Амперометрические пероксидазные сенсоры на основе графитовых электродов для оценки загрязнения окружающей среды тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.16, кандидат химических наук Габсабирова, Регина Расимовна

• Габсабирова, Регина Расимовна
• кандидат химических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат химических наук Габсабирова, Регина Расимовна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ В ОПРЕДЕЛЕНИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ - СУБСТРАТОВ И ЭФФЕКТОРОВ (Литературный обзор).

2.1. Общая характеристика пероксидазы.

2.2. Создание и особенности функционирования пероксидазных сенсоров.

2.2.1. Иммобилизация пероксидазы.

2.2.2. Установление электрохимического контакта между электродом и пероксидазой. Определение пероксида водорода.

2.3. Применение пероксидазного сенсора для определения органических и неорганических токсикантов.

2.3.1. Определение легко окисляющихся органических соединений.

2.3.2. Определение ингибиторов пероксидазы.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Реактивы и расходные материалы.

3.2. Приборы и оборудование.

3.2.1. Изготовление пероксидазного сенсора и измерение его сигнала.

3.2.2. Фотометрическое измерение холинэстеразной активности.

3.2.3. Отбор и анализ проб промышленных сточных вод.

4. ОПЕРАЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПЕРОКСИДАЗНОГО СЕНСОРА.

4.1. Выбор условий измерения пероксидазной активности.

4.2. Оценка сигнала в отношении модельных токсикантов - субстратов и ингибиторов пероксидазы.

5. ОЦЕНКА ПЕРОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ СТОЧНЫХ ВОД.

5.1. Общая оценка тестирования сточных вод с помощью биосенсоров.

5.2. Характеристика основных гидрохимических и биохимических показателей сточных вод.

5.3. Построение прогнозных моделей.

5.4. Связь показателей биосенсоров с характеристиками токсичности сточных вод

6. ПЕРОКСИДАЗНАЯ И ХОЛИНЭСТЕРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ

ПРОИЗВОДНЫХ ПИРИДОКСИНА.

6.1. Влияние производных пиридоксина на пероксидазное окисление гидрохинона.

6.2. Антихолипэстеразная активность аминопроизводных циклических ацеталей и кеталей пиридоксина.

7. ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИХ ИСТОЧНИКОВ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Амперометрические пероксидазные сенсоры на основе графитовых электродов для оценки загрязнения окружающей среды»

Актуальность работы. Современное развитие экологического мониторинга отличается повышенным вниманием, уделяемым развитию средств экспресс-оценки состояния окружающей среды на основании токсикологических критериев. Целью применения таких нестандартных средств диагностики является совокупная оценка неблагоприятных последствий всей совокупности токсикантов, присутствующих в объекте контроля, на биоту [1]. Такая оценка должна предшествовать полному анализу физико-химических и токсикологических свойств образца, требующему дорогостоящего лабораторного оборудования (хроматомасс-спектрометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография и др. [2]) и высокой квалификации обслуживающего персонала. Экспресс-системы оповещения о токсичности призваны заполнить существующий разрыв между потребностью населения и контролирующих природоохранных органов в достоверной информации о качестве среды обитания и реальными сроками ее получения.

Ферменты как никакие другие биологические компоненты подходят для создания и использования экспрессных биологических тестов в экоаналитическом контроле окружающей среды. Они обеспечивают получение быстрого и чувствительного сигнала и способны в течение нескольких минут определить присутствие той или иной группы токсических веществ в объекте контроля. Немаловажно, что влияние токсикантов на ферменты поддается количественной обработке и может быть осуществлено с использованием стандартных процедур, достаточно распространенных в биотехнологии, клиническом анализе и микробиологической промышленности.

Принцип оценки присутствия опасного вещества по его биологическому эффекту характерен для биологического мониторинга [1], однако в случае ферментных тестов становится возможна количественная оценка токсического эффекта. Это расширяет сферу применения экологического мониторинга и позволяет одновременно решать задачи экотоксикологии и экологического нормирования поступающих загрязняющих веществ.

Вместе с тем, практическое использование биохимической диагностики экотоксикантов требует предварительного решения задач стандартизации отклика на основные поллютанты. Эта проблема особенно актуальна, если объект отличается разнообразием макро- и микрокомпонентов, что типично для промышленных сточных вод и отходов производства и потребления. Требуется надежная теоретическая и экспериментальная база для производства и эксплуатации ферментных тестов, в том числе с использованием серийно выпускаемого измерительного оборудования.

Пероксидаза - один из наиболее изученных ферментов, широко используемых в биоаналитических методах исследования. Это связано с уникально широким кругом субстратов, к числу которых относятся фенолы, анилины, аскорбиновая кислота, ароматические амины и другие соединения - индикаторы состояния метаболических процессов и стрессовых состояний живых организмов [3]. Кроме того, пероксидазы отличаются высокой стабильностью и многообразием способов регистрации активности. Не случайно данный фермент используется в качестве метки в иммуноферментном анализе и в контроле активности оксидаз, в первую очередь, в составе глюкозных сенсоров.

Все это делает пероксидазу одним из перспективных объектов для включения в состав ферментных сенсорных устройств, предназначенных для оценки загрязнения окружающей среды. Пероксидазные сенсоры могут найти применение в контроле загрязнения сточных вод, содержащих малоустойчивые органические соединения и тяжелые металлы. Это хозяйственно-бытовые стоки, сточные воды фармацевтической и пищевой промышленности, ливневой сток крупных населенных пунктов и т.д.

В этой связи настоящая работа, посвященная эколого-аналитическому применению пероксидазного сенсора, является актуальной.

Целью настоящей работы явилось создание и всесторонняя характеристика пероксидазного сенсора на основе планарного графитового электрода, предназначенного для контроля содержания основных токсикантов и обобщенной оценки загрязнения сточных вод.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- определить оптимальные условия иммобилизации пероксидазы и измерения сигнала сенсора в присутствии различных токсикантов и сточных вод;

- оценить чувствительность сигнала пероксидазного сенсора к модельным токсикантам в однокомпонентных растворах;

- установить факторы, влияющие на проявление токсических свойств субстратов и эффекторов пероксидазы, а также вклад неферментативных путей образования конечных продуктов, регистрируемых электрохимически; ■""

- провести скрининг пероксидазной активности новых ранее не изучавшихся соединений с различными функциональными группами (циклические производные пиридоксина) "> для установления влияния их строения на пероксидазную активность;

- провести тестирование сточных вод предприятий г.Казани и установить зависимости ■ между сигналом пероксидазного сенсора при различных разведениях вод, гидрохимическими и токсикологическими характеристиками стоков с привлечением современных методов статистического анализа.

Научная новизна работы заключаются в том, что:

- впервые предложено использовать пероксидазный сенсор для количественной характеристики замещенных фенолов и анилинов - потенциальных компонентов сточных вод;

- определены рабочие условия измерения сигнала, позволяющие разделить влияние отдельных групп токсикантов и неферментативные (каталитические) стадии образования продуктов на сигнал биосенсора;

- впервые установлено влияние процессов каталитического окисления гидрохинона в присутствии ионов металлов на изменение сигнала пероксидазного сенсора в широком диапазоне рН и концентраций реагентов;

- впервые охарактеризованы свойства циклических замещенных пиридоксинов как эффекторов пероксидазы;

- впервые показана возможность использования показателя пероксидазной активности для классификации сточных вод по степени их очистки и источнику поступления, установлена корреляция сигнала биосенсора с результатами биотестирования на Paramecium caudatum (острая токсичность).

Практическая значимость работы состоит в том, что:

- разработаны простые и удобные способы иммобилизации пероксидазы и регистрации пероксидазной активности по току восстановления бензохинона, образующегося- в реакции с участием гидрохинона на поверхности амперометрического сенсора;

- предложены методики определения замещенных фенолов и анилинов - субстратов пероксидазы, а также оценки загрязненности промышленных сточных вод без трудоемких способов пробоподготовки;

- на примере циклических производных пиридоксина предложены подходы к оценке влияния структуры соединений на их пероксидазную активность, а также предложены упрощенные процедуры предварительного скрининга биохимической активности новых синтезированных органических соединений, содержащих несколько потенциальных центров связывания с ферментом.

На защиту выносятся:

- исследование влияния условий иммобилизации и измерения сигнала на чувствительность определения органических субстратов и неорганических ингибиторов пероксидаз и вывод о характере влияния упомянутых факторов на сигнал пероксидазного сенсора;

- обоснование возможности применения пероксидазного сенсора в предварительной оценке уровня и характера загрязнения муниципальных и промышленных сточных вод;

- сравнительное изучение процессов каталитического и ферментативного окисления гидрохинона пероксидом водорода в присутствии ионов металлов и вывод о вкладе неферментативных реакций в сигнал пероксидазного сенсора в присутствии солей никеля, кадмия, свинца и ртути (II);

- классификация сточных вод по показателям пероксидазной активности и вывод о возможности определения источника и степени загрязненности сточных вод по совокупности гидрохимических, экотоксикологических и биосенсорных данных;

- скрининг пероксидазной активности циклических производных пиридоксина и подходы к определению центров связывания и механизма взаимодействия полифункциональных неспецифических ингибиторов фермента.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на-Итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2001, 2002 гг.), Всероссийском симпозиуме "Тест-методы химического анализа" (2001 г.), Поволжской конференции по аналитической химии (2001 г.), Всероссийской конференции с международным участием "Актуальные проблемы аналитической химии" (2002 г.), Международной конференции по аналитической химии Euroanalysis-12 (Дортмунд, Германия, 2002 г.), III Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003 г.).

Основные результаты изложены в 1 статье и 6 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 странице машинописного текста, включает 31 рисунок и 26 таблиц. Состоит из введения,

Заключение диссертации по теме «Экология», Габсабирова, Регина Расимовна

1. Разработан пероксидазный сенсор на 0С1юве пероксидазы из хрена, иммобилизованной на поверхности графитового планарного электрода путем кросс-сшивки глутаровым альдегидом в присутствии стабилизирующих добавок желатина. Для мониторинга пероксидазной активности использован гидрохинон, дающий стабильный сигнал, отнесенный к восстановлению окисленной формы (бензохинона), образующейся в ферментативной реакции в присутствии пероксида водорода.2. Пероксидазный сенсор позволяет обнаруживать широкий круг потенциальных загрязнителей (производные фенола и анилина, тяжелые металлы, ряд азоторганических соединений и органических растворителей) как субстратов и ингибиторов фермента в МИЛЛИ- и микромолярном диапазоне их содержания, что позволяет использовать биосенсор для предварительной оценки уровня и характера загрязнения муниципальных и промышленных сточных вод.3. Исследование реакций гидрохинона в условиях измерения сигнала выявило вклад неферментативных реакций в образование бензохинона в присутствии солей никеля, кадмия, свинца и ртути (II), что расширило диапазон изменения сигнала пероксидазного сенсора при тестировании сточных вод, содержащих значительные количества окисляющихся органических веществ и солей металлов.4. Совместное использование гидрохимических и биосенсорных данных позволило провести классификацию сточных вод по их источнику и степени очистки с успешностью прогноза до 80%. Установлена корреляция показателя пероксидазной активности исследованных муниципальных и хозяйственно-бытовых стоков с их острой токсичностью для Daphnia magna и Paramecium caudatum.5. На основе изучения пероксидазной активности семичленных циклических ацеталей и кеталей - производных пиридоксина - установлено влияние стерических и конформационных факторов в их биологическую активность и возможность определения указанных соединений по их активирующему действию на фермент в наномолярном диапазоне концентраций.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Габсабирова, Регина Расимовна, 2003 год

1. Экологический мониторинг. 4.1. Методы биомониторинга. / Под ред. Гелашвили Д.Б. Н.Новгород: Изд-во Нижегород. ун-та, 1995. - 190 с.

2. Майстренко В.Н. Эколого-аналитический мониторинг суперэкотоксикантов / В.Н. Майстренко, Р.З. Хамитов, Г. К. Будников. М.: Химия, 1996.-319 с.

3. Nondestructive Biomarkers in Vertebrates (eds. Walker C.H., Thompson H.M.).- Siena, May 25-27,1992.- 65 P.

4. Андреева B.A. Фермент пероксидаза. М.: Наука. 1988.-161 с.

5. Газарян И.Г. Пероксидазы растений. Итоги науки и техники. Биотехнология. М.: ВИНИТИ. 1992. Т. 36. 4-28.

6. Thevenot D.R. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification / D.R.Thevenot, K.Toth, R.A.Durst, G.S.Wilson // Pure Appl. Chem.-1999.- V.71.- P.2333-2348.

7. Биосенсоры: основы и приложения / Под ред. Тернера Э., Карубэ И., Уилсона Дж, М.: Мир, 1992.-615 с.

8. Dennison M.J. Biosensors for environmental monitoring / M.J.Dennison, A.P.F.Turner // Biotech. Advances-1995.- Vol.13.- P.1-12.

9. Venugopal V. Biosensors in fish production and quality control // Biosens. Bioelectron.- 2002.-V.17.-P.147-157.

10. Electrochemical sensors in bioanalysis / R.-I. Stefan, J. F. van Staden, H.Y.Aboui-Enein, Marcel Dekker. New York: Basel, 2001.- 311 p.

11. Wang B. Sol-gel thin-film immobilized soybean peroxidase biosensor for the amperometric determination of hydrogen peroxide in acid medium / B.Wang, B.Li, Z.Wang, G.Xu, Q.Wang, S.Dong// Anal. Chem.-1999.- V.71.- P.1935-1940.

12. Conesa A. Fungal peroxidases: molecular aspects and applications /A.Conesa, P.J,Punt, C.A.M.J.J. van den Hondel // J.Biotechnol.- 2002.- V.93.- P. 143-158.

13. Bagirova N.A. Enzymatic determination of phenols using peanut peroxidase / N.A.Bagirova, T.N.Shekhovtsova, R.B. van Huystee // Talanta.- 2001.- У.55.- P.1151-1164.

14. Sadeghi S.J., Mediated electrochemistry of peroxidases - effect of variations in protein and mediator structures / SJ.Sadeghi, G.Gilardi, A.E.G.Cass // Biosens.Bioelectron.-1997.- V.12.-P.1191-1198.

15. Ferapontova E.E. Direct electron transferin the system gold electrode - recombinant horseradish peroxidases / E.E.Ferapontova, V.G.Grigorenko, A.M.Egorov, T.Borchers, T.Ruzgas, 1..Gorton//J. Electroanal. Chem.- 2001.- V.509.- P.19-26.

16. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / А.М.Егоров, А.П.Осипов, Б.Б.Дзантиев, Е.М.Гаврилова. М.: Высшая школа, 1991.- 288 с.

17. Veselova I. Visual determination of mercury(II) using horseradish peroxidase polymerized on polyurethane foam./1.Veselova, T.Shekhovtsova // Anal.Chim.Acta.-1999.- V.392.- P.151-158.

18. Veselova LA. Enzymatic determination of organomercury compounds using horseradish peroxidase immobilized in polyurethane foam / LA.Veselova, T.N.Shekhovtsova //Mendeleev Commun.- 2000.- № 6.- P.98-102.

19. Arefyev A.A. Flow-injection enzyme immunoassay of haptens with enhanced chemiluminescence detection / A.A.Arefyev, S.A.Eremin, S.B.Vlasenko, A.P, Osipov, A.M.Egorov // Anal.Chim.Acta.-1990.- V.237.- P.285-289.

20. Easton P.M. Quantitative model of the enhancement of peroxidase-induced luminal luminescence / P.M.Easton, A.C.Simmonds, A.Rakishev, A.M.Egorov, L.P.Candeias // J.Am.Chem.Soc-1996.- V.118.- P.6619-6624.

21. Rubtsova M.Yu. Chemiluminescent biosensors based on porous supports with immobilized peroxidase /M.Yu.Rubtsova, G.V.Kovba, A.M.Egorov// Biosens.Bioelectron.-1998.- V.13.-P.75-85.

22. Frew J.E. A method for estimation of hydrogen peroxide based on mediated electron transfer reactions of peroxidases at electrodes / J.E.Frew, M.A.Harmer, H.A.O.Hill S.I.Libor// J.Electroanal.Chem.-1986.- V.201, № 1.- P.1-10.

23. Schubert F. Mediated amperometric enzyme electrode incorporating peroxidase for the determination of hydrogen peroxide in organic solvents./ F.Schubert, S.Saini, A.P.F.Turner / Anal.Chim.Acta.-1991.- V.245, № 2.- P.133-138.

24. Park T.-M. Sol-gel based amperometric biosensor incoфorating an osmium redox polymer as mediator / T,-M.Park, E.l.Iwuoha, M.R.Smyth, R.Freaney, A.J.McShane // Anal.Commun.-1996.- V.33.- P.271-273.

25. Yan F. A reagentless amperometric biosensor based on the coimmobilization of horseradish peroxidase and methylene green in a modified zeolite matrix / F. Yan, B. Liu, J. Deng, J. Kong // Anal.Chim.Acta.-1999.- V.386, № 1-2.- P.31-39,

26. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы./ Под ред. И.В.Березина, В.К.Антонова, К.Мартинека. М.: Изд-во МГУ, 1976.- Т.2.- 358 с.

27. Zhao J. Direct electron transfer at horseradish peroxidase-colloidal gold modified electrode / Zhao J., Henkens R.W., Stonehuerner J., O'Daly J.P., Crumbliss A.L. // J. Electroanal. Chem.-1992.- V.327.- P. 109-119.

28. Gavalas V.G. Improved operational stability of biosensors based on enzyme-polyelectrolyte complex adsorbed into a porous carbon electrode / V.G.Gavalas, N.A Chaniotakis, T.D.Gibson // Biosens. Bioelectron.-1998.- V.13.- P.1205-1211.

29. Sun C. Fabrication of multilayer films containing horseradish peroxidase based on electrostatic interaction and their application as a hydrogen peroxide sensor / C.Sun, W.Li, Y.Sun, X.Zhang, J.Shen//Electrochim.Acta.- 1999.- V.44.- P.3401-3407.

30. Jonsson G. An electrochemical sensor for hydrogen peroxide based on peroxidase adsorbed on a spectrographic graphite electrode / G.J6nsson, L.Gorton // Electroanalysis. 1989.-V.1.-P.465-468.

31. Presnova G. Direct heterogeneous electron transfer of recombinant horseradish peroxidase on gold / G.Presnova, AEgorov, T.Ruzgas, A.Lindgren, L.Gorton, T.Borchers // Faraday Discuss.-2000.-V.116.-P.281-289.

32. Pandey P.C. Peroxide biosensors and mediated electrochemical regeneration of redox enzymes / P.C.Pandey, S.Upadhyay, B.Upadhyay // Anal.Biochem.- 1997.- V.252.- P.136-142.

33. Miao Y. Amperometric hydrogen peroxide biosensor with silica sol-gel/chitosan film as immobilization matrix./Y.Miao, S.N.Tan // Anal.Chim.Acta.- 2001.- V.437.- P.87-93.

34. Rosatto S.S. Biosensor for phenol based on the direct electron transfer blocking of peroxidase immobilising on silica-titanium / S.S.Rosatto, L.T.Kubota, G. de Oliveira Neto // Anal.Chim.Acta.- 1999.- V.390.- P.65-72.

35. Ruzgas T. The development of a peroxidase biosensor for monitoring phenol and related aromatic compounds / T.Ruzgas, J.Emneus, L.Gorton, G.Marko-Varga // Anal.Chim.Acta.-1995.-V.311.-P.245-253.

36. Li J. Viologen-thiol self-assembled monolayers for immobilized horseradish peroxidase at gold electrode surface / J.Li, J.Yan, Q.Deng, G.Cheng, S.Dong// Electrochim.Acta,-1997.-V.42.- P.961-967.

37. Berzina T.S. Study of horseradish peroxidase activity in alternate-layer Langmuir-Blodgett films / T.S.Berzina, L.Piras, V.l.Troitsky // Thin Solid Films.-1998.- V.327-329.- P.621-626.

38. Willner I. Integration of layered redox proteins and conductive supports for bioelectronics applications / I.Willner, E.Katz // Angew.Chem. Int.Ed.- 2000.- V.39.- P.l 180-1218.

39. Park Т.-М, Development of sol-gel enzyme inhibition based amperometric biosensor for cyanide / T.-M.Park, E.I.Iwuoha, M.R.Smyth // Electroanalysis.-1997.- V,9, №14.- P. 1120-1123.

40. Pandey P.C. An ormosil-based peroxidase biosensor - a comparative study on direct electron transport from horseradish peroxidase / P.C.Pandey, S.Upadhyay, I.Tiwari, V.S.Tripathi // Sensors Actuators B,- 2001.- V.72.- P.224-232.

41. Wang B. Sol-gel-derived amperometric biosensor for hydrogen peroxide based on methylene green incorporated in Nafion film / B.Wang, S.Dong // Talanta.- 2000,- V.51.- P.565-572.

42. Dong S. A novel enzyme electrode for the water-free organic phase / S.Dong, Y.Guo // J.Electroanal.Chem.-1994.- V.375.- P.405-407.

43. Adeyoju O. Determination of kinetic parameters for the inhibitory effects of organic sulphides on an amperometric peroxide biosensor in non-aqueous media / O.Adeyoju, E.I.Iwuoha, M.R.Smyth // Talanta,-1994.- V.41, № 9.- P.1603-1608.

44. Adeyoju O. Reactivities of amperometric organic phase peroxidase-modified electrodes in the presence and absence of thiourea and ethylenethiourea as inhibitors /O.Adeyoju, E.I.Iwuoha, M.R.Smyth//Anal.Chim.Acta.- 1995.- V.305.- P.57-64.

45. Qian J. Immobilization of horseradish peroxidase with a regenerated silk fibroin membrane and its application to a tetrathiafulvalene-mediating H2O2 sensor / J.Qian, Y.Liu, H.Liu, T.Yu, J.Deng// Biosens.Bioelectron.-1997.- V.12.- P.1213-1218.

46. Rosatto S.S. Effect of DNA on the peroxidase based biosensor for phenol determination in waste waters / S.S.Rosatto, G. di Oliveira Netto, L.T.Kubota // Electroanalysis.- 2001.- V.13, №6.- P.445-450.

47. Xu X. Ti02 sol-gel derived amperometric biosensor for H2O2 on the electropolymerized phenazine methosulfate modified electrode / X.Xu, J.Zhao, D.Jiang, J.Kong,-B.Liu, J.Deng // Anal.Bioanal.Chem.- 2002.- V.374.- P.1261-1266.

48. Liu B. An amperometric biosensor based on the coimmobilization of horseradish peroxidase and methylene blue on a a-type zeolite modified electrode / B.Liu, Z.Liu, D.Chen,J.Kong, J.Deng // Fresenius J.Anal.Chem.- 2000.- V.367.- P,539-544.

49. Liu B. A reagentless amperometric biosensor based on the coimmobilisation of horseradish peroxidase and methylene green in a modified zeolite matrix / B.Liu, F.Yan, J.Kong, J.Deng // Anal.Chim.Acta.-1999.- V.386,- P.31-39.

50. Rajendran V. Amperometric peroxide sensor based on horseradish peroxidase and toluidine blue 0-acrylamide polymer in carbon paste / V.Rajendran, E.Csoregi, Y.Okamoto, L.Gorton // Anal.Chim.Acta.- V.373.- P.241-251.

51. Ferri T. Direct electrochemistry of membrane-entrapped horseradish peroxidase. P.L A voltammetric and spectroscopic study / T.Ferri, A.Poscia, R.Santucci // Bioelectrochem. Bioenerg.-1998.- V.44.- P.177-181.

52. Zhanen Z. lectrochemical immobilization of horseradish peroxidase on an electro-activated glassy carbon electrode / Zhanen, L. Chenghong, S. Wenliang, L. Haiying, D. Jiaqi // J.Electroanal.Chem.-1996.- V.419, № 1.- P.85-91.

53. Gerard M. Application of conducting polymers to biosensors / M.Gerard, A.Chaubey, B.D.Malhotra // Biosens.Bioelectron.- 2002.- V.17.- P.345-359.

54. Cosnier S. Biomolecule immobilization on electrode surfaces by entrapment or attachment to electrochemically polymerized films. A review // Biosens.Bioelectron.-1999.- V.14.- P.443-456.

55. Palmisano F. Amperometric biosensors based on electrosynthesized polymeric films / F.Palmisano, P.G.Zambonin, D.Centonze // Fresenius J.Anal.Chem.- 2000.- V.366.- P.586-601.

56. Pham M.C. Voltammetric and XPS analysis of metal-complexed polytyramine films: geometry-dependent electron transfer therein / M.-C.Pham, P,-C.Lacaze, J.-E.Dupois // J.Electrochem.Soc.-1984.- V.131, № 4,- P.777-784.

57. Situmorang M. Immobilisation of enzyme throughout a polytyramine matrix: a versatile procedure for fabricating biosensors / M.Situmorang, J.J.Gooding, D.B.Hibbert // Anal. Chim. ' Acta.-1999.- V.394.- P.211-223.

58. Long D.D. Amperometric hydrogen peroxide sensor electrodes coated with electropolymerized tyrosine derivative and phenolic films / D.D.Long, K.A.Marx, T.Zhou // J.Electroanal.Chem.- 2001.- V.501.- P.107-113.

59. Cosnier S. Electropolymerization of amphiphilic monomers for designing amperometric biosensors // Electroanalysis.-1997.- V.9.- P.894-902.

60. Tatsuma T. Feroxidase-incoфorated polypyrrole membrane electrodes / T.Tatsuma, M.Gondaira, T.Watanabe // Anal.Chem.-1992.- V.64.- P.1183-1187.

61. Tian F. Hydrogen peroxide biosensor with enzyme entrapped within electrodeposited polypyrrole based on mediated sol-gel derived composite carbon electrode / F.Tian, B.Xu, L.Zhu, G.Zhu // Anal.Chim.Acta.- 2001.- V.443.- P.9-16.

62. Razola S.S. Hydrogen peroxide sensitive amperometric biosensor based on horseradish peroxidase entrapped in a polypyrrole electrode / S.S.Razola, B.L.Ruiz, N.M.Diez, H.B.Mark, J.-M. Kauffmann // Biosens.Bioelectron.- 2002.- V.17.- P.921-928.

63. Belanger D. Electrochemistry of the polypyrrole glucose oxidase electrode / D.Belanger, J.Nadreau, G.Fortier//J.Electroanal.Chem.-1989.- V.274.- V.143-155.

64. Palmisano F. Correlation between permeselectivity and chemical structure of overoxidized polypyrrole membranes used in electroproduced enzyme biosensors / F.Palmisano, C.Malitesta, D.Centonze, P.G.Zambonin // Anal.Chem.- 1995.- V.67.- P.2207-2211.

65. Mulchandani A. Ferrocene conjugated m-phenylenediamine conducting polymer- incorporated peroxidase biosensors / A.Mulchandani, S.Pan // Anal.Biochem.-1999.- V.267.-P.141-147.

66. Deng Q. Mediatorless hydrogen peroxide electrode based on horseradish peroxidase entrapped in poly(o-phenylenediamine) / Q.Deng, S.Dong // J.Electroanal.Chem.-1994.- V.377.-P.191-195.

67. Nakabayashi Y. Amperometric biosensors for sensing of hydrogen peroxide based on electron transfer between horseradish peroxidase and ferrocene as mediators./ Y.Nakabayashi, H.Yoshikawa // Anal.Sci.- 2000.- V.16.- P.609-613.

68. Xiao Z. A reagentless hydrogen peroxide sensor based on incoфoration of horseradish peroxidase in poly(thionine) film on a monolayer modified electrode / Z.Xiao, H.-X. Ju, H.Y.Chen//Anal.Chim.Acta.- 1999.- V.391.- P.299-306.

69. Yang R. A H2O2 biosensor based on immobilization of horseradish peroxidase in electropolymerized methylene green film on GCE /R.Yang, C.Ruan, J.Deng // J.Appl. Electrochem.-1998.- V.28.- P.1269-1275.

70. Bartlett P.N. An enzyme switch employing direct electrochemical communication between horseradish peroxidase and a poly(aniline) film / P.N.Bartlett, P.R.Birkin, J.H.Wang // Anal.Chem.-1998.- V.70.- P.3685-3694.

71. Iyengar S. Frequency domain selection of the peroxidase signal for amperometric biosensors / S.Iyengar, E.A.H.Hall, N.G.Skinner, J.J.Gooding // Electroanalysis.-1998.- V.IO.- P. 1089-1095.

72. Tatsuma T. Peroxidase incoфorated sulfonated polyaniline- polycation complexes for electrochemical sensing of H2O2 / T.Tatsuma, T.Pgawa, R.Sato, N.Oyama // J.Electroanal. Chem.- 2001.- V.501.- P.180-185.

73. Yang Y. Bioelectrochemical responses of the polyanline horseradish peroxidase electrodes / Y.Yang, S.Mu // J.Electroanal.Chem.-1997.- V.432.- P.71-78.

74. Bowers L.D. Immobilized enzymes in analytical biochemistry / L.D.Bowers, P.W.Carr // Advances in Biochem.Eng.-1980.- V.15.- P.89-129.

75. Березин И.В. Иммобилизованные ферменты / И.В.Березин, Н.Л.Клячко, А.В.Левашов, К, Мартинек, В.В.Можаев, Ю.Л.Хмельницкий. М.: Высшая школа, 1987.- 159 с.

76. Jin Z. А novel method for polyaniline synthesis with the immobilized horseradish peroxidase enzyme / Z.Jin, Y.Su, Y.Duan // Synth.Metals- 2001.- V.122.- P. 237-242.

77. Han S. A methylene blue-mediated enzyme electrode for the determination of trace mercury(II), mercury(I), methylmercury, and mercury-glutathione complex / S.Han, M.Zhu, Z.Yuan, X.Li // Biosens.Bioelectron.- 2001.- V.16.- P.9-16.

78. Razola S.S. Reagentless enzyme electrode based on phenothiazine mediation of horseradish peroxidase for subnanomolar hydrogen peroxide determination / S.S.Razola, E.Aktas, J.-C.Vire, J.-M.Kauffmann // Analyst.- 2000.- V.125.- P.79-85.

79. Danilowicz С An Os(byp)2ClPyCH2NH poly(allylamine)hydrogel mediator for enzyme wiring at electrodes / C. Danilowicz, E. Gorton, F. Battaglini, E. J. Calvo // Electrochim.Acta.-1998.-V.43.-P.3525-3531.

80. Caspar S. Biosensors based on novel plant peroxidases: a comparative study / S.Gaspar, I.C.Popescu, I.G.Gazaryan, A.G.Bautista, I.Yu.Sakharov, B.Mattiasson, E.Csoregi // Electrochim. Acta.- 2000.- V.46.- P.255-264.

81. Buck S. Use of a peroxidase reactor in flow injection analysis for the determination of chloramine and the inhibition kinetics / S.Buck, K.Stein, G.Schwedt // Anal. Chim. Acta.-1999.-V.390.-P.141-146.

82. Smit М.Н. Cyanide detection using a substrate-regenerating peroxidase based biosensor / M.H.Smit, A.E.G.Cass // Anal.Chem.-1990.- V.62.- P.2429-2436.

83. Darder M. Dithiobissuccinimidyl propionate as an anchor for assembling peroxidases at electrodes surfaces and its application in a H2O2 biosensor // M.Darder, K.Takada, F.Pariente, E.Lorenzo, H.D.Abruna // Anal.Chem.-1999.- V.71, № 24.- P.5530-5537.

84. Li B. Synthesis of a self-gelatinizable grafting copolymer of poly(vinyl alcohol) for construction of an amperometric peroxidase electrode / B.Li., L.Niu, W.Kou, Q.Deng, G.Cheng, S.Dong//Anal.Biochem.-1998.- V.256, № 1.- P.130-132.

85. Gamburzev S. Bifunctional hydrogen peroxide electrode as an amperometric transducer for biosensors / S.Gamburzev, P.Atanasov, A.L.Ghindilis, E.Wilkins, A.Kaisheva, Llliev // Sensors Actuators B. -1997.- V.43, № 1-3.- P.70-77.

86. Ruzgas T. Peroxidase-modified electrodes: fundamentals and application / T. Ruzgas, Csoregi E., J.Emneus, LGorton, G.Marko-Varga // Anal.Chim.Acta.-1996,- V.330.- P.123-138.

87. Matos R.C. Flow-injection system with enzyme reactor for differential amperometric determination of hydrogen peroxide in rainwater / R.C.Matos, J.J.Pedrotti, L.Angnes // Anal. Chim.Acta.- 2001.- V.441.- P.73-79.

88. Ghindilis A.L. Potentiometric biosensors for cholinesterases inhibitor analysis based on mediatorless bioelectrocatalysis / A.L.Ghindilis, T.G.Morzunova, A.V.Barmin, I.N. Kurochkin // Biosens.Bioelectron.-1996.- V.ll , № 9.- P.873-880.

89. Гиндилис А.Л. Потенциометрические электроды для определения холина, бутирилхолина и ингибиторов холинэстераз / А.Л.Гиндилис, И.Н.Курочкин // Прикл.биохим.микробиол.-1998.- Т.34, №3.- 326-331.

90. Csoregi Е. Mediatorless electrocatalytic reduction of hydrogen peroxide at graphite electrodes chemically modified with peroxidases / E.Csoregi, CJonsson-Pettersson, L.Gorton // J. Biotechnol.-1993.- V.30.- P.315-337.

91. Ferapontova E. Adsoфtion of differently charged forms of horseradish peroxidase on metal electrodes of different nature: effect of surface charges / E. Ferapontova, E. Dominguez // Bioelectrochemistry.- 2002.- V.55.- РЛ27-130.

92. Ferri T. Direct electrochemistry of membrane-entrapped horseradish peroxidase. P. II: Amperometric detection of hydrogen peroxide / T.Ferri, A.Poscia, R.Santucci // Bioelectrochem.Bioenerg.-1998.- V.45.- P.221-226.

93. Huang R. Direct electrochemistry and electrocatalysis with horseradish peroxidase in Eastman AQ films / R.Huang, N.Hu // Bioelectrochemistry.- 2001.- V.54.- P.75-81.

94. Ferapontova E. Effect of pH on direct electron transfer between graphite and horseradish peroxidase / E.Ferapontova, E.Puganova // J.Electroanal.Chem,- 2002.- V.518.- P.20-26.

95. Li J. The electrochemical study of oxidation-reduction properties of horseradish peroxidase /J.Li, S.Dong//J.Electroanal.Chem. -1997.- V.431 - P. 19-22.

96. Варфоломеев Д. Конверсия энергии биокаталитическими системами. М.: Изд-во " МГУ, 1981.-С.256.

97. Кулис Ю.Ю., Разумас В.Й. Биокатализ в электрохимии органических соединений / Ю.Ю.Кулис, В.Й.Разумас. Вильнюс: Мокслас, 1981.- 168 с.

98. Ryabov А. Steady-state kinetics, micellar effects, and the mechanism of peroxidase- catalyzed oxidation of n-alkylferrocenes by hydrogen peroxide / A.D.Ryabov, V.N.Goral // JBIC-1997.- V.2.- РЛ82-190.

99. Sanchez P.D. Peroxidase-ferrocene modified carbon paste electrode as an amperometric sensor for the hydrogen peroxide assay / P.D.Sanchez, J.M.Ordieres, A.C.Garcia, P.T.Blanco/ZElectroanalysis.-1991.- V.3, № 9.- P.281-287.

100. Zhang J.Z. Functionalized inorganic-organic composite material derivated by sol-gel for construction of mediated amperometric hydrogen peroxide biosensor / J.Z.Zhang, B.Li, Z.X.Wang, CJ.Cheng, S.J.Dong // Anal. Chim. Acta.-1999.- V.388.- P.71-78.

101. Jiao К, Application of p-phenylenediamine as an electrochemical substrate in peroxidase- mediated voltammetric enzyme immunoassay / K.Jiao, W.Sun, S.-S.Zhang, G.Sun // Analytica Chim.Acta.- 2000.- V.413.- P.71-78.

102. Desmond D. A lactoperoxidase-based flow injection amperometric biosensor for iodide detection / D.Desmond, D.Compagnone, B.Lane, J.Alderman, J.D.Glennon, G.G. Guilbault // Sensors and Actuators В.-1998.- V.47.- P.30-36.

103. WoUenberger U. Enzyme electrodes using bioelectrocatalytic reduction of hydrogen peroxide / U.Wollenberger, V.Bogdanovskaya, S.Bobrin, F.Scheller, M.Tarasevich // Anal. 1.ett.- 1990.- V.23.- P.1795-1808.

104. Palecek E. Past, present and future of nucleic acids electrochemistry // Talanta.- 2002.- V.56.- P.809-819.

105. Cheng X. Spectroelectrochemical investigation of direct electron transfer between resting . horseradish peroxidase and its oxidation states promoted by DNA / X.Chen, C.Ruan, J.Kong, J.Deng // Fresenius J.Anal.Chem.- 2000.- V.367.- P.172-177.

106. Marko-Varga G. Development of enzyme-based amperometric sensors for the determination of phenolic compounds / G.Marko-Varga, J.Emneus, L.Gorton, T.Ruzgas // Trends in Anal.Chem.-1995.- V.14.- P.319-328.

107. Serra B. Graphite-teflon-peroxidase composite electrochemical biosensors. A tool for the wide detection of phenolic compounds / B.Serra, B.Benito, L.Agiii, A.J.Revielo, L.M.Pingarr6n // Electroanalsis.- 2001.- V,13, №3-4.- P.693-700.

108. Yu J. Phenol conversion and dimeric intermediates in horseradish peroxidase-catalyzed phenol removal from water/J.Yu, K.E.Taylor, H.Zou, N.Biswas, J.K.Bewtra // Environ.Sci. Technol.- 1994.- V.28.- P.2154-2160.

109. Юibanov A.M. Enzymatic removal of toxic phenols and anilines from wastewater / A.M.Юibanov, B.N.Alberti, E.D.Morris, L.M.Felshin //J.Appl.Biochem.-1980,- V.2.- P.414-421.

110. ЮШапоу A.M. Horseradish peroxidase for the removal of carcinogenic aromatic amines from water/A.M.Klibanov, E.D.Morris//Enzyme Microb.Technol.-1981.- V.3.- P.l 19-122.

111. Ganjidoust H. Role of peroxidase and chitosan in removing chlorophenols from aqueous solution / H.Ganjidoust, K.Tatsumi, S.Wada, M.ICawase // Water Sci.Technol.- 1996.- V.34.-P.151-155.

112. Arseguel D. Removal of phenol from coupling of talc and peroxidase. Application for depollution of waste water containing phenolic compounds / D.Arseguel, M.Baboulene // J. Chem.Technol.Biotechnol.- 1994.- V.61.- P.331-335.

113. Kanungo M. Studies on electropolymerization of aniline in the presence of dodecyl sulfate and its application in sensing urea / M.Kanungo, A.Kumar, A.Q.Contractor // J.Electroanal. Chem.- 2002.- V.528.- P.46-56.

114. Widera J. Electrochemical oxidation of aniline in a silica sol-gel matrix / J.Widera, J.A.Cox // Electrochem.Commun.- 2002.- V.4.- P.118-122.

115. Lomillo M.A.A. HRP-based biosensor for monitoring rifampicin / M.A.A.Lomillo, J.M. Kauffmann, M.J.A.Martinez // Biosens.Bioelectron.- 2003.- V.18.- P.1165-1171.

116. Шеховцова Т.Н. Тест-метод определения ртути на уровне ПДК с использованием пероксидазы, иммобилизованной на бумаге / Т.Н.Шеховцова, В.Чернецкая, Н.В.Белкова, И.Ф.Долманова // Журн.анал.химии.-1995.- Т.50, № 5.- 538-542.

117. Шеховцова Т.Н. Ферментативный метод определения фенолов с использованием пероксидаз различного происхождения / Т.Н.Шеховцова, А.Л.Лялюлин, Е.И.Кондратьева, И.Г.Газарян, И.Ф.Долманова//Журн. анал. химии.-1994.- Т.49, №12.- 1317-1323.

118. Gazaryan I.G. Determination of phenols using various peroxidases / I.G.Gazaryan, D.B. 1.oginov, A.L.Lialulin, T.N.Shekhovtsova // Anal.Letters.-1994.- V.27, №15.- P.2917-2930.

119. Шеховцова Т.Н. Ферментативный метод определения ртути в природной воде / Т.Н. Шеховцова, В.Чернецкая, И.Ф.Долманова // Журн.анал.химии.- 1995.- Т.50, №3.- 309-311.

120. Шеховцова Т.Н. Тест-метод определения ртути на уровне ПДК с использованием иммобилизованной пероксидазы / Т.Н.Шеховцова, В.Чернецкая, Е.Б.Никольская, И.Ф.Долманова//Журн. анал.химии.-1994.- Т.49, № 8.-С,862-867.

121. Shekhovtsova T.N. Determination of mercury at the picogram per milliliter level using immobilized peroxidase / T.N.Shekhovtsova, S.V.Chernetskaya // Analyt.Let.- 1994.- V.27, № 15.- P.2883-2898.

122. Shekhovtsova T.N. Determination of organomercury compounds and mercury(II) after their separation by thin-layer chromatography on "Silufol" / T.N.Shekhovtsova, S.V.Migunova, N.A.Bagirova // Mendeleev Commun.-1997.- V.3.- P.l 19-120.

123. Shekhovtsova T.N. Determination of organomercury compounds using immobilized peroxidase / T.N.Shekhovtsova, S.V.Migunova, N.A.Bagirova // Anal.Chim.Acta.- 1997.-V.344.-P.145-151.

124. Zhao J.G. Mediator-free amperometric determination of toxic substances based on their inhibition of immobilized horseradish peroxidase / J.G.Zhao, R.W.Henkens, A.L.Crumbliss // Biotechnol.Progr.-1996.- V.12, № 5.- P.703-708.

125. Шеховцова Т.Н. Ферментативный метод определения микроколичеств железа (III) и ряда ингибиторов пероксидазы / Т.Н.Шеховцова, В.Чернецкая, И.Ф.Долманова // Журн.аналит.химии.-1993.- Т.48, № 1.- 129-136,

126. Adeyoju О. Kinetic study of the inhibitory effects of methyl isothiocyanate on a peroxidase- modified platinum electrode in non-aqueous media / CAdeyoju, E.I.Iwuoha, M.R.Smyth // Anal. 1.etters.-1994.- V.27, № 11.- P.2071-2081.

127. Buck S. Use of a peroxidase reactor in flow injection analysis for the determination of chloramine and the inhibition kinetics / S.Buck, K.Stein, G.Schwedt // Anal.Chim.Acta.-1999.-V.390.- P.141-146.

128. Korytnyk W. А seven-membered cyclic ketal of piridoxol // J.Org.Chem.- 1962.- V.27.- P.3724-3726.

129. Шайхутдинова Г.Р.Связь структуры некоторых шести- и семичленных циклических ацеталей с реакционной способностью / Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Казань, 2000.-133 с.

130. ГОСТ Р 51592-2000. Вода. Общие требования к отбору проб. М.: Госстандарт России, 2000.-33 стр.

131. Перечень предельно допустимых концентраций и ориентировочно безопасных уровней воздействия вредных веществ для воды рыбохозяйственных водоемов. М.: Мединор, 1995.-221 с.

132. Перечень методик, внесенных в государственный реестр методик количественного химического анализа. М.: Государственное управление аналитического контроля Минприроды РФ, 1996. - 6 с.

133. Stiene М. Electrochemical characterization of screen-printed carbonaceous electrodes for the determination of peroxidase activity in novel screen-printed flow-through modules / M. Stiene, U.Bilitewski//Anal. Bioanal. Chem.- 2002.- V.372.- P.240-247.

134. Евтюгин Г.А. Биосенсоры для определения ингибиторов ферментов в окружающей среде / Г.А.Евтюгин, Г.К.Будников, Е.Б.Никольская // Успехи химии.- 1999.- Т.68.- №12.-С.1142-1167.

135. Guo L, Electrosynthesis of soluble polyaniline in acetic acid / L.Guo, G.Shi, Y.Liang// Polymer Bulletin.- 1998.- V.41.- P.681-686.

136. Xu J.-J. Amperometric determination of ascorbic acid at a novel 'self-doped' polyaniline modified microelectrode / J.-J.Xu, D.-M.Zhou, H.-Y.Chen // Fresenius J.Anal.Chem.- 1998.-V.362.- P.234-238.

137. Koul S. Conducting polyaniline composite: a reusable sensor material for aqueous ammonia / S.Koul, R.Chandra, S.K.Dhawan // Sensors Actuators В.- 2001.- V.75.- P-151-159.

138. MacDiarmid A.G. Polyanilines: a novel class of conducting polymers / A.G.MacDiarmid, A.Epstein// Faraday Discuss.Chem.Soc-1989.- P.317-332.

139. Evtugyn G.A. Preliminary testing of w a^ste and sewage waters based on cholinesterase biosensor / G.A.Evtugyn, E.P.Rizaeva, N.Ju.Stepanova, A.M.Petrov // Environ. Radiology Applied Ecology.- 1997.- V.3, №1.- P.7-12.

140. Евтюгин Г.А. Экспертная оценка загрязненности промышленных сточных вод с помощью холинэстеразных биосенсоров / Г.А.Евтюгин, А.А.Савельев, Е.П.Ризаева, Е.Е.Стойкова, В.З.Латыпова, Г.К.Будников // Экологическая химия.- 2000.- Т.9, № 2.-С.106-114.

141. Reemtsma Т. Prospects of toxicity-directed wastewater analysis.// Anal.Chim.Acta- 2000. V.426.- P.279-287.

142. Методы биотестирования качества водной среды./ Под ред.Филенко О.Ф. М.: Изд-во МГУ, 1989.-124 с.

143. Karube I. Biosensors for environmental control / I.Karube, Y.Nomura, Y.Arikawa // Trends Anal.Chem.-1995.- V.14, № 7.- P.295-298.

144. TothiU I.E. Developments in bioassay methods for toxicity testing in water treatment / I.E.Tothill, A.P.F.Turner// Trends Anal.Chem.-1996.- V.15, №5.- P.178-188.

145. Steinberg S.M. A review of environmental application of bioluminescence measurements / S.M.Steinberg, E.J.Poziomek, W.H.Engelmann, K.R.Rogers // Chemosphere 1995.- V.30. № 11.-P.2155-2197.

146. Белякова C.B. Холинэстеразные тесты в экологическом контроле биологически активных соединений / Диссертация на соискание ученой степени кандидата наук. Казань, 2002.-151 с.

147. Экологическая химия. Основы и концепции./ Под ред. Корте Ф. М.: Мир, 1996.- 396 с.