Частота обнаружения Мycoplasma hominis и Ureaplasma urealytiсum и их чувствительность к антибиотикам у больных с урогенитальной патологией тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Стуколкина, Наталья Евгеньевна

• Стуколкина, Наталья Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Стуколкина, Наталья Евгеньевна

Оглавление

Стр

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

Глава I Характеристика и методы определения урогенитальных мико-плазм. Распространенность U. urealyticum и М. hominis среди больных с урогенитальной патологией и их чувствительность к антибиотикам

1.1 Общая характеристика урогенитальных микоплазм

1.2 Методы определения урогенитальных микоплазм

1.3 Распространенность генитальных микоплазм у больных с урогенитальной патологией

1.4 Чувствительность и резистентность урогенитальных микоплазм к антибиотикам

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2 Материалы и методы исследования

2.1 Характеристика обследованных контингентов больных

2.2 Микробиологические и молекулярно-биологические методы исследования

2.3 Иммунологические методы исследования

2.4 Статистические методы исследования

Глава 3 Частота встречаемости Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma

hominis и состояние урогенитального тракта у больных с урогенитальной патологией

3.1 Этиологическая структура обследуемых групп больных с урогенитальной патологией

3.2 Особенности состояния урогенитального тракта у женщин с выявленными Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis

3.3 Особенности состояния урогенитального тракта у обследованных мужчин с выявленными штаммами Ureaplasma urealyticum

и Mycoplasma hominis

3.4 Исследование частоты обнаружения Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum у лиц, обследованных на инфекции, передаваемые половым путем за последние годы (2002 -

гг)

3.5 Исследование частоты встречаемости Ureaplasma urealyticum

и Mycoplasma hominis среди студенческой молодежи

Глава 4 Разработка полуколичественного метода определения

Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis. Усовершенствование микробиологического метода культивирования уреап -лазм в жидкой питательной среде

4.1 Методика полуколичественной оценки содержания Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в биоматериале урогенитального тракта

4.2 Методика культивирования Ureaplasma urealyticum в жидкой питательной среде с использованием буфера HEPES

Глава 5 Оценка чувствительности к антибиотикам штаммов Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis у больных с

урогенитальной патологией

Заключение

Выводы

Практические рекомендации

Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

Ш11111 - инфекции, передаваемые половым путём

ИФ - иммунофлюоресценция

ИЭМ - институт экспериментальной медицины

РНК - рибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЦИЕ - цветоизменяющие единицы

CMV - cytomegalovirus

С. trachomatis - Chlamydia trachomatis

G. vaginalis - Gardnerella vaginalis

HSV - Herpes simplex virus

M. genitalium - Mycoplasma genitalium

M. hominis - Mycoplasma hominis

M. pneumoniae - Mycoplasma pneumoniae

N. gonorrhoeae - Neisseria gonorrhoeae

spp. - виды (species)

T. vaginalis - Trichomonas vaginalis

U. parvum - Ureaplasma parvum

U. urealyticum - Ureaplasma urealyticum

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Частота обнаружения Мycoplasma hominis и Ureaplasma urealytiсum и их чувствительность к антибиотикам у больных с урогенитальной патологией»

Введение

Актуальность проблемы

Инфекции, передаваемые половым путем (ИППП), являются одной из важнейших проблем современной медицины и биологии. В начале XXI века в мире значительно возросла частота этих инфекций. В Российской Федерации эпидемическая обстановка по ИППП также остается напряженной. Во многом это обусловлено ранним началом половой жизни, наличием нескольких половых партнеров, пренебрежением к использованию барьерных методов контрацепции, бесконтрольным применением антибиотиков, самолечением и рядом других факторов [Гранская Ю.В. и др., 2005; Шипицина Е.В. и др., 2010; Рищук С.В., 2011].

Среди возбудителей урогенитальных инфекций особое место занимают микоплазмы в связи с особенностями их биологии как мембранных паразитов [Борхсениус С.Н. и др., 2002]. Для них характерна длительная персистенция и влияние на ряд систем организма, в частности иммунную. Урогенитальные ми-коплазмозы с трудом поддаются антибиотикотерапии ввиду частого развития резистентности к антибиотикам. Особую эпидемическую опасность представляют лица с выявленными Mycoplasma hominis (М. hominis) и Ureaplasma urealyticum (U.urealyticum), ассоциированными с другими инфекционными агентами урогенитального тракта. Со смешанными урогенитальными инфекциями чаще всего связывают развитие у женщин цервицита, вагиноза, вторичного бесплодия и привычного невынашивания [Билалов Ф.С. и др., 2011; Андросова Л.Д., 2011]. В виду того, что урогенитальные микоплазмы и другие возбудители ИППП могут вызывать воспалительную реакцию в зоне маточно-плацентарного барьера, они могут являться причиной осложнений беременности: эктопической беременности, спонтанных абортов и преждевременных родов, могут приводить к антенатальному и перинатальному инфицированию, задержке развития плода и гибели новорожденных [Nigro G. et al., 2011; TaylorRobinson D., Lamont R. F., 2011].

У мужчин урогенитальные микоплазмозы и, в частности уреаплазмозы, играют значительную роль при негонококковых уретритах и простатитах [Егоров A.A., 2008]. Имеются данные о значении урогенитальных микоплазм в развитии мужского бесплодия. Установлено снижение подвижности сперматозоидов и ухудшение качественных характеристик спермы у мужчин с уреаплаз-менной и микоплазменной инфекцией мочеполового тракта [Wang Y. et al., 2006; Liu D.F. et al., 2007; Gdoura R. et al., 2008]. Дополнительные трудности в понимании этиологической роли М. hominis и U. urealyticum связаны с их частым обнаружением у здоровых лиц и отсутствием единого мнения о критериях постановки диагноза урогенитального микоплазмоза. Спорным является вопрос о значении некоторых современных лабораторных тестов, в частности полимеразной цепной реакции (ПЦР), в диагностике ИППП и их роли в установлении критериев излеченности [Савичева A.M. и др., 2002; Раковская И.В. и др., 2008]. Актуальность проблемы связана таюке с возможными серьезными социально-демографическими последствиями широкого распространения урогенитальных микоплазмозов, хламидиоза и других ИППП в отдельных группах населения. Этот рост поддерживается высоким уровнем рискованного сексуального поведения, в частности среди студенческой молодежи [Архипова Е.И. и др., 2007]. Однако в литературе практически отсутствуют данные, охватывающие последние годы, по частоте обнаружения микоплазм у разных групп населения, единичными являются работы по длительному наблюдению в динамике чувствительности урогенитальных микоплазм к антибиотикам. В связи с изложенным необходимы научно-прикладные клинико-микробиологические исследования разных групп населения с целью получения достоверной информации о частоте обнаружения микоплазм, разработка методов количественной оценки содержания микоплазм в биоматериале, их чувст-вительности к наиболее широко используемым антибиотикам, которые должны явиться основой широких эпидемических исследований, установления адекватного диагноза и, при необходимости, соответствующей терапии.

Цель исследования

Определить частоту обнаружения Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis у больных с урогенитальной патологией, оценить чувствительность выделенных штаммов к антибиотикам, усовершенствовать методики их определения для выбора оптимальных методов диагностики и лечения урогениталь-ных микоплазмозов.

Задачи исследования

1 Изучить частоту выявления Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis и их ассоциаций с другими инфекционными агентами у лиц, обследуемых на инфекции, передаваемые половым путем.

2 Охарактеризовать особенности клинических проявлений микоплазмен-ной инфекции у мужчин и женщин.

3 Определить динамику изменений чувствительности штаммов Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis, выделенных у больных, к основным антибиотикам, применяемым при лечении урогенитальных микоплазмозов.

4 Разработать полуколичественный метод определения Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в исследуемом биоматериале на жидких питательных средах с визуальной оценкой изменения цвета индикатора - фенолового красного.

5 Усовершенствовать методику культивирования штаммов Ureaplasma urealyticum, полученных у больных, в жидкой питательной среде с использованием буферных растворов.

Научная новизна исследования

Впервые в условиях длительного наблюдения проведено изучение частоты обнаружения Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis на большом контингенте обследованных лиц. Установлена частота их выявления у студенческой молодежи, некоторые факторы риска, способствующие распространению среди студентов инфекций, передаваемых половым путём (ШИШ).

Новыми являются данные по динамике чувствительности Ureaplasma

urealyticum и Mycoplasma hominis, выделенных у лиц, обследованных на инфекции, передаваемые половым путем, к основным антибиотикам, применяемым для их лечения.

Усовершенствована методика полуколичественного определения Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в исследуемом биоматериале, полученном у больных, а также методика культивирования штаммов Ureaplasma urealyticum в жидкой питательной среде с использованием буферного раствора HEPES, что позволяет повысить жизнеспособность микроорганизмов и увеличить их титры в инкубационной среде.

Практическая значимость работы

Разработана модификация микробиологического метода выявления и полуколичественного определения Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis, необходимая для скрининга и диагностики урогенитального микоплазмоза в условиях практического здравоохранения. Модифицирован бактериологический метод определения Ureaplasma urealyticum в биоматериале больных с добавлением в питательную среду буфера HEPES. Проведена оценка чувствительности выделенных штаммов Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis к наиболее широко используемым лекарственным препаратам. Показана их высокая чувствительность к доксициклину и джозамицину и резистентность к ломефлоксацину, офлоксацину и азитромицину. Разработаны практические рекомендации по выбору антибиотиков для лечения микоплазмозов, исходя из данных о чувствительности к ним U. urealyticum и М. hominis.

Основные положения, выносимые на защиту

1 Среди лиц, впервые обратившихся в лечебно-профилактические учреждения для обследования на заболевания, передаваемые половым путём, отмечается высокая частота обнаружения в биоматериале урогенитального тракта Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в высоких титрах. У обследованных на заболевания, передаваемые половым путём, урогенитальные микоплаз-мозы чаще протекают в ассоциации с другими возбудителями инфекций, пере-

даваемых половым путем.

2 При наличии высоких титров Ureaplasma urealyticum в биоматериале урогенитального тракта у женщин выявляется высокая частота уретритов, кольпитов, у мужчин — уретритов и простатитов. Высокие титры Mycoplasma hominis в биоматериале у мужчин ассоциируются с уретритами, у женщин - с бактериальными вагинозами.

3 Штаммы Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis, выделенные у лиц с жалобами, характерными для заболеваний урогенитальной сферы, наиболее чувствительны к доксициклину и джозамицину, наименее - к азитромици-ну, офлоксацину и ломефлоксацину.

4 Методика определения Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в жидкой питательной среде с визуальной регистрацией изменения цвета индикатора фенолового красного в динамике позволяет проводить полуколичественную оценку их содержания в биоматериале.

5 Методика культивирования штаммов U. urealyticum, полученных у больных, в жидкой питательной среде с использованием буферного раствора HEPES позволяет повысить жизнеспособность микоплазм и увеличить их титры.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность лабораторий Новгородского областного кожно - венерологического диспансера, Центральной городской клинической больницы: женской консультации № 1 Клинического родильного дома и женской консультации № 3 Лечебно-диагностического центра г. Великий Новгород. Основные положения диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры микробиологии, иммунологии и инфекционных болезней Института медицинского образования ГОУ ВПО «Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого».

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на пятой Всероссийской конферен-

ции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004); конференции посвященной 10-летию Новгородского государственного университета имени Ярослава Мудрого (Великий Новгород, 2004); XIII и XIV Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 2005, 2006); XVI научно-практической конференции сотрудников и студентов ИМО (Великий Новгород, 2010); конференции молодых учёных Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования (Санкт-Петербург, 2011).

Диссертация доложена и обсуждена на совместном заседании научно-плановой экспертной комиссии ИМО НовГУ и кафедры микробиологии, иммунологии и инфекционных болезней Института медицинского образования ГОУ ВПО «Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого» (протокол от 22 ноября 2010 года № 5).

Диссертация апробирована на заседании Объединённого диссертационного Совета ДМ 208.006.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (протокол от 14 апреля 2011 года № 5).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 в журналах, включенных в перечень рецензируемых журналов и изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций.

Объём и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 112 страницах, содержит 19 таблиц, 7 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы (1 глава), собственных исследований (4 главы), заключения, выводов и практических рекомендаций. Список использованной литературы включает 53 отечественных и 95 зарубежных источников.

Обзор литературы Глава I Характеристика и методы определения урогенитальных ми-коплазм. Распространенность U. urealyticum и М. hominis среди больных с урогенитальной патологией и их чувствительность к антибиотикам 1.1 Общая характеристика урогенитальных микоплазм История изучения заболеваний, вызываемых микоплазмами, начинается с 1898 г., когда Е. Nocard и Е. Roux открыли микроорганизмы, впоследствии названные микоплазмами. Начало изучению роли микоплазм в патологии мочеполовой сферы человека было положено L. Dienes, J. Edsall (1937), которые впервые выделили микоплазмы из абсцесса бартолиниевой железы. Микоплаз-мы относятся к мельчайшим свободно живущим прокариотам, ограниченным одной трехслойной мембраной, лишенным клеточной стенки, способным паразитировать на мембране клетки - хозяина [Fraser Е. et al., 1995; Борхсениус С.Н. и др., 2002]. По современной классификации микоплазмы относятся к классу Mollicutes, порядку Mycoplasmatales, включающему в себя два рода: Mycoplasma и Ureaplasma.

В 90-е годы прошлого века в результате успехов в изучении генома микоплазм было предложено пересмотреть их классификацию. Однако эти предложения были отвергнуты подкомитетом по таксономии класса Mollicutes. Основанием для такого решения послужил тот факт, что перемещение известных и активно изучаемых микоплазм в другие таксоны, могут породить хаос и проблемы при идентификации микоплазм у медиков и ветеринаров [International..., 1997]. В эти годы были получены принципиально новые данные об ультраструктуре микоплазм, их клеточной мембране, метаболизме и строении их генома. Эти данные позволили осмыслить многие факты, полученные ранее о взаимодействии микоплазм с клетками иммунной системы, способности микоплазм к длительной персистенции. Поэтому представляется необходимым специально рассмотреть новые данные о биологических свойствах микоплазм, важных для понимания патогенетических механизмов генитальных микоплаз

мозов.

Средний размер клеток микоплазм составляет 0,3 мкм, что соответствует минимальным размерам самореплицирующейся клетки. Микоплазмы обладают выраженным полиморфизмом. Они имеют вид грамотрицательных овоидных, круглых или удлиненных клеток, а также нитевидных образований — тяжей, длиной до 100 мкм. Полиморфизм клеток обусловлен тем, что формирование микробных тел отстает от репликации генома, в результате чего образуются полиморфные многоядерные структуры. Этот феномен связан с тем, что аппарат деления микоплазм представлен наименьшим числом элементов, при котором возможно самостоятельное бинарное деление, характерное для большинства прокариот, включая и МоШс^еБ.

В отличие от других бактерий у микоплазм отсутствует клеточная стенка. Они содержат только плазматическую мембрану. Именно с мембраной связывают их патогенные свойства. На мембране локализованы рецепторные белки и поверхностные антигены. Установлена высокая антигенная гетерогенность различных видов микоплазм, а также существование антигенных различий между штаммами одного вида, в частности у и.игеа1уйсит [Борхсениус С.Н. и др., 2002].

Микоплазмы характеризуются антигенным многообразием, способностью одного генотипа обеспечивать альтернативные варианты морфологии и физиологических состояний в ответ на изменяющиеся условия окружающей среды [Яагт 8. е1 а1., 1998]. Биологическое значение такой изменчивости связывают со способностью микоплазм преодолевать иммунный контроль макроорганизма, в частности, антителообразование. В геноме микоплазм отмечается наличие супербольших модулей, определяющих широкий и постоянно изменяющийся набор поверхностных антигенов. Большая часть поверхностных антигенов является иммуногенами и селекция осуществляется в пользу клеток микоплазм, способных к преодолеванию иммунологического контроля макроорганизма. Частота возникновения новых генетических вариантов поверхностных

антигенов микоплазм очень велика и составляет 10"4— 10"2, т.е. в 10 тыс. раз превышает частоту обычных точечных мутаций в геноме бактерий [Rosengarten R., Yogev D., 1996]. Образование вариабельных антигенов микоплазм происходит аналогично образованию вариабельных участков иммуноглобулинов. Вариабельность поверхностных антигенов обнаружена у Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и других микоплазм [Борхсениус С.Н. и др., 2002].

Отсутствие клеточной стенки у молликутов приводит к интимному контакту их цитоплазматической мембраны с мембраной клетки хозяина, слиянию обеих мембран и обмену компонентами между ними [Razin S., Jacobs Е., 1992]. В частности мембраны микоплазм содержат стерол, который они не способны синтезировать, а получают его из окружающей среды, в том числе, и из мембран клеток хозяина.

Уникальным свойством генома микоплазм является отклонение их генетического кода от универсального. Это, возможно, является следствием низкого содержания G + С в геномной ДНК. Так, терминальный кодон UGA у M.genitalium, M.pneumoniae, U. urealyticum и большинства других микоплазм также читается как триптофан, а кодон UGG, используемый в универсальном коде для триптофана в кодоне M.pneumoniae вообще отсутствует [Glass G.I. et al., 2000].

В настоящее время известны полные нуклеотидные последовательности ряда микоплазм. Показано, что размер генома этих микроорганизмов существенно различается. Так геном Mycoplasma genitalium содержит 580070 н.п., а Mycoplasma pneumoniae - 816394 н.п. В то же время открытая рамка считывания (ОРС) Mycoplasma pneumoniae содержит все гены Mycoplasma genitalium. Большой размер генома M.pneumoniae обусловлен присутствием в нем дополнительных последовательностей, локализованных между сегментами. Геном U.urealyticum (размер генома 751719 н.п.) значительно отличается от Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma genitalium. Это подтверждает представление о том, что род уреаплазм эволюционно дистанцировался от рода микоплазм.

Вместе с тем надо отметить, что для микоплазм характерны очень короткие временные сроки видообразования не привычные для представителей типичной эволюционной изменчивости [Борхсениус С.Н. и др., 2002].

Микоплазмы обладают способностью осуществлять с достаточной частотой горизонтальный перенос генов от других родов бактерий и даже клеток эу-кариот, хотя и значительно реже [Bertolla F. et al., 2000]. Этот механизм играет определенную роль в возникновении устойчивости к антибиотикам у моллику-тов. Так, резистентность к тетрациклинам у M.hominis и U.urealyticum связаны с наличием tet-M детерминанты, входящей в состав коньюгативного транспозо-на Tn-916, tet-M детерминанта, по данным Гущина А.Е. с соавт. (1998), встречается в 17 % клинических изолятов M.hominis. При этом tet-M, как и сам транспозон, очевидно, был получен M.hominis от Streptococcus faecalis [Roberts М.С. et al., 1985; 1999].

В заключительной части данного раздела необходимо рассмотреть биологические особенности видов микоплазм этиологическая роль, которых явилась предметом нашего рассмотрения.

M.hominis гидролизует аргинин, не ферментирует глюкозу и другие углеводы, слабо продуцирует перекись водорода, вызывая только частичный альфа - гемолиз эритроцитов и не обладает свойствами адсорбции эритроцитов. В то же время некоторые штаммы могут адсорбироваться на сперматозоидах человека, бактериях (Neisseria gonorrhoeae) и ряде клеток животных и человека.

Для M.hominis характерна штаммовая гетерогенность. Путем клонирования ДНК выявлено 87 мембранных белков, позволившие разделить M.hominis на 9 серотипов [Борхсениус С.Н. и соавт., 2002]. В клеточных культурах этот вид микоплазм способен вызывать хромосомные аберрации и другие нарушения хромосом. Однако значение этого феномена in vivo требует дальнейшего изучения, т.к. в определенной степени это связано с потреблением аргинина микоплазмами. Известно, что недостаток аргинина в среде вызывает хромосомные аберрации даже в отсутствие микоплазм.

Уреаплазмы человека - Ureaplasma urealyticum впервые были выделены Shepard М.С. ещё в 1957 году и первоначально были названы Т - штаммами [«tiny» (англ.) - мелкие], т.к. в отличие от других видов микоплазм они образовывали очень мелкие колонии диаметром 10-30 мкм.

Наиболее характерным свойством уреаплазм, отличающих их от других молликутов является уреазная активность — способность вызывать гидролиз мочевины. В отличие от M.genitalium выделение которых требует 14 дней и более, рост Ureaplasma urealyticum наблюдается уже через 16-18 часов. Оптимум pH ростовой среды у уреаплазм ниже, чем у других микоплазм и составляет 6,0-6,5. В более щелочной среде уреаплазмы быстро гибнут.

Уреаплазмы представляют собой гетерогенную группу и серологически разделены на 14 серотипов, составляющих два биовара — Parvum (серотипы 1,3,6,14) и Т - 960 (серотипы 2, 4, 5, 7 - 13), статус которых в настоящее время повышен до отдельных видов [Kong F. et al., 1999]. Наименование Ureaplasma urealyticum остается за серотипами биовара Т - 960, а серотипы биовара Parvum отнесены к виду Ureaplasma parvum; роль этих видов в патологии человека интенсивно изучается благодаря разработке методов их молекулярно-биологической идентификации в ПЦР [Kong F. et al., 2000; Загребина O.C., 2001; Chaim M. et al., 2003].

1.2 Методы определения урогенитальных микоплазм

Для диагностики урогенитальных микоплазменных инфекций используют многочисленные методы: культуральные, молекулярно - биологические, серологические и др. [Тимашева О.А и соавт., 1996; Lu M.G. et al., 2005; Рищук C.B. и соавт., 2006]. Преимущества и недостатки различных методов широко обсуждаются в литературе.

К основным методам диагностики инфекций относятся микробиологические, иммунологические и молекулярно-биологические (метод генетических зондов и ПЦР). В последние годы разработаны нанотехнологические методы выявления урогенитальных микоплазм с помощью биочипов [Shi G. et al., 2005;

Cao X. et al., 2006;].

«Золотым стандартом» диагностики микоплазмозов является микробиологический метод. Он позволяет изучать свойства выделенных культур, в частности чувствительность к антибиотикам. Кроме того, по мнению многих исследователей, имеет значение не сам факт выявления урогенитальных микоплазм, а массивность их диссеминации, которую можно оценить при количественном высеве. Из коммерческих систем наибольшее распространение получила тест -система «MYCOPLASMA DUO» Sanofi Pasteur. Она позволяет одномоментно проводить идентификацию микоплазм и количественное определение инфекта.

Урогенитальные микоплазмы требуют для культивирования богатых питательных сред, содержащих нативную животную сыворотку и дрожжевой экстракт как источник витаминов.

В среды для культивирования Mycoplasma hominis добавляют аргинин (до 1,0 %). Среда для выявления Ureaplasma urealyticum содержит мочевину (до 0,5 %) и отличается от других сред более низким рН (в пределах 6 - 6,5). Рост этих урогенитальных микоплазм наблюдается в значительно более ранние сроки, чем Mycoplasma genitalium. Так, Mycoplasma hominis обычно можно выявить на 5 - 7, a Ureaplasma urealyticum - на 2 - 3 день культивирования.

Для предотвращения бактериального роста в среды обычно добавляют пенициллин (или его производные), а также ацетат таллия, подавляющий рост большинства бактерий, но не микоплазм, за исключением Ureaplasma urealyticum.

Микробиологические методы, таким образом, позволяют диагностировать микоплазменные инфекции в лучшем случае через 3-7 суток после получения исследуемого материала. Это значительно снижает их ценность для клиники в связи с невозможностью планирования раннего этиотропного лечения. Поэтому понятен интерес к разработке методов ранней диагностики урогенитальных микоплазмозов.

До открытия К.В. Mullis (1987) полимеразной цепной реакции, для ран-

ней диагностики микоплазменных инфекций, использовался метод прямой им-мунофлюоресценции, широко применявшийся для индикации Mycoplasma pneumoniae. Данный метод нашел применение также для диагностики урогени-тальных микоплазмозов. Имеются тест системы «Микогени Флюо Скрин», «Урогени Флюо Скрин» производства фирмы «Ниармедик плюс». Аналогичные тест - системы выпускает другая фирма "Sanofi" (Франция), "Orion Diagnostics" (Финляндия) и др.

Теоретически метод прямой иммунофлюоресценции должен быть высокоспецифичным. Однако на практике достоверность результатов в значительной мере зависит от качества реагентов и квалификации исследователя.

При всех ограничениях метода в оптимальных условиях при использовании качественных диагностикумов и высокой квалификации персонала чувствительность метода прямой иммунофлюоресценции может достигать 85 — 90 % [Варламова Г.Ф. и др., 1991; Башмакова М.А., Савичева A.M., 2000].

В настоящее время при диагностике урогенитальных инфекций большинство авторов отдает предпочтение методу полимеразной цепной реакции [Povl-sen К. et al.,1998; Михайлов H.B. и др., 2004]. Разработаны методы одновременного выявления урогенитальных микоплазм и других агентов, вызывающих инфекции урогенитального тракта, с помощью мультиплексной ПНР [Зиганги-рова H.A. 1991; McKechnie M.L. et al., 2009; Wang H. et al., 2010; Diaz N. et al., 2010].

Постановка ПЦР занимает всего несколько часов, метод обладает высокой чувствительностью, достигающей одной искомой последовательности ДНК. Однако именно такая чувствительность в определенной мере накладывает ограничение на диагностическое использование ПЦР, т.к. не позволяет количественно определить величину инфекта, что, как было указано выше, имеет важное диагностическое и прогностическое значение. Кроме того, остаются неучтенными ошибки, связанные с возможностью присутствия в пробе ингибиторов ДНК полимеразы и генома нежизнеспособных микоплазм [Раковская

И.В. и др., 2008; Панкратова Н.В. и др., 2010].

В настоящее время коммерчески доступны наборы для индикации в ПЦР M.hominis, M.genitalium, U.urealyticum и других основных возбудителей урогенитальных инфекций (фирма «Ниармедик плюс», «Интерлабсервис», «Литех» и др.). Более того, современные представления об этиопатогенезе и клинике инфекционных заболеваний последнего десятилетия, в частности ми-коплазмозов, основываются почти исключительно на методах генодиагностики. Однако их правильная интерпретация возможна только при учете преимуществ и принципиальных ограничений молекулярно - биологических методов, рассмотренных выше. Таким образом, в настоящее время предложено и используется на практике ряд диагностических методов. Каждый из них имеет определенные достоинства и недостатки. Метод ПЦР требует современного оснащения лаборатории, поэтому в рутинной диагностике широко используется микробиологический метод, позволяющий получить результат через 3-5 дней. Вместе с тем защелачивание среды при росте уреаплазм приводит к быстрой гибели культуры, что не позволяет в ряде случаев определить ее чувствительность к антибиотикам. Количественная оценка инфекта возможна на средах Sanofi Pasteur. Но этот метод малопригоден для массовых (скрининговых) исследований ввиду высокой стоимости коммерческих наборов. Поэтому актуальной задачей микробиологии является совершенствование методов диагностики урогенитальных микоплазмозов, обладающих достаточной чувствительностью, специфичностью и доступностью для клинических лабораторий.

1.3 Распространенность генитальных микоплазм у больных с уроге-нитальной патологией

Датой рождения исследования микоплазм как отдельной группы микроорганизмов, как было указано выше, считается 1898 год, когда Е. Nocard и Е. Roux выявили возбудителя пневмонии крупного рогатого скота Mycoplasma mycoides. С момента их открытия в 1898 г. начинается достаточно быстрое развитие ветеринарной микоплазмологии. Микоплазмы были выявлены у многих

животных и птиц. Становление медицинской микоплазмологии произошло значительно позднее и начинается с середины прошлого века с выделением L. Dienes и J. Edsall в 1937 году микоплазм из протока бартолиновой железы у женщин.

От человека выделены шестнадцать видов микоплазм (13 видов Mycoplasma, 2 - Acholeplasma и 1 - Ureaplasma, два биовара которой в настоящее время выделены в отдельные виды - U.urealyticum и U.parvum [Krause D.C., Taylor-Robinson D., 1992]. Большинство из них относятся к нормальной микрофлоре. Так Mycoplasma orale и Mycoplasma salivarium могут быть обнаружены в ротоглотке у 64 % здоровых людей [Чеботкевич В.Н. и др., 1981]. Значительно реже обнаруживаются M.buccale, M.faucium, M.primatum, M.lypophilium, M.fermentans, Acholeplasma laidlawii. Принадлежность M.arthritidis к микрофлоре человека остается недоказанной [Taylor-Robinson D., Furr P.M., 1997]. За последние годы в связи с внедрением в диагностические исследования ПЦР принципиально изменился методический подход к изучению этиологии инфекционного процесса. Хотя работы выполненные в прошлые годы, во многом сохраняют свое значение и обобщены в виде нескольких книг [Тимаков В.Д., Каган Г .Я., 1973; Злыдников Д.М. и др., 1975; Прозоровский С.В. и др., 1995], в данном разделе будут проанализированы результаты исследований, касающиеся изучаемых в работе видов микоплазм, выполненных преимущественно в последнее десятилетие.

Колонизация урогенитальными микоплазмами у человека наблюдается уже в период прохождения через родовые пути при рождении [Taylor-Robinson D., 1986]. На это указывает тот факт, что колонизация микоплазмами у детей, рожденных с помощью кесарева сечения, наблюдается реже, чем при естественных родах. Уреаплазмы удавалось выделить из половых путей примерно у одной трети новорожденных девочек. M.hominis встречалась реже, что, очевидно, отражает их меньшую частоту выявления у беременных. У новорожденных мужского пола урогенитальные микоплазмы выделяются реже. В тоже

время в плаценте M.hominis и U.urealyticum встречаются достоверно чаще у плодов мужского пола, чем у женского [Goldenberg R.L. et al., 2006]. При рождении плодов мужского пола чаще выявлялась лимфоплазматическая инфильтрация плаценты. Этот феномен связывают с иммунной реакцией организма матери на ткани плода. Генитальные микоплазмы выделяют также из носа и зева новорожденных обоего пола.

У взрослых колонизация урогенитальными микоплазмами происходит половым путем. У девственников они встречаются редко. Частота обнаружения M.hominis и U.urealyticum возрастает с числом разных половых партнеров. У женщин колонизация генитальными микоплазмами выше, чем у мужчин, что возможно указывает на их большую чувствительность к заражению [Pajaro М.С. et.al., 2001].

Частота колонизации микоплазмами в значительной степени зависит от сексуального поведения. W.M. McCormack et al. (1985), при обследовании 437 студенток колледжа установили достоверно большую частоту выявления M.hominis и U.urealyticum инфекции у женщин, не использовавших контрацептивы. Кроме того урогенитальные микоплазмы достоверно чаще встречались у женщин с хламидийной инфекцией. У девственниц в данном исследовании они не были выявлены ни в одном случае.

V. Chandeying et al. (2000) изучали частоту выявления M.hominis, U.urealyticum, C.trachomatis у 479 студентов во время каникулярного отдыха в лагере в Тайланде. Партнершами студентов в 89 % случаев были подруги и только в 11 % секс - работницы. Всего ИППП были выявлены у 15,9 % обследованных. M.genitalium, M.hominis, U.urealyticum и C.trachomatis были обнаружены в 2,3; 1,3; 10,9 и 4,0 % случаев, соответственно. Авторы особо подчеркивают опасность инфицирования возбудителями ИППП молодых женщин -сексуальных партнерш, так как у них велик риск развития воспалительных заболеваний органов малого таза (ВЗОТ).

На опасность рискованного сексуального поведения указывают также

Е.И. Архипова с соавт. (2004). Так, по данным ЗАГСа по Новгородской области ежегодно отмечается около 2/3 разводов на общее число зарегистрированных браков, причем выявлена тенденция к их росту, в том числе и у лиц молодого возраста - 18 - 24 года. Авторы указывают, что свободные отношения предпочитают 12 - 24 % из числа опрошенных студентов НовГУ имени Ярослава Мудрого. Следует, однако, отметить, что среди студенческой молодежи разводов в 1,5 - 2 раза меньше, чем среди неучащейся молодежи.

В последнее время появились факты, указывающие на возможную связь уреаплазменной инфекции со значительно более опасными заболеваниями в частности с интраэпителиальными неоплазмами шейки матки. Установлено, что U. urealyticum, U. parvum, а также M. genitalium повышают риск инфицирования вирусами папилломы человека клеток эпителия шейки [Varela J.A. et al., 2006; Verterano R. et al., 2009; Zheng M.Y. et al., 2010; Lusk M.J. et al., 2011; Shigehara et al., 2011]. Эти данные указывают на необходимость обследования на скрытые инфекции и, в частности на микоплазмы и уреаплазмы здоровых людей и, по крайней мере, включать эти возбудители в комплекс исследований на ИППП при каждом обращении к врачам - специалистам. R. Teague с соавт. (2008) с сожалением отмечают, что практические врачи обследуют на наличие M.hominis, U.urealyticum, C.trachomatis, а также других возбудителей ИППП (вирус простого герпеса и аденовирусы) только 19 % обратившихся больных с негонококковым неспецифическим уретритом.

Участие генитальных микоплазм предполагается при многих заболеваниях мочеполового тракта как у женщин, так и у мужчин. В частности имеются данные о том, что M.hominis способствует развитию бактериального вагиноза [Кира Е.Ф. 2001; Hartmann M., 2009]. G.G. Donders с соавт. (2009) отметили, что наличие M.hominis при бактериальном вагинозе увеличивает риск преждевременных родов, тогда как у женщин с вагинозом при отсутствии M.hominis инфекции этого не наблюдалось. Аналогичные закономерности выявлены и в отношении U.Urealyticum [Vogel I. et al., 2006].

Имеются предположения о роли уреаплазм в возникновении вторичного бесплодия у женщин. Эти предположения основываются на том факте, что уреаплазмы достоверно чаще обнаруживаются при бесплодии [Gupta V. et al., 2009].

Активно изучается вопрос о значении M.hominis и U.urealyticum при спонтанных абортах, мертворождении и рождении детей с низкой массой тела [Башмакова М.А. и др., 2000; Odendaal H.J. et al., 2002; Taylor-Robinson D., 2007; Taylor-Robinson D., Lamont R., 2011]. M.hominis и U.urealyticum часто обнаруживают в пуповинной крови плодов у женщин с выкидышами и острыми воспалениями плаценты [Goldenberg R.L. et al., 2008]. H.J. Odendaal с соавт. (2002), выявили достоверное повышение частоты выделения M.hominis в уретре и цервикальном канале у женщин с преждевременными родами, чем у рожавших в срок.

Показана связь U.urealyticum - инфекции с развитием хориоамнионита и низкой массой тела новорожденных, а также с самопроизвольным прерыванием беременности [Cheng S. Y. et al., 1994]. Изучение механизмов развития осложнений беременности при инфекциях, вызванных микоплазмами показало, что при этих инфекциях происходит формирование хронической фетоплацентарной недостаточности, при этом основным пороком развития плода является диспла-зия почек различной степени, приводящая к развитию хронического пиелонефрита [Мальцева Л.И. и др., 1998]. Однако мнения исследователей по данному вопросу неоднозначны. По результатам анализа историй родов 303 женщин показано, что почти у половины из них (48,8 %) нижние отделы мочеполовой системы колонизированы U.urealyticum, а статистически значимых различий в частоте преждевременных родов и рождения детей с низкой массой у данной группы рожениц не отмечено [Paul V.K. et al., 1998]. В ретроспективном исследовании не установлена роль M.hominis и U.urealyticum в развитии преждевременных родов и/или выкидышей в I триместре беременности [Matovina М. et al., 2004].

Инфицирование амниотической жидкости M.hominis является главным источником заражения плода. Микоплазмозы плода изучены достаточно подробно. Описаны поражения многих органов плодов и новорожденных детей. Особое значение имеет поражение легких и центральной нервной системы. Внутриутробная M.hominis пневмония протекает по типу интерстициальной и сопровождается выраженными циркуляторными расстройствами, кровоизлияниями в альвеолы, образованием тромбов и гиалиновых мембран. Значительные поражения определяются и в других органах: печени, почках, головном мозге, тимусе и селезенке. Описаны случаи перитонита, септического артрита, случаи выделения микоплазм в качестве единственного инфекционного агента из ликвора новорожденных детей при менингите, менингоэнцефалите, абсцессах мозга [Раковская И.В., 1999].

Исследование роли M.hominis и U.urealyticum в этиологии воспалительных заболеваний мочеполового тракта у мужчин проводилось с середины 30-х годов прошлого века [Клинебергер-Нобель Е., 1966]. Исторически первым изучался вопрос о роли этих микоплазм при негонококковом уретрите у мужчин, основным возбудителем которого считается Chlamydia trachomatis. Ее выявляют в 40 % случаев негонококкового уретрита. M.hominis при негонококковом уретрите, по данным разных авторов, выявляется в 7 - 48 % случаев. Достаточно часто M.hominis и U.urealyticum выявляются и в уретре здоровых мужчин. По обобщенным данным литературы (с 1946 по 1972 годы), обоснованными на обследовании 2171 больных негонококковым уретритом и 1262 здоровых мужчин, M.hominis была выявлена соответственно в 24,7 % и 15,2 % случаев [Ав-тушенко С.С., 1973]. В более поздней литературе возможная роль M.hominis при негонококковом уретрите вообще не рассматривается, хотя Ureaplasma urealyticum рассматривается как возбудитель этого заболевания, причем в полном соответствии с постулатами Коха [Krause D.C., Taylor-Robinson D., 1992; Deguchi Т. et al., 2004; Maeda S. et al., 2004; Vesic S. et al., 2010].

Роль уреаплазм в развитии негонококкового уретрита была впервые пока

зана D. Taylor-Robinson с соавт. (1977) при экспериментальном заражении U.urealyticum добровольцев. T.Yoshida с соавт. (2007) установили, что U.urealyticum встречается достоверно чаще при негонококковом уретрите, чем у здоровых людей. В отношении U.parvum такой закономерности выявлено не было. D.H. Martin (2008) подтвердил эти результаты и кроме того указал на возможную роль аденовирусов в развитии негонококкового уретрита. В тоже время V. Gupta с соавт. (2008) пришли к противоположным выводам. По их данным большее значение в развитии негонококкового уретрита играет U.parvum. J.T. Yu с соавт. (2008) вообще не выявили большей частоты обнаружения уреаплазм при негонококковом уретрите по сравнению со здоровыми лицами. Возможно, это связано с тем, что авторы не проводили типирования уреаплазм. В то же время надо отметить, что имеются работы, в которых также не обнаружено различий в выявлении биоваров U.urealyticum у здоровых людей и при негонококковом уретрите [Chaim W. et al., 2003].

Возможно также, что доля U. urealyticum при негонококковом уретрите подвержена колебаниям в разные годы [Симещенко И.Е. и др., 2009]. J.A. Varela с соавт. (2003) на основании анализа 2101 случаев негонококкового уретрита за период с 1989 по 2000 год отмечают повышение удельного веса U.urealyticum и снижение С.trachomatis в последние годы. Имеется тенденция «вытеснения» хламидий из своей экологической ниши микоплазмами [Кучеренко И.Б. и др., 2010]. Можно также предположить, что частота уреаплазмен-ной инфекции зависит от эпидемической ситуации и степени циркуляции возбудителя. Так, в Словении U.urealyticum обнаруживалась у 22,9 % больных с негонококковым уретритом [Kese D. et al., 2003], а в Израиле примерно в тот же период в 2 раза чаще (45,6 %) [Srugo I. et al., 2003].

Довольно частым клиническим проявлением уреаплазмоза у мужчин является простатит [Егоров А.А., 2008]. Уреаплазмы попадают в простату чаще всего через уретру при восходящей инфекции. Показано, что наличие уреаплазм в секрете простаты в высоких титрах указывает на их этиологическую

скую роль. Подтверждением этого является успешное лечение больных тетра-циклинами. В то же время высказываются сомнения, действительно ли исследование секрета предстательной железы отражает истинное содержание уреаплазм в простате [Krause D.C., Taylor-Robinson D., 1992]. A. Doble с соавт. (1989) при биопсии простаты у больных простатитом не выявили U.urealyticum ни в одном случае. В то же время уреаплазмы были выявлены при биопсии придатков яичка у пациентов с эпидимоорхитом, успешно поддававшимся терапии тетрациклином. Других микробов в биоптате обнаружено не было [Jalil N. et al, 1988].

Y. Lee с соавт. (2010) изучали этиологическую роль U. urealyticum и M.hominis в развитии цистита у женщин и показали, что элиминация M.hominis и U. urealyticum в 87,5 % случаев приводит к исчезновению симптомов цистита (частые позывы к мочеиспусканию).

Некоторые бактерии, способные разлагать мочевину, в частности Proteus индуцируют образование так называемых инфекционных (не метаболических) камней. Уреаплазмы, обладая способностью метаболизировать мочевину, также могут индуцировать кристаллизацию струвита и фосфатов кальция in vitro и в модельных опытах на животных [Kaya S. et al., 2003]. Эти данные позволяют сделать выводы, что уреаплазмы могут способствовать образованию инфекционных камней, хотя и не часто.

Вопрос о роли уреаплазм в мужском бесплодии дискутируется с тех пор, как микроскопически установлен факт прикрепления уреаплазм к сперматозоидам [Gnarpe H., Friberg J., 1973]. Снижение подвижности сперматозоидов рассматривается как один из механизмов воздействия уреаплазм на сперматозоиды. Имеются данные об ухудшении качественных характеристик спермы больных с уреаплазменной инфекцией [Wang Y. et al., 2006; Gdoura R. et al., 2007; Liu D.F. et al., 2008]. Вопрос о влиянии U. urealyticum на сперматогенез продолжает интенсивно изучаться. Так установлено понижение концентрации цинка в семенной жидкости, инфицированной уреаплазмами. Цинк играет важную

роль в процессе сперматогенеза и его дефицит может вызывать нарушение этого процесса [Barney G.H. et al., 1969].

Клинические наблюдения также способствовали изучению механизмов патогенеза уреаплазменных инфекций. Известно, что у больных гипогаммагло-булинемией иногда развиваются артриты, связанные, как предполагают, с U. urealyticum [Taylor - Robinson D. et al, 1986]. Уреаплазмы могут быть изолированы из суставов в течение многих месяцев, несмотря на антибиотикотера-пию и противовоспалительное лечение. Эти клинические наблюдения позволили предположить, что развитие синдрома Рейтера (артрит, конъюнктивит, уретрит) связано с иммунологическими механизмами. Как известно, синдром (болезнь) Рейтера чаще всего ассоциирован с Chlamydia trachomatis, однако в ряде случаев показано участие Ureaplasma urealyticum [Лобзин Ю.В. и др., 2003]. Описано также, что U.urealyticum и M.hominis способны вызывать серьезные инфекции у иммунодепрессивных больных при трансплантации почек [Salmet A. et al., 2003].

Важной самостоятельной задачей микробиологии является изучение смешанных микоплазменных и уреаплазменных инфекций.

Установлено, что развитие респираторного микоплазмоза происходит чаще всего на фоне вирусных респираторных инфекций [Чеботкевич В.Н. и др., 1981]. Mycoplasma pneumoniae инфекция у взрослых в 57,4 % , а у детей в 92,1 % случаев протекала в ассоциации с другими респираторными вирусами. Поэтому изучение смешанных инфекций приобретает большое значение в медицинской микоплазмологии, как и в инфекционной патологии в целом.

Велико значение смешанных инфекций и при урогенитальном микоплазмозе. Так, в 36,7 % случаев U.urealyticum инфекции у больных с различными воспалительными заболеваниями мочеполовых органов сопровождались обострением генитального герпеса [Злотникова И.М. и др., 2002]. Урогенитальный хламидиоз по данным разных авторов протекает как смешанная уреаплазмо - хламидийная инфекция в 40 - 63 % случаев [Кира Е.Ф.,

1996; Тимашева O.A. и др., 1996]. Большой самостоятельной проблемой является изучение микоплазм как ко-факторов развития ВИЧ инфекции и СПИД - ассоциированных микоплазмозов [Shyn-Chiny L.O., 1992].

Изучение смешанных инфекций сопряжено с рядом методологических трудностей, связанных с невозможностью точно определить сроки заражения микробными агентами. Как известно, под смешанной инфекций понимают процессы, вызванные двумя или более возбудителями при одновременном заражении. От смешанной инфекции следует отличать вторичную инфекцию, при которой к первоначальной уже развившейся болезни присоединяется другая, вызванная новым возбудителем [Борисов Л.Б., Смирнова А.М., 1994].

Результатом взаимодействия возбудителей при смешанных инфекциях может явиться независимое размножение, экзальтация (усиление размножения одного или нескольких инфекционных агентов), интерференция (подавление одного из ассоциантов или взаимная интерференция), комплементация (специфическая зависимость размножения одного возбудителя от другого). Например, вирус гепатита D репродуцируется только при наличии вируса-помощника», роль которого выполняет вирус гепатита В.

Четкое определение указанных выше понятий приобретает особую роль при микоплазмозах, так как при них установлена зависимость исхода взаимодействия от сроков заражения и интервала между введением инфекционных агентов.

Выявлена связь между микоплазменной и гонококковой инфекцией. Колонии U. urealyticum и М. hominis, как выяснилось, растут на поверхности колоний гонококков. При электронно-микроскопическом исследовании подтверждена тесная связь гонококков с мембраной уреаплазм. Отмечена возможность долговременного выживания различных инфекционных возбудителей внутри трихомонадной клетки. Это способствует генерализации инфекции и снижению эффективности антибиотикотерапии. Исследование микст - инфекции Mycoplasma hominis и Chlamydia trachomatis показало, что в

этом случае симптомы хламидийной инфекции более выражены [Козлова В.И., Пухнер А.Ф., 2000].

Представленные данные показывают значительную роль урогенитальных микоплазм при многих заболеваниях. Вместе с тем недостаточно изучена эпидемиология урогенитальных микоплазмозов. Открытым остается вопрос о причинах различной частоты обнаружения урогенитальных микоплазм у здоровых людей. Связано ли это с частотой их выявления в разные годы или данные отражают только региональные особенности распространения ИППП остаётся неясным. Мало исследованным является также вопрос о частоте обнаружения Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum у студенческой молодежи, являющейся группой рискованного сексуального поведения и, соответственно, высокого риска развития инфекций, передаваемых половым путем [Архипова Е. И. и др., 2004; Гранская Ю.В. и др., 2005]. Эти вопросы требуют дальнейшего изучения в связи со сложной социальной и демографической ситуацией в нашей стране.

1.4 Чувствительность и резистентность урогенитальных микоплазм к антибиотикам

Антибиотикотерапия является основным методом лечения урогенитальных микоплазмозов. Следует, однако, отметить, что во многих случаях этио-тропное лечение должно являться частью комбинированной терапии, включающей также иммунотропную терапию. Важность этой терапии при уреаплаз-менной инфекции определяется также тем, что антибиотики, активные в отношении микоплазм, обладают бактериостатическим, а не бактерицидным действием. Поэтому определяющую роль в элиминации возбудителя играет иммунный статус больного. М.А. Гомберг и А.М. Соловьева (2004) считают, что иммунотропную терапию, в частности с помощью модулятора «Иммуномакс» надо применять при неэффективности хотя бы одного курса антибиотикотера-пии.

Частота смешанных микоплазменных инфекций достаточно велика, по

этому назначаемые антибиотики должны быть эффективными и в отношении других инфекционных агентов, участвующих в развитии патологического процесса и в первую очередь в отношении Chlamydia trachomatis [Wang Y. et al., 2009]. Кроме того, необходимо учитывать скорость проникновения препарата в ткани при назначении антибиотиков. Это имеет существенное значение для обеспечения необходимой его концентрации в пораженных тканях. Важной проблемой, связанной с лечением урогенитальных инфекций ассоциированных с генитальными микоплазмами является нарастающая с каждым годом резистентность различных микроорганизмов к антимикробным препаратам [Krausse R., Schubert S., 2010].

В настоящее время механизмы развития антибиотикорезистентности интенсивно изучаются. Показано, что устойчивость M.hominis и U.urealyticum к тетрациклинам определяется tet-M и tet-O детерминантами, которые обнаруживаются изменениями конформации рибосом, вследствие чего сродство препарата к местам узнавания на рибосомах падает.

Устойчивость к макролидам определяется генами, детерминирующими синтез метилтрансферраз, которые способны изменять сайты распознавания антибиотиков - 23 S рибосомную РНК [Гущин А.Е. и др., 1998].

Разработаны методы выявления детерминант резистентности с помощью полимеразной цепной реакции. Однако широкое применение этих методов в практике не всегда оправдано. Так, S. Degrange с соавт. (2008) обнаружили наличие tet-M гена в двух из 24 штаммов Mycoplasma hominis, чувствительных к тетрациклину.

Развитие устойчивости формируется по двум основным направлениям. Это хромосомный тип обусловленный мутациями в генах, кодирующих ферменты, являющиеся «мишенью» антибиотика, или в генах, стимулирующих выработку собственных ферментов-антагонистов, блокирующих действие препарата. Второй механизм связан с нарушением проницаемости наружной клеточной мембраны, в результате чего уменьшается проникновение лекарствен-

ного средства в клетку. Если в результате мутаций возникает устойчивость к конкретному препарату или к группе сходных по действию препаратов, то в случае нарушения транспортных систем развивается перекрестная резистентность ко всем антибиотикам, для действия которых необходим нормальный транспорт в клетку - мишень. В настоящее время для лечения воспалительных процессов, ассоциированных с Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, применяются в основном препараты тетрациклинового ряда, макролиды и фторхинолоны [Robertson J.A. 2001; Waites et al., 2008; 2009]. Однако необходимо отметить, что от 2,0 до 10,0 % выделенных штаммов генитальных мико-плазм устойчивы к тетрациклинам и макролидам [Гамова Н.А., 2005; Lin Р.Н., Lu Н.Х., 2007]. Сохраняется высокая чувствительность урогенитальных мико-плазм к джозамицину [Малова И.О., 2004]. Азитромицин активен против широкого спектра микоплазм, хотя U. urealyticum менее чувствительны к нему. Кроме того, около 10,0 % U. urealyticum устойчивы к тетрациклину, около 40,0 % - имеют перекрестную устойчивость к эритромицину, которая возникает в результате наличия гена устойчивости tet- М.

А.Е. Тараскина с соавт. (1999) проанализировали данные антибиотикочув-ствительности 139 клинических изолятов M.hominis в Санкт-Петербурге и установили, что 27 (19,4 %) штаммов были резистентны к тетрациклину, 7 (5,0 %) - к доксициклину, 51 (36,7 %) - к спирамицину, 2 (1,4 %) - к ципро-флоксацину, 4 (2,9 %) - к азитромицину. В данной группе отмечалась мультире-зистентность 13,7 % образцов. Сравнение спектра устойчивости клонов к антибиотикам группы тетрациклина показало, что резистентные к доксициклину изоляты M.hominis обязательно устойчивы к тетрациклину, тогда как устойчивость к тетрациклину не обязательно сопряжена с устойчивостью к доксициклину. Для 7 клинических штаммов Mycoplasma hominis была характерна перекрестная устойчивость к антибиотикам этой группы, 12 — проявили резистентность к тетрациклину и спирамицину. Резистентность к ципрофлоксацину для всех изолятов сопровождается мультирезистентностью (устойчивостью к

тетрациклинам или/и макролидам). Все выявленные устойчивые к азитромици-ну популяции были выделены из клинического материала пациентов, прошедших курс лечения макролидами. Для этой группы штаммов характерна перекрестная устойчивость к спирамицину [Тараскина А.Е. с соавт., 1999].

Для выбора схемы адекватной терапии рекомендуется лабораторное определение чувствительности выделенных штаммов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum к антибиотикам. Так как отмечена способность уреаплазм быстро приобретать устойчивость к антибактериальным препаратам при их пассировании in vitro, необходимо тестировать только свежевыделен-ные штаммы [Laurence В.S., 1983].

Другая сложность состоит в том, что чувствительность к антибиоткам, определяемая in vitro, не всегда коррелирует с их положительным терапевтическим эффектом. Анализ исследований, посвященных лечению уреаплазменной инфекции, показывает чрезвычайный разброс показателей эффективности различных антибиотиков (от 40,0 до 100 %). В независимых исследованиях критерий эффективности того или иного антибиотика при уреаплазмозе редко превышает 80 % [Гомберг М.А., Соловьева A.M., 2004].

Важной самостоятельной микробиологической проблемой является использование адекватных методов чувствительности Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum к антибиотикам. Особенности биологии микоплазм (малый размер колоний, сравнительно длительный срок инкубации и др.) не позволяют использовать общепринятый в микробиологии диско - диффузный метод определения чувствительности [Laurence В.S., 1983]. На результаты теста определения чувствительности к антибиотикам оказывают влияние состав питательной среды, условия инкубации и особенно количество внесенной культуры [Lorian V., 1986; Wolfson J.S., Hooper D.C., 1989]. Эти условия необходимы для получения достоверных и воспроизводимых результатов. К сожалению, для M.hominis и U.urealyticum не определены стандартные условия постановки теста, т.к. состав питательной среды, добавки ростовых факторов и величина

инокулума варьируют в разных лабораториях [Андреева И.В. и др., 2010].

Предложенные тесты основаны на получении возрастающих концентраций антибиотиков в плотной питательной среде или в бульоне [Robertson J.A. et al., 1981]. Для микоплазм обычно используют разведение в жидких питательных средах с последующим добавлением исследуемых культур. Однако, по мнению М.С. Roberts (1992), предпочтительно по возможности использовать разведение в плотных агаровых средах. Этот метод позволяет выявлять гетерогенность исследуемой культуры, мутантные резистентные штаммы, что невозможно в жидкой питательной среде. Тест на плотной питательной среде обычно показывает более низкую ингибирующую концентрацию антибиотика, тогда как в жидкой среде рост может являться результатом размножения единичных резистентных клеток. Так как микоплазмы растут медленно, то достаточно сложно определить пороговый уровень чувствительности из - за инактивации и разрушения антибиотиков в период инкубации.

Как было указано выше, при культивировании in vitro быстро развивается резистентность Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum к антибиотикам. Поэтому для исследования пригодны только свежевыделенные культуры первого пассажа в логарифмической фазе роста. Для достижения этих условий М.С. Roberts (1992), рекомендует для выявления роста культур Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum часть образца замораживать, а другую часть инкубировать при 37° С в свежей питательной среде в разведении 1/100. При появлении роста используют выросшую культуру, а при его отсутствии исследуют замороженный образец.

Несмотря на указанные преимущества теста на плотных средах, в практических исследованиях почти исключительно используют метод разведения в жидкой питательной среде. В этих случаях критическое значение имеет разведение культуры, так как инокулум высокого титра вызывает изменение цвета индикатора даже в отсутствие живой культуры [Kenny G.E. et al., 1989]. В тесте на жидкой среде низшая концентрация антибиотика, ингибирующая

рост культуры через 18-24 часа носит название «минимальная ингибирующая концентрация» (МИК).

С. Bebear с соавт. (1985; 1993) разработали метод определения чувствительности к антибиотикам M.hominis, основанный на регистрации изменения цвета индикатора при метаболической активности культур. На основе этих исследований ими была разработана коммерческая система SIR-mycoplasma, которая в настоящее время производится фирмой Sanofi Pasteur [Renaudin Н., Bebear С., 1990]. Она нашла широкое применение во многих странах, в том числе и в России. Применение данной тест - системы рассматривается в настоящее время как стандартный метод определения антибиотикорезистентности микоплазм. Однако при интерпретации результатов исследований необходимо учитывать, что в тест-системе используется 2 или даже 1 разведение антибиотика, что, по мнению ряда специалистов, недостаточно [Roberts М.С., 1992].

Представленные материалы указывают на необходимость постоянного мониторинга чувствительности микоплазм и уреаплазм к антибиотикам. В то же время работ по мониторингу, охватывающих период нескольких лет и выполненных по единой методике, практически нет. Кроме того важной самостоятельной задачей является изучение региональной антибиотикочувствительно-сти урогенитальных микоплазм.

Собственные исследования Глава 2 Материалы и методы исследования 2.1 Характеристика обследованных контингентов больных

В соответствии с поставленными задачами нами были обследованы на инфекции, передаваемые половым путём, пациенты обоего пола — 54 мужчины и 73 женщины в возрасте от 17 до 58 лет, обратившиеся по поводу заболеваний урогенитального тракта в лечебно-профилактические учреждения г. Великий Новгород. Для сравнения была изучена частота обнаружения Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum среди студенческой молодежи. Было обследовано 18 студентов и 57 студенток в возрасте от 18 до 22 лет, обучавшихся в институте медицинского образования Новгородского государственного университета имени Ярослава Мудрого г. Великий Новгород в 2007 - 2008 гг. Общее число обследованных лиц составило 202 человека (таблица 1). Таблица 1 - Характеристика обследованных контингентов лиц

Пол обследованных Группы обследованных Кол-во обследованных

Мужчины Обследованные на ИППП 54

Студенты 18

Женщины Обследованные на ИППП 73

Студентки 57

Итого 202

Критериями исключения из числа обследованных лиц были: возраст менее 16 и старше 60 лет, наличие социально значимых сопутствующих заболеваний: туберкулеза, сифилиса; тяжелых заболеваний сердечно - сосудистой и гепато-билиарной системы, почек, а также заболеваний крови. На проведение обследования было получено информированное согласие участников.

Исследования проводили на базе Новгородского областного кожно-венерологического диспансера, Городской женской консультации № 1 и Лечебно-диагностического центра (Городская женская консультация №3) г. Великий Новгород.

У лиц, обратившихся в эти лечебно-профилактические учреждения, проводили микробиологические исследования биоматериала из урогенитального тракта на выявление Mycoplasma hominis и Ureaplasma urea-lyticum с применением собственной модификации метода культивирования на жидких питательных средах, позволяющая определять количественные показатели содержания микроорганизмов.

Обнаружение Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в исследуемом материале в титре равном 104 ЦИЕ/мл и больше, свидетельствует о его выраженных патогенных свойствах, а 103 ЦИЕ/мл и меньше - о колонизации микоплазмами тканей. Дифференцировку уреаплазм и определение других возбудителей Ш11111 [Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis, Herpes simplex virus, citomegalovirus (CMV)] проводили методом полимеразной цепной реакции.

Для ретроспективной оценки частоты обнаружения Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis были проанализированы результаты обследования 4100 больных ИППП за период с 2002 по 2008 гг. Анализ данных проведен по журналам регистрации результатов лабораторного обследования больных в лечебно-профилактических учреждениях г. Великий Новгород. Исследована частота выявления Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в биоматериале из уретры, цервикального канала и заднего свода влагалища. Чувствительность выделенных у больных штаммов М. hominis и U. urealyticum к антибиотикам была изучена за период с 2005 по 2008 гг. Всего исследовано 373 штамма Mycoplasma hominis и 617 - Ureaplasma urealyticum.

Сбор анамнеза у студентов проводили с учетом особенностей жилищных условий, наличия и количества половых партнеров, начала и опыта половой жизни, применения методов контрацепции, знания методов профилактики инфекций передаваемых половым путем, обращений к специалистам по поводу ИППП. Наряду с этим у студентов определяли содержание М. hominis и U. urealyticum в отделяемом из уретры, цервикального канала, заднего свода

влагалища микробиологическим методом с применением собственной модификации.

2.2 Микробиологические и молекулярно - биологические методы исследования

Для индикации Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis использовали микробиологический метод. Забор материала для исследования производили с помощью зондов фирмы «Orion» (Финляндия). У женщин изучали содержимое уретры, цервикального канала и заднего свода влагалища. Для получения материала из уретры у мужчин зонд вводили в уретру на глубину 3-4 см.

Питательные среды для культивирования Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis готовили микробиологическим методом в модификации В.Н. Чеботкевича с соавт. (1981). Состав питательных сред указан в таблице 2. Таблица 2 — Состав питательных сред, использованных для выделения Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis из урогенитального тракта больных

Ингредиент Состав питательных сред

№ 1 для М. hominis №2 для U. urealyticum

Рабочий раствор бульона (мл) 80 80

Лошадиная сыворотка (мл) 10 10

Дрожжевой экстракт (мл) 10 10

Ацетат таллия 2% раствор (мл) 1 -

Пенициллин 100000 Ед/мл (мл) 1 1

Феноловый красный до 0,00 2% до 0,002 %

Мочевина 5 % раствор - до 0,5 %

Ь-аргинин гидрохлорид 10 % раст-

вор до 1,0 % -

РН среды 7,6 6,0

Посев исследуемого материала осуществляли в 2 пробирки типа «Эппендорф», содержащие жидкие питательные среды: № 1 - с 1 % аргинина (рН 7,8) для Mycoplasma hominis и № 2 - с 0,5 % мочевины (рН 6,0) для Ureap-lasma urealyticum.

Бульон из свежих мышц говяжьих сердец составлял основу питательной среды для культивирования Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum. Мышечную массу говяжьих сердец освобождали от плёнок, сухожилий и жировой ткани, затем разрезали на мелкие куски, добавляли дистиллированную воду - двойное количество и подвергали термическому воздействию в течение 20 минут после момента закипания. По истечении этого времени мясо вынимали из бульона, измельчали в мясорубке, вновь помещали в бульон. В остывшую смесь вносили панкреатин из расчёта 5 г/л, устанавливали рН 7,8 -8,0, тщательно перемешивали и инкубировали в термостате в течение 1часа при 37° С, периодически взбалтывая. После этого в бульон добавляли хлороформ из расчёта 20 мл/л, корректировали рН и оставляли на 10 дней для переваривания при 37° С, предварительно закрыв бутыль резиновой пробкой. Смесь необходимо было взбалтывать не менее 3 раз в сутки и периодически контролировать рН. Основу питательной среды выдерживали до 6 месяцев при температуре 4° С.

Для приготовления рабочего раствора бульона, основу разбавляли до содержания аминного азота 120 мг/ % и кипятили в течение 10 мин., затем в раствор добавляли натрия хлорид до концентрации 0,6 %, фильтровали через бумажный фильтр и стерилизовали при 105° С 15 минут.

В качестве компонента питательной среды использовали нормальную лошадиную сыворотку производства Ставропольского НИИВС. Каждую серию сыворотки испытывали на способность поддерживать рост микоплазм.

Для поддержки роста М. hominis и U. urealyticum использовали дрожжевой экстракт. С этой целью 1 часть свежих пекарских дрожжей соединяли с 4 частями дистиллированной воды, тщательно перемешивали и

доводили до кипения. Полученную массу охлаждали, фильтровали через двойной слой фильтровальной бумаги, затем устанавливали рН 7,8 - 8,0, стерилизовали при 115° С в течение 15 минут и хранили при (—20)° С.

Мочевину (5 % - ный раствор) и L - аргинин гидрохлорид (10 % - ный раствор) стерилизовали фильтрацией через асбестовый фильтр.

Из указанных ингредиентов готовили питательные среды, состав которых указан в таблице 2.

Инкубацию посевов осуществляли в термостате при 37° С до 12 суток. Рост М. hominis на питательной среде с аргинином выявляли на 3 - 5 сутки, а U. urealyticum визуализировали обычно уже на 2 - 3 сутки в среде с мочевиной по изменению цвета индикатора [Чеботкевич В.Н. и др., 1981].

После этого производили пересев культуры на твердые питательные среды аналогичного состава с добавлением 1,3 % агара "Difco" [США], но без фенолового красного.

Типичные колонии диаметром 0,1 - 0,3 мм с врастающим вглубь агара темным центром и более светлой периферией наблюдались, как правило, у М. hominis, a U. urealyticum образовывали очень мелкие колонии, диаметром 0,01- 0,03 мм и без периферической зоны.

Для индикации Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Gardnerella vaginalis, cytomegalovirus (CMV), Herpes simplex vims (HSV), Neisseria gonorrhoeae, а также для дифференцировки уреаплазм на U. urealyticum и U. parvum использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с набором диагностикумов фирмы ООО «ИнтерЛабСервис» (Москва, Россия).

Биоматериал, полученный у обследованных мужчин и женщин способом, описанным выше, помещали в пробирки типа «Эппендорф». Из исследуемого материала выделяли ДНК сорбентным способом.

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе «Терцик-2» («ДНК-технология», Москва, Россия). Реакционный буфер содержал 1 Ед термостабильной Taq - полимеразы, праймеры, дезоксинуклеотидтрифосфаты.

В буфер вносили подготовленную пробу, поверх которой наслаивали 25 мкл минерального масла для предотвращения испарения реакционной смеси. Реакция состояла из 42 циклов. Каждая проба содержала внутренний контроль, свидетельствующий о том, что реакция прошла успешно.

В работе использовали отдельные наборы автоматических микропипеток, а также одноразовые наконечники с целью предотвращения получения ложноположительных результатов, связанных с возможной контаминацией.

Ввиду частого обнаружения М. hominis и U. urealyticum у здоровых лиц, важное значение имеет количественный учет результатов высева культур. В этой связи, с целью полуколичественной оценки титра Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, нами были использованы коммерческие тест - системы - диагностические наборы «Mycoplasma DUO» код 62740 (SANOFI Pasteur, Франция) (рисунок 1).

ООО1

[ООО] ООО

МЧГС«Ч-Д&И* DUO

Palenh Dcte-

J

Рисунок 1 - Внешний вид панели диагностического набора «Mycoplasma-

DUO».

Материал от больных в соответствии с инструкцией изготовителя помещают в пробирки, содержащие 2 мл транспортной среды, прилагаемой к набору. Забор материала из уретры производят одноразовыми зондами и помещают непосредственно в пробирки со средой. Исследуемый материал затем из транспортной среды засевают в лунки панели диагностического набора «Mycoplasma DUO».

Вначале в лунки U >104иН >104 вносили по 200 mich разбавителя (diluent), прилагаемого к набору. Затем исследуемый материал из пробирки с транспортной средой вносили в количестве 100 мкл в лунки U, X, Н, в количестве 25 мкл - в лунку D. Далее содержимое лунки D тщательно перемешивали пипетированием и в объеме 25 мкл переносили в лунки U > 104 и Н >104. Для всех манипуляций использовали разные пипетки. Далее панели заклеивали прозрачной пленкой и инкубировали в термостате при 37° С 24 часа. Результат интерпретировали по изменению цвета индикатора из оранжевого в красный в лунках U > 104 и/или Н > 104 и расценивали как обнаружение Mycoplasma hominis и/или Ureaplasma urealyticum в титре > 104 ЦИЕ/мл (цветоизменяющих единиц).

При отсутствии изменения цвета индикатора инкубацию продолжали до 48 часов. Покраснение среды в эти сроки в лунках U и/или Н расценивается как

л

выявление Mycoplasma hominis и/или Ureaplasma urealyticum в титре <10 ЦИЕ/мл. Отсутствие изменения цвета интерпретируется как негативный результат посева.

В задачу нашего исследования входило также определение чувствительности выделенных штаммов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum к антибиотикам. Чувствительность этих микоплазм к антибиотикам проводили в планшетах для иммунологических реакций производства Медполимер (г. Санкт-Петербург), в лунки которых вносили антибиотики в концентрациях, соответствующих терапевтической дозе исследуемых препаратов (таблица 3).

Разведения антибиотиков вносили в объеме 50 мкл. Затем в лунки добавляли 50 мкл исследуемой культуры в разведении 1:50, конечное разведение культуры составляло 1:100.

Таблица 3 - Схема постановки опыта определения чувствительности Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis к антибиотикам

Изучаемые антибиотики Концентрация антибиотика в лунках ряда

1 2 3 (контроль)

Доксициклин 4 мг/л 8 мг/л -

Джозамицин 2 мг/л 8 мг/л -

Клиндамицин 2 мг/л - -

Офлоксацин 1 мг/л 4 мг/л -

Азитромицин 2 мг/л 8 мг/л -

Ломефлоксацин 2 мг/л 8 мг/л -

Первый и второй ряды лунок содержали антибиотики (доксициклин, джозамицин, клиндамицин, офлоксацин, азитромицин, ломефлоксацин). Третий ряд лунок не имел антибиотиков и являлся контрольным. Реакцию оценивали после появления роста в контрольной лунке через 24 и 48 часов.

Изменение цвета в обеих лунках с антибиотиком указывало на устойчивость к нему исследуемого штамма. Отсутствие изменения цвета индикатора в обеих лунках оценивалось как чувствительность изучаемой культуры. Изменение цвета только в одной лунке (с малой концентрацией антибиотика) указывало на слабую устойчивость культуры к данному препарату.

Чувствительность Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis к антибиотикам определяли методом серийных разведений биоматериала с использованием собственной модификации состава питательных сред для культивирования урогенитальных микоплазм.

2.3 Иммунологические методы исследования

Для оценки патогенности урогенитальных микоплазм проводили определение уровня секреторных и сывороточных иммуноглобулинов с использованием метода радиальной иммунодиффузии по С.В. МапсЫш с соавт. (1965). Применяли моноспецифические сыворотки к иммуноглобулинам М, О, А производства ИЭМ имени Н.Ф. Гамалеи (г. Москва).При исследовании местного иммунитета мы столкнулись с трудностями в выборе материала для исследования и его стандартизации. Кроме того, необходимо было выяснить характер изменения концентрации иммуноглобулинов в разные периоды менструального цикла. Для выяснения этих вопросов была исследована группа из 10 женщин с различными воспалительными заболеваниями женских половых органов.Учитывая небольшое количество доступного для исследования секрета и его вязкость, забор материала производили с помощью стеклянной трубки с внутренним диаметром около 3 мм, соединенной с резиновой грушей для создания отрицательного давления в момент забора материала. Из-за вязкости секрета его невозможно было перенести в пробирку для последующего анализа. Поэтому мы разработали следующую методику обработки материала: стеклянную трубку, содержащую исследуемый материал, соединяли с предварительно взвешенными пробирками типа «Эппендорф» объемом 0,5 мл и центрифугировали при 500g 10 мин для осаждения секрета. Пробирку с материалом вторично взвешивали и по приросту веса пробирки устанавливали количество полученного секрета. Затем материал смешивали |с равным количеством физиологического раствора, гомогенизировали

I

многократным пипетированием с помощью микрошприца МШ-10 и

I

использовали для определения в нем концентрации белка и различных классов иммуноглобулинов. Разработанный метод был применен для получения исследуемого материала из заднего свода влагалища и наружного зеъа цервикального канала. Предварительные опыты показали, что метод позволяет получить от 5,0 до 20,0 мг секрета заднего свода влагалища (в среднем 12Д

мг) и от 5,0 до 180,0 мг секрета цервикального канала (в среднем 37,7 мг). Этого количества материала вполне достаточно для определения в нем концентрации различных классов иммуноглобулинов. По нашим данным концентрация иммуноглобулинов классов А и G в слизи заднего свода и секрете цервикального канала у женщин была примерно одинаковой. Всвязи с этим для основной серии исследований нами был использован секрет цервикального канала, т.к. он в большей степени характеризует состояние местного иммунитета верхних отделов половых путей.

Далее у обследованной группы пациенток с различными воспалительными заболеваниями женских половых органов определяли уровень иммуноглобулинов цервикальной слизи в различные периоды менструального цикла. Кроме того изучали концентрацию белка в секрете [Зильбер JI.A., 1968]. Установлено, что уровень IgA и IgG был не

одинаков в разные периоды менструального цикла (рисунок 2).

предовуляционный овуляционный постовуляционный предменструальный

ЩИ IgA

IgG

•концентрация белка (мкг/мл)

т

95 % доверительный интервал Рисунок 2 - Концентрация и ^О (мкг/мл) в цервикальной слизи женщин в разные периоды менструального цикла.

Наибольшего уровня эти параметры достигают в предменструальный период, что коррелирует с максимальной концентрацией белка, расчитанного на 1мл секрета. Из общего количества ^ А секреторный 1§ А А) составил от 76,0 до 85,5 %.

При расчете концентрации А на 100 мкг белка секрета его уровень оставался стабильным (от 5,6 до 5,9 мкг/100мкг белка), хотя в предовуляцион-ный период его концентрация была понижена (4,9 мкг/100 мкг белка) (рис. 3). Уровень в существенно различался в разные фазы менструального цикла. Иммуноглобулин М в секретах выявлен не был.

т 160

с;

=г

Я)

е-

X «

а1

/

«Г

¿V-

11д А

|д й

.концентрация белка (мкг/мл)

к 2

0

1

95 % доверительный интервал Рисунок 3 - Концентрация и (на 100 мкг белка) в цервикальной слизи женщин в разные периоды менструального цикла.

Примечания. - Периоды менструального цикла (слева-направо): предовуляционный, овуляционный, постовуляционный, предменструальный.

Наиболее информативной является оценка уровня иммуноглобулинов в цервикальной жидкости в первую фазу менструального цикла.

2.4 Статистические методы исследования

Статистическая обработка результатов проводилась с применением современных программных пакетов математико-статистического анализа [Ребро-ва О.Ю., 2002].

Для описания нормально распределенных количественных переменных использовали показатели: среднее значение признака (М), стандартную ошибку среднего (ш), 95 % доверительный интервал (ДИ ± 95 %). Отличия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Для сравнения нормально распределенных количественных переменных нами был применен критерий Стьюдента. Для сравнения категориальных переменных приводился анализ таблиц сопряженности, определялся критерий X2 -Пирсона и значение р (уровня значимости). Для сравнения процентных долей применяли угловое преобразование Фишера (ф-преобразование) или г- критерий. Был рассчитан относительный риск (ОР) и его 95 % доверительный интервал (95 % ДИ) в группах сравнения.

Учитывая, что результаты параметрических и непараметрических тестов были идентичны данные исследуемых переменных в группах, где распределение признаков отличалось от нормального, были также представлены в виде средней арифметической (М) и ошибки средней величины (т), 95 % доверительного интервала (ГДИ).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Стуколкина, Наталья Евгеньевна

ВЫВОДЫ

1 Среди лиц, обследованных на инфекции, передаваемые половым путем, выявлена высокая частота обнаружения микоплазм в биоматериале уроге-нитального тракта: Ureaplasma urealyticum - 25,9 % - у мужчин и 53,4 % -у женщин (р=0,0044); Mycoplasma hominis - 16,7 % и 20,5 % (р=0,7469) соответственно. В группе больных с урогенитальной патологией преобладают лица, имеющие ассоциированные Ureaplasma urealyticum инфекции (64,3 % - у мужчин, 82,0 % - у женщин; (р=0,0032) и смешанные Mycoplasma hominis инфекции (56,0 % - у мужчин, 100 % - у женщин; (р=0,0227).

2 Клинические особенности уреаплазменной инфекции у мужчин характеризуются высокой частотой уретритов (40,7 %), у женщин - уретритов (35,8 %) и кольпитов (25,6 %). При Mycoplasma hominis инфекции у мужчин чаще выявляются уретриты (33,3 %), у женщин - бактериальные вагинозы (53,0 %).

3 Штаммы Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis, выделенные у больных, наиболее чувствительны к доксициклину (89,8-100 % - U. urealyticum;

97.6-100 % - M.hominis) и джозамицину (77,9-87,8 % - U. urealyticum; 76,982,7 % - M.hominis), наименее - к офлоксацину (24,5-53,9 % - U. urealyticum;

22.7-61,5 % - М. hominis), ломефлоксацину (29,0-64,0 % - U.urealyticum; М. hominis - 28,0-62,0 %) и азитромицину (52,9-71,1 % - U.urealyticum; 50,0-69,9 % - M.hominis).

4 Разработанный метод определения титров U. urealyticum и М. hominis в жидкой питательной среде с визуальной регистрацией изменения цвета индикатора фенолового красного в динамике времени позволяет проводить полуколичественную оценку содержания микоплазм в биоматериале, полученном от больных, что необходимо для проведения скрининговых исследований у населения, адекватной диагностики и терапии урогенитальных инфекций.

5 Усовершенствованная методика культивирования штаммов и. игеа1уй-сит в жидкой питательной среде с использованием буферного раствора НЕРЕБ, позволяет повысить жизнеспособность микроорганизмов, полученных у больных и увеличить титры микробных тел, что необходимо при изучении их антибиотикочувствительности и резистентности.

Практические рекомендации

1 При проведении скрининговых исследований частоты обнаружения микоплазменной инфекции у населения рекомендуется использовать способ микробиологической диагностики, позволяющий полуколичественно оценить концентрацию возбудителя в исследуемом материале по изменению цвета индикатора фенолового красного (0,002 % водный раствор) в динамике.

2 В исследованиях, требующих накопления больших масс и. игеа1у!;ь сит, целесообразно использовать метод микробиологической диагностики с добавлением в культуральную среду 0,05М буфера НЕРЕ8 (N-2-ЬуёгохуеШу1р1регагтеЧЧГ'-2-е^апе5и1:1х>па1е).

3 Для проведения целенаправленного этиотропного лечения больных рекомендуется проводить мониторинг чувствительности к антибиотикам клинических штаммов и.игеа1у1:юит. и М-Иотит. Выделенные у больных штаммы и.игеа1уйсит и М.1ютнш наиболее чувствительны к доксициклину, джозами-цину, наименее - к офлоксацину, ломефлоксацину и азитромицину.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Стуколкина, Наталья Евгеньевна, 2011 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Автушенко С.С. Микоплазмы в мужском половом тракте // Вести, дерматол. - 1973. - № 8. - С. 43 - 46.

2. Андреева И. В., Королев C.B., Стецюк О.У., и др. Негонококковые уретриты у мужчин: современные взгляды на этиологию и подходы к лечению // Лечащий врач. - 2010. - № 8. - С. 1 - 7.

3. Андросова Л.Д. Исследование биоценозов урогенитального тракта у женщин с патологией шейки матки // Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье. Сб. IV междисциплинарной научной конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия». -2011. — С. 10—11.

4. Архипова Е. И, Введенская И. А., Нестеров Д. В., Хуторная О. Е. Анализ здоровья студентов // Актуальные вопросы инфекционной патологии. Материалы научно-практической конференции 23-24 сентября 2004 года. - Великий Новгород. - 2004. - С. 202 - 208.

5. Архипова Е. И., Цветков М. С., Швецова Т. П., Батыгина Ю. В. Диспансеризация студентов в условиях адаптации // Актуальные вопросы инфекционной патологии. Материалы научно-практической конференции 23-24 сентября 2004 года. - Великий Новгород. - 2004. - С. 211-219.

6. Башмакова М.А., Савичева A.M. Лабораторная диагностика гени-тальных инфекций // Проблемы репродукции. - 2000. - Т.6, № 1. - С. 20 - 24.

7. Билалов Ф.С., Аминев P.A., Кагирова А.Ф. Диагностическая роль Ureaplasma uralyticum в инфекционной патологии урогенитального тракта женщин // Молекулярная диагностика — 2010. Сб. трудов VII Всероссийской научно - практической конференции с международным участием, 24 - 26 ноября 2010 г. Москва. - 2010. - Т. III. - С. 187 - 188.

8. Бонецкий A.A., Филипченко А.И., Иванова О.В. Динамика и сезонный ритм частоты C.trachomatis, U.urealyticum, M.hominis у пациентов, обсле-

дованных по поводу УГИ с 1998 по 2002гг. в г. Бишкек / «Генодиагностика инфекционных заболеваний» Сб. тезисов 4-ой Всероссийской научно - практической конференции. - М. - 2002. - С. 6 — 7.

9. Борисов Л.Б., Смирнова A.M. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М.: Медицина, 1994. - С. 146 - 149.

10. Борхсениус С.Н., Чернова O.A., Чернов В.М., и др. Микоплазмы: молекулярная и клеточная биология, взаимодействие с иммунной системой млекопитающих, патогенность, диагностика. - СПб. - 2002. - 319 с.

11. Варламова Г.Ф и др. Диагностика хламидийной инфекции прямым и непрямым иммунофлюоресцентным методом. //Сб. науч. трудов. Нижний Новгород, 1991. С. 94 - 97.

12. Водопьянов С.О., Вдович В.И., Дядюх И.В., и др. Использование метода ПЦР для определения частоты встречаемости некоторых возбудителей №11111 в супружеских парах / «Генодиагностика инфекционных заболеваний» Сб. тезисов 4-ой Всероссийской научно - практической конференции. - М. — 2002.-С.12- 15.

13. Гамова H.A. Чувствительность к антибиотикам Ureaplasma urealyti-cum у больных с хроническими воспалительными заболеваниями урогениталь-ного тракта // ЖМЭИ. - 2003. - № 4. - С. 81 - 85.

14. Гомберг М.А., Соловьева A.M. Лечение уреаплазменной инфекции урогенитального тракта // Лечащий врач. - 2004. - № 10. - С. 42 - 49.

15. Гранская Ю.В., Дятлов Р.В., Веревочкин C.B., и др. Особенности рискованного поведения студентов, проживающих в общежитиях Санкт-Петербурга // Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье. - 2005. — Т.9, № 2. - С. 12-22.

16. Гущин А.Е., Тополь Ю.Ю., Говорун В.М. Механизмы формирования антибиотикоустойчивости клинических штаммов микоплазм и методы их выявления // Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения

инфекционных заболеваний / Материалы II Всероссийской конференции. — М. - 1998.-С. 16-20.

17. Егоров А.А. Патогенетические особенности и лечение хронических уретрогенных простатитов микоплазменной этиологии / Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - СПб.: ВМА. - 2008. - 14 с.

18. Загребина О.С. Этиологическое значение Ureaplasma urealyticum в развитии воспалительных процессов половых и мочевых органов у женщин / Клинико - экспериментальные исследования. - Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - М. - 2001- 22 с.

19. Зигангирова Н.А., Гинцбург A.JL, Четина Е.В. и др. Создание ам-плификационных тест-систем для выявления М. pneumoniae // Журнал микро-биол.- 1991.-№ 11.-С. 20-24.

20. Злотникова И.М., Гончар В.А., Чеботкевич В.Н. Герпесвирусные инфекции при воспалительных заболеваниях урогенитального тракта // Вирусные инфекции у онкогематологических больных (патогенез, диагностика, клиника, профилактика и лечение) / Чеботкевич В.Н., Абдулкадыров К.М. (ред.). — СПб.: Роза Мира, 2002. - 134 с.

21. Злыдников Д.М., Казанцев А.П., Шаманова М.Г. Микоплазмоз человека. - JI. - 1975. - 231 с.

22. Кира Е.Ф. Бактериальный вагиноз. СПб.: ООО «Нева-Люкс», 2001. -363 с.

23. Кира Е.Ф., Цвелев Ю.В., Кочеровец В.И., Бондарев Н.Э. Диагностика и лечение сексуально-трансмиссивных заболеваний в гинекологической практике. - СПб.: ООО «Нева-Люкс», - 1996. - 48 с.

24. Клинбергер - Нобель Е. Плевропневмониеподобные организмы (ПППО). - М. - 1966. - 198 с. (пер. с англ.).

25. Козлова В.И., Пухнер А.Ф. Вирусные, хламидийные и микоплаз-менные заболевания гениталий. Руководство для врачей. М.: Информационно-

издательский дом «Филинъ», 1997. — 402 с.

26. Козлова В.И., Пухнер А.Ф. Вирусные, хламидийные и микоплаз-менные заболевания гениталий. Руководство для врачей. М.: Информационно-издательский дом «Филинъ», 2000. - 572 с.

27. Кучеренко И.Б., Колпакова Д.С., Свечникова JI.B. и др. Мониторинг распространенности И111111 в Ростовской области // Молекулярная диагностика - 2010. Сб. трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, 24 - 26 ноября 2010 г. Москва. - 2010. — T.III. - С. 218 - 221.

28. Лобзин Ю.В., Ляшенко Ю.И., Позняк А.Л. Хламидийные инфекции. - СПб. - 2003. - 400 с.

29. Мазепа В.Н., Бруснигина Н.Ф., Черневская О.М., и др. Выявление возбудителей негонококковых урогенитальных инфекций у женщин репродуктивного возраста г. Нижнего Новгорода // Молекулярная диагностика - 2010. Сб. трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, 24 - 26 ноября 2010 г. - Москва - 2010. - T.III. - С. 221 -222.

30. Малова И.О. Вильпрафен в лечении смешанной хламидийно-микоплазменной инфекции урогенитального тракта у женщин репродуктивного возраста // Вестн. дерматол. и венерол. - 2004. - № 3. - С. 69 - 72.

31. Мальцева Л.И., Капелюшник Н.Л., Зефирова Т.П. и др. Механизмы развития осложнений беременности и перинатальных повреждений плода при микоплазменной инфекции у женщин. // Журн. акуш. и жен. бол. 1998. — Спец. вып.-С. 138.

32. Михайлов Н.В., Симещенко И.Е., Лаврентьев И.А. Частота обнаружения Ureaplasma urealyticum у различных групп обследуемых методом по-лимеразной цепной реакции //«Генодиагностика инфекционных болезней» Сб. трудов 5-ой Всероссийской научно-практической конференции. / Ред. В.И.

Покровский. - M. - 2004. - T. 1. - С. 88 - 89.

33. Панкратова Н.В., Сычев A.JL, Суслов B.C. Практические аспекты применения полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики ИППП в Могилевской области // Молекулярная диагностика - 2010. Сб. трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, 24 - 26 ноября 2010 г. М. - 2010. - T.III. - С. 234 - 238.

34. Помогаева А.П. Диагностика внутриутробных инфекций у новорожденных детей методом полимеразной цепной реакции. Метод, реком. для врачей. - Томск: Кольцово. - 2003. - С. 26 - 28.

35. Прозоровский C.B., Раковская И.В., Вульфович Ю.В. - Медицинская микоплазмология. — М. - 1995. — 288 с.

36. Раковская И.В. Микоплазмы и микоплазмозы человека. Руководство для врачей. М. 1999. - 49 с.

37. Раковская И.В., Бархатов О.И., Балабанов Д.Н., Горина Л.Г., Гончарова С.А., Гамова H.A. Длительность сохранения жизнеспособных клеток, ДНК и антигенов Mycoplasmahominis и уреаплазм в человеческой сыворотке при 37° С // Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. — № 11. — С. 40 — 42.

38. Pap A.B., Максимова Т.Г., Трухина A.B. и др. Уровень колонизации уреаплазмами определенных биоваров в группах женщин с различными клиническими симптомами // Журн. микробиол. - 2004. - № 4. - С. 12 - 17.

39. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных.

Применение пакета прикладных программ Statistica // M.: Издательство

«Медиа Сфера», 2002. - 312 с.

40. Рищук C.B. Диагностика и установление излеченности половых пар по урогенитальному хламидиозу и микоплазмозу. - СПб. - 2006. - 20 с.

41. Рищук C.B., Встречаемость подтверждающих урогенитальную ми-коплазменную инфекцию лабораторных тестов у мужчин и женщин их состава

половых пар // Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье. Сб. материалов IV междисциплинарной научной конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия». - 2011. - С. 64-65.

42. Савичева A.M., Башмакова М.А., Айламазян Э.К. Урогенитальный хламидиоз у женщин и его последствия // - Н.Новгород. - 1998. - 182 с.

43. Савичева A.M., Башмакова М.А., Шипицина Е.В., и др. Интерпретация результатов генодиагностики генитальных инфекций // Генодиагностика инфекционных заболеваний. - М. - 2002. - С. 65 - 67.

44. Симещенко И. Е., Михайлов Н. В. Динамика заболеваемости хла-мидийной инфекцией, трихомониазом и микоплазменной инфекцией, вызванной U. urealyticum населения Санкт-Петербурга // Труды Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций». Санкт-Петербург 19-20 ноября 2009 года. - СПб. - 2009. - С. 252 -253

45. Симещенко И. Е., Михайлов Н. В. Эпидемические тенденции заболеваемости «новыми инфекциями», преимущественно передающимися половым путем, среди населения Российской федерации // Труды Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций» Санкт-Петербург 19-20 ноября 2009 года. - СПб. - 2009. - С. 251 -252

46. Синопальников А.И., Гучев И.А. Макролиды: современная концепция применения // Рус. мед. журн. - 2003. - № 11. - С. 88-92.

47. Соколов Н.В., Бородкина О.И., Козлов А.П. Здоровье и поведенческие риски студенчества: по результатам социологического исследования в общежитиях вузов Санкт-Петербурга - СПб. - 2007. - 120 с.

48. Тараскина А.Е., Тополь Ю.Ю., Савичева А.Н., и др. Антибиотико-устойчивость Mycoplasma hominis в клинической практике. Инфекции, передаваемые половым путем. - 1999. - 2 - С. 32 - 34

49. Тимаков В.Д., Каган Г.Я. L-формы бактерий и семейство Мусо-plasmataceae в патологии. - М. - 1973. - 392 с.

50. Тимашева О.А., Горовиц С.И., Петров В.Ф., и др. Использование серологических тестов для диагностики хламидийной инфекции / Здоровье населения и среда обитания. — 1996. — № 3. — С. 10—13.

51. Чеботкевич В.Н., Боженко Л.В., Лисин В.В., и др. Состояние клеточного иммунитета и фагоцитарных факторов при микоплазма пневмонии инфекции у морских свинок // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунологии - 1981. -С. 84-89.

52. Шапран М.В. Чувствительность Ureaplasma urealyticum к антибиотикам // Гинекология. - 2005. - Т. 7, № 1. - С. 48 - 52.

53. Шипицына Е.В., Красносельских Т.В., Золотоверхая Е.А., и др. Эпидемиология инфекций, передаваемых половым путем, среди пациентов молодежных клиник Санкт-Петербурга // Молекулярная диагностика - 2010. Сб. трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, 24 - 26 ноября 2010 г., Москва - 2010. - T.III. - С. 283 - 287.

54. Barney G.H., Orgebin-Crist М.С., Macapinlac М.Р. Genesis of oesophageal parakeratosis and histologic changes in the zinc-deficient rat and their reversal by zinc repletion // N. J. Nutr. - 1969. - Vol. 95. - P. 526.

55. Bebear C, de Barbeyrac B, Dewilde A, Edert D, Janvresse C, Layani MP, Le Faou A, Lefevre JC, Mendel I, Renaudin H, et al. Multicenter study of the in vitro sensitivity of genital mycoplasmas to antibiotics // Pathol Biol (Paris). -1993. -Vol. 41(4).-P. 289-293.

56. Bébéar С., Cantet P., Renaudin H., Quentin С. Activité comparée de la minocycline et doxicycline sur les mycoplasmes pathogènes pour l'homme //

Pathol.Biol. - 1985. - Vol. 33. - P. 577 - 580.

57. Bertolla F., Kay E., Simonet P. Potential dissemination of antibiotic resistance genes from transgenic plants to microorganisms // Infect. Control Hosp. Epidemiol. - 2000. - Vol. 21.-P. 390-393.

58. Cao X, Wang Y.F., Zhang C.F., Gao W.J. Visual DNA microarrays for simultaneous detection of Ureaplasma urealyticum and Chlamydia trachomatis coupled with multiplex asymmetrical PCR // Biosens Bioelectron. - 2006. - Vol. 22, N 3.-P. 393-398.

59. Chaim W., Horowits S., David J.B., Ingel F., Evinson B., Mazor M Ureaplasma urealyticum in the development of ostpartum endometritis // Sur. J. Obstet. Gynecol. Report. Biol. - 2003. - Aug. 15. - Vol. 109., N 2. - P. 145 - 148.

60. Chandeying V., Skov S., Duramad P., Makepeace B., Ward M., Khu-nigij P. The prevalence of urethral infections amongst asymptomatic young men in Hat Yai, southern Thailand // Int J STD AIDS. - 2000. - Vol. 11., N 6. - P. 402-405.

61. Cheng S.Y., Ling T.S., Fu Q.H. Ureaplasma urealyticum infection in spontaneous abortus. Chung Hua Fu Chan Ko Tsa Chih 1994; 29 : 4 : 230 - 231, 254.

62. Degrange S., Renaudin H., Charron A., Bebear C., Bebear C.M. Tetracycline resistance in Ureaplasma spp. and Mycoplasma hominis: prevalence in Bordeaux, France, from 1999 to 2002 and description of two tet (M) - positive isolates of M.hominis susceptible to tetracyclines // Antimicrob Agents Chemother. - 2008. -Vol. 52 (2)/-P / 742-744.

63. Deguchi T., Yoshida T., Miyazawa T. et al. Association of Ureaplasma urealyticum (biovar 2) with nongonococcal urethritis // Sex. Transm. Dis. - 2004. -Vol. 31, N3,- P. 192- 195.

64. Diaz N, Dessi D, Dessole S, Fiori PL, Rappelli P. Rapid detection of coinfections by Trichomonas vaginalis, Mycoplasma hominis, and Ureaplasma urealyticum by a new multiplex polymerase chain reaction // Diagn Microbiol Infect Dis.

-2010. Vol. 67 (l).-P. 30-6.

65. Diaz N., Dessi D., Dessole S., Fiori P.L., Rappelli P. Rapid detection of coinfections by Trichomonas vaginalis, Mycoplasma hominis, and Ureaplasma urea-lyticum by a new multiplex polymerase chain reaction. Diagn Microbiol Infect Dis. -2010 67(l):30-6.

66. Dienes L., Edsall G. Observation on the L-organism of Klienberger // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1937. - Vol. 36. - P. 740 - 744.

67. Doble A., Thomas B.J., Furr P.M. et al. A search for infectious agents in chronic abacterial prostatitis using ultrasound guided biopsy // Br. J. Urol. - 1989. -Vol. 64.-P. 297-301.

68. Donders G.G., Van Calsteren K., Bellen G., Reybrouck R., Van den Bosch T., Riphagen I., Van Lierde S. Predictive value for preterm birth of abnormal vaginal flora, bacterial vaginosis and aerobic vaginitis during the first trimester of pregnancy//BJOG.-2009.-Vol. 116 (10).-P. 1315-24.

69. Fräser C.M., Gocayne J.D., White O. et al. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium. Science. - 1995. - Vol. 270. - P. 97 - 403.

70. Gdoura R., Kchaou W., Chaari C., Zhazen A., Keskes L., Rebai T. Hammami A. Ureaplasma urealyticum,Ureaplasma parvum, Mycoplasma hominis and Mycoplasma genitalium infections and semen quality of infertile men // BMC Infect Dis. - 2007. - Vol. 8., N 7. - P. 129.

71. Gdoura R, Kchaou W, Znazen A, Chakroun N, Fourati M, Ammar-Keskes L, Hammami A. Screening for bacterial pathogens in semen samples from infertile men with and without leukocytospermia // Andrologia. - 2008. Vol. 40 (4). -P. 209- 18.

72. Glass J.I., Lefkowitz E.J., Glass J.S. The complete sequence of the mucosal pathogen Ureaplasma urealyticum // Nature. - 2000. - Vol. 407. - P. 757 -762.

73. Gnarpe H., Friberg J. T-mycoplasma on spermatozoa and infertility //

Nature (London). - 1973. - Vol. 254. - P. 97.

74. Goldenberg R.L., Andrews W.W., Faye-Petersen O.M., Goepfert A.R., Cliver S.P., Hauth J.C. The Alabama Preterm Birth Study: intrauterine infection and placental histologic findings in oreterm births of males and females less than 32 weeks // Am J Obstet Gynecol. - 2006. - Vol. 195, N 6. - P. 1533 - 1537.

75. Goldenberg R.L., Andrews W.W., Goepfert A.R., Faye-Petersen O., Cliver S.P., Carlo W.A., Hauth J.C. The Alabama Preterm Birth Study: umbilical cord blood Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis cultures in very preterm newborn infants // Am J Obstet Gynecil. - 2008. - Vol. 198, N. 1. - P. 43.

76. Gupta A., Gupta A., Gupta S., Mittal A., Chandra P., Gill A.K. Correlation of mycoplasma with unexplained infertility. // Arch Gynecol Obstet. - 2009. -Vol. 280 (6).-P. 981-5.

77. Gupta V., Dhawan B., Khanna N., Agarwal N., Bhattacharya S.N., Sreenivas V., Chaudhry R. Detection and biovar discrimination of Ureaplasma urealyticum in Indian patients with genital tract infections // Diagn Microbiol Infect Dis. - 2008. - Vol. 60, N 1. - P. 95 - 97.

78. Hartmann M. Genital mycoplasmas // J Dtsch Dermatol Ges.- 2009. Vol. 7 (4).-P. 371-7.

79. International Committee on Systematic Bacteriology-Subcocommittee on the Taxonomy of Mollicutes. Minutes of the intern meeting // Int. J. Syst. Bacte-riol. - 1997. - Vol. 47. - P. 911 - 914.

80. Jalil N., Doble A., Gilchrist C. and Taylor-Robinson D. Infection of the epididymis by Ureaplasma urealyticum // Genitourin. Med. - 1988. - Vol. 64. - P. 367-368.

81. Kaya S., Poyras O., Gokee G. et al. Role of genital mycoplasmata and other bacteria in urolithiasis // Scand. J. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 35, N 5. - P. 315-317.

82. Kenny G.E. The Mycoplasmas. Eds. M.F. Barile, S. Rasin. Academic Press 1998.-P. 351-380.

83. Kese D., Golubovski D., Potocnik M., Maticic M. Chamydia trachomatis, Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum infections in patients with nongonococcal urethritis // Clinical Micribiology and Infection. - 2003. - Vol. 9, N 6.-P. 1163.

84. Kong F., James G., Ma Z. et al. Phylogenetic analysis of support for the establishment of a new species, Ureaplasma parvum // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1999. - Vol. 49, N 4. - P. 1879 - 1889.

85. Kong F., Ma Z., James G. et al. Molecular genotyping of human Ureaplasma species based on multiple-banded antigen (MBA) gene sequences // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2000. - Vol. 50. - P. 1921 - 1929.

86. Krause D.C., Taylor-Robinson D. Mycoplasmas which infect human // Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis / Eds. J. Maniloff et al. Washington. - 1992. - P. 417-444.

87. Krausse R., Schubert S. In-vitro activities of tetracyclines, macrolides, fluoroquinolones and clindamycin against Mycoplasma hominis and Ureaplasma ssp. isolated in Germany over 20 years // Clin Microbiol Infect. - 2010. - Vol. 16 (11). -P. 1649-55.

88. Lee Y.S., Kim J.Y., Kim J.C., Park W.H., Choo M.S., Lee K.S. Prevalence and treatment efficacy of genitourinary mycoplasmas in women with overactive bladder symptoms. Korean J. Urol. - 2010. - Vol. 51 (9). - P. 625 - 30. Epub 2010 Sep 16.

89. Lin P.H., Lu H.X. Analysis of detection and antimicrobial resistance of pathogens in prostatic secretion from 1186 infertile men with chronic prostatitis // Zhonghua Nan Ke Xue. - 2007. Vol. 3 (7). - P. 628 - 31.

90. Liu D.F., Jiang H., Hong K., Zhao L.M., Tang L.F., Liu J.M., Ma L.L., Li B. A meta-analysis of Ureaplasma urealyticum infection and Chinese male infertil

ity // Zhonghua Nan Ke Xue. - 2008. - Vol. 14, N. 7. - P. 55 - 82.

91. Lorian V. Antibiotics in Laboratory Medicine. - Baltimore. - 1986.

92. Lu M.G., Shi J.L., Xu C. Establishment and application of the approach to detecting two biovars of Ureaplasma urealyticum in human semen // Zhonghua Nan Ke Xue. - 2005. - Vol. 11, N 3. - P. 175 - 184.

93. Lusk M.J., Konecny P., Naing Z.W., Garden F.L., Cumming R.G., Rawlinson W.D. Mycoplasma genitalium is associated with cervicitis and HIV infection in an urban Australian STI clinic population // Sex Transm Infect. - 2011. Vol. 87 (2). - P. 107 -9. Mäher CF Haran MV et al Ureaplasma urealyticum chori-oamnionitis//AustNLJ Obst Gun 2004;

94. Maeda S., Deguchi T., Ishiko H. et al. Detection of Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma parvum (biovar 1) and Ureaplasma urealyticum (biovar 2) in patients with non-gonococcal urethritis using polymerase chain reaction- microtiter plate hybridization // Int. J. Urol. - 2004. - Vol. 11, N 9. - P. 750 -754.

95. Manchee R.J., Taylor-Robinson D. Enhanced growth of T-strains Mycoplasmas with N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-Ethanesulfonic acid buffer // J Bacteriol. - 1969. - Vol. 100, N1. - P. 78 - 85.

96. Manchini G., Carbonara A., Hermans J. Immunochemical quantitation of antigens by single radial diffusion // Immunochemistry. - 1965. - N 2. - P. 235 - 249.

97. Martin D.H. Nongonococcal Urethritis: New Views through the Prism of Modern Molecular Microbiology // Curr Infect Dis Rep. - 2008. - Vol. 10, N 3. -P. 128- 132.

98. Matovina M., Husnjak K., Milutin N., Ciglar S. Possible role of bacterial and viral infections in miscarriages. Fertil Steril 2004; 81 : 3: 662 - 669.

99. McKechnie M.L., Hillman R., Couldwell D., Kong F., Freedman E., Wang H., Gilbert G.L. Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in

urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay// J Clin Microbiol. — 2009. Vol. 47 (6). - P. 1871 - 7.

100. McKechnie M.L., Hillman R., Couldwell D., Kong F., Freedman E., Wang H., Gilbert G.L. Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay// J Clin Microbiol. — 2009. Vol. 47 (6). - P. 1871 - 7.

101. McCormack W.M., Rosner B., McComb D.E., Evrard J.R., Zinner S.H. Infection with Chlamydia trachomatis in female college students // Am J Epidemiol. - 1985.-Vol. 121,N 1.-P. 107-115.

102. Mullis K.B. and Faloona F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalysed chain reaction. Methods Enzymol., 1987, 155, 335-350.

103. Nigro G., Mazzocco M., Mattia E., Carlo di Renzo G., Carta G., Anceschi M.M. Role of the infections in recurrent spontaneous abortion // J Matern Fetal Neonatal Med. - 2011. Jan 24[Epub ahead of print].

104. Odendaal H.J., Popov I., Schoeman J., Grove D. Preterm labour - is Mycoplasma hominis involved? // S. Afr. Med. J. - 2002. - Vol. 92, N 3. - P. 235-237.

105. Pájaro M.C., Barberis I.L., Godino S., Pascual L., Agüero M. Epidemiology of sexually transmitted diseases in Rio Cuarto, Argentina // Rev Latinoam Microbiol. - 2001. - Vol. 43, N 4.-P. 157- 160.

106. Patel M.A. , Nyiijesy P. Role of Mycoplasma and Ureaplasma species in female lower genital tract infections. Curr Infect Dis Rep. 2010. - Vol. 12 (6). - P. 417-22.

107. Paul V.K., Gupta U., Singh M. et al. Association of genital mycoplasma colonization with low birth weight. Int J Gynaecol Obstet 1998; 63:2:109 - 114.

108. Povlsen K., Jensen J., Lind L. Detection of Ureaplasma urealyticum by PCR and Biovar determination by liquid hybridization // J.Clin. Microbiol. - 1998. -Vol. 36, N11.-P. 3211 -3216.

109. Razin S., Jacobs E. Mycoplasma adhesion // J. Gen. Microbiol. - 1992. -Vol. 138.-P. 407-422.

110. Razin S., Yogev D., Naot Y. Molecular biology and pathogenecity of mycoplasmas // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 1998. - Vol. 64. - P. 1094 - 1156.

111. Renaudin H., Bébéar C. Evaluation des systemes Mycoplasma PLUS et SIR Mycoplasma pour la detection quantitative et l'étude de la sensibilité aux antibiotiques des mycoplasmales génitaux // Pathol. Biol. - 1990. - Vol. 38. - P. 431 -435.

112. Roberts M.C. Antibiotic resistance // Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis / Maniloff et al. (eds.). - Washington. - 1999. - P. 549 -59.

113. Roberts M.C. Antibiotic resistance // Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis / Maniloff et al. (eds.). - Washington. - 1992. - P. 513 - 523.

114. Roberts M.C., Koutsky L.A., Holmes K.K. et al. Tetracycline-resistant Mycoplasma hominis strains contain streptococcal tetM sequences // Antimicrob. Agents Chemother. - 1985. - Vol. 28. - P. 141 - 143.

115. Robertson J.A., Coppola J.E., Heisler O.R. Standartized method for determining antimicrobal susceptibility of strainsUreaplasma urealyticum and their response totetracycline, erythromycin, and rosaramicin // Antimicrob. Agents Chemother. - 1981.-Vol. 28.-P. 53-58.

116. Rosengarten R., Yogev D. Variant colony surface antigenic phenotypes within mycoplasma strain populations: implications for species identification and strain standardization // J. Clin. Microbiol. -1996. - Vol. 34. - P. 149 - 158.

117. Salmet A., Kochowska-Bronk M., Bronk M. et al. Postoperative infections caused by Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum in patients after renal transplantation // Clinical Micribiology and Infection. - 2003. - Vol. 9, N 6, Abstract P 1148.

118. Shepard M.C. Visualization and morphology of PPLO in clinical materi

al // J. Bacterid. - 1957. -Vol. 72.-P. 162- 171.

119. Shepard M.C., Lunceford C.D. Effect of pH on human Mycoplasma strains // J Bacteriol. - 1965. - Vol. 89. - P. 265 - 270.

120. Shepard M.C., Lunceford C.D. Occurrence of urease in T-strains of Mycoplasma//J Bacteriol. - 1967.-Vol. 93.-P. 1513- 1520.

121. Shi G., Wen S.Y., Chen S.H., Wang S.Q. Fabrication and optimization! of the multiplex PCR-based oligonucleotide microarray for detection of Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis and Ureaplasma urealyticum // J Microbiol Methods. - 2005. - Vol. 62 (2). - P. 245 - 256.

122. Shigehara K., Kawaguchi S., Sasagawa T., Furubayashi K., Shimamura M., Maeda Y., Konaka H., Mizokami A., Koh E., Namiki M. Prevalence of genital Mycoplasma, Ureaplasma, Gardnerella, and human papillomavirus in Japanese men with urethritis, and risk factors for detection of urethral human papillomavirus infection // J Infect Chemother. - 2011 Jan 7. [Epub ahead of print]

123. Shyn-Ching L.O. Mycoplasma and AIDS // Mycoplasmas: molecular biology and pathogensis / Maniloff et al. (eds.). - Washington. - 1992. - P. 525 -545.

124. Srugo I., Steinberg J., Madeb R. et al. Agents of non-gonococcal urethritis in males attending an Israeli clinic for sexually transmitted diseases // Isr. Med. Assoc. J. - 2003. - Vol. 5, N 1. - P. 24 - 27.

125. Taylor-Robinson D., Lamont R.F. Mycoplasmas in pregnancy // BJOG - 2011.-Vol. 118 (2).-P. 164-74.

126. Taylor-Robinson D., Csonka G.W. and Prentice M.J. Human intraurethral inoculation of Ureaplasmas // Q. J. Med. - 1977.-Vol. 46. - P. 309326.

127. Taylor-Robinson D., Furr P.M. and Webster A.D.B. Ureaplasma urealyticum in the immunocompromised host // Pediatr. Infect. Dis. - 1986. - Vol. 5 (Suppl.).-P. 236-238.

128. Taylor-Robinson D., Furr P.M. Genital mycoplasma infections // Wien Klin. Wochenschr. - 1997. - Bd 109. - S. 578 - 583.

129. Taylor-Robinson D., Furr P.M. Update on sexually transmitted mycoplasmas // Lancet. - 1998. - Vol. 351. - P. 12 - 15. (Review).

130. Taylor-Robinson D. The role of mycoplasmas in pregnancy outcome // Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. - 2007. Vol. 21 (3). - P. 425 -38.

131. Teague R., Fairley C.K., Newton D., Bradshaw C., Donovan B., Bowd-en F., Cummings R., Chen M.Y. How men with non-chlamydial, non-gonococcal urethritis are managed in Australasia // Int J STD AIDS. - 2008. - Vol. 19, N 9. - P. 581 -585.

132. Thomsen A.C. Mycoplasmas in human pyelonephritis: demonstration of antibodies in serum and urine // J. Clin Microbiol. - 1978. - Vol. 8. - P. 197 - 202.

133. Varela J.A., Otero L., Garecia M.J. et al. Trends in the prevalence of pathogens causing urethritis in Asturias, Spain, 1989 - 2000 // Sex. Transm. Dis. -2003. - Vol. 30, N 4. - P. 280 - 283.

134. Varela J.A., Otero L., Junquera M.L., Melón S., del Valle A., Vázquez F. Research on sexually transmitted infections in asymptomatic heterosexual males whose partners have cervical intraepithelial neoplasia // Actas Dermosifiliogr. -2006. - Vol. 97, N 5. - P. 319 - 322.

135. Verteramo R., Pierangeli A., Mancini E., Calzolari E., Bucci M., Osborn J., Nicosia R., Chiarini F., Antonelli G., Degener A.M. Human Papillomaviruses and genital co-infections in gynaecological outpatients. - 2009. - Vol. 39. - P. 519 -602.

136. Vogel I., Thorsen P., Hogan V.K., Schieve L.A., Jacobson B., Ferre C.D. The joint effect of vaginal Ureaplasma urealyticum and bacterial vaginosis on adverse pregnancy outcomes // Acta Obstet Gynecol Scand. - 2006. - Vol. 85, N7.-P. 778 - 785.

137. Waites K.B., Cox N.R., Crouse D.T. et al. Mycoplasma infections of the central nervous system in humans and animals // Stanek G., Cassel G.H., Tully J.G. and Whitcomb R.F. (eds.) / Recent Advances in Mycoplasmology. - Gustav Fisher Verlag, Stuttgart. - 1990. Vol. 90. - P. 379-386.

138. Waites K.B., Crabb D.M., Duffy L.B. Comparative in vitro activities of the investigational fluoroquinolone DC-159a and other antimicrobial agents against human mycoplasmas and Ureaplasmas// Antimicrob Agents Chemother. - 2008. Vol. 52 (10).-P. 3776-8.

139. Waites K.B., Crabb D.M., Duffy L.B. Comparative in vitro susceptibilities of human mycoplasmas and Ureaplasmas to a new investigational ke-tolide, CEM-101// Antimicrob. Agents Chemother. - 2009. Vol. 53 (5). - P. 2139 -41.

140. Wang H., Kong F., Wang B., Mckechnie M.L., Gilbert G.L. Multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay to detect common genital pathogens // Int J STD AIDS. - 2010. Vol. 21 (5). - P. 320 - 5.

141. Wang Y., Liang C.L., Wu J.Q., Xu C., Qin S.X., Gao E.S. Do Ureaplasma urealyticum infections in the genital tract affect semen quality? // Asian J Androl. - 2006. - Vol. 8, N 5. - P. 562 - 568.

142. Wang Y., Sun G., Pan J.G., Li T. Correlation of Ureaplasma urealyticum and Chlamydia trachomatis infections with male sterility: a meta-analysis of randomized control trials // Zhonghua Nan Ke Xue. - 2006. - Vol. 12 N. 7. - P. 615 - 618.

143. Wang Y., Yang W.B., Yuan H.Y., Zhang Q.X., Zhu X.Y. Analysis of the infection status and the drug resistance of mycoplasma and chlamydiae in genitourinary tracts of children with suspected nongonococcal urethritis // Zhonghua Er Ke Za Zhi. - 2009. Vol. 47 (1). - P. 62 - 4.

144. Wolfson J.S., Hooper D.C. Fluoroquinolone antimicrobial agents // Clin.Microbiol. Rev. - 1989. - Vol. 2. - P. 378 - 424.

145. Yoshida T., Deguchi T., Meda S., Kubota Y., Tamaki M., Yokoi S., Ya

suda M., Ishiko H. Quantitative detection of Ureaplasma parvum (biovar 1) and Ureaplasma urealyticum (biovar 2) in urine specimens from men with and without urethritis by real-time polymerase chain reaction // Sex Transm Dis. — 2007. — Vol. 34, N. 6.-P. 416-419.

146. Yu J.T., Tang W.Y., Lau K.H., Chong L.Y., Lo K.K., Wong C.K., Wong M.Y. Role Mycoplasma genitalium and Ureaplasma urealyticum in non-gonococcal urethritis in Hong Kong // Hong Kong Med J. - 2008. - Vol. 14, N 3. - P. 125 - 129.

147. Yu J.T., Tang W.Y., Lau K.H., Chong L.Y., Lo K.K. Asymptomatic urethral infection in male sexually transmitted disease clinic attendees // Int. J STD AIDS. - 2008. - Vol. 19, N 3. - P. 155 - 158.

148. Zheng M.Y., Zhao H.L., Di J.P., Lin G., Lin Y., Lin X., Zheng M.Q. Association of human papillomavirus infection with other microbial pathogens in gynecology // Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. - 2010. - Vol. 45 (6). - P. 424 - 8.