Биохимическая диагностика загрязнения объектов окружающей среды тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.16, кандидат химических наук Ризаева, Елена Петровна

• Ризаева, Елена Петровна
• кандидат химических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат химических наук Ризаева, Елена Петровна

ОГЛАВЛЕНИЕ

5

Глава 1. ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ С

ПОМОЩЬЮ БИОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ

(Литературный обзор)

1.1. Использование холинэстераз .для диагностики загрязнения окружающей среды

1.1.1. Общая характеристика холинэстераз

1.1.2. Ингибиторы холинэстераз

1.1.3. Холинэстеразные биосенсоры для определения загрязнителей окружающей среды

1.2. Экологический контроль загрязнения водной среды

1.2.1. Биологический анализ вод

1.2.2. Система ПДК

1.2.3. Методы биотестирования

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы и реагенты

2.2. Приборы и методы эксперимента

Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ ПОВЕДЕНИЯ ХОЛИНЭСЛГЕРАЗНОГО БИОСЕНСОРА В МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ СРЕДАХ

3.1. Определение специфических ингибиторов холинэстеразы

3.2. Влияние поверхностных факторов на поведение биосенсора

3.3. Поведение биосенсоров в многокомпонентных растворах

Глава 4. ЭКСПЕРТНАЯ ОЦЕНКА ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОЧНЫХ ВОД

4.1. Общая характеристика сточных вод, использованных при разработке экспертной системы

4.2. Оценка токсических свойств сточных вод с помощью парамеций и холи-нэстеразного биосенсора

4.3. Экспертная оценка загрязнения сточных вод

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ

ПРИЛОЖЕНИЕ

150

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

АХЭ - ацетилхолинэстераза;

БПК - биохимическое потребление кислорода, мг 02/л БХИ - бутирилхолин иодад; БуХЭ - бутирилхолинэстераза; ДДВФ - дихлордиметилвинилфосфат;

ПДК - предельно допустимая концентраций загрязнителя, мг/л; СПАВ - синтетическое поверхностно-активное вещество; ХПК - химическое потребление кислорода, змгО/л; ХЭ - холинэстераза; I - ингибитор;

к - константа скорости реакции;

кц - бимолекулярная константа скорости необратимого ингибирования

(мольХл^мтг1; 8 - субстрат ферментативной реакции; г - коэффициент регрессии;

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биохимическая диагностика загрязнения объектов окружающей среды»

ВВЕДЕНИЕ

Экспресс-оценка загрязнения объектов окружающей среды является необходимым компонентом экологических исследований, включая мониторинг, экологическое нормирование сбросов и выбросов загрязняющих веществ, опенку последствий загрязнения и другие задачи экологического прогнозирования.

В отличие от традиционных методов химического анализа, системы предварительного контроля опасных уровней загрязнения не ориентированы на количественное определение индивидуальных компонентов. Они решают задачу быстрого качественного обнаружения опасного загрязнения объекта тестирования веществом или группой веществ, в некоторых случаях позволяют провести групповую идентификацию загрязнителей и источника его поступления в окружающую среду. Подобный подход реализуется прежде всего, в методах биотестирования {1,21, отличающихся высокой чувствительностью и принятых для оценки токсичности водной среды, почв, осадков сточных вод. В отличие от химических методов экоаналитического контроля, биологические методы более трудоемки, требуют квалифицированного персонала, с трудом поддаются более аппаратурному оформлению. Это сдерживает их широкое внедрение в практику работы природоохранных органов. За исключением некоторых юстированных методик, методы биотестирования остаются в основном средством научных исследований.

Биохимическая диагностика состояния окружающей среды, основанная на изучении воздействия объекта тестирования на скорость ферментативной реакции in vitro, занимает промежуточное положение между химическими и биологическими тест-методами. С одной стороны, так же, как и традиционные методы биотестирования, ферментные диагностикумы имеют четкое токсикологи-

ческое обоснование и достаточно чувствительны к специфическим токсикантам (пределы обнаружения до 10~12 моль/л {3}). Изучение ферментативных реакций позволяет моделировать процессы токсикащш организма на молекулярном уровне, что особенно важно при исследовании новых химических соединений перед юс промышленным производством. С другой стороны, биохимические методы опираются на надежную аппаратурную базу, позволяющую количественно выражать ответные реакции систем. Они легко формализуются и могут быть реализованы в автономном режиме (например, в составе автоматической станции контроля). Соответствующие средства измерения - биосенсоры - при промышленном производстве достаточно дешевы и могут применяться неквалифицированными пользователями, в том числе в быту.

Работы в области биохимических методов экологического мониторинга ведутся, начиная с 70-х годов. Прежде всего, это методики и средства измерения, предназначенные для определения ингибиторов холинэстераз |3]. К ним относятся фосфорорганические и карбаматные пестициды и некоторые фармацевтические препараты. Основная проблема практического использования хо~ лйнэстеразных методов состоит в низкой специфичности отклика. Фермент позволяет диагностировать групповое содержание пестицидов, иншбирующий эффект зависит от многих факторов, таких, как присутствие обратимых ингибиторов холинэстеразы, минерализации и буферной емкости образца и т.д. В результате, несмотря на высокую чувствительность фермента, требуется предварительное концентрирование пробы путем экстракции или препаративного хрома-тографирования, что нивелирует основное преимущество использования фермента - простоту и экспрессность теста.

Альтернативным подходом является применение фермента для общей оценки загрязнения окружающей среды, когда любое изменение ферментатив-

ной активности (активация, ингибирование) является свидетельством изменения компонентного состава, а следовательно, самого факта загрязнения. При этом наблюдаемый отклик не соотносится с качественным и количественным составом образца, а является его обобщенной оценкой, выражением токсичности, как в методах биотетстировання.

Развитие такого подхода опирается на многообразие соединений и факторов, влияющих на активность холинэстеразы, и требует широкого изучения области применения ферментного диагностикума и способов направленного изменения его чувствительности и селективности для решения конкретных задач экологического мониторинга.

Вышесказанное определяет «ель настоящей работы, которая состоит в изучении аналитических и операционных характеристик хояинэстеразного биосенсора для контроля объектов окружающей среды, выявлении экспериментальных факторов, определяющих чувствительность определения специфических ингибиторов в многокомпонентных средах, а также возможность экспертной оценки загрязненности (токсичности) сточных вод на основе обобщенных показателей, включающих антихолинэстеразную активность образца.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи;

- выявить экспериментальные факторы, влияющие На чувствительность и селективность детектирования специфических ингибиторов холинэстеразы -фосфорорганических пестицидов, фторидов, солей тяжелых металлов, в том числе в многокомпонентных средах;

- выявить механизм формирования отклика биосенсора к ингибитору, в том числе влияние природы носителя фермента, сорбции веществ на аналити-

ческие характеристики определения ингибиторов различного механизма действия;

- установить влияние макрокомпонентов тестируемого образца, в том числе органических растворителей, на чувствительность определения специфических ингибиторов, определить способы дифференциации отклика биосенсора на ингибиторы различного механизма действия при их совместном присутствии в растворе;

- произвести скрининг антихолинэетеразной активности промышленных сточных вод и на этой основе разработать экспертную систему оценки загрязненности (токсичности) вод, оценить эффективность статистических методов построения экспертных систем, базирующихся на результатах биохимического тестирования с привлечением других обобщенных физико-химических показателей.

В работе использовали выпускаемые отечественной промышленностью препараты бутирилхолинэстеразы, устойчивые при хранении и иммобилизации и обладающие достаточно высокой чувствительностью к ингибиторам. Для детектирования ферментативной реакции использовался потенци©метрический сенсор - плоский стеклянный рН-метрический электрод.

Актуальность работы обусловлена как растущей потребностью природоохранных служб в методах обобщенной оценки загрязненности (токсичности) объектов окружающей среды, так и необходимостью дальнейшего методического и приборного оснащения биохимических методов экологического мониторинга, внедрения новейших методов биохимической диагностики в Единую государственную систему мониторинга (ЕГСМ) Российской Федерации и Татарстана. Разработка экспрессных, чувствительных и простых в обслуживании ферментных тестов позволит существенно расширить сферу приложения эколо-

гического мониторинга, снизить риск неконтролируемого поступления токсических веществ в биосферу.

Научная новизна и практическая значимость работы заключаются в том, что:

- проведена сравнительная оценка аналитических и операционных характеристик определения обратимых и необратимых ингибиторов с помощью холинэ-стеразы, иммобилизованной на различных носителях;

- на основе изучения влияния различных экспериментальных факторов (условия измерения, присутствие эффекторов, присутствие органического растворителя, материал мембраны) установлен вклад поверхностных процессов (сорбция, массоперенос реагентов) в формирование отклика холинэстеразного биосенсора к ингибиторам различного механизма действия, показана возможность расчета кинетических параметров ингибирования;

- определены пути повышения чувствительности и селективности определения ингибиторов различного механизма действия за счет регулирования гидрофобных свойств ферментсодержащнх мембран и подавления "защитного" эффекта обратимых ингибиторов холинэстераз;

- впервые построена экспертная система оценки загрязненности сточных вод на основе обобщенных показателей, включающих биохимическое тестирование, проведена сравнительная оценка методов построения экспертной системы с помощью традиционных (дискриминантный анализ) и нетрадиционных (нейронные сети прямого распространения и Fuzzy ART Map) статистических методов,

Диссертация выполнена в Лаборатории экологического контроля Казанского государственного университета в рамках выполнения исследований по основному научному направлению "развитие теоретических и прикладных основ экологического мониторинга (рег.№ 0/980006937) при поддержке грантов

РФФИ № 97-03-33210 "Разработка тестовых методов определения ингибиторов гидролитических ферментов с помощью электрохимических биосенсоров", Санкт-Петербургского конкурсного центра N2 97-0-9.5-238 "Методы групповой оценки загрязнителей окружающей среды на основе биохимических тестов и биосенсоров" и программы ФЦНТП "Новые принципы и методы получения химических веществ и материалов", тема 30.05 "Теоретические и практические основы изменения избирательности биоспецифических методов анализа для решения конкретных аналитических задач".

Часть экспериментальных результатов и выводы на их основе использованы в учебном процессе в Казанском государственном университете при чтении общего курса "Экологический мониторинг".

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Международном симпозиуме НАТО "Применение биосенсоров для прямого определения загрязнителей окружающей среды в полевых условиях" (Смояенице, Словакия, 1997 г.), международном симпозиуме ШСО-Сорепцсш "Применение биосенсоров для анализа загрязнителей окружающей среды" (Коимбра, Португалия, 1998), 9 Европейской конференции по электроаналитической химии (Коимбра, Португалия, 1998) на научных конференциях Казанского государственного университета в 1997, 1998 гг.

Основные результаты изложены в 2 статьях и 4 тезисах докладов.

Структура и объем диссертаций. Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста, включает 23 рисунка и 26 таблиц. Состоит из Введения, 4 глав, Заключения, Выводов, Списка использованных библиографических источников, включающего 151 ссылку на отечественные и зарубежные работы, и Приложения.

Положения, выносимые на защиту:

- исследование особенностей функционирования потенциометрического холинэстеразного биосенсора в различных экспериментальных условиях, подбор рабочих условий определения специфических ингибиторов в модельных водных растворах;

- выявление влияния гетерогенных факторов на формирование отклика потенциометрического биосенсора и методы его дифференциации в зависимости от механизма действия ингибиторов холинэстераз;

- оценка кинетических параметров необратимого ингибирования по результатам измерения с помощью потенциометрического биосенсора с накладными холинэстеразными мембранами на основе промышленно выпускаемых носителей;

- оценка аналитических характеристик определения ингибиторов в многокомпонентных средах, включая реальные образцы промышленных сточных вод;

- построение экспертной системы оценки загрязнения сточных вод на основе обобщенных показателей качества вод, токсичности и антихолинэсте-разной активности;

- сравнительная оценка эффективности статистических методов построения экспертной системы с помощью дискриминантного анализа и искусственных нейронных сетей.

Автор выражает признательность начальнику Центральной специализированной инспекции аналитического контроля (ЦСИАК) Минприроды РТ Шаги-дуллину P.P. за возможность проведения исследований в области экспертной оценки загрязнения промышленных сточных вод, сотрудникам сектора биотестирования ЦСИАК Минприроды РТ Н.Ю.Степановой и к.б.н. А.М.Петрову за

помощь в проведении экспериментов по биотестированию сточных вод и доценту кафедры моделирования экосистем КГУ к.ф.-м.н.А.А.Савельеву за предоставленные программы построения экспертных систем на базе нейрокомпью-терных технологий.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Ризаева, Елена Петровна, 1998 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ

1. Бурдин К.С. Основы биологического мониторинга. М.: Изд-во МГУ, 1985. 158 с.

2. Методы биотестирования вод. / Под ред.Крайнюковой А.Н.- Черноголовка, 1988. 127 с.

3. Майстренко В.Н., Хамитов Р.З., Будников Г.К. Эколого-аналитический мониторинг супертоксикатов. М.: Химия, 1996.- 319 с.

4. Овчинников Ю.А. Основы биоорганической химии. М.: Просвещение, 1987. -815 с.

5. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии фер ментативного катализа. М.: Высшая школа, 1977. 280 с.

6. Страйер Л. Биохимия. М.: Мир, 1984. Т.1. 232 с.

7. Ферит Э. Структура и механизм действия ферментов. М.: Мир, 1980. 432 с.

8. Кабачник М.И., Абдулвахабов А.А., Агабекова И.И., Бресткин А.Л., Волкова Р.И., Годовиков Н.Н., Газына Е.И., Михайлов С.С., Михельсон М.Я., Розегарт В. И., Розен гарг Е.В., Ситке вич Р.В. Гидрофобные области активной поверхности холинэстераз.// Успехи хим. 1970. Т.39. № 6. C.1G50-1G73.

9. Nachmansohn D., Wilson LB. The enzymic hydrolysis and synthesis of acetylcholine.// Advan. Enzymol. 1951. V.12. P.259-339.

10. Stedman E., Stedman E., Easson L.H. Choline esterase. An enzyme present in the blood-serum of the horse.// BiochemJ. 1932. V.26. № 8. P.2056-2066.

11. Оксенгендлер Г.И. Яды и противоядия. Л.: Наука, 1982. 182 с.

12. Silver A. The biology of cholinesterase. Elsevier Publishing Co., Inc. New York. 1974. P.449-488.

13. Giang P.A., Hall S.A. Enzymatic determination of organic phosphorus insecticides.// Anal.Chem. 1951. V.23. № 12. p. 1830-1834.

14. Hamblin D.C., Marchand J.F. Cholinesterase test and their applicability in the field. N.Y. Amer.Cyanamid Co. 1951. 119 p.

15. Химико-токсикологические методы. / Справочник. Под ред.Ангонова Б. и. М.: ВО"Агропромиздат". 1989. 320 с.

16. Du Tingfa, Zhou Shiguang, Tang Mousheng. A new micro-detection tube for Cholinesterase inhibition in water.// Environ.Pollut. 1989. V.57. № 3. P.217-222.

17. Никольская Е.Б., Евтюгин Г.А., Святковский A.B., Искандеров P.P., Сунцов E.B., Прокопов А.А, Моралев С.Н., Кормилицын Б.Н., Латыпова В.З. Тестовое устройство для обнаружения микроколичеств фосфорорганических пестицидов и лекарственных препаратов антихоли н эстеразн о го действия. // Журн.аналит. химии.- 1994. Т.49. № 4. С.374-380.

18. Sadar M.U., Kuan S.S., Guilbault G.G. Trace analysis of pesticides using Cholinesterase from human serum, rat liver, electric eel, bean leaf beetle and white fringe beetle.// Anal.Chem. 1970. V.42. № 14. P.1770-1774.

19. Diaz A.N., Sanchez F.G., Bracho V., Lovillo J., Aguilar A. Enzymatic determination of fenitrothion by Cholinesterase and acetylcholinesterase on fluorogenic substrates.// Fresenius J.Anal.Chem.- 1997.- V.357.- P.958-961.

20. Diaz A.N., Pein ado M.C.r. Sol-gel Cholinesterase for organophosphorus pesticide fluorometric analysis. // Sensors Actuators B. 1997. V.38-39. P.426-431.

21. Goodson l.h., Jacobs W.B., Davis AW. An immobilized Cholinesterase product for use in the rapid detection of enzyme inhibitors in air or water.// Anal.Biochem. 1973. У.51. № 2. P.362-367.

22. La Rosa C., Pariente F., Hernandez l., Lorenzo E. Determination of organophosphorus and carbamic pesticides with an acetylcholinesterase amperometric

biosensor using 4-aminophenyl acetate as substrate.// Anal.Cliim.Acta. 1994. V.295. P.273-282.

23. Gruss R., Scheller F., Shao M.J., Lui C.C. Electrochemical determination of cholinesterase activity using a thik-film metallized platinum electrode.// Anal.Lett. 1989. V.22, № 5. P.l 159-1169.

24. Stoycheva M. Electrocatalysis with an acetylcholinesterase immobilized graphite electrode.// Electroanalysis. 1995. V.7. № 7. P.660-665.

25. Skladal P., Pavlik M., Fiala M. Pesticide biosensor based on coimmobilized acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase.//Anal. Letters. 1994.V.27.№1. P.29-40.

26. Krupka R.M. The mechanism of action of acetylcholinesterase: substrate inhibition and the binding of inhibitors.// Biochemistry. 1963. V.2. №1. P.76-82.

27. Голиков C.H., Розен гарт В.И. Холинэстеразы и антихолинэстеразные вещества. Л.: Наука, 1964. 382 с.

28. Quinn D.M. Acetylcholinesterase: enzyme structure, reaction dinamics and virtual transition states.// Chem.Rev. 1987. V.87. № 5. P.955-979.

29. Ripoll D.R., Faerman C., Axelsen P.H., Silman L, Sussman J.L. An electrostatic mechanism for substrate guidance down the aromatic gorge of acetylcholinesterase.// Biochem. 1993. V.90. P.5128-5132.

30. Harel M., Sussman J.L., Krejci E., Bon S., Chanal P., Massoulie J., Silman I., Conversion of acetylchlohnesterase to butyryleho 1 i nest erase: modelling and mutagenesis. // Proc. Natl .Acad. Sci. USA 1992. V.89. P. 10827-10831.

31. Wolfe A.D., Ashani Y., Doctor B.P., Maxwell D.M. Esterases as organophosphate scavengers. / "Cholinesterases, structure, function, mechanism, genetics and cell biology". Proc. 3rd Int. Meeting on Cholinesterases, Ed: Massoulie J. 1991. P.306.

32. Садыков A.C., Абдулвахабов A.A., Розен гарт Е.В., Асланов Л.Н. Холинэстеразы. Активный центр и механизм действия. Ташкент: ФАН, 1976. 208 с.

33. Кугушева Л.И., Никольская Е.Б. Стабилизация холинэстеразы голов мух, иммобилизванной в желатиновой мембране.// Укр.биохим.журн. 1989. Т.61. №6. С.92-94.

34. Leca В. Marty J.-L. Disposable arnperometric biosensors for the determionation of cholinesterase inhibitors. // 3rd IN CO Copernicus Workshop " Biosensors for the direct determination of environmental pollutants in field" Coimbra, May 1998. Abstr.Proc. 1998.

35. Tran-Minh C., Pandey P.C., Kumaran S. Studies on acetylcholine sensor and its analytical application based on the inhibition of cholinesterase.// Biosensors Bioelec-tron. 1990. V.5. P.461-471.

36. Goodson L.H., Jacobs W.B., Davis A.W. An immobilized cholinesterase product for use in the rapid detection of enzyme inhibitors in air or water.// Anal.Biochem. 1973. V.51. N2.- P.362-367.

37. Nguyen V K,, Ehret-Sabatier L., Goeldner M., Boufier C., Jamet G., Waiter J.M., Poindron P. Stabilization of dry immobilized acetylcholinesterase on microtitration plates for colorimetric determination of its inhibitiors in water and biological fluids.// Enzyme Microb.TechnoI. 1997. Y.20. P. 18-23.

38. Rippeth J.j., Gibson T.D., Hart J.P., Hartley I.C., Nelson G. Flow-injection detector incorporating a screen-printed disposable arnperometric biosensor for monitoring organophosphate pesticides.// Analyst. 1997. V.122. P. 1425-1429.

39. Прокопов А.А., Кузнецова Л.П., Никольская Е.Б., Ягодина О.В. Свойства растворов ферментов в новом полимере, N-фталилхитазане. / "Методы получения, анализа и применения ферментов". Тез.докл. Всесоюзн. конф., Рига, 1990. С. 135.

40. Будников Г.К, Евтюгин Г.А., Никольская Е.Б., Сгойкова Е.Е. Влияние макрокомпонентов на контроль следовых количеств фосфорорганических пес-

тицидов в объектах окружающей среды./Тез.докл.Всерос.конф.с межд.участием "Химическое разоружение-96. Экология и технология". Ижевск, 1996. C.20-2I.

41. Хачачка П. Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир, 1988. 568 с.

42. Rogers К., Foley М., Alter S., Koga P., Eldefrawi M. Light addressable potenti-ometric biosensor or the detection of anticholinesterases.// Anal. Lett. 1991. V.24. N 2. P.191-198.

43. Durand P., Thomas D. Use of immobilized enzyme coupled with an electrochemical sensor for the detection of organophosphates and carbamates pesticides.// J.Environ.PatholToxicol,Onkol. 1984. Vol51. N 5-4. P.51-57.

44. Stein R., Schwedt G. Comparison of immobilization methods for the development on an acetylcholinesterase biosensor. // Anal.Chim.Acta. 1993. V.272. №1. P.73-81.

45. Асатиани B.C. Ферментные методы анализа. M.: Наука, 1969. 740 с.

46. Медянцева Э.П., Будников Г.К., Бабкина С.С. Ферментный электрод на основе иммобилизованной холинэстеразы.// Журн.аналит.химии. 1990. Т.45. №7. С.1386-1389.

47. Mionetto N., Rouillon R., Marty J.-L. Inhibition of acetylcholinesterase by or-ganophosphorus and carbamate compounds. Studies on free and immobilized enzymes.// Z.Wasser Abwasser Forsch. 1992. ¥.25. P. 171-174.

48. Тривен M. Иммобилизованные ферменты. M.: Мир, 1983. 218 с.

49. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы. / Под ред. Березина И.В., Антонова В.К., Мартинека К. - М.: Изд-во МГУ, 1976. Т.2. 358 с.

50. Никольская Е.Б. Применение ферментов для изучения некоторых гидрок-со-комплексов. // Докл.акад.наук СССР. 1981. Т.258. №3. С.682-685.

51. Starodub N.F., Shirshov Ju.M., Kukla A.L., Karjuk N.I., Prokchorovich A.V., Merker R. Multi-enzymatic sensor for simultaneous determination of organophos-

phorus pesticides and heavy metal ions.// Electrochem. Soc. Proc. 1997. V.97. №19. P.799-808.

52. Евтюгин Г.А., Гольфрид В.У., Латыпова В.З. Оценка загрязнения объектов окружающей среды тяжелыми металлами с помощью иммобилизованной холи-нэстеразы./Тез.докл.Всес.научно-практ.конф."Химические и биологические методы в охране окружающей среды от загрязнения тяжелыми металлами". Усть-Каменогорск.-М.: Изд-во ВНИИСЭНТИ, 1990. С.44.

53. Budnikow Н.С., Medjantsewa Е.Р., Babkina S.S. An enzyme arnperometric sensor for toxicant determination.//J.Electroanal.Chem. 1991. V.310. №1-2. P.49-55.

54. Soldatkin A.P., Korpan Y.I., Zhylyak G.A., Martelet C, El'skaya A.V. Selective determination of heavy metal ions with sensors coupled to immobilized enzymes./ Nato ASI Ser. 1997. V.38. Biosensors for direct monitoring of environemntal pollutants in field. (D.P.Nikoielis, U.J.Krull, J.Wang, M.Mascini eds.) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands, P.281-288.

55. Евтюгин Г.А., Стойкова E.E., Никольская Е.Б., Будников Г.К. Влияние ионов металлов на колориметрическое определение необратимых ингибиторов холинэстеразы.//Журн.аналит.химии. 1997. Т.52. №2. C.18S-192.

56. Никольская Е.Б., Евтюгин Г.А. Применение холинэстераз в аналитической химии.// Журн.аналит.химии. 1992. Т.47. №8. С.1358-1377.

57. О'Брайен Р. Токсичные эфиры кислот фосфора. М.: Мир, 1964. С.93-138.

58. Michel Н.О., Gordon E.G., Epstein J. Detection and estimation of isopropyl-methylphosphonofluoridate and O-ethyl-S-diisopropyl-amiiioethylmethylphosphono-thiate in sea water in part-per-trillion level.// Environ.Sci.Technol. 1973. Vol.7. №11. P. 1045-1049.

59. Kennedy W. The mechanism of organophosphate inhibition. In: Cholinesterase inhibiting insecticides (Mineau P., ed.) Elsevier, Amsterdam - 1991. P.77-80.

60. Hobbiger F., Pitman M., Sadler P.W. Reactivation of phosphorylated

acetylcholinesterases by pyridinium aldoximes and related compounds.// BiochemJ. 1960. V.75. №2. P.363-372.

61. Skladal P. Biosensors based on cholinesterase for detection of pesticides.// Food Technol. Biotechnol. 1006. V.34. №1. P.43-49.

62. Кугушева Л.И., Никольская Е.Б. Реактивация фосфорилированной холин-эстеразы, иммобилизованной в желатиновой мембране.// Укр.биохим. журн. 1990. Т.62. №2. С.93-96.

63. Исидоров В.А. Введение в курс химической токсикологии./ С-Пб.: Изд-во С-Пб.ун-та, 1997. 88 с.

64. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: Изд-во МГУ, 1976. 320 с.

65. Бресткин А.П., Жуковский Ю.Г., Розегарт Е.В. Метод определения ингиби-торных констант при обратимом торможении ферментативного гидролиза субстрата.// Укр.биохим.журн. 1987. Т.59. №5. С.77-81.

66. Долманова И.Ф., Шеховцова Т.Н., Стародумова Н.Н. Ферментативный метод определения ртути.// Журн.аналит.химии. 1987. Т.42. №10. С. 1824-1828.

67. Stoycheva М. Bioelectrocatalytical determination of some heavy metals and their influence on the catalytic activity of the immobilized acetylcholinesterase.// Bidl.Soc.Chim.Belg. 1994. V.103. №4. P. 147-149.

68. Будни ков Г.К., Медян цева Э.П., Бабкина C.C., Волков А.В. Влияние ионов металлов на каталитическую активность иммобилизованной холинэстеразы.// Журн.аналит.химии. 1989. Т.44. №12. С.2253-2257.

69. Вертлиб М.Г., Фахертдинова Г.Ф., Иванов В.Б. Возможность определения некоторых платиновых металлов с помощью амперометрическош холинэсте-

разного биосенсора./ "Электрохимические методы анализа. ЭМА-94". Тез докл.Всес.конф. М.: 1994. С.77.

70. Trail-Mi nil С. Immobilized enzyme probes for dete ruling inhibitors.// Ion-Sel.Electrode Rev. 1985. V.7. P.41-75.

71. Биосенсоры: основы и приложения. /Под ред.Э.Тернера, И.Карубе, Дж.Уилсона.- М.: Мир, 1992.- 614 с.

72. Кулис Ю.Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов. -Вильнюс: Моклас, 1981.- 200 с.

73. Матеро ва Е.А., Никольская Е.Б. Ионселективные электроды в исследовании холинэстеразы.// Усп.химии. 1980. Т.69. №10. С. 1937-1944.

74. Новиков Б.Е., Ескараева Р.А., Гладышев ПЛ., Солдаткин А. П., Стародуб Н.Ф., Ельская А.В., Сандровский А.К. Биосенсор для определения субстратов и ингибиторов ацетил - и бутирилхолинэстераз на основе ионоседективного полевого транзистора. // Журн.аналит.химии. 1992. Т.47. №5. С. 882-886.

75. Dumschat С., Muller Н., Stein К., Schwedt G. Pesticide sensitive ISFET based on enzyme inhibition. // Anal.Chim. Acta. 1991. V.252. №1-2. P.7-10.

76. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа. М.: Наука, 1965. 248 с.

77. Bernabei М., Cremisini С., Mascini М., Pallesclii G. Determination of organophosphorous and carbamic pesticides with a choline and acetylcholine electrochemical biosensor.//AnaLChem. 1991. V.24. №8. P.1317-1332.

78. Cremisini C., Di Sario S., Mela J., PiUoton R., Palleschi G. Evaluation of the use of free and immobilized acetylcholinesterase for paraoxon detection with an amperometric choline oxidase based biosensor.// Anal.Chim.Acta. 1995. V.311. № 3. P.273-280.

79. Skladal P. Detection of organophosphate and carbamate pesticides using disposable biosensors mased on chemically modified electrodes and immobilized cholinester-ase.// Anal.Chim.Acta. 1992. V.269. P.281-287.

80. Будников Г.К., Медянцева 3,1 ï.„ Бабкина C.C. Амперометрические датчики на основе иммобилизованных ферментов.// Успехи химии. 1991. Т.60. №4. С.880-909.

81. Budnikov H.С., Evtugyn G.A. Electrochemical biosensors for inhibitor determination: selectivity and sensitivity control.// Electroanalysis. 1996. V.8. M'8-9. P.817-820.

82. Дзядевич C.B., Солдаткин А.П., Шульга A.A., Стриха В.И., Ельская А.В. Кондукгометрический биосенсор для определения фосфорорганических пестицидов.// Журн.аналит.химии. 1994. Т.49. №8. С.874-878.

83. Tran-Minh С., Guyonnet R. Capteur enzymatique pour la detection et le dosage en continu de substances toxiques. // Compt.Rend. 1978. V.286. №12. P.357-359.

84. El Yamani., Tran-Minh C., Abdul M., Dupont M. Automatic unit for measurement of toxicity of river water. // J.Fr.Hydrol. 1987. Y.18. №1. P.67-75.

85. Никольская Е.Б., Евтюгин ГА., Искандеров P.P., Латыпова В.З. Потен-циометрические сенсоры для определения ингибиторов холинэстеразы. // Журн.аналит.химии. 1996. Т.51. №5. С.561-565.

86. Новиков Б.Е., Ескараева Р.А., Глабышев П.П., Солдаткин А.П., Стародуб Н.Ф., Ельская А.В., Сацдровский А.К. Биосенсор для определения субстратов и ингибиторов ацетил- и бутирилхолинэстераз на основе ионоселективного полевого транзистора.// Журн.аналит.химии. 1992. Т.47 №5. С.882-886.

87. Jaffrezic-Renault N., Martelet С., Clechet P., Nyamsi Hendji A.-M., Schulga A.A., Dzyadevitch S.V., Nechiporuk L.Ï., Soldatkin A.P. Comparison of two trans-

duction modes for design of microbioscnsors applicable to detection of pesticides,// Sensors Materials. 1996. V.8. №3. P. 161-167.

88. Nyamsi Hendji A.-M., Jafl'rezic-Renault N., Martelet C., Clechet P., Scliulga A.A., Strikha V.I., Nechiporuk L.I., Soldatkin A.P., Wlodarski W.B. Sensitive detection of pesticides using a differential ISFET-based system with immobilized cholinesterases.// Anal.Chim.Acta. 1993. V.281. P.3-11.

89. Ristori C., Del Carlo C., Martini M., Barabaro A, Ancarani A. Potentiometric detection of pesticides in water samples.// Anal.Chirn.Acta. 1996. V.325. P. 151-160.

90. Ghindilis A.L., Morzunova T.G., Barmin A.V., Rurochkin I.N. Potentiometric biosensors for cholinesterases inhibitor analysis based on mediatorless bioelectrocata-lysis.// Biosens.Bioelectron. 1996. V.ll №9. P.873-880.

91. Pandey P.C., Tran-Minh C., Lantreibecq F. Electrochemical studies on tetrathia-fulvalene-tetracyanoquinodimethane modified acetylcholine-choline sensor.// Appl.Biochem.Biotechnol. 1991. V.31. №2. P. 145-158.

92. Martorell D., Cespedes F., Martinez-Fabregas E., Alegret S. Amperometric determination of pesticides using a biosensor based on a polish able graphite-epoxy biocomposite.// Anal.Chim.Acta. 1994. V.290. P.343-348.

93. Skladal P., Fiala M., Krejci J. Detection of pesticides in the environment using biosensors based on cholinesterases.// Int.J.Environ.Anal.Chem. 1996.V.65.P. 139-148.

94. Stoycheva M. Acetylcholinesterase based amperometric sensor. Inhibitor detection.// Anal.Letters. 1994. V.27. №15. P.3065-3080.

95. Dzydevicli S.V., ShuFga A.A., Soldatkin A.P., Nyamsi Hendji A.M., Jaffrezic-Renault N., Martelet C. Conductornetric biosensors based on cvholinesterases for sensitive detection of pesticides.// Electroanalysis. 1994. V.6. P.752-758.

96. Goodson L.H., Jacobs W.B. Immobilized enzymes for detection and monitoring of organopliospliates and carbamates. // Enzyme Eng. - New York, Plenum Press: 1977. V.2. P.55-69.

97. La Rosa C., Pariente F., Hernandez L., Lorenzo E. Amperometric flow-through biosensor for the determination of pesticides.//Anal.Chim.Acta. 1995.V.308.P. 129-136.

98. Kulys J., Da Costa E.J. Printed amperometric sensor based on TCNQ and cholin-esterase.// Biosensors Bioelectron. 1991 V.6. P. 109-115.

99. Bernabei M., Cremisini C., Mascini M., Palleschi G. Determination of organo-phosphorus and carbarniс pesticides with a choline and acetylcholine electrochemical biosensor.// Anal.Letters. 1991. V.24. №8. P. 1317-1332.

100. Skladal P., Nun es G.S., Yamanaka H., Riberio M.L. Detection of carbamate

pesticides in vegetables samples using cholinesterase-based biosensor.// Electroanalysis. 1997. V.9. №14. P. 1083-1087.

101. Danzer T., Schwedt G. Multivariate evaluation of inhibition studies on an enzyme electrodes system with pesticides and mixtures of mercury and pesticides.// Anal.Chim.Acta. 1996. V.325. №1. P.l-10.

102. Соколова C.A., Евтюгин Г.А., Искандеров P.P., Старцева А.И., Смирнова В.У., Рыдванский Ю.В., Котов Ю.С., Патин С.А Тестирование качества вод с помощью иммобилизованной холинэстеразы./ "Влияние антропогенного фактора на экосистему озер". Сб.научн.трудов ГосНИОРХ. 1990. №312. С. 122-136.

103. Evtugyn G .A., Budnikov Н.С., Nikolskaya Е.В. Influence of surface-active compounds on the response and sensitivity of cholinesterase biosensors for inhibitor determination.// Analyst. 1996. V.121. №12. P.1911-1915.

104. Dehlawi M.S., Eldefrawi A.T., Eldefrawi M.E., Anis N.A., Valdes J J. Choline

derivatives and sodium, fluoride protect acetylcholinesterase against irreversible inhibition and aging by DFP and paraoxon.// J.Biochem.Toxicol. 1994. V.9. №5. P.261-268.

105. Бресткин А.П., Никольская Е.Б., Кузнецова Л.П., Кострова В.М., Тулина H.A. Применение фермент-интибиторных: систем для определения микроколичеств обратимых ингибиторов холинэстераз.// Журн.аналит.химии. 1989. Т.44. №9. С. 1666-1670.

106. Розенгарт В.И., Шерстобитов O.E. Избирательная токсичность фосфорор-ганических инсектоакаринидов. Л.: Наука, 1974. 174 с.

107. Turner А.Р.F. Swain A. Commercial perpsectives for diagnostics using biosensor technologies.// Amer.Biotechnol.Lab. 1988. V.6. №1. P.10-18.

108. Cholinesterase-Hemmtest. Screening test zur Bestimmung von Cholinesterase hemmenden Organophosphat- und Carbamat- Pestiziden in Wasser. / Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim. Cat.No 1293460.

109. InQuest OP/Carbamate Screen, Ohmicron, Newtown, PA, USA

110. Du Tingfa, Zhou Shiguang, Tang Mousheng. A new micro-detection tube for Cholinesterase inhibition in water.// Environ.Pollut. 1989. V.57. №3. P.217-222.

111. Kumaran S., Morita M. Application of a Cholinesterase bosensor to creen for organophosphorus pesticides extracted from soil.//Talanta. 1995.V.42. №4. P.649-655.

112. Evtugyn G.A., Stoikova E.E., Budnikov H.C., Beljakova S.V., Latipova V.Z. Development of enzyme biosensing devices for the direct monitoring of soil and sewage sludge pollution in field. / "New Trends in Biosensor Development" Program and Abstract of NATO Advanced Research Workshop. Kiev (Vorzel), Ukraine, July 69, 1998. P.65.

113. Евтюгин ГА., Искандеров P.P., Латы нова B.3., Гольфрид В.У., Пунегова Л.Н., Марченко I .A. Экспресс-оценка качества вод с помощью иммобилизо-

ванной хол и нэстеразы / В сб.; "Э кол о го -то кс и кол оги ческая характеристика г.Казани и пригородной зоны".- Казань, изд-во К ГУ: 1991. С. 126-128.

114. Davis T.J., Malaney G.W. Acetylcholinesterase inhibition - a new parameter of water pollution.// Water Sewage Works. 1967. V.114. №7. P.272-274.

115. Тимофеева C.C. Санитарно-техническая гидробиология и водная токсикология. Иркутск, Изд-во Иркутского ун-та: 1985. 128 с.

116. Биологические методы оценки природной среды. М.: Наука, 1978. 276 с.

117. Филенко О.Ф. Водная токсикология. Черноголовка. 1988. 156 с.

118. Перечень предельно допустимых концентраций и ориентировочно безопасных уровней воздействия вредных веществ для воды рыбохозяйственных водоемов. М.: Меди нор, 1995.220 с.

119. Методические рекомендации по формализованной комплексной оценке качества поверхностных пресных и морских вод по г и дрохи м ичсски м показателям./ М., Госкомгидромет: 1988.

120. Кузин А. К. Методы обобщенной оценки сброса веществ в водные объекты: и качества поверхностных вод.// Гидрохим.материалы. 1989. Т.95. С.67-87.

121. Временный классификатор токсичных промышленных отходов и методические рекомендации по определению класса токсичности промышленных отходов. / М.: Минздрав - ГКНТ СССР, 1987.

122. Романенко В.Д., Оксинюк О.П., Жукинский В.Н., Стольберг Ф.В., Лаврик В.И. Экологическая оценка воздействия гидротехнического сторительства на водные объекты. Киев: Наукова думка, 1990. 256 с.

123. Сел ивановская С.С., Латыпова В.З., Наумова Р.П. Осадки сточных вод. Справочно-методическое руководство. Казань: Габигать, 1998. 160 с.

124. Г.С.Фоммн, А.Б. Ческис. Вода. Контроль химической, бактериальной, и радиационной безопасности по международным стандартам. Справочник /Под ред. С.А. Подлепы. VI: Геликон, 1992. 392 с.

125. Методическое руководство по биотестированию воды. РД 118.02.90. М.: 1991, 48 с.

126. Методы биотестирования качества водной среды./ Под ред.Филенко О.Ф. М.: Изд-во МГУ, 1989. 124 с.

127. Методические рекомендации по биотестированию природных и сточн ых вод и отдельных загрязняющих веществ. М.: Изд-во ВНИРО, 1982. 36 с.

128. Метод определения токсичности сточной воды на инфузориях. М.: Изд-во ВНИРО, 1993. 34 с.

129. Виноходов Д.О., Виноходов 3.0., Гинак А.И. Биотестирование как метод научного исследования. / "Инфузории в биотестировании". Тезисы межд.заочн. научн.конф. Октябрь, 1997. С-Пб. 1998. С.40-41.

130. Van Hoof F.M., De Jogtie E.G., Briers M.G., Hansen P.O., Pluta H.J., Rawson D.M. Willmer A J. The evaluation of bacterial biosensors for screening of water pollutants.// Environ.Toxicol.Water Qual. 1992. V7. №1. P. 19-33.

131. Унифицированные методы исследования качества вод. Сборник СЭВ. Ч.З. Методы биологического анализа вод. М.: изд-е СЭВ, 1983. 48 с.

132. Основы биологического контроля загрязнения окружающей среды / Под ред.Карабаня Р.Т. М.: Гидрометеоиздат, 1988. 370 с.

133. СанПиН 2.1.7.573-96. Гигиенические требования к использованию сточных вод и их осадков для орошения и удобрения. М.: Минздрав России, 1997. С.45.

134. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия, 1971.

135. Мельников Н.Н., Новожилов К.В., Белан С.Р., Пылова Т.Н. Справочник по пестицидам. М.: Химия, 1985. 35 с.

136. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М.: Мир, 1976. 320 с.

137. Перечень методик, внеснных в государственный реестр методик количественного химического анализа. М.: ГУАК Минприроды РФ, 1996. 6 с.

138. Перес-Бендига Д., Сильва М. Кинетические методы в аналитической химии. М.: Мир, 1991. 395 с.

139. Искандеров Р.Р. Применение холинэстеразных биосенсоров в анализе объектов окружающей среды и контроле качества вод. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Казань. 1993. 145 с.

140. Евтюгин Г.А., Стойкова Е.Е., Никольская Е.Б., Будни ков Г.К. Влияние ионов металлов на колориметрическое определение необратимых ингибиторов холинэстеразы.// Журн.аналит.хим ии. 1997. Т.52. №2. С. 188-192.

141. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. / Под ред. Клисенко М.А. М.: Колос, 1983. С.97-99, 120-127.

142. Малинин О.А Определение хлорорганических и некоторых фосфор-органических пестицидов. // Ветеринария. 1980. №11. С.62-64.

143. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V., Featlierstone R.M. A new and rapid colorimetric détermination of acetylcholinesterase activity. // Biochem. Pharmacol. 1961. V.7. №1. P.88-95.

144. Mionetto N., Marty J.-M., Karube I. Acetylcholinesterase in organic solvents for tlie détection of pesticides: biosensor application.// Biosensors Bioelectron. 1994. V.9. №6. P.463-470.

145. Кузнецова Л.П., Никольская Е.Б. Влияние солевого состава среды и этанола на холинэстеразный гидролиз некоторых субстратов. // Укр.биохим. журн. 1988. Т.60. №4. С.35-40.

146. Бресткин А.П., Майзель Е.Б., Розенгарт Е.В. Влияние некоторых органических растворителей на реакционную способность холинэстеразы. // Биохимия. 1969. Т.34. №5. С.1062-1067.

147. Evtugyn G.A., Rizaeva Е.Р., Stepanova N.Ju., Petrov A.M. Preliminary testing of waste and sewage waters based on cholinesterase biosensor.// Environ.Radiol. AppI.Ecol. 1997. V.3. №1. P.7-12.

148. Kendall M.G., Stuart A. Hie Advanced theory of statistics. London, 1966. V.3. 680 p.

149. Уоссермен Ф. Нейрокомпьютерная техника : теория и практика. М.: Мир, 1992. 240с.

150. Krose В J., van der Srriagt P.P. An introduction to neural network. Amsterdam: The University of Amsterdam, 1993. 129 p.

151. Benediktsson J.A., Sveinsson j.r. Feature extraction for rnultisource data classification with artificial neural networks.// Int.J.Remote Sensing. 1997. ¥.18. №4. P.727-740.