Белки ядерного матрикса, специфически связывающиеся с сателлитными ДНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Лобов, Иван Борисович

• Лобов, Иван Борисович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лобов, Иван Борисович

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. История открытия сателлитных ДНК

2. Организация стДНК

3. Эволюция стДНК

4. Роль стДНК в формировании центромера

5. Примеры консервативности последовательностей стДНК

6. Белки, специфически связывающиеся с стДНК

7. Консервативность структуры стДНК

8. Эпигенетические механизмы формирования гетерохромашна и центромера

9. Эффект положения и эктопическая конъюгация

10. Ядерный матрикс и скэффолд. Ассоциация стДНК с ядерным матриксом и скэффолдом

11. МАК/БАЯ-элементы. Белки, связывающиеся с МАИ/ЗАЯ-элементами

12. Вероятные функции стДНК

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.Клонированные последовательности

2. Выделение плазмидной ДНК, электрофорез ДНК и введение концевой метки в ДНК

3. Выделение ядер и ядерного матрикса из клеток печени

4. Экстракция белков ядерного матрикса и ионообменная хроматография белков на БЕАЕ- и СМ-сефарозе

5. Метод замедления в геле и выявление специфических антител при помощи метода замедления в геле

6. ДНК-футпринтинг

7. Получение антител к ДНК-белковым комплексам

8. Окрашивание белков в полиакриламидном геле

9. Иммуноблотшнг

10. Аффинная очистка антител

11. Саузвестерн-блотшнг

12. Иммунофлуоресцентное окрашивание и гибридизация in situ

13. Определение величины изгиба фрагментов ДНК

14. Другие методы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Выявление ДНК-связывающей активности, специфичной к мажорному сателлиту мыши

2. Идентификация белка, специфически связывающегося с мажорным сателлитом

3. Факторы, обусловливающие специфичность связывания р 120 с ДНК мажорного сателлита

4. Определение участков связывания р 120 в составе мажорного сателлита

5. Идентичность р 120 белку ядерного матрикса и скэффолда

SAF-A/SP120/hnRNP-U

6. Специфичность связывания белков ядерного матрикса с мажорным сателлитом и MAR гена иммуноглобулина к мыши

7. Специфичность связывания белков ядерного матрикса с центромерными и прицентромерными стДНК мыши и человека

8. Определение внутриклеточной локализации р 120

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

стДНК - сателлитная ДНК п.н. - пар нуклеотидов т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

MAR (Matrix Associated Regions) - участки ДНК, связанные с ядерным матриксом

SAR (Scaffold Attachment Regions) - участки ДНК, связанные со скэффолдом

интерфазных и митотических хромосом

БСА - бычий сывороточный альбумин

EDTA - этилендиамин тетрауксусная кислота

SDS - додецилсульфат натрия

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Белки ядерного матрикса, специфически связывающиеся с сателлитными ДНК»

ВВЕДЕНИЕ

История изучения тандемно организованных повторяющихся последовательностей - сателлитных ДНК (стДНК) - насчитывает более тридцати лет, однако роль этих последовательностей до сих пор остается далека от понимания. СтДНК являются одним из наиболее изменчивых в эволюции классов последовательностей генома, но они также его непременный, свойственный всем эукариотам, компонент (Беридзе, 1982).

СтДНК преимущественно локализованы в области центромера и теломеров - основных структурных элементов, обеспечивающих стабильность хромосом. В течение последнего десятилетия значительный прогресс был достигнут в изучении организации, механизмах формирования и функционировани теломера позвоночных. Показано, что теломеры позвоночных сформированы высоко консервативной простой тандемно организованной последовательностью ДНК (Moyzis et al., 1988). Среди стДНК, локализованных в области центромера, консервативный элемент, необходимый и достаточный для формирования функционального центромера, отсутствует. Таким образом^вариабельность стДНК находится в очевидном противоречии с функциональной консервативностью центр о мер а, в формировании которого они принимают участие (Tyler-Smith et al., 1998). До последнего времени общепринятой была гипотеза, что в основе формирования центромера лежат сиквенс-специфические ДНК-белковые взаимодействия. Так, в составе центромерных стДНК различных видов млекопитающих был выявлен общий мотив 17 п.н., который является сайтом связывания белка центромера CENP-B (Masumoto et ak., 1989). Высокая консервативность CENP-B позволила предположить, что он играет ключевую роль в формировании центромера. Однако отсутствие CENP-B в некоторых функционирующих центромерах и, напротив, его присутствие в составе участков хромосом, не выполняющих

функций центромера, противоречат данной гипотезе (Earnshaw et al., 1989; Moens, Pearlman, 1990; Broccoli et al., 1990). Вероятно, не определенная последовательность в составе стДНК центромера, а особенности ее структуры или структуры хроматина определяют формирование центромера. Однако, роль такого рода механизмов формирования центромера еще не исследована.

Несмотря на разнообразие последовательностей стДНК, для участков хромосом, содержащих стДНК? характерна особая структура хроматина -гетерохроматин. Гетерохроматиновые участки хромосом способны ассоциировать между собой специфичным для каждого типа клеток образом, образуя так называемые хромоцентры (Hsu et al, 1971; Куличков, Жимулев, 1976; Прокофьева-Бельговская, 1986). Этот процесс, получивший название эктопической конъюгации, может играть ключевую роль в пространственной организации хромосом в интерфазном ядре (Comings, 1980; Manuelidis, Borden, 1988). Конститутивный гетерохроматин может непосредственно влиять на экспрессию генов не только при хромосомных перестройках, когда ген переносится близко к гетерохроматину, но и в результате эктопической конъюгации участка эухроматина, с гетерохроматином в интерфазном ядре. Показано, что инактивированные (не транскрибируемые) гены в интерфазном ядре ассоциированы с гетерохроматином, в то время, как те же гены, находящиеся в активном состояние в клетках других типов, расположены независимо по отношению к гетерохроматину (Brown et al., 1997). Взаимодействие гетерохроматиновых районов хромосом между собой и с определенными участками эухроматина может играть ключевую роль в пространственной и функциональной организации хромосом в интерфазном ядре.

Структурные особенности молекулы ДНК так же, как и определенные нуклеотидные последовательности в ее составе могут служить сигналом для специфического взаимодействия с белками. Было показано, что стДНК имеют общие структурные характеристики (Martinez-Balbas et al., 1990; Fitzgerald et al.,

1994) и что некоторые белки способны распознать особенности структуры стДНК (Saitoh et. al., 1989). Таким образом, наличие у стДНК общих консервативных свойств позволяет предположить существование белков, специфически связывающих различные негомологичные стДНК, что может обеспечивать консервативность.

Различия в характере ассоциации хроматина с ядерным матриксом и скэффолдом - основной скелетной структурой ядра и митотических хромосом -могут определять различия в структуре эухроматина и гетерохроматина (Saitoh, Laemmli, 1994). СтДНК имеют ряд общих характеристик с последовательностями, участвующими в прикреплении петельных доменов хроматина к ядерному матриксу/скэффолду - MAR- (Matrix Associated Regions) или SAR- (Scaffold Attachment Regions) элементами. Также есть свидетельства обогащения остаточной ДНК в составе ядерного матрикса и скэффолда повторяющимися последовательностями (Matsumoto, 1981; Яровая, Разин, 1983; Strissel et al., 1996). Вероятно, белки, специфически связывающиеся с MAR/SAR-элементами, также способны взаимодействовать с стДНК. Однако, к настоящему моменту о характере взаимодействии стДНК с ядерным матриксом известно немного.

ДНК в составе эухроматина гетерогенна по своей природе, и лишь некоторые участки в ее составе связаны с ядерным матриксом/скэффолдом, подразделяя хромосомы на топологически независимые петльные домены со средней длиной около 75 т.п.н. СтДНК в силу их тандемной организации, напротив, гораздо более однородны, что может обусловливать совершенно иной, чем для эухроматина, тип взаимодействия с ядерным матриксом/скэффолдом и, как следствие, особую структуру хроматина. Было показано, что стДНК в составе ядерного матрикса представлена весьма протяженными фрагментами длиной около 10 т. п. н. (Яровая, Разин, 1983). Картирование участков прикрепления альфоидного сателлита человека к скэффолду (SAR) также показало примерно в 25-50 раз большую частоту

встречаемости этих участков по сравнению со средней для генома величиной (Strissel et al., 1996).

В данной работе для поиска белков ядерного матрикса, специфичных к стДНК, был использован мажорный сателлит мыши. Он составляет 5-10% от всей геномной ДНК Mus Musculus, и для него характерен исключительно низкий уровень дивергенции между отдельными мономерами (Vissel, Choo, 1989). Таким образом, характеристики отдельно взятой (клонированной) последовательности свойственны блокам данной стДНК в целом. С другой стороны, мажорный сателлит по ряду характеристик, таких как: прицентромерная локализация, наличие в составе последовательности олиго(А) блоков и изогнутая конфигурация молекулы, - сходен с стДНК различных видов млекопитающих. Таким образом, мажорный сателлит представляет собой адекватный объект для поиска и изучения ДНК-связывающих белков, специфичных по отношению к стДНК, и основные характеристики ДНК-белкового взаимодействия, определенные для мажорного сателлита, могут быть аналогичными в случае других стДНК.

Анализ локализации стДНК в составе хромосом или интерфазного ядра позволил приблизиться к пониманию их роли в организации и функционировании генома. Но последовательности ДНК функционируют лишь в комплексе со специфическими белками, таким образом, роль стДНК может быть понята лишь в связи с изучением ДНК-белковых взаимодействий, отвечающих за формирование специфической структуры гетерохроматина.

Конкретные задачи настоящей работы состояли в следующем:

1. Разработать метод частичной солюбилизации ядерного матрикса в условиях, не приводящих к денатурации белков.

2. Идентифицировать белки ядерного матрикса, специфически связывающиеся с мажорным сателлитом мыши.

3. Сравнить специфичность связывания белков ядерного матрикса с различными сателлитными ДНК.

4. Определить характеристики сателлитных ДНК, обусловливающие их специфическое связывание с белками ядерного матрикса.

5. Изучить внутриядерную локализации одного из выявленных белков.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Некодирующие последовательности ДНК составляют более 90% генома млекопитающих (Manuelidis, 1990). К их числу относятся два класса повторяющихся последовательностей: длинные и короткие рассеянные по геному (диспергированные) повторы и тандемно организованные сателлитные ДНК (стДНК). Поскольку функция этих последовательностьй до сих пор неизвестна, их зачастую относят к "эгоистической" или "мусорной" ДНК. Однако в последние годы значительный прогресс в понимании роли стДНК был достигнут в результате изучения основных структурных элементов хромосом - теломеров и центромера, в формировании которых стДНК принимают непосредственное участие, а также в связи с изучением структурно-функциональной организации интерфазного ядра.

1. История открытия сателлитных ДНК

СтДНК были впервые обнаружены Китом в 1961 году (Kit, 1961, 1962) как сателлитная фракция геномной ДНК, выявляемая при равновесном центрифугировании в градиенте плотности раствора хлористого цезия благодаря отличию в ее плавучей плотности от остальной ядерной ДНК. Использование ДНК-итеркалирующих красителей и солей тяжелых металлов (ртути и серебра) позволило увеличить разрешающую способность данного метода и обнаружить стДНК у большинства видов эукариот (Беридзе, 1982). Исследования по кинетике реассоциации ДНК показали, что геном эукариот помимо уникальных также содержит быстро ренатурирующие повторяющиеся последовательности (Britten, Kohne, 1968), и стДНК представляет собой фракцию высокоповторяющихся последовательностей, которая может составлять до нескольких десятков процентов от всей ядерной ДНК. Блоки стДНК длиной до нескольких миллионов пар нуклеотидов сформированы относительно короткими последовательностями - от нескольких до нескольких сот пар нуклеотидов, - которые объединены по принципу "голова к хвосту" -

тандема. СтДНК преимущественно локализованы в области ценромерного и теломерного конститутивного гетерохроматина (Pardue, Gall, 1970; Yasmineh, Yunis, 1970), который выявляется в составе митотических хромосом при помощи метода дифференциального С-окрашивания красителем Гимзы - С-сегменты (Прокофьева-Бельговская, 1986). В отличие от рассеянных или диспергированных повторов, которые активно траскрибируются в клетке,

стДНК как правило траскрипционно инертны. Значительные различия в количествах различных стДНК в геноме, а также обнаружение тандемно организованных последовательностей в составе эухроматина - мини- и микросателлитов - расширило рамки термина "сателлитная ДНК". Этим термином теперь обозначают любые тандемно организованные повторяющиеся последовательности. Однако для "классических" стДНК наиболее характерны следующие три признака: 1) тадемная организация последовательности; 2) 103-10б и более копий последовательности на гаплоидный геном; 3) локализация в области конститутивного гетерохроматина.

2. Организация стДНК

СтДНК принято различать по длине повторяющейся единицы

(мономера): стДНК с простой последовательностью, имеющие мономер длиной

несколько нуклеотидов, например сателлит Ш человека с повторяющейся единицей GGAAT, и стДНК, не имеющие короткой повторяющейся единицы (длина мономера более ста нуклеотидов), - сложные стДНК. Ко второму классу относится наиболее досконально изученная стДНК - альфоидный сателлит (а-сателлит) человека, а также мажорный и минорный сателлиты мыши.

Отдельные мономеры в составе стДНК могут различаться по нуклеотидной последовательности заменами, делециями или инсерциями нескольких нуклеотидов. Несколько различных мономеров объединяются в блоки - повторы высшего порядка, которые в свою очередь повторяются в виде тандема. Так, альфоидное семейство стДНК человека представлено сильно

дивергировавшими последовательностями с общим уровнем гомологии между отдельными мономерами 60-80% (Willard, Waye, 1987). От 2 до 18 мономеров альфоидного сателлита длиной 170-172 п.н. объединяются в повторы высшего порядка. При этом гомология между отдельными мономерами в составе такого блока может составлять лишь 60-80%, в то время как повторы высшего порядка почти идентичны между собой (90 и более процентов гомологии). Иерархическая организация так же показана для стДНК с простой последовательностью, например,для сателлита III человека (Choo et al., 1990), и, по-видимому, имеет почти универсальный характер. Различные варианты повторов высшего порядка характерны для отдельных хромосом или могут формировать независимые блоки в составе одной хромосомы (Waye et al., 1987; Wevrick, Willard, 1991; Ikeno et al., 1994; Не et al., 1998). Присутствие в составе центромерного района двух независимых, не перекрывающихся блоков альфоидной ДНК?показано для хромосом человека 7, 21 и X (Waye et al., 1987; Wevrick, Willard, 1991; Ikeno et al., 1994; Не et al., 1998) и весьма вероятно свойственно также и другим хромосомам человека. Различные хромосомо-специфичные варианты альфоидного сателлита локализованы в центромерах всех хромосом, в то время как различные стДНК с простой последовательностью - стДНК I, II и III (Prosser et al., 1986), семейства стДНК SAU3A (Agresti et al., 1987) и HAE3 (Agresti et al., 1989) - локализованы дистальнее по отношению к центромеру, в прицентромерном гетерохроматине, причем набор этих последовательностей и их локализация - хромосомо-специфичны (Lee et al., 1997).

Помимо высокого уровня внутривидовой изменчивости, проявляющейся в наличии хромосомо-спечифичных вариантов последовательностей, для стДНК также характерен высокий уровень межвидовой изменчивости. Так, два вида мыши Mus musculus и Mus spretus содержат различные количества одних и тех же стДНК. В геноме M. musculus обнаружено две стДНК - мажорный и минорный сателлиты, - которые составляют около 5-10% и 1% от всей ядерной

ДНК соответственно (Waring , Britten, 1966; Wong, Rattner, 1988). У M. spretus соотношение между количествами мажорного и минорного сателлитов оказывается обратным, - преобладает стДНК, гомологичная минорному I сателлиту (Narayanswami et al., 1992). Геном третьего вида мыши - Mus caroli -содержит лишь незначительные количества стДНК, гомологичной мажорному сателлиту, и не содержит минорного сателлита (Wong et al., 1990). Однако в геноме этого последнего вида выявлено д^ других стДНК с повторяющейся единицей длиной 60 и 79 п.н. (Kipling et al., 1995).

Организация стДНК мыши Mus Musculus - минорного и мажорного сателлитов - несколько отлична от той, которая свойственна альфоидному сателлиту человека. Блок мажорного сателлита отделяет единственное плечо телоцентрических хромосом мыши от блока минорного сателлита, который непосредственно примьпсает к теломеру (Kipling, 1995). Мажорный и минорный сателлиты мыши домовой Mus Musculus весьма однородны по нуклеотидной последовательности: в мажорном сателлите нуклеотидные последовательности мономеров различаются не более чем на 5 % (Vissel, Choo, 1989), а в минорном -примерно на 5.6 % (Kipling et al., 1994). Иерархическая организация, по-видимому, не характерна для этих стДНК. Наличие хромосомо-специфичных вариантов минорного сателлита также показано лишь для некоторых хромосом (Broccoli et al., 1991; Kipling et al., 1994).

3. Эволюция стДНК

СтДНК составляют наиболее нестабильную, вариабельную часть генома. Для них характерны как внутривидовая, так и межвидовая изменчивость. Концепции эволюции стДНК должны объяснять как высокий темп эволюции этих последовательностей, так и механизм возникновения тандемной, иерархической организации стДНК. Несмотря на то, что из-за отсутствия давления естественного отбора в стДНК очень быстро накапливаются мутации, блоки стДНК в целом весьма однородны по последовательности. По-видимому,

существует некий механизм, который обеспечивает "гомогенизацию" последовательностей в составе блоков стДНК.

В основе представлений о возникновении и эволюции тандемно организованных повторяющихся последовательностей лежат три гипотезы -гипотеза повторных циклов скачкообразной репликации (saltatory replication) (Southern, 1975), гипотеза неравного кроссинговера (Smith, 1976) и гипотеза конверсии последовательностей (Baltimore, 1981).

Анализ последовательностей отдельных мономеров стДНК показал различную частоту встречаемости мутаций для различных позиций в их составе. Первое объяснение этого явления предполагало существование особых "горячих точек" (hot spots),в которых мутации происходят с большей частотой, чем в среднем по последовательности. Второе объяснение, предложенное Саузерном (Southern, 1975), заключалось в том, что после первого этапа амплификации в стДНК происходит случайное постепенное накопление мутаций. На втором этапе амплифицируются лишь некоторые из мутировавших последовательностей, что приводит к наблюдаемой картине "неслучайного" распределения нуклеотидных замен в отдельных мономерах и возникновению иерархической организации стДНК.

Возникновение тандемно организованных последовательностей в результате скачкообразной амплификации исходной последовательности является быстрым, одномоментным событием, по-видимому, основанным на каком-либо механизме диспропорциональной репликации. Хотя конкретный механизм этого явления неизвестен, было предложено несколько моделей данного процесса. К примеру, ошибочное поведение ДНК-полимеразы может приводить к репликации последовательности по механизму "катящегося кольца" (Беридзе, 1982).

Несмотря на быстрое накопление мутаций в отдельных мономерных последовательностях, блоки стДНК в целом однородны. По-видимому, процесс гомогенизации последовательностей стДНК продолжается и по сей день, а не

ограничен лишь моментом исходной амплификации. Два механизма могут лежать в основе этого процесса: неравный кроссинговер (Smith, 1976, 1978) и конверсии последовательностей (генная конверсия; Baltimore, 1981).

Таким образом, в эволюции стДНК принимают участие два процесса: короткие периоды амплификации исходных последовательностей и постоянный процесс гомогенизации за счет обмена последовательностями (в основном между гомологичными хромосомами) на основе механизма неравного кроссинговера и (или) генной конверсии. Данные механизмы могут, с одной стороны^ поддерживать однородность блоков стДНК, с другой - обеспечивать постепенную "экспансию" - увеличение размеров блока стДНК. Существование хромосомо-специфичных вариантов стДНК, по-видимому, отражает тот факт, что процесс гомогенизации протекает преимущественно в рамках каждого отдельного блока стДНК и между гомологичными хромосомами.

Эволюционная консервативность признака, как правило, свидетельствует о его функциональной значимости. С одной стороны, высокая внутри- и межвидовая вариабельность последовательностей стДНК и отсутствие у них явных функций, с другой - присутствие стДНК в геномах всех высших эукариот не имеют достаточного объяснения. Одним из возможных решений этого противоречия является теория "эгоистичной" ДНК (Doolittle, Saienza, 1980;

I

Orgel, Crick, 1980), постулирующая отсутствие у некодирующих повторяющихся j последовательностей каких-либо биологических функций за исключением \ задачи собственного выживания в геноме. Однако повторяющиеся последовательности генома могут быть эгоистичны лишь по происхождению и в процессе эволюции приобретать определенные функции. В то же время, концепция Дулиттла и Сапиенсы более применима к повторам ретропозонового ^

типа, чем к стДНК и, как пояснялось авторами позднее (Дулиттл, 1982), I

(

направлена на объяснение механизмов возникновения и эволюции повторяющихся последовательностей и не исключает наличия у них какой-либо функций.

4. Роль стДНК в формировании центромера

О функциональной значимости стДНК свидетельствует локализация этих последовательностей в области центромера и теломеров - основных элементов, обеспечивающих стабильность хромосом.

Центромер является абсолютно необходимым элементом хромосомы, обеспечивающим правильное расхождение хромосом между дочерними клетками в митозе и мейозе. Центромер выполняет, по крайней мере, следующие функции: 1) служит участком сборки кинетохора - трехслойной пластинки, к которой прикрепляются микротрубочки веретена деления; 2) является участком ассоциации дочерних хроматид до момента перехода делящейся клетки из метафазы в анафазу; 3) служит рецептором сигнала перехода из метафазы в анафазу (Pluta et al., 1990). Структурно центромер представлен так называемой первичной перетяжкой, которая разделяет хромосому на два плеча.

Все исследованные к настоящему моменту центромеры эукариот содержат в качестве основного компонента повторяющиеся последовательности, за единственным исключением наиболее просто организованного центромера Saccharomyces cerevisiae. Центромерный район хромосом высших эукариот включает в свой состав до нескольких сотен тысяч или миллионов пар нуклеотидов ДНК. Несмотря на интенсивные исследования, у высших эукариот до сих пор не было выявлено какой-либо короткой последовательности ДНК, достаточной для формирования центромера.

СтДНК являются единственным классом последовательностей, обнаруженным в области центромера млекопитающих, где они образуют блоки длиной до нескольких миллионов пар нуклеотидов. В хромосомах человека альфоидный сателлит локализован в центромерах всех хромосом, в то время как различные стДНК с простой последовательностью - стДНК I, II и III, семейства стДНК SAU3A (Agresti et al., 1987) и НАЕЗ (Agresti et al., 1989) - локализованы в прицентромерном гетерохроматине (Mitchell et al., 1992). В хромосомах мыши

Mus musculus ту же локализацию, что и альфоидный сателлит, имеет минорный сателлит, в то время как мажорный сателлит расположен дистальнее по отношению к центромеру (Wong, Rattner, 1988).

В экспериментах по получению укороченных вариантов Y-хромосомы при помощи встраивания в ее плечи фрагментов ДНК теломера, сопровождающегося фрагментацией хромосом (teloraere-associated chromosome fragmentation), было показано, что только стДНК локализованы в области центромера (Brown et al., 1994; Heller et al., 1996). Непосредственные свидетельства роли стДНК в формировании центромера были получены в опытах по введению участков альфоидного сателлита хромосомы 17 человека в состав хромосом африканской зеленой мартышки и китайского хомячка (Haaf et al., 1992; Warburton, Cooke, 1997), а также альфоидного сателлита Y-хромосомы человека в хромосомы человека и хомячка (Larin et al., 1994). Участки хромосом, содержавшие встроившиеся блоки стДНК, приобретали ряд свойств активного центромера. Однако в экспериментах по конструированию искусственных хромосом млекопитающих (Mammalian Artificial Chromosome, MAC) на основе клонированных последовательностей в большинстве случаев не удалось добиться возникновения функционирующего центромера de novo (Taylor et al., 1996). Также показано, что включение/выключение центромеров дицентрических хромосом не связано непосредственно с перестройками последовательностей ДНК (Fisher et al., 1997). По-видимому, стДНК и гетер охр оматин составляют структурную основу для формирования центромера, в то время как возникновение активного центромера и его переход в латентное неактивное состояние определяется чисто эпигенетическими факторами (Karpen, Allshire, 1997; Willard, 1998).

Недавно были получены убедительные свидетельства непосредственной роли альфоидного сателлита в формировании центромера. 21-ая хромосома человека содержит два независимых блока альфоидного сателлита - а21-1 и а21-П, - первый из которых расположен непосредственно в области центромера,

тогда как второй смещен относительно центромера ближе к короткому плечу хромосомы (Ikeno et al., 1994). Клонированные последовательности альфоидного сателлита локуса а21-1 при трансфекции в клетки человека в составе генетических конструкций, содержащих последовательности ДНК теломера и селективный маркерный ген, способны с высокой воспроизводимостью формировать центромер denovo (Masumoto et al., 1998). В то же время альфоидный сателлит прицентромерного локуса а21-П подобной способностью не обладает.

Примеры маркерных хромосом, не содержащих характерные для данного вида центромерные стДНК, однако, имеющих функционирующий центромер (Voullaire et al., 1993), по-видимому, указывают на присутствие в геноме других последовательностей, способных формировать центромер.

Центромерный и прицентромерный блоки альфоидной ДНК было предложено обозначать как al и а2 соответственно (Не et al., 1998). В то время как а 1-блок ДНК в составе центромера служит сайтом сборки кинетохора (кинетохорный домен) и, таким образом, участвует в движении хромосом в митозе, роль а2-блока стДНК, остается не ясной. Блок а2 может быть связан со второй функцией центромера - поддержанием контакта между сестринскими хроматидами. Центромеры, выявляемые при помощи иммунофлуоресцентного окрашивания антителами к белкам кинетохора и центромера или при помощи гибридизации ДНК in situ, как правило, имеют вид двух отдельных точек и, следовательно, пространственно разделены. Последовательности, имеющие прицентромерную локализацию, могут отвечать за ассоциацию хромосом. Так, при помощи гибридизации ДНК in situ было показано, что в митозе al-блок хромосомы 7 человека до расхождения хроматид выявляется в виде двух точек -по одной на каждой из хроматид. Блок а2, напротив, представлен тяжом, который соединяет эти два блока al (Не et al., 1998).

5. Примеры консервативности последовательностей стДНК

Несмотря на исключительно высокий уровень изменчивости стДНК в целом, существует несколько примеров высокой консервативности последовательностей стДНК. Так, мотив GGAAT, который идентичен основной повторяющейся последовательности сателлита Ш человека и входит в состав повторяющейся единицы сателлита II человека, также обнаружен в составе повторяющихся последовательностей курицы, Drosophila, морского ежа и кукурузы и имеет гомологию с наиболее функционально значимым участком элемента III (CDE III) центромера Saccharomyces cerevisiae (Grady et al., 1992). Также показано наличие в составе ядерного экстракта клеток HeLa белка (белков), специфически связывающихся с этой последовательностью (Полторацкий и др., 1991; Grady et al., 1992). Однако стДНК III и II локализованы в хромосомах дистальнее по отношению к центромеру, чем альфоидный сателлит (Lee et al., 1997), и роль данной последовательности в функционировании или формировании структуры центромера остается невыясненной.

Последовательности центромерных стДНК млекопитающих не имеют протяженных гомологичных участков, однако, содержат последовательность TTCGNNNNANNCGGG (где N - любой нуклеотид), которая является сайтом связывания консервативного белка CENP-B (Centromere Protein В) (Masumoto et al., 1989). Эта последовательность присутствует в составе центромерных стДНК далеких в эволюционном плане видов: приматов (альфоидный сателлит), видов мыши Mus musculus (минорный сателлит) и M. caroli, тупайи, гигантской панды, песчанки и хорька (Kipling, Warburton, 1997).

Все известные теломерные последовательности - позвоночных, высших растений, тетрахимены (Tetrahymena) и дрожжей, - сформированы короткими (6-8 п.н.) повторами^ в которых цепь ДНК, направленная от центромера к теломеру, содержит все G-остатки. Например, теломер позвоночных содержит последовательность (TTAGGG)n. Хотя ДНК теломера традиционно не относят к

стДНК, ее основные характеристики, по-видимому, за исключением явно выраженной функции, соответствуют стДНК. Теломеры препятствуют слиянию отдельных хромосом и защищают их от деградации под воздействием эндогенных нуклеаз и укорочения в результате недорепликации ДНК на концах хромосом. Хотя размер блока теломерного повтора может различаться между отдельными хромосомами, видами и отдельными индивидами (Kipling, Cooke, 1990) данная последовательность исключительно консервативна (Moyzis et al., 1988). Особый случай представляют собой теломер Saccharomyces cerevisiae, сформированный несовершенным повтором с последовательностью (TGi-3)n. Теломеры в рамках рода Saccharomyces также различны как по длине, так и по последовательности теломерной ДНК (Cohn et al., 1998).

Функциональные тесты показали, что последовательность (TTAGGG)n необходима и достаточна для формирования теломера позвоночных in vivo (Hanish et al., 1994). К настоящему моменту обнаружены два белка, которые специфически связывают теломерный повтор позвоночных in vitro и in vivo -TRF1 и TRF2 (Chong et al., 1995; Smith, de Lange, 1997; Brun et al., 1997). При этом показана корреляция между способностью различных последовательностей, отличающихся от канонического теломерного повтора заменой отдельных нуклеотидов, формировать функциональный теломер и их аффинностью к белку TRF1 (Hanish et al., 1994).

6. Белки, специфически связывающиеся с стДНК

К настоящему моменту описано несколько ДНК-связывающих белков, которые специфически связывают стДНК и (или) могут принимать участие в формировании структуры гетерохроматина.

Белок Dl Drosophila melanogaster (Levinger, Yarshavsky, 1982a, 1982b) и a-белок африканской зеленой мартышки (Strauss, Varshavsky, 1984) были впервые описаны как белки, специфически связывающие стДНК. Позднее было показано, что ос-белок относится к семейству HMG (High Mobility Group)

белков и узнает суженную малую бороздку участков ДНК, содержащих пять и более А/Т пар подряд (Solomon et al., 1986). Белки a/HMG-I и Dl имеют одинаковые ДНК-связывающие домены - так называемый АТ-крюк (AT-hook), - который встречаются в этих белках три и одиннадцать раз соответственно (Reeves, Nissen, 1990; Ashley et al., 1989). Белок Dl преимущественно локализован в области гетерохроматина, содержащего два АТ-богатых сателлита Drosophila melanogaster (Levinger, Yarshavsky, 1982a). В пользу участия белка HMG-I в формировании гетерохроматина свидетельствуют данные о его локализации в области G/Q- и С-сегментов хромосом человека и мыши -факультативном и конститутивном гетерохроматине (Disney et al., 1989).

W-белок курицы с молекулярной массой 72 кДа имеет высокое сродство к X/zoI-семейству стДНК половой W-хромосомы (Harata et al., 1988). W-белок в отличие от а-белка и белка D1 узнает W-сателлит с высокой специфичностью. Особенностью W-белка является его способность связываться лишь с фрагментами стДНК длиной более 300 п.н. W-белок также узнает стДНК фазана и индюка, хотя гомология между последовательностями этих стДНК составляет менее 60% (Saitoh et al., 1989). Специфическое связывание W-белка с стДНК обусловлено не присутствием в их составе общего короткого участка связывания, а способностью белка узнавать свойственную им изогнутую конфигурацию молекулы. Согласно предложенной модели молекула ДНК оборачивается вокруг W-белка или скорее его мультимера, образуя множественные контакты с периодом около 10 п.н., близким к периоду спирали ДНК.

В составе скэффолда клеток печени крысы выявлены два белка с молекулярной массой 123 и 130 кДа (PI23 и PI30) которые специфически связываются с стДНК крысы, имеющей изогнутую конфигурацию (Hibino et al., 1992, 1993а, 1993b). Аффинность этих белков к ДНК пропорциональна величине изгиба молекулы последней. Связывание ингибируется дистамицином А,

узнающим суженную малую бороздку олиго(А/Т) участков ДНК, но не хромомицином Аз, который специфически связывается с GC-богатыми участками ДНК. Скэффолд клеток асцитной гепатомы крысы не содержит белков Р123 и Р130, однако, в его составе присутствует белок Р230, имеющий аналогичные характеристики ДНК-связывания (Hibino et al., 1997).

В сыворотке больных склеродермой и некоторыми другими заболеваниями (в совокупности обозначаемых CREST: calcinosis, Raynaud's phenomenon, esophageal dysmotility, sclerodactyly, telangiectasia), приводящими к выработке антител к собственным белкам организма, присутствуют антитела к белкам, локализованным в области центромера и кинетохора (Moroi et al., 1980). При помощи этих антител было выявлено три белка центромера человека: CENP-A, CENP-B и CENP-C (Centromere Protein). CENP-B является высоко консервативным сиквенс-специфическим ДНК-связывающим белком млекопитающих с мол. массой 80 кДа, который узнает последовательность TTCGNNNNANNCGGG (где N - любой нуклеотид) - "CENP-B box" (Masumoto et al., 1989; Sugimoto et al., 1998). Способность белка CENP-B к димеризации с образованием комплекса, содержащего две молекулы белка и две молекулы ДНК, предположительно может играть существенную роль в формировании специфической структуры хроматина центромера (Muro et al., 1992; Kitagawa et al., 1995). Консервативность CENP-B и присутствие его сайта связывания в составе центромерных ДНК различных видов млекопитающих позволило объяснить функциональную консервативность центромера, несмотря на отсутствие протяженной гомологии между последовательностями ДНК, формирующими центромер. Однако роль белка CENP-B в функционировании центромера остается неясной, поскольку в составе альфоидного сателлита Y-хромосом человека отсутствует "CENP-B box", и Y-хромосома мыши не содержит ни минорного сателлита, ни белка CENP-B (Moens, Pearlman, 1990; Broccoli et al., 1990). Возникшие в результате Робертсоновских транслокаций и слияний стабильные дицентрические хромосомы, имеющие лишь один

активный центромер, могут содержать белок CENP-B в составе как активного, так и неактивного центромера (Earnshaw et al., 1989). Наконец, мутантные мыши, у которых не экспрессируется белок CENP-B, вполне жизнеспособны, и их хромосомы стабильны в митозе и мейозе (Hudson et al., 1998). Таким образом, белок CENP-B недостаточен и не является абсолютно необходимым для формирования центромера. Вероятно, другие белки способны играть роль CENP-B в формировании структуры хроматина центромера.

Белок pJ альфа с мол. массой около 10-15 кДа узнает мотив GTGAAAAAG, который присутствует в составе последовательности, соединяющей блоки альфоидного и третьего сателлитов в 13, 14 и 21-ой хромосомах человека, а также в составе некоторых мономеров альфоидного сателлита приматов (Gaff et al., 1994; Romanova et al., 1996). Семейства альфоидного сателлита низших приматов не содержат (или содержат лишь незначительное количество) участков связывания CENP-B, но в них присутствуют участки связывания pJ альфа. У высших приматов альфоидный сателлит содержит оба типа участков связывания (Romanova et al., 1996). Вероятно, белок pJ альфа может играть ту же роль в организации гетерохроматина центромера, что и CENP-B, что позволило бы объяснить необязательность CENP-B для функционирования центромера, однако свидетельства в пользу данной гипотезы отсутствуют.

7. Консервативность структуры стДНК

Является ли консервативность нуклеотидной последовательности необходимым условием для ее функциональной консервативности? Иными словами, могут ли различные последовательности выполнять аналогичные функции?

Для стДНК показано наличие некоторых консервативных особенностей структур ы, которые могут оказывать влияние как на упаковку хроматина, так

и служить сигналом для узнавания последовательности специфическими белками.

Участкам ДНК, содержащим несколько остатков аденозина подряд (олиго(А) блок), свойственна суженная малая бороздка. Данная особенность структуры молекулы ДНК может распознаваться белками HMG-I и D1 (Reeves, Nissen, 1990). СтДНК часто являются АТ-богатыми, более того было показано, что в 17 из 20 проанализированных последовательностей различных стДНК остатки аденозина распределены по последовательности не случайным образом, а образуют олиго(А) блоки (Martinez-Balbas et al., 1990). Таким образом, наличие олиго(А) блоков является одним из характерных свойств стДНК.

Многим стДНК свойственно наличие стабильного изгиба молекулы, что обусловлено наличием в их составе олиго(А) блоков, которые распределены по последовательности с периодом около 10.5 п.н., совпадающим с шагом спирали ДНК (Wu, Crothers, 1984; Ulanovsky, Trifonov, 1987). К их числу относятся мажорный сателлит мыши (Radie et al., 1987), стДНК мартышки и крысы (Martinez-Balbas et al., 1990; Nakamura et al. 1991), лебедя (Fitzgerald et al., 1994), курицы, фазана и индюка (Kodama et al., 1987; Saitoh et al., 1989), саламандры (Barsacchi-Pilone et al., 1986), Drosophila melanogaster (Doshi et al., 1991), жуков (Barcelo et al., 1997) и креветки (Benfante et al., 1989). Было выдвинуто предположение, что изгиб молекулы ДНК является фактором, способствующим более компактной укладке хроматина, и таким образом определяет конденсацию гетерохроматина (Radie et al., 1987). Интеркалирующие красители, специфически связывающиеся через малую бороздку с АТ-богатыми участками в составе ДНК - Hoechst 33258, дистамицин A, DAPI - устраняют изгиб молекулы ДНК in vitro и вызывают деконденсацию гетерохроматина in vivo (Radie et al., 1987; Benfante et al., 1989; Doshi et al., 1991). Вещества, специфически связывающиеся в малой бороздке GC-богатой ДНК (актиномицин D и оливомицин); не оказывают сходных эффектов. Вероятно, помимо влияния на структурные свойства ДНК Hoechst 33258, дистамицин А,

DAPI могут конкурировать за связывание с белками, участвующими в упаковке хроматина (Radie et al., 1992).

Для всех стДНК показано наличие консервативного периодического распределения участков длиной 50-60 п.н., имеющих изогнутую конфигурацию, что, однако, не обязательно служит причиной для изгиба молекулы ДНК в целом (Fitzgerald et al., 1994). Участки ДНК с изогнутой конфигурацией могут определять положение нуклеосом (Hsieh, Griffith, 1988). Периодическое распределение таких участков по последовательности приводит к фазированному (регулярному) распределению нуклеосом, что характерно для конденсированного хроматина. Распределение участков, имеющих изогнутую конфигурацию, совпадает в стДНК с нуклеосомным повтором, что свидетельствует в пользу роли структурных характеристик стДНК в конденсации гетерохроматина (Fitzgerald et al., 1994). Следует отметить, что эти данные касаются только "сложных" стДНК, в то время как стДНК с простой короткой повторяющейся последовательностью, очевидно, не обладают подобными свойствами.

На свойствах молекулы ДНК также сказывается наличие в ее составе участков чередующихся А и Т нуклеотидов (например, АТАТ), что увеличивает гибкость молекулы ДНК. Напротив протяженные участки последовательности, сформированные либо только А, либо обогащенные G/C нуклеотидами; наоборот увеличивают жесткость молекулы ДНК. Изогнутая конфигурация молекулы ДНК и (или) способность легко изгибаться могут способствовать более компактной укладке ДНК в составе конститутивного гетерохроматина (Trifonov, Sussman, 1980; Fitzgerald et al., 1994). Высокая жесткость молекулы ДНК затрудняет ее сворачивание вокруг нуклеосомы. Так, обогащенность теломерного повтора позвоночных (TTAGGG)n и в еще большей степени теломерного повтора Tetrahymena (TTGGGG)n GC-нуклеотидами обусловливает крайне низкую устойчивость комплекса этих ДНК с нуклеосомами (Cacchione et al., 1997).

Помимо эффектов, которые особенности структуры ДНК оказывают на ее взаимодействие с гистонами, такие свойства ДНК как изгиб и (или) суженная малая бороздка молекулы могут служить сигналом для узнавания ДНК белками (Harata et al., 1988; Saitoh et al., 1989; Radie et al., 1992; Hibino et al., 1992). Структурные характеристики могут быть весьма сходными для молекул ДНК, имеющих различные нуклеотидные последовательности, что может обусловливать наличие одинаковых функций у различных последовательностей или консервативность функции при отсутствии консервативности последовательности.

8. Эпигенетические механизмы формирования гетерохроматина и центромера

В формировании гетерохроматина и центромера помимо специфических ДНК-белковых взаимодействий принимают участие эпигенетические механизмы. Среди них наиболее вероятными кандидатами на роль в формировании гетерохроматина и центромера являются метилирование ДНК и ацетилирование гистонов.

Одним из возможных механизмов, определяющих конденсированное состояние гетерохроматина, является метилирование стДНК. Метилированное состояние ДНК характерно для транскрипционно неактивных генов и связано с конденсацией эухроматина - образованием факультативного гетерохроматина. При культивировании клеток в присутствии ингибиторов метилирования, таких как 5-азацитидин или 5-азадезоксицитидин, происходит деконденсация как конститутивного центромерного гетерохроматина, так и факультативного гетерохроматина инактивированной Х-хромосомы (Haaf, Schmid, 1989). Известны белки, способные специфически связывать участки метилированной ДНК - MeCPl и МеСР2 (Meehan et al., 1989). МеСР2 преимущественно локализован в области прицентромерного гетерохроматина мыши, содержащего высоко метилированный мажорный сателлит, что указывает на вероятную роль белка в организации гетерохроматина. Обработка клеток 5-азадезоксицитидином приводит к деконденсации прицентромерного

гетерохроматина хромосом мыши, содержащего мажорный сателлит, и прицентромерного гетерохроматина хромосом человека, содержащего "простые" стДНК - сателлиты I, II и III и сателлиты семейств SAU3A и НАЕЗ. В то же время обработка 5-азацитидином не оказывает влияния на структуру центромерного гетерохроматина человека и мыши, сформированного минорным и альфоидным сателлитами соответственно (Mitchell et al., 1992; Mitchell et al., 1993). Полагают, что 5-азацитидин на стадии репликации ДНК замещает цитозин в новосинтезированной ДНК, препятствуя ее метилированию. Однако истинный механизм действия 5-азацитидина неизвестен, поскольку обработка 5-азацитидином после завершения фазы синтеза ДНК также приводит к деконденсации гетерохроматина (Haaf, Schmid, 1989). С другой стороны, участие метилирования ДНК в конденсации гетерохроматина показано не для всех эукариот.

Метилирование ДНК минорного сателлита мыши влияет на связывание белка CENP-B. Хромосома 1 мыши линии DBA/2 имеет два независимых блока минорного сателлита. Несмотря на то, что оба блока имеют сайты связывания для CENP-B, только один из них связывает CENP-B in vivo. После культивирования клеток в присутствии 5-азадезоксицитидина CENP-B выявляется в обоих блоках. CENP-B также не связывает метилированную ДНК альфоидного сателлита in vitro. По-видимому, метилирование ДНК служит основным эпигенетическим фактором, влияющим на локализацию CENP-B в области центромера (Mitchell et al., 1996).

Транскрипционно неактивный хроматин характеризуется наличием слабо ацетелированных форм коровых гистонов. В хромосомах человека и мыши высоко ацетилированные формы гистона Н4, преимущественно локализованы в области R-бандов, содержащих потенциально активные гены, в то время как в G- и С-сегментах (факультативном и конститутивном гетерохроматине) уровень ацетилирования значительно ниже (Jeppesen et al., 1992; Jeppesen, Turner, 1993). В дрожжах Schizosaccharomyces низкий уровень ацетилирования гистонов в

центромерном районе необходим как для поддержания структуры гетерохроматина, так и для функционирования центромера (Ekwall et al., 1997). По-видимому, ацетилирование гистонов непосредственно влияет на структуру хроматина и на ассоциацию хроматина со специфическими белками.

Белок кинетохора CENP-C входит в состав внутреннего слоя кинетохора и является маркером активного центромера (Saitoh et al., 1992). Показано, что белок CENP-C обладает ДНК-связывающей активностью, и ДНК-связывающий домен белка, совпадает с доменом, определяющим его локализацию в области центромера (Yang et al., 1996). Однако распознает ли CENP-C какую-либо определенную последовательность ДНК, как это было показано для белка CENP-B, или его центромерная локализация определяется эпигенетическими факторами, остается неизвестным. Для центромера млекопитающих также характерно наличие особого варианта корового гистона - CENP-A (Centromere Protein А), который гомологичен гистону НЗ и замещает его в составе нуклеосом (Palmer et al., 1991). Было выдвинуто предположение, что нуклеосомы, содержащие белок CENP-A, определяют особую укладку хроматина, которая, в свою очередь, необходима для формирования центромера и может быть консервативна, несмотря на различия между последовательностями стДНК (Shelby et al., 1997). В хромосомах человека белок CENP-A локализован только в активном центромере дицентрических хромосом даже в том случае, если активный центромер не содержит альфоидного сателлита (Warburton et al., 1997). Таким образом, белок CENP-A необходим для функционирования центромера и его локализация определяется не последовательностью ДНК, а скорее эпигенетическими факторами.

Конститутивный и факультативный гетерохроматин также содержат белки так называемого хромодоменового семейства, имеющие в своем составе консервативный участок 30-50 аминокислот - хромодомен (chromatin organization modifier domen). К их числу относятся белки Drosophila НР1 (heterochromatin protein 1) и PC (Polycomb) и гомологичные им белки млекопитающих, а также белок

делящихся дрожжей Schizosaccharomyces SWI6 (Lorentzet al., 1994; Kellum, Alberts, 1995; Jenuwein et al., 1998). Эти белки определяют конденсированное транскрипцинно неактивное состояние хроматина (Cavalli, Раго, 1998).

9. Эффект положения и эктопическая конъюгация

Формирование т.н. факультативного гетерохроматина в типично эухроматиновых районах хромосом - гетерохроматинизация - сопровождается репрессией генов. Наиболее известным примером такого рода регуляции является инактивация одной из X хромосом самок млекопитающих. В то же время при хромосомных перестройках типа транслокаций и инверсий, в норме транскрипционно активные гены, оказавшиеся по соседству с конститутивным гетерохроматином, переходят в репрессированное состояние, что сопровождается конденсацией хроматина. Типично эухроматиновые районы приобретают характеристики, свойственные гетерохроматину: конденсированное состояние, поздняя репликация, отсутствие синтеза РНК, генетическая инертность (Прокофьева-Бельговская, 1986). Это явление получило название эффекта положения мозаичного типа, поскольку уровень репрессии генов может варьировать в различных клетках. Эффект положения под влиянием центромерного гетерохроматина был наиболее досконально исследован у Drosophila (Бирштейн, 1976), а в последнее время также у Schizosaccharomycespombe (Allshire et al., 1994).

В интерфазных клетках гетерохроматиновые участки отдельных хромосом ассоциируют между собой не случайным и, более того, специфичным для данного типа клеток образом, формируя крупные агрегаты - т.н. хромоцентры (Hsu et al., 1971; Куличков, Жимулев, 1976; Прокофьева-Бельговская, 1986). Этот явление, получившее название эктопической конъюгации - конъюгации между гетерохроматиновыми участками одной и той же или различных (в том числе негомологичных) хромосом, - по-видимому,

играет ключевую роль в пространственной организации хромосом в интерфазном ядре (Comings, 1980; Manuelidis, Borden, 1988).

Процесс распространения гетерохроматина на эухроматиновые от природы участки хромосом может обусловливать инактивацию генов в течение клеточной дифференцировки и эмбрионального развития. В то время как на стадии зиготы в эмбриогенезе различных видов позвоночных гетерохроматин не выявляется, в течение эмбрионального развития происходит постепенное увеличение количества гетерохроматина в ядре, что также сопровождается увеличением размера хромоцентров в результате их эктопической конъюгации (Прокофьева-Бельговская, 1986).

Эктопическая конъюгация определенных участков эухроматина с центромерным гетерохроматином служит механизмом регуляции экспрессии генов в процессе дифференцировки. Показано, что конститутивный гетерохроматин может подавлять транскрипцию не только в том случае, если ген расположен рядом с гетерохроматином, но и если участок хроматина, содержащий ген, прикрепляется к гетерохроматину в интерфазном ядре, тогда как в составе хромосомы он может быть сколь угодно удален от

гетерохроматина (Dernburg et al., 1996; Brown et al., 1997).

На молекулярном уровне механизм эффекта положения мозаичного типа может быть основан на экспансии белков хромодоменового семейства в прилежащие гетерохроматину эухроматиновые районы. Возможно, что и другие эпигенетические факторы, влияющие на структуру хроматина, - метилирование ДНК, ацетилирование коровых гистонов - также способны распространять свое воздействие за пределы блоков гетерохроматина.

10. Ядерный матрикс и скэффолд. Ассоциация стДНК с ядерным матриксом и скэффолдом

Различные биохимические методы фракционирования ядерных компонентов показали присутствие в ядрах белков, тесно связанных в нерастворимый комплекс, устойчивый к экстракции в широком диапазоне

условий. По аналогии с цитоскелетом, который в отличие от растворимой фракции цитоплазматических белков - цитозоля - представляет собой нерастворимую структуру, представлялось вероятным, что остаточная фракция белков может соответствовать аналогичной скелетной структуре ядра. Березни и Коффи (Berezney, Coffey, 1974) по-видимому, первые показали, что изолированный биохимическими методами ядерный матрикс во многих отношениях воспроизводит структуру, существующую в живой клетке, и предположили роль этой структуры в функционировании ядра.

Ядерный матрикс (Berezney, Coffey, 1974) или скэффолд (Mirkovitch et al., 1984) является основной скелетной структурой клеточного ядра, с которой ассоциировано большинство ядерных систем синтеза и транспорта. Так, процессы репликации и репарации ДНК, транскрипции и сплайсинга РНК, транспорта траскриптов, белков и низкомолекулярных веществ тесно связаны с ядерным матриксом (Berezney et al., 1995; Nickerson et al., 1995). Практически ядерный матрикс/скэффолд представляет собой остаточную белковую структуру, сохраняющуюся после обработки ядер нуклеазами для удаления ДНК и экстракции большей части белков при помощи высокой концентрации соли - 2 М NaCl - ядерный матрикс, или хаотропного агента -дииодосалициллата лития (LIS) - скэффолд.

В интерфазном ядре ДНК организована в виде петельных доменов со средней длиной около 75 т.п.н., причем эта организация сохраняется и в метафазных хромосомах (Cook, Brazell, 1976; Lebkowski, Laemmli, 1982). При выделении ядерного матрикса или скэффолда небольшая часть (около 1-2 %) геномной ДНК остается устойчиво связанной с остаточными белковыми структурами. Ассоциация геномной ДНК с ядерным матриксом/скэффолдом носит неслучайный, специфический характер и осуществляется в определенных участках генома, получивших название MAR- (Matrix Associated Region) или SAR- (Scaffold Attachment Region) элементов. Полагают, что эти участки локализованы в основании петельных доменов. По-видимому общее количество

MAR/SAR-элементов в эукариотическом геноме составляет 105 (Boulikas, 1995). MAR/SAR-элементы были также выявлены по их способности специфически связываться как с интерфазным ядерным матриксом/скэффолдом, так и со скэффолдом метафазных хромосом in vitro (Cockerill, Garrard, 1986a, 1986b; Mirkovitch et al., 1988). MAR/SAR-элементы были обнаружены как на границах генных доменов, так и в составе интронов (Глазков, 1995).

Результаты исследований взаимодействия стДНК с этими скелетными структурами ядра остаются противоречивыми (Яровая, Разин, 1983; Matsumoto, 1981; Small et al., 1982; Strissel et al., 1996; Craig et al., 1997). Между тем, теломеры (de Lange, 1992) и центромеры (Amati, Gasser, 1988; He, Brinkley, 1996) ассоциированы с ядерным матриксом/скэффолдом интерфазных клеток. Белки кинетохора также являются составной частью скэффолда метафазных хромосом (Earnshaw et al., 1984). Весьма вероятно, что ядерный матрикс/скэффолд содержит белки, узнающие стДНК. Однако ДНК-связывающие белки в его составе были выявлены по их способности специфически связываться с последовательности в составе эухроматина - MAR/SAR-элементами.

11. MAR/SAR-элементы. Белки, связывающиеся с MAR/SAR-элементами

MAR/SAR-элементы представляют собой АТ-богатые (более 65% А+Т) участки ДНК длиной более 300 п.н. По мере уменьшения длины фрагментов MAR/SAR происходит быстрое снижение их аффинности к ядерному матриксу/скэффолду, что указывает на наличие в их составе множественных участков связывания с белками. MAR/SAR-элементы часто содержат последовательности, гомологичные консенсусу топоизомеразы II -GTN(A/T)A(T/C)ATTNATNN(G/A) (где N - любой нуклеотид) (Cockerill, Garrard, 1986b; Adachi et al., 1989; Käs, Laemmli, 1992), которая входит в состав ядерного матрикса и является одним из основных компонентов скэффолда метафазных хромосом (Berrios et al., 1985; Earnshaw et al., 1985). Изучение локализации в геноме Drosophila melanogaster участков, расщепляемых

топоизомеразой II in vivo, показало, что они присутствуют как в составе SAR-элементов, так и стДНК (Kas, Laemmli, 1992). Расщепление ДНК эндогенной топоизомеразой II ядерного матрикса было также использовано для картирования границ петельных доменов (Яровая, Разин, 1998). В составе MAR/SAR-элементов было выявлено несколько других коротких относительно консервативных мотивов. Так, для различных SAR-элементов D. melanogaster характерно наличие поледовательностей ААТААА(Т/С)ААА (A-блок) и ТТ(А/Т)Т(Т/А)ТТ(Т/А)ТТ (Т-блок) (Gasser, Laemmli, 1986а); MAR иммуноглобулина к домовой мыши содержит несколько копий последовательности АТАТТТ (ААТАТТТТ) (Cockerill, Garrard, 1986а). В дальнейшем эти последовательности были также выявлены в составе MAR/SAR-элементов других видов. Однако функциональная роль этих мотивов неизвестна.

MAR/SAR-элементы не имеют какой-либо "консенсусной" последовательности, которая могла бы служить их отличительной чертой (Boulikas, 1995). Вероятнее всего структурные свойства MAR/SAR-элементов определяют их специфическое взаимодействие с белками ядерного матрикса/скэффолда. Для многих MAR/SAR-элементов характерно наличие олиго(А) блоков, имеющих суженную малую бороздку (Adachi et al., 1989); изогнутая конфигурация молекулы (Homberger, 1989; Boulikas, 1995); участки, содержащие чередующиеся А и Т нукеотиды, которым свойственна высокая гибкость и способность переходить в неспаренное состоянии (Bode et al., 1992; Boulikas, 1995). Примечательно, что эти структурные особенности, возможно за исключением последней, также свойственны стДНК, и если они отвечают за специфическое связывание MAR/SAR-элементов, то, по крайней мере, некоторые из стДНК могут аналогичным образом взаимодействовать с ядерным матриксом/скэффолдом, вероятно посредством связывания с теми же, что и MAR/SAR-элементы, белками в его составе. К настоящему моменту

помимо топоизомеразы II охарактеризовано несколько белков, которые избирательно связываются с МAR/S АR-элементами (см. таблицу). MAR/SAR-связывающие белки в целом способны узнавать структурные особенности ДНК (Romig et al., 1992; Tsutsui et al., 1993; Renz, Fackelmayer, 1996). Таким образом, MAR/SAR-связывающие белки способны специфически связывать различные ДНК, не имеющие гомологичных участков. В том случае если эти белки или белки с аналогичными свойствами участвуют во взаимодействии с стДНК, это позволяет объяснить консервативность многих свойств стДНК, несмотря на отсутствие консервативности их последовательности. Характерным свойством MAR-связывающих белков является связывание с олиго(А) блоками ДНК в суженной малой бороздке ее молекулы. Гистон HI и топоизомераза II специфически и кооперативно связываются с MAR/SAR-элементами (см. таблицу), узнавая суженную малую бороздку ДНК, что также характерно для белков семейства HMG, которые могут in vivo конкурировать с гистоном HI за связывание с MAR/SAR-элементами (Zhao et al., 1993). Белок HMG-I/Y содержит в своем составе ДНК-связывающий мотив, так называемый АТ-крюк (AT-hook) (Reeves, Nissen, 1990). Синтетические белки МАТН10 и МАТН20, содержащие 10 или 20 копий данного мотива, in vitro и, по-видимому, in vivo связываются с MAR/SAR-элементами (Strick, Laemmli, 1995). Примечательно, что белок Dl D. melanogaster, являющийся природным аналогом этих белков, связывается с стДНК и локализован в центромерном гетерохроматине. В то же время белок млекопитающих HMG-I/Y, преимущественно локализованный в гетерохроматиновых районах хромосом - G/Q- и С-сегментах, также присутствует в эухроматине и связывается с MAR/SAR-элементами (Reeves, Nissen, 1995).

Таблица 1

Белки, специфически связывающиеся с МАЙ^АИ-элементами

Белок Молекулярная масса Характеристики связывания с ДНК и количество молекул белка на ядро Литературный источник

Топоизомераза II 165-180 кДа Кооперативно связывается с ДНК в суженной малой бороздке олиго(А) блоков. Пролиферирующие клетки содержат около 106 молекул белка на ядро. В неделящихся клетках белок не выявляется. Adachietal., 1989; Heck, Earnshaw, 1986.

аГистон Н1 в35кДа Кооперативно связывается с ДНК в суженной малой бороздке олиго(А) блоков Izaurralde et al., 1989

ARBP (Attachment Region Binding Protein) 97 кДа Кооперативно связывается с различными МАЯ/8АК-элементами, узнает последовательность 5'-(3<ЗТСТ-3', фланкированную АТ-богатыми участками ДНК. Около 105 молекул белка на ядро. vonKriesetal., 1991; Buhrmester et al., 1995

Ламины В- и А/С-типов 60-70 кДа Агрегаты ламинов способны специфически связывать МА1^ОД^-элементы и одноцепочечную ДНК. Luderus et al., 1992, 1994

Продолжение таблицы

SATB1 86 кДа Экспрессируется только в Dickinson et

(Special AT-reach клетках тимуса; узнает al., 1992

sequence Binding последовательность АТАТАТ,

protein 1) которая способна переходить в одноцепочечное состояние в составе отрицательно супер скрученной ДНК; также связывается с последовательностями ДНК, содержащими в одной из цепей только А, Т и С, но не G нуклеотиды.

5SA F-A (Scaffold в120 кДа Связывается с гетерогенными Romig et al.,

Attachment MAR/SAR-элементами, является 1992; Tsutsui

Factor A), компонентом гетерогенных et al., 1993;

SP120 (Scaffold Protein of 120 kDa), ядерных РНП, связывает ДНК и РНК in vitro и in vivo. Более 106 молекул белка на ядро. von Kries et al., 1994; Fackelmayer

hnRNP-U et al., 1994; Kiledjian, Dreyfuss, 1992

aSAF-B B150 кДа Связывается с гетерогенными MAR/SAR-элементами. Около 105 молекул белка на ядро. Renz, Fackelmayer, 1996

абелок не входит в состав ядерного матрикса; ббелок был описан независимо несколькими группами исследователей; вбелок имеет более низкую подвижность при электрофорезе в присутствии 8Б8, чем следует из его молекулярной массы, определенной по аминокислотной последовательности; в качестве молекулярных масс беков указаны величины, наблюдаемые при электрофорезе в присутствии 8Э8.

Исключение составляет белок ARBP (von Kries et al., 1991), который связывается в большой бороздке короткой GC-богатой последовательности GGTGT в составе MAR гена лизоцима цыпленка. Однако для связывания белка ARBP с этой последовательностью необходимо, чтобы она была фланкирована АТ-богатыми участками, и, вероятно, белок образует дополнительные контакты с этими участками в малой бороздке ее молекулы (Buhrmester et al., 1995). Недавно было показано, что белок ARBP является гомологом белка МеСР2 (Weitzel et al., 1997), который узнает метилированную ДНК и преимущественно локализован в области прицентромерного гетерохроматина мыши (Lewis et al., 1992). Белок ARBP in vitro также связывается с стДНК мыши, при этом метилирование ДНК увеличивает аффинность связывания (Weitzel et al., 1997). Белок SAF-A (SP 120, hnRNP-U) является компонентом гетерогенных ядерных РНП, связывает РНК и ДНК in vitro и in vivo (Fackelmayer et al., 1994), что обусловлено наличием независимых РНК- и ДНК-связывающих доменов в его составе (Kiledjian, Dreyfuss, 1992; Gohring et al., 1997).

Недавно описанный MAR/SAR-связывающий белок SAF-B из клеток HeLa (Renz, Fackelmayer, 1996) в отличие от других белков этого типа не входит в состав ядерного матрикса, что ставит под сомнение его роль в прикреплении петельных доменов хроматина к ядерному матриксу/скэффолду. Видимо ДНК-связывающие белки, специфичные к MAR/SAR-элементам, принимают участие в организации хроматина не только посредством формирования петельных доменов, но и непосредственно взаимодействуя с ДНК и (или) хроматином. Топоизомераза II и белок SAF-B, находясь в комплексе с ДНК, формируют высокомолекулярные агрегаты (Adachi et al., 1989; Renz, Fackelmayer, 1996). Способность формировать устойчивые агрегаты при физиологических значениях pH и ионной силы также свойственна белкам ARBP (von Kries et al., 1991), SAF-A (SP 120, hnRNP-U) (Romig et al., 1992) и ламинам (Luderus et al., 1992, 1994). В связывании ламинов с ДНК участвует rod-домен, характерный для белков промежуточных филаментов (Luderus et al., 1994; Zhao et al., 1996). Специфическая ДНК-связывающая активность ламинов обусловлена их

агрегированным состоянием (Zhao et al., 1996). Связывание агрегатов ламинов с MAR/SAR-элементами представляет интерес в связи с периферической локализацией гетерохроматина в ядре. Не исключено, что ламины также способны связываться с стДНК.

12. Вероятные функции стДНК

Накоплено много экспериментальных данных об участии стДНК (и гетерохроматина) в формировании основных структурных элементов хромосомы - центромера и теломеров, а также роли стДНК в пространственной организации генома в интерфазном ядре.

Тандемно организованные повторяющиеся нуклеотидные последовательности не только локализованы в области центромерных и теломерных районов хромосом, но непосредственно участвуют в формировании центромера (Wong, Rattner, 1988; Masumoto et al., 1998) и теломеров (Moyzis et al., 1988; Hanish et al., 1994). В то время, как на сегодняшний день известно, какие условия необходимы для формирования теломера, структура и механизмы формирования центромера высших эукариот до сих пор неизвестны. В связи с этим особый интерес представляет изучение ДНК-белковых взаимодействий, лежащих в основе формирования специфической структуры хроматина центромерных и прицентромерных районов хромосом. Наличие у стДНК общих структурных характеристик позволяет допустить возможность существования белков, специфически связывающихся с негомологичными стДНК. Такой "структурно-специфический" тип ДНК-белкового взаимодействия может обеспечивать консервативность структуры хроматина, несмотря на изменчивость последовательностей стДНК. Весьма вероятно, что белки, узнающие особенности структуры ДНК, также могут участвовать в организации центромера эукариот.

Существует ряд данных, указывающих на роль стДНК в пространственной и функциональной организации генома, что неразрывно

связано с их способностью формировать гетерохроматин. Процесс распространения гетерохроматина на эухроматиновые районы хромосом может обусловливать инактивацию генов в процессе эмбриогенеза и клеточной дифференцировки. Ассоциация гетерохроматиновых районов различных хромосом с образованием хромоцентров имеет высоко специфичный и более того консервативный в эволюции характер (Comings, 1980; Manuelidis, Borden, 1988), что указывает на ее функциональную значимость. По-видимому, стДНК являются необходимым структурным компонентом генома.

Сходство стДНК и MAR/SAR-элементов оставляет открытым вопрос о том, могут ли одни и те же белки связываться с обоими класса последовательностей. Специфическое взаимодействие топоизомеразы II и белка ARBP с стДНК (Kas, Laemmli, 1992; Weitzel et al., 1997) свидетельствует в пользу такой возможности. К тому же общее количество молекул различных MAR/SAR-связывающие белков в ядре значительно превосходит 106 (см. таблицу), и является, по-видимому, достаточным для связывания этих белков как с MAR/SAR-элементами, так и стДНК. Вероятно, что взаимодействие MAR/SAR-связывающих белков с стДНК является одним из основных факторов, определяющих формирование гетерохроматина. Способность белков ядерного матрикса формировать устойчивые высокомолекулярные агрегаты может служить одним из механизмов компактизации гетерохроматина и ассоциации гетерохроматиновых районов хромосом с образованием хромоцентров.

Как видно из приведенных литературных данных, сведения о белках ядерного матрикса, связывающихся с стДНК, крайне скудны. Поэтому целью настоящей работы являлось выявление и характеристика белков ядерного матрикса, специфически связывающихся с мажорным сателлитом мыши.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Клонированные последовательности

В работе были использованы следующие клонированные последовательности ДНК. Клонированный в векторе pBluescript II KS+ фрагмент мажорного сателлита мыши длиной 471 п.н., который является димером основной повторяющейся последовательности (Radie et al., 1987). Плазмида была любезно предоставлена Б. Хамкало (University of California, Irvine). Клонированный в pGEM7 фрагмент минорного сателлита мыши 362 п.н. - "тример" основной повторяющейся последовательности 120 п.н. (Kipling et al., 1994). Плазмида была любезно предоставлена Д. Киплингом (Western General Hospital, Edinburgh). Клонированные в векторе pUCl 19 фрагменты (11-меры) а-сателлита человека из локусов а21-1 (клон 11-4, фрагмент 1868 п.н.) и а21-И (клон pN31, фрагмент 1821 п.н.) (Ikeno et al., 1994). Клоны были любезно предоставлены X. Мазумото (Nagoya University, Nagoya). Клонированный в векторе pUC18 фрагмент MAR гена иммуноглобулина к мыши длиной 365 п.н. (плазмида pARl; Tsutsui et al., 1993). Плазмида была любезно предоставлена К. Тсутсуи (Okayama University Medical School, Okayama).

2. Выделение плазмидной ДНК, электрофорез ДНК и введение концевой метки в ДНК

Клетки Е. coli штаммов XL1 blue (Stratagene) трансформировали плазмидной ДНК по стандартной кальциевой методике (Sambrook et al., 1989) или методом электропорации. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989) и дополнительно очищали равновесным центрифугированием в градиенте плотности раствора CsCl (Sambrook et al., 1989).

*ÖCCHftOKA*

4! ПХ^ДАРСЩ^м^

Электрофорез ДНК проводили в 0.5-1.5% агарозных гелях в 1х трисацетатном буфере (40 мМ Трис-ацетат pH 7.5, 1 мМ EDTA). Гель после электрофореза окрашивали в растворе 0.5 мкг/мл бромистого этидия в 1х трисацетатном буфере.

Клонированные последовательности изолировали при помощи расщепления двумя различными рестриктазами по полилинкеру или при помощи расщепления рестриктазой Pvull, которая не расщепляет клонированные последовательности, но все использованные в работе векторы имеют два сайта для данной рестриктазы. Для ДНК-футпринтинга фрагмент метили с одного конца: плазмиду расщепляли первой рестриктазой до включения метки, второй - после включения метки. Использованные рестриктазы и размер полученных фрагментов указан в соответствующих разделах Экспериментальной части. Использовали ферменты фирмы Сибэнзим и Fermentas в соответствии с рекомендациями фирм производителей.

Фрагменты ДНК метили Кленовским фрагментом ДНК полимеразы I (Сибэнзим) или ДНК полимеразой Т4 (Boehriger Mannheim) в присутствии а-[32P]-dATP и остальных трех нерадиоактивных dNTP (Sambrook et al., 1989). Клонированные фрагменты отделяли от вектора и очищали от невключившихся нуклеотидов при помощи электрофореза в 0.8%-ном агарозном геле. Участки геля, содержащие меченый фрагмент, вырезали и замораживали при -20° С. ДНК элюировали центрифугированием фрагментов геля на подложке из спрессованной стекловаты.

3. Выделение ядер и ядерного матрикса из клеток печени

Выделение ядер и ядерного матрикса из клеток печени мыши и фетальной печени человека (абортивный материал) было выполнено согласно описанным методикам (Berezney, Coffey, 1974; Belgrader et al, 1991) с некоторыми модификациями. Выделение проводили на льду или при +4° С. Все растворы содержали 1 мМ PMSF. Около 25 г печени гомогенизировали в стеклянном

гомогенизаторе с тефлоновым пестиком, соединенным с электромотором, в буфере, содержащем 50 мМ Трис-НС1 рН 7.5, 2 мМ Г^СЬ (ТМ-1 буфер) и 300 мМ сахарозы. Ядра осаждали центрифугированием при 1500 g в течение 15 мин, ресуспендировали в ТМ-1 буфере, содержащем 2.1 М сахарозы, наслаивали на подушку того же раствора и повторно осаждали при помощи центрифугирования при 80000 § 30 мин. Чистоту препаратов проверяли под микроскопом. Ядра ресуспендировли в буфере ТМ-2 (20 мМ Трис-НС1 рН 7.5, 5 мМ МяС12) с 50% глицерина и замораживали при -70 °С. Для определения количества ядерной ДНК, аликвоту суспензии ядер смешивали с 0.1 М №ОН и измеряли оптическую плотность (СЮ260) полученного раствора. Для выделения ядерного матрикса, ядра, ресуспендированные в ТМ-2, обрабатывали ДНКазой I (30 Ед ДНКазы I на 1 мг ядерной ДНК) при +4° С в течение 30 мин. К суспензии по каплям с постоянным перемешиванием добавляли равный объем ТМ-2, содержащий 0.4 М (ЫН^гЗСЬ. Нерастворимый материал осаждали центрифугированием на подушке буфера ТМ-2, содержащего 300 мМ сахарозы и 0.2 М (№14)2804, при 2000 g в течение 15 мин. Осадок - ядерный матрикс - ресуспендировали в буфере для экстракции или в ТМ-2, содержащем 50% глицерина, и замораживали при -70° С.

4. Экстракция белков ядерного матрикса и ионообменная хроматография белков на ЭЕАЕ- и СМ-сефарозе

Белки ядерного матрикса экстрагировали буфером, содержащим 50 мМ Трис-НС1 рН 9.0, 10 мМ ЕБТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0.1% тритона Х-100 и 0.1 мМ РМБР. После инкубации с перемешиванием в течение 10 ч при +4° С суспензию центрифугировали при 20000 g 30 мин. рН экстракта доводили буфером Трис-НС1 до 8.0. Далее экстракт использовался для ЭЕАЕ-хроматографии.

Экстракт наносили на 15 мл колонку с ОЕАЕ-сефарозой, уравновешенную 15 мМ Трис-НС1 рН 8.0. После промывки колонки буфером, содержащим 15 мМ

Трис-HCl рН 8.0, 25 мМ NaCl, 0.1 мМ EDTA, 0.1% тритона Х-100, 1 мМ 2-меркаптоэтанола и 0.1 мМ PMSF, сорбировавшиеся белки элюировали либо ступенчатым (100, 250, 400 и 750 мМ NaCl), либо линейным (50-600 мМ NaCl в 75 мл) градиентом концентрации NaCl в том же буфере, при объеме фракций 1.5 мл.

Фракции разбавляли до концентрации NaCl 25 мМ буфером 15 мМ PIPES-NaOH рН 7.0. Далее фракции, содержащие ДНК-связывающую активность, наносили на колонку с СМ-сефарозой объемом 10 мл, уравновешенную 15 мМ PIPES-NaOH рН 7.0. После отмывки колонки раствором, содержащим 15 мМ PIPES-NaOH рН 7.0, 25 мМ NaCl, 0.1 мМ EDTA, 0.1% тритона Х-100, 1 мМ 2-меркаптоэтанола и 0.1 мМ PMSF, сорбировавшиеся белки элюировали ступенчатым градиентом концентрации NaCl (100, 250, 400 и 750 мМ).

По второй методике ядерный матрикс солюбилизировали в растворе, содержащем 8 M мочевины, 20 мМ Трис-HCl рН 7.5, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 0.1 мМ PMSF. Экстракт осветляли центрифугированием при 20000 g 30 мин и наносили на колонку с Q-сефарозой. Белки элюировали ступенчатым градиентом концентрации NaCl (100, 200, 300 и 500 мМ)в присутствие 8 M мочевины и при рН 7.5.

5. Метод замедления в геле и выявление специфических антител при помощи метода замедления в геле

Использовали несколько модифицированную методику Штрауса и Варшавски (Strauss, Varshavsky, 1984). Пробы, как правило, содержали 1 нг меченого фрагмента, 2-10 мкл DEAE- или СМ-фракции и 0.2 мкг неспецифической конкурентной ДНК в буфере для связывания, содержащем 20 мМ Трис-HCl, 4 мМ MgCb, 0.1 мМ EDTA, 0.05% тритона Х-100, 1 мМ 2-меркаптоэтанол и 5% глицерина. В качестве неспецифического конкурента использовали обработанную ультразвуком ДНК Е. coli. Обычно концентрация NaCl в пробе составляла около 150 мМ. После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре пробы наносили на 4% полиакриламидный гель (соотношение

акриламидгбисакриламид 30:1). Электрофорез проводили в 0.5х трисацетатном буфере (20 мМ Трис-ацетат pH 7.5, 0.5 мМ EDTA) при напряжении 10 В/см (Sambrook et al., 1989). Гель высушивали и экспонировали на рентгеновскую пленку XAR-5 (Kodak). Для тестирования антител пробы инкубировали 30 мин при комнатной температуре, после чего добавляли преиммунную, или иммунную сыворотку, или аффинно-очищенные антитела, и пробы инкубировали еще 30 мин.

6. ДНК-футпринтинг

Проба содержала 2 нг (около 10000 имп/мин) меченого фрагмента, 1 мкг ДНК Е. coli и 25 мкл DEAE-фракции в буфере для связывания. После инкубации пробы 30 мин при 22° С добавляли 0.02 Ед. ДНКазы1 (Boehringer Mannheim). Реакцию останавливали через 30 секунд, добавляя EDTA до 10 мМ и 10 мкг тРНК. Смесь экстрагировали фенолом и ДНК осаждали этанолом. Осадок ДНК растворяли в 95% формамиде, 5мМ EDTA с лидирующим красителем, нагревали до 90°С и наносили на блок 7.5% полиакриламид/7М мочевина геля. После электрофореза гель высушивали и экспонирован на рентгеновскую пленку XAR-5 (Kodak). Расщепление ДНК по G проводили согласно методу Максама и Гилберта (Sambrook et al., 1989).

7. Получение антител к ДНК-белковым комплексам.

Для иммунизации были использованы ДНК-белковые комплексы, изолированные при помощи электрофореза в неденатурирующих условиях. Количество меченого фрагмента мажорного сателлита DEAE- или СМ-фракции было увеличено по сравнению с аналитическим вариантом метода замедления в геле в несколько раз. Около 0.3 мкг фрагмента мажорного сателлита находилось в комплексе с белком в каждой пробе. Положение ДНК-белковых комплексов определяли по радиоавтографу (гель не высушивали). Участки геля, содержащие комплексы, вырезали, гомогенизировали, ресуспендировали с адьювантом Фрейнда и инъецировали морской свинке внутрикожно и в

лимфатические узлы. Сыворотку забирали после 2 инъекций, на каждую из которых использовали материал 8 проб. Сыворотку хранили при +4° С с 0.02 % NaN3.

8. Окрашивание белков в полиакрил амид ном геле

После разделения белков при помощи диск-электрофореза в присутствии 0.1% додецилсульфата натрия - по методу Лэммли (Laemmli, 1970), - гель фиксировали в растворе, содержащем 10% уксусной кислоты и 40% этанола, в течение 1 ч при комнатной температуре. Гель окрашивали в растворе, содержащем 0.25% Кумасси G-250 (Serva), 10% уксусной кислоты и 40% этанола, в течение 20 мин и отмывали в нескольких сменах 7% уксусной кислоты. Для окрашивания серебром после фиксации гель отмывали в нескольких сменах 50% этанола 4-8 часов. Раствор для окрашивания готовили следующим образом: к 50 мл раствора AgNÜ3 (1 мг/мл) добавляли 100 мкл 10 М NaOH и немедленно по каплям концентрированный раствор аммиака, до тех пор, пока раствор не становился почти полностью прозрачным. Растворы с незначительной остаточной опалесценцией дают более интенсивное окрашивание. Гель инкубировали в данном растворе в течение 30 мин и интенсивно промывали несколько раз дистиллированной водой. Окраску проявляли в растворе 0.04% формальдегида и 0.01% лимонной кислоты. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор белков HMW (Sigma): 205 кДа - миозин; 116 кДа - ß-галактозидаза Е. coli; 97 кДа -фосфорилаза Ь; 66 кДа - бычий сывороточный альбумин; 45 кДа - овальбумин.

9. Иммуноблоттинг

Белки разделяли электрофорезом по Лэммли (Laemmli, 1970), переносили на нитроцеллюлозный фильтр (Towbin et al., 1979) ВА 85, 0.45 цт (Schleicher&Schuell) и окрашивали Ponceau red. Дорожку, содержащую белки-маркеры мол. массы, отрезали и высушивали. Фильтр отмывали в нескольких сменах 10 мМ Трис-HCl pH 7.5 и инкубировали в ТБС-Tween (20 мМ Трис-НС1

pH 7.5, 120 мМ NaCl, 0.05% Tween 20), содержащем 3% обезжиренного сухого молока, 2 ч при комнатной температуре. Затем фильтр последовательно инкубировали по 1.5 ч при комнатной температуре в ТБС-Tween, содержащем 1%) БСА, с иммунной сывороткой (первые антитела), с антителами к иммуноглобулину G морской свинки или кролика (вторые антитела), меченными биотином (Sigma), и с конъюгатом срептавидина со щелочной фосфотазой (Vector Labs). Фильтр отмывали в ТБС-Tween после каждого этапа инкубации. Разведения первых антител указаны в подписях к рисункам. Разведения вторых антител и конъюгата срептавидина со щелочной фосфотазой были сделаны в соответствии с рекомендациями фирм производителей. Блот окрашивали NBT/BCIP (Sigma) в 100 мМ Трис-HCl pH 9.5, 4мМ MgCl2. Сыворотка кролика к белку SP 120 была любезно предоставлена К. Тсутсуи (Okayama University Medical School, Okayama).

10. Аффинная очистка антител

Аффинную очистку AT проводили на белковом блоте согласно методу Смита и Фишера (Smith, Fisher, 1984) с некоторыми модификациями. Блот с белками ядерного матрикса инкубировали в ТБС-Tween, содержащем 3% обезжиренного сухого молока, в ТБС-Tween с иммунной сывороткой (по 2 ч при комнатной температуре) и отмывали в нескольких сменах 10 мМ Трис-HCl pH 7.5. Участки фильтра, с белками с мол. массой около 120 кДа, вырезали, и связавшиеся антитела элюировали буфером, содержащим 10 мМ глицин pH 2.2, 100 мМ NaCl и 0.1% Tween 20. К раствору антител немедленно добавляли Трис-HCl pH 7.5 до концентрации 50 мМ и бычий сывороточный альбумин до концентрации 100 мг/мл.

11. Саузвестерн-блоттинг

Саузвестерн-блоттинг - связывание ДНК с белками, иммобилизованными на фильтре после электрофореза в денатурирующих условиях, - проводили по описанной методике (von Kries et al., 1991) с некоторыми модификациями.

Белковые препараты смешивали с буфером для проб (10% SDS, 625 мМ Трис-НС1 pH 6.8, 10 мМ EDTA и 10% 2-меркаптоэтанола) в соотношении 4:1 и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Нерастворенный материал удаляли центрифугированием. Белки разделяли электрофорезом в 7% полиакриламидном геле по Лэммли (Laemmli, 1970) и переносили электрофоретически на PYDF фильтр (ICN) в буфере, содержащем 25 мМ Трис и 190 мМ глицин (pH 8.3) без додецилсульфата натрия. Белки окрашивали Ponceau red, и фильтр разрезали на полоски, соответствующие отдельным дорожкам геля. Участки фильтра, с белками-маркерами мол. массы, высушивали или дополнительно окрашивали амидо черным. Остальные полоски отмывали от краски в нескольких сменах раствора 20 мМ Трис-HCl pH 7.5, 1 мМ EDTA и инкубировали в буфере для связывания (15 мМ Трис-HCl pH 7.4, 50 мМ NaCl, 1 мМ EDTA), содержащем 1% обезжиренного сухого молока, дважды по 45 мин при комнатной температуре. Затем фильтры инкубировали в буфере для связывания, содержащем 0.1 мг/мл БСА, 32Р-меченый фрагмент ДНК и различные количества конкурентной ДНК, в течение 1.5 ч. В качестве неспецифического конкурента использовали частично фрагментированную ДНК Е. coli со средней длиной фрагментов около 10 т.п.н. Фильтры отмывали в буфере для связывания трижды по 15 мин, высушивали и экспонировали на рентгеновской пленке XAR-5 (Kodak).

12. Иммунофлуоресцентное окрашивание и гибридизация in situ

Использовали процедуру, предложенную Митчеллом с соавторами (Mitchell et al, 1992). Монослой клеток постоянной линии фибробластов мыши линии DBA/2 (Mitchell et al. 1993) или изолированные ядра клеток печени мыши, иммобилизованные на покрытых полилизином стеклах, фиксировали в 4 %-ном формальдегиде в буфере, содержащем 135 мМ KCl, 20 мМ NaCl, 0.5 мМ EDTA, 0.1% Тритона Х-100, 10 мМ Трис-HCl pH 8.0. Препараты инкубировали последовательно в том же буфере, содержащем 5% БСА, с аффинно

очищенными антителами к белку р120 и иммуноглобулину G морской свинки (Sigma), меченым FITC, и дополнительно окрашивали DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) (Sigma). Для гибридизации in situ фрагмент мажорного сателлита мыши метили биотин-16-dUTP (Boehringer Mannheim) при помощи метода случайной затравки. Препараты клеток, окрашенные антителами к р 120 (но не окрашенные DAPI) инкубировали в растворе 70% формамида/2х88С (0.03 М цитрат натрия, 0.3 М NaCl, pH 7) при 70° С в течение 3 мин и обезвоживали последовательно в 70, 90 и 100% этаноле при 0° С. Меченый биотином фрагмент мажорного сателлита (около 80 нг) денатурировали нагреванием до 100° С в течение 5 мин, охлаждали на льду 3 мин и инкубировали с препаратами клеток в течение ночи в 50% формамиде/2х88С при 37° С в присутствие ДНК спермы лосося в качестве носителя. Затем препараты отмывали в 2xSSC при 50° С и инкубировали с авидином-D, меченным Texas red (Vector Labs). Препараты дополнительно окрашивали DAPI и анализировали на флуоресцентном микроскопе Zeiss Axioplan с помощью программного обеспечения Digital Scientific. Обработка клеток 5-азацитидином и получение препаратов митотических хромосом были выполнены согласно опубликованным ранее методикам (Joseph et al., 1989; Mitchell et al. 1993). Поликлональные антитела к CENP-B были любезно предоставлены В. Эрншоу (Edinburgh University).

13. Определение величины изгиба фрагментов ДНК

Фрагменты разделяли электрофорезом в 7% полиакриламидном геле (соотношение акриламид:бисакриламид 40:1) при напряжении 10 В/см в 1х трисацетатном буфере (40 мМ Трис-ацетат pH 7.5, 1 мМ EDTA) в отсутствии или присутствии 1 мкг/мл бромистого этидия. В первом случае гель после электрофореза окрашивали в растворе 0.5 мкг/мл бромистого этидия в 1х трисацетатном буфере.

Компьютерный анализ величины изгиба ДНК, выраженной в градусах, проводили согласно алгоритму, основанному на так называемой wedge- (клин) модели Улановского и Трифонова (Ulanovsky, Trifonov, 1987). Программа для

подсчета суммарного эффекта, накладываемого на структуру молекулы ДНК наличием в составе ее последовательности АА и TT динуклеотидов, была написана в Matlab версии 5.1.0.421 (The MathWorks, Inc.). Корректность работы программы была проверена при помощи анализа последовательностей, структурные характеристики которых были опубликованы в литературе ранее.

14. Другие методы

Для денситометрирования радиоавтографы сканировали и анализировали при помощи программы Image Tool. Обсчет и графическое представление числовых экспериментальных данных было сделано при помощи Microsoft Excel. Иллюстрации были подготовлены с использованием Adobe Photoshop 4.0.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Выявление ДНК-связывающей активности, специфичной к ДНК мажорного сателлита.

Существует два основных методических подхода к изучению ДНК-связывающих белков, которые позволяют выявлять и анализировать ДНК-связывающую активность в сложных белковых смесях: метод замедления в геле (Strauss, Varshavsky, 1984) и метод связывания ДНК на белковом блоте -саузвестерн-блоттинг (Miskimins et al., 1985). Необходимым условием для применения метода замедления в геле является способность исследуемых белков находиться в растворе. Напротив, саузвестерн-блоттинг не накладывает такого ограничения и непосредственно дает информацию о мол. массе ДНК-связывающего белка, что сделало его особенно популярным при исследовании ядерного матрикса и скэффолда (von Kries et al., 1991; Romig et al., 1992; Hibino et al., 1992; Tsutsui et al., 1993). Однако при помощи метода саузвестерн-блоттинга возможно выявить лишь те белки, которые способны восстанавливать специфическую активность после денатурации в условиях SDS-электрофореза и обладающие способностью непосредственно, а не в комплексе с другими белками, связывать ДНК.

На первом этапе работы для поиска ДНК-связывающего белка, специфичного по отношению к мажорному сателлиту мыши, использовали метод замедления в геле.

Основным препятствием для применения метода замедления в геле в данном случае является исключительно низкая растворимость белков ядерного матрикса. Это потребовало отработки метода экстракции белков в неденатурирующих условиях. Известно, что двухвалентные катионы (Mg2+ и Са2+) и дисульфидные связи между белками стабилизируют структуру ядерного матрикса. Поэтому экстракцию белков проводили в буфере с низкой ионной силой, содержащем высокие концентрации хелатирующего (EDTA) и

восстанавливающего (2-меркаптоэтанол) агентов, при щелочном значении рН -9.0. Несмотря на то, что в этих условиях менее 20% от общего количества белка переходит в растворимую форму, экстракт по спектру белков, выявляемому на SDS-электрофорезе, мало отличается от препаратов ядерного матрикса. Хотя экстракция в тех же условиях, но растворами с высокой ионной силой является более эффективной (солюбилизируется до 50% общего белка ядерного матрикса), последующее разбавление или диализ (что необходимо для дальнейшего анализа методом замедления в геле или фракционирования при помощи ионообменной хроматографии) приводит к значительным потерям в результате повторной агрегации белков. Низкосолевой экстракт является достаточно репрезентативным, поскольку в нем была обнаружена специфическая ДНК-связывающая активность по отношению к клонированным фрагментами мажорного (Лобов и др., 1998) и минорного сателлитов мыши, альфоидного (Енукашвили и др., 1999) и третьего сателлитов человека, а также теломерного повтора позвоночных (Воронин и др., 1999).

Экстракт белков ядерного матрикса наносили на колонку с DEAE-сефарозой. Сорбировавшиеся белки элюировали ступенчатым градиентом концентрации NaCl. ДНК-связывающую активность выявляли при помощи метода замедления в геле. В качестве зонда использовали клонированный фрагмент мажорного сателлита длиной 471 п.н. (димер основной повторяющийся единицы 234 п.н.), который отделяли от ДНК вектора при помощи обработки рестриктазами HindiII и Xbal. Фрагмент метили 32Р, достраивая укороченные 3'-концы с помощью фермента Кленова. В серии повторных экспериментов было показано наличие двух различных ДНК-связывающих активностей, элюируемых с DEAE-сефарозы при 250 (DE25) и 400 (DE40) мМ NaCl (рис. 1, А и Б). Хотя относительная подвижность комплексов мажорного сателлита с белками фракций DE25 и DE40, значительно варьировала в различных экспериментах, наличие двух пиков ДНК-связывающей активности во фракциях, элюированных ступенчатым или

A SS

Б

1 2 3 4 5

В

1 2 3 4 5

С 2 4 б 8 10 12 14 16 18 20 22

Рис. 1. Выявление ДНК-связывающей активности методом замедления в геле после фракционирования белков ядерного матрикса на DEAE- (А, В) и СМ-сефарозе (Б).

А - Анализ фракций, элюированных с DEAE-сефарозы. Пробы содержали 1 нг меченого фрагмента мажорного сателлита и 200 нг ДНК Е. coli. 1-150 мМ, 2 -250 мМ (DE25), 3 - 400 мМ (DE40), 4 - 750 мМ, 5 - свободный фрагмент.

Б - Анализ фракций, элюированных с СМ-сефарозы. Пробы содержали 1 нг меченого фрагмента мажорного сателлита и 200 нг ДНК Е. coli. 1 - свободный объем колонки, 2 - 100 мМ, 3 - 250 мМ, 4 - 400 мМ, 5 - свободный фрагмент.

В - Анализ фракций, элюированных линейным градиентом концентрации NaCl с DEAE-сефарозы. Под дорожками указаны номера фракций. С - свободный объем колонки. Каждая проба содержала 1 нг меченого фрагмента и 250 или 500 нг (для каждой фракции) ДНК Е. coli.

Стрелками указаны положения ДНК-белковых комплексов.

линейным градиентами концентрации NaCl, стабильно воспроизводилось. Присутствие при анализе белков фракции DE25 нескольких комплексов, имеющих экспоненциальный характер различий в подвижности, указывает на способность ДНК-связывающего белка к агрегации (рис 1, А). Об этом также говорит постепенная агрегация белков в процессе хранения фракций, приводящая к появлению высокомолекулярных ДНК-белковых комплексов, которые остаются на старте электрофореза. По-видимому, белок в растворе в форме мономеров неустойчив, и легко полимеризуется при изменении условий. При нанесении белка на ионообменник происходит увеличение его концентрации в результате сорбции на матрице, что приводит к его агрегации. Так, после хроматографии белков фракции DE25 на СМ-сефарозе около половины ДНК-связывающего белка перешло в форму высокомолекулярных комплексов, как это видно на рисунке 1, Б. Хроматография белков фракции DE40 на СМ-сефарозе напротив приводит к диссоциации высокомолекулярных комплексов. Увеличение времени фракционирования белков экстракта ядерного матрикса на ионообменной колонке дает аналогичный результат, как видно из рисунка 1, В. В отличие от белка, элюируемого с DEAE-сефарозы при концентрации NaCl 200-250 мМ, который образует высокомолекулярный комплекс с ДНК, комплексы ДНК с белком, присутствующим во фракциях с концентрацией NaCl 300-500 мМ (DE40), приобретают высокую подвижность на электрофорезе. Их подвижность зависит от небольших различий в количестве конкурентной ДНК. По-видимому, несколько молекул белка независимо (а не в виде устойчивого комплекса) связываются с ДНК и легко диссоциируют при добавлении неспецифической конкурентной ДНК. Специфичность связывания белка фракции DE40 с фрагментом мажорного сателлита оказалась невысока. В случае белка фракции DE25 при добавлении неспецифической конкурентной ДНК количество меченого фрагмента в комплексе с белком несколько снижается, но при этом подвижность комплекса не изменяется (рис. 1, В).

Вероятно, белок формирует устойчивый высокомолекулярный комплекс, который связывается с фрагментом мажорного сателлита.

Сравнение эффективности, с которой ДНК Е. coli и немеченый фрагмент мажорного сателлита (неспецифический и специфический конкурент соответственно) конкурируют с меченым фрагментом мажорного сателлита за связывание с белком, показало, что ДНК-связывающая активность во фракции DE25 специфична по отношению к мажорному сателлиту (рис 2). Избытки специфического конкурента в 50 раз меньшие, чем неспецифического, полностью подавляют связывание белка с меченым фрагментом. Таким образом, сродство ДНК-связывающего белка во фракции ДЭ25, по крайней мере, в 50 раз выше по отношению к фрагменту мажорного сателлита, чем к ДНК Е. coli.

На связывание белка фракции DE25 также оказывает влияние длина фрагмента ДНК. Мономер мажорного сателлита длиной 234 п.н. получали при помощи дополнительного расщепления Hindlll-Xbal фрагмента (димера) рестриктазой BstNl. Белок фракции DE25 специфически связывается с мономером мажорного сателлита, однако, имеет к нему в 5 раз меньшее сродство, чем к димеру (рис 2, Б). Отдельная молекула белка способна связываться лишь с коротким участком последовательности и, по-видимому, не может различать использованные в данном случае фрагменты длиной более 200 п.н. Однако это возможно в том случае, если в связывании с ДНК участвует комплекс, содержащий несколько молекул белка и связывание имеет кооперативный характер. Способность кооперативно связываться с ДНК в форме высокомолекулярного комплекса и вследствие этого зависимость аффинности связывания от длины фрагмента ДНК характерны для ДНК-связывающих белков ядерного матрикса/скэффолда - топоизомеразы II (Adachi et al., 1989), ARBP (von Kries et al., 1991) и SP120 (Tsutsui et al., 1993).

W Л Л Л

• в

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Лобов, Иван Борисович

ВЫВОДЫ

1. В ядерном матрнксе клеток печени мыши выявлены белки с молекулярными массами 120, 123, 130 и 150 кДа, специфически связывающиеся с мажорным сателлитом.

2. Сравнение сродства белков р120 и р 130 к различным сателлитными ДНК показало высокую специфичность взаимодействия этих белков с стДНК, локализованными в прицентромерных районах хромосом мыши и человека. Выявлена прямая зависимость аффинности связывания белков р120 и р 130 от наличия изгиба цепи стДНК.

3. Показано, что белки ядерного матрикса р 120, р123, р 130 и р150 с одинаковой специфичностью связываются с мажорным сателлитом и MAR гена иммуноглобулина к мыши, что представляет собой непосредственное свидетельство наличия общих свойств у стДНК и MAR/SAR-элементов - in vitro стДНК могут быть аналогичны MAR/SAR-элементам.

4. Белок ядерного матрикса р120 идентифицирован как описанный ранее MAR/SAR-связывающий белок SAF-A/SP120/hnRNP-U. Двойственная специфичность ДНК-связывания и локализация р120 в интерфазном ядре на периферии хромоцентров, содержащих мажорный сателлит, позволяют предположить, что р120 участвует в прикреплении MAR/SAR-районов к гетерохроматину.

Автор глубоко благодарен Ольге Игоревне Подгорной за предложенную тему, научное руководство, постоянную помощь и внимание. Автор искренне признателен Артуру Митчеллу за помощь в выполнении работы, активное обсуждение результатов и плодотворную дискуссию. Хотелось бы поблагодарить всех коллег, которые проявляли внимание и интерес к этой работе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лобов, Иван Борисович, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Беридзе Т.Г. Сателлитная ДНК. М.: Наука. 1982. 121 с.

Бирштейн В.Я. Гетерохроматин, мозаичный эффект положения у Drosophila и проблема гетерохроматинизации хромосом // Усп. соврем, биол. 1976. Т. 81. № 2. С. 225-243.

Воронин А.П., Лобов И.Б., Бугаева Е.А., Парфенов В.Н., Подгорная О.И. Теломер-связывающий белок ядерного матрикса мыши. I. Идентификация. // Молекуляр. биология. 1999 (в печати).

Глазков М.В. Петльно-доменная организация генов в эукариотических хромосомах // Молекуляр. биология 1995. Т. 29. № 5. С. 965-982.

Дулиттл У.Ф. Четырнадцать месяцев концепции "эгоистичной" ДНК // В кн.: Эволюция генома. М.: Мир. 1986. С. 13-39.

Енукашвили Н.И., Лобов И.Б., Подгорная О.И. Ядерный матрикс человека содержит белковый комплекс, специфически связывающий альфа-сателлитную ДНК in vitro // Биохимия. 1999. Т. 64. № 4. С. 132-141.

Куличков В.А., Жимулев И.Ф. Анализ пространственной организации генома Drosophila melanogaster на основе данных по эктопической конъюгации политенных хромосом // Генетика. 1976. Т. XII. № 5. С. 81-89.

Лобов И.Б., Митчелл А.Р., Подгорная О.И. Белок ядерного матрикса, специфически связывающий основной сателлит мыши II Молекуляр. биология. 1998. Т. 32. № 6. С. 893-898.

Лобов И.Б., Подгорная О.И. Роль белков ядерного матрикса в формировании гетерохроматина // Цитология. 1999. (в печати).

Полторацкий В.П., Деи Р., Белгрейдер Ф., Березней Р., Подгорная О. Белок, связанный с сателлитной ДНК, присутствует в препаратах ядерного матрикса клеток человека//Молекуляр. биология. 1991. Т. 25. № 1. С. 83-90.

Прокофьева-Бельговская A.A. Гетерохроматические районы хромосом. М.: Наука. 1986. 431 с.

Яровая О.В., Разин С.В. Два типа участков прикрепления ДНК к ядерному скелету в клетках асцитной карциномы Эр лиха//Молекуляр. биология. 1983. Т. 17. № 2. С. 303-312.

Яровая О.В., Разин С.В. Новые подходы к изучению структурно-функциональной организацииэукариотического генома// Молекуляр. биология. 1998. Т. 32. № 1. С. 43-53.

Adachi Y., Käs Е., Laemmli, U.K. Preferential, cooperative binding of DNA topoisomerase П to scaffold-associated regions //EMBO J. 1989. Vol. 8. P. 3997-4006.

Agresti A, Meneveri R, Siccardi A.G., Marozzi A, Corneo G., Guadi S., Ginelli E. Linkage in human heterochromatin between highly divergent Sau ЗА repeats and a new family of repeatedDNAsequences (HAE 3 family)// J. Mol. Biol. 1989. Vol. 205. P. 625-631.

Agresti A, Rainabli G., Lobbiani A, Magnani I., Dilernia R., Meneveri R, Siccardi AG., Ginelli E. Chromosomal location by in situ hybridization of the human Sau3A family of DNA repeats//Hum. Genet. 1987. Vol. 75. P. 326-332.

Allshire R.C., Javerzat J.-P., Redhead N, Cranston G. Position effect variegation at fission yeast centromeres//Cell. 1994. Vol. 76. P. 157-169.

Amati В., Pick L., Laroche Т., Gasser S.M. Nuclear scaffold attachment stimulates, but is not essential for ARS activity in Saccharomyces cerevisiae: analysis of the Drosophila ftz SAR//EMBO J. 1990. Vol. 9. P. 4007-4016.

Amati B.B., Gasser S.M Chromosomal ARS and CEN elements bind specifically to the yeast nuclear scaffold// Cell 1988. Vol. 54. P. 967-978.

Anderson J.N. Detection, sequence patterns and function of unusual DNA structures // Nucleic Acids Res. 1986. Vol. 21. P. 8513-8533.

Ashley C.T., Pendleton CG., Jennings W.W., Saxena A, Glover C.V.C. Isolation and sequencing of cDNA clones encoding Drosophila chromosomal protein Dl. A repeating

motif in proteins which recognize AT DNA // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 83948401.

Avides M. C., Sunkel C. E. Isolation of chromosome-associated proteins from Drosophila melanogaster that bind a human centromeric DNA sequence // J. Cell Biol. 1994. Vol. 127. P. 1159-1171.

Baltimore D. Gene conversion: some implications for immunoglobulin genes // Cell. 1981. Vol. 24. P. 592-594.

Barcelo F., Pons J., Petitpierre E., Barjau I., Portugal J. Polymorphic curvature of satellite DNA in three subspecies of the beetle Pimelia sparsa II Eur. J. Biochem. 1997. Vol. 244. P. 318-324.

Barsacchi-Pilone G., Batistoni R., Andronico F., Vitelli L., Nardi I. Heterochromatic DNA in Triturus (Amphibia, Urodela). I. A satellite DNA component of the pericentric C-bands // Chromosoma 1986. Vol. 93. P. 435-446.

Baum M., Ngan V.K., Clarke L. The centromeric K-type repeat and the central core are together sufficient to establish a functional Schizosaccharomyces pombe centromere // Mol. Biol. Cell. 1994. Vol. 5. P. 747-761.

Belgrader P., Siegel A. J., Berezney R. A comprehensive study on the isolation and characterization oftheHeLa S3 nuclear matrix//J. Cell Sci. 1991. Vol. 98. P. 281-291.

Benfante R, Landsberger N., Tubiello G., Badaracco G. Sequence-directed curvature of repetitive AM DNA in constitutive heterochromatin of Artemia franciscana II Nucleic Acids Res. 1989. Vol. 17. P. 8273-8282.

Berezney R, Coffey D.S. Identification of a nuclear protein matrix // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. Vol. 60. P. 1410-1417.

Berezney R, Mortillaro M.J, Ma H, Wei X, Samarabandu J. The nuclear matrix: a structural mileu for nuclear genomic function//Int. Rev. Cytol. 1995. Vol. 162A. P. 2-66.

Berrios M, Osheroff N, Fisher P.A. In situ localization of DNA topoisomerase II, a major polypeptide component of the Drosophila nuclear matrix fraction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985. Vol. 82. P. 4142-4146.

Bickmore W.A, Oghene K. Visualization the spatial relationships between defined DNA sequences and the axial region of extrated metaphase chromosomes // Cell. 1996. Vol. 84. P. 95-104.

Bilaud T., Koering C.E., Binet-Brasselet E., Ancelin K, Pollice A., Gasser S.M, Gilson E. The telobox, a Myb-related telomeric DNA binding motif found in proteins from yeast, plants and human//Nucleic Acids Res. 1996. Vol. 24.1294-1303.

Blasquez V.C., Speny AO., Cockerill P.N, Garrard W.T. Protein:DNA interaction at chromosomal loop attachment sites // Genome. 1989. Vol. 31. P. 503-509.

Bode I, Kohwi Y., Dickinson L., Joh T., Klehr D., Mielke C., Kohwi-Shigematsu Z. Biological significance of unwinding capability of nuclear matrix associating DNAs // Science. 1992. Vol. 255 P. 195-197.

Boulikas T. Prediction of MAR sequences // Int. Rev. Cytol. 1995. Vol. 162A. P. 279-388.

Britten RJ., Kohne E.D. Repeated sequences in DNA// Science 1968. Vol. 161. P. 529-540.

Broccoli D., Miller O.J., Miller D.A. Relationship of mouse minor satellite DNA to centromere activity// Cytogenet. Cell. Genet. 1990. Vol. 54. P. 182-186.

Broccoli D., Trevor K.T., Miller O.J., Miller D.A Isolation of a variant family of mouse minor satellite DNA that hybridized preferentially to chromosome 4 // Genomics. 1991. Vol. 10. P. 68-74.

Broccoli D., Chong L., Oelmann S., Fernald AA, Marziliano N., van Steensel B., Kipling D., Beau M.M.L., de Lange T. Comparison of the human and mouse genes encoding the telomeric protein, TRF1: chromosomal localization, expression and conserved protein domains//HumanMol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 69-76.

Brown K.E., Barnett MA, Burgtorf C., Shaw P., Buckle V.J, Brown W.R.A. Dissecting the centromere of the human Y chromosome with cloned telomeric DNA // Hum. Mol. Genet. 1994. Vol. 3. P. 1227-1237.

Brown K.E., Guest S.S., Smale S.T., Hahm K., Merkenschlager M., Fisher AG. Association of transcriptionally silent genes with Ikaros complexes at centromeric heterochromatin // Cell. 1997. Vol. 91. P. 845-854

Brun C., Marcand S., Gilson E. Proteins that bind to double-stranded regions of telomeric DNA // Trends Cell Biol. 1997. Vol. 7. P. 317-324.

Buhrmester H., von Kries J.P., StratJing W.H. Nuclear matrix protein ARBP recognizes a novel DNA sequence motif with high affinity // Biochem. 1995. Vol. 34. P. 4108-4117.

Cacchione S., Fua M., Rossetti L., Savino M Nucleosome assembly on telomeric sequences // EMBO Workshop 1997. P. 103.

Capoa, de, A, Menendez F., Poggesi I., Giancotti P., Grappelli C., Marotta M.R., Di Leandro M, Reynaud C., Niveleau A Cytological evidence for 5-azacytidine-induced demethylation of the heterochromatic regions of human chromosomes // Chromosome Res. 1996. Vol. 4. P. 271-276.

Cavalli G., Paro R. Chromo-domain proteins: linking chromatin structure to epigenetic regulation//Curr. Opin. Cell Biol. 1998. Vol. 10. P. 354-360.

Chatterjee B., Lo C.W. Chromosome recombination and breakage associated with instability of mouse CEN sat DNA//J. Mol. Biol. 1989. Vol. 210. P. 303.

ChongL., van Steensel B., Broccoli D., Erdjument-Bromage H., Hanish J., Tempst P., de Lange T. A human telomeric protein//Science. 1995. Vol. 270. P. 1663-1667.

Choo K.H., Earle E., McQuillan C. A homologous subfamily of satellites m DNA on human chromosomes 14 and 22//Nucleic Acids Res. 1990. Vol. 18. P. 5641-5648.

Cockerill P. N, Garrard W. T. Chromosomal loop anchorage of the kappa immunoglobulin gene occurs next to the enhancer in a region containing topoisomerase II sites // Cell. 1986b. Vol. 44. P. 273-282.

Cockerill P.N., Garrard W.T. Chromosomal loop anchorage sites appear to be evolutionary conserved//FEBS Lett. 1986a. Vol. 204. P. 5-7.

Cohn M, McEachern M.J., Blackburn E.H. Telomeric sequence diversity within the genus Saccharomyces//Curr. Genet. 1998. Vol. 33. P. 83-91.

Comings D.E. Arrangement of chromatin in the nucleus // Hum. Genet. 1980. Vol. 53. P. 131143.

Craig J.M, Boyle S., Perry P., Bickmore W.A Scaffold attachments within the human genome //J. Cell Sci. 1997. Vol. 110P. 2673-2682.

de Lange T. Human telomeres are attached to the nuclear matrix // EMBO J. 1992. Vol. 2. P. 717-724.

Dernburg A.F., Broman K.W., Fung J.C., Marshall W.F., Philips J., Agard D.A., Sedat J.W. Perturbation of nuclear architecture by long-distance chromosome interactions // Cell. 1996. Vol. 85. P. 745-759.

Disney J.E., Johnson K.R., Magnuson N.S., Sylvester S.R., Reeves R High-mobility group protein HMG-I localizes to G/Q- and C-bands of human and mouse chromosomes // J. Cell Biol. 1989. Vol. 109. P. 1975-1982.

Doolittle W.F., Sapienza C. Selfish genes, the phenotype paradigm and genome evolution. Nature 1980. Vol. 284. P. 601-603.

Doshi P., Kaushal S., Benyajati C., Wu C. I. Molecular analysis of the responder satellite DNA in Drosophila melanogaster. DNA bending, nucleosome structure, and Rsp-binding proteins//Mol. Biol. Evol. 1991. Vol. 8. P. 721-741.

Earnshaw W.C., Halligan B., Cooker C.A., Heck M.M.S., Liu L.F. Topoisomerase II is a structural component of mitotic chromosome scaffolds // J. Cell. Biol. 1985. Vol. 100. P. 1706-1715.

Earnshaw W.C., Halligan N., Cooke C., Rothfield N. The kinetochore is part of the metaphase chromosome scaffold//J. Cell. Biol. 1984. Vol. 98. P. 352-357.

Earnshaw W.C., Ratrie H., Stetten G. Visualization of centromere proteins CENP-B and CENP-C on a stable dicentric chromosome in cytological spreads // Chromosoma 1989. Vol. 98. P. 1-12.

Ekwall K., Olsson T., Turner B.M., Cranston G., Allshire R.C. Transient inhibition of histone deacetylation alters the structural and functional imprint at fission yeast centromeres // Cell. 1997. Vol. 91. P. 1021-1032.

Fackelmayer F.O., Dahm K, Ramsperger U., Richter A Nucleic acid binding properties of hnRNP-U/SAF-A, a nuclear matrix protein which binds DNA and RNA in vivo and in vitro //Eur. J. Biochem. 1994. Vol. 211. P. 749-757.

Fisher AM., Al-Gazali L., Pramathan T., Quaife R, Cockwell A.E., Barber J.C.K., Earnshaw W.C., Axelman J., Migeon B.R., Tyler-Smith C. Centromeric inactivation in a dicentric human Y;21 translocation chromosome//Chromosoma. 1997. Vol. 106. P. 199-206.

Fitzgerald D.J., Dryden G.L., Bronson E.C., Williams J.S., Anderson J.N. Conserved pattern of bending in satellite and nucleosome positioning DNA // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 21303-21314.

Gaff C., du Sart D., Kalitsis P., Iannello R., Nagy A, Choo K.H. A novel nuclear protein binds centromeric alpha satellite DNA // Hum. Mol. Genet. 1994. Vol. 3. P. 711-716.

Gasser S.M, Laemmli U.K. Cohabitation of scaffold binding regions with upstream/enhancer elements of three developmentally regulated genes of D. melanogaster // Cell. 1986. Vol. 46. P. 521-530.

Gohring F., Fackelmayer F.O. The scaffold/matrix attachment region binding protein hnRNP-U (SAF-A) is directly bound to chromosomal DNA in vivo: a chemical cross-linking study // Biochem. 1997. Vol. 36. P. 8276-8283.

Gohring F., Schwab B.L., Nicotera P., Leist M., Fackelmayer F.O. The novel SAR-binding domain of scaffold attachment factor A (SAF-A) is a target in apoptotic nuclear breakdown//EMBO J. 1997. Vol. 16. P. 7361-71.

Grady D.L., Ratliff R.L., Robinson D.L., McCanlies E.C., Meyne J., Moyzis R.K. Highly conserved repetitive DNA sequence are present at human centromeres // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992. Vol. 89. P. 1695-1699.

Haaf T., Schmid M. 5-Azadeoxycytidine induced undercondensation in the giant X chromosomes ofMicrotw agrestis. Chromosoma (Berl) 1989. Vol. 98. P. 93-98.

Haaf T., Warburton P.E., Willard H.F. Integration of human a-satellite DNA into simian chromosomes: centromere protein binding and disruption of normal chromosome segregation//Cell. 1992. Vol. 70. P. 681-696.

Hanish J.P., Yanowitz J.L., de Lange T. Stringent sequence requirements for the formation of human telomeres//Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994. Vol. 91. P. 8861-8865.

Harata M, Ouchi K, Ohata S., Kikuchi A., Mizuno S. Purification and characterization of W-protein. A DNA-binding protein showing high affinity for the W chromosome-specific repetitive DNA sequences of chicken//J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263. P. 13952-13961.

He D., BrinHey B.R Structure and dynamic organization of centromeres/prekinetochores in the nucleus of mammalian cells //J. Cell. Sci. 1996. Vol. 109. P. 2693-704.

He D., Zeng C., Woods K, Zhong L., Turner D., Busch R.K., BrinHey B.R, Busch H. CENP-G: a new centromeric protein that is associated with the a-1 satellite DNA subfamily // Chromosoma. 1998. Vol. 107. P. 189-197.

Heck M.M., Earnshaw W.C. Topoisomerase II: A specific marker for cell proliferation // J. Cell Biol. 1986. Vol. 103. P. 2569-2581.

Heller R, Brown K.E., Burgtorf C., Brown W.RA Mini-chromosome derived from the human Y chromosome by telomere directed chromosome breakage // Proct. Natl. Acad. Sci. USA 1996. Vol. 93. P. 7125-7130.

Hibino Y., Nakamura K., Asano S., Sugano N. Affinity of a highly repetitive bent DNA for nuclear scaffold proteins from rat liver // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. Vol. 184. P. 853-858.

Hibino Y., Nakamura K., Tsukada S., Sugano N. Purification and characterization of nuclear scaffold proteins which bind to a highly repetitive bent DNA from rat liver // Biochim. Biophys. Acta. 1993. Vol. 1174. P. 162-170.

Hibino Y., Tsukada S., Sugano N. Properties of a DNA-binding protein from rat nuclear scaffold fraction//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. Vol. 197. P. 336-342.

Hibino Y, Tsukada S, Sugano N. Purification and characterization of a DNA binding protein in a nuclear scaffold fraction from rat ascites hepatoma cells // Carcinogenesis. 1997. Vol. 18. P. 707-713.

Hofinann J.F.-X., Laroche T., Brand A.H., Gasser S.M. RAP-1 factor is necessary for DNA loop formation in vitro at the silent mating type locus HMLI I Cell. 1989. Vol. 57. P. 725-737.

Homberger H.P. Bent DNA is a structural feature of scaffold-attached regions in Drosophila melanogaster // Chromosoma. 1989. Vol. 98. P. 99-104.

Hsieh C-H., Griffith J.D. The terminus of SV40 DNA replication and transcription contains a sharp sequence-directed curve // Cell. 1988. Vol. 52. P. 535-544.

Hsu T.C., Cooper J.E.K., Mace ML., Jr., Brinkley B.R Arrangement of the centromeres in mouse cells//Chromosoma. 1971. Vol. 34. P. 73-87.

Hudson D.F., Fowler K.J., Earle E., Saffeiy R, Kalitsis P., Trowell H, Hill J., Wreford N.G., de Kretser D.M., Cancilla MR, Howman E., Hii L., Cutts S.M., Irvine D.V., Choo K.H.A. Centromere protein B null mice are mitotically and meiotically normal but have lower body and testis weights //J. Cell Biol. 1998. Vol. 141. P. 309-319.

Ikeno M., Masumoto H, Okazaki T. Distribution of CENP-B boxes reflected in CREST centromere antigenic sites on long-range alpha-satellite DNA arrays of human chromosome21 //Hum. Mol. Genet. 1994. Vol. 3. P. 1245-1257.

Izaurralde E., Kas E., Laemmli U.K. Highly preferential nucleation of histone HI assembly on scaffold-associated region sequences//J. Mol. Biol. 1989. Vol. 210. P. 573-585.

Jenuwein T., Laible G., Dorn R., Reuter G. SET domain proteins modulate chromatin domains in eu- and heterochromatin // CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 1998

Jeppesen P., Mtchell A, Turner B., Perry P. Antibodies to defined histone epitopes reveal variations in chromatin conformation and underacetylation of centric heterochromatin in human metaphase chromosomes//Chromosoma. 1992. Vol. 101. P. 322-332.

Jeppesen P., Turner B.M The inactive X chromosome in female mammals is distinguished by a lack of histone H4 acetylation, a cytogenetic marker for gene expression // Cell. 1993. Vol. 74. P. 281-289.

John B., Miklos G.G. Functional aspects of satellite DNA and heterochromatin. Intern. Rev. Cytol. 1979. Vol. 58.P. 1-114.

Joseph A, Mitchell A.R, Miller O.J. The organization of the mouse satellite DNA at centromeres. Exp. Cell. Res. 1989. Vol. 183. P. 494-500.

Karpen G.H., Allshire R.C. The case for epigenetic effects on centromere identity and function // Trends Genet. 1997. Vol. 13. P. 489-496.

Kas E., Izaurralde E., Laemmli U.K. Specific inhibition of DNA binding to nuclear scaffold and histone HI by distamycin: the role of oligo(dA)-oligo(dT) tracts // J. Mol. Biol. 1989. Vol. 210. P. 587-599.

Kas E., Laemmli U. K. In vivo topoisomerase II cleavage of the Drosophila histone and satellite in repeats: DNA sequence and structural characteristics // EMBO J. 1992. Vol. 11. P. 705-716.

Kellum R., Alberts B.M. Heterochromatin protein 1 is required for correct chromosome segregation in Drosophila embryos//J. Cell Sci. 1995. Vol. 108 P. 1419-1431

Kiledjian M., Dreyfuss G. Primary structure and binding activity of the hnRNP U protein: binding RNA through RGG box//EMBO. 1992. Vol. 11. P. 2655-2664.

Kipling D., Cooke H.J. Hypervariable ultra-long telomeres in mice // Nature. 1990. Vol. 347. P. 347-402.

Kipling D., Mitchell AR, Masumoto H., Wilson H.W., Nicol L., Cooke H.J. CENP-B binds a novel centromeric sequence in the Asian mouse Mm caroli //Mol. Cell. Biol. 1995. Vol. 15. P. 4009-4020.

Kipling D. The telomere. New York: Oxford University Press. 1995. 208 pp.

Kipling D., Warburton P.E. Centromeres, CENP-B and Tigger too // Trends Genet. 1997. Vol. 13. P. 141-145.

Kipling D., Wilson H.W., Mitchell AR, Taylor B.A, Cooke H.J. Mouse centromere mapping using oligonucleotide probes that detect variants of the minor satellite // Chromosoma 1994. Vol. 103. P 46-55.

Kit S. Equilibrium sedimentation in density gradients of DNA preparations from animal tissues // J. Mol. Biol. 1961. Vol. 3. P. 711-716.

Kit S. Species differences in animal deoxyribonucleic acids as revealed by equilibrium sedimentation in density gradients //Nature 1962. Vol. 193. P. 274.

Kitagawa K., Masumoto H., Ikeda M., Okazaki T. Analysis of protein-DNA and protein-protein interactions of centromere protein B (CENP-B) and properties of the DNA-CENP-B complex in the cell cycle//Mol. Cell. Biol. 1995. Vol. 15. P. 1602-1612.

Kodama H., Saitoh H., Tone M., Kuhara S., Sakaki Y., Mizuno S. Nucleotide sequences and unusual electrophoretic behavior of the W chromosome-specific repeating DNA units of the domestic fowl, Gallus gallus domesticus II Chromosoma. 1987. Vol. 96. P. 18-25.

Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4// Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.

Larin Z., Fricker M.D., Tyler-Smith C. De novo formation of several features of a centromere following introduction of a Y-alphoid YAC into mammalian cells // Hum. Mol. Genet. 1994. Vol. 3. P. 689-695.

Lebkowski J.S., Laemmli U.K. Evidence for two levels of DNA folding in histone-depleted HeLa interphase nuclei //J. Mol. Biol. 1982. Vol. 156. P. 309-324.

Lee C., Wevrick K, Fisher R.B., Ferguson-Smith M. A, Lin C.C. Human centromeric DNAs // Hum. Genet. 1997. Vol. 100. P. 291-304.

Levinger L.F. D1 protein of Drosophila melanogaster. Purification and AT-DNA binding properties//! Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 14311-14328.

Levinger L.F., Varshavsky A. Protein D1 preferentially binds A+T-rich DNA in vitro and is a component of Drosophila melanogaster nucleosomes containing A+T-rich satellite DNA //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982a. Vol. 79. P. 7152-7156.

Levinger L.F., Varshavsky A Selective arrangement of ubiquitinated and D1 protein-containing nucleosomes within the Drosophila genome // Cell. 1982b. Vol. 28 P. 375-385.

Lewis J.D., Meehan R.R., Henzel W.J., Maurer-Fogy I., Jeppesen P., Klein F., Bird A. Purification, sequence, and cellular localization of a novel chromosomal protein that binds to methylated DNA//Cell. 1992. Vol. 69. P. 905-914.

Lorentz, A., Ostermann, K., Reck, O. and Schmidt, H. Switching gene swi6, involved in repression of silent mating-type loci in fission yeast, encodes a homologue of chromatin-associated proteins from Drosophila and mammals // Gene 1994. Vol. 143. P. 139-143.

Luderus M.E.E., de Graaf A, MattiaE., den Blaauwen J.L., Grande M.A, de Jong L., van Driel R Binding of matrix attachment regions to lamin B] // Cell. 1992. Vol. 70. P. 949-959.

Luderas M.E.E., den Blaauwen J.L., de Smit O.J.B., Compton D.A., van Driel R. Binding of matrix attachment regions to lamin polymers involves single-stranded regions and the minor groov//Mol. Cell. Biol. 1994. Vol. 14. P. 6297-6305.

Manuelidis L., Borden J. Reproducible compartmentahzation of individual chromosomes domains in human CNS cells revealed by in situ hybridization and 3-dimentionai reconstruction//Chromosoma. 1988. Vol. 96. P. 397-410.

Manuelidis L. A. A view of interphase chromosomes//Science. 1990. Vol. 250. P.1533-1540.

Martinez-Balbas A., Rodriguez-Campos A, Garcia-Ramirez M., Sainz J., Carrera P., Aymami J., Azorin F. Satellite DNAs contain sequence that induce curvature // Biochemistry. 1990. Vol. 29. P. 2342-2348.

Masumoto H., Ikeno M., Nakano M., Okazaki T., Grimes B., Cooke H., Suzuki N. Assay of centromere function using a human artificial chromosome // Chromosoma 1998. Vol. 107. P. 406-416.

Masumoto, H., Masukata, H., Muro, Y., Nozaki, N, and Okazaki, T. A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite // J. Cell Biol. 1989. Vol. 109. P. 1963-1973.

Matsumoto L.H. Enrichment of satelhte DNA on the nuclear matrix of bovine cells // Nature. 1981. Vol. 294. P. 481-482.

Meehan R.R, Lewis J.D., McKay S., Kleiner E., Bird AP. Identification of a mammalian protein that binds specifically to DNA containing methylated CpGs.// Cell 1989. Vol. 58. P. 499-507.

Mirkovitch J., Gasser S.M, Laemmli U.K. Scaffold attachment of DNA loops in metaphase chromosomes//! Mol. Biol. 1988. Vol. 200. P. 101-109.

Mirkovitch J., Mirault M.-E., Laemmli U.K. Organization of the higher-order chromatin loop: specific DNA attachment sites on nuclear scaffold// Cell 1984. Vol. 39. P. 223-232.

Mskimins W.K., Roberts M. P., McClelland A, Ruddle F. H. Use of a protein-blotting procedure and a specific DNA probe to identify nuclear proteins that recognize the promoter region of the transferrin receptor gene. Proct. Natl. Acad. Sci. USA 1985. Vol. 82. P. 67416744.

Mitchell AR, Jeppesen P., Hanratty D., Gosden J. The organisation of repetitive DNA sequences on human chromosomes with respect to the kinetochore analysed using a combination of oligonucleotide primers and CREST anticentromere serum // Chromosoma. 1992. Vol. 101. P. 333-341.

Mtchell AR, Jeppesen P., Nicol L., Morrison H., Kipling D. Epigenetic control of mammalian centromere protein binding: does DNA methylation have a role? // J. Cell Sci. 1996. Vol. 109. P. 2199-2206.

Mtchell AR, Nicol L., Malloy P., Kipling D. J. Novel structural organisation of a Mus musculus DBA/2 chromosome shows a fixed position for the centromere. J. Cell. Sci. 1993. Vol. 106 P. 79-85.

Moens P.B., Pearlman RE. Telomere and centromere DNA are associated with the cores of meiotic prophase chromosomes//Chromosoma. 1990. Vol. 100. P. 8-14.

Moroi Y., Peebles C., Fritzler MJ., Steigerwald J., Tan E.M Autoantibody to centromere (kinetochore) in scleroderma sera//Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980. Vol. 77. P. 16271631.

Moyzis RK., Buckingham J.M., Cram L.S., Dani M., Deaven L.L., Jones MD., Meyne J., Ratliff R.L., Wu J.-R. A highly conserved repetitive DNA sequence, (TTAGGG)n, present at the telomeres of human chromosomes.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988. Vol. 85. P. 6622-6626.

Muro Y., Masumoto H., Yoda K., Nozaki N, Ohashi M., Okazaki T. Centromere protein B assembles human centromeric a-satellite DNA at the 17-bp sequence, CENP-B box // J. Cell Biol. 1992. Vol. 116. P. 585-596.

Nakamura K, Dceda Y., Iwakami N., Hibino Y., Sugano N. Bending of a highly repetitive component in rat nuclear DNA//Biochem. Int. 1991. Vol. 52. P. 355-362.

Nickerson J.A, Blencowe B.J, Penman Sh. The architectural organization of nuclear metabolism //Int. Rev. Cytol. 1995. Vol. 162A P. 67-124.

Okada S., Tsutsui K., Tsutsui K., Seki S., Shohmori T. Subdomain structure of the matrix attachment region located within the mouse immunoglobulin-kappa gene intron // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. Vol. 222. P.472-477.

Orgel L.E., Crick F.H.C. Selfish DNA: the ultimate parasite // Nature 1980. Vol. 288. P. 604607.

Palmer D.K., O'Day K., Trong H.L., Charbonneau H., Margohs RL. Purification of the centromere-specific protein CENP-A and demonstration that it is a distinctive histone // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. P. 3734-3738.

Pardue M.L., Gall J.D. Chromosomal localization of mouse satellite DNA // Science. 1970. Vol. 168. P. 1356-1358.

Pluta AF., Cooke C.A., Earnshaw W.C. Structure of the human centromere at metaphase // Trends Biochem. Sci. 1990. Vol. 15. P. 181-185.

Prosser J., Frommer M., Paul C., Vincent P.C. Sequence relationships of three human satellite DNAs // J. Mol. Biol. 1986. Vol. 187. P. 145-155.

Radic M.Z., Lundgren K., Hamkalo B.A. Curvature of mouse satellite DNA and condensation of heterochromatin // Cell 1987. Vol. 50. P. 1101-1108.

Radic M.Z., Saghbini M, Elton T.S., Reeves R, Hamkalo B.A, Hoechst 33258, distamycin A, and high mobility group protein I (HMG-I) compete for binding to mouse satellite DNA // Chromosoma 1992. Vol. 101. P. 602-608.

Reeves R, Nissen M. S. The AT-DNA-binding domain of mammalian high mobility group I chromosomal proteins. A novel peptide motif for recognizing DNA structure // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 8573-8582.

Reeves R, Nissen MS. Cell cycle regulation and functions of HMG-I(Y) // Prog. Cell Cycle Res. 1995. Vol. 1. P. 339-349.

Renz A, Fackelmayer, F.O. Purification and molecular cloning of the scaffold attachment factor B (SAF-B), a novel human nuclear protein that specifically binds to S/MAR DNA // Nucleic Acids Res. 1996. Vol. 24. 843-849.

Romanova L.Y., Deriagin G.V., Mashkova T.D., Tumeneva I.G., Mushegian AR, Kisselev L.L., Alexandrov I.A. Evidence for selection in evolution of alpha satellite DNA: the central role of CENP-B/pJ alpha binding region // J. Mol. Biol. 1996. Vol. 261. P. 334-40.

Romig H., Fackelmayer F.O., Renz A, Ramsperger U., Richter A. Characterization of SAF-A, a novel nuclear DNA binding protein from HeLa cells with high affinity for nuclear matrix/scaffold attachment DNA elements//EMBO J. 1992. Vol. 11. P. 3431-3440.

Saitoh H., Harata M., Mzuno S. Presence of female-specific bent-repetitive DNA sequences in the genomes of turkey and pheasant and their interaction with W-protein of chicken // Chromosoma. 1989. Vol. 98. P. 250-258.

Saitoh H., Tomkiel J., Cooke C.A., Ratrie H., Maurer M., Rothfield N.F., Earnshaw W.C. CENP-C, an autoantigen in scleroderma, is a component of the human inner kinetochore plate// 1992. Cell. 70. 115-125.

Saitoh Y., Laemmli U.K. Metaphase chromosomes structure: bands arise from differential folding path of the highly AT-rich scaffold // Cell 1994. Vol. 76 P. 609-622.

Sambrook J., Maniatis T., Fritsch E.F. Molecular cloning: A Laboratory Manuel. 2nd Ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Schnedl W., Breitenbach M, Stranzinger G. Mthramycin and DM: a pair of fluorochromes specific for GC-and AT-rich DNA respectively. // Hum. Genet. 1977 Vol. 36 P. 299-305.

Shelby R.D., Vafa O., Sullivan K.F. Assembly of CENP-A into centromeric chromatin requires cooperative array of nucleosomal DNA contact sites // J. Cell Biol. 1997. Vol. 136. P. 501-513.

Small K., Nelkin B., Vogelstein B. Nonrandom distribution of repeated DNA sequences with respect to supercoiled loops and the nuclear matrix.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. Vol. 79. P. 5911-5915.

Smith G.P. Evolution of repeated DNA sequences by unequal crossing-over // Science. 1976. Vol. 191. P. 528-535.

Smith S., de Lange T. TRF1, a mammalian telomeric protein // Trends Genet. 1997. Vol. 13. P. 21-25.

Solomon M.J., Strauss F., Varshavsky A. A mammalian high mobility group protein recognizes any stretch of six A-T base pares in duplex DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. Vol. 83. 1276-1280.

Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis//! Mol. Biol. 1975. Vol. 98. P. 503-517.

Strausbaugh L.D., Williams S.M. High-density of an SAR-associated motic differentiates heterochromatin from euchromatin // ! Theoretical Biol. 1996. Vol. 183. P. 159-167.

Strauss F., Varshavsky A. A protein binds to a satellite DNA repeat at three specific sites that would be brought into mutual proximity by DNA folding in the nucleosome // Cell 1984. Vol. 37. P. 889-901.

Strick R., Laemmli U.K. SARs are cis DNA elements of chromosome dinamics: synthesis of a SAR repressor protein//Cell. 1995. Vol. 83. P. 1137-1148.

Strissel P.L., Espinosa R IH, Rowley J.D., Swift H. Scaffold attachment regions in centromere-associated DNA//Chromosoma. 1996. Vol. 105. P. 122-133.

Sugimoto K., Shibata A, Himeno M. Nucleotide specifcity at the boundary and size requirement of the target sites recognized by human centromere protein B (CENP-B) in vitro // Chromosome Res. 1998. Vol. 6. P. 133-140.

Taylor S.S., Larin Z., Tyler-Smith C. Analysis of extrachromosomal structures containing human centromeric alphoid satellite DNA sequences in mouse cells // Chromosoma. 1996. Vol. 105. P. 70-81.

" Theunissen O., Rudt F., Guddat U., Mentzel H., Pieler T. RNA and DNA binding zinc fingers in Xenopus TFIHA// Cell. 1992. Vol. 71. P. 679-690.

Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979. Vol. 76. P. 4350-4354.

Trifonov E. N, Sussman J. L. The pitch of chromatin DNA is reflected in its nucleotide sequence //Proc. Natl. Acad Sci. USA 1980. Vol. 77. P. 3816-3820.

Tsutsui K., Tsutsui K., Okada S., Watarai S., Seki S., Yasuda T., Shohmori T. Identification and characterization of a nuclear scaffold protein that binds the matrix attachment region DNA//J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 12886-12894.

Tyler-Smith C., Corish P., Bums E. Neocentromeres, the Y chromosome and centromere evolution//Chromosome Res. 1998. Vol. 6. P. 65-71.

Ulanovsky L.E., Trifonov E.N. Estimation of wedge components in curved DNA // Nature 1987. Vol. 326. P. 720-722.

Vissel B., Choo K.H. Mouse major (gamma) satellite DNA is highly conserved and organized into extremely long tandem arrays: Implications for recombination between nonhomologous chromosomes//Genomics. 1989. Vol. 5. P. 407-414.

von Kries J.P., Phi-Van L., Diekmann S., Strathng W.H. A non-curved chicken lysozyme 5' matriix attachment site is 3' followed by strongly curved DNA sequence // Nucleic Acids Res. 1990. Vol. 18. 3881-3885.

von Kries J.P., Buhrmester H., Stratling W.H. A matrix scaffold attachment region binding protein: identification, purification and mode of binding // Cell. 1991. Vol. 64. P. 123135.

von Kries J.P., Buck F., Stratling W. H. Chicken MAR binding protein pi20 is identical to human heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) U // Nucleic Acids Res. 1994. Vol. 22 P. 1215-1220.

Voullaire L.E., Slater H.R, Petrovic V., Choo K.H. A functional marker centromere with no detectable alpha-satellite, satellite EI, or CENP-B protein: activation of a latent centromere? //Amer. J. Hum. Genet. 1993. Vol. 52. P. 1153-1163.

Warburton D., Tyler-Smith C., Sullivan K.F., Poirier G.G., Earnshaw W.C. hnmunolocalization of CENP-A suggests a distinct nucleosome structure at the inner kinetochore plate of active centromeres//Curr. Biol. 1997. Vol. 7. P. 901-904.

Warburton P., Cooke H.J. Hamster chromosomes containing amplified human a-satellite DNA show delayed sister chromatid separation in the absence of de novo kinetochore formation//Chromosoma. 1997. Vol. 106. P. 149-159.

Waye J.S., England S.B., Willard H.F. Genomic organization of alpha satellite DNA of human chromosome 7: evidence for two distinct alphoid domains on a single chromosome // Mol. Cell. Biol. 1987. Vol. 7. P. 349-356.

Waring M, Britten RJ. Nucleotide sequence repetition: a rapidly reassociating fraction of mouse DNA //Science. 1966. Vol. 154. P. 791-794.

Weitzel J.M., Buhrmester H., Stratling W.H. Chicken MAR-binding protein ARBP is homologous to rat methyl-CpG-binding protein MeCP2//Mol. Cell. Biol. 1997. Vol. 17. P. 5656-5666.

Wevrick R, Willard H.F. Physical map of the centromeric region of human chromosome 7: relationship between two distinct alpha satellite arrays // Nucleic Acids Res. 1991. Vol. 19. P. 2295-2301.

Willard H.F. Centromeres: the missing link in the development of human artificial chromosomes // Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. Vol. 8. P. 219-225.

Willard H.F., Waye J.S. Hierarchical order in chromosome-specific human alpha satellite DNA //TrendsGenet. 1987. Vol. 3. P. 192-198.

Wong A.K.C., Rattner J.B. Sequence organization and cytological localization of the minor satellite of mouse //Nucleic Acids Res. 1988. Vol. 16. P. 11645-11661.

Wu H, Crothers D.M. The locus of sequence-directed and proteininduced DNA bending // Nature. 1984. Vol. 308. P. 509-513.

Yang C.H., Tomkiel J., Saitoh H., Jonson D.H., Earnshaw W.C. Identification of overlapping DNA-binding and centromere-targeting domains in the human kinetochore protein CENP-C // Mol. Cell. Biol. 1996. Vol. 16. P. 3576-3586.

Yasmineh W.G., Yunis J.J. Localization of mouse satellite DNA in constitutive heterochromatin //Exp. Cell Res. 1970. Vol. 59. P. 69-75.

Yunis J.J., Yasmineh W.G. Heterochromatin, satelhte DNA and cell function // Science 1971. Vol. 174. P. 1200-1209.

Yunis J.J., Yasmineh W.G. Satelhte DNA in constitutive heterochromatin of the Guinea Pig // Science 1970. Vol. 168. P. 263-265.

Zhao K., Harel A, Stuurman N, Guedalia D., Gruenbaum Y. Binding of matrix attachment regions to nuclear lamin is mediated by the rod domain and depends on the lamin polymerization state//FEBS Lett. 1996. Vol. 380. P. 161-164.

Zhao K., Kas E., Gonzales E., Laemmli U.K. SAR-dependent mobilization of hustone HI by HMG-I/Y in vitro: HMG-I/Y is enriched in Hl-depleted chromatin // EMBO J. 1993. Vol. 12. P. 3237-3247.