Структура и видоспецифичность действия гомолога микроцина B из Pseudomonas syringae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.07, кандидат наук Метелев, Михаил Васильевич

• Метелев, Михаил Васильевич
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Метелев, Михаил Васильевич

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость работы

Публикации и апробация работы

Структура и объем работы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Общая характеристика ТОММ

Линейные азол(ин)-содержащие пептиды

Микроцин В

Стрептолизин Б

Плантазолицин

Гоадспорин

Цианобактины

Тиопептиды

Боттромицины

Перспективы изучения ТОММ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оборудование

Расходные материалы

Реактивы и ферменты

Буферные растворы

Микробиологические среды

Бактериальные штаммы

Метод ПЦР

Электрофорез ДНК в агарозном геле

Лигирование продукта амплификации в плазмидные вектора

Рестрикция

Выделение плазмидной ДНК (минипреп)

Секвенирование

Переосаждение ДНК спиртом

Приготовление компетентных клеток Е. coli

Трансформация замороженных компетентных клеток Е. coli

Процедура получения штамма XL1 Blue с делецией в геноме

Процедура молекулярного клонирования оперонов

Очистка ДНК-гиразы

Электрофорез белков в полиакриламидном геле

Опыт по расщеплению ДНК ДНК-гиразой in vitro

Получение релаксированной ДНК для определения активности ДНК-гиразы in vitro:

Выделение микроцина из клеток Е. coli и ВЭЖХ-анализ

Масс-спектрометрический анализ (МАЛДИ и тандемная MC)

Определение антибактериальной активности антибиотиков и демонстрация SOS ответа внутри клеток

Тестирование токсичности Рр-МсВ, производящегося в клетках

Выделение РНК

Обратная транскрипция

ПЦР в реальном времени

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Идентификация mcb оперонов Р. syringae

Исследование продукции вещества, подобного микроцину В, штаммом Р. syringae pv. glycinea В076

Гетерологическая продукция Р. syringae микроцина В в клетках Е. coli

Ps-McBl и Ps-McB2 ингибируют рост клеток Е. coli и действуют на ДНК-гиразу

Видоспецифичность действия Ps-McB и Ес-МсВ

Исследование продукции вещества, подобного микроцину В, закодированного в mcb опероне Pseudomonas putida КТ2440

Биологическая активность Рр-МсВ

Идентификация гомологичных оперонов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ПРОЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

ATP (АТФ) - аденозинтрифосфорная кислота

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

CFX - ципрофлоксацин

Да - Дальтон

DMSO (ДМСО) - диметилсульфоксид ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота DTT - дитиотреитол

Ее-МсВ - микроцин, производящийся Е. coli

ЭДТА (EDTA) - этилендиаминтетрауксусная кислота

ИПТГ (IPTG) - изопропилтиогалактозид

ЛАП - линейные азол(ин)-содержащие пептиды

МА1_01(МАЛДИ) - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация МС - масс-спектрометрия

dNTP - смесь дезоксирибонуклеотидов (dGTP, dATP, dTTP и dCTP)

ПЦР - полимеразная цепная реакция

PIPES - пиперазин-Л/, Л/'-6ис(2-этансульфоновая кислота)

Рр-МсВ - гомолог микроцина В из P. putida.

Ps-McB - гомолог микроцина В из P. syringae

РПП - рибосомально-синтезируемые пост-трансляционно-модифицируемые пептиды РНК - рибонуклеиновая кислота

БОБ -додецилсульфат натрия

- стрептолизин Б Т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

ТОММ -тиазол-оксазол модифицированные микроцины ТФУ-трифторуксусная кислота РММ (ФМН) - флавинмононуклеотид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура и видоспецифичность действия гомолога микроцина B из Pseudomonas syringae»

Введение

Актуальность работы

Распространение лекарственной устойчивости среди патогенных штаммов различных микроорганизмов значительно сужает спектр доступных антибиотиков, в связи с этим поиск и изучение новых антибиотиков является крайне актуальной задачей.

Данная работа посвящена исследованию гомолога ингибитора ДНК-гиразы микроцина В из Pseudomonas syringae pv. glycinea B076. Микроцин В - пептидный антибиотик, продуцируемый штаммами Е. coli, - является оружием в конкурентной борьбе за выживание между близкородственными видами микроорганизмов. Мишенью микроцина В является ДНК-гираза (топоизомераза типа Па) - фермент, ответственный за поддержание отрицательной сверхспирализации ДНК бактерий. Известно, что микроцин В стабилизирует двухцепочечный разрыв в ДНК, образующийся во время работы ДНК-гиразы, накопление двухцепочечных разрывов приводит к нарушению процесса репликации и индукции SOS ответа. К сожалению, детальный механизм действия микроцина В и его сайт связывания с ДНК-гиразой в настоящий момент не известны. Изучение механизма ингибирования ДНК-топоизомераз важно для понимания того, как функционируют эти ферменты, а также для разработки новых лекарственных препаратов. В настоящее время антибиотики из группы фторхинолонов, мишенью которых является ДНК-гираза, успешно применяются в клинической практике. Широкое использование фторхинолонов в немалой степени связано с пониманием механизма действия этих антибиотиков.

Микроцин В является рибосомально-синтезируемым пост-трансляционно-модифицируемым пептидом и относится к группе тиазол-оксазол модифицированных микроцинов (TOMM). Биоинформатические и биохимические данные последних лет свидетельствуют о широкой распространенности TOMM в природе, и многие из этих соединений представляют интерес с точки зрения разработки новых лекарственных препаратов. Поиск и исследование биологической активности неизученных TOMM является важной научной задачей.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение гомолога микроцина В из Pseudomonas syringae pv. glycinea B076.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Получить и очистить гомолог микроцина В из Pseudomonas syringae pv. glycinea B076;

2. Определить его химическую структуру (характер циклизации);

3. Исследовать антибактериальную активность полученного вещества;

4. Выявить и проанализировать опероны бактерий рода Pseudomonas, гомологичные mcb оперону Р. syringae.

Научная новизна и практическая значимость работы

В работе были обнаружены опероны, гомологичные mcb оперону Е. coli, в геномах нескольких патоваров растительных патогенов Pseudomonas syringae. Было показано, что при гетерологической экспрессии в клетках Е. coli с оперона mcb Pseudomonas syringae pv. glycinea B076 производится два варианта P. syringae микроцина (Ps-McB). Было выявлено, что микроцин из Е. coli (Ес-МсВ) и Ps-McB обладают разной специфичностью действия. Ес-МсВ не активен в отношении бактерий рода Pseudomonas, в то время как Ps-McB является эффективным ингибитором роста таких бактерий. Важно отметить, что Ps-McB способен ингибировать рост патогенного для человека штамма Р. aeruginosa РА01. Также было показано, что специфичность действия микроцинов не зависит от специфичности взаимодействия с ДНК-гиразой и, по-видимому, определяется эффективностью транспорта внутрь клетки. Было продемонстрировано, что три немодифицированные аминокислоты в центральной области микроцина Ps-McB отвечают за специфичность действия в отношении штаммов рода Pseudomonas. Полученные результаты открывают новые возможности для конструирования пептидов, подобных микроцину В Е. coli, но с измененным спектром действия.

В геномах различных бактерий рода Pseudomonas были идентифицированы опероны, гомологичные оперону mcb Е. coli. Показано, что эти опероны кодируют вещества, способные ингибировать рост бактерий, но действие которых отлично от действия микроцина В Е. coli и Р. syringae. Дальнейшее изучение этих веществ перспективно с точки зрения поиска новых антибиотиков.

Публикации и апробация работы

По результатам диссертационной работы было опубликовано 4 печатные работы, в том числе 1 статья в международном рецензируемом журнале и 3 тезиса конференций. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 1) «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова», 14-17 ноября, 2011, Москва, Россия; 2) «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», 22-24 ноября, 2012, Казань, Россия (международная конференция); 3) Конгресс Федераций европейских биохимических обществ 2013 «Биологические механизмы», 6-11 июля, 2013, Санкт-Петербург, Россия (международная конференция).

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов работы, заключения, выводов, благодарностей и списка использованной литературы. Работа изложена на 96 страницах машинописного текста, включая 29 рисунков и 2 таблицы. Список цитируемых литературных источников включает 121 наименование.

Обзор литературы

Общая характеристика ТОММ

Настоящий обзор посвящен биологически активным прокариотическим £ибосомально-синтезируемым пост-трансляционно-модифицируемым пептидам (РПП) [1], в которых аминокислотные остатки цистеина, серина и треонина подвергаются циклизации с образованием тиазольных(тиазолиновых) и (метил)оксазольных(оксазолиновых) гетероциклов. Общее название для таких веществ - тиазол-оксазол модифицированные микроцины (ТОММ). Биоинформатические и биохимические данные последних лет свидетельствуют о широкой распространенности ТОММ в природе [2]. Согласно современной номенклатуре, к ТОММ относятся такие классы РПП как линейные азол(ин)-содержащие пептиды, цианобактины, тиопептиды и боттромицины. Наиболее изученными представителями ТОММ являются микроцин В (ингибитор ДНК-гиразы), стрептолизин (гемолитический экзотоксин), тиострептон (ингибитор трансляции), транкамид (обладает противораковой активностью) и гоадспорин (сигнальное вещество).

В отличие от пептидов нерибосомальной природы, в последовательность которых могут входить нестандартные аминокислоты, в состав рибосомально синтезируемых пептидов могут входить лишь 20 канонических аминокислот. Однако после трансляции такие пептиды могут модифицироваться с участием специализированных ферментов. Такими модификациями могут являться дегидратация остатков серина или треонина, гетероциклизация остатков цистеина, серина и треонина, пренилирование, метилирование, образование дисульфидных связей, эпимеризация аминокислот, макроциклизация и другие. В результате образуются биологически активные низкомолекулярные вещества, в которых часто нелегко распознать исходный рибосомально-синтезированный пептид. Образование гетероциклов и макроциклов в процессе модификации пептидов создает фиксированную структуру, которая необходима для функционирования вторичных метаболитов и защищает их от деградации протеазами.

Для всех РПП характерна определенная схема биосинтеза. Все вещества, относящиеся к этому классу, первоначально синтезируются в виде пептида-предшественника длиной от 7

до 110 аминокислот. Гены, ответственные за продукцию каждого вещества, организованы в кластер. Помимо гена, кодирующего пептид-предшественник, в таком кластере находятся гены, кодирующие ферменты модификации пептида-предшественника, а также гены, ответственные за экспорт зрелого (функционально активного) вещества. В случае если производимый РПП является антибиотиком, в кластере также находятся гены, обеспечивающие устойчивость клеток-продуцентов к производимому ими веществу.

Пептид-предшественник РПП можно разделить на две части: собственно модифицируемый пептид и лидерную последовательность (см. рисунок 1). Модифицируемый пептид - та часть пептида-предшественника, которая подвергается модификации и образует конечное вещество. Лидерная последовательность необходима для узнавания пептида-предшественника ферментами, отвечающими за модификацию. Для многих представителей РПП было показано, что эти ферменты достаточно толерантны к мутациям в модифицируемом пептиде (если эти мутации непосредственно не изменяют химические группы, необходимые для модификации) и для их функционирования важна лишь специфическая лидерная последовательность [3]. Это свойство, по-видимому, объясняет высокое разнообразие природных РПП, а также открывает большие возможности к созданию различных искусственных РПП для использования в медицине и биотехнологии. Лидерная последовательность расположена, как правило, на Ы-конце пептида-предшественника, однако встречаются и исключения [4]. Лидерная последовательность может также отвечать за экспорт зрелого пептида из клетки. На последних стадиях созревания РПП лидерная последовательность отщепляется от модифицируемого пептида. У эукариотических РПП, таких как циклотиды и конопептиды, на 1\1-конце присутствует сигнальная последовательность, которая необходима для того, чтобы пептид попал в нужный компартмент клетки [5, 6].

Кластер генов ген пептида-предшественника

| транскрипция, трансляция

и

л.

I

лидерная последовательность

модифицируеммый пептид

модификация

Т Т т т т т

отрезание лидернои последовательности

зрелый модифицированный пептид

Рисунок 1. Общая схема биосинтеза РПП. Ген, кодирующий пептид-предшественник, и гены ответственные за его посттрансляционную модификацию организованы в кластер. Пептид-предшественник состоит из модифицируемой части и лидерной последовательности.

Кластеры генов синтеза различных классов РПП часто кодируют ферменты модификации, катализирующие сходные реакции, и отличаются друг от друга лишь набором кодируемых ферментов (кластеры генов синтеза известных ТОММ схематично изображены на рисунке 2). Так например серин/треонин дегидратазы вовлечены в модификацию лантибиотиков, тиопептидов и линейных азол(ин)-содержащих пептидов [7-9]. Наличие метилирующих ферментов характерно для биосинтеза тиопептидов, боттромицинов и др. Предполагается, что образование новых классов РПП может происходить за счет перегруппировки или дупликации генов ферментов модификации с последующей дивергенцией [10]. Несмотря на то, что многие ферменты, отвечающие за аналогичные модификации в разных кластерах, являются гомологами, существуют примеры и конвергентной эволюции. Так например макроциклизация прокариотических цианобактинов и циклотидов осуществляется не гомологичными ферментами [5, 11].

А В

Стрептолизин 5 (¡ад) Микроцин В (тсЬ)

Плантазолицин (ргл) Гоадспорин (доф Пателламид (раО с|— Тиоциллин (ГсО Боттромицин (Ытл)

■ф Пептид-предшественник ■ф Субъединица О циклодегидратазы (УсаО домен) I % Дегидрогеназа (субъединица В) ■ф Субъединица С циклодегидратазы

Транспортер 11^ Фактор имунности Пептидаза

Метилтрансфераза I—Дегидратаза лантибиотиков ■Ь Регулятор транскрипции

Фермент, отвечающий за макроциклизацию ^^ Прочие модификации Другие

Рисунок 2. Кластеры генов биосинтеза основных представителей ТОММ. Во всех кластерах присутствует ген, кодирующий пептид-предшественник, и гены ответственные за образование тиазольных и (метил)оксазольных гетероциклов. Гены, кодирующие субъединицы циклодегидратазы, обозначены синим и голубым цветом, гены, кодирующие дегидрогеназу отмечены желтым цветом).

Из-за большого объема материала, в данном обзоре будут подробно рассмотрены представители лишь одной группы РПП, ТОММ, для всех представителей которых характерно наличие в структуре конечного вещества тиазольных (тиазолиновых) и (метил)оксазольных (оксазолиновых) гетероциклов, формирующихся из остатков цистеина, серина или треонина пептида-предшественника. Ниже структура и биосинтез отдельных классов ТОММ рассмотрены детально.

Линейные азол(ин)-содержащие пептиды

К линейным азол(ин)-содержащим пептидам (ЛАП) относят все нециклические ТОММ. Гетероциклизация остатков серина, цистеина и треонина в составе ЛАП

13

осуществляется ферментным комплексом, состоящим из трех (или двух) белков: дегидрогеназы (согласно общепринятой номенклатуре - фермент В) и циклодегидратазы (Сй согласно номенклатуре), которая в кластере может кодироваться двумя генами (С и Р) или же одним (белки Си О слиты в одну полипептидную цепь) [10]. Белки В, С и 0 у разных ЛАП гомологичны между собой, что и является основанием для объединения данных веществ в одну группу. Введение гетероциклов происходит в два этапа: сначала под действием фермента В происходит циклодегидратация с образованием азолинового цикла, а затем может происходит дегидрирование с образованием тиазольных, оксазольных или метилоксазольных гетероциклов (см. рисунок 3) [12].

Рисунок 3. Общая схема образования тиазольных(тиазолиновых) и (метил)оксазольных(оксазолиновых) гетероциклов в составе TOMM. Белки синтетазного комплекса BCD узнают лидерную последовательность и вносят модификации в модифицируемый пептид. Реакция происходит в 2 этапа, сначала с участием белков С и D и молекулы АТР происходит циклодегидратация, затем под действием FMN-зависимого белка В происходит дегидрирование с образованием ароматического гетероцикла.

Долгое время роль субъединиц В, С и D в осуществлении реакции не была ясна. При изучении микроцина В было установлено, что реакция дегидрирования осуществляется FMN-зависимой дегидрогеназой [13], но лишь недавно на примере TOMM из Bacillus sp. AI Hakam удалось установить механизм реакции циклодегидратации [14]. Было показано, что в составе синтетазного комплекса реакция дегидратации осуществляется белком D. Ранее предполагалось, что этот белок не является каталитической субъединицей комплекса, а необходим для узнавания субстрата и регулирования процесса циклизации. Было показано,

что белок D фосфорилирует карбонильный кислород предшествующего серину, треонину или цистеину аминокислотного остатка с использованием АТР. В результате фосфорилирования облегчается отщепление воды, что и приводит к образованию цикла (см. рисунок 4). Также было показано, что третья субъединица (белок С) участвует в регуляции процесса, однако детально ее роль пока не изучена.

Рисунок 4. Механизм реакции циклодегидратации. Белок D использует АТР для фосфорилирования карбонильного кислорода предшествующего аминокислотного остатка, что облегчает отщепление воды, и в конечном итоге приводит к образованию гетероцикла.

Лидерная последовательность отщепляется после образования набора гетероциклов, характерного для конкретного ЛАП. Образуемый зрелый пептид узнается АТР-зависимыми транспортерами, закодированными в кластере, и экспортируется из клетки.

При помощи биоинформатического анализа было выявлено множество различных кластеров генов, предположительно кодирующих вещества, относящиеся к классу ЛАП [2, 10, 15, 16]. В некоторых таких кластерах помимо белков В, С и D присутствует ряд других ферментов модификации, например, метилтрансферазы, ацетилтрансферазы и дегидратазы, что указывает на возможность наличия не только тиазольных и оксазольных гетероциклов, но и других модификаций. Как правило, поиск оперонов ЛАП проводится путем идентификации кластрированных генов, кодирующих гомологи белков ферментативного комплекса BCD. Гены пептидов-предшественников представляют собой очень короткие открытые рамки считывания, поэтому их поиск в потенциальных кластерах синтеза ЛАП приходиться проводить вручную.

Ниже приведены основные сведения относительно наиболее изученных представителей ЛАП.

МикроцинВ

А в

D

МсЬА (пептид-предшественник)

1 27 40 51 69

melkasefgwlsvdalklsrqsplgVGIGGGGGGGGGGSCGGQGGGCGGCSNGCSGGNGGSGGSGSHI

в.

27

С

лидерная последовательность

40 41

И-

#

VGIGGGGGGGGG—N

.^.-Л 3-L GGQGGN

Г

48

н Г\ н f

" '. X ,G—N. L

55 56

62

65 69

О о

H nil

if

" I г й Г\

GGNG-N'^/Ч^Л^ ,-G—N

Протеаза TldD/TldE

27

40 41 s

VGIGGGGGGGGG—JJ_I GGQGGN

H""N

48 s-

51

\ .о-я. ?~Y

55 56 S—о

62 н Г\

65 69

rx

в

Рисунок 5. А. Кластер генов синтеза микроцина В, первый ген кодирует пептид-предшественник. Синтетазный комплекс BCD узнает лидерную последовательность (1-26 аминокислоты) пептида-предшественника и вносит тиазольные и оксазольные гетероциклы в модифицируемый пептид (указаны номера аминокислотных остатков серина и цистеина, участвующие в циклизации). После образования гетероциклов, лидерная последовательность отщепляется протеазой TldD/TldE и образуется зрелая форма микроцина. Б. Структура плантазолицина. В результате модификации, помимо образования тиазольных и (метил)оксазольных гетероциклов, метилируется N-концевой аргинин. Последний остаток треонина образует азолиновый гетероцикл. В. Структура гоадспорина.

Микроцин В - антибиотик пептидной природы, синтезируемый некоторыми штаммами Escherichia coli [17]. Клетки Е. coli, которые продуцируют микроцин В, содержат оперон из 7 генов (mcbABCDEFG), расположенный на плазмиде (см. рисунок 2). Ген тсЬА кодирует пептид-предшественник, гены тсЬВ, тсЬС и mcbD кодируют субъединицы ферментативного комплекса BCD [12]. Гены тсЬЕ и mcbF ответственны за транспорт созревшего микроцина из клетки, последний ген mcbG кодирует белок, который необходим для защиты внутриклеточной мишени микроцина - ДНК-гиразы продуцирующих микроцин клеток от действия антибиотика (см. рисунок 5А) [18]. Пептид-предшественник микроцина В имеет длину 69 аминокислот, из которых 26 N-концевых остатков составляют лидерную последовательность, а оставшиеся 43 аминокислоты образуют модифицируемый пептид. Ферментативный комплекс McbBCD специфически узнает лидерную последовательность, а затем последовательно образует гетероциклы в модифицируемом пептиде: от N-конца к С-концу [19].

Исторически сложилось, что номенклатура белков ферментативного комплекса микроцина В отличается от общепринятой номенклатуры ЛАП: белок МсЬС является FMN-зависимой дегидрогеназой (согласно общепринятой номенклатуре - белок В), а МсЬВ и McbD совместно осуществляют реакцию дегидратации (белки С и D соответственно). Ввиду упомянутых выше новых данных, полученных на ферментативной системе ТОММ из Bacillus sp. AI Hakam, предполагается, что белок McbD катализирует образование азолиновых циклов, а затем флавин-содержащая дегидрогеназа окисляет эти пятичленные циклы до оксазольных и тиазольных ароматических гетероциклов. Белок McbD работает в комплексе с белком МсЬВ, однако роль последнего не вполне ясна, возможно, он связывает лидерную последовательность или же участвует в передаче формирующихся циклов от одного фермента к другому. Известно, что белок МсЬВ связывает Zn2+, который, по-видимому, не участвует в катализе, а необходим для поддержания структуры белка [20]. Так как вариантов микроцина с оксазолиновыми или тиазолиновыми кольцами обнаружено не было, предполагается, что реакция дегидрирования происходит непосредственно за циклизацией без диссоциации ферментативного комплекса. Обычно гетероциклизации подвергаются только те остатки серина и цистеина, которым предшествует глицин. Наличие глицина, по-видимому, увеличивает свободу вращения вокруг амидной связи и таким образом облегчает образование гетероцикла. Помимо одиночных гетероциклов в последовательности микроцина В есть оксазол-тиазольный и тиазол-оксазольный бис-гетероциклы, которые

17

образуются в результате циклизации трипептидов GlySerCys и GlyCysSer (сайты А и В на рисунке 5А). В последовательности пептида-предшественника есть еще один трипептид Gly50Cys51Ser52i однако производимый микроцин, как правило, содержит в этом месте не бис-гетероцикл, а либо отдельный тиазольный гетероцикл, либо тиазольный гетероцикл и сложноэфирную связь, соединяющую аминокислотные остатки 51 и 52 [21]. После образования определенного количества гетероциклов, лидерная последовательность отрезается с участием клеточных белков TldD и TldE и зрелый микроцин выводиться из клетки за счет активности McbEF [22]. Основная форма микроцина В, которая экспортируется из клетки, содержит 4 оксазольных и 4 тиазольных гетероцикла. При выделении микроцина из клеток обнаруживается небольшое количество вариантов, содержащих б или 7 гетероциклов [19]. В таких вариантах недостает двух или одного С-концевого оксазольного(ых) циклов(а), соответственно. Было показано, что такие не полностью модифицированные варианты микроцина также проявляют антибактериальную активность.

Реакция модификации пептида-предшественника ферментативным комплексом BCD была воспроизведена in vitro [12]. В качестве субстрата использовался полноразмерный пептид МсЬА и его укороченный вариант, включающий только первые 46 аминокислотных остатков.

Интересной структурной особенностью микроцина В является наличие линкера между лидерной последовательностью и первым модифицирующимся остатком серина (из 13 аминокислотных остатков линкера - 11 остатки глицина). Было сделано предположение, что такой линкер обладает повышенной гибкостью, и необходим для правильного позиционирования модифицируемой последовательности в каталитическом центре ферментативного комплекса. В экспериментах in vitro было проверено, является ли линкер необходимым для модификации. Для этого были сконструированы делеционные мутанты с вариантами линкера, укороченными на 1, 3, 5 и 7 аминокислотных остатка [23]. Также был сконструирован вариант микроцина, в котором в линкер был вставлен один дополнительный остаток глицина. Было показано, что удлинение линкера повышает скорость реакции модификации in vitro, а укорочение линкера приводит к постепенному падению скорости реакции (при изменении длины линкера до трех глицинов реакция модификации полностью прекращалась).

Мишенью микроцина В является ДНК-гираза (топоизомераза типа На) [24-26] -фермент, ответственный за поддержание отрицательной сверхспирализации ДНК бактерий. Микроцин В стабилизирует двухцепочечный разрыв в ДНК, образующийся во время работы гиразы. Накопление двухцепочечных разрывов приводит к нарушению процесса репликации и индукции SOS ответа. Таким образом, действие микроцина напоминает действие применяемых в клинической практике антибиотиков из группы фторхинолонов. Однако в экспериментах in vitro механизм действия микроцина отличается от механизма действия фторхинолонов. В отличие от фторхинолонов микроцин не полностью останавливает, а лишь замедляет реакцию сверхспирализации и релаксации. Кроме того, действие микроцина зависит от наличия АТР, а фторхинолоны эффективно ингибируют и АТФ независимую релаксацию ДНК. Наконец, для функционирования микроцина требуется фрагмент ДНК длиной не менее 150 нуклеотидных пар; для фторхинолонов такого требования нет. Сайт связывания микроцина В с гиразой не известен. Единственная известная к настоящему моменту мутация ДНК-гиразы, вызывающая устойчивость к микроцину В, попадает в район, отличный от района связывания фторхинолонов (GyrB W751R) [24]. Таким образом, предполагается, что микроцин В связывается с GyrB субъединицей ДНК-гиразы и ингибирует транспорт сегмента ДНК через образующийся двухцепочечный разрыв. Были предприняты попытки получить биологически активные фрагменты микроцина В, которые были бы способны стабилизировать двухцепочечныее разрывы, образующиеся в процессе работы ДНК-гиразы. Была продемонстрирована способность ряда фрагментов в той или иной степени ингибировать ДНК-гиразу, однако фрагменты, действующие на ДНК-гиразу, не ингибировали рост клеток. Авторы предполагают, что отсутствие биологической активности связано с нарушением проникновения фрагментов микроцина внутрь бактериальных клеток [27].

В геноме почвенного микроорганизма P. putida КТ2440 также найден кластер генов, близкий по организации кластеру mcb из Е. coli [28]. Р. putida населяет богатую питательными веществами ризосферу растений. Предполагается, что Р. putida КТ2440 может синтезировать микроцин для борьбы с конкурирующими почвенными бактериями.

Стрептолизин S

Streptococcus pyogenes - вид грамположительных бактерий, которые способны вызывать разрушение эритроцитов крови (Р-гемолиз) и являются причиной ряда заболеваний человека, таких как импетиго и фарингит [29]. В 1938 году стало известно, что за способность стрептококков вызывать разрушение эритроцитов отвечают два токсина: стрептолизин О и стрептолизин S [30]. Стрептолизин О - белок, который способен связываться с холестерином в составе клеточной мембраны и вызывать лизис клеток. Стрептолизин S (SLS) является веществом пептидной природы. Плохая растворимость, склонность к агрегации и другие специфические свойства SLS не позволяют выделить это вещество в чистом виде [31]. Стрептолизины действуют на эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, а также внутриклеточные органеллы. Показано, что SLS вызывает образование трансмембранных пор и необратимый осмотический лизис клеток. Отсутствие иммунного ответа на SLS, по-видимому, связано с его токсичностью для клеток, обеспечивающих врожденный и приобретенный иммунитет, малыми размерами и высокой степенью модификации.

В геноме S. pyogenes был идентифицирован кластер генов sag, отвечающий за биосинтез SLS [32] (см. рисунок 2). В кластер входит девять генов (sagA-l), из которых семь (sagA-G) необходимы для обеспечения цитолитического фенотипа S. pyogenes [33]. Ген sagA кодирует пептид-предшественник длиной 53 аминокислоты. Гены sagB, sagC и sagD гомологичны генам mcbC, тсЬВ и mcbD Е. coli. Ген sagB кодирует дегидрогеназу, а продукты генов sagC и sagD осуществляют реакцию циклодегидратации. Предполагается, что пептид-предшественник SagA в результате модификации превращается в SLS. В опытах in vitro было показано, что ферменты SagBCD способны вносить тиазольные и оксазольные гетероциклы в структуру пептида-предшественника с образованием цитолитически активного пептида [2]. Зрелый токсин экспортируется из клеток за счет ABC-транспортера SagGHI. Функции оставшихся генов sagEF на сегодняшний день не ясны: предполагается, что они ассоциированы с мембраной и, возможно, участвуют в отрезании лидерного пептида и защите штамма-продуцента от производимого токсина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Метелев, Михаил Васильевич, 2013 год

Список процитированной литературы

1. Arnison P.G., Bibb M.J., Bierbaum G., Bowers A.A., Bugni T.S., Bulaj G., Camarero J.A., Campopiano D.J., Challis G.L., Clardy J., Cotter P.D., Craik D.J., Dawson M., Dittmann E., Donadio S., Dorrestein P.C., Entian K.D., Fischbach M.A., Garavelli J.S., Goransson U., Gruber C.W., Haft D.H., Hemscheidt T.K., Hertweck C., Hill C.; Horswill A.R., Jaspars M., Kelly W.L., Klinman J.P., Kuipers O.P., Link A.J., Liu W., Marahiel M.A., Mitchell D.A., Moll G.N., Moore B.S., Muller R., NairS.K., Nes I.F., Norris G.E., Olivera B.M., Onaka H., Patchett M.L., Piel J., Reaney M.J., Rebuffat S., Ross R.P., Sahl H.G., Schmidt E.W., Selsted M.E., Severinov K., Shen B., Sivonen K., Smith L., Stein T., Sussmuth R.D., Tagg J.R., Tang G.L., Truman A.W., Vederas J.C., Walsh C.T., Walton J.D., Wenzel S.C., Willey J.M., van der Donk W.A. 2013. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature. Nat Prod Rep. 30, 108-60.

2. Lee S.W., Mitchell D.A., Markley A.L., Hensler M.E., Gonzalez D., Wohlrab A., Dorrestein P.C., Nizet V., Dixon J.E. 2008. Discovery of a widely distributed toxin biosynthetic gene cluster. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 5879-84.

3. Oman T.J.,van der Donk W.A. 2010. Follow the leader: the use of leader peptides to guide natural product biosynthesis. Nat Chem Biol. 6, 9-18.

4. Zhang W., Li Y., Qian G., Wang Y„ Chen H., Li Y.Z., Liu F., Shen Y„ Du L. 2011. Identification and characterization of the anti-methicillin-resistant Staphylococcus aureus WAP-8294A2 biosynthetic gene cluster from Lysobacter enzymogenes OH11. Antimicrob Agents Chemother. 55, 5581-9.

5. Gruber C.W., Cemazar M., Anderson M.A., Craik D.J. 2007. Insecticidal plant cyclotides and related cystine knot toxins. Toxicon. 49, 561-75.

6. Kaas Q., Westermann J.C., Craik D.J. 2010. Conopeptide characterization and classifications: an analysis using ConoServer. Toxicon. 55,1491-509.

7. Chatterjee C., Miller L.M., Leung Y.L., Xie L., Yi M., Kelleher N.L., van der Donk W.A. 2005. Lacticin 481 synthetase phosphorylates its substrate during lantibiotic production. J Am Chem Soc. 127,15332-3.

8. Kelly W.L., Pan L., Li C. 2009. Thiostrepton biosynthesis: prototype for a new family of bacteriocins. J Am Chem Soc. 131, 4327-34.

9. Onaka H., Nakaho M., Hayashi K., Igarashi Y., Furumai T. 2005. Cloning and characterization of the goadsporin biosynthetic gene cluster from Streptomyces sp. TP-A0584. Microbiology. 151, 3923-33.

10. Melby J.O., Nard N.J., Mitchell D.A. 2011. Thiazole/oxazole-modified microcins: complex natural products from ribosomal templates. Curr Opln Chem Biol. 15, 369-78.

11. Lee J., Mcintosh J., Hathaway B.J., Schmidt E.W. 2009. Using marine natural products to discover a protease that catalyzes peptide macrocyclization of diverse substrates. J Am Chem Soc. 131, 2122-4.

12. Li Y.M., Milne J.C., Madison L.L., Kolter R., Walsh C.T. 1996. From peptide precursors to oxazole and thiazole-containing peptide antibiotics: microcin B17 synthase. Science. 274, 1188-93.

13. Milne J.C., Roy R.S., Eliot A.C., Kelleher N.L., Wokhlu A., Nickels B., Walsh C.T. 1999. Cofactor requirements and reconstitution of microcin B17 synthetase: a multienzyme complex that catalyzes the formation of oxazoles and thiazoles in the antibiotic microcin B17. Biochemistry. 38, 4768-81.

14. Dunbar K.L., Melby J.O., Mitchell D.A. 2012. YcaO domains use ATP to activate amide backbones during peptide cyclodehydrations. Nat Chem Biol. 8, 569-75.

15. Haft D.H., Basu M.K., Mitchell D.A. 2010. Expansion of ribosomally produced natural products: a nitrile hydratase- and Nifll-related precursor family. BMC Biol. 8, 70.

16. Velasquez J.E.,van der Donk W.A. 2011. Genome mining for ribosomally synthesized natural products. CurrOpin Chem Biol. 15,11-21.

17. Yorgey P., Lee J., Kordel J., Vivas E., Warner P., Jebaratnam D., Kolter R. 1994. Posttranslational modifications in microcin B17 define an additional class of DNA gyrase inhibitor. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 4519-23.

18. Garrido M.C., Herrero M., Kolter R., Moreno F. 1988. The export of the DNA replication inhibitor Microcin B17 provides immunity for the host cell. EMBO J. 7,1853-62.

19. Sinha Roy R., Kelleher N.L., Milne J.C., Walsh C.T. 1999. In vivo processing and antibiotic activity of microcin B17 analogs with varying ring content and altered bisheterocyclic sites. Chem Biol. 6, 305-18.

20. Zamble D.B., McClure C.P., Penner-Hahn J.E., Walsh C.T. 2000. The McbB component of microcin B17 synthetase is a zinc metalloprotein. Biochemistry. 39,16190-9.

21. Ghilarov D., Serebryakova M., Shkundina I., Severinov K. 2011. A major portion of DNA gyrase inhibitor microcin B17 undergoes an N,0-peptidyl shift during synthesis. J Biol Chem. 286, 26308-18.

22. Allali N., Afif H., Couturier M., Van Melderen L. 2002. The highly conserved TldD and TldE proteins of Escherichia coli are involved in microcin B17 processing and in CcdA degradation. J Bacteriol. 184, 3224-31.

23. Sinha Roy R., Belshaw P.J., Walsh C.T. 1998. Mutational analysis of posttranslational heterocycle biosynthesis in the gyrase inhibitor microcin B17: distance dependence from propeptide and tolerance for substitution in a GSCG cyclizable sequence. Biochemistry. 37, 4125-36.

24. Heddle J.G., Blance S.J., Zamble D.B., Hollfelder F., Miller D.A., Wentzell L.M., Walsh C.T., Maxwell A. 2001. The antibiotic microcin B17 is a DNA gyrase poison: characterisation of the mode of inhibition. J Mol Biol. 307, 1223-34.

25. Pierrat O.A.,Maxwell A. 2003. The action of the bacterial toxin microcin B17. Insight into the cleavage-religation reaction of DNA gyrase. J Biol Chem. 278, 35016-23.

26. Pierrat O.A.,Maxwell A. 2005. Evidence for the role of DNA strand passage in the mechanism of action of microcin B17 on DNA gyrase. Biochemistry. 44, 4204-15.

27. Collin F., Thompson R.E., Jolliffe K.A., Payne R.J., Maxwell A. 2013. Fragments of the bacterial toxin microcin B17 as gyrase poisons. PLoS One. 8, e61459.

28. Severinov K., Semenova E., Kazakov A., Kazakov T., Gelfand M.S. 2007. Low-molecular-weight post-translationally modified microcins. Mol Microbiol. 65,1380-94.

29. Cunningham M.W. 2000. Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin Microbiol Rev. 13, 470-511.

30. Todd E.W. 1938. The differentiation of two distinct serological varieties of streptolysin, streptolysin O and streptolysin S. The Journal of Pathology and Bacteriology. 47, 423-445.

31. Molloy E.M., Cotter P.D., Hill C., Mitchell D.A., Ross R.P. 2011. Streptolysin S-like virulence factors: the continuing sagA. Nat Rev Microbiol. 9, 670-81.

32. Betschel S.D., Borgia S.M., Barg N.L., Low D.E., De Azavedo J.C. 1998. Reduced virulence of group A streptococcal Tn916 mutants that do not produce streptolysin S. Infect Immun. 66, 1671-9.

33. Datta v., Myskowski S.M., Kwinn L.A., Chiem D.N., Varki N., Kansal R.G., Kotb M., Nizet V. 2005. Mutational analysis of the group A streptococcal operon encoding streptolysin S and its virulence role in invasive infection. Mol Microbiol. 56, 681-95.

34. Gonzalez D.J., Lee S.W., Hensler M.E., Markley A.L., Dahesh S., Mitchell D.A., Bandeira N., Nizet V., Dixon J.E., Dorrestein P.C. 2010. Clostridiolysin S, a post-translationally modified biotoxin from Clostridium botulinum. J Biol Chem. 285, 28220-8.

35. Chen X.H., Koumoutsi A., Scholz R., Eisenreich A., Schneider K., Heinemeyer I., Morgenstern B., Voss B., Hess W.R., Reva O., Junge H., Voigt B., Jungblut P.R., Vater J., Sussmuth R., Liesegang H., Strittmatter A., Gottschalk G., Borriss R. 2007. Comparative analysis of the complete genome, sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nat Biotechnol. 25,1007-14.

36. Scholz R., Molohon K.J., Nachtigall J., Vater J., Markley A.L., Sussmuth R.D., Mitchell D.A., Borriss R. 2011. Plantazolicin, a novel microcin B17/streptolysin S-like natural product from Bacillus amyloliquefaciens FZB42. J Bacteriol. 193, 215-24.

37. Kalyon B., Helaly S.E., Scholz R., Nachtigall J., Vater J., Borriss R., Sussmuth R.D. 2011. Plantazolicin A and B: structure elucidation of ribosomally synthesized thiazole/oxazole peptides from Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Org Lett. 13, 2996-9.

38. Molohon K.J., Melby J.O., Lee J., Evans B.S., Dunbar K.L., Bumpus S.B., Kelleher N.L., Mitchell D.A. 2011. Structure determination and interception of biosynthetic intermediates for the plantazolicin class of highly discriminating antibiotics. ACS Chem Biol. 6,1307-13.

39. Onaka H., Tabata H., Igarashi Y., Sato Y., Furumai T. 2001. Goadsporin, a chemical substance which promotes secondary metabolism and morphogenesis in streptomycetes. I. Purification and characterization. J Antibiot (Tokyo). 54,1036-44.

40. Onaka H. 2009. Biosynthesis of indolocarbazole and goadsporin, two different heterocyclic antibiotics produced by actinomycetes. Biosci Biotechnol Biochem. 73, 2149-55.

41. Donia M.S., Ravel J., Schmidt E.W. 2008. A global assembly line for cyanobactins. Nat Chem Biol. 4, 341-3.

42. Schmidt E.W.,Donia M.S. 2009. Chapter 23. Cyanobactin ribosomally synthesized peptides-a case of deep metagenome mining. Methods Enzymol. 458, 575-96.

43. Schmidt E.W., Nelson J.T., Rasko D.A., Sudek S., Eisen J.A., Haygood M.G., Ravel J. 2005. Patellamide A and C biosynthesis by a microcin-like pathway in Prochloron didemni, the cyanobacterial symbiont of Lissoclinum patella. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 7315-20.

44. Agarwal V., Pierce E., Mcintosh J., Schmidt E.W., Nair S.K. 2012. Structures of cyanobactin maturation enzymes define a family of transamidating proteases. Chem Biol. 19,1411-22.

45. Jian X.H., Pan H.X., Ning T.T., Shi Y.Y., Chen Y.S., Li Y., Zeng X.W., Xu J., Tang G.L. 2012. Analysis of YM-216391 biosynthetic gene cluster and improvement of the cyclopeptide production in a heterologous host. ACS Chem Biol. 7, 646-51.

46. Sivonen K., Leikoski N., Fewer D.P., Jokela J. 2010. Cyanobactins-ribosomal cyclic peptides produced by cyanobacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 86,1213-25.

47. Ishida K., Matsuda H., Murakami M., Yamaguchi K. 1997. Kawaguchipeptin B, an antibacterial cyclic undecapeptide from the cyanobacterium Microcystis aeruginosa. J Nat Prod. 60, 724-6.

48. Williams A.B.Jacobs R.S. 1993. A marine natural product, patellamide D, reverses multidrug resistance in a human leukemic cell line. Cancer Lett. 71, 97-102.

49. Salvatella X., Caba J.M., Albericio F., Giralt E. 2003. Solution structure of the antitumor candidate trunkamide A by 2D NMR and restrained simulated annealing methods. J Org Chem. 68, 211-5.

50. Leikoski N., Fewer D.P., Jokela J., Alakoski P., Wahlsten M., Sivonen K. 2012. Analysis of an inactive cyanobactin biosynthetic gene cluster leads to discovery of new natural products from strains of the genus Microcystis. PLoS One. 7, e43002.

51. Donia M.S.,Schmidt E.W. 2011. Linking chemistry and genetics in the growing cyanobactin natural products family. Chem Biol. 18, 508-19.

52. Mcintosh J.A., Donia M.S., Nair S.K., Schmidt E.W. 2011. Enzymatic basis of ribosomal peptide prenylation in cyanobacteria. J Am Chem Soc. 133,13698-705.

53. Leikoski N., Fewer D.P., Jokela J., Wahlsten M., Rouhiainen L., Sivonen K. 2010. Highly diverse cyanobactins in strains of the genus Anabaena. Appl Environ Microbiol. 76, 701-9.

54. Donia M.S., Hathaway B.J., Sudek S., Haygood M.G., Rosovitz M.J., Ravel J., Schmidt E.W. 2006. Natural combinatorial peptide libraries in cyanobacterial symbionts of marine ascidians. Nat Chem Biol. 2, 729-35.

55. Mcintosh J.A., Robertson C.R., Agarwal V., Nair S.K., Bulaj G.W., Schmidt E.W. 2010. Circular logic: nonribosomal peptide-like macrocyclization with a ribosomal peptide catalyst. J Am Chem Soc. 132,15499-501.

56. Fu X., Do T., Schmitz F.J., Andrusevich V., Engel M.H. 1998. New cyclic peptides from the ascidian Lissoclinum patella. J Nat Prod. 61,1547-51.

57. Bagley M.C., Dale J.W., Merrltt E.A., Xiong X. 2005. Thiopeptide antibiotics. Chem Rev. 105, 685-714.

58. Carnio M.C., Holtzel A., Rudolf M., Henle T., Jung G., Scherer S. 2000. The macrocyclic peptide antibiotic micrococcin P(l) is secreted by the food-borne bacterium Staphylococcus equorum WS 2733 and inhibits Listeria monocytogenes on soft cheese. Appl Environ Microbiol. 66, 2378-84.

59. Fuller A.T. 1955. A new antibiotic of bacterial origin. Nature. 175, 722.

60. Su T.L. 1948. Micrococcin, an antibacterial substance formed by a strain of Micrococcus. Br J Exp Pathol. 29, 473-81.

61. Dutcher J.D.,Vandeputte J. 1955. Thiostrepton, a new antibiotic. II. Isolation and chemical characterization. Antibiot Annu. 3, 560-1.

62. Liao R., Duan L., Lei C., Pan H., Ding Y., Zhang Q., Chen D., Shen B., Yu Y., Liu W. 2009. Thiopeptide biosynthesis featuring ribosomally synthesized precursor peptides and conserved posttranslational modifications. Chem Biol. 16,141-7.

63. Heffron S.E.,Jurnak F. 2000. Structure of an EF-Tu complex with a thiazolyl peptide antibiotic determined at 2.35 A resolution: atomic basis for GE2270A inhibition of EF-Tu. Biochemistry. 39, 37-45.

64. Parmeggiani A., Krab I.M., Okamura S., Nielsen R.C., IMyborg J., Nissen P. 2006. Structural basis of the action of pulvomycin and GE2270 A on elongation factor Tu. Biochemistry. 45, 6846-57.

65. Hensens O.D.,Albers-Schonberg G. 1978. Total structure of the peptide antibiotic components of thiopeptin by 1H and 13C NMR spectroscopy. Tetrahedron Letters. 19, 3649-3652.

66. Puar M.S., Ganguly A.K., Afonso A., Brambilla R., Mangiaracina P., Sarre O., MacFarlane R.D. 1981. Sch 18640. A new thiostrepton-type antibiotic. Journal of the American Chemical Society. 103, 5231-5233.

67. Nishimura H., Kimura T., Tawara K., Sasaki K., Nakajima K., Shimaoka N., Okamoto S., Shimohira M., Isono J. 1957. Aburamy cin, a new antibiotic. J Antibiot (Tokyo). 10, 205-12.

68. Puar M.S., Chan T.M., Hegde V., Patel M., Bartner P., Ng K.J., Pramanik B.N., MacFarlane R.D. 1998. Sch 40832: a novel thiostrepton from Micromonospora carbonacea. J Antibiot (Tokyo). 51, 221-4.

69. Benazet F., Cartier M., Florent J., Godard C., Jung G., Lunel J., Mancy D., Pascal C., Renaut J., Tarridec P., Theilleux J., Tissier R., Dubost M., Ninet L. 1980. Nosiheptide, a sulfur-containing peptide antibiotic isolated from Streptomyces actuosus 40037. Experientia. 36, 414-6.

70. Lentzen G., Klinck R.; Matassova N., Aboul-ela F., Murchie A.I. 2003. Structural basis for contrasting activities of ribosome binding thiazole antibiotics. Chem Biol. 10, 769-78.

71. Porse B.T., Cundliffe E., Garrett R.A. 1999. The antibiotic micrococcin acts on protein Lll at the ribosomal GTPase centre. J Mol Biol. 287, 33-45.

72. Baumann S., Schoof S., Bolten M., Haering C., Takagi M„ Shin-ya K., Arndt H.D. 2010. Molecular determinants of microbial resistance to thiopeptide antibiotics. J Am Chem Soc. 132, 6973-81.

73. Rodnina M.V., Savelsbergh A., Matassova N.B., Katunin V.I., Semenkov Y.P., Wintermeyer W. 1999. Thiostrepton inhibits the turnover but not the GTPase of elongation factor G on the ribosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9586-90.

74. Harms J.M., Wilson D.N., Schluenzen F., Connell S.R., Stachelhaus T., Zaborowska Z., Spahn C.M., Fucini P. 2008. Translational regulation via Lll: molecular switches on the ribosome turned on and off by thiostrepton and micrococcin. Mol Cell. 30, 26-38.

75. Anborgh P.H.,Parmeggiani A. 1991. New antibiotic that acts specifically on the GTP-bound form of elongation factor Tu. EMBOJ. 10, 779-84.

76. Mizuhara N., Kuroda M., Ogita A., Tanaka T., Usuki Y., Fujita K. 2011. Antifungal thiopeptide cyclothiazomycin B1 exhibits growth inhibition accompanying morphological changes via binding to fungal cell wall chitin. Bioorg Med Chem. 19, 5300-10.

77. Aoki M., Ohtsuka T., Yamada M., Ohba Y., Yoshizaki H., Yasuno H., Sano T., Watanabe J., Yokose K., Seto H. 1991. Cyclothiazomycin, a novel polythiazole-containing peptide with renin inhibitory activity. Taxonomy, fermentation, isolation and physico-chemical characterization. J Antibiot (Tokyo). 44, 582-8.

78. Morris R.P., Leeds J.A., Naegeli H.U., Oberer L., Memmert K., Weber E., LaMarche M.J., Parker C.N., Burrer N., Esterow S., Hein A.E., Schmitt E.K., Krastel P. 2009. Ribosomally synthesized thiopeptide antibiotics targeting elongation factor Tu. J Am Chem Soc. 131, 5946-55.

79. Yu Y., Duan L., Zhang Q., Liao R., Ding Y., Pan H.; Wendt-Pienkowski E., Tang G., Shen B., Liu W. 2009. Nosiheptide biosynthesis featuring a unique indole side ring formation on the characteristic thiopeptide framework. ACS Chem Biol. 4, 855-64.

80. Wieland Brown L.C., Acker M.G., Clardy J., Walsh C.T., Fischbach M.A. 2009. Thirteen posttranslational modifications convert a 14-residue peptide into the antibiotic thiocillin. Proc Natl Acad Sci USA. 106; 2549-53.

81. Wang J., Yu Y., Tang K., Liu W., He X., Huang X., Deng Z. 2010. Identification and analysis of the biosynthetic gene cluster encoding the thiopeptide antibiotic cyclothiazomycin in Streptomyces hygroscopicus 10-22. Appl Environ Microbiol. 76, 2335-44.

82. Bowers A.A., Walsh C.T., Acker M.G. 2010. Genetic interception and structural characterization of thiopeptide cyclization precursors from Bacillus cereus. J Am Chem Soc. 132, 12182-4.

83. Young T.S.,Walsh C.T. 2011. Identification of the thiazolyl peptide GE37468 gene cluster from Streptomyces ATCC 55365 and heterologous expression in Streptomyces lividans. Proc Natl Acad Sci USA. 108,13053-8.

84. Waisvisz J.M., van der Hoeven M.G., van Peppen J., Zwennis W.C.M. 1957. Bottromycin. I. A New Sulfur-containing Antibiotic. Journal of the American Chemical Society. 79, 4520-4521.

85. Takahashi Y., Naganawa H., Takita T., Umezawa H., Nakamura S. 1976. The revised structure of bottromycin A2.JAntibiot (Tokyo). 29, 1120-3.

86. Schipper D. 1983. The revised structure of bottromycin A2. J Antlbiot (Tokyo). 36,1076-7.

87. Shimamura H., Gouda H., Nagai K., Hirose T., Ichioka M., Furuya Y., Kobayashi Y., Hirono S., Sunazuka T., Omura S. 2009. Structure determination and total synthesis of bottromycin A2: a potent antibiotic against MRSA and VRE. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 914-7.

88. Gouda H., Kobayashi Y., Yamada T., Ideguchi T., Sugawara A., Hirose T., Omura S., Sunazuka T., Hirono S. 2012. Three-dimensional solution structure of bottromycin A2: a potent antibiotic active against methicillin-resistant Staphylococcus aureus and vancomycin-resistant Enterococci. Chem Pharm Bull (Tokyo). 60,169-71.

89. Waisvisz J.M., van der Hoeven M.G., Nijenhuis B.t. 1957. The Structure of the Sulfur-containing Moiety of Bottromycin. Journal of the American Chemical Society. 79, 45244527.

90. Tokuyama H., Yokoshima S., Yamashita T., Fukuyama T. 1998. A novel ketone synthesis by a palladium-catalyzed reaction of thiol esters and organozinc reagents. Tetrahedron Letters. 39, 3189-3192.

91. Kobayashi Y., Ichioka M., Hirose T., Nagai K., Matsumoto A., Matsui H., Hanaki H., Masuma R., Takahashi Y., Omura S., Sunazuka T. 2010. Bottromycin derivatives: efficient chemical modifications of the ester moiety and evaluation of anti-MRSA and anti-VRE activities. Bioorg Med Chem Lett. 20, 6116-20.

92. Otaka T.,Kaji A. 1976. Mode of action of bottromycin A2. Release of aminoacyl- or peptidyl-tRNA from ribosomes. J Biol Chem. 251, 2299-306.

93. Otaka T.,Kaji A. 1981. Mode of action of bottromycin A2: effect on peptide bond formation. FEBS Lett. 123, 173-6.

94. Otaka T.,Kaji A. 1983. Mode of action of bottromycin A2: effect of bottromycin A2 on polysomes. FEBS Lett. 153, 53-9.

95. Huo L., Rachid S., Stadler M., Wenzel S.C., Muller R. 2012. Synthetic biotechnology to study and engineer ribosomal bottromycin biosynthesis. Chem Biol. 19,1278-87.

96. Crone W.J.K., Leeper F.J., Truman A.W. 2012. Identification and characterisation of the gene cluster for the anti-MRSA antibiotic bottromycin: expanding the biosynthetic diversity of ribosomal peptides. Chemical Science. 3, 3516-3521.

97. Gomez-Escribano J.P., Song L., Bibb M.J., Challis G.L. 2012. Posttranslational [small beta]-methylation and macrolactamidination in the biosynthesis of the bottromycin complex of ribosomal peptide antibiotics. Chemical Science. 3, 3522-3525.

98. Hou Y., Tianero M.D., Kwan J.C., Wyche T.P., Michel C.R., Ellis G.A., Vazquez-Rivera E., Braun D.R., Rose W.E., Schmidt E.W., Bugni T.S. 2012. Structure and biosynthesis of the antibiotic bottromycin D. Org Lett. 14, 5050-3.

99. Tanaka N., Nishimura T., Nakamura S., Umezawa H. 1966. Biological studies on bottromycin A and its hydrazide. J Antibiot (Tokyo). 19,149-54.

100. Inoue M., Shinohara N., Tanabe S., Takahashi T., Okura K., Itoh H., Mizoguchi Y., lida M., Lee N., Matsuoka S. 2010. Total synthesis of the large non-ribosomal peptide polytheonamide B. Nat Chem. 2, 280-5.

101. Mcintosh J.A., Donia M.S., Schmidt E.W. 2009. Ribosomal peptide natural products: bridging the ribosomal and nonribosomal worlds. Nat Prod Rep. 26, 537-59.

102. Wang H., Fewer D.P., Sivonen K. 2011. Genome mining demonstrates the widespread occurrence of gene clusters encoding bacteriocins in cyanobacteria. PLoS One. 6, e22384.

103. Kersten R.D., Yang Y.L., Xu Y., Cimermancic P., Nam S.J., Fenical W., Fischbach M.A., Moore B.S., Dorrestein P.C. 2011. A mass spectrometry-guided genome mining approach for natural product peptidogenomics. Nat Chem Biol. 7, 794-802.

104. Freeman M.F., Gurgui C., Helf M.J., Morinaka B.I., Uria A.R., Oldham N.J., Sahl H.G., Matsunaga S., Piel J. 2012. Metagenome mining reveals polytheonamides as posttranslationally modified ribosomal peptides. Science. 338, 387-90.

105. Deane C.D., Melby J.O., Molohon K.J., Susarrey A.R., Mitchell D.A. 2013. Engineering Unnatural Variants of Piantazolicin through Codon Reprogramming. ACS Chem Biol.

106. Lee J., Hao Y., Blair P.M., Melby J.O., Agarwal V., Burkhart B.J., Nair S.K., Mitchell D.A. 2013. Structural and functional insight into an unexpectedly selective N-methyltransferase involved in piantazolicin biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110,12954-9.

107. Dunbar K.L.,Mitchell D.A. 2013. Insights into the mechanism of peptide cyclodehydrations achieved through the chemoenzymatic generation of amide derivatives. J Am Chem Soc. 135, 8692-701.

108. Miller J.H. 1972. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory. 0,

109. Datsenko K.A.,Wanner B.L. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6640-5.

110. Stover C.K., Pham X.Q., Erwin A.L., Mizoguchi S.D., Warrener P., Hickey M.J., Brinkman F.S., Hufnagle W.O., Kowalik D.J., Lagrou M., Garber R.L., Goltry L., Tolentino E., Westbrock-Wadman S., Yuan Y., Brody L.L., Coulter S.N., Folger K.R., Kas A., Larbig K., Lim R., Smith K., Spencer D., Wong G.K., Wu Z., Paulsen I.T., Reizer J., Saier M.H., Hancock R.E., Lory S., Olson M.V. 2000. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAOl, an opportunistic pathogen. Nature. 406, 959-64.

111. Joardar V., Lindeberg M., Jackson R.W., Selengut J., Dodson R., Brinkac L.M., Daugherty S.C., Deboy R., Durkin A.S., Giglio M.G., Madupu R., Nelson W.C., Rosovitz M.J., Sullivan S., Crabtree J., Creasy T., Davidsen T., Haft D.H., Zafar N., Zhou L., Halpin R., Holley T., Khouri H., Feldblyum T., White O., Fraser C.M., Chatterjee A.K., Cartinhour S., Schneider D.J., Mansfield J., Collmer A., Buell C.R. 2005. Whole-genome sequence analysis of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A reveals divergence among pathovars in genes involved in virulence and transposition. J Bacteriol. 187, 6488-98.

112. 113.

114.

115.

116.

117.

118.

119.

120.

Feil H., Feil W.S., Chain P., Larimer F., DiBartolo G., Copeland A., Lykidis A., Trong S.; Nolan M., Goltsman E., Thiel J., Malfatti S., Loper J.E., Lapidus A., Detter J.C., Land M., Richardson P.M., Kyrpides N.C., Ivanova N., Lindow S.E. 2005. Comparison of the complete genome sequences of Pseudomonas syringae pv. syringae B728a and pv. tomato DC3000. Proc Natl Acad Sei US A. 102, 11064-9.

Buell C.R., Joardar V., Lindeberg M., Selengut J., Paulsen I.T., Gwinn M.L., Dodson R.J., Deboy R.T., Durkin A.S., Kolonay J.F., Madupu R., Daugherty S., Brinkac L., Beanan M.J., Haft D.H., Nelson W.C., Davidsen T., Zafar N., Zhou L., Liu J., Yuan Q., Khouri H., Fedorova N., Tran B., Russell D., Berry K., Utterback T., Van Aken S.E., Feldblyum T.V., D'Ascenzo M., Deng W.L., Ramos A.R., Alfano J.R., Cartinhour S., Chatterjee A.K., Delaney T.P., Lazarowitz S.G., Martin G.B., Schneider D.J., Tang X., Bender C.L., White O., Fräser C.M., Collmer A. 2003. The complete genome sequence of the Arabidopsis and tomato pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Proc Natl Acad Sei U S A. 100,10181-6. Inoue H., Nojima H., Okayama H. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with Plasmids. Gene. 96, 23-8.

Horton R.M., Hunt H.D., Ho S.N., Pullen J.K., Pease L.R. 1989. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-8. Reece R.J.,Maxwell A. 1991. Probing the limits of the DNA breakage-reunion domain of the Escherichia coli DNA gyrase A protein. J Biol Chem. 266, 3540-6.

Moreno F., Gonzalez-Pastor J.E., Baquero M.R., Bravo D. 2002. The regulation of microcin B, C and J operons. Biochimie. 84, 521-9.

Beishaw P.J., Roy R.S., Kelleher N.L., Walsh C.T. 1998. Kinetics and regioselectivity of peptide-to-heterocycle conversions by microcin B17 synthetase. Chem Biol. 5, 373-84. Han M.J., Lee S.Y., Hong S.H. 2012. Comparative analysis of envelope proteomes in Escherichia coli B and K-12 strains. J Microbiol Biotechnol. 22, 470-8. Lavina M., Pugsley A.P., Moreno F. 1986. Identification, mapping, cloning and characterization of a gene (sbmA) required for microcin B17 action on Escherichia coli K12. J Gen Microbiol. 132,1685-93.

Vizan J.L., Hernandez-Chico C., del Castillo I., Moreno F. 1991. The peptide antibiotic microcin B17 induces double-strand cleavage of DNA mediated by E. coli DNA gyrase. EMBOJ. 10, 467-76.