Структурно-функциональный анализ ингибитора ДНК-гиразы микроцина Б тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.07, кандидат биологических наук Гиляров, Дмитрий Алексеевич

• Гиляров, Дмитрий Алексеевич
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гиляров, Дмитрий Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость работы

Публикации и апробация работы

Структура и объем работы

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ i. ДНК-топоизомеразы и их функции в клетке

ДНК-топоизомеразы типа 1А обратная гираза

ДНК-топоизомеразы типа 1В

ДНК-топоизомеразы II типа

Инициация репликации

Репликация ДНК

Транскрипция

Рекомбинация ДНК

Топоизомеразы и организация хроматина

II. Ингибиторы ДНК-топоизомераз 30 Камптотецин и другие ингибиторы топоизомеразы I 30 Хинолоны 33 Кумарины 36 циклотиалидины 37 Аминобензимидазолы 38 Симоциклиноны 38 клероцидин 39 дистамицин А и другие вещества, связывающиеся с малой бороздкой ДНК 40 Ш>В 41 бУй! 42 Микроцин Б

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оборудование

Расходные материалы

Реактивы и ферменты буферные растворы

Микробиологические среды

Бактериальные штаммы получение релаксированной ДНК для определения активности ДНК-гиразы in vitro

Опыт по расщеплению ДНК ДНК-гиразой IN VITRO выделение микроцина из клеток Е. сои и ВЭЖХ-анализ

Масс-спектрометрический анализ (МАЛДИ итандемная МС)

Химические модификации микроцина Б

Определение антибактериальной активности антибиотиков и демонстрация SOS-otbeta

Сайт-специфический мутагенез

Электрофорез ДНК в агарозном геле

Лигирование продукта амплификации в плазмидные вектора

Рестрикция

Приготовление химически компетентных клеток Е. сои

Трансформация замороженных компетентных клеток Е. сои

Анализ колоний Е.сои

Выделение плазмидной ДНК (минипреп)

Секвенирование

Переосаждение ДНК спиртом

Экстракция ДНК фенолом ингибирование репликации в пермеабилизованных клетках Е. COLI

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ характеризация выделяемого из клеток микроцина Б химические модификации микроцина Б

Щелочной гидролиз модифицированного по Ser52 микроцина подтверждает наличие сложноэфирной связи в микроцине «X»

Биологическая активность вещества X и переход X->N

Направленный мутагенез микроцина Б

Структурно-функциональный анализ микроцина Б

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональный анализ ингибитора ДНК-гиразы микроцина Б»

Актуальность работы

ДНК-топоизомеразы управляют топологическим? состоянием ДНК и; делают возможным протеканиегфундаментальных, клеточных процессов, таких какрепликация, транскрипция и сегреграция хромосом. Изучение ингибиторов топоизомераз.важно как с точки.зрения понимания:механизмов действия этих ферментов; так и. для., разработки новых лекарств. Топоизомераза II человека является мишенью противоопухолевых препаратов, а бактериальнаягтопоизомераза П типа - ДНК-гираза - является мишенью фторхинолонов, наиболее мощных из используемых - в настоящее время антибиотиков широкого - спектра» действия; Поиск; изучение и целенаправленное создание? новых ингибиторов ДНК-топоизомераз является важной научной задачей.

Данная работа посвящена исследованию природного пептидного антибиотика; микроцина Б. Гены, отвечающие за продукцию и устойчивость к микроцину; Б закодированы на плазмиде; присутствующей в некоторых штаммах £. со//'. Антибиотик, обладает1 бактерицидным- действием. и> активен: в» отношении: большинства грамотрицательных бактерий! Зрелый микроцин представляет собой 47-аминокислотный пептид, пост-трансляционно модифицированный» с помощью специального ферментативного! комплекса. Эти-модификации включают в себя циклизации остатков^ серина и цистеина, приводящие кпоявлению ароматических оксазольных'и тиазольных: гетероциклов в составе молекулы. Такой: тип модификации является широко распространенным в природе и за последние несколько лет было выявлено: множество; классов природных соединений, синтезируемых на рибосомах: и модифицируемых аналогичным образом. Выбор: аминокислот,, подвергаемых: циклизации определяется; контекстом, тем: не менее, подробности этого процесса остаются загадкой. Мишенью' микроцина Б является ДНК-гираза. Связывание микроцина с комплексом гираза-ДНК приводите ингибированию реакции; переноса участка сверхспирализованной-ДНК черех двуцепочечный разрыв, образуемый ДНК-гиразой. Накопление двухцепоченых разрывов приводит к остановке репликации ДНК и к гибели бактериальной клетки. Точный механизм ингибирования ДНК-гиразы микроцином Б неизвестен, также как и район ДНК-гиразы, с которым взаимодействует микроцин.

Цели и задачи исследования

Целью работы являлось проведение структурно-функционального анализа микроцина Б.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1) Охарактеризовать естественное природное разнообразие форм микроцина Б;

2) Исследовать значение двойных тиазол-оксазольных гетероциклов для функционирования микроцина Б;

3) Определить минимальный фрагмент микроцина Б, способный подавлять рост клеток и ингибировать ДНК-гиразу.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые было установлено, что большая часть выделяемого из клеток зрелого микроцина Б несет ранее неизвестную модификацию - сложноэфирную связь, соединяющую аминокислотные остатки 51 и 52. Эта модификация является результатом РОО-пептидил изомеризации остатка Бег52, находящегося непосредственно за одним из тиазольных гетероциклов в составе микроцина. Сложноэфирная связь является одним из продуктов' работы ферментного комплекса, в норме осуществляющего циклизацию остатков серина и цистеина в составе микроцина. Этот результат представляет большой интерес для понимания процессов, приводящих к синтезу ароматических гетероциклов в подобных микроцину природных соединениях.

Впервые с помощью исчерпывающего ПЦР-мутагенеза были систематически проанализированы синтез гетероциклов и их функциональная роль, для чего было получено около сотни генетически модифицированных пептидов. Полученные результаты существенно дополняют известные данные и прямо указывают на неполноту существующих представлений о работе синтетазного комплекса, модифицирующего микроцин Б. Понимание функционирования McbBCD синтетазного комплекса позволит создавать генно-инженерным путем принципиально новые биологически активные вещества и является актуальной задачей большой практической и научной значимости. Полученные в результате работы химически модифицированные производные микроцина Б могут быть в дальнейшем использованы для детальной характеризации взаимодействия пептида с гиразой.

Публикации и апробация работы

По результатам диссертационной работы было опубликовано 8 печатных работ, в том числе 1 статья в международном рецензируемом журнале и 7 тезисов международных конференций. Основные положения и результаты работы были представлены на следующих конференциях: 1) «ТОРО-2008», July 20-24, 2008, Norwich, UK; 2) Первый Международный форум по нанотехнологиям «Rusnanotech-2008», 3-5 декабря, 2008, Москва, Россия; 3) «FEMS-2009», June 28-July 02, 2009, Gothenburg, Sweden; 4) «34th FEBS Congress», July 4-9, 2009, Prague, Czech Republic; 5) Второй Международный форум-по нанотехнологиям «Rusnanotech-2009», Oct. 6-8, 2009, Москва, Россия; 6) «International Congress of Young Scientists», April 13-14, 2010, Yerevan, Armenia; 7) «36th FEBS Congress», June 20-25, 2011, Turin, Italy.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждений, заключения, а также выводов, благодарностей и списка литературы. Работа изложена на 97 страницах машинописного текста, включая 26 рисунков и 1 таблицу. Список цитируемых литературных источников включает 146 наименований.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная генетика», Гиляров, Дмитрий Алексеевич

Выводы

1. Обнаружены новые природные варианты микроцина Б, содержащие сложноэфирные связи.

2. Показано, что остатки серина в составе трипептидов ^у-СуБ-Бег в составе микроцина Б подвергаются ранее неизвестной для данного вещества модификации - Г\1-0-пептидильному сдвигу.

3. Систематически проанализировано влияние мутаций в двойных гетероциклах на продукцию и антимикробную активность микроцина Б.

4. Продемонстрировано, что в процессе гетероциклизации остатков Бег и Суэ могут участвовать карбонильные атомы аминокислотных остатков, отличных от Оу.

5. Определены минимальные фрагменты микроцина Б, способные проникать в клетки и способные ингибировать ДНК-гиразу.

Благодарности

Автор выражает признательность своему научному руководителю — Константину Викторовичу Северинову, коллегам - Ирине Шкундиной, Галине Пашвыкиной, Светлане Дубилей и Александру Ершову, а также всему коллективу лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ИБГ РАН и группы регуляции генов мобильных элементов прокариот ИМГ РАН. Автор благодарит Марину Серебрякову и Тимофея Зацепина за консультации по методам масс-спектрометрии, ВЭЖХ и химической модификации пептидов. Автор поддержан программой «У.М.Н.И.К» Фонда содействию развития малых форм предприятий в научно-технической сфере.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в журналах

1. Ghilarov Р. Serebryakova М., Shkundina I. and Severinov К. A major portion of DNA gyrase inhibitor microcin В undergoes an N,0-peptidyl shift during synthesis. J BlolChem, 2011, 286, 26308-26318

Тезисы докладов международных конференций

1. Ghilarov Р. Serebryakova М., Shkundina I, Severinov К. A major portion of PNA gyrase inhibitor microcin В undergoes an N,0-peptidyl shift during synthesis. Abstract book of the 36th FEBS Congress, Turin, Italy, June 25-30, 2011

2. I. Shkundina, P. Ghilarov, A. Ershov, G. Pashvikina, and K. Severinov. Structure-function analysis of Microcin B17. The New Armenian Medical Journal 4 (1), pp. 130-131 - Abstracts of the International Congress of Young Scientists, April 13-14, 2010, Yerevan, Armenia

3. Д.А. Гиляров, Г.В. Пашвыкина, A.H. Ершов, И.С. Шкундина. Структурно-функциональный анализ пептидного антибиотика микроцина В17. Сборник тезисов докладов участников Второго международного конкурса научных работ молодых ученых в рамках международного форума по нанотехнологиям Rusnanotech 2009, 6-8 октября 2009. Секция 17 «Биологические молекулярные машины», стр. 3-5

4. I. Shkundina, P. Ghilarov. A. Ershov, and К. Severinov. Structure-function analysis of Microcin B17. Late Abstract Book of the 34th FEBS Congress, pp 58-59, Prague, Chezh Republic, July 4-9, 2009.

5. I. Shkundina, P. Ghilarov, A. Ershov, and K. Severinov. Structure-function analysis of Microcin B17. Compact disc of FEMS 2009, 3rd Congress of European Microbiologists, Gothenburg, Sweden, June 28-July 2, 2009.

6. Гиляров Д. А. Пашвыкина Г. В., Шкундина И. С. Создание новых эффективных ингибиторов ДНК-топоизомераз с помощью молекулярной машины процессинга промикроцина В. Сборник тезисов докладов участников международного конкурса научных работ молодых ученых в рамках международного форума по нанотехнологиям Rusnanotech 2008, 3-5 декабря 2008. Секция 8 «Биологические молекулярные машины»

7. I. Shkundina, D. Ghilarov. and К. Severinov. Mutational analysis of Microcin B17. Abstract book of the Conference "DNA Topoisomerases in biology and medicine", Norwich, United Kingdom, July 20-24, 2008

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гиляров, Дмитрий Алексеевич, 2011 год

1. Norrby, R., et al., The bacterial challenge: time to react. ECDC/EMEA Joint Technical Report, 2009.

2. Fischbach, M.A. and C.T. Walsh, Antibiotics for Emerging Pathogens. Science, 2009. 325(5944): p. 1089-1093.

3. Melby, J.O., N.J. Nard, and D.A. Mitchell, Thiazole/oxazole-modified microcins: complex natural products from ribosomal templates. Current Opinion in Chemical Biology, 2011. 15(3): p. 369-378.

4. Mitchell, D.A., et al., Structural and Functional Dissection of the Heterocyclic Peptide Cytotoxin Streptolysin S. Journal of Biological Chemistry, 2009. 284(19): p. 13004-13012.

5. Morris, R.P., et al., Ribosomally Synthesized Thiopeptide Antibiotics Targeting Elongation Factor Tu. Journal of the American Chemical Society, 2009.131(16): p. 5946-5955.

6. Onaka, H., et al., Cloning and characterization of the goadsporin biosynthetic gene cluster from Streptomyces sp. TP-A0584. Microbiology, 2005.151(12): p. 3923-3933.

7. Molloy, E.M., et al., Streptolysin S-like virulence factors: the continuing sagA. Nat Rev Micro, 2011. 9(9): p. 670-681.

8. Walsh, C.T., M.G. Acker, and A.A. Bowers, Thiazolyl Peptide Antibiotic Biosynthesis: A Cascade of Post-translational Modifications on Ribosomal Nascent Proteins. Journal of Biological Chemistry, 2010. 285(36): p. 27525-27531.

9. Mcintosh, J.A. and E.W." Schmidt, Marine Molecular Machines: Heterocyclization in Cyanobactin Biosynthesis. ChemBioChem, 2010.11(10): p. 1413-1421.

10. Gonzalez, DJ., et al., Clostridiolysin S, a Post-translationally Modified Biotoxin from» Clostridium botulinum. Journal of Biological Chemistry, 2010. 285(36): p. 28220-28228.

11. Wieland Brown, L.C., et al., Thirteen posttranslational modifications convert a 14-residue ■ peptide into the antibiotic thiocillin. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009.106(8): p. 2549-2553.

12. Scholz, R., et al., Plantazolicin, a Novel Microcin B17/Streptoiysin S-Like Natural Product from Bacillus amyloliquefaciens FZB42. J. Bacterid., 2011.193(1): p. 215-224.

13. Oman, T.J. and W.A. van der Donk, Follow the leader: the use of leader peptides to guide natural product biosynthesis. Nat Chem Biol, 2010. 6(1): p. 9-18.

14. Li, Y.-M., et al., From Peptide Precursors to Oxazole and Thiazole-Containing Peptide Antibiotics: Microcin B17Synthase. Science, 1996. 274(5290): p. 1188-1193.

15. Kelleher, N.L., C.L. Hendrickson, and C.T. Walsh, Posttranslational Heterocyclization of Cysteine and Serine Residues in the Antibiotic Microcin B17: Distributivity and Directionalityt. Biochemistry, 1999. 38(47): p. 15623-15630.

16. Milne, J.C., et al., Cofactor Requirements and Reconstitution Of Microcin B17 Synthetase: A Multienzyme Complex that Catalyzes the Formation of Oxazoles and Thiazoles in the Antibiotic Microcin B17t. Biochemistry, 1999. 38(15): p. 4768-4781.

17. Herrero, M. and F. Moreno, Microcin B17 Blocks DNA Replication and Induces the SOS System In Escherichia coli. Journal of General Microbiology, 1986.132(2): p. 393-402.

18. Yorgey, P., et al., Posttranslational modifications in microcin B17 define an additional class of DNA gyrase inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1994. 91(10): p. 4519-4523.

19. Allali, N., et al., The Highly Conserved TldD and TldE Proteins of Escherichia coli Are Involved in Microcin B17 Processing and in CcdA Degradation. J. Bacteriol., 2002. 184(12): p. 3224-3231.

20. Heddle, J.G., et al., The antibiotic microcin B17 is a DNA gyrase poison: characterisation of the mode of inhibition. Journal of Molecular Biology, 2001. 307(5): p. 1223-1234.

21. Pierrat, O.A. and A. Maxwell, The Action of the Bacterial Toxin Microcin B17. Journal of Biological Chemistry, 2003. 278(37): p. 35016-35023.

22. Pierrat, O.A. and A. Maxwell, Evidence for the Role of DNA Strand Passage in the Mechanism of Action of Microcin B17 on DNA Gyrase~i~. Biochemistry, 2005. 44(11): p. 4204-4215.

23. Parks, W.M., et al., The action of the bacterial toxin, microcin B17, on DNA gyrase. Biochimie, 2007. 89(4): p. 500-507.

24. Wang, J.C., Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002. 3(6): p. 430-40.

25. Kirkegaard, K. and J.C. Wang, Bacterial■ DNA topoisomerase I can relax positively supercoiled DNA containing a single-stranded loop. J Mol Biol, 1985.185(3): p. 625-37.

26. Baker, N.M., R. Rajan, and A. Mondragon, Structural studies of type I topoisomerases. Nucleic Acids Res, 2009. 37(3): p. 693-701.

27. Lima, C.D., J.C. Wang, and A. Mondragon, Three-dimensional structure of the 67K N-terminalfragment of E. coli DNA topoisomerase I. Nature, 1994. 367(6459): p. 138-46.

28. Zhang, Z., B. Cheng, and Y.C. Tse-Dinh, Crystal structure of a covalent intermediate in DNA cleavage and rejoining by Escherichia coli DNA topoisomerase I. Proc Natl Acad Sci USA, 2011.108(17): p. 6939-44.

29. Schmidt, B.H., et al., A novel and unified two-metal mechanism for DNA cleavage by type II and IA topoisomerases. Nature. 465(7298): p. 641-4.

30. Dekker, N.H., et al., The mechanism of type IA topoisomerases. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(19): p. 12126-31.

31. Rodriguez, A.C., Studies of a positive supercoiling machine. Nucleotide hydrolysis and a multifunctional "latch" in the mechanism of reverse gyrase. J Biol Chem, 2002. 277(33): p. 29865-73.

32. Ganguly, A., et al., The latch modulates nucleotide and DNA binding to the helicase-like domain of Thermotoga maritima reverse gyrase and is required for positive DNA supercoiling. Nucleic Acids Res. 39(5): p. 1789-800.

33. Champoux, J.J., DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annu Rev Biochem, 2001. 70: p. 369-413.

34. Koster, D.A., et al., Friction and torque govern the relaxation of DNA supercoils by eukaryotic topoisomerase IB. Nature, 2005. 434(7033): p. 671-4.

35. Woo, M.H., et al., Locking the DNA topoisomerase I protein clamp inhibits DNA rotation and induces cell lethality. Proc Natl Acad Sci USA, 2003.100(24): p. 13767-72.

36. Carey, J.F., et al., DNA relaxation by human topoisomerase I occurs in the closed clamp conformation of the protein. Proc Natl Acad Sci USA, 2003.100(10): p. 5640-5.

37. Bates, A.D., J.M. Berger, and A. Maxwell, The ancestral role of ATP hydrolysis in type Ih topoisomerases: prevention of DNA double-strand breaks. Nucleic Acids Res.

38. Rybenkov, V.V., et al., Simplification of DNA topology below equilibrium values by type II topoisomerases. Science, 1997. 277(5326): p. 690-3.

39. Bates, A.D. and A. Maxwell, Energy coupling in type II topoisomerases: why do they hydrolyze ATP? Biochemistry, 2007. 46(27): p. 7929-41.

40. Stuchinskaya, T., et al., How do type II topoisomerases use ATP hydrolysis to simplify DNA topology beyond equilibrium? Investigating the relaxation reaction of nonsupercoiling type II topoisomerases. J Mol Biol, 2009. 385(5): p. 1397-408.

41. Baxter, J., et al. Positive supercoiling of mitotic DNA drives decatenation by topoisomerase II in eukaryotes. Science. 331(6022): p. 1328-32.

42. Dong, K.C. and J.M. Berger, Structural basis for gate-DNA recognition and bending by type IIA topoisomerases. Nature, 2007. 450(7173): p. 1201-5.

43. Liu, L.F. and J.C. Wang, DNA-DNA gyrase complex: the wrapping of the DNA duplex outside the enzyme. Cell, 1978.15(3): p. 979-84.

44. Ruthenburg, A.J., et' al., A superhelical spiral in the Escherichia coli DNA gyrase A C-terminal domain imparts unidirectional supercoiling bias. J Biol Chem, 2005. 280(28): p. 26177-84.

45. Kampranis, S.C. and A. Maxwell, Conversion of DNA gyrase into a conventional type II topoisomerase. Proc Natl Acad Sei USA, 1996. 93(25): p. 14416-21.

46. Kampranis, S.C., A.D. Bates, and A. Maxwell, A model for the mechanism of strand passage by DNA gyrase. Proc Natl Acad Sei USA, 1999. 96(15): p. 8414-9.

47. Ullsperger, C. and N.R. Cozzarelli, Contrasting enzymatic activities of topoisomerase IV and DNA gyrase from Escherichia coli. J Biol Chem, 1996. 271(49): p. 31549-55.

48. Corbett, K.D., et al., The structural basis for substrate specificity in DNA topoisomerase IV. J Mol Biol, 2005. 351(3): p. 545-61.

49. Francine B, P., Protein Splicing of Inteins and Hedgehog Autoproteolysis: Structure, Function, and Evolution. Cell, 1998. 92(1): p. 1-4.

50. Corbett, K.D., P. Benedetti, and J.M. Berger, Holoenzyme assembly and ATP-mediated conformational dynamics of topoisomerase VI. Nat Struct Mol Biol, 2007. 14(7): p. 6119.

51. Rampakakis, E., et al., Replication initiation and DNA topology: The twisted life of the origin. J Cell Biochem. 110(1): p. 35-43.

52. Bermejo, R., et al., Topi- and Top2-mediated topological transitions at replication forks ensure fork progression and stability and prevent DNA damage checkpoint activation. Genes Dev, 2007. 21(15): p. 1921-36.

53. Kegel, A., et al., Chromosome length influences replication-induced topological stress. Nature. 471(7338): p. 392-6.

54. Tadesse, S., et al., Genetic interaction of the SMC complex with topoisomerase IV in Bacillussubtilis. Microbiology, 2005.151(Pt 11): p. 3729-37.

55. Hayama, R. and K.J. Marians, Physical and functional interaction between the condensin MukB and the decatenase topoisomerase IV in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sei USA. 107(44): p. 18826-31.

56. Li, Y., et al., Escherichia coli condensin MukB stimulates topoisomerase IV activity by a direct physical interaction. Proc Natl Acad Sei USA. 107(44): p. 18832-7.

57. Coelho, P.A., J. Queiroz-Machado, and C.E. Sunkel, Condensin-dependent localisation of topoisomerase II to an axial chromosomal structure is required for sister chromatid resolution during mitosis. J Cell Sei, 2003.116(Pt 23): p. 4763-76.

58. Suski, C. and K.J. Marians, Resolution of converging replication forks by RecQ and topoisomerase III. Mol Cell, 2008. 30(6): p. 779-89.

59. Lodge, J.K., T. Kazic, and D.E. Berg, Formation of supercoiling domains In plasmid pBR322. J Bacteriol, 1989.171(4): p. 2181-7.

60. Cook, D.N., et al., Dynamics of DNA supercoiling by transcription in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sei USA, 1992. 89(22): p. 10603-7.

61. Liu, L.F. and J.C. Wang, Supercoiling of the DNA template during transcription. Proc Natl Acad Sei USA, 1987. 84(20): p. 7024-7.

62. Wang, J.C. and A.S. Lynch, Transcription and DNA supercoiling. Curr Opin Genet Dev, 1993. 3(5): p. 764-8.

63. Drolet, M., Growth inhibition mediated by excess negative supercoiling: the interplay between transcription elongation, R-hop formation and DNA topology. Mol Microbiol, 2006. 59(3): p. 723-30.

64. Cook, P.R., The organization of replication and transcription. Science, 1999. 284(5421): p. 1790-5.

65. Vreugde, S., et al., Nuclear myosin VI enhances RNA polymerase ll-dependent transcription. Mol Cell, 2006. 23(5): p. 749-55.

66. Mitchell, J.A. and P. Fraser, Transcription factories are nuclear subcompartments that remain in the absence of transcription. Genes Dev, 2008. 22(1): p. 20-5.

67. Perales, R. and D. Bentley, "Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions. Mol Cell, 2009. 36(2): p. 178-91.

68. French, S.L., et al., Distinguishing the roles of Topoisomerases I and II in relief of transcription-induced torsional stress in yeast rRNA genes. Mol Cell Biol. 31(3): p. 48294.

69. Ju, B.G., et al., A topoisomerase llbeta-mediated dsDNA break required for regulated transcription. Science, 2006. 312(5781): p. 1798-802.

70. Varga-Weisz, P.D., et al., Chromatin-remodelling factor CHRAC contains the ATPases ISWI and topoisomerase II. Nature, 1997. 388(6642): p. 598-602.

71. LeRoy, G., et al., Purification and characterization of a human factor that assembles and remodels chromatin. J Biol Chem, 2000. 275(20): p. 14787-90.

72. Perillo, B., et al., DNA oxidation as triggered by H3K9me2 demethylation drives estrogen-induced gene expression. Science, 2008. 319(5860): p. 202-6.

73. Tsutsui, K.M., et al., Expression dynamics and functional implications of DNA topoisomerase II beta in the brain. Anat Sci Int, 2006. 81(3): p. 156-63.

74. Tsutsui, K., et al., Involvement of DNA topoisomerase llbeta in neuronal differentiation. J Biol Chem, 2001. 276(8): p. 5769-78.

75. Sano, K., et al., Topoisomerase IIOI Activates a Subset of Neuronal Genes that Are Repressed inAT-Rich Genomic Environment. PLoS One, 2008. 3(12): p. e4103.

76. Tuduri, S., et al., Topoisomerase I suppresses genomic instability by preventing interference between replication and transcription. Nat Cell Biol, 2009. 11(11): p. 131524.

77. Durand-Dubief, M., et al., Topoisomerase I regulates open chromatin and controls gene expression in vivo. EMBO J. 29(13): p. 2126-34.

78. Shykind, B.M., et al., Topoisomerase I enhances TFIID-TFIIA complex assembly during activation of transcription. Genes Dev, 1997.11(3): p. 397-407.

79. Dayani, Y., G. Simchen, and M. Lichten, Meiotic Recombination Intermediates Are Resolved with Minimal Crossover Formation during Return-to-Growth, an Analogue of the Mitotic Cell Cycle. PLoS Genet. 7(5): p. el002083.

80. Chen, C.F. and S.J. Brill, Binding and activation of DNA topoisomerase III by the Rmil subunit. J Biol Chem, 2007. 282(39): p. 28971-9.

81. Lai, M.S., et al., Rmil, a member of the Sgsl-Top3 complex in budding yeast, contributes to sister chromatid cohesion. EMBO Rep, 2007. 8(7): p. 685-90.

82. Wu, L. and I.D. Hickson, The Bloom's syndrome helicase suppresses crossing over during homologous recombination. Nature, 2003. 426(6968): p. 870-4.

83. Yang, J., et al., Human topoisomerase lllalpha is a single-stranded DNA decatenase that is stimulated by BLM and RMIl. J Biol Chem. 285(28): p. 21426-36.

84. Plank, J.L., J. Wu, and T.S. Hsieh, Topoisomerase lllalpha and Bloom's helicase can resolve a mobile double Holliday junction substrate through convergent branch migration. Proc Natl Acad Sci USA, 2006.103(30): p. 11118-23.

85. Kwan, K.Y., P.B. Moens, and J.C. Wang, Infertility and aneuploidy in mice lacking a type IA DNA topoisomerase III beta. Proc Natl Acad Sci USA, 2003.100(5): p. 2526-31.

86. Gasser, S.M., et al., Metaphase chromosome structure. Involvement of topoisomerase II. J Mol Biol, 1986.188(4): p. 613-29.

87. Gasser, S.M. and U.K. Laemmli, The organisation of chromatin loops: characterization of a scaffold attachment site. EMBO J, 1986. 5(3): p. 511-8.

88. Adachi, Y., E. Kas, and U.K. Laemmli, Preferential, cooperative binding of DNA topoisomerase II to scaffold-associated regions. EMBO J, 1989. 8(13): p. 3997-4006.

89. Cockerill, P.N. and W.T. Garrard, Chromosomal loop anchorage of the kappa immunoglobulin gene occurs next to the enhancer in a region containing topoisomerase IIsites. Cell, 1986. 44(2): p. 273-82.

90. Masliah, G., et al., Identification of intrinsic dynamics in a DNA sequence preferentially cleaved by topoisomerase II enzyme. J Mol Biol, 2008. 381(3): p. 692-706.

91. Hizume, K., et al., Topoisomerase II, scaffold component, promotes chromatin compaction in vitro in a linker-histone Hl-dependent manner. Nucleic Acids Res, 2007. 35(8): p. 2787-99.

92. Christensen, M.O., et al., Dynamics of human DNA topoisomerases llalpha and llbeta in living cells. J Cell Biol, 2002.157(1): p. 31-44.

93. Gimenez-Abian, J.F. and D.J. Clarke, Replication-coupled topoisomerase II templates the mitotic chromosome scaffold? Cell Cycle, 2003. 2(3): p. 230-2.

94. Takagi, K., et al., Novel E-ring camptothecin keto analogues (S38809 and S39625) are stable, potent, and selective topoisomerase I inhibitors without being substrates of drug efflux transporters. Mol Cancer Ther, 2007. 6(12 Pt 1): p. 3229-38.

95. Pommier, Y. and M. Cushman, The indenoisoquinoline noncamptothecin topoisomerase I inhibitors: update and perspectives. Mol Cancer Ther, 2009.

96. Teicher, B.A., Next generation topoisomerase I inhibitors: Rationale and biomarker strategies. Biochem Pharmacol, 2008. 75(6): p. 1262-71.

97. Strumberg, D., et al., Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff. Mol Cell Biol, 2000. 20(11): p. 3977-87.

98. Dexheimer, T.S., et al., Tyrosyl-DNA phosphodiesterase as a target for anticancer therapy. Anticancer Agents Med Chem, 2008. 8(4): p. 381-9.

99. Zhang, A., et al., A protease pathway for the repair of topoisomerase ll-DNA covalent complexes. J Biol Chem, 2006. 281(47): p. 35997-6003.

100. Cortes Ledesma, F., et al., A human 5'-tyrosyl DNA phosphodiesterase that repairs topoisomerase-mediated DNA damage. Nature, 2009. 461(7264): p. 674-8.

101. Kreuzer, K.N. and N.R. Cozzarelli, Escherichia coli mutants thermosensitive for deoxyribonucleic acid gyrase subunit A: effects on deoxyribonucleic acid replication, transcription, and bacteriophage growth. J Bacterid, 1979.140(2): p. 424-35.

102. Laponogov, I., et al., Structural basis of gate-DNA breakage and resealing by" type II topoisomerases. PLoS One, 2010. 5(6): p. ell338.

103. Tran, J.H. and G.A. Jacoby, Mechanism of plasmid-mediated quinolone resistance. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(8): p. 5638-42.

104. Hegde, S.S., et al., A fluoroquinolone resistance protein from Mycobacterium tuberculosis that mimics DNA. Science, 2005. 308(5727): p. 1480-3.

105. Garrido, M.C., et al., The export of the DNA replication inhibitor Microcin B17 provides immunity for the host cell. EMBO J, 1988. 7(6): p. 1853-62.

106. Lewis, R.J., et al., The nature of inhibition of DNA gyrase by the coumarins and the cyclothialidines revealed by X-ray crystallography. EMBO J, 1996.15(6): p. 1412-20.

107. Flatman, R.H., et al., Structure-activity relationships of aminocoumarin-type gyrase and topoisomerase IV inhibitors obtained by combinatorial biosynthesis. Antimicrob Agents Chemother, 2006. 50(4): p. 1136-42.

108. Oblak, M., M. Kotnik, and T. Solmajer, Discovery and development of ATPase inhibitors of DNA gyrase as antibacterial agents. Curr Med Chem, 2007.14(19): p. 2033-47.

109. Mani, N., et al., In vitro characterization of the antibacterial spectrum of novel bacterial type II topoisomerase inhibitors of the aminobenzimidazole class. Antimicrob Agents Chemother, 2006. 50(4): p. 1228-37.

110. Oppegard, L.M:, et al., In vivo and in vitro patterns of the activity of simocyclinone D8, an angucyclinone antibiotic from Streptomyces antibioticus. Antimicrob Agents Chemother, 2009. 53(5): p. 2110-9.

111. Sadiq, A.A., et al., Anti-proliferative effects of simocyclinone D8 (SD8), a novel catalytic inhibitor of topoisomerase II. Invest New Drugs, 2010. 28(1): p. 20-5.

112. Edwards, M.J., et al., A crystal structure of the Afunctional antibiotic simocyclinone D8, bound to DNA gyrase. Science, 2009. 326(5958): p. 1415-8.

113. Sissi, C., et al., Mapping simocyclinone D8 interaction with DNA gyrase: evidence for a new binding site on GyrB. Antimicrob Agents Chemother, 2010. 54(1): p. 213-20.

114. Gatto, B., et al., The topoisomerase II poison clerocidin alkylates non-paired guanines of DNA: implications for irreversible stimulation of DNA cleavage. Nucleic Acids Res, 2001. 29(20): p. 4224-30.

115. Pan, X.S., et al., Clerocidin selectively modifies the gyrase-DNA gate to induce irreversible and reversible DNA damage. Nucleic Acids Res, 2008. 36(17): p. 5516-29.

116. Storl, K., et al., Minor-groove binders are inhibitors of the catalytic activity of DNA gyrases. FEBS Lett, 1993. 317(1-2): p. 157-62.

117. Dao-Thi, M.H., et al., Molecular basis of gyrase poisoning by the addiction toxin CcdB. J Mol Biol, 2005. 348(5): p. 1091-102.

118. San Millan, J.L., R. Kolter, and F. Moreno, Plasmid genes required for microcin B17 production. J Bacteriol, 1985.163(3): p. 1016-20.

119. Zambie, D.B., et al., The McbB component of microcin B17 synthetase is a zinc metalloprotein. Biochemistry, 2000. 39(51): p. 16190-9.

120. Destoumieux-Garzon, D., J. Peduzzi, and S. Rebuffat, Focus on modified microcins: structural features and mechanisms of action. Biochimie, 2002. 84(5-6): p. 511-9.

121. Wang, R., F.P. Healey, and J. Myers, Amperometric measurement of hydrogen evolution in chlamydomonas. Plant Physiol, 1971.48(1): p. 108-10.

122. Herrero, M. and F. Moreno, Microcin B17 blocks DNA replication and induces the SOS system in Escherichia coli. J Gen Microbiol, 1986.132(2): p. 393-402.

123. Glenn, T.M., et al., Production of a myocardial depressant factor in cardiogenic shock. Am Heart J, 1971. 82(1): p. 78-85.

124. Heddle, J.G., et al., The antibiotic microcin B17 is a DNA gyrase poison: characterisation of the mode of inhibition. J Mol Biol, 2001. 307(5): p. 1223-34.

125. Curran, J.P. and J.S. Wang, Fatal intracranial hemorrhage as the first sign of hemophilia B in an infant. Am J Dis Child, 1971.122(1): p. 63-5.

126. Sinha Roy, R., et al., In vivo processing and antibiotic activity of microcin B17 analogs with varying ring content and altered bisheterocyclic sites. Chem Biol, 1999. 6(5): p. 30518.

127. Zambie, D.B., et al., In vitro characterization of DNA gyrase inhibition by microcin B17 analogs with altered bisheterocyclic sites. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(14): p. 7712-7.

128. Roy, R.S., et al., Role of the microcin B17 propeptide in substrate recognition: solution structure and mutational analysis of McbAl-26. Chemistry & Biology, 1998. 5(4): p. 217-228.

129. Vizan, J.L., et al., The peptide antibiotic microcin B17 induces double-strand cleavage of

130. DNA mediated by E. coli DNA gyrase. EMBO J, 1991.10(2): p. 467-476.1.vina, M., A.P. Pugsiey, and F. Moreno, Identification, Mapping, Cloning and

131. Characterization of a Gene (sbmA) Required for Microcin B17 Action on Escherichia coli

132. K12. Journal of General Microbiology, 1986.132(6): p. 1685-1693.

133. Drlica, K., et al., Quinolones: Action and Resistance Updated. Current Topics in Medicinal

134. Chemistry, 2009. 9(11): p. 981-998.

135. Couturier, M., E.M. Bahassi, and L. Van Melderen, Bacterial death by DNA gyrase poisoning. Trends in Microbiology, 1998. 6(7): p. 269-275.

136. Perler, F.B., M.-Q. Xu, and H. Paulus, Protein splicing and autoproteoiysis mechanisms. Current Opinion in Chemical Biology, 1997.1(3): p. 292-299.

137. Saleh, L. and F.B. Perler, Protein splicing In Cis and In Trans. The Chemical Record, 2006. 6(4): p. 183-193.

138. Zamble, D.B., et al., In vitro characterization of DNA gyrase inhibition by microcin B17 analogs with altered bisheterocyclic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2001. 98(14): p. 7712-7717.

139. Maxwell, A., DNA gyrase as a drug target. Biochem Soc Trans, 1999. 27(2): p. 48-53. Pommier, Y., et al., DNA topoisomerases and their poisoning by anticancer and antibacterial drugs. Chem Biol, 2010.17(5): p. 421-33.