Азотная регуляция биосинтеза авермектинов у штаммов Streptomyces avermitilis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Сергеева, Алла Владимировна

• Сергеева, Алла Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сергеева, Алла Владимировна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Характеристика группы макролидных антибиотиков.

2.2. Макролидный антибиотик авермектин.

2.2.1. Структурная формула авермектинов.

2.2.2. Биогенез агликона авермектинов и его предшественников.

2.2.3. Биогенез дисахарида олеандрозы.

2.3. Механизмы регуляции биосинтеза макролидных антибиотиков.

2.3.1. Углеродная регуляция биосинтеза антибиотиков.

2.3.1.1 .Катаболитная регуляция биосинтеза поликетидных антибиотиков углеродсодержащими субстратами.

2.3.1.2.Катаболитная регуляция углеродом биосинтеза макролидного антибиотика авермектина.

2.3.2.Фосфорная регуляция биосинтеза антибиотиков.

2.3.3.Азотный контроль биосинтеза антибиотиков у актиномицетов.

2.3.3.1.Азотные метаболиты - предшественники антибиотиков.

2.3.3.2.Ассимиляция азота актиномицетами и связь источника азотного питания с вторичным метаболизмом.

2.3.3.3.Азотная регуляция вторичного метаболизма.

2.3.3.4.Особенности азотного контроля в биосинтезе авермектинов.

2.4.Культивирование БйерШтусеБ ауегтШШ, штамма-продуцента авермектинов.

2.4.1 .Данные о штаммах 81тер1отусеБ ауегтйШз, используемых в биосинтезе авермектинов.

2.4.2.Питательные среды, используемые для культивирования штаммов-продуцентов авермектина.

3.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4 .РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 .Влияние различных источников азота на биосинтез авермектинов и соотношение компонентов в авермектиновом комплексе при культивировании штаммов 3\герШтусе& ауегтШШ.

4.1.1.Влияние азотсодержащих компонентов питательной среды на соотношение компонентов «а» и «в» авермектинов.

4.1.2.Влияние отдельных аминокислот, участвующих в биосинтезе авермектинов.

4.1.3 .Разработка метода определения активности треониндезаминазы (ТД) в суспензии клеток.

4.2.Изучение роли метаболизма треонина в биосинтезе авермектина.

4.3.Влияние аминокислот в составе посевной среды на биосинтез авермектинов.

4.4.Регуляция биосинтеза авермектинов Ь-лизином при глубинном культивировании штамма 81гер1отусе8 ауегтШШ 103.

4.4.1.Влияние Ь-лизина на биосинтез авермектинов у штамма ЗггерШтусе^ ажгтШШ 103.

4.4.2.Определение оптимальной для биосинтеза концентрации Ь-лизина, вносимого в посевную среду.

4.4.3.Вероятный механизм воздействия лизина на биосинтез комплекса авермектинов.

4.4.4.Влияние Ь-лизина, вносимого в посевную среду, на биосинтез авермектина.

4.5.Азотная регуляция биосинтеза авермектинов при глубинном культивировании штамма-продуцента $1гер1отусех сметШИв 103.

4.5.1.Азотная регуляция соотношения компонентов В1а и В1в при биосинтезе З^рШтусея смегтЫйт 103.

4.6.Разработка регулируемого биосинтеза авермектинов.

5.Разработка биотехнологического способа получения авермектинов с помощью штамма

81герПтусе$ ауегтШШ 103.

5.1 .Характеристика штамма-продуцента авермектина, условия его поддержания и хранения.

5.1.1.Описание культурально-морфологических признаков продуцента.

5Л.2.Хранение штамма $\гер1отусе$ ачегтШШ 103.

5.2.Поддержание штамма в активном состоянии и наработка производственной партии посевной культуры.

5.2.1. Получение моноизолятов культуры.

5.2.2,Определение активности моноизолятов и отбор лучших вариантов. 100 5.2.3.Наработка производственной партии посевной культуры.

5.3. Технологическая схема получения авермектинов.

5.4. Аппаратурная схема получения авермектинов.

5.5.Изложение технологического процесса.

6.ВЫВОД Ы.ИЗ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Азотная регуляция биосинтеза авермектинов у штаммов Streptomyces avermitilis»

Актуальность темы. Из нескольких тысяч известных антибиотиков в ветеринарной практике используется около 20, причем в основном антибиотики медицинского назначения, что приводит к возникновению проблем, связанных с возникновением резистентных клинических штаммов микроорганизмов. Поэтому правильным является путь создания новых антибиотиков, используемых только в ветеринарной практике. Примером таких антибиотиков может служить авермектин, который обладает беспрецедентной активностью и широким спектром антипаразитарного действия при низком уровне токсичности. Он вызывает гибель нематод различных животных, паразитов крупного рогатого скота. Спектр действия авермектинов не ограничивается эндопаразитами, в низких дозах антибиотик активен в отношении личинок подкожных оводов, зеленых мух, его действие губительно для клещей, вшей, блох, тараканов, двукрылых и прямокрылых вредителей, платяной моли, ковровых и обойных жучков. Токсичность авермектинов для беспозвоночнных обусловлена их способностью блокировать передачу нервного импульса в нервно-мышечном синапсе, что ведет к параличу, а затем и гибели паразитов. Такой механизм действия уникален и до сих пор не обнаружен у известных антипаразитарных соединений [72,135]. Сущность этого механизма заключается в стимуляции авермектином выброса ионов хлора, которые приводят к деполяризации клеточной мембраны, а, следовательно, и к нарушению ее функционирования. Авермектины оказывают в отношении паразитов как нейротоксическое, так и ингибирующее синтез хитина действия. 5

Благодаря этому, препараты на основе авермектинов и их полуеинтетичееких производных находят широкое применение в ветеринарии для профилактики и лечения инвазионных болезней сельскохозяйственных животных.

Исследования последних лет показали также эффективность ивермектина при воздействии на клетки лимфатической лейкемии в медицинской практике при лечении онкологических заболеваний [47].

В биологическом отношении наиболее активными являются авермектины группы В1, которые представляют наибольший практический интерес. В частности известный коммерческий препарат «ивермектин» содержит только авермектины В1 ( 80% авермектина В1а и 20% авермектина В1в).

Дальнейшие исследования в области физиологии, объяснение биохимии и генетики продуцента авермектинов может способствовать созданию новых высокопродуктивных штаммов, синтезирующих преимущественно требуемые компоненты авермектинового комплекса, а также созданию эффективных технологий культивирования продуцента авермектинов.

Настоящая диссертационная работа является частью комплексного исследования по созданию высокоактивных штаммов продуцентов, разработке технологий ферментации, выделения и очистки антигельминтного, антипаразитарного продукта макролидной природы авермектина В1 (абамектина) проводимого в научно-исследовательском центре БИОАН г.Москва и лаборатории биотехнологии продуцентов антибиотиков ГУН «ГосНИИсинтезбелок» г.Москва. Диссертант как соискатель был прикреплен к кафедре «Экология и промышленная биотехнология» МГУИЭ. б

Цель исследования. Создание рентабельной технологии биосинтеза авермектинов при использовании высокоактивных штаммов Streptomyces avermitilis, обеспечивающей максимальный выход авермектинов группы В1 в целевом продукте.

Задачи исследования. Выявление факторов азотного контроля, влияющих на уровень антибиотической активности штамма S.avermitilis, а также соотношение компонентов в синтезируем авермектиновом комплексе.

Научная новизна результатов. Установлена связь источника азотного питания и уровнем продуктивности мицелия штамма продуцента авермектина. Влияние азотсодержащего компонента среды обусловлено не только его концентрацией, отражаемой параметром C/N среды, но и качественным составом азотного субстрата. Впервые у установлена регуляторная роль метаболизма треонина (in vivo) в биосинтезе авермектинов.

Для определения активности ключевого фермента метаболизма треонина - треониндезаминазы (ТД), разработан быстрый и удобный способ измерения активности ТД (in vitro).

Установлена регуляторная роль некоторых аминокислот на биосинтез авермектинов и соотношение компонентов в комплексе. Внесение L-лизина в оптимальной концентрации в посевную среду повышает продуктивность процесса на 76% и увеличивает долю авермектинов группы «В» в комплексе с 46 до 56 % при использовании мутантного штамма S.avermitilis 103 (Патент РФ №2098483).

Практическая ценность результатов. Получен мутантный штамм S.avermitilis 103, способный синтезировать 1,5 г/л авермектинов (в том числе 0,7 г/л авермектина В1 в комплексе). Продуктивность штамма 103 7 в 30 раз выше по сравнению с таковой у исходного штамма АТСС31271. Разработан регулируемый биосинтез авермектина в лабораторных условиях, увеличивающий суммарный синтез авермектинового комплекса до 2,5 г/л, а также разработана технология (лабораторный регламент, маршрутная технология), на основании которых осуществляется промышленный биосинтез авермектинов в условиях ОАО «Биохимик» г.Саранска с использованием штамма ^герготусея ауегтШШ 103.

Из исходного штамма БшегтШШ 103 впоследствии были получены новые штаммы, обладающие улучшенными биотехнологическими свойствами и способные продуциировать авермектинов не менее 3,5г/л, и авермектина В1(а+в) не менее 1,5г/л [13,14].

На защиту выносится. Изучение азотной регуляции биосинтеза авермектинов у штаммов Б.ауегтШШ , которое позволило установить важную роль аминокислот, входящих в состав азотных субстратов среды. Доказательства значимости метаболизма треонина в биосинтезе авермектинового комплекса и быстрый, удобный метод определения ключевого фермента метаболизма треонина - треониндезаминазы. Эффективная технология получения антипаразитарного препарата, созданная на основе регулируемого биосинтеза авермектинов.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 работ и получен 1 патент РФ на штамм и способ получения авермектинов.

Диссертация содержит 125 страниц текста, 12 рисунков, 24 таблицы. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, результаты и обсуждения полученных результатов, выводы и списка литературы.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Сергеева, Алла Владимировна

выводы

1. Влияние азотсодержащего компонента среды на биосинтез авермекгинового комплекса обусловлено качественным составом азотного субстрата, в частности, содержанием в нем аминокислот, влияющих на продуктивность авермектинов.

2. Установлена важная роль некоторых аминокислот, главным образом, участвующих в синтезе компонентов авермектина непосредственно (метионин, изолейцин, валин), а также являющихся промежуточными метаболитами в биосинтезе изолейцина (треонин, а -кетобутират), или влияющие на биосинтез изолейцина косвенно (лизин) в азотном контроле биосинтеза препарата авермектин.

3. Доказана значимость метаболизма треонина (in vivo) в биосинтезе авермектинов. Разработан удобный и быстрый способ определения активности ключевого фермента метаболизма треонина -треониндезамйназы (ТД).

4. Повышенная активность ТД при глубинном культивировании штаммов (мутантов) S.avermitilis сопровождалась увеличением синтеза компонентов "В" в авермектиновом комплексе:

-в мицелии мутантов, устойчивых к аналогу треонина;

-при использовании лизина в посевной среде в оптимальных концентрациях.

5. Получен штамм S.avermitilis 103, способный синтезировать 1,5г/л авермектинового комплекса и в том числе 0,7г/л авермектина В1 и обнаружено, что использование лизина в посевной среде в концентрации 0,2% позволило в культуре штамма S.avermitilis 103

114 увеличить общий синтез авермектинов на 76% и увеличить на 10% синтез авермектинов "В" (Патент РФ № 2098483).

6. Регулируемый биосинтез авермектинов, включающий в себя дробную подачу глюкозы в процессе ферментации продуцента авермектинов, позволяет в лабораторных ферментерах увеличить суммарный синтез авермектинового комплекса до 2,5 г/л.

7. Биотехнологический способ получения авермектинов реализован на ОАО «Биохимик», где осуществляется промышленная наработка авермектинсодержащей культуральной жидкости в промышленных ферментерах вместимостью 10 м3. (Акт о проведении ферментаций аверсектина с использованием штамма З.ауегшШНз 103 в цехе 10а ОАО «Биохимик» от 14 ноября 1999г).

115

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сергеева, Алла Владимировна, 2001 год

1. Безбородой A.M. Биохимические основы регуляции синтеза антибиотиков. //Сб. Механизмы биосинтеза антибиотиков. М.-1986-С.34-45.

2. Бирюков В.В, Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза.//М. «Наука».-1985-С.27-44.

3. Бибикова М.В., Рыбакова A.M., Востров С.Н., Иваницкая Л.П. Оптимизация состава ферментационных сред для биосинтеза циклоспорина АЛ Успехи в области изучения и производства антибиотиков. -1991 -Вып. 18-С. 15-20.

4. ГерасимоваТ.В., Яненко A.C., АстауроваО.Б., Полякова И.Н., Погорелова Т.Е., Пауков В.Н. Регуляция утилизации нитрилов у Rhodocoecus. //Биотехнология-1995-№7-8-С. 139-144.

5. Danilenko V.N., Mironov V.A., Elizarov S.M. Calcium-induced alterations in the functioning of protein serine/threonine and tyrosine kinases in Streptomyces fradiae cells.// IUBMB Life-2000-V.50-N2-P.139-143.

6. Елизаров C.M., Миронов B.A., Даниленко В.Н. Изменение серин/ треонин протеинкиназной активности во время роста у дикого штамма Streptomyces avermitilis и хлорамфениколустойчивого мутанта. //Микробиология-2000-Т.69-№3-С.345-351.

7. Миронов В.А., Бобылева Р.И., Даниленко В.Н. Возможная роль метаболизма треонина в биосинтезе тетрациклинов.//Антибиотики и химиотерапия -1995- Т.40 № З-с.52-56.

8. Патент СССР 1.806.198, 1993.116

9. Патент США №4.310.519, 1982. Ю.Патент США №4.310.519,1978. И.Патент США №4.412.991, 1983.

10. Патент Японии № 238247,1989.

11. Патент Россия №2125609,1999.

12. Патент Россия №2147320, 2000.

13. Ждан-Пушкина С.М. Основы роста культур микроорганизмов. Ленинград-1983- С. 17-53.

14. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток.М,-1978.- С.110.

15. Aharonowitz Y. Nitrogen metabolite regulation of antibiotic biosinthesis. //Annu. Rev. Microbiol.- 1980,- V.34.- P.209.

16. Aharonowitz Y., Demain A.L. Nitrogen nutrition and regulation of cephalosporin prodaction in Streptomyces clavuliverus. // Can. J. Microbiol.-1979.- V.25.- P.61.

17. Ahmed Z.U., Shapiro S., and Vining N.C. Excrection of a-ketiacids by strain of Streptomyces venezuelae. //Can. J. Microbiol.-1984.-V.30,- P. 1014.

18. Albers-Schonberg G., Aristón B.H., Chabala J.C., Douglas A.W., Eskola P. Fisher M.H., Lusi A., Mrozik, Hsmith J.L. and Tolman R.L.//J.AM.117

19. Chem.Soc., 18th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1 -4 October 1978.

20. Albers-Schonberg G.,B.H. Ariston,J.C. Chabala,A.W. Douglas,P .Eskola, M.H. Fisher, A.Lusi, H.Mrozik, J.L.Smith, and R.L.Tolman. Avermectins Structure Determination.//J.Am.Chem.Soc.-1981 .-V. 103-P.4216-4221.

21. Arena J.P. Liu K.K., Paress P.S., Cully D.F. Avermectin-sensitive chloride currents induced by Caenorhabditis elegans RNA in Xenopus oocytes. //Mol.Pharmacol.-1991 -V.40-P.368.

22. Basak K.,Majumdar S.K. Utilisation of carbon and nitrogen sources by Streptomyces kanamyceticus for canamycin prodaction. // Antimicrob. Agents Chemother.-1973.-V.4.-P.6-10.

23. Bascaran V., Sanchez L., Hardisson C., Brana,A.F. Stringent response andinitiation of secondary metabolism in Streptomyces clavuligerusJ/ J.Gen.Microbiol.-1991 -V. 137.- P. 1625-1634.

24. Birch A.J. Biosynthesis of polyketides and related compounds // Science.-1967,- V.156.- P.202-206.

25. Brana A.P., Wolfe S., Demain A.L. Ammonium repression of cephalosporin prodaction in Streptomyces clavuliverus. //Can. J. Microbiol.1985,- V.31.- P.736.

26. Brana A.P., Paiva N., Demain A.L. Pathways and regulation of ammonium assimilation in Streptomyces clavuliverus. //J.Gen. Microbiol.1986.-V.132.-P.1305.

27. Britz M.L., and Demain A.L. Regulation of metabolite synthesis, in Conpr. Biotechnology. //Dalton H., Ed.Press.Oxford.- 1985,- V.I.- P.617.118

28. Burg R.W., Miller B.M., Baker E.E. et.al. Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: producing organism and fermentation. // Antimicrobical. Agents, and Chemotherapy.- 1979.- V.15.- N.3.-P361-361.

29. Bu Lock J.D., Morris G.A., Richards M.K. Biosynthetic origins of the large macrolides, oligomicin A.// Tetrahedron Lett.-1986-V.27.-P.2917-2920.

30. Cane D.E., Liang T.C., Kaplan L.K., Nallin,M.K., Schulman M.D., HensensO.D., Douglas A.W., Albers-Schonberg O. Biosynthetic origin of the carbon skeleton and oxygen atoms of the avermectins.// J.Am.Chem.Soc. -1983-V.105- P. 4110-4112.

31. Chatterjee S., Vining L.C., and Westake D.W.S. Nutritional requirments for chloramphenicol biosynthesis in Streptomyces venezuelae. // Can. J. Microbiol.- 1983- V.29- P.247.

32. Chen T.S., Arison B.N.,Gullo VP.Jnamine. Further studies on the biosynthesis of avermectins.// J.Ind.Microbiol.-1989-V.4-P.231-238.

33. Chen T.S., Hensens O.D., Schulman M.D. Biosynthesis // In Ivermectin and Avermectin; Campbell,W.C., Ed.:Springer-Verlag.New York.-1989-P.55.

34. Chen T.S., Inamin E.S., Hensens O.D., Zink D., Ostlind D A. Directed biosynthesis of avermectins.//Arsh.Biochem.Biophys.-l989-V.269-P.544~ 547.

35. Cimburkova E., Novak J., Zima J., Vanek Z. Control of avermectin biosynthesis in Streptomyces avermitilis by nitrogen compounds.// Folia Microbiol.-1989-V.34- P.418.119

36. Cimburkova E., Zima J., Novak J., Vanek Z. Nitrogen regulation of avermectins biosynthesis in Streptomyces avermitilis in a chemically defined medium. //J.Basic Microbiol.- 1988- V.28- P.491-499.

37. Crandall L.W., Hamill R.L. Antibiotics Produced by Streptomyces: Major Strraetural classes // In: Antibiotic-producing Streptomyces, The Bacteria eds. Queener S., Day L.E. Acad. Press, Orlando, Florida.-1986-. V.9-P. 55-391.

38. Curdova E., Jechova V., Zima J., and Vanec Z. The effect of inorganic phosphate on the production of avermectin in Streptomycts avermitilis. // J. Basic Microbiology.- 1989- V.29- P.341-346.

39. Curdova E., Kremen A., Vanec Z., and Hostalek Z., Regulation and biosynthesis of secondary metabolites. XVIII Adenylate level and Chlortetracycline prodaction in Streptomycts aureofaciens. // Folia Microbiol.- 1976- V.21- P.481-487.

40. Dalton H. Utilization of inorganic nitrogen by microbial cell. // Int. Rev.Biochem.- 1979- V.21- P.227.

41. Demain,A.L. Carbon source regulation of idiolite biosynthesis in actinomycetes. // In S.Shapiro (ed). Regulation of Secondary Metabolism in Aetinomycetes,CRC Press,Boca Raton,EL.-1989- P.127-134.

42. Demain A.L., Kupka J., Shen Y.Q., and Wolfe S. Microbiological synthesis of ß-lactam antibiotics, in Trends in Antibiotics Research. Umezawa H., Demain A.L., Hata T., Hutchinson C.R., // Eds. Japan Antibiotics Research Associations. Tokio.-1982- P.233.

43. Demain A.L. Mutation and the production of secondary metabolites. //Adv. Appl. Microbiol. -1973-V.16-P. 177-202.120

44. Dekleva M.L., Titus J A., and Strohl W.R. Nutrient effects on antracycline production by Strptomyces peucetius in a defined medium. I I Can. J. Microbiol.- 1985- V.31- P.287.

45. Didier A, Loor F. The abamectin derivative ivermectin is potent P-glycoprotein ingibitor./ZAnticancer Druds-1996-V.7-N7-P.745-751.

46. Donin M.N., Pogano J., Dutcher J.D., McKee C.M. Methymycin, a new crystalline antibiotic // Antibiot.Annu.- 1954-1955- P. 179-185.

47. Dutton C.J. Gibson S.P., Goudie A.C., Holdom K.S. Pacey M.S. Ruddock J.C. Bu Lock J.D., Richards M.K. Novel avermectins produced by mutational biosynthesis.//J.Antibiotics.-1991- V.44-P.357-365.

48. Fisher S.H. Glutamat synthesis in Streptomyces// Gene.- 1992-V.115.-P. 105-111.

49. Fisher S.H. Nitrogen assimilation in Streptomyces I I Biology of Actinomycetes.- Japan Scientific Press, Tokio.-1988-P.47-51.

50. Flores M., and Sancher S. Nitrogen regulation of Strptomyces erythreus. //FEMS Microbiol. Lett.- 1985,-V.26.- P.191.

51. Friscke H., Ihn W., Heinrich T.,Drewell S. Chemische Charakterisierung des turimycin-komplexes // Pharmazie.- 1979- V.34- P.339-340.

52. Gale E.F., Cunliffe E., Reynolds P.E., Richmond M.H., Waring M.J. // The Molecular Basis of Antibiotic Action. Wiley (Interscience), London, 1981.

53. Gallo M., Katz E. Regulation of secondary metabolite biosynthesis: catobolite repression of phenoxazinone synthase and actinomycin formation by glucose. //J.Bacteriol.- 1972- V.109- P.659-667.121

54. Gaumanii E., Hutter R., Keller-Schierlein W., Neipp L., Prelog V., Zahner H. Lankamycin and lankacidin // Helv.Chim.Acta.- 1960-V.43-P.601-606.

55. Gil G.A., Naharro J.R., Villanueva J.R., and Martin J.F. Charekterization and regulation of p-aminobenzoic acid synthase from Streptomycts griseus. //J.Gen.Microbiol.- 1985- V.131- P.1279-1257.

56. Gibson S.P. Holdom K.S., Goude AC., Bu Lock J.D. Antiparasitic avermectin and milbemicin derivatives and process for their preparation. // Eur.pat. 0.214.731 ,1987.

57. Grafe U. Relavance of microbial nitrogen metabolism to production of secondary metabolites in overproduction of Microbial Products.// Krumphanzl V.,Sikyta B., and Vanek Z.- Eds., Academic Press, London.-1982.-P.63.

58. Hanel F., Grafe U., Friedrich W., and Borman E.G. ATP levels in phosphate- deregulated and arsenate-resistant mutant of S.noursei. // Z.All.Microbiol.- 1984.- V.24.- P.239-245.

59. Hamill R.L., Haney M.E.Jr., Stamper M., Wiley P.F. Tylosin, a new antibiotic. II. Isolation, properties and preparation of desmycosin,a microbiologically active degradation product // Antibiot. Chemother. (Washington DC.)-1961- V.l 1- P.328-334.122

60. Hata T., Sano Y., Ohki N., Yokoyama Y., Matsumae A. S. leucomycin, a new antibiotic // J.Antibiot. Ser.A.- 1953-V.6-P.87-89.

61. Hara O., Hutchinson C.R. Cloning of Medicamycin resistance gene from Streptomyces Mycarofaciens, Streptomyces lividans and Streptomyces coelicolor //J. Cell. Biochem. Suppl 14A.- Abstr.l9th Annual Meet., Part Mol. Biol. Of Streptomyces.- 1990-P.116.

62. Haavik H.I. Stadies on the formation of bacitracin by Bacillus licheniformis : role of catabolite repression and organic acid.// J.Gen.Microbiol.-l 974-V.84-P.321 -326.

63. Higashide E., Fugono T., Hatano T., Shibata M. Stadies on T-2636 antibiotics.I Taxonomy of Streptomyces roshei var.volubilis., and production of antibiotics and an esterase // J.Antibiot.-1971- V.24- P. 1-24.

64. Hostalek Z. Catabolite regulation of antibiotic biosinthesis. // Folia microbiol.,- 1980- V.25- P.445-450.

65. Ikeda H.,Nonomiya T., Usami M., Omura S. Organization of the biosynthetic gene cluster for the polyketide anthelmintic macrolide avermectin in Streptomyces avermitilis. II Proc Natl Sci USA 1999 V.17;96-N17-P.9509-9514.

66. Ikeda H., Wang LR, Ohta T, Inokoshi J5 Omura S. Cloning of the gene encoding avermectin B 5-O-methyltransferase in avermectin-producing Streptomyces avermitilisll Gene -1998-V.206-N2-P. 175-180.

67. Isogai A., Sakuda S., Matsumoto S., Ogura M., Furihata K., Seto H., Suzuki A. The structure of Leucanicidin, a novel insecticidal macrolide produced by Streptomyces halstedii HAgric Biol. Chem.-1984-V.48-P.1379-1382.

68. Kanida T. Biosynthesis of branched-chain fatty acid.II. Microbial synthesis of branched-long-chain fatty acids from certain short-chain fatty acid substrates.// J.Biol.Chem.-1963- V.238.-P. 1229-1235.

69. Kass IS., Wang CC, Walrong JP, Strelton AOW. Avermectin Bla- a new paralyzing anthelmintic that affects interneurous and inhibitory motorneuros.// In Ascaris. Proc.Nat.Acad. Sc.USA.- 1980-V.77- P.6211-6215.

70. Katz L, Donadio S. Polyketide synthesis: prospects for hybrid antibiotics.//Annu.Rec.Microbiol.-1993-V.47-P. 875.

71. Katz E., Demain A.L. The peptide antibiotics of Bacillus: chemistry, biogenesis, and possible function. // Bacteriol.Rev.- 1977-N.41- P.449.

72. Kern B., Hendlin D., and Inamina E. L-Lisine a-aminotransferase involved in cephamycin C synthesis in Strptomyces lactamdurans. // Antimicrob. Agents Chemother 1980- V.17.- P.679.

73. Kimura A. Biochemical studies on Strptomyces sioyanensis II. Mechanism of the inhibitory effect of glucose on siomycin formation. // Agr. Biol.Chem.-l 967-V.31 -P.845-852.

74. Laurent M,, Seydoux F. Influence of phosphate on the allosteric behavior of yeast phosphofructokinase. // Biochem. And Biophys. Res. Commun.-1977- V.78- P. 1289-1295.

75. MacNeil DJ, Occi JL, Gewain KM, MacNeil T. //Correlation of avermectin polyketide synthase genes to the avermectin structure.Implication for designing novel avermectins.// Ann N Y Sci -1994- V.721- N2-P.123-132.125

76. Majumdar M.K., Majumdar S.K. Synthesis of neomycin by washed mycelium of Streptomyces fradiae and some physiological consideration.// Folia Microbial.-1971 -V. 16-P.285-292.

77. Martin J.F., Demain A.L. Control of Antibiotic Biosynthesis.// Microbiological Reviews.-l 980-V.44-№2.-P.230-251.

78. Marshall V P., Cialdella J.I., Fox J.A., Laborde A.L. Precursor directed biosynthesis of paulomycin A and B.The effect of valine, isoleucine, isobutyric acid and 2-methilbutyric acid.// J.Antibiotics.-1984- V.37-P.923-925.

79. Masuma R., Tanaka Y., and Omura S. Ammonium ion-de-pressed fermentation of tylosin by the use of a natural zeolin and its significance in the study of biosynthetic regulation of the antibiotic. // J. Ferment. Technol.-1983-V.61-P.607.

80. McCann-McCormick P.A., Monaghan R.L., Baker E.E.,Goegelman R.T. Stapley E.O. Study the fermentation of avermectins // Advances in Biotechnology.- 1981-V.l-P.69-74.

81. Mc Guire J.M., Bunch R.L., Anderson R.C., Boaz H.E., Flynn E.H., Powell H.M., Smith J.W. Ilotycin, a new antibiotic // Antibiot. Chemother. (Washington D.C.)-1952- V.2- P.281-283.

82. Mendelovitz S. And Aharonowitz Y. B-lactam antibiotic production by Streptomyces clavuligerus mutants impaired in regulation of aspartokinase. // Gen. Microbiol.-1983- V.129.- P.2063.126

83. Miller T.W., Chaiet L., Cole D.J.,Cole L.J., Flor J.E., et all. Avermectins,new family of potent anthelmintic agent: isolation and chromatographic properties.// Antimicrob. Agents and Chemother.-1979 -V.15-N3- P.368-371.

84. Nakazawa K. Stadies on Streptomyces albireticuli nov. Sp. // J.Agric Chem. Soc. Jpn.- 1955- V.29- P.647-649.

85. Novak J.,Rezanka T., Koza T., and Vanek Z. Biosynthesis of avermectins and lipids in Streptomyces avermitilis.// FEMS Microbiol. Letters- 1990-V.70- P.291-294.

86. Novak J., Curdova E., Jechova V., Cimburkova E. And Vanek Z. Enzymes of Ammonium Assimilation in Streptomyces avermitilis.// Folia Microbiol. -1992- V.37-N4-P.261 -266.

87. Novak J., Jechova V., Curdova E., Cimburkova E., Hajek P., Vanek Z. Metabolism of nitrogen in Streptomyces avermitilis and its relationship to the prodaction of avermectins.//GIM 90, Augest 12-18.-1990.

88. Novak J., Jechova V., Curdova E., Cimburkova E., Vanek Z.Enzymes responsible for NH/ assimilation in Streptomyces avermitilis // Folia Microbiol.-1990-V.35-P.482.

89. Omura S.,Tanaka Y. Biosynthesis of tylosin and its of ammonium and phosphate, in regulation of Secondary Metabolite Formation.// Kleinkauf H.,VonDonren H.,Dornauer H.,Nessemann G., Eds. VCH Veriagsgeselishaft Weinheim.-1985-P.305.

90. Pastan I., Adhua S. Ciclic adenosin 5'-monophosphate in Esherishia coli.il Bacteriol.Rev.-1976.-V.40,- P.527-551.

91. Pinnert-Sindico S.,Ninet L., Preudhomme J., Cjsar C. A new antibiotic spiramycin // Antibiot.Annu.- 1954-1955- P.724-727.

92. Podojil M., Vanek Z., Behal V., Blumauerova M. Regulation of biosynthesis of exessive metabolites.XlV/Incorpation of U14C asparagine in the molecule of tetracycline.// Folia Microbiol.-1973-V.l 8-P.415-417.

93. Pong S.S., Dehaven Rand Wang C.C. A comparative study of avermectin Bia fnd other modulators of the a-aminobutyrie acid receptor chloride ion channel complex. // J.Ncuroscience -1982-V.2-P.966-971.

94. Pospisil S., Peterkova M., Krumphanzl V.,and Vanek Z. Regulatory mutants of Strptomyces cinnamonensis produsing monensin A. // FEMS Microbiol. Lett.- 1984- V.24- P.209.

95. Satoh A.,Ogava H.,Satomura Y. Regulation of N-acetylkanamycin amidogidralase in the idiophase in kanamycin fermentation.// Agr.biol.-1976-V. 40-P191 -196.

96. Schulman M.D., Valentino D., Hensens O. Bisynthesis of the avermectins by in Streptomyces avermitilis. il J.Antibiot.-1986- V.39-P. 541-549.

97. Shapiro S., Vining N.C. Nutrogen metabolism and chloramphenicol production in Streptomyces venezuelae. // Can. J. Microbiol.- 1983- V.29-P.1706.

98. Shapiro S., Vining N.C.,Laycock M.,Innes A.G., Walter J.A. Pathway of ammonium assimilation in Streptomyces venezuelae. examined by amino acid and 15N nuclear magnetic resonance spectroscopy.// Can. J.Microbiol. -1985-V.31-P.621-634.131

99. Tanaka Y., Taki A., Masuma R., Omura S. Mechanism of nitrogen regulation of protylonolide biosynthesis in Streptomyces fradiae.H J.Antibiotics.-1986-V.39-P.813-821.

100. Thomas D.I., Cove J.H., Baumberg S., Jones C.A., Rudd b.A.M. Plasmid effects on secondary metabolite prodaction by Streptomyces thermoarchaensis // J. Cell. Biochem. Suppl 14A.- Abstr.l9th Annual Meet., Part Mol. Biol. Of Streptomyces.1990- P. 121.

101. Tsou HR, Fiala RR, Bullock MW, Caret GT, Gudman JJ, Lurders DB. Biosynthetic origin of the carbon skeleton and oxygen atoms of the LL-F28249 alpha, a potent antiparasitic macrolide.// J.Antibiot.-1989- V.42-P.398.

102. Tyler B. Regulation of the assimilation of nitrogen compounds. // Annu. Rev. Biochem.- 1978- V.47- P.l 127-1162.132

103. Uramoto M., Otake N., Ogawa Y., Yonehara H. The structure of bundlin A (lancacidin) and bundlin B // Tetrahedron Lett.- 1969,- V.27.-P.2249-2254.

104. Vining L.C. Global Regulation of Secondary Metabolism.// Proceeding of the Ninth Symp.on Actinomycetes,Moscow.- 1995.- P. 183-190.

105. Vancurova I. Anhydrotetracycline oxygenase and ammonium assimilation enzymes in Streptomyces aareofaciens. .// PhD Thesis. Prague.-1988.

106. Wagman G.H., Waitz J.A., Marquez J., Murawski A., Oden E.M., Testa R.T., Weinstein M.J. A new Micromonospora-produced macrolide antibiotic, rosamicin // J.Antibiot- 1972,- V.25.- P.641-646.

107. Weinberg E.D. Mineral element control of microbial secondary metabolism.- In: Microorganisms and minerals / Ed. E.D.Weinberg.- N.Y.: Dekker.- 1977.-P.289-316.

108. Weinheim L., Omura S., and Tanaka Y. Biosynthesis of tylosin and its of ammonium and phosphate, in Regulation of Secondary Metabolite Formation. // Kleinkauf H.,von Donren H.,Dornauer H., and Nesemann G., Eds.,VCH Veriagsgeselishaft. .-1985,- P.305.

109. Werner C., Hagenmaier H., Drautz H., Baumgartner A., Zahner H. Bafilomycins, a new group of macrolide antibiotics. Production, isolation, chemical structure and biological activity // J.Antibiot.-1984.-V.37.-P.110-117.

110. Yajima T., Mason K.T., Katz E. Branched chain amino acid substitutions in the biosynthesis of the antibiotic actinomyein. // Antimicrob. Agents Chemother.,- 1975,- V.7.- P.773.133

111. Zalacain M., Cundliffe E. Methylation of 23 r RNA caused by tlrA (ermSF), a tylosin resistance determinant from Streptomyces fradiae // J. Bacterid.- 1989.- V.171.- P.4254-4260.

112. Культуральная жидкость по окончании процесса .была отфильтрована и расфасована в бочки. Во влажной биомассе было определено содержание авермектинов и влажность. Полученные результаты представлены в таблице N 2.

113. Характеристика влажной биомассы культуры штамма Streptomyces avermltilis 103.