Биосинтез пептид-нуклеотидного антибиотика микроцина C и его гомологов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Бантыш, Ольга Борисовна

• Бантыш, Ольга Борисовна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Бантыш, Ольга Борисовна

Оглавление.......................................................................................................................2

Список сокращений и условных обозначений..........................................................5

Общая характеристика работы....................................................................................7

Актуальность темы исследования........................................................................................................7

Цели и задачи исследования.................................................................................................................8

Научная новизна и практическая значимость работы........................................................................9

Положения, выносимые на защиту....................................................................................................10

Степень достоверности и апробация результатов............................................................................10

Личное участие автора в проведении исследований........................................................................11

Обзор литературы.........................................................................................................12

Бактериоциньт.......................................................................................................................................12

Микроцины...........................................................................................................................................13

Микроцины класса 1............................................................................................................................16

Микроцин В17..............................................................................................................................16

Микроцин 125...............................................................................................................................17

Микроцин С7-С51........................................................................................................................19

Микроцин С - пептид-нуклеотидный антибиотик............................................................................21

История открытия микроцинов...................................................................................................21

Расшифровка структуры микроцина С.......................................................................................22

Гены синтеза микроцина С..........................................................................................................23

Роль белков микроцинового кластера........................................................................................27

Возможные гомологи генов микроцинового кластера.............................................................28

Регуляция генов микроцинового кластера.................................................................................30

Механизм действия микроцина С...............................................................................................33

Антибактериальная активность микроцина С и его аналогов.................................................34

Белок МссВ...........................................................................................................................................39

Ферментативная функция белка МссВ.......................................................................................39

Структура белка МссВ.................................................................................................................42

Положение пептидного субстрата в активном центре пептид-связывающего домена.........45

Структура аденилирующего активного центра.........................................................................46

Уникальные черты активного центра белка МссВ....................................................................48

Конформационная подвижность активных центров.................................................................48

Е1 -суперсемейство...............................................................................................................................51

Филогенетическиое древо белков El-суперсемейства.............................................................51

Характерные структурные элементы белков El-суперсемейства...........................................53

Структурные особенности белков El-суперсемейства.............................................................54

Сравнительный структурный анализ некоторых представителей прокариотических белков Е1-суперсемейства.....................................................................................................................................58

Биологическая роль белков ThiF и МоеВ..................................................................................58

Сравнительный структурно-функциональный анализ белков El-суперсемейства МссВ, МоеВ, ThiF....................................................................................................................................62

Материалы и методы....................................................................................................70

Бактериальные штаммы......................................................................................................................70

Геномная и плазмидная ДНК..............................................................................................................70

Питательные среды..............................................................................................................................70

Отбор бактериальных колоний и их проверка на устойчивость к антибиотикам.........................71

Метод ПЦР............................................................................................................................................71

Праймеры для ПЦР..............................................................................................................................72

Праймеры для мутагенеза по методу Даценко-Уорнера..................................................................73

Электрофорез в агарозном геле..........................................................................................................73

Извлечение фрагментов ДНК из агарозного геля.............................................................................73

Расщепление ДНК рестриктазами......................................................................................................74

Лигирование фрагментов ДНК...........................................................................................................74

Клонирование фрагментов ДНК.........................................................................................................74

Мутагенез по методу Даценко-Уорнера............................................................................................76

Приготовление химически компетентных клеток Е. coli.................................................................76

Трансформация компетентных клеток Е. coli...................................................................................77

Пептиды................................................................................................................................................77

Получение и очистка рекомбинантных белков.................................................................................78

Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ)...............................................................80

Аденилирование пептидов in vitro.....................................................................................................81

Масс-спектрометрический анализ (MALDI-MS и MS/MS).............................................................81

Тесты на чувствительность к микроцину и его аналогам................................................................81

Приготовление S30 клеточных экстрактов........................................................................................82

Реакция аминоацилирования тРНК....................................................................................................82

Процессинг пептидов МссА в S30 экстрактах..................................................................................83

Аминопропилирование аденилированного пептида MHRIMKD-АМФ L.johnsonii in vitro........83

Введение радиоактивной метки in vitro.............................................................................................83

Проверка токсичности аденилированного белка in vivo..................................................................84

Определение продуктов реакции с помощью ВЭЖХ.......................................................................84

Биоинформатический анализ белковых последовательностей........................................................85

Результаты работы........................................................................................................87

Часть 1. Изучение ортологов белка МссВ и микроцин С-подобных соединений, закодированных в /исс-подобных оперонах бактерий, отличных от Escherichia coli...................87

Анализ результатов биоинформатического поиска гомологов микроцинового оперона.....87

Энзиматический синтез аденилированных пептидов in vitro..................................................89

Биологическая активность аденилированных пептидов..........................................................95

Активность аденилированных пептидов in vitro.......................................................................98

Биологическая активность аминопропилированных микроцин С-подобных соединений .101

Филогенетическое древо МссВ-подобных аденилат-трансфераз..........................................103

Анализ аминокислотных последовательностей ортологов МссВ.........................................106

Часть 2. Получение новых антибактериальных пептид-нуклеотидных соединений с измененной пептидной частью с помощью белка МссВ Е. coli.........................................................................Ill

Поиск нового субстрата для белка МссВ Е. coli путем трехмерного моделирования.........111

Тестирование различных пептидных субстратов белка МссВ in vitro..................................116

Биологическая активность аденилированных пептидов........................................................120

Сравнение антибактериальной активности некоторых аналогов микроцина С...................122

In vitro аденилирование белка, содержащего на своем С-конце пептид MRTGNAN..........124

In vivo аденилирование белка, содержащего на своем С-конце пептид MRTGNAN..........126

Обсувдение полученных результатов.....................................................................129

Выводы..........................................................................................................................145

Список используемой литературы..........................................................................146

Приложение..................................................................................................................154

Благодарности..............................................................................................................159

Список сокращений и условных обозначений

т(5 - деионизованная вода;

ед. ак. - единицы активности;

ед.м. - единицы массы;

п.о. - пары оснований;

а.к. - аминокислота;

а.о. - аминокислотный остаток;

Да - Дальтон, единица измерения массы молекул;

АТФ - аденозинтрифосфат;

АМФ - аденозинмонофосфат;

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат;

НТФ - нуклеотидтрифосфат;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

мРНК - матричная РНК;

тРНК - транспортная РНК;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

8АМ - Б-аденозин метионин;

НАД(Ф) - никотинамиддинуклеотидфосфат;

Ацетил-КоА - ацетил-кофермент А;

ДТТ - дитиотреитол;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ИПТГ - изопропил-P-D-1 -тиогалактопиранозид; ОРС - отбытая рамка считывания; ПО - программное обеспечение;

ВЭЖХ - высоко эффективная жидкостная хроматография;

cpm - counts per minute, количество распадов в минуту;

об./мин. - обороты в минуту;

Mw - молекулярный вес;

мин. - минута;

с - секунда;

тыс. - тысяча;

см. ниже - смотри ниже;

др. - другой;

т.е. - то есть.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биосинтез пептид-нуклеотидного антибиотика микроцина C и его гомологов»

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования

По данным Всемирной организации здравоохранения, одной из серьезнейших проблем, стоящей перед человечеством, является развитие устойчивости бактериальных патогенов к антимикробным препаратам, широко применяющимся в медицинской практике. Поиск новых потенциальных антибиотиков, а также улучшение свойств уже известных антимикробных соединений - актуальная задача, стоящая перед учеными всего мира. Одним из перспективных направлений в этой области является изучение бактериоцинов и микроцинов - антимикробных соединений на основе пептидов, синтезируемых на рибосомах, и, в частности, микроцина С.

Микроцин С - пептид-нуклеотидный антибиотик, продуцируемый кишечной палочкой и активный против близкородственных видов бактерий. За синтез микроцина С и устойчивость к этому антибиотику ответственны продукты шести генов. Пять из них тссАВСИЕ организованы в оперон, транскрибируемый с общего промотора. Ген тссА кодирует гептапептид-предшественник микцроцина С (МЯТОКАМ). Продукты генов тссВ, тсс О и тссЕ обеспечивают созревание микроцина: внесение пост-трансляционных модификаций в пептид МссА. При этом белок МссВ является первым и наиболее важным участником этого процесса: в ходе двустадийной реакции он аденилирует пептид МссА по С-концевому остатку аспарагина. В результате образуется микроцин С с молекулярной массой 1092 Да (МсС1092), который способен ингибировать рост бактериальных клеток. Микроцин С - это антибиотик действующий по принципу Троянского коня: он проникает в клетки за счет облегченного транспорта, обеспечиваемого пептидной частью. В цитоплазме клетки пептидная часть микроцина С разрушается под действием пептидаз широкого спектра действия. В результате чего высвобождается токсин - аспартил-аденилат, который представляет собой аналог активированной аминокислоты. Этот токсин ингибирует аспартил-тРНК-синтетазу, тем самым блокируя один из самых важных клеточных процессов - синтез белка.

До сегодняшнего дня единственным известным организмом, способным продуцировать микроцин С, была кишечная палочка. О существовании других микроцин С-подобных соединений не было известно. В то же время потенциальные гомологи микроцинового оперона были предсказаны ранее в статье Северинова и соавторов [84]. Данная работа посвящена исследованию пептид-нуклеотидного антибиотика микроцина С и его природных гомологов из различных бактериальных организмов, а также синтетических аналогов микроцина С, которые являются ингибиторами аспартил-тРНК-синтетазы. Аминоацил-тРНК-синтетазы - это перспективные мишени для новых антибактериальных препаратов, так как обеспечивают функционирование такого важного процесса, как синтез белка в клетке. В то же время новые микроцин С-подобные соединения, изученные в данной работе, за счет измененной пептидной части, обладают способностью проникать в бактериальные клетки посредством различных транспортных путей, что открывает перспективы использования таких пептид-нуклеотидов против различных патогенов.

Цели и задачи исследования

Целями данной работы было: 1) подтвердить существование ранее предсказанных аналогов микроцина С, закодированных в mcc-подобных оперонах бактерий, отличных от Escherichia coli, и продемонстрировать антибактериальную активность таких соединений, а также 2) установить принципиальную возможность использования микроцин С синтазы МссВ Escherichia coli для создания новых антибактериальных пептид-нуклеотидных соединений с измененной пептидной частью.

Для достижения поставленных целей были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Получить рекомбинантные белки - гомологи микроцин С синтазы МссВ Escherichia coli из организмов Bartonella washoensis, Helicobacter pylori, Lactobacillus johnsonii, Streptococcus thermophilus, Yersinia pseudotuberculosis и

Synechococcus sp. и продемонстрировать их аденилат-трансферазную активность в присутствии предсказанных пептидных субстратов.

2. Наработать пептид-нуклеотиды, отличные от микроцина С Е. coli и продемонстрировать их антибактериальное действие на клетки Е. coli.

3. Определить набор субстратов, которые способны аденилироваться белком МссВ Е. coli in vitro и провести сравнительное исследование активности полученных пептид-аденилатов.

Научная новизна и практическая значимость работы

В данной работе впервые была экспериментально показана функциональная активность mcc-подобных оперонов из Bartonella washoensis, Helicobacter pylori, Lactobacillus johnsonii, Streptococcus thermophilus, Yersinia pseudotuberculosis и Synechococcus sp. Также впервые продемонстрирована антибактериальная активность пептид-нуклеотидных соединений, являющихся продуктами этих оперонов.

На основании анализа фермент-субстратного комплекса белка МссВ Е. coli с его природным пептидным субстратом МссА, впервые были получены синтетические варианты микроцина С Е. coli. Некоторые из полученных синтетических аналогов обладали повышенной антибактериальной активностью. Также впервые был разработан и апробирован высокоэффективный способ -янесщия^^гоег^грансляционной модификации (аденилирования) в белковые молекулы, содержащие на своем С-корще^последоватШГь

(MRTGNAN), с помощью белка МссВ Е. coli. Этот способ можно применять в лабораторной практике для внесения специфических меток (например, радиоактивных) в белковые молекулы, а полученные новые природные и синтетические антибактериальные соединения могут быть использованы для создания новых антибактериальных препаратов на их основе.

Положения, выносимые на защиту

1. Экспериментально подтверждены сделанные ранее биоинформатические предсказания о существовании пептид-нуклеотидных соединений, подобных микроцину С Е. coli, и закодированных в геномах Bartonella washoensis, Helicobacter pylori, Lactobacillus johnsonii, Streptococcus thermophilus, Yersinia pseudotuberculosis и Synechococcus sp., а также показано, что такие гомологи микроцина С обладают антибактериальной активностью по отношению к клеткам Е. coli и действуют по механизму, аналогичному описанному ранее для микроцина С Е. coli.

2. Белок МссВ Е. coli аденилирует пептидные субстраты на основе пептида MccA (MRTGNAN), с заменой N-концевого остатка метионина на аминокислоты с крупными гидрофобными боковыми радикалами, также как и пептидные субстраты на основе пептида MccA (MRTGNAN), с дополнительными аминокислотами на N-конце. Удлинение пептидного субстрата до определенного предела стимулирует эффективность узнавания ферментом МссВ и антибактериальные свойства получаемых аналогов микроцина С.

3. МссВ Е. coli можно использовать для концевого аденилирования белков, несущих на своём С-конце последовательность MRTGNAN, in vitro и in vivo.

Степень достоверности и апробация результатов

По результатам диссертационной работы было опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в международных рецензируемых журналах и 5 тезисов конференций. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 1) "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", 14-17 ноября, 2011, Москва, Россия; 2) "XXIV Зимняя молодежная научная школа

"Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", 7-9 февраля, 2012, Москва, Россия; 3) "Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты", 13 апреля, 2012, Москва, Россия; 4) 22nd IUMBB & 37th FEBS Congress, 4-9 September, 2012, Seville, Spain; 5) "IX молодежная школа-конференция с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии", 21-23 октября, 2013, Москва, Россия.

Личное участие автора в проведении исследований

Автором самостоятельно выполнен основной объем исследований. Показана энзиматическая активность ортологов МссВ и антибактериальная активность полученных пептид-аденилатов, проведен анализ фермент-субстратного комплекса белка МссВ-МссА Е. coli, получены синтетические аналоги микроцина С, продемонстрирована их антибактериальная активность, а также разработан система внесения пост-трансляционной модификации in vitro и in vivo в С-конец белковой молекулы. Масс-спектрометрический анализ образцов, подготовленных автором, был проведен Серебряковой Мариной Васильевной. Автор принимал непосредственное участие в разработке и обсуждении концепции биоинформатического поиска для построения филогенетического древа белков семейства МссВ/РааА, само филогенетическое древо было построено Макаровой Кирой. Автором был проведен анализ и обработка полученных результатов, подготовлен материал для публикации в научных журналах.

Обзор литературы

Бактериоцины

в составе природных сообществ в условиях жесткой конкуренции за природные ресурсы и свободное пространство совместно сосуществуют —во Гроортанизмов. В условиях голодания и стресса некоторые штаммы бактерии „ ^ переключают свой метаболизм на продукт целого арсенала токсических „тидов и белков. Такие соединения дают конкурентное преимущество штамма^ продуцентам на» другими близкородственными видами, занимающими сходную

экологическую нишу [75].

Антимикробные белки и пептиды, продуцируемые на рибосомах

бактериальными клетками, были названы бактериоцинами. В наши дни бактерии,

синтезирующие бактериоцины, используются человеком в качестве цробиотиков.

нГ бактериоцины возлагаются большие надежды, как на потенциальный источник

новых антибиотиков для медицины. „„„те,

характерным отличием бактериоцинов от других антибиотиков является специфичность их действия: обычно, бактериоцины проявляют активное против го круга организмов, как правило, в пределах того же вида или рода, что и ГрганизмТродуцент, тогда как классические антибиотики обладают достаточно

широким спектром действия [22].

Упчггификация бактериоцинов достаточно сложна. Это, в первую очередь,

связано с тем, что под термином ..бактериоцины' скрывается

разнообразный класс пептидных соединений с различной химической структурой и механизмом действия. Следует отметить, что, зачастую, один вид бактерии може продуцировать сразу несколько типов

этим имеет смысл разделить бактериоцины по происхождению, Грамм-положительных и Грамм-отрицательных бактерий.

Бактериоцины Грамм-положительиых бактерий принято делить „а лантибиотики (класс О и нелантибиотики (класс 2). Лантибиотики представит собой маленькие пептиды длиной .9-38 а.к. с характерными

трансляционными модификациями, такими как аминокислоты с циклической структурой, содержащие тноэфирные связи (известные как лантиоиин или Р-метиллантионин), или D-аланин. Так как лантибиотики отличаются большим разнообразием пост-тРа„сляцноинЫх модификации, внутри этого класса выделяют еще дополнительно И подклассов. В качестве примера лантибиотиков можно привести хорошо изученный низин, а также субтилнн, лак™цин 3147 и другие [35].

К бактериоцинам Грамм-положительных бактерий класса 2 относятся короткие положительно заряженные термостабильные пептиды (длинной от 25 до 60 а к) не несушие пост-трансляционных модификаций. Бактериоцины этой группы продуцируется в основном молочно-кислыми бактериями. Бактериоцииы leca 2 подразделяются на четыре подкласса. Из-за огромного разнообразия этих соединений классификация антимикробных пептидов Грамм-положительных бактерий меняется от автора к автору, в зависимости от выбранного критерия,

положенного в основу классификации [35].

Большинство известных бактериоцинов Грамм-отрицательных бактерии продуцируются кишечной палочкой или другими энтеробакгериями. Традиционно их делят на две группы в зависимости ох их молекулярного веса: микроцины (сравнительно маленькие пептиды) и колицины (относительно крупные нолипептиды). В свою очередь микроцины подразделяются на две подкупны: „нкропины класса 1 представлены пептидами с молекулярным весом менее 5 кДа и значительными пост-трансляционными модификациями. К этому классу, например, относятся микроцин С, микроции В и микроцин J. К мнкроцинам класса 2 относятся пептиды е молекулярными весом от 5 до 20 кДа с незначительными пост-трансляционными модификациями ил^еэ них. Последний класс включает в

себя микроцин Е, колицин V и Н47 [35].

Микроцины

Микроцины - это пептиды, обладающие антиба^ериальным действием, которые синтезируются в ходе трансляции на рибосомах, и, в некоторых случаях, несут пост-трансляционные модификации. Микроцины - это очень гетерологичная

группа антимикробных пептидов. На сегодняшний день описано четырнадцать типов микроцинов, но только восемь из них были выделены, и их структуры были охарактеризованы. Гены синтеза микроцинов класса 1 (класс низкомолекулярных микроцинов) расположены на плазмидах. Зрелые микроцины этого класса со всеми модификациями имеют молекулярную массу менее 5 кДа. Представителями этого класса являются микроцин В17, микроцин С (С7-С51) и микроцин ^5. Высокомолекулярные микроцины класса 2 имеют молекулярный вес от 5 до 10 кДа. Эти соединения можно разделить на два подкласса. Гены синтеза микроцинов класса 2а расположены на плазмидах, зрелые микроцины не содержат посттрансляционных модификаций и могут иметь одну-две дисульфидных связи. К микроцинам класса 2а относятся микроцин Ь, микроцин V и микроцин N. К классу 26 относятся микроцины, имеющие линейную структуру, которые могут нести на своем С-конце модификации. Гены синтеза этих микроцинов расположены на хромосомной ДНК. Представителями микроцинов класса 26 являются микроцин Е492, микроцин М и Н47.

Общая организация генов микроцинового кластера имеет схожие черты. Микроцины обычно синтезируются в виде пептидного предшественника, который состоит из ^концевой сигнальной (лидерной) части и корового (основного) пептида. В некоторых случаях лидерный пептид необходим для корректного внесения пост-трансляционных модификаций и формирования зрелого микроцина [56, 69]. Часто эта И-концевая часть отсутствует в зрелом микроцине, так как удаляется в процессе его созревания и транспорта наружу из клетки, как правило, с помощью АВС-транспортера (системы транспортных белков, использующих энергию АТФ) [75]Т Гены в составе—микроцш1овош__щшстер£_могут быть организованы в один или несколько оперонов. Можно выделить ряд характерных генов, которые присутствуют практически в любом кластере: это структурный ген, кодирующий пептидный предшественник микроцина, гены, отвечающие за устойчивость клетки к эндогенному микроцину, а также гены, кодирующие систему экспорта зрелого микроцина наружу из клетки. Дополнительно к этому "базовому" набору в опероне могут также присутствовать гены, кодирующие систему пост-трансляционной модификации микроцинов (Рисунок 1). Следует иметь в виду, что строгой общепринятой системы наименования генов,

ответственных за синтез микроцинов, нет, хотя в большинстве случаев ген "А" кодирует пептидный предшественник микроцина [24].

А Микроцины класса 1

РтсО[=- Р21> -С Р3

МссВ17 —^¡нм^ввафамаа

МссС7/С51 -+

тсЬА пкЬВ тсЬС тсЬй тсЬЕ тсЬР тсЬй £_,___,___

тссА тссВ тссС тссО тссЕ тссР

МссЛ25 --- —

тс/А тс;8 тсу'С тсу'О

Б Микроцины класса 2а

МссУ ^-ч,,^.,,,*^

сиаД сгаВ сгаС Ы

тсН

тс1А тс1В тс!С си

Мсс24

тШ пШЭ тНА тНВ

В Микроцины класса 26

МссЕ492 (ЯУС492)

1 кЬ

тсеА тсеВ тсеС тсеО тсеЕ тсеР тсей тсеН тсеI mceJ

Рисунок 1. Организация генов микроциновых кластеров (по 0|щие$пе 8. и соавторы с изменениями). Гены представлены в виде цветных стрелок. Ген, кодирующий пептид-предшественник микроцина, окрашен желтым. Гены, обеспечивающие устойчивость клеток к эндогенному микроцину, его экспорт и пост-трансляционную модификацию, окрашены красным, синим и зеленым соответственно. Прямые повторы, окружающие .кластер МссС7/С51 показаны вертикальными линиями. Промоторы изображены в виде флажков. Названия генов приведены рядом с соответствующей стрелкой. Внутри класса~1~ (А) гены, ответственные за устойчивость и экспорт, окрашены фиолетовым. Продукт гена тссЕ (МссС7/51 кластера) обеспечивает как устойчивость, так и внесение посттрансляционных модификаций, этот ген окрашен красно-зеленым. Внутри класса 2 (Б и В) гены с неизвестной функцией окрашены серым. Нарушенные гены перечеркнуты [24].

Микроцины класса 1

К микроцинам класса 1 относят микроцин В17, микроцин J25 микроцин С (С7-С51). Мы отдельно остановимся на каждом из представителей данного класса, что позволит нам выявить общие закономерности синтеза и функционирования этих антибиотиков.

Микроцин В17

Микроцин В17 представляет собой пептид длиной 43 а.к., несущий посттрансляционные модификации. Синтез микроцина В17 обеспечивается за счет совместной работы продуктов семи генов: тсЬАВСВЕРС, расположенных на плазмиде [8]. Ген тсЪА кодирует пептид-предшественник, длинна которого составляет 69 аминокислот. В процессе созревания этот пептид претерпевает посттрансляционные модификации, которые вносятся комплексом белков МсЬВСБ. После этого в результате протеолитической активности белков ТЫЕ и Т1сГО отщепляется М-концевой лидерный пептид длиной 26 а.к. В конечном итоге, образуется зрелый микроцин В17, который содержит четыре оксазольных и четыре тиазольных кольца, которые сформировались путем модификации четырех сериновых и четырех цистеиновых остатков (Рисунок 2). Устойчивость клетки к эндогенному микроцину обеспечивается продуктами генов тсЬЕРС, первые два из которых кодируют АВС-транспортер, переносящий микроцин В из клетки [57].

VJ

о

.-л

Microcin В17

о

GjQGi-

S—

Рисунок 2. Структура зрелого микроцина В17. На рисунке показаны посттрансляционные модификации микроцина В17, который содержит в своем составе тиазольные (показаны красным) и оксазольные (показаны синим) кольца [6].

Зрелый антибиотик попадает в периплазматическое пространство чувствительной клетки, главным образом, посредством порина ОтрБ, а также

частично через порин ОшрС. Далее из периплазматического пространства микроцин В17 доставляется в цитоплазму транспортером БЬтА, расположенным в плазматической мембране [57, 50]. Этот белок функционирует как димер [19]. На основании структурной гомологии трансмембранного домена, БЬшА относят в к семейству АВС-транспортеров. Тем не менее, цитоплазматический домен, ответственный за гидролиз АТФ, у этого белка отсутствует. По всей видимости, 8ЬшА использует электрохимический градиент для транспорта веществ через внутреннюю мембрану [79]. Естественный субстрат для этого транспортера остается неизвестным, хотя показано, что посредством 8ЬтА в клетки проникают такие антимикробные пептиды как микроцин В17, микроцин 125 [80], блеомицин [92] и пролин-богатые эукариотические антимикробные пептиды [59].

Мишенью для микроцина В17 в бактериальной клетке является ДНК-гираза [36]. Этот фермент относится к топоизомеразам типа II. Гираза может релаксировать положительно сверхспирализованную ДНК, а также обладает уникальной способностью вносить отрицательные супервитки в ДНК за счет энергии гидролиза АТФ [11]. ДНК-гираза - это жизненно важный фермент, и его ингибирование приводит к остановке репликации и гибели клеток. Точный механизм действия микроцина В не ясен, но известно, что микроцин В способен стабилизировать ковалентный комплекс гираза-ДНК в момент, в котором гираза произвела двуцепочечный разрыв ДНК и должна осуществить транспорт через него другой цепи [36].

Микроцин 125

Микроцин 125 представляет собой антимикробный пептид длиной 21 а.к. Этот пептид синтезируется на рибосомах и впоследствии претерпевает посттрансляционные модификации. За синтез микроцина 125 ответственны 4 гена -тс]АВСО. Ген тс]А кодирует линейный петпид-предшественник длиной 58 аминокислот. Гены тс]В и тс]С кодируют белки, отвечающие за внесение посттрансляционных модификаций в пептид Мс]А и образование структуры по типу лассо. Продукт гена тс]Ъ представляет собой АВС-транспортер, который

обеспечивает выброс зрелого микроцина наружу, а также устойчивость клетки-продуцента к эндогенному микроцину. Зрелый микроцин 125 обладает уникальной третичной структурой по типу лассо (Рисунок 3): в результате циклизации между аминогруппой 1М-концевого остатка глицина и карбоксильной группой бокового радикала остатка глутамата С)8 образуется лактамное кольцо. По всей видимости, именно благодаря своей структуре этот антибиотик проявляет высокую стабильность к действию высоких температур и протеолизу [57].

Рисунок 3. Структура микроцина Микроцин 125 содержит макролактамное кольцо на Ы-конце и линейный С-концевой участок - "хвост". С-концевой хвост располагается внутри лактамного кольца, формирующего лассо-подобную структуру. На рисунке представлена линейная последовательность и трехмерная структура (РБВ: 1(^)71) микроцина .125 [6].

Микроцин 125 проникает через внешнюю мембрану в периплазму Грамм-отрицательных бактериальных клеток посредством рецептор-Р1шА-зависимого ТопВ пути [80]. Белок ПшА является рецептором сидерофоров, связывающих железо, а комплекс белков ТопВ-ЕхЬВ-ЕхЬБ, расположенных на внутренней мембране клетки, ответственен за активацию этого рецептора [57]. Как уже было сказано ранее, в транспорте микроцина 125 через плазматическую мембрану принимает участие белок 8ЬшА [80].

Проникнув в цитоплазму клетки, микроцин 125 ингибирует фермент РНК-полимеразу [83]. Антибиотик связывается с РНК-полимеразой в области вторичного канала, временно прекращая элонгацию транскрипта, но не оказывает эффекта на скорость элонгации между паузами. Таким образом, микроцин 125 как бы "закупоривает" вторичный канал РНК-полимеразы [3].

Микроцин С7-С51

Микроцин С7-С51 представляет собой пептид-нуклеотидный антибиотик, который продуцируется некоторыми штаммами кишечной палочки и действует против близкородственных видов энтеробактерий. Микроцин С7 [68] и микроцин С51 [47] были независимо выделены из различных штаммов Е. coli и охарактеризованы. Поначалу казалось, что это два разных антибиотика, относящихся к одному классу химических соединений. Но после проведения структурных исследований было установлено, что это одно и то же вещество [32]. В связи с этим, далее мы будем именовать это соединение общим термином "микроцин С" или сокращенно МсС. За синтез микроцина С и устойчивость клеток-продуцентов к этому антибиотику ответственны гены микроцинового кластера mccABCDEF, расположенные на плазмиде [8, 31]. Ген тссА кодирует гептапептид-предшественник микроцина С, синтезируемый на рибосомах [30]. По окончании синтеза на рибосомах, пептид МссА претерпевает пост-трансляционные модификации под действием ферментов МссВ, МссЕ и MccD [77, 61], в результате чего образуется зрелый микроцин С с молекулярной массой 1178 Да (Рисунок 4). Зрелый МсС экспортируется из клетки с помощью белка МссС, который представляет собой транспортер семейства MFS (Major Facilitate Superfamily), встроенный в цитоплазматическую мембрану. За устойчивость клетки-продуцента к эндогенному микроцину ответственны белки МссС, МссЕ и MccF [31, 66].

МНз

МссВ ^

!-Ме1-Аг8-ТЬ|^Иу-Азп-А1а-А8П-——> {-Ме1-Агд-ТИг-ау-А5[>-А1а-А5[1-ЫН-Р-ОНгС о

2 АТФ

он

МссА

МсС1120

0

1 I

он он

МссО МссЕ БАМ

(-Мй-Агд-ТЬМЫу-Азгу-Ай-Азр—ЫН~Р—ОНгС о

МсС1178

° о

мн, он он

Ре?

Ме1-Агд ~ТЬг-С!у-А8ГУ-А1а~А5р-ЫН—Р—ОН,С о

»а

МсС1092

I I

он он

Р~ОН,С о

о

о

!

(СИ,),

I

он он

Ме1-Ач-ТИ»-ау-А8п-А1а-А5р-ЫН-Р-ОНгО о о ^ ^ МсС1149 ' ._.

| I ОН ОН

МссР

РерА, РерВ, РерМ

Асе!у1-А5р-МН-Р-0Н2С ^о

0

1

(С

МссЕ

т

Ацетил-КоА

Токсин

? ^

Азр-НН-Р-ОНХ о

4 а

он он

(СИЛ ,-;

МП, он он

Рисунок 4. Роль различных белков в синтезе и процессинге микроцина С. Из

пептидного предшественника МссА с использованием двух молекул АТФ за счет фермента МссВ синтезируется незрелый микроцин С с молекулярной массой 1120 Да (МсС1120). Который под действием пептид деформилазы (Ое!) может преобразовываться в микроцин С с молекулярной массой 1092 Да (МсС1092) или претерпевать дальнейшие пост-трансляционные модификации за счет совместной работы ферментов МссБ и МссЕ. Такой зрелый микроцин С с молекулярной массой 1178 Да (МсС1178) выбрасывается из клетки за счет работы мембранного транспортера МссС. Попав в цитоплазму клетки зрелый микроцин С деформилируется пептид деформилазой (Ое!) с образованием микроцина С с молекулярнойП^с^й-т9^Да-СМсеН-49)-Протеолиз-пептидной-част-и-антибиотика происходит под действием пептидаз широкого спектра РерА, РерВ и РерК в результате чего высвобождается токсин - аналог активированной аминокислоты аспартата, ингибирующий аспартил-тРНК-синтетазу. Защита от эндогенного микроцина С клеток-продуцентов осуществляется белками МссЕ и МссР, которые модифицируют микроциновый токсин таким образом, что он теряет свое сродство к аспартил-тРНК-синтетазе.

Мы рассказали про структуру микроцина С, его синтез и механизм действия в общих чертах. Далее мы разберем каждый пункт более подробно, начиная с истории открытия микроцина С.

Микроцин С - пептид-нуклеотидный антибиотик

История открытия микроцинов

В семидесятых годах XX века, в контексте поиска новых типов антибиотических соединений, перед учеными встал вопрос изучения механизмов смены бактериальных сообществ (сукцессии) под воздействием различных химических соединений. Даже в составе достаточно хорошо изученных бактериальных сообществ, населяющих кишечник здоровых людей, или индивидуумов с патологическими состояниями, механизмы сукцессии были неизвестны. На тот момент ученые имели представление о существовании колицинов - антибактериальных белков с молекулярной массой от 40 до 80 кДа, продуцируемых некоторыми штаммами Е. coli и активными против близкородственных клеток кишечной палочки, а также некоторых других энтеробактерий [15]. Но только действием колицинов нельзя было объяснить вытеснение одних штаммов другими. Накапливались противоречия, указывающие на существование других типов антибактериальных соединений, способных дать конкурентное преимущество одним бактериальным штаммам над другими в процессе борьбы за существование [38]. Для разрешения этих противоречий Асенсио и Перез-Диаз провели поиск новых низкомолекулярных антибактериальных соединений, продуцируемых энтеробактериями, населяющих кишечник, и активных против близкородственных видов [7]. В своих экспериментах исследователи использовали штаммы кишечной палочки (Е. coli Kl2, Е. coli В, Е. coli W и Е. coli 402), которые растили на минимальной мягкой агаризованной среде. На поверхность застывшей среды накладывали целлофановую пленку, поверх которой наносили мазки штаммов - потенциальных продуцентов антибиотика (аэробных энтеробактерий, изолированных из

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бантыш, Ольга Борисовна, 2014 год

Список используемой литературы

1. Азарова И.Н. Предсказание объемов удерживания и УФ-спектров пептидов в обращенно-фазовой ВЭЖХ // Биоорганическая химия. - 2006. - Vol. 32. - Р. 1-8.

2. Addlagatta A. Structural basis for the unusual specificity of Escherichia coli aminopeptidase N // Biochemistry. - 2008. - Vol. 47. - P. 5303-5311.

3. Adelman K. Molecular mechanism of transcription inhibition by peptide antibiotic Microcin J25 // Mol Cell. - 2004. - Vol. 14. - P. 753-762.

4. Altschul S.F. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. - 1997. - Vol. 25. - P. 3389-3402.

5. Armougom P. Expresso: automatic incorporation of structural information in multiple sequence alignments using 3D-Coffee // Nucleic Acids Res. - 2006. -Vol. 34. - P. W604-608.

6. Arnison P.G. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature // Nat Prod Rep. - 2013 - Vol. 30. - P. 108-160.

7. Asensio C. A new family of low molecular weight antibiotics from enterobacteria // Biochem Biophys Res Commun. - 1976. - Vol. 69. - P. 7-14.

8. Baquero F. Microcin plasmids: a group of extrachromosomal elements coding for low-molecular-weight antibiotics in Escherichia coli // J Bacteriol. - 1978. - Vol. 135. - P. 342-347.

9. Baquero F. The microcins // FEMS Microbiology Letters. - 1984. - Vol. 23. - P. 117-124.

10. Barilla D. The tail of the ParG DNA segregation protein remodels ParF polymers and enhances ATP hydrolysis via an arginine finger-like motif // Proc Natl Acad Sci USA.- 2007. - Vol. 104. - P. 1811-1816.

11. Bates A.D. Energy coupling in type II topoisomerases: why do they hydrolyze ATP? // Biochemistry. - 2007. - Vol. 46. - P. 7929-7941.

12. Blond A. Structure-activity relationship of the antibiotic nucleotide-peptide microcin C51 // in Proceedings 26th European Peptide Symposium - 11 Sep. - 15 Sep. 2000. - Montpellier, France. - 601-602 p.

13. Branden C. Introduction to Protein Structure / Garland Publishing Inc., 1999. -410 p.

14. Burroughs A.M. Natural history of the El-like superfamily: implication for adenylation, sulfur transfer, and ubiquitin conjugation // Proteins. - 2009. - Vol. 75. - P. 895-910.

15. Cascales E. Colicin biology // Microbiol Mol Biol Rev. - 2007. - Vol. 71. - P. 158-229.

16. Chabbert Y. Analyse bactériologique des complexes de colicines produits par 14 souches d'Escherichia coli antibiotiques // Annales de l'Institut Pasteur (Paris). -1950. - Vol. 79. - P. 51-59.

17. Chandu D. PepN is the major aminopeptidase in Escherichia coli: insights on substrate specificity and role during sodium-salicylate-induced stress // Microbiology. - 2003. - Vol. 149. - P. 3437-3447.

18. Ciechanover A. Ubiquitin-mediated proteolysis: biological regulation via destruction // Bioessays. - 2000. - Vol. 22. - P. 442-451.

19. Corbalan N. Functional and structural study of the dimeric inner membrane protein SbmA // J Bacteriol. - 2013 - Vol. 195. - P. 5352-5361.

20. Datsenko K.A. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products // Proc Natl Acad Sci USA.- 2000. - Vol. 97. - P. 66406645.

21. Diaz-Guerra L. appR gene product activates transcription of microcin C7 plasmid genes //J Bacteriol. - 1989. - Vol. 171. - P. 2906-2908.

22. Drider Djamel R.S. Prokaryotic Antimicrobial Peptides: From Genes to Applications / Springer Science+Business Media, 2011. - 451 p.

23. Duda D.M. Structural analysis of Escherichia coli ThiF // J Mol Biol. - 2005. -Vol. 349. - P. 774-786.

24. Duquesne S. Microcins, gene-encoded antibacterial peptides from enterobacteria // Nat Prod Rep. - 2007. - Vol. 24. - P. 708-734.

25. Dye B.T. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins // Annu Rev Biophys Biomol Struct. - 2007. - Vol. 36. - P. 131-150.

26. Fomenko D. Regulation of microcin C51 operon expression: the role of global regulators of transcription // Res Microbiol. - 2001. - Vol. 152. - P. 469-479.

27. Fomenko D.E. Microcin C51 plasmid genes: possible source of horizontal gene transfer // Antimicrob Agents Chemother. - 2003. - Vol. 47. - P. 2868-2874.

28. Garcia-Bustos J.F. Microcin 7: purification and properties // Biochem Biophys Res Commun. - 1984. - Vol. 119. - P. 779-785.

29. Garcia-Bustos J.F. Structure and mode of action of microcin 7, an antibacterial peptide produced by Escherichia coli // Antimicrob Agents Chemother. - 1985. -Vol. 27. - P. 791-797.

30. Gonzalez-Pastor J.E. The smallest known gene //Nature. - 1994. - Vol. 369. - P. 281.

31. Gonzalez-Pastor J.E. Structure and organization of plasmid genes required to produce the translation inhibitor microcin C7 // J Bacteriol. - 1995. - Vol. 177. -P. 7131-7140.

32. Guijarro J.I. Chemical structure and translation inhibition studies of the antibiotic microcin C7 // J Biol Chem. - 1995. - Vol. 270. - P. 23520-23532.

33. Haft D.H. A strain-variable bacteriocin in Bacillus anthracis and Bacillus cereus with repeated Cys-Xaa-Xaa motifs // Biol Direct. - 2009. - Vol. 4. - P. 15.

34. Han M.J. Comparative analysis of envelope proteomes in Escherichia coli B and K-12 strains // J Microbiol Biotechnol. - 2012 - Vol. 22. - P. 470-478.

35. Hassan M. Natural antimicrobial peptides from bacteria: characteristics and potential applications to fight against antibiotic resistance // J Appl Microbiol. -2012-Vol. 113,- P. 723-736.

36. Heddle J.G. The antibiotic microcin B17 is a DNA gyrase poison: characterisation of the mode of inhibition // J Mol Biol. - 2001. - Vol. 307. - P. 1223-1234.

37. Hofreuter D. Characterization of two cryptic Helicobacter pylori plasmids: a putative source for horizontal gene transfer and gene shuffling // J Bacteriol. -2002. - Vol. 184. - P. 2755-2766.

38. Ikari N.S. Interaction in the germfree mouse intestine of colicinogenic and colicin-sensitive microorganisms // Proc Soc Exp Biol Med. - 1969. - Vol. 130. - P. 12801284.

39. Iobbi-Nivol C. Molybdenum enzymes, their maturation and molybdenum cofactor biosynthesis in Escherichia coli // Biochim Biophys Acta. - 2013 - Vol. 1827. - P. 1086-1101.

40. Jin M. Structural and functional analysis of pantocin A: an antibiotic from Pantoea agglomerans discovered by heterologous expression of cloned genes // Angew Chem Int Ed Engl. - 2003. - Vol. 42. - P. 2898-2901.

41. Jin M. The biosynthetic gene cluster of Pantocin a provides insights into biosynthesis and a tool for screening // Angew Chem Int Ed Engl. - 2003. - Vol. 42. - P. 2902-2905.

42. Kazakov T. Amino acid residues required for maturation, cell uptake, and processing of translation inhibitor microcin C // J Bacteriol. - 2007. - Vol. 189. -P. 2114-2118.

43. Kazakov T. Escherichia coli peptidase A, B, or N can process translation inhibitor microcin C // J Bacteriol. - 2008. - Vol. 190. - P. 2607-2610.

44. Khmel I.A. Isolation and characterization of Escherichia coli strains producing microcins of B and C types // FEMS Microbiol Lett. - 1993. - Vol. 111. - P. 269274.

45. Kulikovsky A. The molecular mechanism of aminopropylation of peptide-nucleotide antibiotic microcin C // J Am Chem Soc. - 2014 - Vol. 136. - P. 1116811175.

46. Kurepina N.E. [Microcin R51 and a plasmid determining its synthesis] // Mol Gen Mikrobiol Virusol. - 1990. - Vol. - P. 12-17.

47. Kurepina N.E. Cloning and mapping of the genetic determinants for microcin C51 production and immunity // Mol Gen Genet. - 1993. - Vol. 241. - P. 700-706.

48. Lake M.W. Mechanism of ubiquitin activation revealed by the structure of a bacterial MoeB-MoaD complex // Nature. - 2001. - Vol. 414. - P. 325-329.

49. Larkin M.A. Clustal W and Clustal X version 2.0 // Bioinformatics. - 2007. - Vol. 23. - P. 2947-2948.

50. Lavina M. Identification, mapping, cloning and characterization of a gene (sbmA) required for microcin B17 action on Escherichia coli K12 // J Gen Microbiol. -1986. - Vol. 132. - P. 1685-1693.

51. Law C.J. Ins and outs of major facilitator superfamily antiporters // Annu Rev Microbiol. - 2008. - Vol. 62. - P. 289-305.

52. Lee I. Structural insights into El-catalyzed ubiquitin activation and transfer to conjugating enzymes // Cell. - 2008. - Vol. 134. - P. 268-278.

53. Lehmann C. Structure of the Escherichia coli ThiS-ThiF complex, a key component of the sulfur transfer system in thiamin biosynthesis // Biochemistry. -2006. - Vol. 45. - P. 11-19.

54. Leimkuhler S. Characterization of Escherichia coli MoeB and its involvement in the activation of molybdopterin synthase for the biosynthesis of the molybdenum cofactor // J Biol Chem. - 2001. - Vol. 276. - P. 34695-34701.

55. Lois L.M. Structures of the SUMO El provide mechanistic insights into SUMO activation and E2 recruitment to El // Embo J. - 2005. - Vol. 24. - P. 439-451.

56. Madison L.L. The leader peptide is essential for the post-translational modification of the DNA-gyrase inhibitor microcin B17 // Mol Microbiol. - 1997. -Vol.23. - P. 161-168.

57. Mathavan I. The role of bacterial membrane proteins in the internalization of microcin MccJ25 and MccB17 // Biochem Soc Trans. - 2012 - Vol. 40. - P. 15391543.

58. Matthews B.W. Hydrophobic Interactions in Proteins / Autor // Encyclopedia of life science. - 2001.- Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1038/npg.els.0002975/abstract.

59. Mattiuzzo M. Role of the Escherichia coli SbmA in the antimicrobial activity of proline-rich peptides // Mol Microbiol. - 2007. - Vol. 66. - P. 151-163.

60. Metlitskaya A. Aspartyl-tRNA synthetase is the target of peptide nucleotide antibiotic Microcin C // J Biol Chem. - 2006. - Vol. 281. - P. 18033-18042.

61. Metlitskaya A. Maturation of the translation inhibitor microcin C // J Bacteriol. -2009. - Vol. 191. - P. 2380-2387.

62. Metlitskaya A.Z. Structure of microcin C51, a new antibiotic with a broad spectrum of activity // FEBS Lett. - 1995. - Vol. 357. - P. 235-238.

63. Moreno F. The regulation of microcin B, C and J operons // Biochimie. - 2002. -Vol. 84. - P. 521-529.

64. Nadanaciva S. Importance of Fl-ATPase residue alpha-Arg-376 for catalytic transition state stabilization // Biochemistry. - 1999. - Vol. 38. - P. 15493-15499.

65. Notredame C. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment // J Mol Biol. - 2000. - Vol. 302. - P. 205-217.

66. Novikova M. MccE provides resistance to protein synthesis inhibitor microcin C by acetylating the processed form of the antibiotic // J Biol Chem. - 2010 - Vol. 285. - P. 12662-12669.

67. Novikova M. The Escherichia coli Yej transporter is required for the uptake of translation inhibitor microcin C // J Bacteriol. - 2007. - Vol. 189. - P. 8361-8365.

68. Novoa M.A. Cloning and mapping of the genetic determinants for microcin C7 production and immunity // J Bacteriol. - 1986. - Vol. 168. - P. 1384-1391.

69. Oman T.J. Follow the leader: the use of leader peptides to guide natural product biosynthesis // Nat Chem Biol. - 2010 - Vol. 6. - P. 9-18.

70. Paz-Yepes J. Role of a microcin-C-like biosynthetic gene cluster in allelopathic interactions in marine Synechococcus // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2013 - Vol. 110.- P. 12030-12035.

71. Price M.N. FastTree 2~approximately maximum-likelihood trees for large alignments // PLoS One. - 2010 - Vol. 5. - P. e9490.

72. Pruitt K.D. NCBI reference sequences (RefSeq): a curated non-redundant sequence database of genomes, transcripts and proteins // Nucleic Acids Res. -2007. - Vol. 35. - P.D61-65.

73. Quinones M. Sequence and gene expression analyses of plasmid pHPM8 from Helicobacter pylori reveal the presence of two operons with putative roles in plasmid replication and antibiotic activity // Plasmid. - 2001. - Vol. 46. - P. 223228.

74. Rajagopalan K.V. Biosynthesis and processing of the molybdenum cofactors // Biochem Soc Trans. - 1997. - Vol. 25. - P. 757-761.

75. Rebuffat S. Microcins in action: amazing defence strategies of Enterobacteria // Biochem Soc Trans. - 2012 - Vol. 40. - P. 1456-1462.

76. Regni C.A. How the MccB bacterial ancestor of ubiquitin El initiates biosynthesis of the microcin C7 antibiotic // Embo J. - 2009. - Vol. 28. - P. 1953-1964.

77. Roush R.F. Maturation of an Escherichia coli ribosomal peptide antibiotic by ATP-consuming N-P bond formation in microcin C7 // J Am Chem Soc. - 2008. -Vol. 130. - P. 3603-3609.

78. Rudolph M.J. Crystal structure of molybdopterin synthase and its evolutionary relationship to ubiquitin activation //Nat Struct Biol. - 2001. - Vol. 8. - P. 42-46.

79. Runti G. Functional characterization of SbmA, a bacterial inner membrane transporter required for importing the antimicrobial peptide Bac7(l-35) // J Bacteriol. - 2013 - Vol. 195. - P. 5343-5351.

80. Salomon R.A. The peptide antibiotic microcin 25 is imported through the TonB pathway and the SbmA protein // J Bacteriol. - 1995. - Vol. 177. - P. 3323-3325.

81. Saraste M. The P-loop—a common motif in ATP- and GTP-binding proteins // Trends Biochem Sci. - 1990. - Vol. 15. - P. 430-434.

82. Scheffzek K. GTPase-activating proteins: helping hands to complement an active site // Trends Biochem Sci. - 1998. - Vol. 23. - P. 257-262.

83. Semenova E. Structure-activity analysis of microcinJ25: distinct parts of the threaded lasso molecule are responsible for interaction with bacterial RNA polymerase // J Bacteriol. - 2005. - Vol. 187. - P. 3859-3863.

84. Severinov K. Low-molecular-weight post-translationally modified microcins // Mol Microbiol. - 2007. - Vol. 65. - P. 1380-1394.

85. Smajs D. Complete sequence of low-copy-number plasmid MccC7-H22 of probiotic Escherichia coli H22 and the prevalence of mcc genes among human E. coli // Plasmid. - 2008. - Vol. 59. - P. 1-10.

86. Studer R.A. Residue mutations and their impact on protein structure and function: detecting beneficial and pathogenic changes // Biochem J. - 2013 - Vol. 449. - P. 581-594.

87. Tikhonov A. The mechanism of microcin C resistance provided by the MccF peptidase // J Biol Chem. - 2010 - Vol. 285. - P. 37944-37952.

88. Walden H. Insights into the ubiquitin transfer cascade from the structure of the activating enzyme for NEDD8 // Nature. - 2003. - Vol. 422. - P. 330-334.

89. Walker J.E. Distantly related sequences in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold // Embo J. - 1982. - Vol. 1. - P. 945-951.

90. Walker J.R. Biotinylation facilitates the uptake of large peptides by Escherichia coli and other gram-negative bacteria // Appl Environ Microbiol. - 2005. - Vol. 71. - P.1850-1855.

91. Wendler P. Structure and function of the AAA+ nucleotide binding pocket // Biochim Biophys Acta. - 2012 - Vol. 1823. - P. 2-14.

92. Yorgey P. Posttranslational modifications in microcin B17 define an additional class of DNA gyrase inhibitor // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1994. - Vol. 91. - P. 4519-4523.

93. Zeng Y. Characterization of two seryl-tRNA synthetases in albomycin-producing Streptomyces sp. strain ATCC 700974 // Antimicrob Agents Chemother. - 2009. -Vol. 53.- P. 4619-4627.

94. Zukher I. Ribosome-controlled transcription termination is essential for the production of antibiotic microcin C // Nucleic Acids Res. - 2014- Vol. 42. - P. 11891-11902.

Приложение

Таблица 1. Сравнение структурных элементов белков Е1-суперсемейства. Таблица основана только на опубликованных данных различных авторов, получивших и разрешивших кристаллы белков МссВ, МоеВ и ТЫБ.

Белок,

представитель Е1- МссВ [76] МоеВ [481

ThiF [23, 53]

суперсемейства

среди прокариот

РВБ ЗН5А, ЗН5ТЧ, 1JW9; 1JWA; 1JWB 1ZKM; 1ZFN; 1ZUD

идентификатор ЗГОй, 3119(2, ЗН91,

ЗН5Я

Длина фермента// 351 а.к.// 7 а.к. 249 а. к.//81 а.к. 253 а.к.// 66 а.к.

субстрата

Комплекс с МссВ2-МссА2 MoeB2-MoaD2 ThiF2-ThiS2

субстратом

Доменная 2 домена: домен 1 домен: Е1-домен 1 домен: Е1-домен

организация "пептидные

клещи" и Е1 -домен

Димеризация Структуры не Через гидрофобные Через гидрофобные взаимодействия

описаны поверхности в с участием: 1) антипараллельно

гомодимере МоеВ расположенных а8-спиралей от

обоих мономеров (остатки,

участвующие во взаимодействии:

VI90, Р192, VI93, VI96, Т199, L200,

А202, L203, Е204,1206, К207);

2) петель между al и «2, a8 и 07

одной субъединицы (L15,118,1212) и

петель между [35 и [36 другой

субъединицы (F154);

3) Зю-спирали и петли между ними

(L65, S66, L68, Q69,172);

4) стекинга между остатками

триптофана [38 каждой из

мономерных субъединиц (W229);

5) остатков Р192 и 172 одной

субъединицы и L45 и Y46 другой.

Через полярные взаимодействия и

образование водородных связей

между аминокислотными остатками

на разных субъединицах:

1) К207 и S227;

2) К225 и D17, Е213.

Вторичная 13 р-тяжей, 10 а- 8 Р-тяжей, 8 а-спиралей, 8 Р-тяжей, 8 а-спиралей, 2 Зю-

структура спиралей, 4 Зю- 2 Зю-спирали (3ША и спирали (ЗюА и ЗюВ).

фермента спирали (ЗюЛ-Б). 3,0В). 8 р-тяжей формируют один

р6-р13 формируют 8 р-тяжей формируют протяженный р-слой, окруженный с

один протяженный один протяженный Р- обеих сторон 8 а-спиралями.

Р-слой, слой, окруженный с В N-концевой части расположена

окруженный с обеих сторон 8 а- вариация укладки Россманна, где

обеих сторон 7 а- спиралями. правильное чередование рарар

спиралями (а4-а10) В И-концевой части нарушается между р2 и а4 вставкой

и 3 Зю -спиралями расположена вариация из двух Зю-спиралей: ЗюА и ЗюВ-

(3|(,В-3[оО). Такая укладки Россманна, где

структура правильное чередование

представляет собой рарар нарушается

вариант укладки между р2 и а4 вставкой

Россманна (Е1- из двух 3 ю-спиралей:

укладка). 3,0А и 3ШВ.

Связывание пептидного субстрата

Аминокислотные Пептид связан в В комплексе МоеВ- В комплексе ТЫР-ТЫБ:

остатки и борозде, МоаО: С-концевой гидрофобные взаимодействия между

структуры, сформированной фрагмент МоаЭ (76-81) белками осуществляются за счет

принимающие АТФ- участвует в связывании поверхностей сформированных:

участие в связывающим с активным центром поворотом цепи перед аЗ, петлей

связывании доменом и МоеВ. С-конец МоаБ перед аб, Я70, тяжами р5-р8 и а7-

пептидного или доменом вытянут вдоль Р5 МоеВ. спиралью белка ТЫБ и рЗ, Р4, Т>1,

белкового "пептидные Центральная часть р5 Ь58 и С-концевым участком (60-66)

субстрата клещи". С-конец образована белка ТЫБ. Также образуются

ферментами пептидного предпочтительно водородные связи и солевой мостик

субстрата небольшими между 11230 ТЫР и В7 ТЫБ.

находится в аминокислотам (в, А, Я132 принимает участие в

непосредственной Б). правильной ориентации активного

близости от а- Л135 принимает участие центра при связывании С-конца

фосфата АТФ. в правильной пептидного субстрата в его

В заякоривании ориентации активного основании в непосредственной

субстрата центра при связывании близости от а-фосфата АТФ.

принимают С-конца пептидного

участие субстрата в его

аминокислотные основании в

остатки: непосредственной

- связывание С- близости от а-фосфата

концевой части - АТФ.

К10, Е26;

-формирование

гидрофобного

кармана для

метионина МссА -

1243, V245, W326,

НЗЗЗ, R322, Q335.

Связывание АТФ

Аминокислотные В комплексе МссВ- В комплексе МоеВ- Аденин связан в гидрофобном

остатки, МссА-АТР: АТФ МоаО-АТР: АТФ связан кармане с остатками 134, L107, Т126,

принимающие связан в в непосредственной Т131, D59, R106 за счет

участие в непосредственной близости от С-конца гидрофобных взаимодействий,

связывании АТФ близости от С- субстрата МоеБ. гидроксо-группой Т131 и

конца субстрата Аденин связан кислородом остова L107 за счет

МссА. В неспецифически в образования водородной связи с N6

формировании гидрофобном кармане, аденина. Рибоза связана с остатками

АТФ- заякоривание АТФ G35 и G37 Р-петли, 2'-гидроксил

связывающего осуществляется за счет связан с D59, З'-гидроксил с D59 и

центра принимают рибозы и трифосфата. а- К83. a-фосфат координируется за

участие обе фосфат расположен счет остова G38 и боковых

субъединицы. глубоко в АТФ- радикалов R70 и D127. р-фосфат

Аденин связан в связывающем пакете, взаимодействует с R70, Q71, К83. у-

гидрофобном формирует основной фосфат формирует солевой мостик с

кармане: L121, контакт с 041 Р-петли, R70.

1194, А213, L219. С Я73 образует контакты

рибозой и с атомами кислорода а-

фосфатами и (3-фосфатов, К86

формируют взаимодействует с р-

полярные контакты фосфатом, а 869 и N70

остатки N154, связывают у-фосфат.

R157, Q158, К170.

Вторичные структуры, принимающие участие в связывании АТФ

(жирным шрифтом отмечены консервативные остатки, в скобках - координаты аминокислотного остатка на

соответствующей первичной последовательности белка)

Глицин богатый В петле между аб и В петле между аЗ и pi: В петле между аЗ и pi :

мотив (или Р- Р6: LIVGLGGLG (35-43) LIIGLGGLG (32-40)

петля) (обеспечивает вход АТФ в активный сайт )[89] VILGCGGIG (119-127)

Консервативный ОХО-мотив (участвует в связывании рибозы) Петля между Р7 и 310В-спиралью: DND (146-148) Петля между р2 и 310А-спиралью: ЭРЭ (62-64) Петля между р2 и ЗюА-спиралью: ООБ (59-61)

Связывание р- и у-фосфата АТФ и стабилизация пирофосфата ЗюВ-спираль: TNLTRQ (153-158) 310А-спираль: БМЬдид (69-74) 310А-спираль: БГШЗШЗ (66-71)

Связывание D214 Б130 Б127

Аргининовый палец R94, YSRNF (92-96) Ш4, УЫЯСЛ (12-16) Я11, УБЯд! (9-13)

Особые структуры

Связывание 2п2+ С257, С260, С343, С346 С172, С175, С244, С247 С169, С172, С240, С243

Кроссоверная петля (координаты) Входит в состав домена "пептидные клещи" Не просматривается на кристалле Участок между рб и а8 (174-186). Важна длина петли. Остаток \V174 принимает участие в реакции аденилирования, остаток С184 - в формировании ТЫР-ТЫБ ацидилсульфида

Аминокислотные остатки, участвующие в катализе Аргининовый палец Я94 предоставляется второй субъединицей. У239 связывает а-фосфат АТФ и С-конец МссА. Аргининовый палец Я14 предоставляется второй субъединицей. Конформационные изменения в самом активном центре малы (заметны движения Ш4), напротив, С-конец МоаБ достаточно подвижен. Аргининовый палец II11 предоставляется второй субъединицей.

Рисунок 1. Выравнивание первичных аминокислотных последовательностей белков МссВ, МоеВ и Т1нР. Аминокислотные последовательности представлены с использованием однобуквенного кода, элементы вторичной структуры обозначены прямоугольниками: зеленым - р-тяжи, красным - а-спирали, красной пунктирной линией -Зю-спирали. Желтым помечены аминокислотные остатки участвующие в связывании АТФ; зеленым - связывании пептидного субстрата МссА (светло-зеленым) и убиквитин-подобных белков (темно-зеленым); красным - димеризации; розовым - остатки, участвующие в катализе; коричневым - цистеины кроссоверной петли; голубым -цистеины, связывающие Ъл~\ Жирным шрифтом показаны консервативные аминокислотные остатки. Слева от выравнивания расположены названия белков, справа отображена позиция аминокислотного остатка. Выравнивание сделано с помощью сервиса Ехргезэо (Т-СоГГее) [5].

МоеВ

50

ть1г-------------------------------мюя—рр

МоеВ----------------------------маеьбро—емь

— 100

МссВ цуван руъуоркькнакуух тьхг —рр1 МоеВ —Ив

и,РвООКЫХ)5 ЭУЫI

рЬррсоеаъшж

ЦССС^ЮШУБУТЬАТдЬЮЁТтЫЙНРО! ■ 1сьс01£трааьу1а(3|»усус тьуъарррру 150 УЪТУСЬСБЪОСААБОУГАБАЬУШЪТЬШ РРТУ

МссВ ЕОТНЬТКОУЬР^РРуСК» *М? Н£БМК)В01ЬР'РГЕР?1:Р1 МоеВ 5:ЬБНЬокоТЪНБ1>АТУ001

[ЕУ1КВЕШШ

гбоубоорътоъ

^БАЯРЛЬТИ!

МссВ нкуреар ТЬхР рауаф МоеВ АЫДЬНР

1цуу5арнрр

ьуър:тры-уа~

АШ

ОЬЫАОСРАДКУР[ЬУБСАА1

)НЬТЬЕАЬК 200

250

1шуыкусур \ni2p пыа(жу ярмашрсръу

ИешаасуАытр ытабау зр зс^ьм^уь

ТИМЕ1

¡(зщт-УР

мссв урскт-ссуесокууарьуовекЕмхрнкткыыбЬрк---------рат

тьхр тррууеоофкиа^рр----------------------ыоеремлртаву 300

МоеВ туорсерс у^сь б|иь----------------------рсеыаът§уеасу

МссВ ТЫР МоеВ

3 ЕЕ Ш2 э 5 ЕЕ ЕЗ Я 3 Нё Ш 7

куберьбь 31етр—а' зувкра-б

ИОДБРЕ! ШВЪЕЁЬКБ

«ЗЯБ риа 350 мга

МссВ РУСБУССКИМ----

т|1±г б отср усвв б n ар р v 364 МоеВ РвСЕУССд------

с ^

Благодарности

Автор хотел бы высказать большую признательность своему научному руководителю - Северинову Константину Викторовичу, за чуткое руководство, ценные критические замечания, возможности для саморазвития и личностного роста, а также предоставленные свободы мысли, действий и самореализации. Также автор выражает благодарность всему научному коллективу лаборатории Молекулярной генетики микроорганизмов, в особенности Гилярову Дмитрию за помощь в подготовке текста диссертации и обсуждении результатов, Серебряковой Марине за масс-спектрометрический анализ проб, ценные советы и критический взгляд на получившиеся результаты, а также Дубилей Светлане и Куликовскому Алексею за поддержание автора в активном тонусе. Также автор хотел бы выразить особую признательность всему преподавательскому составу кафедры Молекулярной биологии МГУ им. М.В.Ломоносова, за приложенные самоотдачу, терпение и труд в процессе обучения студентов, за те фундаментальные знания, которые они вложили в головы своих студентов, и любовь к науке, которую они привили. Автор также хотел уделить особое внимание и высказать слова благодарности своим друзьям и одногруппникам за поддержку, жаркие научные дискуссии и взаимную помощь в постановке экспериментов и анализов, в особенности Гордиенко Евгению, за ценные консультации и советы в области биоинформатики, а также Горкун Анастасии за помощь в подготовке текста диссертации и моральную поддержку.

Работа была выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской федерации, договор № 14.В25.31.0004, а также программы Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" (номер государственной регистрации: 01201355171).