Поиск белков, взаимодействующих с новым транскрипционным фактором Е(у)2 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Куршакова, Мария Михайловна

• Куршакова, Мария Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Куршакова, Мария Михайловна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Gcn5-содержащие комплексы многоклеточных.

Транскрипция и ацетилирование

Структурная организация GCN5 и PCAF белков и их функции.

Два различных GCN5-COдержащих комплекса многоклеточных и их состав.

GCN5-содержащие STAGA/TFTC-подобные комплексы массой 2 МДа.

GCN'5-содержащие АТАС комплексы массой 700 кДа.

Трехмерная структура SAGA/TFTC-подобных комплексов.

Функции GCN5-содержащих комплексов.

II. Экспорт мРНК и транскрипция. 24 Рецептор и адаптеры экспорта мРНК. 24 TREX комплекс. 25 Sac3-Thpl-Susl-Cdc31 комплекс.

III. Транскрипция на периферии ядра. 28 Эпигенетическое состояние генома. 28 Транскрипционно неактивный хроматин и ядерная периферия.

Репрессия теломер у дрожжей.

Ядерная ламина и репрессия генов.

Транскрипционно активные гены на периферии ядра.

Факторы, влияющие на связывание транскрипционно активных генов с NPC.

Влияние мРНК на прикрепление генов к ядерным порам.

SAGA комплекс участвует в организации связывания генов с ядерной порой.

IV. Инсуляторы.

Организация эукариотических геномов.

Su(Hw) - зависимые инсуляторы.

Строение и белковый состав Зи(Нм>)-инсуляторов.

Энхансер-блокирующая активность Би(Н\к>)-ш1суляторов.

Барьерная активность Sи(Нч>)-инсуляторов.

Модели функционирования инсуляторов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

I. Объект и задачи исследования.

II. Материалы и методы.

1. Материалы. 50 Штаммы и вектора S. cerevisiae и Е. Coli. 50 Клеточные линии. 50 Библиотека кДНК. 50 Эмбриональный ядерный экстракт. 51 Дрожжевые и бактериальные среды. 51 Ферменты и реактивы. 51 Антитела. 51 Праймеры. 52 Конструкции для двухгибридного скрининга. 54 Конструкции для экспрессии рекомбинантных белков. 55 Конструкции для трансформации S2 клеток.

2. Работа с дрожжами.

3. Работа с клетками.

Трансформация S2 клеток.

РНК интерференция.

4. Работа с ДНК. 56 Приготовление компетентных клеток. 56 Трансформация бактерий. 57 Щелочное выделение плазмидной ДНК. 57 Обработка ДНКрестриктазами. 5 7 Лигирование. 57 Выделение геномной ДНК из мух. . 58 Гель-электрофорез ДНК. 58 PCR. 58 Секвенирование ДНК.

5. Работа с РНК. 59 Получение двухцепочечной РНК. 59 Выделение РНК. 59 RT-PCR. 59 Нозерп-блот анализ.

6. Работа с белками. 61 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков. 61 Связывание белков на глютатион-сефарозе. 61 Получение антител и их очистка. 62 Белковый гель-электрофорез. 62 Вестерн-блот анализ 63 Соосаждение белков антителами. 63 Дот-блот анализ.

7. Иммуноокрашивание.

Иммуноокрашивание политенных хромосом.

Иммуноокрашивание S2 клеток.

8. Гибридизация in situ. 66 РНК in situ гибридизация с СуЗ-oligo-dT праймером. 66 ДНК in situ гибридизация с зондом к индивидуальному гену.

9. Электронная микроскопия.

10. Анализ изображений.

11. Хроматиниммунопреципитация.

12. Использованное программное обеспечение.

III. Результаты. 70 Поиск белков, взаимодействующих с Е(у)2, в дрожжевой двухгибридной системе. 70 Изучение взаимодействия Е(у)2 с компонентами SAGA/TFTC комплекса дрозофилы. 70 Изучение внутриклеточной локализации Е(у)2 и компонентов SAGA/TFTC комплекса дрозофилы. 71 Исследование внутриядерной локализации Е(у)2 при помощи электронной микроскопии.

Изучение взаимодействия Е(у)2 с белком Xmas-2 (X-linked male sterile-2).

Исследование влияния Е(у)2 и Xmas-2 на экспорт мРНК из ядра в цитоплазму.

Изучение влияния Е(у)2 и Xmas-2 на экспорт транскриптов hsp70 генов.

Изучение влияния Е(у)2 и Xmas-2 на расположение hsp70 локусов внутри ядра.

Изучение влияния Е(у)2 и Xmas-2 на регуляцию транскрипции hsp70 генов.

Анализ взаимодействия Е(у)2 с белком Su(Hw).

Изучение взаимодействия Е(у)2 и Su(Hw) in vivo.

Анализ взаимодействия Е(у)2 с Su(Hw) инсуляторами.

Изучение влияния Е(у)2 на функции 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов.

IV. Обсуждение результатов.

Основные результаты.

Е(у)2 - новый компонент SAGA/TFTC комплекса дрозофилы.

Е(у)2 входит с состав нового комплекса, осуществляющего экспорт мРНК.

Е(у)2 в комплексе с Xmas-2 осуществляет прикрепление hsp70 локусов к NPC.

Е(у)2 координирует транскрипцию генов, прикрепление к NPC и экспорт мРНК.

Биологический смысл прикрепления hsp70 локусов к ядерной поре.

Е(у)2 - новый белковый компонент S и(Н\у)-зависимых инсуляторов.

Возможные механизмы барьерной активности 8и(Н\\г)-инсуляторов.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ. Ю

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поиск белков, взаимодействующих с новым транскрипционным фактором Е(у)2»

Одной из фундаментальных задач современной науки является изучение принципов организации и функционирования живых систем. Неотъемлемое свойство живых организмов< - способность хранить и передавать потомкам! наследственную информацию. Таким образом, изучение механизмов реализации наследственной информации имеет фундаментальное значение для понимания феномена жизни. Помимо t фундаментального значения, исследования в данной области имеют обширное практическое применение в медицине, фармакологии, биотехнологии, селекции. В настоящее время молекулярные механизмы реализации наследственной информации активно изучаются с помощью методов молекулярной биологии и генетики.

Носителями наследственной информации являются гены, а процесс ее реализации называется экспрессией генов. Экспрессия генов представляет собой сложный 1 многостадийный процесс. Он включает следующие этапы: транскрипцию и процессинг мРНК в ядре, экспорт мРНК из ядра в цитоплазму через ядерные поры, трансляцию в • > цитоплазме и, наконец, деградацию мРНК и белков. Хотя изначально эти процессы, рассматривались и изучались, как полностью независимые друг от друга, в последнее время становится понятным, что in vivo они тесным образом взаимосвязаны. Так транскрипция влияет на процессинг и экспорт мРНК, и наоборот: нарушения процессинга I способны иметь негативный эффект на транскрипцию. Молекулярные механизмы, обеспечивающие такую координацию различных стадий экспрессии генов друг с другом, еще очень слабо изучены.

Транскрипция является ключевым этапом экспрессии генов. Регуляция транскрипции обеспечивается при помощи чрезвычайно сложно устроенных клеточных систем, включающих цис-действующие элементы — разнообразные регуляторные элементы генома и транс-действующие элементы — многочисленные факторы транскрипции. Эукариотическая ДНК упакована в хроматин, который способен находиться в различных состояниях^, отличающихся прежде всего степенью компактизации и транскрипционной- активностью. Поддержание и изменение структуры хроматина является, важнейшими факторами, влияющими на экспрессию генов, так как определяют степень доступности регуляторных элементов действию транскрипционных факторов. Одним' из факторов, регулирующих организацию хроматина, является пространственное распределение хроматина в ядре: клетки, в частности, взаимодействие хроматинах белками, ассоциированными с ядерной оболочкой. Также в формировании раздельных функциональных доменов хроматина: принимают участие регуляторные элементы, называемые инсуляторами. Одно из свойств инсулятора состоит в способности препятствовать распространению гетерохроматина на близлежащие эухроматиновые области. В клетке имеется ряд комплексов, способных изменять структуру хроматина и, таким образом, регулировать транскрипцию, к ним относятся и комплексы^ осуществляющие различные химические модификации гистонов. Активная транскрипция ;> связана с ацетилированием гистонов, которое осуществляется г гистонацетилтрансферазными комплексами:

В настоящее время большое количество исследований посвящено изучению транскрипционных факторов и принципов их работы. Конечной целью является' понимание работы молекулярного аппарата транскрипции.

Ранее в нашей лаборатории был впервые описан новый коактиватор транскрипции эволюционно консервативный белок Е(у)2. Было предположено, что Е(у)2 вовлечен в регуляцию; транскрипции большого числа генов в ходе развития дрозофилы. Было показано, что; Е(у)2 коактивирует транскрипцию1 на хроматиновой матрице и входит: в составмногосубъединичного комплекса; содержащего белок TAF9.

Целью данной работы являлось изучение функций Е(у)2. Было показано, что Е(у)2: входит в состав SAGA/TFTC гистонацетилтрансферазного комплекса дрозофилы, являясь новым, ранее- не описанным компонентом этого комплекса. Кроме того, Е(у)2 взаимодействует с белком Xmas-2 и вместе с ним входит с состав нового ассоциированного с ядерной порой комплекса, который участвует в организации экспорта мРНК. На модели кластера SAGA/TFTC-зависимых генов теплового шока hsp70 мы показали, что Е(у)2 является белком, координирующим транскрипцию hsp70 генов, их прикрепление к NPC и экспорт мРНК. Таким образом, впервые в многоклеточном организме был описан белок, осуществляющий физическую связь между транскрипцией генетического локуса, его внутриядерным положением и экспортом его транскриптов. Также впервые было показано, что Е(у)2 связывается с белком Su(Hw) и является белковым компонентом 8и(Вл¥)-зависимых инсуляторов МДГ-4 и 1А2. Е(у)2 необходим для барьерной активности данных инсуляторов. Полученные результаты позволили предложить модель работы 8и(Нду)-зависимых инсуляторов как барьерных элементов. Таким образом, в данной работе сделан шаг в понимании функций инсуляторов и, следовательно, в развитие представлений о механизмах функциональной организации хроматина.

В целом, проведенное исследование вносит вклад в понимание функций Е(у)2 и, следовательно, в общую картину организации экспрессии генов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Ссп5-содержащие комплексы у многоклеточных.

Транскрипция и ацетилирование.

Транскрипция у эукариот - сложный многостадийный процесс, подверженный строгой регуляции. Для того, чтобы обеспечить точную инициацию транскрипции РНК-полимеразой П, необходим доступ к конкретному генетическому локусу ген-специфических активаторов, нескольких различных кофакторов и общих факторов транскрипции. То, каким образом активируется транскрипция генов, организованных в хроматин, представляется важным вопросом в изучении эукариотической транскрипции. Было показано, что.определенные посттрансляционные модификации гистонов нуклеосом коррелируют с тем или иным транскрипционным состоянием хроматина: активацией или репрессией (30,80). Одна из наиболее интенсивно изучаемых модификаций -ацетилирование аминокислот высококонсервативных N-концов гистонов. Постоянный уровень ацетилирования гистоновых белков поддерживается работой гистонацетилтрансфераз (HATs) и гистондеацетилаз (HDACs) (30,80,107). Различные HATs модифицируют е-аминогруппу лизина или аргинина, используя acetyl coenzyme А в качестве коэнзима. Ацетилирование влияет на формирование более высокоорганизованных хроматиновых структур и регулирует гистон-белковые взаимодействия (139,154,159). Таким образом, действие HATs увеличивает афинность транскрипционных факторов к нуклеосомной ДНК (147).

Первая гистон-специфическая ацетилтрансфераза, р55, была выделена из Tetrahymena. Было показано, что р55 является гомологом дрожжевого белка GCN5 (General Control Nonderepressive 5), транскрипционного адаптера, и, таким образом, р55 стал первым обнаруженным белком, связавшим ацетилирование гистонов и активацию транскрипции (12). С тех пор было найдено большое количество HATs. HATs можно

разделить на три семейства: GNAT семейство (GCNS-подобные N-ацетилтрансферазы), MYST семейство, рЗОО/СВР семейство, TAF1 и SRC ацетилтрансферазы (18,128). Кроме того, было показано, что нескольким ранее описанным коактиваторам/адапторам транскрипции присуща собственная HAT активность. Интересно, что ацетилтрансферазная активность была также обнаружена у больших мультисубъединичных комплексов. Выяснилось, что комплексы, обладающие HAT активностью, могут также функционировать как простые ацетилтрансферазы, катализируя ацетилирование не-гистонового субстрата, что приводит к изменениям в активности и стабильности субстрата (147,163).

Структурная организация GCN5 и PCAF белков и их функции.

Семейство GNAT ацетилтрансфераз включает более 10000 представителей среди различных организмов. GCN5 гомологи у многоклеточных отличаются от GCN5 белка дрожжей наличием длинного N-концевого участка (12,142,162,164). В то время как большинство геномов содержит одну копию gcn5 гена, позвоночные имеют второй ген, кодирующий PCAF (рЗОО/СВР associated factor), степень гомологии которого с GCN5 составляет приблизительно 73% (Рис.1) (164). У всех известных гомологов GCN5 многоклеточных могут быть выделены два участка: N-концевой, который является специфическим для многоклеточных и С-концевой, который высокогомологичен короткому дрожжевому белку. N-концевая часть содержит так называемый PCAF homology домен, а С-концевая часть состоит из двух консервативных доменов: ацетилтрансферазного домена (AT) и бромодомена (147).

Была определена структура AT домена белка GCN5 Tetrahymena, связанного со своими лигандами: коэнзимом А (СоА) и гистоном НЗ (125). Эта структура вместе со структурой AT домена PCAF выявила (22), что центральная коровая область AT домена участвует в связывании СоА и является основой для каталитической реакции, a N- и Сконцевые участки AT домена содержат структуру, которая, по-видимому, ответственна за специфичность к гистоновому субстрату (97). GCN5 и PCAF обладают широкой субстратной специфичностью, но основными мишенями для ацетилирования являются гистоны и нуклеосомы. Нуклеосома представляет собой структурную единицу хроматина. Основная часть нуклеосомы образована гистоновым! октамером, содержащем по две копии гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4, и участком ДНК в 147 пар оснований, закрученным вокруг октамера. В экспериментах со свободным гистонами рекомбинантные GCN5 и> PCAF преимущественно ацетилировали К14 гистона НЗ, и в меньшей степени, К8 и К16 гистонаН4 (58,85,131).

Бромодомен состоит из приблизительно 110 аминокислот и играет роль во многих клеточных процессах, как связанных с хроматином, так и нет. Бромодомены имеются у многих известных ядерных HATs, которые осуществляют ассоциированное с транскрипцией ацетилирование гистонов по определенным остаткам лизина, но отсутствуют у цитоплазматических HATs. Принято считать, что бромодомены распознают ацетилированные хвосты гистонов и таким образом участвуют в ремоделировании хроматина. Структурные исследования бромодоменов yGCN5 и hPCAF в, комплексе с пептидами гистоновых хвостов показали, что бромодомен GCN5 связывается с гистоном Н4, ацетилированным по 16 остатку лизина (71,109), а бромодомен PCAF распознает гистон Н4, ацетилированный по К8 и гистон НЗ, ацетилированный по К14 (26). Интересно то, что механизм распознавания ацетилированных лизинов бромодоменом схож с механизмом распознавания ацетил-СоА AT доменом. Было показано, что эти HATs связываются посредством бромодоменов с теми же ацетилированными аминокислотными остатками гистонов, которые они сами же ацетилируют. Отсюда возникает вопрос: каким образом происходит ацетилирование? Один из возможных ответов следующий: на хроматиновой матрице GCN5- или PCAF-содержащий комплекс сначала ацетилирует нужный сайт, не связываясь с ним, а затем i другой комплекс распознает и связывает эту модификацию и далее ацетилирует второй сайт. Этот второй сайт может находиться на N-конце другого гистона. В этом отношении интересно'Отметить, что в дрожжевом SPT-ADA-GCN5 ацетилтрансферазном комплексе (SAGA) имеется два белка, содержащие бромодомен (GCN5 и SPT7), из которых только бромодомен GCN5 необходим для связывания комплекса с ацетилированным хроматином in vitro (26,65,66). При этом в соответствующем комплексе у человека только GCN5 имеет бромодомен, a hSPT7L не содержит такого участка (25,144). Анализ GCN5 мутантов in vivo показал, что в то время как PCAF homology домен и HAT домен необходимы для функционирования белка dGCN5, бромодомен, по-видимому, для этого не требуется (17). Эти данные указывают на то, что бромодомен dGCN5 может быть не единственным доменом, необходимым для посадки ССК5-содержащих комплексов на ацетилированные гистоны.

Было показано, что PCAF обладает ЕЗ убиквитин-лигазной активностью и участвует в регуляции уровня белка р53 в клетке (92). ЕЗ убиквитин-лигазная активность локализуется в PCAF homology домене белка. Следовательно, PCAF является не только ацетилтрансферазой, но и фактором убиквитинилирования с присущей ему ЕЗ лигазной активностью, что говорит о функциональной взаимосвязи между процессами ацетилирования и убиквитинилирования в клетке (16). Неизвестно, обладает ли GCN5 ЕЗ лигазной активностью, имея относительно консервативный PCAF homology домен, специфичность ЕЗ лигазной активности PCAF и GCN5 также еще предстоит определить.

Два различных GCNS-содержащих комплекса многоклеточных и их состав. GCNS-codepoicainue STAGA/TFTC-подобные комплексы массой 2 МДа.

GCN5 и PCAF, как и большинство ядерных HATs, существуют в клетке в составе больших многосубъединичных комплексов. У многоклеточных первые GCN5-содержащие комплексы были выделены из клеток человека. Изучение этих комплексов показало, что они похожи по составу на SAGA комплекс дрожжей массой 2 МДа (Таб. 1). Эти комплексы были очищены с использованием двух разных подходов: методом двойного соосаждения антителами против эндогенных белков (TFTC комплекс; (8,99,158)) и методом соосаждения антителами к тагу, с которым оверэкспрессировали один из предполагаемых компонентов комплекса: PCAF, GCN5 комплексы (108) и STAGA комплекс (99). Все найденные комплексы содержат либо GCN5, либо PCAF в качестве каталитических HAT субъединиц (Таб.1). Кроме того, в их состав входит ряд ТВР-связанных факторов (TAFs) и несколько человеческих гомологов дрожжевых белков, ранее описанных как необходимых для правильного выбора сайта инициации транскрипции полимеразой П (группа Spt белков) или для активированной транскрипции (группа Ada белков). Эти комплексы содержат также белок TRRAP массой 400 кДа (PAF40), который исходно был изолирован как транскрипционный коактиватор. Его гомолог у дрожжей входит в состав дрожжевого SAGA комплекса (105). Недавние исследования SAGA комплекса дрожжей обнаружили три новых SAGA-ассоциированных фактора (Sgf73, Sgf29; Sgfll), а также Ubp8, убиквитин-специфическую протеазу, что свидетельствует о том, что комплекс помимо HAT активности обладает еще одной ферментативной активностью (118,129). Кроме того, в составе SAGA был найден белок Susl. У позвоночных есть гомологи этих новых дрожжевых SAGA-ассоциированных факторов и дальнейшие исследования должны проверить, входят ли они в состав STAGA или TFTC комплексов. Хотя исходно описанные TFTC, PCAF/GCN5 и STAGA комплексы имели набор общих субъединиц, они рассматривались как неидентичные комплексы. Считалось, что вариации в их составе могут быть объяснены разными протоколами очистки или существованием различий в их функциях. Однако, накопленные с тех пор данные указывают на то, что выделяемые из клеток человека TFTC и STAGA комплексы очень похожи (Таб.1). Действительно, хотя исходно набор TAFs (TAF2, TAF4, TAF5, TAF6) был обнаружен в составе эндогенного TFTC (158), эти дополнительные TAFs могут ( быть удалены из TFTC, который после этого становится идентичен STAGA (25). Чтобы сравнить PCAF комплекс со STAGA/TFTC комплексами потребуется дальнейшее ! изучение его белкового состава.

У Drosophila только один ген кодирует GCN5 ацетилтрансферазу. В нескольких лабораториях из экстрактов клеток дрозофилы были очищены и частично охарактеризованы SAGA/TFTC комплексы массой 2 МДа (43,44,63,88,103). На сегодняшний день белковый состав этого ОСК5-содержащего HAT комплекса известен лишь частично (Таб.1). Однако комплекс очень похож на дрожжевой SAGA комплекс и STAGA/TFTC комплексы человека. Сравнительный анализ этих GCNS-содсржащих комплексов массой 2 МДа, выделенных из дрожжей, клеток дрозофилы и человека, показывает, что их состав весьма консервативен. Высокий уровень гомологии соответствующих субъединиц и консервативная структура комплексов массой 2 МДа позволяют предполагать, что они выполняют сходные функции у различных видов.

Дрожжевой SAGA комплекс, SAGA/TFTC дрозофилы, TFTC, PCAF/GCN5 и STAGA HAT комплексы человека преимущественно ацетилируют гистон НЗ как в свободном состоянии, так и в составе нуклеосомы (8,59,62,88,100,108). В то время как GCN5 и PCAF сами по себе ацетилируют в основном К14 гистона НЗ, в составе , комплексов массой 2 МДа специфичность GCN5 меняется: фермент ацетилирует К9, К14,

К18, К23 гистона НЗ, в меньшей степени - Н2В и незначительно Н4 (8,62,108). Таким образом, дополнительные субъединицы GCN5-содержащих HAT комплексов необходимы f для регуляции специфичности ацетилтрансфераз по отношению к хроматину и, возможно, другим субстратам.

GCNS-содержащие АТАС комплексы массой 700 кДа.

У дрожжей помимо SAGA комплекса массой 2 МДа существует другой GCN5-содержащий комплекс массой 700-800 кДа, названный ADA комплексом. Кроме yGCN5 ADA содержит yADA2, yADA3, yAhcl, а также ряд не идентифицированных полипептидов с молекулярной массой в 65, 90, 110, 180 и 250 кДа (31,57). Паттерны ацетилирования лизинов гистона НЗ дрожжевыми ADA и SAGA HAT комплексами перекрываются, но отличны друг от друга. ADA комплекс ацетилирует 14 и 18 остатки лизина гистона НЗ, a SAGA комплекс ацетилирует в той или иной степени,все четыре лизина гистона НЗ (58).

Фракционирование ядерных экстрактов из клеток Drosophila и человека показало, что существует две различных фракции GCN5-содержащих комплексов: одна с массой приблизительно 2 МДа, а другая - 700 кДа. Очистка 700 кДа комплекса была, облегчена, тем обстоятельством, что у Drosophila имеется два ADA2 гена, кодирующие ADA2a и ADA2b белки. ADA2a очищается вместе с GCN5 в составе комплекса массой 700 кДа, а ADA2b - в составе 2 МДа SAGA-подобного комплекса (88,103). Методом аффинной очистки комплекс массой 700 кДа был выделен и назван АТАС. Протеомный анализ показал, что в состав dATAC входят, кроме GCN5, ADA2a и ADA3, два других белка: АТАС1 и dHCF (host cell factor). Эти последние являются компонентами dATAC комплекса, но отсутствуют в dSAGA/TFTC. Молекулярная масса dATAC (700 кДа) намного больше, чем суммарная масса известных субъединиц (450 кДа), поэтому стоит ожидать открытия новых компонент этого комплекса (62). Имеется большое количество данных, говорящих о том, что у позвоночных, в частности, у человека, также существует ССН5-содержащий АТАС комплекс, хотя сам этот комплекс пока не выделен .

В экспериментах по изучению HAT активности на свободных гистонах dATAC комплекс в равной степени ацетилировал гистоны НЗ и Н4. Однако в опытах на нуклеосомном субстрате dATAC комплекс преимущественно ацетилировал гистон Н4 и в меньшей степени гистон НЗ (62). Исходя из имеющихся данных, можно предположить, что in vivo dSAGA/TFTC-подобные комплексы преимущественно ацетилиругот гистон НЗ, в то время как dATAC комплекс проявляет специфичность к гистону Н4. Таким образом, различия в субъединичном составе двух разных типов комплексов приводят к различиям в субстратной специфичности GCN5 ацетилтрансферазы.

Трехмерная структура SAGA/TFTC-подобных комплексов.

С целью лучше понять функции GCN5-содержащих 2 МДа комплексов структура и расположение субъединиц ySAGA и hTFTC комплексов были исследованы методами электронной микроскопии (8,160). Была реконструирована трехмерная модель с разрешением в 30 А, которая продемонстрировала, что ySAGA и hTFTC состоят из пяти модулярных доменов размером 70-100 А в диаметре (Рис.2). Сравнение полученных структур позволило сделать вывод о высоком уровне консервативности строения и размеров комплексов дрожжей и человека. Это дало возможность предположить, что субъединицы SAGA/TFTC комплексов у многоклеточных занимают то же расположение внутри. комплекса, что и компоненты ySAGA. Различные домены ySAGA были исследованы путем картирования его субъединиц методами иммуноэлектронной микроскопии (Рис.2). Выяснилось, что домен I SAGA комплекса содержит Tral и является областью, взаимодействующей с активаторами. Домены П, Ш и IV несут несколько TAFs, содержащих гистон-фолд мотив, и TAF5, которые могут выполнять структурообразующую функцию в этом комплексе. В домене Ш были найдены две субъединицы, имеющие бромодомен: Gcn5 и Spt7. Биохимические и генетические данные по взаимодействию субъединиц говорят о том, что Gcn5 и Spt7 колокализуются с Ada2 и Ada3, и, таким образом, домен Ш является не только структурообразующим доменом, но обладает HAT активностью. Домен V, имеющий подвижную структуру, содержит Spt3, Spt20, возможно, Spt8 и определяет модуль, взаимодействующий с ТВР (137,160).

Что касается АТАС-подобных комплексов, их точный полипептидный состав и структура пока не известны.

Функции GCNS-содержащих комплексов.

HAT комплексы, как правило, воспринимаются как коактиваторные комплексы, рекрутируемые на определенные хроматиновые локусы для выполнения ген-специфических регуляторных функций. Менее изученным феноменом является то, что многие из этих комплексов выполняют функции модификации хроматина на глобальном уровне (86). У дрожжей локальные направленные модификации хроматина имеют место на фоне постоянно поддерживаемого баланса между глобальным ацетилированием GCN5 ацетилтрансферазой и деацетилированием Rpd3 деацетилазой. Работа последней на только снижает уровень базальной транскрипции, но и приводит к быстрому возвращению хроматина в исходное состояние ацетилирования после исчезновения направленного действия HAT комплексов. Недавно было показано, что ySAGA при помощи GCN5 осуществляет ассоциированное с транскрипцией ацетилирование нуклеосом, расположенных в открытых рамках считыванияг (56). Возможно, что модификация хроматина на глобальном уровне GCN5-coдержащими комплексами является свойством глобального ацетилирования открытых рамок, считывания.

Похожие выводы могут быть сделаны и у многоклеточных. У D.melanogaster генетический и биохимический анализ показал, что ССЫ5-содержащие комплексы массой 700 кДа и 2 МДа выполняют несколько разных функций в клетках. Предположительно, 700 кДа комплекс осуществляет модификацию гистонов НЗ и Н4 на всем протяжении хромосом, а 2 МДа комплекс - направленное ацетилирование гистонов в конкретном генетическом локусе. У D.melanogaster снижение уровня глобального ацетилирования-вносит вклад в структурные изменения, наблюдаемые у различных мутантных хромосом (21).

Механизмы посадки 2 МДа ССЫ5-содержащих комплексов на промотор у многоклеточных и дрожжей аналогичны. Большое количество разнообразных транскрипционных активаторов и белков, регулирующих клеточный цикл, контактирует с

ОСЫ5/РСАР-содержащими комплексами и рекрутирует их на те или иные специфические промоторы. В соответствии с наиболее принятой моделью (18) активаторы непосредственно контактируют с TRRAP субъединицей этих комплексов, однако, возможно, что различные активаторы могут взаимодействовать с разными субъединицами. Ранее имевшиеся в области промотора модификации гистонов, созданные другими хроматин-ремоделирующими комплексами, могут влиять на посадку SAGA/TFTC/PCAF комплексов. Связавшись с хроматином, 2 МДа GCN5-содержащие комплексы преимущественно ацетилируют гистон НЗ вблизи промоторов, что в свою очередь стабилизирует их связывание с промоторными областями.

GCN5 l 100 he Г

330

PCAF-HD

550 625 725 831

804

И*.

МЧ

828

813

И% izzzzBBitt^z^z^^^B^

73?»

PCAF 1 75 121 242 320

I и ■■ т

550 625 ?25 832 jromol

99

753

92%

82%

796

Рис. 1. Структура белков GCN5 u PCAF у позвоночных, D.Melanogaster и дрожжей.

Схематическое представление доменной организации белков GCN5 и PCAF у человека (hs; Homo sapiens), курицы (gg; Gallus gallus), zebrafish (Danio rerio), pufferfish (tn; Tetraodon nigroviridis), дрозофилы (dm; Drosophila melanogaster) и дрожжей (sc; Saccharomyces cerevisiae). Домен гомологии PCAF (PCAF-HD) выделен серым цветом, ацетилтрансферазный домен (AT) выделен черным, бромодомен (Вгошо) затенен. Также показан недавно открытый (92) домен убиквитин ЕЗ лигазы (ЕЗ) PCAF. Числа сверху обозначают позиции аминокислотных остатков. Справа указан уровень гомологии в процентах.

2 МЕИ compkin 700 VDi contptrin

Сомркх JfSACA dSACiATFTC МГТС hSTAUA ЬКЛР ADA ЛТАС AT AC

11АТ luburni i errrvmae yGcоЗ D mtliBiogaxter dOt"NJ И. лартепл hOCNJ И тaptnrnj hOOJJ H tapintm hPCAf fffnxaitf JtiCNJ Г) mrtanogajter iltiCN* H. lapmm bUCSS yAd.1 dADAl hADAI hSTAF42 t • . уА0ш2 dADAIb b\DA2b HADA2b t

- - . - hADAO. jAdiJ dADA2a bADAla vAdaJ dADA3? hADAJ STAFJ4 hAD.U yAfU3 dADA3 n vAd»J5lti20 ? 7 т .?. yspu dsro bSPTS hSPT3 tiSPTJ * до * hSPTTL STAFftJr 7 - ysp<s T 1 t 7 - hTAF2 hTAFt yTAFS ЬТЛ>"5 • ■ dTAFSL/WDA htAHL bTAFSL hTAFSL УТА>«, hTAK • - hTAK6L hTAFftL hTAF6L уТАГЧ dTAFd bTA>9 hTAF9 hTAF9 hTAMfc yTAFtO dTAFlO hTAf 10 KTAFIO hTAHO

VTAF12 •> hTAFlI hTAFI2 hTAF 12

Гм1 dTf»] dTRRAP hTkRAP МШАР hPAFWO l^gfll T hSTAFW.' 7 j5gf29 5ТЛП6 7 ySgHS ? hATXN7 HATXNT ? yUbpK 7 7 faSTA>'60? 7 yS»t <аду)2 ? ? 7 bSTAFiJ

- ? hSAPlJO hSAPUO 7

- * - yAhcl ? dATAC 7 dHCT ?

Таблица 1. Сравнительный состав GCN5 и PCAF-содержащих комплексов у разных организмов.

По горизонтали представлены гомологи из разных организмов. «?» обозначены белки, кДНК которых найдена в данном организме, но присутствие в соответствующем комплексе еще не показано. «-» обозначает, что в данном комплексе соответствующий фактор отсутствует.

Рис. 2. Трехмерная модель 2 МДа GCNS-содержащих комплексов: дрожжевого SAGA комплекса и TFTC комплекса человека.

Методами электронной микроскопии были получены трехмерные структуры с низким разрешением двух 2 МДа вС^-содержащих комплексов: дрожжевого SAGA комплекса и TFTC комплекса человека (7,160). Обработка изображений привела с созданию трехмерной модели с разрешением в -30 А, которая показала, что оба комплекса имеют высококонсервативную структуру. Представлено наложение модели SAGA (голубой) и модели hTFTC (красный), пять модульных доменов выделены белыми овалами. Показано предполагаемое положение GCN5 (или PCAF).

Транскрипция и экспорт мРНК из ядра.

Рецептор и адаптеры экспорта мРНК.

Экспрессия генов в эукариотических клетках нуждается в организованном транспорте молекул и макромолекул через ядерную мембрану. Ядерная мембрана всех эукариот пронизана большими многосубъединичными комплексами, называемыми комплексами ядерной поры NPC (nuclear pore complex). NPC образуют каналы, которые служат для /гранспорта всех молекул между ядром и цитоплазмой. NPC комплекс обладает восьмикратной симметрией и состоит из многочисленных копий около 30 различных белков, называемых нуклеопоринами, и ассоциированных белков. У позвоночных только два нуклеопорина Рот121 и gpl20 являются интегральными мембранными белками и предположительно закрепляют NPC в ядерной мембране, все остальные нуклеопорины синтезируются как растворимые белки и большая часть из них располагается симметрично на обеих сторонах NPC. Те нуклеопорины, которые преимущественно или исключительно находятся на одной из сторон NPC, составляют ядерные или цитоплазматические филаменты (119). мРНК находится в ядре и экспортируется из него в виде так называемых рибонуклепротеиновых частиц (mRNPs), сборка которых происходит параллельно с образованием новосинтезированной мРНК в ходе транскрипции и процессинга. В ходе последовательных этапов формирования mRNPs на транскрипты рекрутируются многочисленные РНК-связывающие и РНК-модифицирующие белки: факторы кэпирования, сплайсинга и процессинга, белки, организующие экспорт мРНК. Исследования, проведенные на ряде модельных организмов, показали, что основные составляющие экспорта мРНК консервативны. Основным экспортным рецептором является гетеродимерный комплекс Mex67-Mtr2 у дрожжей и гомологичный комплекс у многоклеточных ТАР 15-р 15 (иначе называемый NXF1-NXT1) (61,136). Хотя этот рецептор способен связываться непосредственно с мРНК, он привлекается на транскрипты адаптерными РНК-связывающими белками. Некоторые из адаптеров уже известны, но предполагают, что среди большого количества предсказанных РНК-связывающих белков будут найдены и другие. Адаптерный белок Yral или Aly/REF (Aly/REF у многоклеточных) рекрутируется на синтезирующиеся транскрипты и способен связываться с рецептором Mex67-Mtr2. Кроме этого, Yral и Aly/REF физически взаимодействуют с другим рекрутирующимся на мРНК консервативным экспортным фактором - Sub2p (у дрожжей) и UAP56 (у многоклеточных) (122,166). Sub2p и UAP56 представляют собой РНК-хеликазы, которые могут связываться с различными комплексами, участвующими в созревании мРНК. Связывание Mex67-Mtr2 с Yral приводит к высвобождению Sub2p. Mex67-Mtr2 взаимодействует с нуклеопоринами NPC, осуществляя перенос mRNP через канал ядерной поры (155).

TREX комплекс.

Исследования, проведенные на дрожжах и высших эукариотах, включая D.melanogaster и человека, выявили, что взаимодействующие друг с другом белки Yral и Sub2p входят в состав эволюционно консервативного многосубъединичного комплекса TREX (101,123,148). Четыре субъединицы TREX комплекса S.cerevisiae (Tho2, Hprl, Mftl и Thp2) образуют субкомплекс ТНО, который вовлечен в различные стадии котранскрипционного формирования mRNP и транскрипционно зависимой рекомбинации (77). У дрожжей TREX рекрутируется на-активно транскрибирующиеся гены в ходе элонгации транскрипции, что способствует сворачиванию новосинтезированных транскриптов в mRNP комплексы и помогает рекрутировать другие РНК-связывающие белки (2,72,74,148,166). При этом компоненты ТНО комплекса связываются с хроматином, в то время как Yral и Sub2p ассоциируются с мРНК (2). Эксперименты по РНК-интерференции в организме D.melanogaster в сочетании с анализом профилей экспрессии генов показали, что большая часть мРНК синтезируется и экспортируется без участия TREX (123). Тем не менее, мутации субъединиц TREX приводили к значительному накоплению мРНК в ядре и были детальны в комбинациях с мутациями экспортных факторов, что указывает на широкое участие TREX в сцепленном с транскрипцией экспорте мРНК. В отсутствии, функционального ТНО субкомплекса наблюдалось формирование РНК-ДНК гибридов между несвернутым транскриптом и ДНК матрицей, что приводило к ингибированию транскрипции и образованию неправильно свернутых мРНК, которые не могли* быть экспортированы (72). Однако когда в эксперименте снижали скорость синтеза транскриптов, эти дефекты частично компенсировались, что позволило предположить существование временных ограничений для котранскрипционной посадки РНК-связывающих белков и транскрипционных факторов на мРНК (76).

Sac3-Thpl-Susl-Cdc31 комплекс.

Были найдены и другие факторы экспорта мРНК (81). У дрожжей в результате генетического скрининга белков, взаимодействующих с Yral, был обнаружен белок Sac3, который связывается с экспортным рецептором Мех67 и нуклеопоринами Nup60 и Nupl. Делеция Sac3 вызывает накопление мРНК в ядре. Таким образом было показано, что Sac3 является экспортным фактором (34). Кроме того, выяснилось, что Sac3 ассоциирован с цитоплазматической частью NPC, а мутация Sac3 приводит к скоплению Мех67 вблизи ядерной-оболочки. Предполагают, что Sac3 участвует в высвобождении Мех67 из mRNP на конечном этапе экспорта t мРНК (91). Дальнейшие исследования показали, что Sac3 образует комплекс вместе с белками Thpl, Susl и Cdc31 in vivo (33,34,36,124). Белок Thpl ранее был найден как белок, участвующий в элонгации транскрипции и поддержании стабильности генома (35). Делеция Thpl приводила к нарушению экспорта мРНК. Sac3 рекрутирует Thpl на периферию ядра, взаимодействуя с FG-нуклеопоринами NPC с внутренней стороны ядра (34). Белок Susl был обнаружен в результате генетического скрининга белков, взаимодействующих с Yral. Помимо Sac3p-Thpl комплекса Susl входит в состав SAGA комплекса, необходимого для инициации транскрипции ряда дрожжевых генов. Susl локализуется как внутри ядра, так и на периферии, где совпадает с ядерными порами. При этом его периферическое расположение зависит от Sac3. В согласии с данными о взаимодействии с SAGA комплексом, Susl присутствует на промоторах SAGA-зависимых генов после активации транскрипции. Делеция Susl вызывает нарушения как транскрипции, так и экспорта мРНК, что свидетельствует об участии белка в обоих процессах. Более того, фракция Thpl очищается вместе с компонентами SAGA, что свидетельствует о том, что Susl физически осуществляет взаимодействие между SAGA и Sac3-Thpl комплексами (124). Белок Cdc31 относится к центринам, калмодулин-подобным белкам, которые участвуют в дупликации центросом (33).

Транскрипция на периферии ядра.

Эпигенетическое состояние генома.

Регуляция транскрипции генов — решающий этап в определении клеточной идентичности. Такая регуляция не может быть достигнута только скоординированным поведением транскрипционных факторов, а является результатом сложной взаимосвязи между сиквенс-специфичными ДНК-связывающими факторами и эпигенетическим статусом последовательностей, с которыми эти факторы связываются. Вместе с посттранскрипционными стадиями, регулирующими эффективность процессинга мРНК, её экспорт и трансляцию, эти механизмы поддерживают воспроизводящийся, специфичный паттерн экспрессии генов (32).

Эукариотические геномы содержат три класса хроматина (60). Первый представляет собой открытый или активно транскрибируемый хроматин, несущий гены с ассоциированными с ними РНК-полимеразами П. Второй - это потенциально активный хроматин, который содержит промоторы, доступные для активаторов, но транскрипты с которых редки или отсутствуют. Эти два типа хроматина составляют большую часть хроматина у дрожжей, однако представляют лишь небольшую фракцию генома у млекопитающих. Третий тип хроматина объединяет ряд состояний транскрипционно неактивного или молчащего гетерохроматина и является наиболее распространенной формой организации ДНК в дифференцированных соматических клетках. Гены в основном находятся в наследуемом состоянии репрессии, промоторы генов не доступны для транскрипционных факторов. Хотя существование характерных хроматиновых доменов хорошо известно, факторы, которые их создают и регулируют, еще плохо изучены. Одним из факторов, влияющих на установление и поддержание состояния хроматина, является его пространственное распределение внутри интерфазного ядра (146).

Многочисленные исследования посвящены связи активации или репрессии транскрипции генов с их положением относительно ядерных компартментов: ядерной периферии, ядрышка или кластеров гетерохроматина. Периферия ядра исходно связывалась с репрессией, однако недавние работы показали, что активные гены также могут находиться и транскрибироваться на периферии ядра вблизи ядерных пор (20,150). На электронных микрофотографиях ядер дифференцированных клеток дрожжей и D.melanogaster интенсивно окрашенный транскрипционно неактивный.хроматишсобран в кластеры вокруг ядрышка и вдоль внутренней поверхности ядерной мембраны. При этом флуоресцентные маркеры для гетерохроматина и ядерных пор могут быть четко разделены как ряд различных неперекрывающихся локусов (151). Аналогичная картина наблюдается и в ядрах млекопитающих: участки гетерохроматина, расположенные по периферии ядра, прерываются ядерными порами, вблизи которых видны светлые области нуклеоплазмы, по-видимому, содержащие активно транскрибируемый хроматин (51). i

Транскрипционно неактивный хроматин и ядерная периферия. Репрессия теломер у дрожжей.

Транскрипционно неактивные домены у дрожжей, включающие теломерные участки и локусы mating type кластеризуются на периферии ядра. Гетерохроматин у дрожжей состоит из деацетилированных нуклеосом, связанных с комплексом белков Sir (silent information regulators): Sir2, Sir3 и Sir4. Sir-ассоциированный хроматин находится в скоплениях вблизи ядерной оболочки, располагаясь между ядерными порами, но не совпадая с ними (55,111,150). У дрожжей имеется два частично дублирующих друг друга механизма прикрепления теломер к оболочке ядра. Первый связан с репрессией и осуществляется путем связывания Sir4 с ассоциированным с ядерной мембраной белком Escl (enhancer of silent chromatin 1) (111,150). Взаимодействие Sir4 с Escl необходимо и достаточно для прикрепления транскрипционно неактивного хроматина к ядерной оболочке (37,150,150). Второй способ прикрепления теломер требует участия консервативного гетеродимерного белка уКи (67,68). Этот ДНК-связывающий фактор способен прикреплять хромосомы независимо от осуществляемого Sir белками сайленсирования, возможно, организуя теломеры в кластеры до того, как установлено транскрипционно неактивное состояние. Кроме Escl и уКи на прикрепление и репрессию теломер влияют другие факторы, в том числе и компоненты ядерной поры. Эти факторы опосредованы: нарушения в работе белков, модифицирующих ключевых участников процесса (Ulpl, Mms21), мутации факторов, поддерживающих структуру хроматина (SMC factors), и белков, помогающих им в этом (СШ8). Предполагают, что в прикреплении уКи и Escl - связанных теломер вовлечены и другие ассоциированные с мембраной белки, в том числе консервативные белки внутренней ядерной оболочки, содержащие SUN или KASH домены (3).

Функциональное значение подобной ядерной организации теломер было прояснено в экспериментах по искусственному прикреплению к ядерной оболочке гена, фланкированого Sir-связывающими последовательностями, называемыми* сайленсерами. Оказалось, что такое прикрепление способствует репрессии репортерной конструкции, до тех пор, пока она содержит сайленсеры>(4). В другой работе было показано, что усиление слабой репрессирующей функции сайленсеров происходит при направленной посадке 8хг4-связывающего домена Escl наг репортерную конструкцию или при скоординированной оверэкспрессии генов, кодирующих Sir белки (5). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что ключевым фактором, который обеспечивает периферия ядра, является доступ к белкам-репрессорам Sir. Концентрация Sir факторов в ядре лимитирующая всюду, кроме теломерных участков, где многочисленные сайты связывания белка Rapl отбирают Sir белки с хвостов гистонов на протяжении всего генома. Такое перераспределение способствует тому, что Sir факторы преимущественно t распространяются вдоль хроматина вблизи теломер и препятствует репрессии нетеломерных генов (94).

Ядерная ламина и репрессия генов.

В клетках высших эукариот ядерной ламиной называют слой промежуточных филаментных белков, выстилающих поверхность» между хроматином и внутренней ядерной мембраной. Генетические данные говорят о том, что ядерная ламина участвует в организации хроматина. Так, мутация или делеция ламина А у мышей приводит к падению уровня типичной для гетерохроматина модификации гистонов: триметилирования'гистона НЗ по 9 остатку лизина (НЗК9теЗ). Кроме этого, у мышей с делецией ламина А наблюдаются изменения размера и формы ядер кардиомиоцитов и перемещение гетерохроматина от периферии ядра (15,149), а также снижение уровня характерной для гетерохроматина модификации - метилирования НЗК9 (140). Нарушения экспрессии или процессинга ламина В1 у мышей также влияют на расположение интерфазных хромосом внутри ядра и на экспрессию генов (95). Показано, что у нематод^ нарушения организации хроматина, вызываемые удалением ламина, компенсируются удалением двух или более ассоциированных с ламином белков, Manl и emerin, которые участвуют в локализации хроматина на периферии ядра (93). Таким образом, ядерная ламина напрямую или опосредованно задействована в распространении и поддержании гетерохроматина.

В ранних работах для того, чтобы показать, что те или иные специфические области хромосом ассоциированы с ядерной оболочкой, использовали метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). Недавно с целью найти у D.melanogaster последовательности, связывающиеся с ламинами, был применен метод in vivo модификации ДНК, названный DamID (116). Этот метод основан на экспрессии химерного слитого белка, в данном случае между ламином В дрозофилы и ДНК аденин метилтрансферазой E.Coli (Dam), который преимущественно модифицирует ДНК, находящуюся постоянно или временно в физическом контакте в сетью ламинов. Обнаруженные таким образом метилированные области обладают типичными характеристиками гетерохроматина: они лишены ассоциированных с транскрипцией модификаций гистонов, транскрипционно неактивны и поздно реплицируются. Эти гены расположены вдоль всей длины хромосом, но отсутствуют в районе центромер.

Транскрипционно активные гены на периферии ядра.

Несмотря на данные, говорящие о нахождении репрессированных генов на периферии ядра, в последнее время появляются свидетельства того, что ассоциация активированных индуцируемых генов с ядерными порами образует еще один функциональный компартмент на периферии ядра. У дрожжей количественный анализ внтуриядерного расположения нескольких индуцируемых генов, а именно INOl (inositol 1-phosphate), НХК1 (hexokinase isoenzyme 1), GAL1, GAL2, HSP104 (heat shock protein 104) при помощи LacO/LacI системы подтвердил, что после активации эти гены стабильно позиционируются вблизи ядерной оболочки (1,10,11,13,19,20,27,152). Для некоторых локусов сравнительным анализом положения гена и количественного уровня мРНК было показано, что максимальная экспрессия наблюдается при стабильном связывании гена с ядерной порой (11,19,152).

Хотя элементы, необходимые для перемещения генов на периферию ядра, ген-специфичны, удалось выявить общие закономерности в позиционировании генов (3). Одна из них состоит в том, что определяющим для стабильного связывания гена с NPC является, наличие специфических промоторных последовательностей и активаторов. Так, репортерная конструкция, содержащая промотор GAL1, сохраняла способность перемещаться к ядерным порам (1). Из двух способов активации гена НХК1 только один (индукция низким содержанием глюкозы) приводит к ассоциации с NPC (152). Таким образом, само по себе наличие транскрипта недостаточно для связывания гена с NPC, необходимы промоторные последовательности. Однако и наличие промоторов не является достаточным условием. В случае гена GAL2 последовательность UAS и промотор были достаточны для обеспечения локализации гена с ядерными порами (27), а в случае генов INO, и GAL1 перемещение на периферию ядра происходило независимо от элонгации транскрипции (10). При этом сам по себе UAS гена GAL1 был недостаточен, требовалось также наличие специфического 3'UTR. Аналогично, стабильное связывание гена НХК1 с NPC зависело от присутствия его 3'UTR (152). Было предположено, что различия в требовании наличия 3'UTR для локализации генов с ядерной порой связаны с различиями в силе взаимодействий между ассоциированными с промоторами факторами и NPC. В случаях сильного взаимодействия достаточно промотора и участие 3'UTR не требуется, другие промоторы требуют присутствия 3'UTR (3).

То, каким образом перемещение генов к ядерным порам влияет на уровень экспрессии, еще не понятно. Для некоторых генов увеличение уровня транскриптов может быть результатом стабильного связывания генов с NPC (11,152), для других такое влияние незначительно (1,13,27). Так, было показано, что активация гена INOl у S.cerevisiae происходит вблизи ядерной мембраны. В этом случае, как активация транскрипции, так и перемещение гена зависело от белка Scs2 - интегрального белка ядерной мембраны. При искусственном прикреплении IN01 локуса к периферии ядра активация происходит в отсутствии Scs2, для GAL1 искусственное прикрепление приводит к более быстрой реиндукции транскрипции (10,11). В другой работе меченый НХК1 ген перемещался из теломерного кластера к ядерной поре после активации транскрипции низким содержанием глюкозы (132,152). Когда связывание локуса с NPC предотвращалось посадкой вирусного трансактиватора на 5'-область гена, уровень НХК1 транскрипта снижался в два раза (152). Так же, как и для IN01 (10,11), индукция НХК1 становилась в два раза эффективнее после прикрепления гена к ядерной оболочке посредством субдомена белка Escl. Эти результаты свидетельствуют о том, что ассоциация генов с NPC действительно может регулировать уровень экспрессии. Полагают, что такое прикрепление может облегчать доступ новосинтезированных транскриптов к ядерным порам. Тем не менее, bj случае с другими индуцируемыми генами мутации, приводящие к нарушению связывания с ядерными порами, не оказывали значительного влияния на уровни соответствующих мРНК (1,13,27). Такую вариабельность можно объяснить различиями в хроматиновом окружении репортерных генов или в силе промоторов.

Было показано, что'у D.melanogaster прикрепление генов'к ядерным порам также играет роль в усилении экспрессии определенных генов, а именно, генов, подверженных дозовой компенсации (102). В ходе дозовой компенсации у самцов D.melanogaster транскрипция генов, находящихся на Х-хромосоме, возрастает в два раза по сравнению с самками. Этот процесс зависит от Rox РНК и MSL комплекса, состоящего из белков MSL1, MSL2, MSL3 и MOF гистон ацетилтрансферазы. В результате очистки MSL белков» были выделены компоненты NPC MTOR (Megator) h NUP153, а также составляющие экзосомы DIS3 и RRP6. Хотя эти белки присутствовали в субстихиометрических количествах, их нокаут при помощи РНК-интерференции проводил к нарушению паттерна связывания MSL белков с Х-хромосомой и влиял на дозовую компенсацию ряда генов X-хромосомы (102). Так как MTOR является функциональным гомологом дрожжевого белка Mlpl, можно провести параллель между взаимодействием MTOR с MSL белками и взаимодействием между Мехб7р и Mlpl в дрожжах (20,27).

Факторы, влияющие на связывание транскрипционно активных генов с NPC. Влияние мРНК на прикрепление генов к ядерным порам.

Имеются свидетельства того, что важную роль в прикреплении активно транскрибирующихся генов к ядерной поре играет mRNP (мРНК в комплексе с РНК-связывающими белками) и комплексы, участвующие в его процессинге и экспорте. Так, у S.cerevisiae компоненты mRNP связываются с ассоциированными с NPC белками Mlplp и

М1р2р, результаты ChIP экспериментов указывают на то, что Mlplp связывается с транскрибирующимися генами РНК-зависимым образом. Эти наблюдения позволили предположить, что М1р белки участвуют в прикреплении генов к NPC, взаимодействуя с синтезируемыми транскриптами. Кроме того, показано, что некоторые факторы, организующие экспорт мРНК из ядра, связываются с мРНК уже в ходе транскрипции. Мех67р, экспортный рецептор мРНК, который осуществляет перенос mRNP через NPC, также рекрутируется на мРНК котранкскрипционно. Мех67р связывается с Mlpl, они оба необходимы для стабильного связывания активированных GAL10 и HSP104 генов с ядерными порами. Однако локализация этих генов на периферии ядра не оказывает значительного влияния на уровень их экспрессии. По крайней мере в случае GAL2 локуса участие Мех67р в ассоциации с NPC не требует РНК: прикрепление происходило даже тогда, когда мРНК-кодирующий участок гена отсутствовал, а Мех67р сохранял способность связываться с геном независимо от РНК (27). SAGA комплекс участвует в организации связывания генов с ядерной порой.

Большинство генов S.cerevisiae, для которых показано перемещение к ядерным порам после активации транскрипции - индуцируемые гены, транскрипция которых зависит от SAGA комплекса. При помощи визуализации GAL локусов в живых клетках дрожжей было показано, что перемещение GAL генов (GAL1, GAL7, GAL10) на периферию ядра требует наличия компонент SAGA комплекса Susl, являющегося дрожжевым гомологом Е(у)2, и Ada2, а также Sac3, фактора, участвующего в экспорте мРНК и физически связывающем активированные GAL гены с нуклеопорином Nupl. Делеция ADA2 или NUP1 генов приводит к нарушению периферического расположения GAL локусов, не влияя на уровень транскрипции. То есть, в этом случае активация транскрипции не являлась следствием связывания генов с ядерной порой (13). Эти результаты были подтверждены данными ChIP экспериментов о том, что ассоциированные с NPC белки Mlpl и М1р2 непосредственно взаимодействуют с SAGA комплексом на промоторах транскрибирующихся GAL генов. При этом для связывания М1р белков с GAL промоторами не требуется ацетилтрансферазная активность SAGA, их количество существенно снижается в отсутствии SAGA, но в условиях, когда транскрипция продолжается. То есть, для ассоциации GAL локусов с NPC нужно физическое, а не функциональное присутствие SAGA комплекса на промоторах генов (13).

37

ИНСУЛЯТОРЫ.

Организация эукариотических гномов.

Экспрессия генов высших эукариот в ходе развития и тканеспецифичная экспрессия подразумевают активацию генов в определенной группе клеток и на определенной стадии развития организма и поддержание их в неактивном состоянии в остальное время. В отличие от генов домашнего хозяйства, тканеспецифичные гены не собраны в кластеры на хромосоме. Они могут располагаться в районах генома с высокой плотностью генов и в районах репрессированного хроматина. В зависимости от расположения, для их экспрессии может потребоваться экранирование от положительного или отрицательного влияния регуляторного эффекта соседнего хроматина. В частности такой эффект имеет место за счет взаимодействий между белками основного транскрипционного комплекса, собранного на промоторе, и специфическими белковыми комплексами на регуляторных элементах, называемых энхансерами. В установлении доменов независимой транскрипции принимают участие последовательности, называемые инсуляторами. Инсуляторы определяют как регуляторные элементы, обладающие двумя функциональными свойствами. Во-первых, они способны блокировать активность энхансеров и сайленсеров, если находятся между этими регуляторными элементами и промотором (блокирующая функция). Таким образом инсуляторы осуществляют важнейшую функцию ограничения действия энхансеров и сайленсеров только на свои промоторы. Во-вторых, инсуляторы препятствуют распространению гетерохроматина и таким образом защищают экспрессию гена от позитивного или негативного влияния окружающего хроматина (барьерная функция). Инсуляторы обнаружены у многих эукариотических организмов (38,89).

Su(Hw) — зависимые ннсуляторы.

Строение и белковый состав 8и(Ню)-инсуляторов.

Одним из наиболее изученных инсуляторов является так называемый МДГ-4 инсулятор. Он был впервые обнаружен в составе ретротранспозона МДГ-4 у дрозофилы, вблизи З'-конца 5'-длинного концевого повтора МДГ-4 (49,70). МДГ-4 инсулятор представляет собой последовательность длиной в 340 п.н., содержащую 12 прямых повторов короткого мотива, являющегося локусом связывания белка Su(Hw) (29,145). Для функционирования инсулятора достаточно четырех таких повторов (135). Этот инсулятор обладает всеми свойствами инсуляторов: способностью блокировать взаимодействие между энхансерами и промоторами и способностью экранировать ген от репрессирующего действия окружающего хроматина. И та, и другая активность МДГ-4 инсулятора требует участия белка Su(Hw), поэтому этот инсулятор принято называть 8и(Н\у)-инсулятором.

Кроме МДГ-4 инсулятора в геноме дрозофилы были найдены эндогенные Su(Hw)-зависимые инсуляторы. Большинство из них содержит меньше четырех локусов связывания белка Su(Hw) (114,120). Наиболее хорошо изученным эндогенным Su(Hw)-инсулятором является 1А2 инсулятор, который располагается вблизи З'-конца гена yellow и, по-видимому, препятствует неправильным регуляторным воздействиям между геном yellow и комплексом генов achaete-scute (AS-C). 1А2 инсулятор имеет только два локуса связывания Su(Hw), но при этом проявляет все свойства инсулятора в трансгенных тестах (52,115).

Su(Hw) содержит ДНК-связывающий домен, состоящий из 12 цинковых пальцев, и два домена, обогащенных кислыми аминокислотными остатками, на N- и С- концах. С помощью делеционного анализа было показано, что за энхансер-блокирующую активность инсулятора (инсуляцию) отвечает домен, расположенный между цинковыми пальцами и С-концевым кислым доменом (79). В то же время кислые домены не имели большого значения для инсуляции.

Были найдены и охарактеризованы и другие белковые компоненты, необходимые для энхансер-блокирующей активности МДГ-4 инсулятора: белок Mod(mdg4)-67.2 (40,47) и белок СР190 (110). Mod(mdg4)-67.2 представляет собой; один из многочисленных сплайс-вариантов, образующихся с гена mod(mdg4). На N-конце всех белков, кодируемых геном mod(mdg4), находятся так называемые BTB/POZ домен и Q домен, богатый глютаминовыми а.о. BTB/POZ' домен присутствует у многих белков, являющихся регуляторами транскрипции. Наличие этого домена определяет способность белков образовывать гомо- и гетеродимеры, а также необходимо для олигомеризации белков. Кроме того, Mod(mdg4)-67.2 имеет на С-конце кислый домен, содержащий 50% Asp и Glu (47). Этот домен отсутствует у других Mod(mdg4) белков, его наличие, по-видимому, придает специфические свойства белковому продукту Mod(mdg4)-67.2, объясняя то, почему именно эта форма играет важную роль в инсуляции. Mod(mdg4)-67.2 сам по себе не способен'связываться с последовательностью МДГ-4 инсулятора, а рекрутируется на нее, взаимодействуя с белком Su(Hw). Mod(mdg4)-67.2 связывается с доменом Su(Hw), ответственным за блокирование энхансеров, посредством своего С-концевого домена (39,50). Что касается BTB/POZ домена, то было показано, что он осуществляет взаимодействие между молекулами Mod(mdg4)-67.2 in vitro. Было предположено, что гомодимеризация Mod(mdg4)-67.2 in vivo необходима для активности 8и(Н\у)-инсулятора (39,50). Действительно, недавно in vivo было показано, что BTB/POZ домен необходим для функционального участия Mod(mdg4)-67.2 в инсуляции, но помимо BTB/POZ домена в гомодимеризации участвует другой домен белка (53). Точечные замены в BTB/POZ домене или его делеция приводили к нарушению связывания Mod(mdg4)-67.2 с локусами связывания Su(Hw). Кроме того, было замечено, что взаимодействия с Su(Hw) недостаточно для рекрутирования Mod(mdg4)-67.2 эти локусы. Поэтому было предположено, что для связывания Su(Hw)-Mod(mdg4)-67.2 комплекса с Su(Hw)-инсулятором требуется дополнительный белок, который который взаимодействует с BTB/POZ доменом. Этот белок еще предстоит найти.

Белок CP 190 также содержит BTB/POZ домен, взаимодействует с Mod(mdg4)-67.2 и Su(Hw) (110).

Энхапсер-блокирующая активность Su(Hw)-uHcynnmopoe.

Энхансер-блокирующие свойства 8и(Н\у)-инсулятора были> детально изучены на модели гена yellow. Этот ген кодирует пигмент кутикулы у дрозофилы, поэтому уровень его экспрессии можно оценивать по степени пигментации. Транскрипция гена yellow регулируется несколькими тканеспецифическими энхансерами. В результате встраивания мобильного элемента МДГ-4, содержащего 8и(Н\у)-инсулятор, в регуляторную область гена yellow энхансеры, необходимые для экспрессии гена в теле и крыльях, оказались изолированными от промотора. В результате у мух наблюдалось изменение нормальной окраски соответствующих участков кутикулы. При этом экспрессия гена yellow в других зонах кутикулы, регулируемая энхансерами, которые не были отделены инсулятором от промотора, не нарушалась. Таким образом, одним из свойств 8и(Н\у)-инсулятора является направленность его действия: инсулятор блокирует взаимодействие между энхансером и промотором только, если располагается между ними. Перечислим другие свойства 8и(Н\у)-инсулятора, которые присущи и всем другим известным инсуляторам: действие инсулятора неспецифично - он может блокировать взаимодействие между любым энхансером и промотором; изолированые инсулятором энхансер и промотор сохраняют функциональную активность; эффективность работы инсулятора зависит от количества локусов связывания белка Su(Hw) (9). Инсулятор не является непреодолимым барьером между энхансером и промотором. При некоторых условиях энхансер-блокирующая активность инсулятора может быть нейтрализована, а взаимодействие между энхансером и промотором восстановлено. Такой эффект наблюдается, когда между энхансером и промотором два МДГ-4 инсулятора располагаются тандемно. Было предложено, что потеря< инсуляторной активности' обусловлена взаимодействием между двумя инсуляторами (14,104). Более того, добавление третьего МДГ-4 элемента между энхансером и промотором в одних случаях приводит к восстановлению, энхансер-блокирующей активности, а в других нет (84,130).

Было показано, что Su(Hw) H?Mod(mdg4) ассоциированы с большим количеством (порядка нескольких сотен) геномных локусов на политенных хромосомах D.Melanogaster. Между тем, в диплоидных клетках дрозофилы сигналы< Su(Hw) и Mod(mdg4) не проявляют диффузного распространения, которое можно ожидать от такого большого количества индивидуальных локусов связывания этих белков с хроматином. Распределение Su(Hw) и Mod(mdg4) в ядре имеет вид больших «пятен», небольшое количество которых (около двух десятков) указывает на то, что белки собраны в этих' структурах вместе* (46). Такие агрегаты белков МДГ-4 инсулятора. получили название «инсуляторных телец». Большая часть «инсуляторных телец» находится» на периферии-ядра. Было также показано, что ДНК-последовательность, до того распределенная в ядре равномерно, при встраивании в нее ретротранспозона МДГ-4 перемещается к ядерной оболочке. Было предположено; что эти «инсуляторные тельца» представляют собой скопления многочисленных удаленных друг от друга» 8и(Н\у)-инсуляторов, каким-то образом собранных вместе и удерживаемых путем взаимодействия между своими белковыми компонентами Mod(mdg4) и CP 190. Постулировалось, что в результате образования «инсуляторных телец» и их взаимодействия с ядерным матриксом происходит- формирование отдельных петлевых доменов в геноме' (45). Авторы рассматривали описанную, модель в качестве объяснения способности инсулятора блокировать энхансеры, а в более широком смысле участвовать в пространственной организации и функционировании генома. Однако, так и не было доказано, что «инсуляторные тельца» содержат скопления различных инсуляторных последовательностей. Недавно были представлены убедительные данные, свидетельствующие о том, что «инсуляторные тельца» представляют собой не функциональные инсуляторные комплексы, а агрегаты соответствующих белков; и не имеют никакого отношения к активности 8и(Н\у)-инсуляторов (54). Барьерная активность Su(Hw)-uncyjuimopoe.

Помимо энхансер-блокирующей активности МДГ-4 инсулятор обладает также барьерной активностью: препятствует репрессии, вызываемой белками группы Polycomb (PcG) (23,78,96,141), и частично защищает трансген от репрессирующего влияния гетерохроматина (126,127).

На сегодняшний день существует следующее представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе процесса распространения гетерохроматина. Центральное место- занимает саморазвивающаяся цепь событий: метилирование НЗК9 приводит к связыванию белка НР1 с модифицированными! гистонами посредством своего хромодомена, затем НР1 привлекает на хроматин комплексы с метилтрансферазной активностью и таким образом область транскрипционно неактивного, ассоциированного с НР1 гетерохроматина распространяется (60).

Сайленсирование определенных хромосомных доменов белками Рсв начинается с образования мультимерных комплексов на регуляторных элементах, названных PRE (PcG response elements). Эти последовательности могут иметь протяженность в несколько сотен пар нуклеотидных оснований и, как полагают, содержат локусы связывания для сиквенс-специфичных белковых факторов, рекрутирующих PcG комплексы. Известно три типа PcG комплексов, которые совместно участвуют в сайленсировании.(134): PRC1, PRC2 и PhoRC. PRC1 комплекс был выделен из D.melanogaster и содержит кор из четырех PcG белков: PC (Polycomb), PSC (Posterior sex combs), PH'(polyhomeotic) и RING, а также белок SCM (Sex comb on midleg) и многочисленные дополнительные белки. Аналогичный комплекс был очищен из клеток млекопитающих. Функциональные свойства PRC1 определяются присутствием хромодомена в PC субъединице, который специфически связывается с триметилированным лизином 27 гистона НЗ (НЗК27). RING белки содержат RING домен, обладающий ЕЗ убиквитин-лигазной активностью и убиквитинилирующий Н2АК119. Ключевым компонентом PRC2 комплексов является E(Z) (enhancer of zeste), гистон НЗ метилтрансфераза, содержащая SET домен. E(Z) сам по себе на обладает гистон метилтрансферазной активностью, но в составе комплекса он метилирует НЗК9 и НЗК27. PhoRC комплекс D.melanogaster содержит PcG белки РНО и SFMBT и участвует в репрессии транскрипции Нох генов. МВТ домен SFMBT специфически- связывается с моно- и диметилированными НЗК9 и Н4К20.

Осуществляемое PcG белками сайленсирование характеризуется тремя видами модификаций гистонов: деацетилированием гистонов деацетилазами: Rpd3/HDAC1, ассоциированной с PRC1 и PRC2 комплексами, и Sir2 в составе PRC2; метилированием» НЗ по К9 и К27 Е(г)-содержащим PRC2 комплексом и убиквитинилированием Н2А RING в составе PRC1 (117). Ключевую роль в связывании PcG комплексов с хроматином играет метилирование НЗК27. PRE-связывающие белки рекрутируют PRC2, тот метилирует гистоны, а затем хромодомен связывается с метилированными гистонами, рекрутируя PRC1. Таким образом, по аналогии с гетерохроматином была сформулирована следующая концепция: PRE служит местом сборки PcG комплексов, которые последовательно распространяются путем деацетилирования и метилирования гистонов и связывания новых PcG комплексов» (156). Эта модель предполагает, что PcG комплексы распостраняются с PRE элемента вдоль хроматиновой фибриллы и затем способствуют образованию компактной структуры хроматина, что делает его недоступным для действия транскрипционных факторов. Однако ряд наблюдений не подтверждает эту модель. В частности, известно, что хотя PcG-зависимое сайленсирование осуществляется на расстоянии в несколько десятков т.п.н., PcG белки в основном локализуются в районе PRE элемента. При этом в сайленсированном локусе НЗК27 модификация наблюдается на всем протяжении транскрипционной единицы и вышерасположенной регуляторной области, охватывая многие десятки т.п.н (78,113,133).

Механизм осуществляемой PcG белками репрессии транскрипции еще очень слабо изучен. Несмотря на то, что in vitro очищенные и реконструированные PRC1 комплексы ингибируют ремоделирование хроматина и транскрипцию и способны вызывать компактизацию нуклеосом, нет серьезных доказательств того, что PcG комплексы участвуют в компактизации хроматина in vivo (134). Более того, в определенных условиях сайленсированные промоторы доступны для связывания транскрипционных активаторов, общих факторов транскрипции и даже РНК-полимеразы П. Так уровень индуцированной тепловым шоком экспрессии с промотора гена hsp26 уменьшился в 10 раз, когда был фланкирован PRE элементом, но при этом связывание HSF, ТВР и РНК-полимеразы П не нарушилось (24).

Было показано, что один Su(Hw) инсулятор, помещенный между промотором и PRE элементом, блокирует репрессию, контролируемую PcG белками (78,96,141). Но инсерция двух инсуляторов не является, препятствием для сайленсирования, вызывая репрессию транскрипции с промотора (23). В этом случае PcG белки связываются с отделенным инсуляторами промотором, но отсутствуют на участке ДНК, заключенном между инсуляторами. Авторы предположили, что в основе этого явления лежит взаимодействие между двумя инсуляторами, которое приводит к образованию петлевого домена. Этот механизм может объяснить PRE-зависимое сайленсирование, когда PRE элемент, находящийся на большом расстоянии от своего промотора, контактирует с ним посредством выпетливания промежуточного домена. Это выпетливание может происходить при участии эндогенных регуляторных элементов, присутствующих в локусах, подверженных репрессии PcG белками.

Модели функционирования инсуляторов.

На сегодняшний день ни одна из существующих моделей не может полностью объяснить все известные свойства инсуляторов (9,38,84). Это связано с тем, что до сих пор отсутствует единая концепция механизма взаимодействия между регуляторными элементами на больших расстояниях. Иными словами, для понимания принципов функционирования инсуляторов требуется знание того, как осуществляется взаимодействие между энхансерами и промоторами, и наоборот. Существует две группы моделей активности инсуляторов: первая основывается на ряде исследований, устанавливающих связь между инсуляторами и структурной организацией хроматина, а другая интегрирует данные о взаимосвязи свойств инсуляторов с транскрипцией генов. i

Структурная модель предполагает, что свойства инсуляторов объясняются их участием в организации хроматина в ядре, что приводит к установлению доменов независимой транскрипции (89). Предполагается, что инсуляторы взаимодействуют друг с другом или со структурными элементами ядра посредством своих белковых компонентов, вызывая- образование петлевых доменов хроматина, что - препятствует взаимодействию энхансера и промотора. Если принять модель, при которой энхансеры взаимодействуют со своими промоторами напрямую, то причиной инсуляции в этой i модели является пространственный эффект, который мешает энхансеру контактировать с другими промоторами, благоприятствуя взаимодействию энхансера с промотором внутри I одной петли или препятствуя контактам между разными петлями. В случае, если взаимодействие между энхансером и промотором определяется сигналом, распространяющимся от первого ко второму, то инсулятор может его блокировать у основания образованной петли (38). Утверждалось, что предложенная модель, помимо инсуляторной активности, может объяснить и барьерные свойства инсуляторов (45,165).

Транскрипционная модель использует то, что инсуляторы оказывают непосредственное влияние на транскрипцию (6,28,48). Эта модель может быть if подразделена на два различных механизма в зависимости от того, каким образом осуществляется взаимодействие между энхансерами и промоторами. Если предположить, что сигнал от энхансера к промотору каким-либо образом распространяется вдоль по хроматиновой фибрилле, то инсулятор в составе нуклепротеинового комплекса может блокировать это распространение. Если предположить, что энхансер взаимодействует с промотором непосредственно, то инсулятор может конкурировать с промотором за связывание с энхансером, таким образом препятствуя взаимодействию энхансера со своим промотором, что приводит к потере активности промотора (48).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

I. ОБЪЕКТ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Ранее в генетической ^системе; с активированным мобильным элементом Stalker в присутствии дат^ля yellow2 был обнаружен ряд мутаций; названных e(y)btl (enhancer of yellow, N — номер5 мутации); благодаря - их способности;усиливать, фенотип указанного yellow2 аллеля (42). Все найденные мутации связаны с генами, находящимися в X-хромосоме; Ген yellow отвечает за; окраску кутикулы у дрозофилы. Этот ген имеет сложную,систему регуляции экспрессии: у него имеется четыре энхансера, действующих на разных: стадиях1 развития; и в разных тканях. Мутация yellow2 связана со вставкой мобильного элемента МДГ-4в регуляторную область гена -yellow. Этот мобильный элемент содержит инсулятор, блокирующишдействие расположенных выше энхансеров , на промотор; гена; Мутация yellow2 имеет следующий фенотип у взрослых мух:' светлые (желтые) покровы .тела, темные (нормальные),щетинки; Щетинки сохраняют пигментацию, благо даря.тому, что соответствующий энхансер щетинок располагается в первом интроне гена yellow и не подвержен влиянию МДГ-4: Наличие мутации в каком-либо гене- e(y)N приводит к тому, что и щетинки лишаются.пигментации и становятся светлыми. Таким образом белковые продукты генов е(у) каким-то образом участвуют в; активированной: транскрипции гена yellow, запускаемой; с энхансера; щетинок; Иными словами* кодируемые генами е(у) белки вовлечены в организацию взаимодействия! между энхансером и промотором: Интересно;, что слабые мутации е(у) генов, не влияющие на выживаемость мух каждая по отдельности, в совокупности .являются, летальными, что указывает на. то, что? кодируемые е(у) генами белки выполняют перекрывающиеся функции (41).

Продукты всех трех генов е(у) бьши охарактеризованы. Ген е(у)1 кодирует общий фактор транскрипции и коактиватор TAF9, входящий в состав комплексов TFIID и SAGA (143). Ген е(у)3 кодирует повсеместно экспрессирующийся ядерный белок размером более

2000 а.к., имеющий гомологов у. других эукариот, и названный SAYP (Supporter of Activation of Yellow Protein). SAYP связывается со многими областями транскрипционно активного хроматина на политенных хромосомах и коактивирует транскрипцию эухроматиновых генов. SAYP' также в большом- количестве присутствует в-гетерохроматине 4-ой хромосомы и хромоцентре и репрессирует транскрипцию: эухроматиновых генов, перемещенных в гетерохроматин. То есть SAYP играет двоякую-роль в регуляции транскрипции в эухроматине и гетерохроматине (138).

Объектом изучения в данной работе является белковый продукт гена е(у)2 — белок Е(у)2. Е(у)2 представляет собой эволюционно консервативный белок размером в 101 ак, не содержащий известных структурных доменов. Е(у)2 экспрессируется на всех стадиях развития и во всех органах D.melanogaster. Е(у)2 локализуется преимущественно в ядре клетки и присутствует в большом количестве сайтов локализации на политенных хромосомах из клеток слюнных, желез D.melanogaster. Слабая мутация - е(у)2" вызывает многочисленные фенотипические нарушения'у мух (44) и> усиливает фенотипические* проявления, слабых.мутаций, генов .yellow, white, cut и scute (41). Сильная мутация е(у)2 является летальной. Было предположено, что Е(у)2 вовлечен в регуляцию транскрипции большого 1 числа генов-в ходе развития дрозофилы. У человека также имеется гомолог е(у)2, кДНК которого присутствует в различных тканях организма. Предполагается, что гомолог Е(у)2 у человека участвует в регуляции широкого спектра генов (44). Был найден паралог е(у)2 — ген е(у)2Ъ, экспрессирующийся только в небольшой, группе половых клеток самцов. Оказалось, что е(у)2 является ретрокопией е(у)2Ъ, приобретшей общие функции, в то* время как исходный ген стал узкоспецифичным* (83). Было показано, что Е(у)2 коактивирует транскрипцию на- хроматиновой матрице* и входит в состав многосубъединичного комплекса, содержащего белок TAF9 (Е(у)1) (44). TAF9 является-субъединицей общего фактора транскрипции TFED, а также входит в состав dSAGA/TFTC гистонацетилтрансферазного комплекса, участвующего в ремоделировании хроматина и инициации транскрипции ряда Pol П-зависимых генов (88,103,112). Позднее был найден дрожжевой гомолог Е(у)2 - белок Susl. Было показано, что Susl является компонентом транскрипционного SAGA комплекса дрожжей и ассоциированного с ядерной порой Sac3-Thpl-Cdc31 комплекса, участвующего в экспорте мРНК из ядра в цитоплазму (124). Susl необходим для перемещения активированных GAL генов к ядерным порам и эффективного экспорта их транскриптов (13).

С целью исследовать функции Е(у)2 в многоклеточном организме были поставлены следующие экспериментальные задачи:

- провести поиск белков, взаимодействующих с белком Е(у)2, в дрожжевой двухгибридной системе;

- охарактеризовать комплекс, содержащий белки Е(у)2 и TAF9; исследовать функции белка Е(у)2 на основе полученной информации о взаимодействующих с ним белках.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

Штаммы и вектора S. cerevisiae и Е. coli, использованные в работе.

Для двухгибридного скрининга использовался штамм дрожжей L40 с генотипом МАТа HIS3A200 trpl-901 leu2-3, 112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 URA3::(lexAop)8-lacZ GAL4.

Для двухгибридного скрининга бьши использованы вектора:

- рАСТ2 (Clontech) - вектор, кодирующий AD транскрипционного фактора GAL4. Содержит ген LEU2, позволяющий дрожжам расти на среде без лейцина. В вектор рАСТ2 клонирована библиотека кДНК из эмбрионов D. melanogaster;

- рВТМ117с - вектор, кодирующий ДНК-связывающий белок LexA. Содержит ген TRP1, позволяющий дрожжам расти на среде без триптофана, ген CAN1, определяющий чувствительность дрожжевых клеток к канаванину. В вектор клонирована кДНК исследуемого белка Е(у)2.

Для экспрессии рекомбинантных белков использовали вектора pQE (Qiagen). Для промежуточного клонирования использовали вектор pBlueScript SK+ (Stratagene).

Для трансформации и наращивания плазмид, а также для экспрессии рекомбинантных белков использовали штамм Е. coli XL2-Blue. Клеточные линии.

Использовалась S2 клеточная линия D. melanogaster. Библиотека кДНК.

Для двухгибридного скрининга использовалась библиотека кДНК из эмбрионов D. melanogaster, клонированная в вектор рАСТ2 по сайтам рестриктаз EcoRl-Xhol, любезно предоставленная А. Солдатовым. Представительность библиотеки не менее 106 клонов.

Эмбриональный ядерный экстракт.

Использовался ядерный экстракт (растворимые белки) из эмбрионов D.melanogaster полученный по методике (44): 0-12-часовые эмбрионы дехорионезировали, выделяли ядра, лизировали их в 0,4 М сульфате аммония, растворимую фракцию белков высаливали 2,3 М сульфатом аммония, осадок растворяли. Дрожжевые и бактериальные среды.

Для культивирования дрожжей использовались среды: YPD (бакто-пептон (2%), бакто-дрожжевой экстракт (1%), бакто-агар (1,8%) (для чашек), глюкоза (2%)) и SD (Difco yeast nitrogen base without amino acids (0,67%), бакто-агар (2%) (для чашек), глюкоза (2%), аденин (0,02%), урацил (0,02%), изолейцин (0,03%), валин (0,15%), аргинин (0,02%), гистидин (0,02%), лейцин (0,1%), лизин (0,03%), метионин (0,02%), фенилаланин (0,05%), треонин (0,2%), триптофан (0,02%), тирозин (0,03%)).

Для культивирования Е. coli использовалась среда 2YT (3,1%) и LB-arap (4%). Ферменты и реактивы.

В работе использовались ферменты фирм Fermentas, Gibco, Promega с соответствующими буферами, реактивы фирм Serva, Sigma, Roche. Антитела.

Были использованы следующие антитела: полученные в нашей лаборатории кроличьи антитела против TAF10 (43), любезно предоставленные L.Tora антитела против TAF1, TRRAP (90) и ADA2b (103). Нами были получены и использованы кроличьи и мышиные антитела против Е(у)2, кроличьи антитела против GCN5 и Xmas-2. Также в работе использовались антитела против ламина DmO (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Department of Biological Sciences), антитела к NPC компонентам Mab414 (Abeam), антитела к FLAG тагу (Sigma). Все кроличьи антитела были афинно очищены.

Праймеры.

В работе были использованы следующие праймеры:

Номер/ название Последовательность 5'-3' btmsfvvd CCATTGAAGGGCTGGCGGTTGG btmsrev CGCCCGGAATTAGCTTGGCTGC

ADF CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACeC

ADR GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT

390 TCCTCGAGCATATCAATAAGTTTACC

494 TGTCCTCGAGATCTCATTCGTGAAC

495 ACTGGGATCCGTCCGCACAAGTGTGAT

558 CGCGGATCCCTTCGCGCCGAATTGGTCA

559 TCAAAGCTTCATTTGTCCCACAGCCCCA

627 TCAGAATTCTTATCTCAAATGGCTCAATCC

628 GGACACCATGGGATCGGATTTGAAGC

629 TCCACCATGGACATTGACATACGCAC

1 GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGCACTTCCGGCGCAGTTGATC

2 GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGATTCGTCCTCTGGCTCA

3 GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGACCTGCACCGTAAG

4 GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGGTTGTAGTTCATAG

5 GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTACATGATCCCCCATG

6 GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATTTCGCCCCGAAGAACG

7 CGACATACTGCTCTCGTTGGTTC

8 AGCTAAAATCAATTTGTTGCTAACTT hsp70fwd AGGTCGACTAAAGCCAAATAGA hsp70rev AGCTAAAATCAATTTGTTGCTAACTT

E(y)2fwd GGAGAAGG G СACCAACAACAG

E(y)2rev TGACGCTGAGTTAAAGTTAGGATTCG

Xmas-2fwd AGTTCAATGCTGCCTGCCATAC

Xmas-2rev GCTTGTGTTGCGTTCGGTT trffwd GGCGACACATCTGCGTAATCCTCTC trfrev TGGTCTGTTGCTGCTGCGGTTG actinfwd GGCACCACACCTTCTACAATGAGC actinrev GAGGCGTACAGCGAGAGCACAG

Mflr-4fwd TTCTCTAAAAAGTATGCAGCACTT

МДГ-4геу CACGTAATAAGTGTGCGTTGA lAlfwd TTGCCTTGAAGAGATTGGTCG lAlrev CCTCAGACATAATTTGCCTGC lA2fwd ACCACACATCAGTCATCGTGT lA2rev AGCATTCTTTTACCATGCGTAT lA6fw TCTACCTGTTGCATTATTCTCC lA6rev GCCTTTTAAGGTTACCTATTACAG

24Dfwd GCAATTCTATGGAGATTAAAGGTG

24Drev ACAGCATGAGAACTTCTTAGG

50Afwd TTGATAAATAGTCCAGCACGCATAC

50Arev ATACAAAGTGGTTTCAGCCAAGAAG

62Dfwd TGATACCAGGCGAACAGAAATC

62Drev TTTGGGCTTGGTGAGAACAG

66Efwd AACTCCATTCCATTCACCTGTCTC

66Erev GCTGCTGATCCTCGCTTTCC

87Efwd TTTGCGTTTCGGCTGCTGTC

87Erev GGATGTTACATTGAGAGTGCTTAGG

Для секвенирования конструкций в векторе рВТМ117с использовались праймеры btmsfwd и btmsrev; для секвенирования клонов библиотеки кДНК в векторе рАСТ2 использовались праймеры ADF и ADR.

Также использовались праймеры на ТЗ и Т7 промоторы (Stratagene), oligo-dT праймер. Конструкции для изучения взаимодействия Е(у)2 и Su(Hw).

GAL4-Su(Hw)(363-941) -исходный фрагмент кДНК Su(Hw) в двухгибридном клоне в векторе рАСТ2, кодирующий а.о. 363-941.

GAL4-Su(Hw)(363-781) - ПЦР фрагмент кДНК Su(Hw) из двухгибридного клона в векторе рАСТ2 (ADF-#390), кодирующий а.о. 363-781, субклонирован в вектор рАСТ2 по сайтам рестриктаз Ncol-Xhol.

GAL4-Su(Hw)(363-620) - ПЦР фрагмент кДНК Su(Hw) из двухгибридного клона в векторе рАСТ2 (ADF-#494), кодирующий а.о. 363-620, субклонирован в вектор рАСТ2 по сайтам рестриктаз Ncol-Xhol.

GAL4-Su(Hw)(363-597) - ПЦР фрагмент кДНК Su(Hw) из двухгибридного клона в векторе рАСТ2 (ADF-#627), кодирующий а.о. 363-597, субклонирован в вектор рАСТ2 по сайтам рестриктаз NcoI-EcoRI.

GAL4-Su(Hw)(401-781) - ПЦР фрагмент кДНК Su(Hw) (#628-#390), кодирующий а.о. 401-781, субклонирован в вектор рАСТ2 по сайтам рестриктаз Ncol-Xhol. GAL4-Su(Hw)(435-781) - ПЦР фрагмент кДНК Su(Hw) (#629-#390), кодирующий а.о. 435781, субклонирован в вектор рАСТ2 по сайтам рестриктаз Ncol-Xhol.

GAL4-Su(Hw)(497-781) - ПЦР фрагмент кДНК Su(Hw) (#495-#390), кодирующий а.о. 497-781, субклонирован в вектор рАСТ2 по сайтам рестриктаз Ncol-Xhol. Конструкции для экспрессии рекомбинантных белков.

His-E(y)2 - кДНК Е(у)2 субклонирована в вектор pQE30; использовалась для получения антител и для экспериментов по связыванию белков на глютатион-сефарозе. GCN5(349-814) - ПЦР фрагмент кДНК GCN5 (#558-#559), кодирующий а.о. 349-814, субклонирован в вектор pQE30 по сайтам рестриктаз BamHI-Hindlll; использовалась для получения антител.

Xmas-2(755-1370) - фрагмент кДНК Xmas-2, кодирующий а.о. 755-1370, субклонирован в вектор pQE32 из двухгибридного клона в векторе рАСТ2 по сайтам рестриктаз BamHI-Xhol; использовалась для получения антител.

Su(Hw)(435-620)-GST - ПЦР фрагмент кДНК Su(Hw) (#629-#494), кодирующий а.о. 435620, субклонирован в вектор pGEX5x-l по сайтам рестриктаз Ncol-Xhol; использовалась для экспериментов по связыванию белков на глютатион-сефарозе.

His-TAF10 - кДНК TAF10 субклонирована в вектор pQE30; использовалась для экспериментов по связыванию белков на глютатион-сефарозе. Конструкции для трансформации S2 клеток.

3xFLAG-Su(Hw) - кДНК Su(Hw) субклонирована в вектор рАс5.1 в одной рамке считывания с последовательностью, кодирующей три FLAG эпитопа.

2. Работа с дрожжами.

Трансформация дрожжей кДНК библиотекой, индивидуальной плазмидой, анализ активации репортерного гена LacZ с использованием субстрата X-gal, анализ активации репортерного гена LacZ в жидкой культуре с использованием субстрата CPRG, отбор клонов, позитивных по активации обоих репортерных генов, элиминация «автоактиваторов» проводились по протоколам Clontech.

3. Работа с клетками. Трансформация S2 клеток.

Трансформацию клеток проводили при помощи Effectene Transfection Reagent (Qiagen) по протоколу производителя. РНК интерференция.

S2 клетки сажали на 3 мм чашки в количестве 5 млн. в объеме среды 3 мл. Через сутки из чашек удаляли среду, добавляли 1 мл среды без сыворотки, затем к клеткам добавляли 15 нг двухцепочечной РНК, осторожно перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 40 мин. Добавляли в чашки с клетками по 2 мл среды, содержащей 15% FBS. Использовались двухцепочечные РНК, соответствующие генам Е(у)2, Xmas-2, в качестве отрицательного контроля - двухцепочечная РНК, полученная с фрагмента вектора pBlueScript П- (pBSK-). Анализировали результаты РНК интерференции на 5 сутки методами RT-Q-PCR и Вестерн-анализа.

4. Работа с ДНК.

Приготовление компетентных клеток.

Бактерии рассевали штрихом на чашку с селективной средой, растили в течение ночи при 37°С, несколько колоний помещали в 40 мл среды SOB (2% Bactotriptone; 0,55% Bacto Yeast extract; 5M NaCl; 1M KC1; 0.01 V 2M Mg2+) и растили на 37°C с покачиванием (200-300 об/мин). В 50 мл пробирку помещали 30 мл культуры; охлаждали в ледяной бане 10 мин и осаждали центрифугированием (4500 об/мин, 10 мин, 4°С). Удаляли супернатант и ресуспендировали клетки в 10 мл ледяного буфера ТВ (10mM PIPES; 55тМ MnCl2x2H20; 55тМ МпС12х4Н20; 15тМ СаС12х2Н20; 250тМ КС1), центрифугировали (4500 об/мин, 10 мин, 4°С). Клетки растворяли в 2 мл ТВ, добавляли ДМСО до 7% (140 мкл). Переносили клетки по 100 мкл в стерильные пробирки и хранили на -70°С.

Трансформация бактерий.

К аликвоте компетентных клеток добавляли Ю'МО"4 мкг плазмиды или лигазного материала и инкубировали во льду 15 мин. Прогревали 1 мин в водяной бане при 42°С, охлаждали во льду, добавляли 1мл среды SOC (2% Бакто-триптон; 0,55% бакто-' дрожжевой экстракт; 5М NaCl; 1М КС1; 0.01V 2М Mg2+(106); 0.01V 2М глюкозы) и растили 1 ч при 37°С. Рассевали на чашку со средой LB+arap с соответствующим антибиотиком и растили ночь при 37°С. Щелочное выделение плазмидпой ДНК.

Колонию, выросшую на чашке, сеяли в 5мл среды 2YT и растили 16-24 часа при 37°С. 3 мл культуры (последовательно по 1,5 мл) помещали в 1,7 мл пробирку, центрифугировали (13000 об/мин, 30 мин), удаляли супернатант. Ресуспендировали осадок в 200, мкл раствора (50 шМ глюкозы; 25 шМ Трис-HCl, рНБ.О; 10 шМ ЭДТА). Добавляли 400 мкл раствора (0,2 NNaOH; 1% SDS), мягко смешивали, инкубировали во льду 5 мин. Добавляли 200 мкл холодного ЮМ CH3COONH4, мягко смешивали, инкубировали во льду 15 мин, центрифугировали (13000 об/мин, 10 мин). Супернатант переносили в пробирку с 500 мкл изопропанола, смешивали и выдерживали, помешивая, при комнатной температуре до образования осадка. Центрифугировали (4000 об/мин, 5 мин). Растворяли осадок в 200 мкл 2М CH3COONH4, центрифугировали (13000 об/мин, 5мин). Супернатант переносили в пробирку с 200 мкл изопропанола,. смешивали и выдерживали, помешивая, при комнатной температуре до образования осадка, центрифугировали (13000 об/мин, 10' мин). Осадок промывали 70% этанолом, подсушивали 10 мин при комнатной температуре и растворяли в 50 мкл воды. Обработка ДНКрестриктазами.

Реакции проводили в соответствующих буферах с добавлением 5 ед. фермента на 1 мкг ДНК и инкубировали при температуре 37°С от 30 мин до 2 ч. Лигирование.

Реакцию проводили в лигазном буфере с АТФ (Fermentas) с добавлением 1-5 ед. ДНК-лигазы фага Т4 (Fermentas). На реакцию брали 1-7 мкг/мл ДНК. Соотношение молярных количеств вектора и вставки выбирали в соответствии с конкретным экспериментом. Реакцию вели 2-4 ч при комнатной температуре или 24 ч при +4°С. Выделение геномной ДНК из мух.

Готовили раствор А (0,1 М Трис-HCl, рН 9.0; 0.1 М ЭДТА; 1% ДЭПК).

Непосредственно перед выделением ДНК готовили рабочий раствор (9/10 V раствора А +

• »

1/10 V 10% SDS). Замаривали эфиром 60 - 120 мух, помещали их в пластиковую 1,5 мл пробирку, добавляли 500 мкл рабочего раствора и гомогенизировали мух при помощи пестика. Инкубировали гомогенат 1 ч при 65°С, добавляли 72 мкл СН3СООК, перемешивали, инкубировали во льду 30 мин и осаждали остатки мух центрифугированием (14000 об/мин, 5 мин). Супернатант переносили а новую пробирку, добавляли равный объем хлороформа, тщательно перемешивали и центрифугировали (14000 об/мин, 5-10 мин). Верхнюю фазу переносили в новую пробирку. Осаждали ДНК равным объёмом изопропанола, промывали 75% этанолом и растворяли в воде. Гель-электрофорез ДНК.

Для разделения фрагментов ДНК использовался 1% агарозный гель и 5% полиакриламидный гель. Электрофорез проводили в буферах lxTAE (2М Трис-HCl; 0,05М ЭДТА) и lxTBE (89 гаМ Трис-HCl; 89тМ Н2В04; 2тМ ЭДТА), соответственно.

PCR.

Для PCR использовали 10х PCR-буфер следующего состава: 0.1 М Tris-HCl, рН 8,6, 0,5 М КС1, 25 мМ MgCl2, 1 % Triton Х-100. Реакцию проводили в 1х PCR-буфере с добавлением dNTPs до 0,1 мМ, праймеров до 0,2 мкМ, полимеразы Taq/Pfu (10:1) до 0.05 ед/мкл, 50нг ДНК.

Секвенирование ДНК.

Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе фирмы Applied Biosystems 373А.

5. Работа с РНК.

Получение двухцепочечной РНК.

Двухцепочечные РНК синтезировали с геномной ДНК при помощи Arabion MEGA script Т7 kit. Для синтеза использовали следующие праймеры: дцРНК для РНК интерференции Е(у)2 - #1 и #2, дцРНК для РНК интерференции Xmas-2 - #3 и #4, дцРНК, соответствующая фрагменту вектора pBSK - #5 и #6.

Выделение РНК.

Выделение тотальной РНК из S2 клеток производили с помощью тризола по рекомендациям производителя (Invitrogene). Для выделения ядерной РНК S2 клетки лизировали в буфере (50 мМ Tris-HCl рН 8.0,- 140 мМ NaCl, 1.5 мМ MgCl2, 0.5% NP40, 1000 ед./мл RNase inhibitor, 1 мМ DTT), ядра осаждались центрифугированием. Для RT-PCR реакции для выделения тотальной и ядерной РНК использовали RNeasy Mini Kit (Qiagen).

RT-PCR.

Для реакции обратной транскрипции брали 2 мкг РНК и 0,3 мкл 10 мкМ олиго-dT праймера, добавляли воду до 5 мкл, нагревали до 65°С, помещали в лед на несколько минут. Добавляли 2 мкл 5xFSB (1х: 50 мМ Tris-HCl, рН 8,3, 75 мМ КС1, 3 мМ MgCl2), 1 мкл 0,1 М DTT, 1 мкл 10 мМ dNTPs, 0,3 мкл rRNAzin и 200 ед. SuperScript Ш (Invitrogene) и инкубировали 1ч при 42°С. ПЦР амплификация кДНК проводилась с использованием SYBR Green I на ПЦР приборе MiniOpticon instrument (BioRad). Использовались следующие праймеры (в скобках обозначено положение относительно первого нуклеотида кодирующей части гена): hsp70fwd (+1915), hsp70rev (+2066), E(y)2fwd (+137), E(y)2rev (+322), Xmas-2fwd (+396), Xmas-2rev (+580), trfjwd, trfrev, actinfwd, actinrev.

Нозерн-блот анализ.

Проводили форез в геле из 1 % агарозы в буфере lxFGRB (50х: 1 М MOPS рН 7,0, 0.5 М AcONa2, 50 mMEDTA) с добавлением формальдегида рН 4,0 до 2,2 М. polyA+ РНК (1.5 мкг) смешивали RNA loading mix (на одну пробу 0.2 мкл 50xFGRB, 1.75 мкл 12.3 М формальдегида, 5 мкл 100% формамида, EtBr), инкубировали 15 мин. при 65°С, помещали в лед на несколько мин.ут. К каждому образцу добавляли 1/10 объема RNA gel buffer (50 % глицерин, 1 М EDTA, 0.1 % бромфеноловый синий, 0.1 % ксиленцианол). Проводили 5-минутный префорез при напряженности 5 В/см, наносили образцы и производили дальнейший форез в тех же условиях.

После фореза гель отмывали 30 мин, инкубировали гель 30 мин. в том же объеме 20xSSC. Далее ставили 12-часовой капиллярный перенос в SSC той же кратности на мембрану Hybond N (Amersham). Затем фиксировали РНК на мембране ультрафиолетом. Помещали мембрану в HSB (f) (7% SDS, 50% формамид, 5х SSC, 2% сухое обезжиренное молоко, 50 мМ NaP, рН 7.0, 0,1 % N-Lauroylsarcosine Na, 50 мкг/мл ДНК спермы лосося) и проводили предгибридизацию 30 мин при 50°С. Затем добавляли в буфер меченый зонд и гибридизовали в течение ночи при 50°С. Отмывали мембрану от неспецифически связавшейся метки два раза по 15 мин при 68°С в I буфере для отмывки (lxSSC, 0,1 % SDS) и два раза по 25 мин во П буфере (0,3х SSC, 0,1 % SDS) для отмывки при той же температуре.

Для визуализации использовали Cyclone Storage Phosphor System (Packard Instrument Company). Для последующих гибридизаций мембрана опускалась на 1 мин. в кипящий раствор 0,5 % SDS.

6. Работа с белками.

Экспрессия и очистка рекомбинантных белков.

Для экспрессии рекомбинантных белков соответствующими конструкциями трансформировали клетки Е. coli BL21. Выросшими колониями инокулировали среду 2YT (ампицилин 50 мг/мл) и растили клетки до оптической плотности СЮбоо=0.6 с покачиванием при температуре 30°С. Затем индуцировали экспрессию белка добавлением в среду IPTG до концентрации 0.1-1 мМ. Экспрессию проводили в течение ночи. Клетки осаждали центрифугированием, осадок хранили при -20°С.

Из клеточных лизатов при помощи Ni-NTA агарозы выделяли рекомбинатные белки с гистидиновым тагом. Сначала клеточный осадок, полученный из 500 мл среды, ресуспендировали в 25 мл LB (50 мМ NaPj рН8.0, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол). Затем добавляли лизоцим до 0.4 мг/мл, инкубировали 30 мин. во льду, обрабатывали ультразвуком, центрифугировали 30 мин. на 12000 об/мин, супернатант наносили на колонку с 1 мл Ni-NTA агарозы, инкубировали, 1 ч при- 4°С. Отмывали смолу от несвязавшихся, белков 10 мл WB (50 мМ NaP! рН 8.0, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол). Элюировали связавшиеся с Ni-NTA агарозой белки в подходящем объеме ЕВ (50 мМ NaP, рН8.0, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол). Фракции, содержащие белок диализовали против PBS (1.7 мМ КН2Р04> 5.2 мМ Na2HPO«, 150 мМ NaCl) + 20% глицерин. В случае нерастворимого белка р2 осадок после лизиса клеток промывали, растворяли в буфере UB (8М мочевина, 100 мМ NaH2P04, 10 мМ Tris, рН 8.0, 10 мМ имидазол), далее очищали по той же процедуре с использованием буфера UB с добавлением имидазола. Связывание белков на глютатон-сефарозе.

Белок GST или белок, слитый с GST, в количестве 30 мкг связывались с глютатион сефарозой 4В (Pharmacia Biotech). Отмывали смолу от несвязавшегося белка раствором LBST-100 (50 мМ Tris-HCl рН8.0, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 20% глицерин, 0.1% Triton Х-100, 0.5 мМ DTT). Добавляли рекомбинантные белки Е(у)2 или TAF10 (по 50 мкг), связывание происходило в объеме 600 мкл в течение 2 часов. После инкубации смолу отмывали пять раз, увеличивая концентрацию NaCl (LBST-100, LBST-300 и LBST-500).

Получение антител и их очистка.

Для получения кроличьих антител кроликов иммунизировали каждые две недели интердермально смесью 1:1 адъюванта Фрейнда (Sigma) и рекомбинантного белка. (200500 мкг). Кровь сливали через 6-8 мес. и получали из нее сыворотку. Для получения мышиных антител мышей иммунизировали каждую неделю интердермально, использовали 20 мкг рекомбинантного белка. Сыворотку получали через 1-1,5 месяца.

Антитела- из сыворотки очищали аффинно. Для этого с BrCN-активированной сефарозой (Pharmacia) ковалентно сшивали антиген по методике производителя, полученную матрицу инкубировали с сывороткой, промывали PBS (1.7 мМ КН2Р04, 5.2 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCl), антитела элзоировали раствором 0.1 М глицин, рН 2.8. Необходимые фракции объединяли и диализовали против PBS с 20 % глицерина.

Белковый гель-электрофорез.

Разделение белков проводили при помощи электрофореза в акриламидном геле по стандартной методике: концентрирующий гель - 5 %.АА, 0.13 М Tris-HCl, рН 6.8, 0.1 % SDS, 0.1 % PSA, 0.1 % TEMED, разделяющий гель - 10 или 15 % АА, 375 мМ' Tris-HCl рН8,8, 0.1% SDS, 0.1% PSA, 0.08% TEMED. Стоковый раствор 30% АА: 29% акриламид, 1 % бис-акриламид. Использовался буфер TGB (25 мМ Tris, 250 мМ глицин, 0.1 % SDS). Для нанесения белковых препаратов на гель использовали 2х буфер для нанесения (50 мМ Tris-HCl, рН 6.8, 10 % глицерин, 4 % SDS, 4 мМ EDTA, 0Л М DTT, 0.1 % bromphenolblue). Разделение белков «проводили в камере MiniProtean П (Bio-Rad) в соответствии с методиками производителя.

Ядерный экстракт наносили в количестве 15-30 мкг. Использовали маркеры фирмы Amersham.

Вестерн-блот анализ.

Белки после электрофореза в акриламидном геле переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Amersham) в системе переноса MiniProtean П (Bio-Rad) по рекомендациям производителя. Далее проводили блокирование неспецифической сорбции, инкубируя мембрану в PBS с добавлением 3 % сухого обезжиренного молока (Fluka) 1 час. Инкубировали мембрану ночь (4°С) с первичными антителами (1:300 -1:1000) в буфере PBS, отмывали от несвязавшихся антител в буфере PBS с 0,05 % Tween-20. Затем инкубировали мембрану 1 час со вторичными анти-кроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Amersham). После отмывания мембраны от несвязавшихся вторичных антител проводили детектирование перенесенных белков с помощью ECL или ECL+ системы детекции (Amersham) по протоколу производителя.

Соосаждение белков антителами.

С proteinA-сефарозой (Pharmacia) связывали антитела в соответствии с > рекомендациями производителя. 100 мкл белкового экстракта в буфере IP 100 (25 мМ Tris-НС1, рН 7.9, 5 мМ MgCl2, Ю % глицерин, 100 мМ КС1, 0.1 % NP-40, 0.5 нг/мкл ДНКаза I) инкубировали с 10 мкл сефарозы в течение ночи (4°С). Затем осаждали сефарозу, отбирали супернатант, к осадку добавляли 100 мкл буфера IP500 (25 мМ Tris-HCl, рН 7.9, 5 мМ MgCb, 10 % глицерин, 500 мМ КС1, 0.1 % NP-40), отмывали 3 раза по 5 мин. Затем к осадку добавляли равный объем буфера для нанесения на форез. Суспензию кипятили, центрифугировали, супернатант наносили на форез.

Дот-блот анализ.

Для оценки аффинности антител наносили на нитроцеллюлозную мембрану последовательные разведения антигена (50, 10, 2, 0,4 нг) в растворе PBS + BSA (10 мг/мл) и проводили окрашивание антителами как при вестерн-блот анализе. Также наносили разведения BSA: 250, 100 и 50 нг.

7. Иммуноокрашнвание.

Иммуноокрашивание политенных хромосом.

В стаканы с кормом сажали мух линии Oregon на 1 сутки при25°С. Затем мух сбрасывали и выращивали личинок при 18°С до III стадии. Готовили буфер 10х TBS (0.1 МТрис-HCl, рН 7.5; 1.5 М NaCl). Личинки Ш стадии извлекали, препарировали слюнные железы в капле раствора I (TBS; 0.1% NP-40), удаляли основную часть жирового тела. Переносили слюнные железы в каплю раствора П (0.8х TBS, 3.7% ПФА, 1% NP-40) на 1530 с, удаляли остатки жирового. тела: Фиксировали препарат в капле раствора Ш (50% СН3СООН, 3.7% ПФА)' в течение 2 мин. Затем накрывали покровным стеклом, расправляли хромосомы надавливанием и вращательными движениями. Замораживали стекло в камере с жидким азотом в течение 20 мин, затем скалывали, покровное стекло. Отмывали препараты 10 мин в 100 мл lxTBS, инкубировали 30 мин в TBSTB (lx TBS, 10% сыворотки (Fetal Bovine Serum), 0.1% Tween20). Сыворотку перед употреблением инактивировали нагреванием при 56°С в течение 30 мин. Инкубировали препараты с первичными антителами, разведенными в TBSTB, при +4°С в1 течение 12 часов во влажной камере. В экспериментах использовались следующие комбинации афинно очищенных антител: мышиные против Е(у)2 (в разведении 1:20) вместе с кроличьими против GCN5 (в разведении 1:100)'; мышиные против Е(у)2 (в разведении 1:20) вместе с кроличьими против Su(Hw) (в разведенииЛ:1000). Промывали препараты 3 раза по 10 мин в TBS и инкубировали со вторичными антителами при комнатной температуре 1 час во влажной камере. В качестве вторичных антител использовали: антитела против IgG (H+L) кролика, коньюгированные с СуЗ (Amersham), антитела против IgG мыши, коньюгированные с Alexa Fluor 488 (Molecular Probes). После инкубации отмывали-препараты 3 раза по 10 мин в TBS и инкубировали с DAPI (Sigma). Промывали препараты в TBS 5 мин и заключали в Vectashield (Vector Laboratories). Результаты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Leica DMR/HC5, оснащенного НСХ PZ Fluotar 100х/1.3 объективом и CCD DC 350 F камерой. Иммуноокрашивапие S2 клеток.

Прикрепившиеся к покровным стеклам, S2 клетки дважды промывали PBS, фиксировали 3.7% ПФА 10 мин, промывали PBS три раза по 5 мин, затем обрабатывали 0.2% раствором Triton Х-100 5 минут, промывали PBS три раза по 5 минут, 10 мин инкубировали в 3% обезжиренном сухом молоке, разведенном на PBS. Первичные антитела разводили в 3% молоке/PBS, препараты инкубировали с антителами 1 час при комнатной температуре во влажной камере. Использовали следующие антитела: мышиные против Е(у)2 (в разведении 1:20), афинно очищенные антитела - кроличьи против Е(у)2 (в разведении 1:100), кроличьи против GCN5 (в разведении 1:200), кроличьи против ADA2b (в разведении 1:200), кроличьи против TAF1 (в разведении 1:400), кроличьи против Xmas-2 (в разведении 1:100), мышиные антитела против ламина DmO (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Department of Biological Sciences) (в разведении 1:500), мышиные антитела к NPC компонентам Mab414 (Abeam) (в разведении 1:500). Промывали препараты в PBS три раза по 5 минут, затем препараты инкубировали со вторичными антителами 1 час при комнатной температуре. В качестве вторичных антител использовали: антитела против IgG (H+L) кролика, коньюгированные с СуЗ (Amersham), антитела против IgG мыши, коньюгированные с Alexa Fluor 488 (Molecular Probes). Промывали препараты 3 раза по 5 мин в lxPBS и инкубировали с DAPI (Sigma). Отмывали препараты в PBS 5 мин и заключали в Vectashield (Vector Laboratories). Результаты анализировали при помощи конфокального микроскопа Leica TCS SP2.

8. Гибридизация in situ.

РНКin situ гибридизация с СуЗ-oligo-dl'праймером:,

Прикрепившиеся к покровным стеклам S2 клетки фиксировали 3:7%ЛФА 10 мин. Затем проводили предгибридизацию 15'минут при комнатной температуре в растворе 2xSSC (3 М NaGl, 0.3 М Na3e6H507) с 20% формамида. СуЗ-меченый oligo-dT праймер длиной* в 50 п:н. (Синтол) растворяли- в гибридизационном растворе (2xSSC, 20% формамид, 10% dextran sulfate, 1. мкг/мкл тРНК дрожжей, 5 мкг/мкл BSA) в концентрации 0.4 пмоль/мкл, гибридизацию проводили в 10 мкл раствора ночь при, 37°С во влажной камере. Промывали препараты в следующих растворах: при 42°С - три раза по 5 мин в 2xSSC/20% формамид, три раза по 5 мин в 2xSSC, один раз 5 мин в lxSSC, при комнатной > температуре - один раз 5 мин в PBS. Затем инкубировали препараты в :3% обезжиренном сухом молоке, разведенном на PBS, и проводили иммуноокрашивание клеток антителами, к л амину DmO в соответствии с описанным выше протоколом. ДНК in situ гибридизациях зондом к индивидуальному гену.

Прикрепившиеся к покровным стеклам S2 клетки: фиксировали в растворе (3.7% ПФА, 50 мМ MgCb, lxPBS) 10 мин. Промывали препараты PBS три раза по 5 минут, затем охлажденными спиртовыми, растворами 70%, 80%, 96%) по 5 минут каждым. Сначала обрабатывали препараты* РНКазой А (в 2xSSC, 100 мкг/мл) 1 час при 37°С. После промывки три раза по 5 мин в 2xSSC препараты инкубировали с 0.01% pepsine (в 10 мМ НС1) 10 мин при 37°С. Промывали два раза PBS по 5 мин, один раз PBS/50 мМ MgCb 5 мин. Проводили постфиксацию раствором (1% ПФА, 50 мМ MgCl2, lxPBS) 10 мин при комнатной температуре. Промывали препараты три' раза PBS по 5 мин, затем охлажденными спиртовыми растворами. В качестве зондов использовали следующие праймеры: для hsp70 генов - ПЦР фрагмент длиной 2405 п.н. (праймеры #7 и #8); для trf2 гена - полноразмерный кДНК (DQ162845) клон в векторе pBlueScripffl SK-. Пробы были помечены биотинилированным 16-dUTP с использованием Biotin-Nick Translation Mix

Roche) по протоколу производителя. Пробу переосаждали и растворяли в гибридизационном растворе (2xSSC, 50% формамид, 1% Tween-20, 10% dextran sulfate, 1 мкг/мкл тРНК дрожжей и 0.5 мкг/мкл ДНК спермы лосося, обработанной ультразвуком) в конечной концентрации 2-5 нг/мкл. 10 мкл полученного раствора наслаивали на препарат, прогревали при 75°С 5 мин и гибридизовали ночь при 37°С во влажной камере. Последовательно промывали препараты в следующих растворах: при комнатной температуре - 10 мин в 2xSSC, при 45°С - два раза по 10 мин в 2xSSC/50% формамид, при 55°С - 5 мин в O.lxSSC. Затем прогибридизовавшиеся пробы были визуализированы при помощи трех последовательных инкубаций препаратов с авидином, меченым TRITC (Invitrogen) (в разведении 1:100), и антителами к авидину, меченых биотином (Vector Laboratories) (в разведении 1:100). Между инкубациями препараты промывали три раза по 5 мин раствором 4xSSC/0.05% Tween-20. ДНК окрашивали DAPI. Промывали препараты в PBS 5 мин и заключали в Vectashield (Vector Laboratories). Результаты анализировали при помощи конфокального микроскопа Leica TCS SP2.

9. Электронная микроскопия.

Ультра тонкие криосекции S2 клеток дрозофилы были иммуноокрашены в соответствии с методикой (153). Клетки фиксировали 2.5% ПФА и 0.1% глюторальдегидом 1 час. Свободные альдегиды блокировали в растворе 0.2% глицина в. PBS. Клетки помещали в 10% желатин и осаждали. Затем из этого клеточного осадка были сформированы замороженные кубики. При помощи крио-иммунного алмазного ножа (Diatome) с использованием криоультрамикротома (UM6-Leica) были получены секции толщиной 100 нм. Далее секции были обработаны афинно очищенными антителами против Е(у)2 (в разведении 1:1000-1:200) с использованием аппарата автоматического мечения (IGL, Leica). Первичные антитела проявляли при помощи протеина А, меченого частицами золота. Секции были проинкубированы с methylcellulose-uranyl acetate.

Результаты анализировали при помощи трансмиссионного Philips СМ 120 при значении ускоряющего напряжения в 80В. электронного микроскопа

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Куршакова, Мария Михайловна

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что белок Е(у)2 входит в состав SAGA/TFTC транскрипционного комплекса дрозофилы.

2. Показано, что Е(у)2 образует комплекс с белком Xmas-2.

3. Показано, что комплекс, содержащий Е(у)2 и Xmas-2, ассоциирован с ядерной порой и участвует в организации экспорта мРНК из ядра в цитоплазму.

4. Показано, что часть Е(у)2-содержащих SAGA/TFTC комплексов находится в контакте с ядерными порами.

5. На модели кластера SAGA/TFTC-зависимых генов теплового шока hsp70 исследованы функции Е(у)2: Е(у)2 в комплексе с Xmas-2 осуществляет прикрепление hsp70 локусов к ядерной поре, участвует в экспорте hsp70 мРНК и активирует транскрипцию hsp70 генов.

6. Показано, что Е(у)2 связывается с белком Su(Hw) и присутствует на последовательностях 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов.

Таким образом, в настоящей работе охарактеризованы функции нового эволюционно консервативного активатора транскрипции D.melanogaster - белка

Е(у)2.

109

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает сердечную благодарность коллегам, внесшим вклад в данную работу: Копытовой Дарье Владимировне, Шидловскому Юлию Валерьевичу, Максименко Оксане Геннадьевне, Головнину Антону Клеменсовичу, Николенко Юлии Владимировне, Набирочкиной Елене Николаевне, Лебедевой Любови Александровне, Воробьевой Надежде, а также своим научным руководителям Краснову Алексею Николаевичу и Георгиевой Софии Георгиевне за их терпеливое и чуткое руководство. Хочется поблагодарить также Георгиева Павла Георгиевича за его искреннюю заинтересованность в работе автора и ценные советы. Искреннюю благодарность автор выражает оппонентам и рецензентам данной работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Куршакова, Мария Михайловна, 2008 год

1. Abruzzi, К. С., D. A. Belostotsky, J. A. Chekanova, К. Dower, and М. Rosbash.2006. З'-end formation signals modulate the association of genes with the nuclear periphery as well as mRNP dot formation. EMBO J. 25:4253-4262.

2. Abruzzi, К. C., S. Lacadie, and M. Rosbash. 2004. Biochemical analysis of TREX complex recruitment to intronless and intron-containing yeast genes. EMBO J. 23:26202631.

3. Akhtar, A. and S. M. Gasser. 2007. The nuclear envelope and transcriptional control. Nat. Rev. Genet. 8:507-517.

4. Andrulis, E. D., A. M. Neiman, D. C. Zappulla, and R. Sternglanz. 1998. Perinuclear localization of chromatin facilitates transcriptional silencing. Nature 394:592-595.

5. Andrulis, E. D., D. C. Zappulla, A. Ansari, S. Perrod, С. V. Laiosa, M. R. Gartenberg, and R. Sternglanz. 2002. Escl, a nuclear periphery protein required for Sir4-based plasmid anchoring and partitioning. Mol. Cell Biol. 22:8292-8301.

6. Bell, A. G. and G. Felsenfeld. 1999. Stopped at the border: boundaries and insulators. Curr. Opin. Genet. Dev. 9:191-198.

7. Brand, M., C. Leurent, V. Mallouh, L. Tora, and P. Schultz. 1999. Three-dimensional structures of the TAFII-containmg complexes TFITO and TFTC. Science 286:2151-2153.

8. Brand, M., K. Yamamoto, A. Staub, and L. Tora. 1999. Identification of TATA-binding protein-free TAFII-containing complex subunits suggests a role in nucleosome acetylation and signal transduction. J. Biol. Chem. 274:18285-18289.

9. Brasset, E. and C. Vaury. 2005. Insulators are fundamental components of the eukaryotic genomes. Heredity 94:571-576.

10. Brickner, D. G., I. Cajigas, Y. Fondufe-Mittendorf, S. Ahmed, P. C. Lee, J. Widom, and J. H. Brickner. 2007. H2A.Z-mediated localization of genes at the nuclear periphery confers epigenetic memory of previous transcriptional state. PLoS. Biol. 5:e81.

11. Brickner, J. H. and P. Walter. 2004. Gene recruitment of the activated INOl locus to the nuclear membrane. PLoS. Biol. 2:e342.

12. Brownell, J. E., J. Zhou, T. Ranalli, R. Kobayashi, D. G. Edmondson, S. Y. Roth, and C. D. Allis. 1996. Tetrahymena histone acetyltransferase A: a homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84:843-851.

13. Cai, H. N. and P. Shen. 2001. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. Science 291:493-495.

14. Capell, В. С. and F. S. Collins. 2006. Human laminopathies: nuclei gone genetically awry. Nat. Rev. Genet. 7:940-952.

15. Caron, С., C. Boyault, and S. Khochbin. 2005. Regulatory cross-talk between lysine acetylation and ubiquitination: role in the control of protein stability. Bioessays 27:408415.

16. Carre, C., D. Szymczak, J. Pidoux, and C. Antoniewski. 2005. The histone H3 acetylase dGcn5 is a key player in Drosophila melanogaster metamorphosis. Mol. Cell Biol. 25:8228-8238.

17. Carrozza, M. J., R. T. Utley, J. L. Workman, and J. Cote: 2003. The diverse functions of histone acetyltransferase complexes. Trends Genet. 19:321-329.

18. Casolari, J. M., C. R. Brown, D. A. Drubin, O. J. Rando, and P. A. Silver. 2005. Developmentally induced changes in transcriptional program alter spatial organization across chromosomes. Genes Dev. 19:1188-1198.

19. Casolari, J. M., C. R. Brown, S. Komili, Ji West, H. Hieronymus, and P. A. Silver.2004. Genome-wide localization of the nuclear transport machinery couples transcriptional status and nuclear organization. Cell 117:427-439.

20. Ciurciu, A., O. Komonyi, T. Pankotai, and I. M. Boros. 2006. The Drosophila histone acetyltransferase Gcn5 and transcriptional adaptor Ada2a are involved in nucleosomal histone H4 acetylation. Mol. Cell Biol. 26:9413-9423.

21. Clements, A., J. R. Rojas, R. C. Trievel, L. Wang, S. L. Berger, and R. Marmorstein. 1999. Crystal structure of the histone acetyltransferase domain of the human PCAF transcriptional regulator bound to coenzyme A. EMBO J. 18:3521-3532.

22. Comet, I., E. Savitskaya, B. Schuettengruber, N. Negre, S. Lavrov, A. Parshikov, F. Juge, E. Gracheva, P. Georgiev, and G. Cavalli. 2006. PRE-mediated bypass of two Su(Hw) insulators targets PcG proteins to a downstream promoter. Dev. Cell 11:117-124.

23. Dellino, G. I., Y. B. Schwartz, G. Farkas, D. McCabe, S. C. Elgin, and V. Pirrotta.2004. Polycomb silencing blocks transcription initiation. Mol. Cell 13:887-893.

24. Demeny, M. A., E. Soutoglou, Z. Nagy, E. Scheer, A. Janoshazi, M. Richardot, M. Argentini, P. Kessler, and L. Tora. 2007. Identification of a small TAF complex and its role in the assembly of TAF-containing complexes. PLoS. ONE. 2:e316.

25. Dhalluin, C., J. E. Carlson, L. Zeng, С. He, A. K. Aggarwal, and M. M. Zhou. 1999. Structure and ligand of a histone acetyltransferase bromodomain. Nature 399:491-496.

26. Dieppois, G., N. Iglesias, and F. Stutz. 2006. Cotranscriptional recruitment to the mRNA export receptor Mex67p contributes to nuclear pore anchoring of activated genes. Mol. Cell Biol. 26:7858-7870.

27. Dorsett, D. 1999. Distant liaisons: long-range enhancer-promoter interactions in Drosophila. Curr. Opin. Genet. Dev. 9:505-514.29.