaus I. Resistance in the Protozoan Parasite Entamoeba histolytica Is Associated with Increased Expression of Iron-containing Superoxide Dismutase and Peroxiredoxin and Decreased Expression of Ferredoxin 1 and Flavin Reductase // The J. of biological chemistry. - 1999. - Vol. 274. - № 37. - P. 26051-26056.

103. Wiese W., Patel S. R., Patel S. C., Ohl C. A., Estrada C. A. A meta-analysis of the Papanicolaou smear and wet mount for the diagnosis of vaginal trichomoniasis // Am J. Med. - 2000. - Vol. 108. - P. 301-308.

104. World Health Organization. Global prevalence and incudence of selected curable sexually transmitted infections. Overview and estimates // In Global program on AIDS. World Health Organization, Geneva. - 2002. - P. 2-27.

105. Yoon, K., Ryu J. S., Min D. Y. Cytotoxicity of lymphokine activated peritoneal macrophages against Trichomonas vaginalis // Kor. J. Parasitol. - 1991. -Vol. 29.-P. 381-388.

106. Yuh Y.S., Liu J. Y., Shaio M. F. Chromosome number of Trichomonas vaginalis // Parasitol. - 1997. - V. 83, №3. - P.551-553.