Изучение факторов, влияющих на компонентный состав антибиотиков у штаммов Streptomyces fradiae продуцента тилозина и Saccharopolyspora erythraea продуцента эритромицина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Сергиенко, Ольга Васильевна

• Сергиенко, Ольга Васильевна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сергиенко, Ольга Васильевна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Антибиотики группы макролидов: характеристика, основные 10 свойства

2.2. Биогенез и регуляция биосинтеза эритромицина

2.2.1. Структура и биогенез эритромицинов

2.2.2. Биосинтез 6-деоксиэритронолида В (DEB)

2.2.3. Биосинтез сахарных компонентов эритромицинов

2.2.4. Биохимия и генетическая регуляция биосинтеза эритромицина

2.3. Участие серин/треониновых протеинкиназ в регуляции биосинтеза 28 антибиотиков

2.3.1. Протеинкиназы и сигналтрансдукция в клетках актиномицетов

2.3.2. Регуляция биосинтеза антибиотиков AfsR/AfsK - 37 сигналтрансдуцирующей системой

2.3.3. Двухкомпонентные системы в регуляции биосинтеза антибиотиков

2.3.4. Влияние мутаций устойчивости к антибиотикам на 41 функционирование протеинкиназ

2.4. Роль ионов кальция в регуляции внутриклеточных процессов 45 актиномицетов

2.5. Использование мутаций устойчивости к антибиотикам для селекции 54 штаммов актиномицетов с повышенной антибиотической активностью

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Штаммы, используемые в работе

3.2. Среды

3.2.1. Среды для проведения селекционной работы, поддержания, хранения и глубинного культивирования штаммов Streptomyces fradiae

3.2.1.1. Среда СР

3.2.1.2. Модифицированная среда Гаузе (МСГ)

3.2.1.3. Посевная среда для глубинного культивирования штамма 59 Streptomyces fradiae

3.2.1.4. Ферментационная среда для глубинного культивирования штамма 60 Streptomyces fradiae

3.2.2. Среды для проведения селекционной работы, поддержания, хранения и глубинного культивирования штаммов Saccharopolyspora erythraea

3.2.2.1. Среда CP

3.2.2.2. Модифицированная среда Гаузе (МСГ)

3.2.2.3. Посевная среда для глубинного культивирования штамма 61 Saccharopolyspora erythraea

3.2.2.4. Ферментационная среда для глубинного культивирования штамма 61 Saccharopolyspora erythraea

3.3. Получение мутантов устойчивых к верапамилу

3.4. Определение чувствительности штамма S. fradiae к различным 62 антибиотикам методом наложение дисков

3.5. Получение мутантов устойчивых к канамицину

3.6. Методика проведения мутагенеза низкими дозами N-метил-М- 63 нитро-N нитрозогуанидина на проростках спор для штамма

Sa. erythraea

3.1. Использование градиентной концентрации для отбора мутантов, устойчивых к антибиотикам

3.8. Оптимизация ферментационной среды

3.8.1. Оптимизация ферментационной среды методом Бокса-Уилсона

3.8.2. Оптимизация ферментационной среды методом «Латинских 67 прямоугольников»

3.9. Методики количественного определения антибиотиков

3.9.1. Количественное определение антибиотиков тилозинового комплекса 68 методом ТСХ в сочетании с оптической денситометрией

3.9.2. Количественное определение антибиотиков тилозинового комплекса 69 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

3.9.3. Количественное определение антибиотиков эритромицинового 70 комплекса методом ТСХ в сочетании с оптической денситометрией

3.9.4. Количественное определение антибиотиков эритромицинового 72 комплекса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

3.9.5. Методы анализа серин/треониновых протеинкиназ у исследуемых 74 штаммов Streptomyces fradiae и Saccharopolyspora erythraea

3.9.5.1. Анализ фосфорилирования белков in vitro

3.9.5.2. Электрофорез в геле

3.9.5.3. Анализ фосфорилирования белков in situ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

4.1. Получение и характеристика мутантов штамма S. fradiae 25А с увеличенным содержанием целевого продукта - тилозина

4.1.1. Изучение влияния ионов Са на биосинтез тилозина и устойчивость 75 к антибиотикам штамма S. fradiae 25А

4.1.1.1. Изучение влияния ионов Са на компонентный состав тилозинового 75 комплекса штамма S. fradiae 25А

4.1.1.2. Получение и характеристика мутантов штамма S. fradiae 25А, 81 устойчивых к верапамилу

4.1.1.3. Влияние ионов Са на устойчивость штамма S. fradiae 25А к 81 аминогликозидным антибиотикам

4.1.2. Получение и характеристика мутантов штамма S. fradiae 25А, 82 устойчивых к канамицину, в отношении уровня и спектра продукции тилозинового комплекса

4.1.2.1. Селекция мутантов штамма S. fradiae 25А, устойчивых к 82 канамицину (капг)

4.1.2.2. Характеристика капг -Са2+-зависимых мутантов штамма 83 S. fradiae 25А в отношении способности продуцировать тилозин

4.1.2.3. Влияние верапамила, хлорпромазина и прениламин лактата на 84 устойчивость штамма S. fradiae 25А и мутанта S. fradiae 36 к канамицину

4.1.2.4. Сравнительное изучение спектра устойчивости к антибиотикам у 85 исходного штамма S. fradiae 25А и мутанта S. fradiae

4.1.2.5. Обсуждение раздела 4.1.

4.2. Получение, характеристика и разработка условий ферментации для мутантов штамма Saccharopolyspora erythraea с увеличенной продукцией целевого продукта - эритромицина А

4.2.1. Характеристика компонентного состава эритромицинового 89 комплекса штамма Sa. erythraea 221-К, 254-К

4.2.2. Селекция мутантов штамма Sa. erythraea, устойчивых к 90 антибиотикам

4.2.2.1. Селекция мутантов штамма Sa. erythraea 221-К, устойчивых к 90 хлорамфениколу и их антибиотическая продуктивность

4.2.2.2. Селекция мутантов штамма Sa. erythraea 254-К, устойчивых к 92 аминогликозидному антибиотику мономицину

4.2.2.2.1. Селекция шопг-Са2+-зависимых мутантов штамма Sa. erythraea 221-К

4.2.2.2.2. Селекция monr- мутантов штамма Sa. erythraea 221-К

4.2.2.2.3. Проверка антибиотической продуктивности отобранных monr 93 мутантов штамма Sa. erythraea 221-К

4.2.2.2.4. Характеристика компонентного состава эритромицинового 94 комплекса, синтезируемого мутантом Sa. erythraea

4.2.2.2.5. Характеристика спектра устойчивости к различным антибиотикам 95 отобранного мутанта Sa. erythraea

4.2.3. Влияние источников углеводов, липидов и азота на уровень 96 активности и компонентный состав эритромицинового комплекса, синтезируемого мутантом Sa. erythraea

4.2.4. Оптимизация ферментационной среды для штамма Sa. erythraea

4.2.4.1. Оптимизация ферментационной среды методом Бокса-Уилсона

4.2.4.2. Оптимизация ферментационной среды методом "Латинских 101 прямоугольников"

4.2.4.3. Биосинтез эритромицинов штаммом Sa. erythraea 60 на 103 оптимизированной и контрольной ферментационных средах

4.2.5. Изучение влияния дробного внесения углеводных компонентов на 104 уровень и компонентный состав антибиотиков эритромицинового комплекса, синтезируемого штаммом Sa. erythraea

4.2.6. Влияние предшественников эритромицинов на уровень и 107 компонентный состав антибиотиков эритромицинового комплекса, синтезируемого штаммом Sa. erythraea

А.2.1. Обсуждение раздела 4.2.

4.3. Изучение возможной роли серин/треониновых протеинкиназ в продукции макролидных антибиотиков тилозина и эритромицина

4.3.1. Идентификация Са -зависмых протеинкиназ в штамме 113 S.fradiae 25А в продуценте тилозина в различных фазах роста

4.3.1.1. Исследование фосфорилирования белков in vivo

4.3.1.2. Исследование фосфорилирования белков in situ

4.3.1.3. Исследование фосфорилирования белков in vitro

4.3.2. Сравнительное изучение фосфорилирования белков у исходного 117 штамма Sa. erythraea 221 -К и мутанта Sa. erythraea

4.3.3. Изучение влияния ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ 117 класса бисиндолилмалеимидов на уровень устойчивости к канамицину и мономицину мутанта S.fradiae 36 и мутанта Sa. erythraea

4.3.4. Обсуждение раздела 4.3.

5. ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение факторов, влияющих на компонентный состав антибиотиков у штаммов Streptomyces fradiae продуцента тилозина и Saccharopolyspora erythraea продуцента эритромицина»

Актуальность темы: В последнее время возросло внимание к макролидным антибиотикам, связанное со значительными успехами в области химической и биологической трансформации их молекул и проявлением новых терапевтических свойств у модифицированных антибиотиков [1,2,3]. Получены, в частности, новые производные эритромицина А, показавшие не только измененный спектр антимикробного действия, но и антипаразитарный, антиопухолевый, иммуносупрессантный, нейротрофический и противовоспалительный эффект [8]. Поэтому является актуальным получение новых штаммов макролидных антибиотиков с повышенной продуктивностью и совершенствование технологии производства на стадии ферментации.

Одной из основных проблем, которую необходимо решить при работе со штаммами Saccharopolyspora erythraea и Streptomyces fradiae, является получение монопродуцента, так как данные культуры образуют антибиотические комплексы. Получение чистого целевого продукта (эритромицина А, тилозина) является необходимым для дальнейшего получения синтетических производных данных макролидных антибиотиков и в значительной степени облегчит стадии выделения и очистки. Для решения этих проблем проводились исследования в двух направлениях: отбор мутантов с улучшенным компонентным составом и уровнем продуктивности и изучение факторов, влияющих на компонентный состав антибиотического комплекса, включая ионы кальция и состав питательных сред. В данной работе изучалось влияние различных генетических и физиологических факторов на биосинтез антибиотиков штаммами Sa. erythraea и S. fradiae: мутации устойчивости к антибиотикам; возможная активация лимитирующих путей биосинтеза антибиотиков и присоединение Сахаров к лактонной части молекулы; влияние ионов кальция [118,126] изучение возможной связи продукции тилозина и эритромицина с протеинкиназами; влияние ингибиторов протеинкиназ. Цели и задачи исследования: Основная цель диссертационной работы состояла в изучении факторов, влияющих на компонентный состав образуемого антибиотического комплекса у штаммов Streptomyces fradiae продуцента тилозина и

Saccharopolyspora erythraea продуцента эритромицина. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: изучено влияние различных факторов на биосинтез и антибиотическую продуктивность штамма S. fradiae 2 5А; получены и охарактеризованы мутанты штамма S. fradiae 25А в отношении уровня и спектра продукции тилозинового комплекса; проведено сравнительное изучение исходного штамма S. fradiae 25А и полученного S. fradiae 36 (kanr-Ca2+); отобраны и охарактеризованы мутанты штамма Sa. erythraea в отношении антибиотической продуктивности, компонентного состава эритромицинового комплекса и спектра

2+ устойчивости к различным антибиотикам; проведена идентификация Са -зависимых протеинкиназ у S. fradiae25A и изучена корелляция с биосинтезом тилозинового комплекса. л I

Научная новизна работы: Впервые показано влияние ионов кальция (Са ) и выявлена возможная роль Са2+- зависимых серин/треониновых протеинкиназ на компонентный состав тилозинового комплекса у штамма S. fradiae. Разработаны новые методы селекции, основанные на получении мутантов в сигнал-трансдуцирующих системах, регулирующих биосинтез макролидов, и на их основе получены штаммы S. fradiae и Sa. erythraea с улучшенным содержанием целевых продуктов (тилозина и эритромицина А).

Практическая значимость и реализация результатов работы: В ходе исследований получены и охарактеризованы мутанты с улучшенным компонентным составом у штаммов Streptomyces fradiae продуцента тилозина и Saccharopolyspora erythraea продуцента эритромицина за счет увеличения целевого продукта. Получен капг-Са2+-зависимый штамм S. fradiae 36, способный синтезировать 7,7 г/л тилозина (что составляет 96% его в синтезируемом антибиотическом комплексе) и превышает в 1,5 раза уровень целевого продукта в исходном штамме. Получен монопродуцент целевого продукта тилозина штамма S. fradiae.

Получен шопг-Са2+-зависимый штамм Sa. erythraea 60, способный синтезировать 7,0 г/л эритромицина А (что составляет 80% его в синтезируемом антибиотическом комплексе). Продуктивность в отношении эритромицина А полученного мутанта в 1,3 раза выше по сравнению с таковой у исходного штамма

Sa. erythraea 254-K. Осуществлена оптимизация ферментационной среды и разработаны основы метода регулируемого по углеводам биосинтеза, позволяющего получать преимущественно целевой продукт - эритромицин А.

Созданные штаммы и технологии биосинтеза антибиотиков эритромицина и тилозина могут быть использованы при организации конкурентноспособного производства этих антибиотиков на заводах России. Разработанные новые методы селекции могут быть использованы при создании высокопродуктивных штаммов других макролидных антибиотиков.

Апробация работы: Основные положения работы докладывались на Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (г. Саранск, 2001 г.) и на 1-ом и 3-ем Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2002 г., 2005 г.). Публикации: по материалам диссертации опубликовано 5 работ: 1 статья в сборнике докладов Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий», 2 - в сборнике статей 1-го Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» и 2 статьи в научных журналах.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 159 источников, из них иностранных 149 источников. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, включает 30 таблиц и 16 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Сергиенко, Ольга Васильевна

5. ВЫВОДЫ

1) Впервые показано влияние ионов кальция на компонентный состав продуцируемого тилозинового комплекса у штамма S. fradiae. Охарактеризован механизм Са2+- зависимого биосинтеза целевого продукта - тилозина.

2) Идентифицированы Са - зависимые серин/треониновые протеинкиназы и выявлена их возможная роль в биосинтезе сахарной части молекулы тилозина. Установлено, что мутация устойчивости к верапамилу (ингибитору Са -каналов) блокирует биосинтез сахарной части молекулы тилозина.

3) Разработан метод селекции штамма S. fradiae и с его использованием получен монопродуцент целевого продукта тилозина. Основой метода является отбор плейотропных Са2+-зависимых мутантов устойчивых к канамицину.

4) Разработан метод селекции и получены штаммы устойчивые к мономицину с повышенным содержанием целевого продукта - эритромицина А. Охарактеризованы две группы мутантов в качестве предшественников синтезирующие: а) дезоксиэритронолид В, О-микарозил-эритронолид В; б) дезоксиэритронолид В.

5) Осуществлена оптимизация ферментационной среды для отселектированного монопродуцента эритромицина А. Установлено, что снижение общего количества углеводов и увеличение содержания азота в среде приводит к увеличению содержания эритромицина А.

6) Разработаны основы метода регулируемого по углеводам биосинтеза эритромицинов. Установлено, что оптимизировав время внесения и состав подпиток, можно увеличить суммарный выход антибиотиков комплекса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сергиенко, Ольга Васильевна, 2006 год

1. Walsh С.// Antibiotics: actions, origins, resistance// Washngton, ASM Press, 2003, P. 10-13.

2. Katz L., Ashley G. W.// Translation and Protein Synthesis: Macrolides//Chem. Rev., 2005, №105, P. 499-527.

3. McDaniel R., Welch M., Hutchinson C. R.// Genetic Approaches to Polyketide Antibiotics// Chem. Rev., 2005, №105, P. 543-588.

4. Staunton J., Wilkinson В.// Biosynthesis of Erythromycin and Rapamycin.// Chem Rev., 1997, №97(7), P. 2611-2630.

5. Hutchinson C.// Microbial polyketide synthases: more and more prolific.Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar 30;96(7):3336-8. Review.

6. Ikeda H, Omura S.//Combinatorial biosynthesis: engineered biosynthesis of polykelide compounds// Tanpakushitsu Kakusan Koso. Review. Japanese. 1998. Jul. 43(9): 126577.

7. Сазыкин Ю.В., Иванов В.П., Салова Т.В.//кетолиды производные эритромицина с активностью противмакролидорезистентных бактерий// Антибиотики и химиотерапия. 2000. №2. С. 3-4.

8. Reynolds К.// Combinatorial biosynthesis: lesson learned from nature.// Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Oct 27;95(22): 12744-6. Review.

9. Bonay P., Duran-Chica I, Fresno M., Alarcon В., Alcina A.// Antiparasitic effects of the intra-Golgi transport inhibitor megalomicin.// Antimicrob. Agents & Chemother. 1998. 42,2668-73.

10. Lacey E., Gill J., Power M. Rickards R., O'Shea M., Rothschild J.// Bafilolides, potent inhibitors of the motility and development of the free-living stages of parasitic nematodes. //1995. Int J Parasitol. 25, 349-357.

11. Bollag DM, McQueney PA, Zhu J, Hensens O, Koupal L, Liesch J, Goetz M, Lazarides E, Woods CM.// Epothilones, a new class of microtubule-stabilizing agents with a taxol-like mechanism of action//1995. Cancer Res. 55 (11), 2325-33.

12. Jacobsen J., Hutchinson C., Cane D., Khosla C.//Precursor-directed biosynthesis of erythromycin analogs by an engineered polyketide synthase//1997. Science .277 (5324). P. 367-9.

13. Steiner J., Connolly M., Valentine H., Hamilton G., Dawson Т., Hester L., Snyder S.// Neurotrophic actions of nonimmunosuppressive analogues of immunosuppressive drugs FK506, rapamycin and cyclosporin A.// Nat Med. 1997 Apr;3(4):421-8/

14. Kudoh S.// Erythromycin treatment in diffuse panbronchiolitis.//Curr Opin Pulm Med. 1998 Mar;4(2):l 16-21. Review.

15. Peeters T.// Erythromycin and other macrolides as prokinetic agents.// Gastroenterology. 1993 Dec; 105(6): 1886-99. Review.

16. Nielsen J.// The role of metabolic engineering in the production of secondary metabolites.//Curr Opin Microbiol. 1998. V.l(3):330-6. Review.

17. Ruan X., Pereda A., Stassi D.L. et. al. // Acyltransferase domain substitutions in erythromycin polyketide synthase yield novel erythromycin derivatives.//J.Bacteriol. 1997. V.179(20):6416-25.

18. Weissman K.J., Bycroft M., Stannton J., Leadlay P.F. // Origin of starter units for erythromycin biosynthesis.//Biochemistry. 1998. V.37. №31. P. 11012- 7.122

19. Stassi DL, Kakavas SJ, Reynolds KA, Gunawardana G, Swanson S, Zeidner D, Jackson M, Liu H, Buko A, Katz L. // Ethyl-substituted erythromycin derivatives produced by directed metabolic engineering.//Proc Natl Acad Sci USA. 1998. V.23; №95(13):7305-9.

20. Lombo F., Pfeifer В., Leaf T. et.al. // Enhancing the atom economy of polyketide biosynthetic processes through metabolic engineering.//Biotechnol. Prog. 2001. V.17. №4. P. 612-7.

21. Frykman S., Leaf Т., Carreras C., Licari P. // Precursor-directed production of erythromycin analogs by Saccharopolyspora erythraeaJ/Biotechnol Bioeng. 2001. V.76. №4. P. 303 -10.

22. Gaisser S, Lill R, Staunton J, Mendez C, Salas J, Leadlay PF. //Parallel pathways for oxidation of 14-membered polyketide macrolactones in Saccharopolyspora erythraea JI 2002. Mol Microbiol. May. 44(3):771-81.

23. Andersen JF, Tatsuta K, Gunji H, Ishiyama T, Hutchinson CR.// Substrate specificity of 6-deoxyerythronolide В hydroxylase, a bacterial cytochrome P450 of erythromycin A biosynthesis.//Biochemistry. 1993. V.32. №8. P. 1905 1913.

24. Stassi D., Donaldio S., Stavor M.J., Kotz L. // Identification of a Saccharopolyspora erythraea gene required for the final hydroxylation step in erythromycin biosynthesis.//J Bacteriol. 1993. V.175. №1. P. 182- 189.

25. Lambalot R.H., Cane D.E. // Overproduction and characterization of the erythromycin C-12 hydroxylase, EryK. // Biochemistry. 1995. V.34. №6. P.1858-66.

26. Hessler P.E., Larsen P.E., Constantion A.I.// Isolation of isoflavones from soy-based fermentations of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea.il Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V.47. P. 398-404.

27. Patent USA. № 5 908 764; 1999.

28. Mirjalili N, Zormpaidis V V, Leadlay PF, Ison AP. // The Effect of Rapeseed Oil Uptake on the Production of Erythromycin and Triketide Lactone by Saccharopolyspora erythraea.//Bitechnol. Prog. 1999. V.15 P.911-8.

29. Hamedi Y, Malekzadeh F., Nirman V.// Improved production of erythromycin by Saccaharopolyspora erthraea by various plant oils //2002. Biotech. Lett. 24 :697-700.

30. Martin J.F.// Nonpolyene microlide antibiotics// 1979. Economic Microbiology. Rev.V.3 P. 239-291.

31. Seignez C, Adler N, Suard JC, Peringer P. //Aerobic and anaerobic biodegradability of 1-anthraquinone sulphonate.// 1996. Appl. Microbiol. Biotechnol. Jun. 45(5):719-22.

32. Грузина В.Д., Шищенко Л.Д., Трофимова H.T. /Коммуникативные сигналы бактерий // Антибиотики. 1981. Т.26. №26 С. 407-410.

33. Roszkowski J, Ruczaj Z, Sawnor-Korszynska D, Kotiuszko D, Morawska H, Siejko D, Raczynska-Bojanowska K.J/ NADPH-regenerating systems in microorganisms producing macrolide antibiotics// Acta Microbiol. Pol. B. 1971; V.3(2) P.97-106.

34. Hunaiti AA, Kolattukudy PE// Source of methylmalonyl-coenzyme A for erythromycin synthesis: methylmalonyl-coenzyme A mutase from Streptomyces erythreus.il Antimicrob. Agents Chemother. 1984. V.25 P. 173-8.

35. Hunaiti AA, Kolattukudy PE. // Malonyl-CoA decarboxylase from Streptomyces erythreus: purification, properties, and possible role in the production of erythromycin.// Antimicrob. Agents Chemother. 1984. V.229 P.426-39.

36. Hsieh YJ, Kolattukudy PE. // Inhibition of erythromycin synthesis by disruption of malonyl-coenzyme A decarboxylase geneeryM in Saccharopolyspora erythraea./П Bacteriol. 1994. V.176. P.714-24.

37. Kirsanov AIu, Mironov VA, Danilenko VN.//The role of propionyl-CoA carboxylase in the biosynthesis of antibiotics.// 1991. Antibiot Khimioter. T.36. V.4. P.32-35.

38. Hunaiti AR, Kolattukudy PE.// Isolation and characterization of an acyl-coenzyme A carboxylase from an erythromycin-producing Streptomyces erythreus. //Arch. Biochem. Biophys. 1982. V.216. №1. P. 362-71.

39. Cane D.E., Liang T.C., Taylor P.B. Chang C, Yang CCH Macrolide biosynthesis. 3. Stereochemistry of the chain-elongation steps of erythromycin biosynthesis// J. Am. Chem. Soc. 1986. V.108. P. 4957-64.

40. Madduri K., Waldron C., Merlo D.J.// Rhamnose biosynthesis pathway supplies precursors for primary and secondary metabolism in Saccharopolyspora spinosa //J. Bacteriol. 2001.V.183. №19. P.5632-8.

41. Vara J.A., Hutchinson C.R.// Purification of thymidine-diphospho-D-glucose 4,6-dehydratase from an erythromycin-producing strain of Saccharopolyspora erythraea by high resolution liquid chromatography //J Biol. Chem. 1988. V.263. №29. P. 14992-5.

42. Crossley MJ, Spowage M, Hunneyball IM.//Studies on the effects of pharmacological agents on antigen-induced arthritis in BALB/c// 1987. Drugs Exp Clin Res.l3(5):273-7.

43. Leon E, Seignez C, Adler N, Peringer P. //Growth inhibition of biomass adapted to the degradation of toluene and xylenes in mixture in a batch reactor with substrates supplied by pulses.// 1999. Biodegradation.l0(4):245-50.

44. Lynch H.C., Bushell M.E. // The physiology of erythromycin biosynthesis in cyclic fed batch culture. //Microbiology. 1995. V.141. P.3105-11.

45. Raczynska-Bojanowska K, Rafalski A, Ostrowska-Krysiak В.// Carboxylation of propionyl-CoA in erythromycin biosynthesis.//Acta Biochim. Polon.1970. V.17. №4. P.331-8.

46. Bosnjak M, Topolovec V, Johanides V //Growth kinetics and antibiotic synthesis during the repeated fed-batch culture of Streptomycetes.// 1979. Biotechnol Bioeng Symp. (9): 155-65.

47. Lieske R.//Morphologie und Biologie der Strahlenpilze.Bontraeger.// Leipzig. 1921.

48. Крисс A.E.//Изменчивость актиномицетов. 1937.Изд-во АН СССР.

49. Красильников Н.А.//Лучистые грибки и родственные им мокроорганизмы.1938. Изд-во АН СССР.

50. Красильников Н.А.//Лучистые грибки (высшие формы).1970. Изд-во «Наука».

51. Duggar ВМ, Backus EJ, Campbell ТН.// Types of variation in Actinomycetes. // 1954.Ann N Y Acad Sci. T.60.V.1.P.71-85.

52. WaksmanS.A.// The actinomycetes and their antibiotics// 1963. Adv Appl Microbiol.T.175.P.235-315.

53. Kutzner H. //Variability in streptomycetes. A review.// 1967. Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr Hyg. T.121.V.4.P.394-413.

54. Шигаева М.Х.//Изменчивость пигментных актиномицетов. 1968. Изд-во «Наука».

55. Алиханян С.И.//Селекция промышленных микроорганизмов. М.1968. С.29-355.

56. Kalakoutskii LV, Nikitina ЕТ.// Natural variability of developmental patterns in Streptomyces J1 1977 .Postepy Hig Med Dosw. T.31.V.3.P.313-55.

57. Nastasiak IN, Fedorenko VA, Kirichenko NV, Danilenko VN. //Isolation and characteristics of rifampicin-resistant mutants of Streptomyces erythraeus strain//1990.Antibiot Khimioter. T.35. V.12. P.l 1-3.

58. Fedorenko VA, Starodubtseva LI, Zavorotnaia SA, Lomovskaia ND, Danilenko VN.//Characterization of multiple changes of antibiotic resistance characters in Streptomyces coelicolor A3(2)// 1989.Genetika. T.25.V.4.P.626-34.

59. Настасяк И.Н., Заворотная С.А. и др.//Выделение и характеристика мутантов Saccharopolyspora erythraea, устойчивых к хлорамфениколу//Антибиотики и химиотерапия. 1999.Т.44.№З.С.5

60. Starodubtseva LI, Taisova AS, Danilenko VI. //Genetic instability of determinants of resistance to chloramphenicol and kanamycin in Streptomyces lividans 66.1 I 1989. Genetika. T.25. V.6. P.1001-12.

61. Elizarov S.M., Mironov V.A., Danilenko V.N.//Calcium-induced alterations in the functioning of protein serine/threonine and tyrosine kinases in Str. fradiae.H 2000. IUBMB Life. V.50-.1-5.

62. Elizarov S .M., D anilenko V .N.// M ultiple p hosphorylation of membrane-assotiated calcium-dependent protein serine/threonine kinase in S. fradiae.ll 2001. FEMS Microbiology Letters.V 202:135-138.

63. Миронов B.A., Сергиенко O.B., Настасяк И.Н., Даниленко В.Н//Биогенез и регуляция биосинтеза эритромицинов Saccharopolyspora erythraea!I 2004, Прикл. Биохим. и Микробиол. Т.40, №6, С. 613-624.

64. Navashin SM, Fedorenko VA, Nastasiak IN, Mironov VA, Kirichenko NV, Danilenko VN.//Genetic and biochemical control of biosynthesis of macrolide antibiotics.// 1990 .Antibiot Khimioter. T.35. V.12. P.34-8.

65. Kirichenko VN, Basiliia LI, Nastasiak IN, Zakharova GM, Fedorenko VA, Danilenko VN.//Use of protoplast fusion in the selection of erythromycin-producing strains of Saccharopolyspora erythraea.il 1993. Antibiot Khimioter. T.38. V.6. P.3-8.

66. Nastasiak IN, Fedorenko VA, Danilenko VN.//The isolation and characteristics of mutants of the Saccharopolyspora erythraea strain resistant to thiostrepton// 1997.Antibiot Khimioter.T.42. V.l. P.7-11.

67. Даниленко B.H, Акопянц К.Э., Сизова И.А., Мичурина T.A. .// Определение нуклеотидной последовательности и характеристика нового гена аминогликозидфосфотрансферазы aph VIII из штамма Streptomyces rimosus //1997. Генетика. Т.ЗЗ. С. 1478-1486.

68. Braun V. // Energy-coupled transport and signal transduction through the gram-negative outer membrane via TonB-ExbB-ExbD-dependent receptor proteins.//1995. FEMS Microbiol. Rev. V.16(4):295-307.

69. Petrichkova K., Petrichek M.//Eukariotic-type protein kinases in Streptomyces coelicolor variations on common them//2003 .Microbiol.V. 149.P. 1609-1621.

70. Vomaster T. et. al.// Characterization of two putative protein Ser/Thr kinases from S. granaticolor both endowed with different properties.// 1998. Eur. J. Biochem. V.257: 55-61.

71. Neu J.M., Wright G.D.// Inhibition of sporulation, glicopeptide antibiotic production and resistance in Streptomyces toyocaensis NRRL 15009 by protein kinase inhibitors.// 2001. FEMS Microbiology Letters. V.l99.15-20.

72. Neu J.M. et. al.// StoPK-1, a Serine/Threonine protein kinase from the glicopeptide antibiotic producer Streptomyces toyocaensis NRRL 15009, affects oxidative stress response.// 2002. J. Molecular Microbiology. V.44(2):417-430.

73. Wang W. et. al.// Molecular and biochemical characterization of a novel two-component signal transduction system, amrA-amkA, involved in rifamycin SV production in Amycolatopsis mediterranei U32.// 2002. J.Arch. Microbiology. V. 178(5):376-86.

74. Mikulik K., Janda I.// Protein kinase assotiated with ribosomes phosphorylates ribosomal proteins of S. collinus.//Biochem. Biophys. Res.Comm.l997,V.238: 370-76).

75. Horinouchi S., Beppu T.ll Regulation of secondary metabolism and cell differentiation in Streptomyces: A-factor as a microbial hormone and the AfsR protein as a component of a two-component regulatory system.//1992.Gene.V.l 15(1 -2): 167-72.

76. Lee PC, Umeyama T, Horinouchi S.ll afsS is a target of AfsR, a transcriptional factor with ATPase activity that globally controls secondary metabolism in Streptomyces coelicolorA3(2).//2002.Mol.Mkrobiol. V.43(6): 1413-30.

77. Floriano В., Bibb M.// afsR is a pleiotropic but conditionally required regulatory gene for antibiotic production in Streptomyces coelicolor A3(2). 1996 Mol.Microbiol. V.21(2):385-96.

78. Anderson Т. B. et. al.// Genetic and transcriptional analysis of absA, an antibiotic gene cluster-linked two-component system that regulates multiple antibiotics in Streptomyces coelicolorll 2001. J. Molecular Microbiology. V.39(3):553-566.

79. Umeyama T, Horinouchi S.// Autophosphorylation of a bacterial serine/threonine kinase, AfsK, is inhibited by KbpA, an AfsK-binding protein.// Bacteriol. 2001.T183.V.19.P.5506-12.

80. Umeyama T, Lee PC., Horinouchi S.// Protein serine/threonine kinases in signal transduction for secondary metabolism and morphogenesis in Streptomyces. II 2002. Appl Microbiol Biotechnol. T.59.V.4.P.419-425.

81. Миронов В.А. и др.//. Влияние ионов Са2+ на биосинтез и компонентный состав тилозина у Str.fradiae.ll 1997.Антиб. и химиотер. 42(4):3-7.

82. Elizarov S.M., Mironov V.A., Danilenko V.N.// Dinamics of serine/threonine protein kinase activity during the growth of the wild-type Streptomyces avermitilis strain and its chloramphenicol-resistant mutants.// 2000. Microbiology. V.69.N.3.P.281-286.

83. Елизаров C.M., Гаврилина A.B., Даниленко В.Н.//Модулирование активности серин-треониновых протеинкиназ у хлорамфеникол устойчивых мутантов Streptomyces avermitilis/fMojieKynnpHax биология. 2004. Т.38., №3., С.329-336.

84. Даниленко В.Н, Акопянц КЗ.// Нестабильность и «молчащие» гены актиномицетов.//1995. Биотехнология. Т. 7-8. С.104-112.

85. Davies J., Smith D.// Plasmid-determined resistance to antimicrobial agents.//1978. Ann. Rev. Microbiol. V.32. P.469-518.

86. Wright G.D., Thompson P.R.//Aminoglycoside phosphotransferases: proteins, structure, and mechanism.// 1999. Front. Biosci. V.4.D9-D21.

87. Wright G.D.//Aminoglycoside-modifying enzymes.// 1999. Curr. Opin. Microbiol. V.2. P. 499-503

88. Daigle D.M., McKay G.A., Thompson P.R., Wright G.D// Aminoglycoside antibiotic phosphotransferases are also serine protein kinases. .//1999. Chem. Biol. V.6. P.ll-18.

89. Boehr D.D., Thompson P.R., Wright G.D.// Molecular mechanism of aminoglycoside antibiotic kinase APH(3")-IIIa : roles of concerved active site residues.// 2001. J. Biol. Chem. V.276. P.23929-23936.

90. Daigle D.M., McKay G.A., Wright G.D.// Inhibition of aminoglycoside antibiotic resistance enzymes by protein kinase inhibitors.// 1997. J. Biol. Chem. V.272. P.24755-24758.

91. Boehr D.D., Lane W.S., Wright G.D.// Active site labeling of the gentamicin resistance enzymes ААССб')- APH(2") by the lipid kinase inhibitor wortmannin.// 2001. Chem. Biol. V.8. P.791-800.

92. Danilenko VN, Puzynina GG, Lomovskaia ND. // Multiple antibiotic resistance in actinomycetes.// 1977. Genetika. T. 13. V.10.P. 1831-42.

93. Potekhin IaA, Danilenko VN. //Determinant of resistance to kanamycin in Streptomycin rimosus: amplification in the chromosome and reversible genetic instability//1985. Mol Biol (Mosk). T.19. V.3. P.805-17.

94. Даниленко B.H, Акопянц К.Э., Сизова И.А., Мичурина T.A. .// Определение нуклеотидной последовательности и характеристика нового гена аминогликозидфосфотрансферазы aph VIII из штамма Streptomyces rimosus //1997. Генетика. Т.ЗЗ. С. 1478-1486.

95. Danilenko V.N.,Starodubtseva L., Navashin S.//1985. Proc. 6 Intern. Symp. Biology Actinomycetes. Hungary: De brzen. P. 79-81.

96. Urabe H., Ogawara H.// Cloning, sequencing and expression of serine/threonine kinase-encoding genes from Streptomyces coelicolor A3(2).//1995. Gene. V.153. P.99-104.

97. Matsumoto A., Hong S.K., Ishizuka H., Horinouchi S., Beppu T. //Phosphorylation of the AfsR protein involved in secondary metabolism in Streptomyces species by a eukaryotic-type protein kinase. //1994. Gene. V.146. P.47-56.

98. Nadvornik R., V omastek TJanecek J., Technikova Z.,Branny P.// P kg2, a n ovel transmembrane protein Ser/Thr kinase of Streptomyces granaticolor.//\999. J. Bacteriol. V. 181. P. 15-23.

99. Umeyama Т., Lee P.C., Ueda K., Horinouchi S.// An AfsK/AfsR system involved in the response of aerial mycelium formation to glucose in Streptomyces griseus.ll 1999. J. Microbiology. V.145. P.2281-2292.

100. Elizarov S.M., Mironov V.A., Danilenko V.N.// Calcium-induced alterations in the functioning of protein serine/threonine and tyrosine kinases in Streptomyces fradiae cells.//IUBMB Life. 2000. 50(2):139-43. 2000. IUBMB Life.V.500. P.139-143.

101. Benveniste R., Davies J.I.// Aminoglycoside antibiotic-inactivating enzymes in actinomycetes similar to those present in clinical isolates of antibiotic-resistant bacteria.// 1973. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.70. P. 2276-2280.

102. Shaw K.J., Rather P.N., Hace R.C., Miller G.H.// Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familial relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes.//1993. Microbiol. Rev. V.57. P.138-163.

103. Акопянц К.Э., Сизова И.А., Мичурина Т.А., Даниленко В.Н.// Определение нуклеотидной последовательности «молчащего» гена аминогликозидфосфотрансферазы Streptomyces rimosus РЗ.//1997. Антиб. и химиотер. №42, С.3-13.

104. Hon W.C., McKay G.A., Thompson P.R.,Sweet R.M., Yong D.S.C., Wright G.D., Berghuis A.M.// Structure of an enzyme required for aminoglycoside antibiotic resistance reveals homology to eukaryotic protein kinases.//1997. Cell. V.89. P.887-895.

105. Demain A. L., Fang A.// Emerging concepts of secondary metabolism in Actinomycetes.//1995. Actinomycetol. V.9(2):98-l 17.

106. Bibb M.// 1995 Colworth Prize Lecture. The regulation of antibiotic production in Streptomyces coelicolor A3(2).//1996. J. Microbiology. V. 142:1335-44.

107. Norris V. et.al.// Calcium signaling in bacteria (minirev).// 1996. J.Bacteriol. V.l78 (13):3677-82.

108. Natsume M. et.al.// Calcium ion regulates aerial mycelium formation in actinomycetes.// 1989. J. Antibiotics. V.42(3):440-47.

109. Natsume M, Marumo S.// Calcium signal modulators inhibit aerial mycelium formation in Streptomyces alboniger.ll 1992. J.Antibiotics. V.45(6): 1026-28.

110. Natsume M. et.al.// Transient increase in intracellular calcium in Str. alboniger.il 1995. Biosci. Biotech. Biochem. V.59(l): 152-54.

111. Natsume M.// Differetion of aerial mycelia by pamamycins and calcium ion m Str. alboniger.//1999. Actinomycetol. V.l3(1): 11-19.

112. Leadlay P.F., Roberts G., Walker J.E.// Isolation of a novel calcium-binding protein from S. erythreus.il 1984. FEBS Lett. V.178(l):157-160.

113. Bylsma N. // Prokaryotic calcium-binding protein of the calmodulin superfamily.// 1992. FEBS Lett. V.299(l):44-47.

114. Tossavainen H. et.al.// NMR solution structure of calerythrin, an EF-hand calcium-binding protein from Sa. erythraea.//2003. Eur. J. Biochem. 270:2505-12. 2003. Eur. J. Biochem. V.270:2505-12.

115. Yonekawa T. et.al.// A calcium-binding protein with four EF-hand motifs in S. ambofaciens.//2001. BBB. V.65(l).156-160.

116. Иванова И.В. и др.// Влияние ионов кальция на дифференциацию актиномицетов.// 1994. Антиб. и Химиотер. V.39(l 1):21-27.

117. Данова С.Т. и др.// Роль кальция в жизненном цикле Str.albogriseolus 444.// 1997. Антиб. и Химиотер. V.42(4): 12-15.

118. Reed P., Lardy H.// A23187: a divalent cation ionophore. //1972. J.Biol.Chem. V.247:6970-6977.

119. Sverdlova AN, Agbenoko K, Iaglova LG, Egorov NS.// Calcium transport in cells of Streptomyces chrysomallus var. macrotetrolidi— a producer of macrotetrolide antibiotics.//1992. Antibiot Khimioter.T.37. V.l. P.8-11.

120. Moncheva P., Christova K., Sholeva Z., Ivanova I., Beijerinck //Centennial Microbial Physiology and Gene Regulation: Emerging Principales and Applications/W.A. Scheffers and J.P. van Dijken,ed//1995. V.l85-186.

121. Мончева П.А. и др.// Физиологическая роль внеклеточных протеаз и ионов кальция в процессах дифференциации и антибиотикообразования S.albogriseolus.II 1997. Антиб. и ХимиотерЛЛ42(9):14-19.

122. Mateles R.J., Ben-Bassat A.// Production of actinomycin D in complex media. The influence of metal ions.// 1973. Agr. Bid. Chem.V.37(10):2215-17.

123. Singh A. et.al.// Streptomycin: a fermentation study.// 1976. Enr. J. Appl. Microbiol. V.3(l):97-101.

124. Debnath M., Majumbar S.K.// Effect of minerals on the production by Str. kanamyceticus.il 1987.Appl.Microbiol.Biotichnol.V.26(2): 189-96.

125. Imail H. et.al.// Isenamicins: macrolide antibiotics preparated Micromonospora sp. fermentation.// 1989. J.Antibiotics. V.42(6): 1000-2.

126. CoverW.H. et.al//Calcium inhibition of efrotomycin production.// 1991. J. Ind. Microbiol. V.7(l):41-44.

127. Miguelez E.M. et.al//Hyphal death during colony development in Str.antibiocus.ll1999.J.Cell Biol. V.145(3);515-25.

128. Miguelez E.M. et.aV//Streptomyces: a new model to study cell death.// 2000. Int.Microbiol. V.3:153-58.

129. Nicieza R.J. et.al.// Purification, characterization and role ofnuclease and serine proteases m Streptomyces differentiation.// 1999. J. Biol. Chem. V.274(29):20366-75.

130. Fernandez M.,Sanchez J.// Nuclease activities and cell death processes associated with the development of surface cultures of Str.antibiocus.// 2002. Microbology. V.148(2):405-12.

131. Lee P.C. et.al.// Afs S is a target of AfsR, a transcriptional factor with ATPase activity in Str. coelicolor.il 2002.Mol.Microbiol. V.43(6):1413-30.

132. Aravind L. et.al.// The domains of death: evolution of apoptosis machinery.// 1999. TIBS. V.24:47-53.

133. Anderson P.// Kinase cascades regulating entry into apoptosis.// 1997. MMB Reviews. V.61(l):33-46.

134. Hosoya Y, Okamoto S, Muramatsu H, Ochi K.//Acquisition of certain streptomycin-resistant (str) mutations enhances antibiotic production in bacteria.// 1998. Antimicrob Agents Chemother. T.42.V.8.P.2041-7.

135. Ни H, Ochi K.//Novel approach for improving the productivity of antibiotic-producing strains by inducing combined resistant mutations.// 2001.Appl Environ Microbiol. T.67.V.4.P. 1885-92.

136. Ochi К. I I Streptomyces relC mutants with an altered ribosomal protein ST-L11 and genetic analysis of a Streptomyces griseus relC mutant.// 1990. Bacteriol. Т. 172.V.7.P.4008-16.

137. Hosokawa K, Park NH, Inaoka T, Itoh Y, Ochi K.//Streptomycin-resistant (rpsL) or rifampicin-resistant (rpoB) mutation in Pseudomonas putida KH146-2 confers enhanced tolerance to organic chemicals.//2002 .Environ Microbiol. T.4.V.1 l.P.703-12.

138. Inaoka T, Takahashi K, Yada H, Yoshida M, Ochi K.//RNA polymerase mutation activates the production of a dormant antibiotic 3,3'-neotrehalosadiamine via an autoinduction mechanism in Bacillus subtilis.// 2004J Biol Chem. T.279.V.5.P.3885-92.

139. Бирюков B.B., Кантере B.M.// Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза.// 1985, Москва, Издательство Наука.