Индукция образования антибиотиков неактивными культурами актиномицетов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.31, кандидат биологических наук Малкина, Наталья Дмитриевна

• Малкина, Наталья Дмитриевна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Малкина, Наталья Дмитриевна

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Биохимические и генетические основы

биосинтеза антибиотиков

ГЛАВА 1. Биохимическая регуляция образования вторичных

метаболитов у актиномицетов

1.1. Катаболитная репрессия в присутствии глюкозы

азота

1. 3- Регуляция фосфатом

1.4. Ауторегуляторы

1. 4« 1 •> А~ ф з. я т о р»

ГЛАВА 2. Генетические аспекты вторичного метаболизма у

актиномицетов

2. 1. Геном актиномицетов

2. 1.1. Хромосомы и кластеры генов биосинтеза антибиотиков

актиномицетов

2. 1. 2. Плазмиды

2. 2. Функционирование генома актиномицетов

2. 2. 1. Экспрессия кластера биосинтетических генов

2. 2. 2. Гены резистентности к антибиотикам

ГЛАВА 3. Генетическая нестабильность

3. 1. Спонтанная генетическая нестабильность

3. 2. Индуцированная генетическая нестабильность

3.2. 1. Влияние мутагенов на генетическую

нестабильность актиномицетов

3.2.2. Влияние протопластирования на генетическую

нестабильность актиномицетов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. Материалы и методы исследования

1. 1. Штаммы микроорганизмов

1. 2. Условия культивирования. Питательные среды

1. 3. Мутагенная обработка штаммов актиномицетов

1. 3. 1. Мутагенные факторы

1. 3. 2. Мутагенная обработка

1. 4. Определение антибиотической активности

методом диффузии в агар

1. 4. 1. Выявление в рассеве колоний актиномицетов, проявляющих антибиотическую активность

1. 4. 2. Определение антимикробного спектра актиноми -цетов-продуцентов путем совместного высева

штрихами с тест- культурами -

1. 4. 3. Определение МПК антибиотиков, синтезируемых му-

тантными штаммами при глубинном культивировании

1.5. Изучение морфологических, хемотаксономических, культуральных свойств актиномицетов

1. 5. 1. Морфологические характеристики

1. 5. 2. Хемотаксономические характеристики

1. 5. 3. Анализ дифференцирующих Сахаров

1. 5. 4. Культуральные свойства

1.6. Изучение физиологических свойств культур актиномицетов

1. 6. 1. Потребление источников углерода

1. 6. 2. Потребление источников азота

1. 6. 3. Разжижение желатины

1. 6. 4. Гидролиз крахмала

1. 6. 5. Гидролиз казеина

1. 6. 6. Уреазная активность

1. 6. 7. Восстановление нитратов в нитриты

ГЛАВА 2. Результаты и обсуждение

2. 1. Отбор штаммов антиномицетов, не проявляющих

антибиотическую активность

2. 2. Отбор активных штаммов после обработки

неактивных культур антиномицетов мутагенами

2. 2. 1. Обработка этидий бромидом

2. 2. 2. Обработка даунорубицином

2. 2. 3. Обработка N" метил- N' - нитро- N" нитрозогуанидином 75 . 2. 3. Изучение культур антиномицетов, у которых был индуцирован биосинтез антибиотиков под

действием мутагенов

2.3.1. Мутантный штамм 167ЭБ5

2. 3. 2. Мутантный штамм 1281 ЭБ10

2. 3. 3. Мутантный штамм 5738МННГ50

2. 3. 4. Мутантный штамм 2608ЭБ5- 1

2.3.5. Мутантный штамм 438МННГ25-54 -----

2.3.6. Мутантный штамм 2798МННГ100

2. 3. 7. Мутантный штамм 977 3Б20

2. 3. 8. Мутантный штамм 6038ЭБ40

2. 3. 9. Мутантный штамм 1977ДР50

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Индукция образования антибиотиков неактивными культурами актиномицетов»

- 4 -ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Получение новых эффективных антибиотинов является важной задачей в связи широким распространением патогенных микроорганизмов, устойчивых к имеющимся препаратам. Большинство известных в настоящее время антибиотиков - актиномицетного происхождения. При поиске продуцентов новых антибиотиков среди культур актиномицетов традиционными методами значительнвя часть тестируемых штаммов оказывается биологичесни неактивной и отбраковывается. Ранее в НИИ по изысканию новых антибиотиков РАМН было показано, что регенерация протопластов антибиотически неактивных штаммов актиномицетов индуцировала образование активных вариантов, синтезирующих антибиотики [Маланичева, 1993], что можно объяснить активацией молчащих генов биосинтеза вторичных метаболитов. Другим способом воздействия на геном актиномицетов является мутагенез. Однако, полученные этим методом активные варианты, оказывались нестабильными и быстро утрачивали способность к образованию антибиотиков. Другим способом воздействия на геном антиномицетов является использование химических мутагенов. Известно, что обработка интеркалирующими агентами усиливает генетическую нестабильность актиномицетов [Родионова, 1988] и, вероятно, может привести к экспрессии молчащих генов вторичного метаболизма.

Цель и задачи исследования. Представляемая работа является продолжением исследований, связанных с поиском новых антибиотиков, проводящихся в Институте по изысканию новых антибиотиков РАМН. Цель настоящей работы заключалась в изучении

возможности получения продуцентов антибиотиков при обработке мутагенами неактивных культур актиномицетов, и выявление синтезируемых ими антибиотиков.

В соответствии с целью исследования в работе были поставлены следующие задачи:

- отобрать неактивные в отношении тест- микроорганизмов штаммы актиномицетов;

- подобрать условия для обработки их мутагенами;

- выявить активные варианты и изучить условия биосинтеза антибиотиков на агаризованных и жидких питательных средах;

- изучить естественную изменчивость продуцентов антибиотиков для отбора наиболее продуктивных вариантов;

-наработать антибиотики в количествах, достаточных для изучения их физико-химических свойств;

- сопоставить таксономические признаки исходных и мутантнь штаммов.

Научная новизна. Показана возможность индукции образования антибиотиков неактивными штаммами после обработки их мутагенами. У 44% неактивных культур актиномицетов после обработки этидий бромидом в популяции с высокой частотой обнаруживались активные варианты.

Показано более широкое распространение актиномицетов-антагонистов в природе, чем это можно обнаружить традиционными методами, и доказано, что при определенных условиях большинство актиномицетов может синтезировать антибиотини.

В результате мутагенной обработки неактивных культур антиномицетов получены:

новый антибиотик из группы цервиномицинов; антибиотик 1281 неизвестной ранее природы;

новые продуценты брунеомицина, монензина, актиномицина, относящиеся к видам актиномицетов, для которых ранее не было описано образование этих антибиотиков.

Прагтичесгая значимость. Показано, что в результате обработки мутагенами неактивных культур актиномицетов можно получить стабильные продуценты антибиотиков. Получены продуценты двух новых антибиотиков и новые продуценты брунеомицина, монензина и актиномицина.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Биохимические и генетические основы биосинтеза антибиотиков

Многоклеточная мицелиальная структура с образованием в репродуктивной части спор и способность к синтезу большого разнообразия вторичных метаболитов значительно увеличивает адаптивные возможности актиномицетов.

Такие вторичные метаболиты, как антибиотики, являются формой биохимической дифференциации у антиномицетов. Гены, кодирующие вторичные метаболиты, дифференциально эьспрессируются на стадии замедления скорости клеточного роста. Селективная экспрессия этих генов происходит через узнавание РНК- полимеразой промоторов. Взаимодействие отдельных РНК- полимераз с

промоторами вторичного метаболизма и, следовательно, экспрессия генов, возможно, контролируется А- фактором и родственными плейотропными эффекторами, фосфатом, легко усвояемыми источниками углерода и азота [Martin, 1989].

ГЛАВА 1. Биохимическая регуляция образования вторичных метаболитов

Необходимость получения антибиотиков, образуемых

актиномицетами, требует разработки определенных методов культивирования этих микроорганизмов в условиях погруженной культуры, резко отличающихся от условий естественной среды их обитания. Способность роста актиномицетов в жидкой питательной среде явилась отражением широкого диапазона нормы реакции признаков актиномицетов, обеспеченной функционированием их генома. Оказалось, что антибиотики, как и большинство вторичных

метаболитов, при культивировании в жидкой среде образуются после стадии активного роста вегетативного мицелия (тропофазы) в идиофазе, при низкой концентрации питательных веществ. Такое разделение тропофазы и идиофазы наблюдается при культивировании микроорганизмов на обогащенной питатальной среде, что характерно для образования большинства антибиотиков в оптимальных лабораторных условиях. При определенной концентрации компонентов питательной среды, поддерживающей слабый рост, возможна экспрессия генов биосинтеза антибиотиков в период роста культуры [Vining, 1995]. Очевидно, в этих условиях проявляется морфобиохимическая гетерогенность мицелия актиномицета, одна часть которого может находиться в состоянии ассимилиции и роста (тропофазе), а другая часть - в состоянии вторичного метаболизма и генеративной дифференциации (идиофазе). Частичное совпадение идиофазы и тропофазы наблюдалось при культивировании продуцентов хлорамфеникола, этамицина, рифамицина [Demain, 1992; Lancini 1993] и, вероятно, характерно для жизнедеятельности актиномицетов в природных условиях .

Начало биосинтеза антибиотиков актиномицетами регулируется специфическими механизмами, включающими натаболитную репрессию, регуляцию метаболизма азота и фосфата. В присутствии легко усваиваемых источников углерода, азота и фосфата может происходить как репрессия синтеза, так и подавление активности ферментов, вовлеченных в образование антибиотиков.

1. 1. Катаболитная репрессия в присутствии глюкозы

Синтез многих индуцибельных ферментов биосинтеза

антибиотинов актиномицетами, растущими в присутствии какого-либо источника углерода, может быть репрессирован вносимой в питательную среду глюкозой. Катаболитная репрессия глюкозой представляет собой общую координирующую систему, которая создает преимущество глюкозе благодаря подавлению экспрессии оперонов, кодирующих ферменты альтернативных метаболических путей.

Глюкоза является легко усваиваемым источником углерода, стимулирующим синтез первичных метаболитов, но может препятствовать образованию аминогликозидов, полипептидов, ß-лактамов, тетрациклинов, пуромицина, актиномицина и других антибиотиков [Jones, 1985; Cortes, 1986; Piret, 1988; Lancini, 1993]. В процессе синтеза этих антибиотиков наблюдалась репрессия глюкозой активности одного или нескольких ферментов. Это показано экспериментально при замещении медленно потребляемых источников углерода {полисахаридов, олигосахаридов, растительных масел) в ферментационной среде глюкозой, действующей как репрессор синтеза и как ингибитор активности ферментов вторичного метаболизма [Demaine, 198 9; Vining, 1995].

У продуцента актиномицина S. antibioticus

феноксазинон-синтаза и ферменты, участвующие в синтезе пептидной части молекулы, а также практически все изученные ферменты биосинтеза этого антибиотика являются объектом катаболитной репрессии глюкозой . Позднее эти данные были подтверждены методами молекулярной генетики. Методом блоттинга показано, что появление фермента завершающего этапа биосинтеза актиномицина перед началом образования актиномицина (AM) обусловлено биосинтезом новой мРНК, кодирующей этот фермент (ФС). При росте S. antibioticus на глюкозо-галантозной среде доля мРНМ для ФС в

общем количестве синтезируемой мРНК незначительна, но по мере потребления глюкозы ее доля увеличивается и достигает максимума при полном истощении глюкозы; начинается потребление галактозы и полная дерепрессия биосинтеза мРНК ФС. Регуляция биосинтеза ФС глюкозой происходит на уровне транскрипции [Jones, 1984].

Для некоторых продуцентов антибиотиков катаболитная репрессия может быть временным явлением, возможно, устраняемым за счет усиления инициации транскрипции генов, ответственных за усвоение медленно потребляемых источников углерода, в присутствии циклического аденозинмонофосфата (сАНР). Роль этого эффектора в инициации биосинтеза антибиотиков до конца не выяснена. Известно, что увеличение внутриклеточной концентрации сАМР стимулирует образование тилозина у S.fradiae; стимулирует синтез N-ацил-канамицин-амидогидролазы у S. kanamyceticus- С другой стороны сАМР не участвует в дерепрессии ферментов биосинтеза антибиотиков у s. venezuelae, S. antibioticus и S. coelicolor [Seno, 1983].

Существует мнение [Ikeda, 1984], что сАМФ облегчает репрессию глюкозой, благодаря фосфорилированию молекулы глюкозы в присутствии фермента глюкониназы ^окислительное

фосфорилирование}. Мутации, инактивирующие ген glk глюкокиназы у S. coelicolor A3 (2), предотвращают не только потребление глюкозы, но также репрессию глюнозой генов, обеспечивающих транспорт и усвоение глицерина, арабинозы и других Сахаров. Мутации устраняют также репрессию глюкозой ферментов, необходимых для расщепления агара и других полисахаридов. Введение клонированного гена glk в мутантный штамм S. coelicolor восстанавливает как синтез глюкозо-6-фосфата, так и репрессию

глюнозой.

1. 2. Катаболитная репрессия в присутствии источников

азота

Регуляция источниками азота характерна для вторичного метаболизма актиномицетов. Образование антибиотиков находится под контролем ионов аммония Жц* или определенных аминонислот. Биосинтез антибиотиков начинается только тогда, когда значительная часть ионов аммония в среде истощается или замещается на медленно потребляемые источники азота. Доказательством этого может служить трехкратное увеличение выхода стрептомицина, обнаруженное при замещении в ферментационной среде ионов аммония медленно потребляемым пролином [Lancini, 1993].

Традиционное использование соевой муки при культивировании продуцентов антибиотков связано с ее медленным потреблением. В результате устраняются высокие концентрации ионов аммония и аминокислот. Среда с медленно потребляемым источниками азота является оптимальной для синтеза вторичных метаболитов. Высокие концентрации ионов аммония негативно влияют на синтез стрептомицина, цефамицина, рифомицина, клавулановой кислоты, эритромицина, хлорамфенинола, линкомицина, тилозина, спирамицина [Piret, 1988].

Идентифицированы некоторые ферменты биосинтеза

антибиотиков, ингибируемые ионами аммония. Среди них - циклаза и экспандаза, участвующие в синтезе цефамицина [Castro, 1985]; валин- дегидрогеназа, синтезирующая тилозин, спирамицин [Omura, 1984]; ангидротетрациклин- оксигеназа, ответственная за синтез

тетрациклина [Behal, 1983].

Добавление в ферментационную среду фосфата магния, мочевины или природных цеолитов (служащих ловушкой для приводит к

увеличению выхода макролидов и стрептомицина [Masuma, 1983].

Другой тип регуляции источниками азота осуществляется тогда, когда антибиотик или аминокислота синтезируются по одному и тому же биосинтетическому пути, и образование специфической аминокислоты конкурирует с образованием антибиотика. Репрессия аминокислотой по принципу обратной связи препятствует образованию антибиотика на ранней стадии общего пути. Примером может служить синтез кандицидина и ароматических кислот S. griseus. Один путь - синтез триптофана, тирозина, фенилаланина осуществляется через хоризмовую кислоту, другой путь - синтез кандицидина - через пара-аминобензойную кислоту (ПАБК). Все три аминокислоты подавляют образование кандицидина: они репрессируют как первый фермент общего пути, так и первый фермент биосинтеза кандицидина - ПАБК-синтетазу [Martin, 1983].

В культурах актиномицетов, у которых образование вторичных метаболитов начинается после истощения источников азота или после замены быстро потребляемого источника азота на более медленно потребляемую форму, активация генов вторичных метаболитов может происходить как за счет освобождения от катаболитной репрессии, так и за счет снижения скорости роста [Vining, 1995].

1. 3. Регуляция фосфатом

Регуляция фосфатом синтеза антибиотиков характерна для многих штаммов- продуцентов и для разных антибиотиков. При

высокой концентрации фосфата в ферментационной среде наблюдалось подавление биосинтеза практически всех антибиотинов, в том числе аминогликозидов, тетрациклинов, макролидов, полиенов, ионофоров и др.

Различный уровень концентрации фосфата в питательной среде может индуцировать экспрессию генов, ответственных за биосинтез разных антибиотиков в одной и той же культуре. Изучено влияние различных концентраций фосфата на биосинтез вторичных метаболитов у <?. с1ауиИдеги&- Этот микроорганизм продуцирует как клавулановую кислоту, так и цефамицин. Образование первого вещества репрессируется фосфатом, а образование второго фосфат не контролирует, поэтому вполне возможно разделение биосинтетичесних путей цефамицина и клавулановой кислоты с помощью регуляции уровнем фосфата в культуральной жидкости [Ъв.пс1п1, 1993].

Было установлено, что антибиотики, синтезируемые из аминокислот, менее чувствительны к влиянию фосфата, чем, например, антибиотики, синтезируемые из ацетатных и пропионатных единиц (поликетиды) или из Сахаров (аминогликозиды) [там же].

В зависимости от ферментов, принимающих участие в биосинтезе антибиотиков и подверженных репрессии фосфатом, выделяют, по крайней мере, два механизма регуляции фосфатом.

1) Фосфатазы. Фосфотрансферазы участвуют в образовании аминогликозидов. Биологически неактивные фосфорилированные промежуточные продукты при участиии фосфотрансфераз дефосфорилируются с образованием стрептомицина, неомицина. Такой механизм подавления фосфатом ферментов биосинтеза антибиотиков наблюдается всякий раз, когда осуществляется биосинтетичесний

путь, включающий фосфорилированные промежуточные продукты. Это касается, в основном, аминогликозидных антибиотиков [Ланчини, 1993].

2) Синтетазы. Фосфат или внутриклеточный эффектор (АТР или сАМР), в составе молекулы которого присутствует фосфат, репрессирует образование или активность синтетаз, отличных от фосфатаз.

Добавление в ферментационную среду фосфата резко снижает образование цефалоспорина культурой Streptomyces clavuligerus. Все четыре синтетазы, участвующие в синтезе антибиотика, ACV (аминоадипил-цистеин-валин) синтетаза, циклаза, эпимераза и экспандаза репрессируются фосфатом. Подавление активности ферментов может быть устранено благодаря добавлению в ферментационную среду ионов Fe2*, которые, взаимодействуя с фосфатом, образуют нерастворимые соли.

У S. fradiaet по крайней мере, два фермента синтеза тилозина контролируются фосфатом. И ним относится фермент, ответственный за превращение протилонолида в тилозин, и макроцин-О-метилтрансфераза, катализирующая конечную стадию синтеза этого антибиотика [Сох, 1986].

Образование парааминобензойной кислоты {ПАБК)-синтазы, вовлеченной в биосинтез полиенового антибиотика кандицидина у S. griseus, сильно подавляется фосфатом. Эффект подавления синтеза фермента является результатом специфической репрессии транскрипции соответствующего гена pabS. Обнаружено, что фосфат подавляет эспрессию промотора этого гена [ Rebollo, 1989].

До сих пор остается неясным вопрос: принимают ли участие в контроле фосфатом биосинтеза антибиотиков внутриклеточные эффекторы сАМР и АТР?

Циклический аденозинмонофосфат (сАМР). У штамма

Streptomyces coelicolor МТ 1110 максимальное накопление сАМФ наблюдалось как в период роста продуцента, так и в период образования воздушного мицелия и спор. У штамма BZ1 этого же стрептомицета мутация гена суа, отвественного за синтез сАМФ, повлияла на процесс прорастания спор и образования воздушного мицелия. Добавление экзогенного сАМФ стимулировало образование воздушного мицелия, резкое увеличение концентрации актинородина и уменьшение накопления ундецилпродигиозина [Susstrunk, 1998].

С другой стороны у некоторых штаммов-продуцентов в конце тропофазы наблюдалось параллельное уменьшение уровня сАМФ и концентрации ортофосфата (Р0ц)3~. Например, у S. hygroscopicus осуществлялась параллельная регуляция сАМР- фосфодиэстеразы и фосфатаз в процессе ферментации туримицина. Напротив, у S. griseus сАМР вовсе не вовлекался в фосфатный контроль образования стрептомицина или кандицидина. Имеющиеся данные не позволяют пока сделать определенные выводы о роли сАМФ в контроле биосинтеза антибиотиков.

Гуанозинтетрафосфат - ppGpp и Строгий ответ

(stringent response)

Значение нуклеозидтетрафосфата (ppGpp) в контроле строгого ответа у эубактерий достаточно хорошо изучено. Присутствие нуклеозидфосфатов обнаружено также у разных видов стрептомицетов, и роль их в процессе инициации вторичного

метаболизма изучается.

Строгий ответ выражается в ослаблении синтеза стабильных РНК в ответ на истощение фонда свободных аминокислот и является одним из защитных механизмов, индуцирующих образование антибиотиков и споруляцию у стрептомицетов. Однако, не была установлена четкая корреляция между синтезом антибиотика, концентрацией фосфата и уровнем гуанозинтетрафосфата. Известно, что ppGpp представляет собой продукт регуляторного гена reí. Мутанты relC (с нарушенным строгим ответом), выделеные из различных штаммов стрептомицетов, синтезировали значительно меньшее количество антибиотина, что доказывает важную роль ppGpp для начала индукции вторичного метаболизма [Ochi, 1990]. Инициация синтеза антибиотина посредством ppGpp обнаружена при культивировании продуцента формицина Streptomyces sp. МА406А1-Установлено, что кратковременное возрастание концентрации ppGpp перед началом образования формицина, обусловлено истощением источника азота в питательной среде. Аналогичная

связь между увеличением концентрацией ppGpp, сопровождающимся истощением азота, и инициацией синтеза стрептомицина была обнаружена у S. griseus [Ochi, 1987]. Holt с коллегами также наблюдали пик клеточной концентрации ppGpp, совпадающий с временной остановкой роста культуры S.hygroscopicus, во время которой произошла активация генов биосинтеза биалофоса [Holt, 1992].

Изучение образования актиномицина показало, что ген биосинтеза фермента завершающего этапа биосинтеза актиномицина -ФС (катализирует окислительную конденсацию двух молекул пентапептидолактона) относится к генам, экспрессия которых

регулируется уровнем ppGpp. У продуцента актиномицина D (AMD) S. antibioticus при переносе мицелия с богатой аминокислотами среды, на которой не образуется AMD, на обедненную среду резно возрастает уровень ppGpp и относительная доля мРНК для ФС, т.е. происходит индукция биосинтеза фермента и AMD, соответственно. rel-Мутант С49 в аналогичных условиях не увеличивает концентрации ppGpp, не контролирует скорости биосинтеза РНК, не образует вторичных метаболитов - AMD и меланоидного пигмента. Это указывает на важную роль продукта reí гена ppGpp в регуляции образования вторичных метаболитов [Kelly 1991].

У другого мутанта, полученного после обработки S.coelicolor хлорамфениколом, наблюдалась транскрипция гена биосинтеза актинородина (act III), хотя синтез ppGpp в результате мутации был заблокирован. Таким образом, reí мутанты S. coelicolor нормально синтезировали актинородин или ундецилпродигиозин [Strauch, 1991].

1. 4. Ауторегулятомл

Использование методов рекомбинантных ДНК у стрептомицетов позволило клонировать индивидуальные гены, контролирующие как клеточную дифференциацию так и вторичный метаболизм и доказать их близкую генетическую связь. Оба процесса представляют собой фенотипичесное выражение экспрессии многочисленных регуляторных генов в комплексе регуляторного каскада. Одним из важных этапов в таком регуляторном каскаде является включение ауторегуляторных факторов, представляющих собой низкомоленулярные вещества, действующие в крайне малых концентрациях.

К ауторегуляторам, или плейотропным эффекторам, относятся

фанторы А CKhoKhLov, 1982; Graefe, 1985; Beppu, 1986], В [Kawaguchi, 1984], С [Szabo, 1988], гомологи А-фактора [Sato, 1989; Yamada 1987], памамицин [_McCann, 1979],

карбазомицин [Yanagimoto, 1979] и некоторые другие [Horinouchi, 1992].

1. 4. 1. А-фактор

В настоящее время наиболее изучен А- фактор (2-изокаприлоил- R-гидроксиметил - бутиролактон) , выделенный впервые группой A.C. Хохлова из культуральной жидкости S.griseus [Хохлов, 1967]. А-фактор является плейотропным эффектором, индуцирующим у s. griseus образование воздушного мицелия, споруляцию, синтез стрептомицина (Sm) и резистентности к антибиотику при концентрации 1 нМ.

А- фактор широко распространен среди различных штаммов актиномицетов. Установлено, что только для отдельных культур было установлено, что он способен выполнять регуляторную функцию. Кроме s. griseus А-фактор индуцирует биосинтез стрептомицина, резистентность к нему и спорообразование у S. bikiniensis, индуцирует образование антрациклинового антибиотика У S. griseus и нозигептида - у S. actuosus. А-фактор восстанавливает образование Sm у 114 из 119 необразующих антибиотик мутантов S. griseus [Хохлов, 1973].

Известно, что образование А-фактора кодирует afsA ген, обнаруженный у S.bikiniensis. afsA ген у S.griseus контролирует синтез не только А-фактора, но и А-фактор-связывающего белка. Последний в отсутствие А- фактора репрессирует синтез стрептомицина и споруляцию у S. coelicolor. Мутантный штамм, имеющий дефицит А-фактор-связывающего белка, синтезировал

стрептомицин и спорулировал на ранних стадиях роста в отличие от дикого штамма. Синтез А-фактора и А-фактор-связывающего белка происходит одновременно [Верри, 1986].

У Б.соеИсо1ог был выделен плейотропныИ ген, а/яВ, контролирующий образование позитивного регуляторного белка, необходимого для синтеза А- фактора и антибиотиков актинородина и продигиозина. Введение а£зВ гена в Б. Пухйапялндутлровапо образование а-фактора и значительное количество пигментов актинородина и продигиозина [Ног^поисЫ, 1983].

Таким образом, образование антибиотиков актиномицетами представляет собой сложный многоступенчатый ферментативный процесс, регулируемый такими механизмами как катаболитная репрессия, регуляция фосфатом, источниками азота. Для биосинтеза антибиотиков необходимы специфические ферменты и для ряда антибиотиков плейотропные регуляторы.

ГЛАВА 2. Генетические аспекты вторичного метаболизма

у актиномицетов

Актиномицеты имеют сложное строение колоний, мицелий которых дифференцирован на области, выполняющие вегетативные и репродуктивные функции. Последнй стадией развития культуры является образование в репродуктивной части мицелия (воздушном мицелии) гаплоидных спор. Мицелиальная структура дает возможность дифференцированного выражения генов индивидуальных геномов в процессе роста актиномицетов в ответ на постоянно изменяющиеся условия среды их обитания. Сложный цикл морфологического развития, синтез вторичных метаболитов способствовали развитию сложного в структурном и функциональном отношении генома актиномицетов.

2. 1. Геном актиномицетов.

Геном изученных видов Streptomyces в 1,5 - 2 раза превышает размеры геномов Escherichia coli и Bacillus subtilis. Существование избыточного генетического материала у актиномицетов является следствием разнообразных адаптивных ответов на изменения концентрации питательных компонентов и возникновение стрессовых ситуаций в окружающей среде. Существование избыточного генома трудно объяснить тольно присутствием генов дифференциации и биосинтеза вторичных метаболитов. Предполагается, что для осуществления сложного контроля экспрессии генов актиномицетов необходимо присутствие более длинных участков некодирукнцей ДНК, чем у одноклеточных прокариот [Ломовская, 1990]. В геноме актиномицетов обнаружено

большое число копий тандемно повторяющихся последовательностей ДНК, которые могут возникать в отсутствии селективного давления. Число тандемно повторяющихся последовательностей может достигать 500 [Birch, 1990].

2- 1-1- Хромосомы и кластеры генов биосинтеза антибиотиков

актиномицетов

Гаплоидный геном актиномицетов представлен единственной хромосомой. На основе анализа рекомбинантов, возникающих в скрещиваниях между генетически маркированными штаммами, построена генетическая карта S.coelicolor А3(2) и приведены доказательства ее кольцевого строения. Кольцевое строение характерно для генетических карт сцепления большинства изученных стрептомицетов [Hopwood 1965]. Недавние исследования обнаружили существование линейных хромосом у 9 видов стрептомицетов. У некоторых из них в результате спонтанных делеций в нестабильных концевых регионах линейные хромосомы становились кольцевыми [Lin, 1993/ Leblond, 1994; Chen, 1994; Volff, 1994].

4

Геном стрептомицетов содержит оноло 10 тысяч пар нуклеотидов (т. п. н. ) и характеризуется высоким содержанием GC-nap - 70-74% iE. coli 49%, B.subtilis 43%).

Наиболее изученным в генетическом отношении является культура Streptomyces. coelicolor А3(2). С помощью набора мутантов в геноме штамма S. coelicolor А3{2) идентифицированы гены первичного метаболизма, дифференциации, биосинтеза некоторых ферментов и антибиотиков. Особенностью генетической карты S.coelicolor А3(2) является присутствие двух больших областей генома, которые являются генетически молчащими,

разделенными большим количеством маркированных генов [Lancini, 1993].

По данным генетического картирования наблюдается тенденция группировки генов одного пути биосинтеза в кластеры. Структурные гены биосинтеза многих антибиотиков также сцеплены между собой и вместе с регуляторными генами, и генами устойчивости представляют собой кластер нескольких оперонов, объединенных в единый регулон. Гены, кодирующие биосинтез актинородина, ундецилпродигиозина, тетраценомицина, окситетрациклина,

рифамицина, стрептомицина, эритромицина, тилозина, грамицидина S, тироцидина и других антибиотиков организованы в кластеры [Rudd, 1979; Hotamedi, 1987; Binnie, 1989; Schupp, 1979; Kumada, 1986; Stanzak, 1986; Сох, 1987; Anzai, 1988].

Гены, контролирующие биосинтез антибиотиков и других вторичных метаболитов, как правило, имеют хромосомную локализацию и тесно сцеплены между собой. Установлена хромосомная локализация генов, ответственных за биосинтез антибиотиков актинородина, окситетрациклина, рифамицина, ундецилпродигиозина, стрептомицина, хлорамфеникола, тилозина, олеандомицина и многих других [Rhodes, 1981; Martin, 1992].

В отличие от генов вторичного метаболизма гены морфологической дифференциации распределены по всей хромосоме [Horinouchi, 1992; Hopwood, 1986].

2. 1. 2. Плаэииды

У многих стрептомицетов обнаружены плазмиды. Большая часть

изолированных плазмид представлена ковалентно замкнутыми

кольцевыми (ССС) молекулами. Однако обнаружены и линейные

плазмиды, например, pSlA2 в штамме S. rochei [Hirochika, 1982]. Размеры изученных плазмид варьируют от 4 до 200 т. п. н. при копийности от одной до нескольких сот. В спорах плазмида существует в единственной копии [Birch, 1990]. У большинства исследуемых плазмид актиномицетов, как правило, не обнаруживается каких-либо функций, не связанных с их поддержанием в автономном или интегрированном в хромосому состоянии и коньюгативными свойствами. Практически только в одном случае обнаружено присутствие на плазмидах SCP1 и pSVl генов, контролирующих биосинтез метиленомицина. [Chater, 1983]. Kinashi и Shimaj обнаружили локализацию всех генов биосинтеза метиленомицина на серии гигантских линейных плазмид размером до 1/10 части хромосомы, изолированных из штамма S. coelicolor A3(2) [Kinashi, 1987].

2. 2. Функционирование генома актиномицетов

2.2. 1. Экспрессия кластера биосинтетических генов

Большой вклад в понимание механизмов регуляции вторичного метаболизма внесли новые методы молекулярной генетики клонирование и идентификация генов, ответственных за этот процесс. Было обнаружено, что во многих случаях регуляторные и структурные гены часто локализованы в едином кластере. Такие кластеры могут содержать одну транскрипционную единицу {один оперон) или несколько единиц. Но в любом случае эти гены физически сцеплены друг с другом. У штаммов-продуцентов часто гены, ответственные за устойчивость к собственному антибиотику, также локализованы в биосинтетичесном кластере. Вся группа генов может транскрибироваться в одну полицистронную мРНК, которая

последовательно транслируется рибосомами с образованием разных белков. Тесная связь генов биосинтетических путей и генов резистентности обеспечивает четкую координацию временной и количественной экспрессии, при которой все гены выражаются одновременно. Такая экспрессия контролируется как на транскрипционном, так и на трансляционном уровне. В настоящее время в научной литературе обсуждается гипотеза, согласно которой кластерная организация генов биосинтеза антибиотиков может быть связана с их латеральным межвидовым распространением, например, при помощи трансмиссивных плазмид, умеренных фагов и транспозонов [К1пазЬ1, 1992; Табаков, 1997]. Использование методов секвенирования и компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК кластеров генов биосинтеза антибиотиков у стрептомицетов выявило высокую степень подобия отдельных генов и их взаимного расположения (организация транскрипционных единиц) в кластерах, определяющих синтез аналогичных, родственных или сходных по структуре антибиотиков [Нага, 1991; 01з1:1ег, 1992]. Также значительные совпадения были обнаружены не только между кластерами генов биосинтеза родственных антибиотиков у разных видов БЬгерЬотусе^ но и между соответствующими генетическими структурами синтеза аналогичных или родственных антибиотиков стрептомицетов и эволюционно удаленных от них организмов, например гифомицетов [Табаков, 1997].

Транскрипция. Одним из ключевых факторов регуляции экспрессии биосинтетических генов является их местоположение в бактериальном геноме. В связи с пространственной организацией генов биосинтеза регуляция может осуществляться двумя способами:

1) с помощью организации биосинтетических генов в большие опероны, контролируемые единственным промотором, образующим полицистронную мРНК;

2) с помощью физического сцепления в большую мультифункциональную единицу различных полипептидов, вовлеченых в одну группу реакций, чья пространственная близость имеет решающее значение для осуществления биосинтеза. Другой способ регуляции осуществляется тогда, когда отдельные транскрипционные единицы могут контролироваться посредством транс-действующих регуляторных генов [ |_:а.лсгги, 1993].

Промоторы. Изучение последовательностей ДНК, вовлеченных в регуляцию транскрипции у актиномицетов, до сих пор находится на ранней стадии. Охарактеризовано лишь несколько промоторов стрептомицетов. Большинство из них проявляет функциональную гомологию с промоторными участками Е. coli. Так, промоторы эубактерий Е. coli, Serratia marcescens и Bacillus brevis может узнавать РНК-полимераза S. lividans. Но лишь незначительное количество промоторов стрептомицетов узнается транскрипционным механизмом е. coli [Lancini, 1993].

Возможное объяснение этого явления связано с высоким содержанием GC- пар в ДНК стрептомицетов, что может создавать барьер для инициации транскрипции генов актиномицетов в E.coli и В. subtilis [Орехов, 1986].

Жизненный цикл актиномицетов предполагает дифференциальную экспрессию генов первичного и вторичного метаболизма, т. е. выключение транскрипции ранее экспрессируемых генов и включение новых транскрипционных единиц, а также участие компонентов системы регуляции, обеспечивающих их переключение. Одним из

широко распространенных механизмов регуляции экспрессии генов вторичного метаболизма у микроорганизмов является образование альтернативных а-факторов или других белков, которые могут управлять экспрессией одних генов в процессе роста или других генов, контролирующих вторичный метаболизм, т. е. менять специфику РНК- полимераз. Вполне вероятно, что промоторный полиморфизм, связанный со специфичностью РНК- полимераз, также способствует контролю экспрессии генов у стрептомицетов. Изучение РНК-полимеразы S. coelicolor позволило установить существование семи или более о- факторов, влияющих на специфичность голофермента [ Lancini , 1993].

Регуляторные гены. Регуляция вторичного метаболизма, в частности синтеза антибиотиков, представляет собой

многостадийную каскадно- организованную систему. Структура этой системы в модельном штамме s. coelicolor на сегодняшний день выглядет следующим образом. Верхний уровень занимает группа bid генов (A-D, F-G), мутации которых затрагивают как дифференциацию, так и синтез всех четырех антибиотиков, образуемых этой культурой: актинородина, ундецилпродигиозина, метиленомицина и кальций-зависимого антибиотика. Известно, что продукт гена bldA - тРНК необычного для рода Streptomyces лейцинового кодона UUA, может регулировать трансляцию генов вторичного метаболизма на многих уровнях регуляции, вплоть до специфических регуляторов кластеров и даже отдельных струнтурных генов.

К следующему уровню регуляции можно отнести недавно обнаруженные и идентифицированииые локусы absA и absR Мутации в этих локусах блокируют синтез всех антибиотиков, но не влияют на

дифференциацию [Adamidis, 1990]. Мутанты по лонусу absA утрачивают или уменьшают продукцию актинородина, ундецилпродигиозина и кальций-зависимого антибиотика, но не метиленомицина.

Другие два гена, afsR и afsK, также вовлечены в глобальную регуляторную сеть вторичного метаболизма у S.coelicolor и составляют двухкомпонентную регуляторную систему [Lancini , 1993]. а/в-мутанты теряют способность образовывать только пигментные антибиотики и синтезировать соединения, подобные А- фактору. Продукты afsR и afsQ генов осуществляют контроль образования антибиотиков непосредственно на уровне кластеров путем активации actII-ORF4 и redD или в кооперации с продуктами этих генов [Vining, 1995]. По данным Adamidisa afsR ген, встроенный на мультикопийную плазмиду, индуцирует образование актинородина и ундецилпродигиозина у afsB мутантов, не синтезирующих эти антибиотики, а также у диких штаммов S. coelicolor и S. lividans. Этот стимулирующий эффект на примере синтеза актинородина объясняется усилением транскрипции генов, отвественных за биосинтез этого антибиотика [Adamidis, 1990].

Известен позитивный регуляторный ген strR синтеза стрептомицина, контролирующий полную экспрессию strA гена аминогликозидфосфотрансферазы, и strB ген у S. griseus [Distler, 1985]. Продукт ЬгрА гена S.hygroscopicus также является позитивными эффектором, активирующими транскрипцию шести bap генов биосинтеза биалофоса, и bar гена резистентности к нему [Anzai, 1988]. Недавно установлено, что aveR ген, ответственный за образование аглинона и фуранового кольца в молекуле авермектина, является регуляторным [Ikeda, 1995]. saf ген, клонированный из S. griseus, участвует в контроле синтеза пяти

экстрацеллюлярных ферментов, образовании пигмента и дифференциации [Martin, 1983]. Обнаружено, что saf Ген присутствует в различной гомологии у большинства изученных представителей рода Streptomyces [Daza, 1990].

Генетическое изучение штамма Streptomyces peucetius позволило установить, что локус dnrRl содержит два гена dnrl и dnrJ, составляющих двуномпонентную систему контроля биосинтеза даунорубицина [Stutzman-Engwall, 1992]. Последующие исследования показали, что dnrl активирует транскрипцию большинства, если не всех генов биосинтеза даунорубицина, тогда как dnrJ ген не является регуляторным, он кодирует фермент, ответственный за присоединение аминогруппы к дезоксиаминосахару. В гипотетической модели регуляции биосинтеза даунорубицина транскрипция биосинтетических генов и генов резистентности контролируется регуляторным каскадом, в котором dnrN активирует транскрипцию регуляторного гена dnrl, последний, в свою очередь, активирует транскрипцию генов биосинтеза даунорубицина [Madduri, 1995; Otten, 1995].

Практически во всех случаях продукт регуляторного гена действует как позитивный регулятор биосинтеза антибиотиков. У S.coelicolor ~ продукт регуляторного гена mmyR осуществлял негативную регуляцию кластера генов биосинтеза метиленомицина [Martin, 1989]. Местоположение этого гена в кластере и его негативное влияние на процесс биосинтеза метиленомицина были выявлены случайно: повреждение или делетирование ДНК на одном из его концов приводило к сверхпродукции антибиотика [Chater, 1990].

Регуляторный ген, ответственный за синтез тетраценомицина,

также осуществлял негативную регуляцию ранних и промежуточных генов бисинтетического пути антибиотика [Маг'Ьл.п, 1989].

Но несмотря на то, что определенная иерархия взаимоотношений между генами, регулирующими вторичный метаболизм, существует, ничего не известно о механизмах взаимодействия этих генов в процессе активации генетических структур вторичного метаболизма. Имеются данные,

свидетельствующие о том, что взаимодействие генов не строится по принципу простого соподчинения. Продукты этих генов могут взаимодействовать, . функционировать на разных уровнях регуляторного каскада или выполнять роль дополнительных элементов регуляции для передачи определенных метаболических сигналов [Ул.пз.пд, 1995].

Генетическое картирование позволило установить, что гены, осуществляющие функции глобального контроля вторичного метаболизма, не сцеплены с контролируемыми ими генетическими структурами и распределены по всей хромосоме микроорганизма [Нор\*оос1,1994] .

Известно, что инициировать транскрипцию кластеров генов биосинтеза антибиотиков могут также дополнительные факторы регуляции - продукты регуляторных генов более высокого уровня, чем гены специфической регуляции, действующие на уровне оперонов и кластеров. Таким продуктом генов глобальной регуляции образования вторичных метаболитов является ауторегулятор А-фактор. Конечным эффектом А-фактора является связывание позитивного регуляторного белна с ДНК участком, который расположен на расстоянии 330-430 пар нуклеотидов вверх от траскрипционной стартовой точки вЬгй промотора. В результате

инициируется транснрипция гена, продукт которого, в свою очередь, активирует другие гены биосинтеза стрептомицина.

Синтез стрептомицина культурой З.дг1веи8 является одним из наиболее изученных фенотипических проявлений, контролируемых А-фактором. Анализ транскрипции с промоторов, локализованных в составе нластера генов биосинтеза стрептомицина, показал, что только один из 4 исследуемых промоторов контролируется А-фактором. Оказалось, что этот промотор предшествует гену специфической регуляции биосинтеза стрептомицина вЬгН и способен усиливать его транскрипцию в присутствии А- фактора более, чем в 10 раз.

Образуемый А- фактор репрессирует А- фактор- связывающий белок, тем самым освобождая промотор неизвестного х гена и инициируя его транскрипцию. Синтезируемый х геном белок- активатор X связывается с рА промотором регуляторного гена вЬгИ биосинтетического кластера и активирует синтез мРНК, ответственной за экспрессию бЬгЕ и арЬЭ генов. Прямая зависимость транскрипции арЫ) гена устойчивости от промотора, инициируемого А-фактором, помогает достигнуть достаточного уровня устойчивости продуцента к собственному антибиотику перед началом его синтеза. Синтезируемый геном 5Ьг11 белок-активатор БЬгЕ инициирует эспрессию промотора рС гена srtД контролирующего образование фермента синтеза Бт амидинотрансферазу. В итоге А-фактор активирует с помощью позитивного регуляторного Б^И белка целый кластер генов синтеза Бш. Белок- активатор отличается от А- фактор- связывающего белка, действующего как репрессор синтеза Бт, еще и тем, что он осуществляет контроль только синтеза антибиотика, но не

споруляции. Модель регуляторного каскада биосинтеза стрептомицина культурой дг1веиз представлена на схеме 1.

Схема 1.

Модель регуляторного каскада биосинтезастрептомицина у З.дгхзеив, включающего А-фактор и А-фактор-связывающий белок

[Ногз.поисЫ, 1992]

afsA

А- фактор

.1.

-> А- фактор- связывающий белок (репрессор)

V

-р-Х-

белон X

-рА-БЬтЯ-арЬИ

белок БЬгИ

-рС-зЬгВ-I

V V

образование желтого воздушного

пигмента мицелия

4

споруляция

->5л!-фосфотранс-фераза (резистентность)----

->амидинотранс-фераза

СТРЕПТОМИЦИН

Совместное функционирование ауторегупятора и

соответстующего ему белка (репрессора) является защитным механизмом стрептомицетов в сложной экологической системе окружающей среды. [Horinouchi, 1992]

Таким образом, регулирующая функция А- фактора реализуется при участии регуляторных белков, от которых сигнал через каскад усиления передается на гены, ответственные за синтез стрептомицина, резистентность и спорообразование.

Трансляция. Высокое содержание GQ пар в геноме актиномицетов увеличивает возможность использования редких видов тРНК в регуляции экспрессии генов. Редко используемая лейциновая тРНК со стартовым кодоном GUG, вероятно, ограничивает транскрипцию генов, экспрессируемых в переходный период от фазы вегетативного роста к фазе дифференциации. У S.coelicolor bldA ген контролирует синтез тРНК, распознающую редко встречающийся в ДНК Streptomyces лейциновый кодон UUA Использование UUA кодона обеспечивает контроль за процессом дифференциации на уровне трансляции [Chater, 1984; Hopwood, 1986].

Структурные гены биосинтеза антибиотиков. Использование методов молекулярной биологии позволило увеличить число клонированных генов, ответственных за биосинтез антибиотиков.

Клонированные act гены поликетидного антибиотика антинородина, синтезируемого S.coelicolor , локализованы в едином кластере на участке ДНК протяженностью 25 т. п. н. Гены несут полную информацию о синтезе антибиотика из простых первичных метаболитов (ацетат - малонатных единиц). Использование метода мутационного клонирования показало, что при считывании кластера генов биосинтеза актинородина образуется

несколько транскриптов. В первой части кластера расположены гены, колирующие ранние этапы биосинтеза актинородина. В результате считывания act III образуется короткий транскрипт (1,1 т. п. н. }, кодирующий ß- кеторедуктазу, а считывание генов act I, YII и IY - длинный полицистронный транскрипт, причем act I кодирует большую часть поликетидсинтаз, в том числе ß- кетоацилсинтазу [Malpartida, 1986].

Генный кластер содержит также ген резистентности и специфический позитивный регулятор act II. Регуляторный ген act II локализован в центре кластера. Большое число копий этого участка у S. coelicolor приводит к значительной сверхпродукции актинородина. Гены actYI и act Y, контролирующие поздние этапы биосинтеза антибиотика, локализованы в левой части кластера и считываются с образованием одного или нескольких транскриптов [Malpartida, 1986].

Пока нет данных ни о структуре промотора act генов, ни о регуляторной цепи, осуществляющую экспрессию актинородинового нластера.

Гены actl и act III, ответственные за начальные этапы биосинтеза актинородина, оказались широко распространенными среди стрептомицетов, образующих антибиотики по поликетидному пути. Биосинтетические гены, имеющие высокую степень гомологии с actl или act III, были также обнаружены у других штаммов-продуцентов тетрациклина, макролидов, антрациклинов, полиэфиров, рифампицина, авермектина [Hopwood, 1986; Lancini 1993], нонактина и тетранактина [Plater, 1991]. Высокая степень гомологии указывает на консервативность генов поликетид-синтетаз.

Культура S.coelicolor А3{2) синтезирует антибиотик метиленомицин. Детерминанты биосинтеза метиленомицина

локализованы на плазмиде. Клонирование тту генов показало, что участок ДНК протяженностью 17 т. п. н. является кластером биосинтеза метиленомицина [Chater, 1985]. Детерминант резистентности ттг располагается между двумя длинными оперонами размером 9,5 и 6,5 т. п. н. Каждый из них содержит по два биосинтетических гена. С левого конца оперона протяженностью 9,5 т. п. н. локализован предполагаемый регуляторный ген [Hopwood, 1986].

Отклонирован фрагмент ДНК размером 24 т. п. н. , содержащий кластер всех генов биосинтеза антрациклинового антибиотика тетраценомицина С ítem) [Motamedi, 1986]. Обнаружено, что структурные гены tcmC расположены в последовательности, определяющей промежуточные, ранние и поздние этапы биосинтеза Теш. Ген резистентности tcmr и гипотетический регуляторный ген тесно сцеплены с поздними генами. Таким образом, кластер генов биосинтеза тетраценомицина имеет структуру, сходную с кластером генов актинородина [Motamedi, 1987].

Все девять ote генов биосинтеза окситетрациклина вместе с генами резистентности otcRI и otcRII S. rimosus организованы в единственный оперон [Binnie, 1989]. Также сообщалось о биосинтетическом кластере, локализованном на хромосоме и состоящим их двух генов, отвественных за ранние этапы, и четырех генов, ответственных за поздние этапы биосинтеза рифамицина

[Schupp, 1979], цефамицина у S- clavuligerus [Madduri, 1991].

Кластрированные биосинтетичесние гены нунлеозидного антибиотика пуромицина, образуемого S.alboniger, расположены на фрагменте ДНК протяженностью 15 т. п. н. Кластер биосинтеза пуромицина содержит предполагаемый рас ген резистентности, инактивирующий антибиотик с помощью N" ацетиляции; биосинтетический dmpM ген, кодирующий диметил- пуромицин-о - метилтрансферазу; pacHY ген N- ацетил- пуромицин гидролазы, обеспечивающий экспорт антибиотика [Cundliffe, 1989].

Гербицидный антибиотик биалофос образуется культурой S.hygroscopicus и представляет собой трипептид, содержащий две молекулы L-аланина и фосфинотрицин.. С помощью комплементации с нективными мутантами идентифицировано семь генов биосинтеза Ьар и ген резистентности bar, которые кластрированы на участке ДНК протяженностью 16 т. п. н. . Оказалось, что ген bar, контролирующий биосинтез ацетилтрансферазы, одновременно участвует в обеспечении резистентности продуцента к собственному

антибиотику и в биосинтезе биалофоса на стадии превращения его предшественника диметилфосфинотрицина в N- ацетилфосфинотрицин [Raibaund, 1991]. Организация кластера биосинтетических генов биалофоса имеют аналогичную структуру у продуцентов S. viridochromogenes Tu 494 и S.hygroscopicus [Wohlleben, 1992; Нага, 1991].

2. 2- 2. Гены резистентности к антибиотикам

Многие штаммы- продуценты обладают как резистентностью к

собственному антибиотику, так и множественной устойчивостью к другим антибиотикам. У разных видов Streptomyces клонированы гены резистентности к метиленомицину, неомицину, тиострептону, эритромицину, виомицину, гигромицину, канамицину,

окситетрациклину, парамомицину, стрептомицину, пуромицину и хлорамфениколу [Martin, 1989]. Основная часть изученных детерминант резистентности, как правило, расположена на хромосоме.

Если вторичный метаболит синтезируется в процессе идиофазы, явно отличающейся от тропофазы, то экспрессия генов резистентности является нормальным явлением жизнедеятельности актиномицета. Но в некоторых случаях образование антибиотика происходит в процессе всей фазы роста. В этом случае микроорганизмы должны иметь защитные механизмы резистентности, при которых гены экспрессируются конститутивно вместе с образованием активного вещества.

Некоторые гены резистентности начинают функционировать только в присутствии соответствующих антибиотиков в среде. Продуцент хлортетрацикпина S.aureofaciens чувствителен к очень низким концентрациям тиострептона и макролидных антибиотиков. Однано присутствие в среде определенных небольших количеств тиострептона, эритромицина, тилозина, олеандомицина индуцирует резистентность к этим антибиотикам. Такой механизм регуляции генов резистентности расширяет адаптивные возможности штаммов-продуцентов за счет экспрессии соответствующих генов.

С помощью генетических методов установлено, что

устойчивость и собственному антибиотику контролируется одним или несколькими генами. Несколько генов устойчивости tir обнаружено в штамме-продуценте тилозина [Фролова, 1988; Birmingham, 1986]. Продуцент хлортетрациклина S.aureofaciens также имеет несколько генов устойчивости ter. Обнаружена перекрестная устойчивость этого штамма к присутствующим в среде макролидным антибиотикам и одновременно к более высоким концентрациям хлортетрациклина. Полученные мутанты с высоким конститутивным уровнем резистентности к хлортетрациклину, олеандомицину, эритромицину, тилозину обладали повышенной продукцией хлортетрациклина [Ломовская, 1990].

Если в штамме-продуценте присутствует не один, а несколько детерминант резистентности к антибиотику, то при этом часть из них может быть не сцеплена с генами биосинтеза. У продуцента макролидного антибиотика тилозина S.fradiae из трех генов резистентности только один ген не сцеплен с генами биосинтеза [Фролова, 1988]. Изучение детерминант устойчивости у мутантных штаммов S.coelicolor А3(2) показало, что пять изученных детерминант имели классическую хромосомную локализацию и располагались в трех различных локусах, занимая промежуточное положение между другими генами [Danilenko, 1995].

При изучении явления резистентности у стрептомицетов было обнаружено, что в некоторых случаях детерминанты резистентности функционируют в качестве позитивного регулятора генов биосинтеза. Это выявлено на примере генов резистентности к эритромицину у Saccharopolyspora erythraea, пуромицину и

биалафосу [Vara, 1985; Murakami, 1986].

Таким образом, сложный цикл морфологического развития, включающий рост полигеномного мицелия, образование спор, синтез вторичных метаболитов способствовали развитию генома актиномицетов, который может осуществлять сложный контроль экспрессии многочисленных генов. Переход от стадии активного роста к стационарной фазе и образование антибиотиков находится под контролем целой иерархии генов, включающей гены глобальной регуляции, регуляторные и биосинтетические гены. Гены биосинтеза организованы в кластеры и вместе с детерминантами резистентности контролируются регуляторными генами. Кластерная организация генов способствует тому, что вся группа генов может выражаться одновременно и транскрибироваться в одну попицистронную мРНК, которая транслируется рибосомами с образованием разных ферментов. Экспрессия генов происходит через узнавание РНК-полимеразой промоторов. Взаимодействие отдельных

РНК-полимераз с промоторами генов вторичного метаболизма и, следовательно, их экспрессия, возможно, контролируется плейотропными эффенторами (А-факторами и др. ).

ГЛАВА 3. Генетичесгая нестабильность

Характерным свойством, присущим многим штаммам актиномицетов, является высокая генетическая нестабильность, которая, вероятно, является результатом приспособления этих микроорганизмов к постоянно меняющимся условиям среды обитания.

Генетическая нестабильность может индуцировать изменение таких характерных для актиномицетов признаков как устойчивость к антибиотикам, способность образовывать пигменты, антибиотики, ауторегуляторы, воздушный мицелий, споры и т. д. В некоторых случаях наблюдается одновременное изменение неснольних признаков [Родионова 1988; Birch, 1990].

З.1.. Спонтанная генетичесгая нестабильность

Генетическая нестабильность является результатом значительных геномных перестроек, таких как амплификация, делеция, транспозиция [Даниленко, 1988]. Эти перестройки встречаются с высокой частотой в двух нестабильных концевых участках линейной хромосомы и близко к одной или двум амплифицирующимся единицам ДНК (AUD) [Leblond, 1994]. Клоны с мутантным фенотипом возникают при этом спонтанно. Частота появления вариантов с измененными признаками может достигать десятых долей процента [Birch,1990].

Известно, что вторичный метаболит меланин образуется многими штаммами стрептомицетов из тирозина с помощью фермента тирозиназы. Оказалось, что у мутантов Mel" S.glaucescens, не способных синтезировать меланин, делетированы

последовательности, содержащие ген tyr синтеза тирозиназы [Hentermann, 1985]. В хромосоме промышленного продуцента олеандомицина S.antibioticus присутствовали в большом числе копий (около 150) тандемно повторяющиеся последовательности. Увеличение дозы гена за счет амплификации участка ДНИ размером 31 т. п. н. привело к позитивной регуляции экспрессии синтеза олеандомицина [Орлова, 1983].

У Streptomyces ambofaciens RP181110, продуцента поликетидного антибиотика спирамицина, амплификация

специфического участка хромосомы AUD 205 влияет на биосинтез антибиотика таким образом, что потеря амплифицирующей последовательности приводит к восстановлению образования спирамицина. Амплифицированный участок хромосомы размером 930 т. п. н. , содержал гены orfPSt ответственные за образование кетоацилсинтазы, ацилтрансферазы, кеторедуктазы, а также фермента, переносящего ацильную группу. Продукты генов orfPS в высокой степени гомологичны БгуА и Raps белкам, ответственным за биосинтез эритромицина у Saccharopolyspora erythraea и рапамицина у Streptomyces hydroscopicus соответственно. orfPS штамма RP 181110 транскрибировали в тропофазе и идиофазе и сверхтранскрибировали у мутантного штамма, содержащего амплифицированный участок. Таким образом, амлификация участка ДНИ, имеющего ген поликетидсинтазы I типа, ответственна за потерю образования спирамицина мутантным штаммом [Aigle, 1996].

У некоторых стрептомицетов делеции тесно связаны с амплификацией, точнее делеции предшествуют амплификации [Birch

1989]. Амплификации были обнаружены в штаммах S glaucescens, имеющих протяженные делеции; не было случая обнаружения амплификации в отсутствии сопровождающей делеции. Такие события, связанные с генетическими перестройками, как амплификации и делеции у разных видов стрептомицетов встречаются в 2-3 раза чаще, чем у E.coli и B.subtilis. Генетическая нестабильность, сопровождающаяся делециями крупных участков ДНИ, происходит без летального исхода у микроорганизмов, что, предполагает отсутствие в делетированных областях жизненно важных генов [Birch, 1£90].

У S.glaucescens делеции участков хромосомы с генами, кодирующими тирозиназу и гидроксистрептомицинфосфотрансферазу, явились в свою очередь компонентами более протяженных делеций от 270 до 800 т. п. н. [Hintermann, 1984,1985].

Амплифицированные участки хромосомы могут иметь протяженность от 2, 9 до 93 т. п. н. и составлять до 500 повторяющихся единиц амплификации [Birch, 1990].

В ряде экспериментов получены данные, показывающие, что увеличение резистентности к антибиотикам и возрастание продуктивности штаммов актиномицетов явилось результатом амплификации, которая индуцирует генетическую нестабильность [Flett, 1987; Hornemann, 1987; Huetter, 1988]. Так, например, устойчивость к канамицину, гентамицину и неомицину у мутантных штаммов S.kanamyceticus и нестабильного кап" мутанта

обусловлена высоким уровнем амплификации резистентного гена ктг [Demydchuk, 1997].

Известно, что плазмиды, существующие в интегрированном в хромосому состоянии, способны вырезаться из нее и существовать автономно. Вырезка специфических последовательностей с частотой, характерной для рекомбинационных событий, может также приводить к высокой генетической нестабильности ряда признаков у актиномицетов [Ломовская, 1990].

Хромосомные перестройки - амплификации и делеции - могут явиться причиной экспрессии молчащих генов. Результатом амплификации фрагментов ДНК штамма Б.гшозив 183 - продуцента канамицина явилась экспрессия молчащих генов резистентности к антибиотику. Амплификация фрагмента хромосомы протяженностью 15 т. п. н. привела к повышенной устойчивости этого штамма к канамицину [Вапл.1епко, 1995].

Многие гены, ответственные за нестабильные состояния являются молчащими, поэтому включение и выключение молчащих генов, вероятно, является дополнительным фактором генетической нестабильности у актиномицетов [БапИепко, 1995].

Во многих изученных случаях детерминанты резистентности являются генетически нестабильными.

Были получены чувствительные варианты штамма 3.г1тозиз 183 продуцента окситетрациклина устойчивого к большинству аминогликозидных антибиотиков. Проверенные варианты оказались нестабильными и ревертировали в исходный резистентный тип. Отобранный резистентный вариант штамма ¿7. готовив РЗ был в пять раз устойчивее к канамицину, чем исходный штамм, и рос в жидкой среде при 50000 мкг/мл канамицина. Ферментативная активность,

обнаруженная у высоноустойчивого штамма РЗ, может быть детерминирована молчащими генами резистентности, которые присутствовали в исходном штамме. У исходного штамма £Г.г^повиБ 183 обнаружено четыре различных гена резистентности, три из них не экспрессировались. У высоноустойчивого штамма РЗ произошла их экспрессия, т. е. активация трех молчащих генов. Для этого была необходима мутация гена, ответственного за резистентность к канамицину у исходного штамма, или включение молчащих генов в какой-либо путь, контролирующий резистентность. Автор считает, что повышенная резистентность к канамицину у устойчивого к этому антибиотину штамма была обусловлена экспрессией молчащих генов. Экспрессия сопровождалась амплификацией (15 т. п. н. ) фрагмента ДНК в хромосоме З.г1лю£ги5 [Вап11епко, 1995].

Продуцент аверментина Б. ауеттИЩв имел сильную

морфологическую изменчивость и гетерогенность популяции; был

чувствителен к изучаемым двадцати трем антибиотикам. Можно

предположить, что этот штамм имеет гены резистентности к разным

антибиотикам, но они находятся в молчащем, не энспрессированном

состояниии. В действительности были получены мутанты,

резистентные к каждому из этих антибиотиков с относительно

- 4

высокой частотой (10 ). Большинство мутаций оказались

плейотропными. Высокая частота их появления, плейотропный характер, относительная нестабильность по признаку устойчивости к исследуемым антибиотикам говорит о том, что эти мутации не точечные и происходят вследствие запуска соответствующих молчащих генов. Антивация молчащих генов может быть осуществлена

двумя механизмами: 1) с помощью мутаций регуляторных генов, вовлеченных в экспрессию молчащих генов; 2) с помощью амплификации участков ДНК, содержащих гены резистентности к данному антибиотику. В обоих случаях возможны плейотропные изменения, затрагивающие различные свойства, в т. ч. стабильность. Сравнительное изучение электорофореза полной и обработанной соответствующими ферментами ДНК исходного и мутантного штаммов S.avermitilis обнаружило сравнительно небольшие перестройки в ДНК мутантного штамма. Высказано предположение, что обнаруженные плейотропные мутации имели место в регуляторных генах. Включение молчащего emir гена уменьшило уровень морфологической изменчивости, изменило продукцию авермектина и привело к увеличению устойчивости к хлорамфениколу в двадцать раз [Danilenko, 199 5].

3.2. Индуцированная генетическая нестабильность

Генетичесная нестабильность актиномицетов усиливается под влиянием таких стрессовых факторов, как протопластирование, воздействие химических реагентов, экстремальных температур и хранения. Преимуществом индуцированных мутаций является образование с более высокой частотой вариантов с измененными признаками вторичного метаболизма и морфологии.

3. 2. 1. Влияние мутагенных факторов на генетическую нестабильность актиномицетов.

В зависимости от природы мутагенных факторов,

воздействующих на геном антиномицетов, могут возникать нак крупные хромосомные перестройки, так и точечные мутации.

Так, например, дикий штамм S. ambofaciens SA2002, образующий колонии, окрашенные в серый цвет, спонтанно выщеплял мутанты, не образующие пигмента (Pig с частотой около 0,8 16. Частота возникновения Pig" мутантов, индуцированных фторхинолонами, повышалась до 90 %. Потеря способности синтезировать пигмент мутантами определялась образованием делеций размером 150 т. п. н. В некоторых случаях делеции могли возникнуть в результате амплифинаций в двух нестабильных локусах AUD б и AUD 90 генома S. ambofaciens. Такие мутагенные факторы нак УФ, митомицин С, азотистая кислота увеличивали частоту возникновения Pig- мутантов более, чем на 30%. Два ингибитора ДНК-гиразы - новобиоцин и оксолиновая кислота - также стимулировали генетическую нестабильность у S ambofaciens, причем, оксолиновая кислота увеличила частоту Pig" мутантов почти до 100% при концентрации, которая не влияла на эффективность споруляции [Volff, 1994].

Другим примером генетической нестабильности, индуцированной обработкой мутагенами, может быть получение мутантных штаммов после обработка УФ-лучами и нитрозогуанидином культуры S.murayamaensis, образующей кинамицины. Установлено, что кинамицины образуются из поликетидного предшественника. Авторы также установили, что исходный штамм синтезирует редкое поликетидное производное о-фенантранвинон, мурияквинон, т.е. существует в одном микроорганизме не менее двух независимых

путей синтеза полинетидов. Под действием нитрозогуанидина и УФ-лучей были выделены мутанты, не синтезирующие кинамицин и синтезирующие или не синтезирующие муриянвинона. Те из них, которые синтезировали мурияквинон, по сравнению с диким типом имели уровень биосинтеза, намного превышающий уровень исходного штамма; мутанты, не синтезирующие мурияквинон образуют значительные количества новых квинонов, из которых некоторые присутствовали в исходном штамме в следовых количествах [Cone, 1991].

После воздействия теплового шока культура S.venezuelae синтезировала поликетидный антибиотик ядомицин В. Генетическое исследование показало, что кластер генов биосинтеза антибиотика содержит два регуляторных гена jadRl и jadRZ Продукт первого jadRl гена является регуляторным белком из группы PhoB, тогда как продукт jadR2 гена относится к известным белкам-репрессорам. Делеция или разрушение jadRl приводит к неспособности мутантного штамма синтезировать ядомицин В, а разрушение jadR2 гена вызывает образование антибиотика без предварительной стрессовой обработки. Таким образом, продемонстрировано, что воздействие теплового шока вызывает изменение регуляции синтеза ядомицина у S. venezuelae [Vining, 1997].

Воздействие на культуры актиномицетов интеркалирующими соединениями (акридиновыми красителями, антибиотиками из группы антрациклинов) также стимулируют возникновение генетической нестабильности [Родионова, 1988]. Обработка клеток этими агентами приводит к подавлению репликации как хромосомной, так и

плазмидной ДНК. Обнаружено, что ковалентно замкнутые кольцевые матрицы значительно более чувствительны к действию интеркаляторов, чем линейные. Для большинства стрептомицетов обработка интеркалирующими красителями и антибиотиками приводит к возникновению плейотропных мутаций, затрагивающих различные фенотипическиеи признаки. Частота возникновения вариантов с измененными признаками колеблется от нескольких процентов до 100% [Родионова, 1988]. В результате обработки интеркаляторами с высокой частотой одновременно утрачиваются несколько функционально не связанных признаков, что, по- видимому, вызвано обширными перестройками в геноме актиномицетов [оагу, 1992],

Обработка этидий бромидом родительского штамма Б .Ьудгоэсорхсиз 358 АУ2 ~ продуцента нарриомицина привела к появлению мутантных штаммов ЕВ32, не способных образовывать воздушный мицелий. Голые варианты помимо карриомицина синтезировали новый антибиотик курромицин. Обработка исходного штамма удговсор1сия другими интеркаляторами - акрифлавином (АФ) и акридином оранжевым (АО) - также привела к образованию нового антибиотика курромицина. Количество голых мутантов при обработке этими мутагенами возникало значительно меньше (АФ -7%; АО - 32%; ЭБ - 93%). Изучение фингерпринтов тотальной ДНК родительского 358 АУ2 и мутантного ЕВ32 штаммов с помощью ферментов рестрикции показало присутствие повторов с небольшим числом копий на фингерпринте мутантного штамма. Автор предполагает, что образование мутантным штаммом ЭБ32 антибиотика

нурромицина является следствием изменения последовательностей ДНК, индуцированное обработкой этидий бромидом [Ogura, 1986].

Обработка различными интеркалирующими агентами культуры Streptomyces hygroscopicus, синтезирующей карриомицин, приводила к выщепелению в популяции аспорогенных вариантов, синтезирующих как карриомицин, так и курромицины А и В, имеющих другую химическую природу. Наиболее эффективным мутагенным агентом был этидий бромид (до 93% аспорогенных вариантов). После исследования структуры курромицинов было показано, что в исходном штамме в следовых количествах в определенных культуральных условиях, в частности в зависимости от источника углерода, может образовываться курромицин А; курромицин В обнаружен не был. Таким образом, сопоставление исходного и одного из мутантных штаммов позволило авторам прийти к заключению, что с помощью этидий бромида произошло изменение регуляции синтеза карриомицина и курромицина. Хотя молекулярные механизмы индукции синтеза курромицина и, в неноторых случаях, карриомицина интеркалирующими агентами неизвестны, на основании полученных результатов авторы констатируют, что произошла активация молчащих генов биосинтеза антибиотиков [Ogura, 1986].

С целью получения новых перспективных антибиотиков Герлиц с сотрудниками обработали метилнитронитрозогуанидином штамм Streptomyces cellulosae ssp. griseoincarnatus FH-S 1114 продуцент комплекса поликетидных антибиотиков, биосинтез которых связан с действием оксидоредуктаз. У этого штамма, синтезирующего ангуциклинон, основным компонентом

антибиотического комплекса является элмицин D, минорными охромицинон и дезоксирабеломицин, следовыми - элмицины A, D, Ей F. После обработки мутагеном получен мутант 1114-2, который образовывал в большом количестве элмицин D, охромицинон, эмицин А, а также эмицины D, Е, F; в незначительном количестве синтезировал эмицин С. Таким образом, было доказано, что генетические изменения вызвали существенные модификации в спектре антибиотиков, синтезируемых стрептомицетом. Однако, осталось неясным, затронул ли мутагенез непосредственно гены одной или нескольких оксидоредуктаз или произошли регуляторные изменения, например, вследствие повышенного синтеза охромицинона, ноторый может использоваться как субстрат для действия оксигеназы [Gerlitz, 1995] .

3- 2. 2. Влияние протопластирования на генетическую нестабильность актиномицетов.

Протопластирование является сильным фактором, увеличивающим генетическую нестабильность актиномицетов. В результате слияния или регенерации протопластов возможны увеличение продуктивности штаммов - продуцентов антибиотиков или потеря антибиотической активности, элиминация плазмидной ДНИ, изменение спектра устойчивости к антибиотикам, образование новых антибиотиков, увеличение числа прототрофных ревертантов [Дудник, 1987; Орлова 1991 ].

Вышеперечисленные фенотипические изменения являются результатом различных хромосомных перестроек, стимулированных

слиянием или регенерацией протопластов. Один из мутантов (Ant~), полученный после протопластирования штамма S. fradiae продуцента тилозина, утратил способность синтезировать, по крайней мере, 7 ферментов, участвующих в последовательных этапах биосинтеза антибиотика, а также устойчивость исходного штамма к тилозину, хлорамфениколу, митомицину С, гигромицину, канамицину. В геноме этого мутанта обнаружена амплифицированная последовательность, состоящая из 500 тандемно повторяющихся единиц размером 10,5 т. п. н [Baltz, 1985].

В результате протопластирования у продуцента стрептомицина S. griseus SS-1198 были получены мутанты двух типов (SS-1198PR и NP1-1PR) , устойчивые к канамицину. Были нлонированы и охарактеризованы гены устойчивости обоих типов, а также молчащий ген дикого штамма. Установлено, что гены резистентности к канамицину контролируют синтез фермента

аминогликозидацетилтрансферазу (ААС(З)) нового типа. Точечная мутация гена приводит к появлению резистентности у штамма SS-1198RP, а амлификация участка ДНК индуцирует резистентность у NP1-1PR штамма. Уровень транскрипции гена мутантного штамма SS-1198PR был чрезвычайно высоким. Авторы делают вывод, что точечная мутация привела к появлению сильного промотора и к транскрипции молчащего гена, обусловливающего высокий уровень активности ААС(З) и резистентности к канамицину [Ishikawa, 1991].

Известна . роль протопластирования в образовании штаммов, синтезирующих антибиотические вещества, отличающихся от

антибиотиков родительских штаммов. Так, при слиянии протопластов S.griseus продуцента аминогликозидного антибиотика

стрептомицина и S.tenjimariensis, образующего аминогликозид истамицин, получен штамм, синтезирующий индолизомицин, структурно отличающийся от аминоглинозидов [Hotta, 1985]. При внутривидовои слиянии протопластов двух ауксотрофных мутантов Streptomyces sp. 215, образующих ваззумицин, получен рекомбинантный штамм, синтезирующий два компонента из группы виргиниамицинов [Singh, 1987-1988]. Новый антибиотик неизвестной структуры получен в результате слияния протопластов S.antibioticus, продуцента мультиомицина, и S. fradiae, продуцента неомицина [Okamura, 1989].

При слиянии протопластов штамма S. monomycini ИНА 1465, образующего мономицин, и штамма S. kanamyceticus ИНА К-13, образующего канамицин, был получен штамм 344, синтезирующий альбофунгин и хлоральбофунгин. При сравнительном изучении фингерпринтов тотальных ДНК всех трех штаммов было обнаружено существенное сходство между штаммами S.monomycini и 344. Фингерпринт штамма 344 показал отсутствие фрагмента ДНК размером около 20 т. п. н. , характерный для родительского штамма S. monomycini. Высказано предположение, что штамм 344 образовался в результате перестройки генома продуцента мономицина, выраженной в исчезновении уникального фрагмента тотальной ДНК. Изменение хромосомной ДНК могло произойти вследствие делеции фрагмента хромосомы S. monomycini размером не менее 20 т. п. н. [Маланичева , 1991].

Так, при межвидовом слиянии Б^ггвеив неактивного мутанта продуцента стрептомицина и Б. Ьепз1таг1епз1в неактивного мутанта продуцента истомицина получен рекомбинантный штамм, синтезирующий новый антибиотик индолизомицин [Но^а 1985]. Из десяти неактивных штаммов разных видов Streptomycesг У которых осуществлялась регенерация протопластов, у четырех наблюдалось появление активных клонов. Также обнаружено с высокой частотой появление продуцентов неизвестных антибиотиков в результате слияния (1,3-26,8%) и простой регенерации (1-20%) протопластов большинства проверенных активных и неактивных штаммов

стрептомицетов [Маланичева, диссер. ]. Наиболее вероятной причиной образования «молчащих» антибиотиков является активация молчащих генов биосинтеза этих антибиотиков, которые присутствовали в геноме исходных штаммов [Нор\*оос1, 1981].

Таним образом, наиболее вероятной причиной синтеза штаммами - продуктами слияния протопластов антибиотиков, отличающихся по химической природе от антибиотиков, образуемых исходными штаммами, является активация молчащих генов биосинтеза вторичных метаболитов у родительских штаммов. Утрата способности к образованию исходных антибиотиков у штаммов - продуктов слияния протопластов может быть вызвана изменением экспрессии регуляторных генов или изменением структурных генов соответствующих биосинтетических путей [Маланичева, 1991].

Предпринята попытка использования методов

протопластирования для повышения антибиотической активности штаммов. Таким способом удалось увеличить активность продуцентов

манролидных антибиотиков спирамицина (S.ambofaciens) и тилозина (S.fradiae) в 2 раза соответственно, а цинломицина (S.capoamus) - в 5 раз [Baltz, 1985; Ikeda, 1983].

Интересные результаты были получены при протопластировании неактивных штаммов актиномицетов. В результате слияния протопластов неактивных продуцентов актиномицина S.chrysomallus 305 и Streptomyces sp. 26-115 получен рекомбинантный штамм, образующий новый антибиотик неантиномициновой природы [Орлова, 1991 ]. При регенерации протопластов неактивного штамма S.fradiae ИНА 00708 - продуцента неомицина получены штаммы, образующие неомицин, и штаммы, которые образуют антибиотики, отличающиеся от неомицина. По-видимому, геном штамма 00708 содержит гены, ответственные за биосинтез неомицина и других антибиотиков неизвестной природы. В норме эти гены находятся в репрессированном состоянии и начинают функционировать после генетических перестроек, обусловленных слиянием и регенерацией протопластов.

При изучении регенерации протопластов 10 неактивных штаммов появление активных клонов было отмечено у 4-х регенерантных штаммов с частотой 2-10%. Активность клонов была низкой и утрачивалась при пересевах. Полученные результаты указывают на возможность обнаружения продуцентов антибиотиков среди неактивных штаммов с помощью метода регенерации протопластов [Маланичева , 1993].

Генетическая нестабильность, присущая многим штаммам актиномицетов, влияет на такие характерные признаки, как

спорообразование, биосинтез антибиотиков, пигментов,

устойчивость н антибиотикам, ауксотрофность. Генетическая нестабильность является результатом геномных перестроек, встречающихся в специфических областях, содержащих нестабильные детерминанты. Клоны с мутантным фенотипом возникают при этом спонтанно, а под влиянием стрессовых факторов (обработка мутагенами, протопластирование, изменение температуры) частота вариантов с измененными признаками возрастает. Такие события, как включение и выключение молчащих генов, интеграция или вырезка плазмид также приводят к высокой генетической нестабильности.

ЭКСПЕРИМ EH ТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Заключение диссертации по теме «Химиотерапия и антибиотики», Малкина, Наталья Дмитриевна

выводы

1. В результате обработки 95 неактивных штаммов актиномицетов различными мутагенами у 43 были выявлены активные варианты; таким образом доказано, что при определенных условиях у многих неантивных штаммов актиномицетов в популяции могут быть обнаружены варианты, способные синтезировать антибиотики, что свидетельствует о более широком распространении актиномицетов-антагонистов в природе, чем можно судить по результатам традиционного скрининга.

2. Частота возникновения активных колоний после обработки неактивных культур этидий бромидом составляла не менее О, 1%, а у 21 из 43 культуры - более 10%; частота появления активных колоний после обработки даунорубицином в ряде случаев оказалась более высокой (от 0,5% до 50%); Метилнитронитрозогуанидин индуцировал образование активных колоний с частотой от О, 1% до 47%. Обработку неактивных культур актиномицетов мутагенами можно считать методом индукции образования антибиотиков у этих культур.

3. Показано, что способность синтезировать антибиотики у 49 (51%) активных вариантов, полученных под действием различных мутагенов, сохраняется не менее, чем в четырех пассажах; таким образом, образование антибиотиков носит стабильный характер.

4. Установлена таксономическая принадлежность девяти мутантных штаммов - продуцентов антибиотиков и исходных культур.

5. Накоплены и изучены антибиотики семи мутантных штаммов: антибиотик из группы цервиномицинов, образуемый

Атусо1аЬа аиЬогорЬ1са 167ЭБ5; антибиотик неизвестной ранее природы, образуемый ЗассЬагоЫ1г1х зуг1пд1ае 1281ЭБ10; антибиотический комплекс из четырех компонентов (два из которых антрахиноны, два других - вещества, активные в отношении грамположи тельных тест-микроорганизмов), образуемый Носагантибактериального действия, образуемые БЬгерЬотусез с1ппатопепз1з 2798МННГ100; брунеомицин, образуемый ЗЬгерЬотусеэ Ье1уаЫсиз 5738МННГ50, - новым продуцентом этого антибиотика; монензин, образуемый БЬгер^тусез }1е1уо1оу1о1асеиз 2608ЭБ5, - новым продуцентом антибиотика; актиномицин образуемый БЬгерЬотусез У1о1асеогиЬег

977ЭБ20, - новым продуцентом антибиотика.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Малкина, Наталья Дмитриевна, 1998 год

- 135 -СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алиханян С. И. 1968. Селекция промышленных микроорганизмов. М. » Изд-во «Наука», с. 284-287.

2. Бондарцев A.C. 1954. Шкала цветов (Пособие для биологов при научных и научно-прикладных исследованиях). - М. , JI.

3. Бражникова М. Г. , Н. В. Константинова, Н. П. Потапова, И. В. Толстых. 1977. Физико-химическая характеристика нового противоопухолевого антибиотика нокамицина. Антибиотики. 6, с. 486-488.

4. Бражникова М. Г. , В. И. Пономаренко, И. Н. Ковшарова и др. 1968. Исследование брунеомицина, образуемого Act. albus var, bruneomucini, и его идентификация со отрептонигрином. Антибиотики. 2, с. 99-102.

5. Гаузе Г. Ф. , Ю. В. Дудник. 1987» Противоопухолевые антибиотики. М. , «Медицина», с. 23, 27.

6. Гаузе Г. Ф. , Т.П. Преображенская, М. А. Свешникова и др. 1983. Определитель актиномицетов. М. .-Наука.

7. Гаузе Г. Ф. , М. А. Свешникова, P.C. Ухолина и др. 1977. Образование нового антибиотика нокамицина культурой Nocardiopsis syringiae sp.nov. Антибиотики. 6, с. 483-486.

8. Даниленко В. Н. , Родионова И. И. 1988. Механизмы генетической нестабильности стрептомицетов. Антибиотики и химиотерапия, 33 (3), с. 164-171.

9. Дудник Ю. В. , Козьмян JI. И. 1987. Использование метода слияния протопластов актиномицетов для получения рекомбинантных штаммов, образующих новые антибиотики. Антибиотики и медицинская биотехнология. 2, с. 86-89.

10. Захаров И. А. 1978. Методы селекции продуцентов

антибиотиков и ферментов. Л. , «Медицина», с. 42-43.

11. Звягинцев Д. Г., И.В.Асеева, И. П. Бабьева, Т. Г. Мирчник. 1980. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М. ,МГУ, с. 224.

12. Инге-Вечтомов. 1984. Генетика с основами селекции. М. , «Высшая школа», с. 391.

13. Конев Ю. Е. , В. А. Цыганов, Е. Д. Этингов и др. 1973. Выделение и идентификация гептаенового антибиотика, образуемого новым видом Actinomycetes helvoloviolaceus п.sp. Антибиотики, 18(4), с. 354-358.

14. Кузнецов В. Д. 1972. Изучение изменчивости актиномицетов продуцентов антибиотиков и других биологически активных

веществ. Антибиотики. 7, с. 666-671.

15. Ломовская Н. Д. 1990. Генетика актиномицетов рода Streptomyces - продуцентов биологически активных веществ. В кн.: Генетика промышленных микроорганизмов и биотехнология. М. , Наука, с. 35-62.

16. Маланичева И.А. 1997. Использование методов клеточной инженерии актиномицетов для получения продуцентов новых антибиотиков. Диссертация на соискание ученой степени к. б. н. Москва.

17. Маланичева И. А. , Козьмян Л. И., Белова А. Ю. , Дудник Ю. В. 1993. Использование методов слияния и регенерации протоластов для поиска продуцентов антибиотиков среди неактивных штаммов стрептомицетов. Антибиотики и химиотерапия, 38 (6), с. 8-11.

18. Маланичева И. А. , Л. И. Козьмян, Ю. В. Дудник и др. 1991. Образование альбофунгина штаммом, полученным в результате слияния протопластов продуцентов аминогликозидных антибиотиков. Антибиотики и химиотерапия. 36(5), с. 5-8.

19. Маланичева И. А., Л. И. Козьмян, Ю. В. Дудник и др. 1992.

Сравнительное изучение стрептомицетов-продуцентов аминогликозид-ных антибиотиков мономицина и канамицина и штамма 344, полученного при слиянии их протопластов, методом рестрикционных фингерпринтов тотальной ДНК. Антибиотики и химиотерапия. 37(5), с. 5-7.

20. Международный кодекс номенклатуры бактерий. 1978. М.: Наука.

21. Орехов A.B., Н. Д. Ломовская. 1986. Актиномицеты -объекты генно-инженерных исследований. Генетика, 22(11), с. 2593-2604.

22. Орлова Т. И. 1991. Слияние протопластов неактивных вариантов двух продуцентов актиномицина С и биосинтез антибиотиков неактиномициновой природы. Антибиотики и химиотерапия, 36(4), с. 3-5.

23. Орлова В. А. , В. Н. Даниленко. 1983. Мультипликация фрагмента ДНК у Streptomyces antibioticus - продуцента олеандомицина. Антибиотики. 3, с. 163-167.

24. Пехов А.П. 1977. Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов. В кн. : Генетика бактерий. М. , Медицина, с. 346.

25. Родионова И. И, В. Н. Даниленко. 1988. Факторы генетической нестабильности стрептомицетов и их использование в генетико-селекционной практике. Антибиотики и химиотерапия. 33(3), с. 171-179.

26. Табаков В.Ю., Т. А. Воейкова. 1997. Элементы систем регуляции биосинтеза антибиотиков. Генетика, 33 (11), с. 1461-1477.

27. Тарасов В.А.. 1982. Молекулярные механизмы репарации и мутагенеза. М. , Изд-во «Наука», с. 20-21.

28. Фролова Г. Я. , Т. А. Чиненова и др. 1988. Идентификация

генов, ответственных за биосинтез тилозина и устойчивости к тилозину у штамма Streptomyces fradiae Б-45. Биотехнология. 4(1), с. 37-44.

29. Франклин Т. , Дж. Сноу. 1984. Био/химия антимикробного действия. М. , Изд-во «Мир», с. 104-105.

30. Хохлов А. С. , Д. Т. Анисова, И. И. Товарова и др. 1973. Влияние А-фактора на рост аспорогенных мутантов Streptomyces griseus, не образующих этот фактор. Микробиология, 13, 647-655.

31. Хохлов А. С. , И. И. Товарова, JI. Н. Борисова и др. 1967. А-фактор, ответственный за биосинтез стрептомицина мутантным штаммом Actinomyces streptomycini. Доклад АН СССР. Т. 177, 2, с. 232-235.

32. Adamidis W. , P. Riggle, W. Champness. 1990. Mutation in a new Streptomyces coelicolor locus which globally block antibiotic biosynthesis but not sporulation. J Bacterid. 172, P. 2962-2069„

33. Agtarap A., J.W. Chamberlin, M. Pinkerton et.al. 1967. Monensin A, a new biologically active compound. J. Am. Chem. Soc. 89(22), P. 5737.

34. Aigle В., D. Schneider, C. Morilhat et.al. 1996. An amplifiable and deletable locus of Streptomyces ambofaciens RP181110 contains a very large homologous to polyketide synthase genes. Microbiology, 142(10), 2815-2824.

35. Anzai H., T. Murakami, O. Haraet. et.al. 1988. Organization and regulation of bialaphos biosynthetic genes. In: Biology of Actinomycetes,88, ed. Y. Okami, T Beppu, H. Ogawara, P.92-96. Tokyo: Jpn. Sci.Soc. P. 508.

36. Baltz R.H., J. Stonisifer. 1985. Phenotypic changes assotiated with loss of expression of tylosin biosynthesis and

resistance genes in Streptomyces fradiae. J. Antibiot. 38, P. 1226-1236.

37. Behal V. , J. Neuzil and Z. Hostalek. 1983. Effect of tetracycline derivativ and some cations on the activity of anhydrotetracycline oxygenase. Biotechnology Letters, 5, P. 537-542.

38. Beppu T. 1986 Pleiotropic regulatory mechanisms of secondary metabolism in Streptomyces. In: Overproduction of microbial metabolites. Strain improvement and process control strategies. Z.Vanek, Z. Hostalek (edit.). Butterworths, Boston, P.165-200.

39. Binnie C. , M. Warren, M.J. Butler. 1989. Cloning and geterologous exspression in • Streptomyces lividans of Streptomyces rimosus genes involved in oxytetracycline biosynthesis. J. Bacterid. 171, 887-895.

40. Birch A., M. Haeusler, M. Voegtli et.al. 1989. Extremely large chromosomal deletions are intimately involved in genetic instability and genomic rearrangement in Streptomyces glaucescens. Mol. Gen. Genet. 217, 447-458.

41. Birch A., M. Haeusler, R. Huetter. 1990. Genome rearrengement and genetic instability in Streptomyces sp. J.Bacterid. 178, (8), 4138-4142.

42. Birmingham V.A., K.L. Cox et.al. 1986. Cloning and expression of a tylosin resistance gene from a tylosin-producing strain of Streptomyces fradiae.Mol. and Gen. Genet. 204, P. 532-539.

43. Castro J., P Liras., J. Cortes and J.F. Martin. 1985. Regulation of a-aminoadipyl-cystein-valine, isopenicillin N

synthetase, isopenicillin N isomerase and deacetoxycephalosporin C synthetase by nitrogen sources in Streptomyces lactamdurans. Appl. Microbiol, and Biotechnol. 22, P. 32-40.

44. Chater K.F., C.J. Bruton. 1983. Mutational cloning in Streptomyces and the isolation of antibiotic production genes. Gene. 26, P. 67-78.

45. Chater K.F. 1990. The improving prospects for yield increase by genetic engineering in antibiotic-producing streptomycetes. Bio/Technology, 8, 115-121.

46. Chater K.F. 1984. Morphological and physiological differentiation in Streptomyces. Microbial development. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab., P.89-115.

47. Chater K.F., C.J. Brutton. 1985. Resistance, regulatory and production genes for the antibiotic methylenomycin are clustered. EMBO J. 4, 1893-1900.

48. Chen C.W., Lin Y.-S., Y.-L. Yang and et.al. 1994. Structure and dynamics of the linear chromosomes of streptomycetes. Theses of 9th Inter. Symposium on the biology of actinomycetes. Moscow, Russia. July 10-15, P. 152.

49. Cone M.C. and S.J. Gould. 1991. New metabolites from a mutant strain of the kinamycin producer, Streptomyces murayamaensis. 8th Intern. Symposium Biology of Actinimycetes. August 11-16, Madison, Winconsin, USA. Theses, P2-096.

50. Cortes J., P. Liras, J.M. and J.F. Martin. 1986. G1 gerulation of cephamycin biosynthesis in Streptomyces lactamdurans is exerted on the formation of a-aminoadipyl-cysteinyl-valine and deacetoxycephalosporin C syntase. J. of Gen. Microbiol. 132, 1805-1814.

51. Cox, K.L., S. E. Fishman, J.L. Larson et al. 1986. The

use of recombinant DNA techniques to study tylosin biosynthesis and resistance in Streptomyces fradiae. Natur. products, 49, 971-979.

52. Cox K.L., S.E. Fishman, J.L. Larson et.al. 1987. Cloning and characterization of genes involved in tylosin biosynthesis. In: Genetics of Industrial Microorganisms, ed. M. Alacevie, D. Hranueli, Z. Toman. P. 337-346. Zagreb, Yugoslavia: Pliva. P. 579.

53. Cundliffe E. 1989. How antibiotic-producing organisms suicide. Annu. Rev. Microbiol. 43, P. 207-233.

54. Danilenko V.N., Akopiants K.E. 1995. Instability of the genome and "silent" genes of actinomycetec. Proceeding of the 9th Int. Symposium on the biology of Actinomycetes, July 10-15, 1994, Moscow, Russia, (Биотехнология, 7-8, с. 103-113).

55. Dary A., N. Bourget, N. Girard et.al. 1992. Amplification of a particular DNA sequence in Streptomyces ambofaciens RP181110 reversibly prevents spiramycin production. Res. Microbiol. 143, 99-112.

56. Daza A., J.A. Gil and J.F. Martin. 1990. Cloning and characterization of a gene of Streptomyces griseus that increases production of several extracellular enzymes in Streptomyces species. J. Bacteriol. 222, 384-392.

57. Demain A.L. 1992. Regulation of secondary metabolism. In: Biotechnology of filamentous fungi. Finkelstein D.B., London, P. 89-112.

58. Demain A.L. 1989. Carbon source regulation of idiolite biosynthesis in actinomycetes. In: Regulation of secondary metabolism in Actinomycetes. Shapiro S., CRC Press, Boca Raton, Fla, P. 127-134.

59. Demydchuk J., M. Oliynyk, Z. Oliynyk et.al. 1997. Cloning, sequencing and hybridisation analysis of kanamycin-resistance genes from different strains of Streptomyces kanamyceticus. 10th Inter. Symposium on Biology of Actinomycetes. May 27-30, Beijing, China. Abstract, 10P3.

60. Distler J., K. Mansouri, J. Bull et.al. 1992. Streptomycin biosynthesis and its regulation in Streptomyces. Gene. 115, P. 105-111.

61. Distler J., W. Piepersberg. 1985. Cloning and characterization of a gene from Streptomyces griseus coding for a streptomycin phosphorylating activity. FEMS Microbiol.Lett. 28, 113-117.

62. Flett F., J. Cullum. 1987. DNA deletions in spontaneous chloramphenicol-sensitive mutants of Streptomyces coelicolor A3(2) and Streptomyces lividans 66. Mol. Gen.Genet. 207, 499-502.

63. Gerlitz M., Udvarnoki G., Rohr J. 1995. Biosynthesis of novel emycins from the mutant strain Streptomyces cellulosae ssp. griseoincarnatus 1114-2. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34(15), P. 1617-1621.

64. Goodfellow M. 1971. Numerical taxonomy of some nocardioform bacteria. J. Gen. Microbiol. 69(1), P. 33-80.

65. Gordon R.E. 1967. The taxonomy of soil bacteria. In: The ecology of soil bacteria. Eds. Gray T.R. , Parkinson.- P. 293-321.

66. Graefe U. , G. Reinhardt, I. Eritt, W.F. Fleck. 1985. Der A-Factor - ein pleiotroper endogener Effector der Zytodifferenczierung von Streptomyces-griseus -Stammen. Biol. Zbl. 104, 361-373.

67. Grund E. , R.M. Kroppenstedt. 1990. Chemotaxonomy zand numerical taxonomy of the genus Nocardiopsis Meyer 1976. Int. J. Syst. Bacterid. 40(1), P. 5-11.

68. Haney M.E., M.M. Hoehn. 1967. Monensin, a new boilogically active compound. I. Discovery and isolation. Antimicrob. agents Chemother - 1967: 349-352.

69. Hara 0., T. Murakami, S. Imai et.al. 1991.The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces viridochromogenes: cloning, expression, heterospecific exsoression and comparison with the genes of Streptomyces hygroscopicus. J. Gen. Microbiol. 137, P. 351-359.

70. Hasegawa T., M. Takizawa, S. Tanida. A rapid analysis for chemical grouping of aerobic actinomycetes. J. Gen. Appl. Microbil. 1983, 29, P. 319-322.

71. Hintermann G., M. Zatchej, R. Huetter. 1985. Cloning and expression of the genetically unstable tyrosinase structural gene from Streptomyces glaucescens. Mol. and Gen. Genet. 200, P. 422-432.

72. Hintermann G., R. Crameri, M. Voegtli et.al. 1984. Heterogeneous genomic amplification in Streptomyces glaucescens: structure, location, and function sequence analysis. Mol. Gen.Genet. 200, 375-384.

73. Hintermann G., M. Zatchej and R. Huetter. 1985. Cloning and expression of the unstable tyrosinase structural gene from Streptomyces glaucescens. Mol. Gen.Genet. 200, 513-520.

74. Hirochika H. , K. Nakamura, K. Sakaguchi. 1982. Analis of linear DNA plasmids isolated from Streptomyces. Plasmid. 7, P. 59-65.

75. Holt T.G., C. Chang, C. Laurent-Winter and et.al. 1992.

Global changes in gene expression related to antibiotic synthesis in Streptomyces hygroscopicus. Mol. Microbiol. 6, 969-980.

76. Hopwood D. A. 1965. A circular linkage map in the actinomycete Streptomyces coelicolor. J. of Molecular Biology, 12, 514-516.

77. Hopwood D., K.Chater, M. Bibb. 1994. Genetics of antibiotic production in Streptomyces coelicolor A3(2): A model streptomycete. Genetic and biochemistry of antibiotic production. Ed. Vining L. Butterworth-Heinemann: Newton. MA. P. 65-101.

78. Hopwood D.A., J. M. Bibb, K. F. Chater et.al. 1986. Regulation of gene expression in antibiotic-producing Streptomyces. Symposium of the socirty for general microbiology. Regulation of Gene expression. J. Booth and C. Higgins (eds.) Cambridge University Press.

79. Hopwood D. A. 1981. Possible application of genetic recombi- nation in the discovery of new antibiotics in actinomycetes. In: The future of Antibiotherapy and antibiotic research. London, Acad.Press. P. 407-414.

80. Horinouchi S. and T. Beppu. 1992. Autoregulatory factors and communication in Actinomycetes. Annu. Rev. Microbiol. 46, 377-398.

81. Horinouchi S., 0. Hara, T. Beppu. 1983. Cloning of pleiotropic gene that positively controls biosynthesis of A-factor, actinorhodin , and prodigiosin in Streptomyces coelicolor A3(2) and Streptomyces lividans. J. Bacteriol. 155, 1238-1248.

82. Hornemann U., D. Otto, G. Hoffman et.al. 1987.

Spectinomycin resistance and associated DNA amplification in Streptomyces achromogenes subsp. rubradiris. J. Bacterid. 169, 2360-2366.

83. Hotta K. , F. Yamashita, Y. Okarni, H. Umesawa. 1985. New antibiotic -producing streptomycetes, selected by antibiotic resistance as a marker. 2. Feature of new antibiotic-producing clones, generated after fusion treatment. J. Antibiotics. 38(1), P. 64-69.

84. Hotta K., J. Ishikawa, M. Ichihara et.al. 1988a. Mechanism of increased kanamycin-resistance, generated by protoplast regeneration of Streptomyces griseus. I. Cloning of a gene segment directing a high level of an aminoglicoside 3-N-acetyltransferase activity. J Antibiotics, 4(1), 94-103.

85. Hotta K., J. Ishikawa, S. Mazuno. 19886. Activation of cryptic kanamycin resistance gene in Streptomyces griseus. Proceeding of the 7th Inter. Symposium on the Biology of actinomycetes, Tokio, Japan, P. 380-385.

86. Hotta K. , J. Ishikawa. 1988b. Strain- and species-specific distributon of streptomycin gene cluster and kan-related sequences in Streptomyces griseus. J. of Antibiotics, 41(8), P. 1116-1123.

87 Hotta K., S. Takamura, Y. Hosoya et.al. 1994. Visualization of potential antibiotic productivity of actinomycetes: effect of antibiotics, amino acid analogues, and shift-down. The 9th Inter. Symposium on the Biology of Actinomycetes. Jujy 10-15, Moscow, Russia. Theses, P2-16.

88. Huetter R. , T. Eckhardt. 1988. Genetic manipulation. In: M. Goodfellow, S. Williams and M. Mordarski (ed.), Actinomycetes in biotechnology. Academic Press, Inc. (London),

89. Ikeda H. , E.T. Seno, C.J. Bruton, K.F. Chater. 1984. Genetic mapping,cloning and phisiological aspects of the glucose kinase gene of Streptomyces coelicolor. Mol. Gen. Genet. 196, P. 501-507.

90. Ikeda H., S. Omura. 1995, Control of avermectin biosynthesis in Streptomyces avermitilis for the selective production of a useful components. J. of Antibiot. 48(7), P. 549-562.

91. Ikeda H., M. Inoue, S. Omura. 1983. Improvement of macrolide antibiotic-producing Streptomycete strains by the regeneration of protoplasts. J Antibiotics. 36(3), P. 283-288.

92. Ishikawa J., S. Mizuno and K. Hotta. 1991. Molecular mechanism of activation of the cryptic Kan gene in Streptomyces griseus. 8th Intern. Symposium Biology of Actinimycetes. August 11-16, Madison, Winconsin, USA. Theses, Pl-054.

93. Jhang J., S. Wolfe and A.L. Demain. 1989. Phosphate regulation of ACV syntetase and cephalosporin biosynthesis in Streptomyces clavuligerus. FEMS Microbiology Letters, 57, 145-150.

94. Jones G. , D. Hopwood. 1984. Activation of phenoxaz synthase expression in S, lividans by cloned DNA sequences from S. antibioticus. J. Biol. Chem. 259, 14151-14157.

95. Jones D. A. 1975. Numerical study of coryneform and related bacteria. J. Gen. Microbiol. 87(1), P. 52-96.

96. Jones G.H. 1985. Regulation of phenoxazinone synthase expression in Streptomyces antibioticus. J. of Bacterid. 163, 1215-1221.

97. Kawaguchi T., T. Asahi, T. Satoh and et.al. 1984.

B-factor, an essential regulatory substance inducing the production of rifamycin in a Nocardia sp. J. of Antibiot. 37, 1587-1595.

98. Kelly K.S., K. Ochi and G.N. Jones. 1991. Pleotropic effects of a relC mutation in Streptomyces antibioticus. J. Bacterid. 173, 2297-2300.

99. Khokhlov A. C. 1982. Low molecular weight microbial bioregulators of secondary metabolism. In: Overproduction of microbial product, ed. V. Krumphanzl, B. Sikyta, Z. Vanek. London: Academic. P. 97-109.

100. Kinashi H., M. Shimaji. 1987. Detection of giant linear plasmids in antibiotic producing strains of Streptomyces by the OFAGO technique. J of Antibiot. 40, P. 913-916.

101. Kinashi H., M. Shimaji, T. Hanafusa. 1992. Integration of SCP1, a giant linear plasmid into the Streptomyces coelicolor chromosome. Gene. 115, P. 35-41.

102. Kondo S., M. Katayama., S.Marumo. 1986. Carbazomycinal and 6-methoxy-carbazomycinal as aerial mycelium formation-inhibitory substance of StreptoverticiIlium species. J. of Antibiot. 39, 727-730.

103. Kumada Y., S. Horinouchi, S. Uozumi, T. Beppu. 1986. Cloning of a streptomycin-production gene directing synthesis of N-methyl-glucosamine. Gene, 42, 221-224.

104. Lancini G. 1993. Biotechnology of antibiotics and other bioactive microbial metabolites. Lancini G. Lorezetti R. Plenum press, New York.

105. Lutz W.K., Winkler F.K., J.D. Dunitz. 1971. Crystal structure of the antibiotic monensin. Similarities and differences between free acid and metal complex. Helv. Chem.

106. Leblond P. and B. Decaris. 1994. Genetic instability in Streptomyces ambofaciens: genome structure, inducibility of the rearrangements and expression of the unstable region. Theses the 9th Inter. Symposium on the Biology of Actinomycetes, July 10-15, Moscow, Russia, S 3-2, P. 42.

107. Lechevalier M. 1968. Identification of aerobic actinomycetes of clinical importance. J. Labor. Clinical Medicine. 71(6), P. 934-944.

108. Lechevalier M.P., H. Prauser, D.P. Labedo, T.-S. Ruan. 1986. Two new genera of Nocardioform Actinomycetes: Amycolata gen. nov. and Amycolatopsis gen nov. J. Syst. Bacteriol. 36(1), P. 29-37.

109. Li H., W. Lu, Y. Zhang et al. 1991. Novel antibiotic mutactimycin produced by a mutant of natural non-antibiotic producing Streptomyces. 8th Intern. Symposium Biology of Actinimycetes. August 11-16, Madison, Winconsin, USA. Theses, P2-001.

110. Lin Y. S., H.M. Kieser, D.A. Hopwood and C.W. Chen. 1993. The chromosomal DNA of Streptomyces lividans 66 is linear. Mol. Microbiol. 10, 923-9343.

111. Lutz W.K., Winkler F.K., J.D. Dunitz. 1971. Crystal structure of the antibiotic monensin. Similarities and differences between free acid and metal complex. Helv. Chem. Acta. 54, P. 1103-1107.

112. Madduri K. and C. Hutchinson. 1995. Functional characterization and transcriptional analysis of the dnrRl locus, wich controls daunorubicin biosynthesis in Streptomyces peucetius. J. Bacteriol., Mar. P. 1208-1215.

113. Madurri K., C. Stuttard and L.C. Vining. 1991. Cloning and location of a gene governing lysine e-aminotransferase, an ensyme initiating /3-lactam biosynthesis in Streptomyces spp. J. Bacterid. 173, P. 985-988.

114. Malpartida F. , Hopwood D.A. 1986. Physical and genetic charactrrization of the gene cluster for antibiotic actinorhodin in S. coelicolor A3(2). Mol. and Gen Genet. 205, P. 66-73.

115. Martin J. F. Polyenes. 1983. In: Biochemistry and genetic regulation of commercially important antibiotics. L.C. Vining, ed. Addison Wesley, Reading, Massachusetts, P. 207-229.

115. Martin J. F. 1989. Molecular mechanisms for the control by phosphate of the biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites. In: Regulation of secondary metabolism in Actinomycetes. Shapiro S., ed. CRC, Press, Boca Raton, Fla, P. 135-211.

117. Martin J.F. 1992. Clusters of genes for the biosynthesis of antibiotics: regulatory genes and overproduction of pharmaceuticals. J. of Industrial Microbiology. 9, 73-90.

118. Martin J.F., Liras P. 1989. Organization and expression of genes involved in the biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites. Ann. Rev. Microbiol., 43, P. 173-206.

119. Masuma R. , Y. Tanaka and S. Omura. 1983. Ammonium ion-depressed fermentation of tylosin by the use of a natural zeolite and its significance in the study on the biosynthetic regulation of the antibiotic. J. of Fermentation Technology, 61, 607-614.

120. McCfnn, P.A., B.M. Pogell. 1979. Pamamycin: a new

antibiotic and stimulator of aerial mycelia formation. J. Antibioy. 32, 673-678.

121. Motamedi H. , C.R. Hutchinson. 1987. Cloning and heterologous expression of a gene cluster for the biosynthesis of tetracenomycin C, the anthracycline antitumor antibiotic of Streptomyces glaucescens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 4445-4449.

122. Motamedi H., E. Wendt-Pienkowski, C.R. Hutchinson. 1986. Isolation of tetracenomycin C non-producing Streptomyces glaucescens mutants. J Bacteriol. 167, 575-580.

123. Motamedi H., C.R. Hutchinson. 1987. Cloning and geterologous expression of a gene cluster for the biosynthesis of tetracenomycin C, the anthracycline antitumor antibiotic of Streptomyces glauscens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 44454449.

124. Murakami T. , H. Anzai, S. Imai et.al. 1986. The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hrgroscopicus: molecular cloning and characterization of the gene cluster. Mol. Gen. Genet. 205, P. 42-50.

125. Nakagawa A., Omura S., K. Kushida et.al. 1987. Structure of cervinomycin, a novel xanthone antibiotic active against anaerobes and mycoplasma. J. of Antibiotics, 40, P. 301-308.

126. Ochi K. 1987. Metabolic initiation of differentiation and secondary metabolism by Streptomyces griseus: significance of the stringent response (ppGpp) fnd GTP content in relation to A-factor. J. Bacteriol. 169, 3608-3616.

127. Ochi K. 1990. Streptomyces relC mutants with an altered ribosomal protein ST-L11 and genetic analysis of a

Streptomyces griseus. J. of Bacteriol. 172, 4 008-4016.

128. Ochi K., Y. Hosoya. 1998. Genetic mapping and characterization of novel mutations which supress the effect of a relC mutation on antibiotic production in Streptomyces cjtlicolor A3(2). J. of Antibiot., 51(6), P.592-595.

129. Ogura M., T. Tanaka, K. Furihata et.al. 1986. Induction of antibiotic production with ethidium bromide in Streptomyces hygroscopicus. J. of Antibiotics. 39(10), 1443-1449.

130. Okamura T., S. Nagata, S. Misono, S. Nagasaki. 1989.New antibiotic-producing Streptomyces TT-strain, generated by electrical fusion of protoplasts. J. Fermentation Bioeng. 67(4), P 221-225.

131. Omura S., Y. Tanaka, H. Mamada and R. Masuma. 1984. Effect of ammonium ion, inorganic phosphate and amino acids on the biosynthesis of protylonolide, a precursor of tylosin aglycone. J. of Antibiotics, 37, 494-502.

132. Omura S., J. Iwai, K. Hinotozawa et.al. 1982. Cervinomycins A1 and A2, new antibiotics active against anaerobes, produced by Streptomyces cervinus sp. nov. J. of Antibiotics, 35, 645-652.

133. Otten S.L., J. Ferguson and C.R. Hutchinson. 1995. Regulation of daunorubicin production in Streptomyces peucetius by the dnrR2 locus. J. of Bacteriology, Mar. 1216-1224.

134. Piret J.M., A.L. Demain. 1988. Actinomycetes Biotechnology: An overview. In:Actinomycetes in Biotechnology. M. Goodfellow et.al., Academic Press. P. 461-482.

135. Plater R.W. and J.A. Robinson. 1991. A macrotetrolide resistance gene from Streptomyces griseus. 8th Intern. Symposium

Biology of Actinimycetes. August 11-16, Madison, Winconsin, USA. Theses, Pl-065.

136. Prauser H. 1964.: Aptness and application of color codes for exact description of colours of Streptomycetes. Z.Allg. Mikrobiol. 4, 95-98.

137. Rao K.V., W.P. Cullen. 1959. Antibiotics Annual. 1059-Eds. Welch H., T. Marti-Ibanes. New York, P. 950.

138. Rao K.V., K. Biemann, R.B. Woodward. 1963. J. Amer. Soc. 85(16), P. 2532-2533.

139. Raibaud A., M. Zalacain., T. Holt et.al. 1991. Nucleotide sequence analysis reveals linked N-acetyl hydrolase, thioesterase, transport, and regulatory genes encoded by the bialaphos biosynthetic gene cluster of Streptomyces hygroscopicus. J. Bacteriol. 173, 4454-4463.

140. Rebollo A., J. A. Gil, P.A. Liras, J.A. Martin. 1989. Cloning and characterization of a phosphate-regulated promoter involved in phosphate control of candicidin biosynthesis. Gene, 79, 47-58.

141. Rhodes P.M., N. Winskill, E. Friend, M. Warren. Biochemical and genetic characterization of Streptomyces rimosus mutants impaired in oxytetracycline biosynthesis. J Gen. Microbiol.

142. Rudd B.A. D.A. Hopwood. 1979. Genetics of actinorhodin biosynthesis by Streptomyces coelicolor A3(2). J. Gen. Microbiol. 14, 35-43.

143. Sato K., T. Nihira, S. Sakuda and et.al. 1989. Isolation and structure of a new butyrolactone autoregulator from Streptomyces sp. FRI-5. J. Ferment. Bioeng. 68, 170-17 3.

144. Schirling E.B., D. Gottlieb. 1966. Methods for

characterization of Streptomyces species. Internat. J. System. Bacterid. 16, P. 313-319.

145. Schupp T., J. Nuesch. 1979. Chromosomal mutation in the final step of rifamycin B biosynthesis. FEMS Microbiol. Lett. 6, 23-27.

146. Seno E. T., K.F. Chater. 1983. Glycerol catabolic enzymes and their regulation in wild-type and mutant strains of Streptomyces coelicolor A3 (2) . J. Gen. Microbiol. 129, 1403-1413.

147. Singh U., S.K. Singh, S. Gurusiddiaiah. 1987-1988. Antibiotics by protoplast fusion of the auxotrophs ffrom wassumycin-producing Streptomyces sp. 215. The Actinomycetes. 20(1), P. 7-25.

148. Stanzak R. , P. Matsushima., R. Baltz., R. Rao. 1986. Cloning and expression in S. lividans of clustered erythromycin biosynthetic genes from S. erythraeus. Bio/Technology. 4, 229-232.

149. Strauch E., E. Takano, H.A. Bayliss and M.J. Bibb. 1991. The stringent responce in Streptomyces coelicolor A3(2). Mol. Microbiol. 5, 289-298„

150. Stutzman-Engwall K., S. Otten, C. Hutchinson. 1992. Regulation of secondary metabolism in Streptomyces spp., and overproduction of daunorubicin in Streptomyces peucetius. J. Bacteriol. 174, P. 144-154.

151. Suesstrunk U., S. Taubert, J Pidoux at.al. 1998. The role of cyclic AMP in germination, antibiotic biosynthesis, and aerial mycelium development in Streptomyces coelicolor. 8th International symposium on the genetics of industrial microorganisms.Jerusalem,Israel, June 28-July 2, Abstract, P.15.

152. Szabo G., F. Szeszak, S. Vitalis, F. Toth. 1988. New date on the formation and mode of action of factor C. In: Biology of Actinomycetes'88. ed. Y. Okami, T.Beppu, H. Ogawara. Tokyo, Jpn. Sci. Soc. Press, P. 324-329.

153. Vara J., J. Perez-Gonzales, A. Jimenez. 1985. Biosynthesis of puromycin N-acetyltransferase. Biochemistry, 24, 8074-8081.

154. Vining C.L. 1995. Global regulation of secondary metabolism. 9th Intrnational Symposium on the Biology of actinomycetes, July 10-15, 1994, Moscow. Biotekhnologiay, 7-8, P. 183-190.

155. Vining L. C., K. Yang and L. Han. 1997. The genetic mechsnism mediating stress activation of jadomycin production in Streptomyces venezuelae. 10th Inter. Symposium on Biology of Actinomycetes. May 27-30, Beijing, China. Abstract, 3S2.

156. Volff J.N., D. Vandenwiele, B. Decaris. 1994. Stimulation of genetic instability and associated large genomic rearrangements in Streptomyces ambofaciens by three fluoroquinolones. Antimicrob. Agents and Chemotherapy. Sept. P. 1984-1990.

157. Volff J.N., D. Vandewiele, J. Simonet and B. Decaris. 1991. Factors stimalating genetic instability in Streptomyces ambofaciens ATCC23877. 8th Intern. Symposium Biology of Actinimycetes. August 11-16, Madison, Winconsin, USA. Theses, PI—097.

158. Wohlleben W., R. Alijah, J Dorendorf et.al. 1988. Identification and characterization phosphinothricin-tripeptide biosynthetic genes in Streptomyces viridochromogenes Tu494 and its expression Nicotiana tabacum.

159. Yamada Y., K. Sugamura, K. Kondo and et.al. 1987.The structure of inducing factors for virginiamycin production in Streptomyces virginiae. J. of Antibiot. 40, 496-504.

160 Yanagimoto.M., Y. Yamada, G. Terui. 1979. Extraction and purification of inducing material produced in staphylomycin fermentation. Hakko Kogaku Kaishi. 57, P. 6-14.

Выражаю благодарность научному руководителю Ю. В. Дуднику за предоставление диссертационной темы и научное руководство.

Очень признательна сотрудникам Института Лысенковой Л. Н. , Лажко Э. И. , Потаповой Н. П. и Натрухе Г. С. за творческое отношение к проблемам, связанными с идентификацией антибиотиков.

Благодарю зав. лабораторией изыскания продуцентов антибиотиков Л. П. Терехову и с. н. с. О. А. Галатенко за консультации по определению таксономического положения культур актиномицетов, старших научных сотрудников отдела ферментации Е. Г. Гладких и М. О. Макарову за выращивание продуцентов антибиотиков в ферментерах, а также Т. С. Бакай - за проведение рестрикционного анализа ДНК исследуемых штамов.

Также выражаю признательность руководителю сектора О. В. Ефременковой за редактирование и помощь в оформлении работы.