Аптамерные неканонические ДНК к гемагглютинину вируса гриппа А тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Бизяева Анастасия Александровна

• Бизяева Анастасия Александровна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Бизяева Анастасия Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Степень разработанности проблемы

Цели и задачи работы

Объект исследования

Предмет исследования

Научная новизна исследования

Теоретическая значимость исследования

Практическая значимость исследования

Методология диссертационного исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Степень достоверности результатов

Апробация работы

Публикации

Личный вклад автора

Структура и объем диссертации

ГЛАВА 1. АПТАМЕРЫ К ВИРУСУ ГРИППА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Гемагглютинин

1.2. Аптамеры к белкам вируса гриппа

ГЛАВА 2. АПТАМЕРНЫЕ НЕКАНОНИЧЕСКИЕ ДНК К ГЕМАГГЛЮТИНИНУ ВИРУСА ГРИППА А (РЕЗУЛЬТАТЫ И

ОБСУЖДЕНИЕ)

2.1. Аптамер 07 и его производные

2.1.1. Структура аптамера 07 и его производных

2.1.2. Аффинность 07 и его производных к рекГА

2.1.3. Взаимодействие 07 и его производных с вирГА

2.1.4. Корреляции между структурой и аффинностью аптамеров серии G7

2.2. Аптамер 06 и его производные

2.2.1. Структура аптамера 06 и его производных

2.2.2. Аффинность 06 и его производных к рекГА

2.2.3. Взаимодействие аптамеров серии 06 с вирГА

2.3. Аптамер 15 и его производные

2.3.1. Структура аптамера 15 и его производных

2.3.2. Взаимодействие 15 с вирГА

2.3.3. Аффинность 15 и его производных к рекГА

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Реактивы и буферы

3.2. Олигонуклеотиды

3.3. Белки и вирусы

3.4. Ядерный магнитный резонанс

3.5. Спектроскопия кругового дихроизма

3.6. УФ-спектроскопия

3.7. Эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография

3.8. Определение концентрации вируса методом реакции

гемагглютинации

3.9. Поверхностный плазмонный резонанс

3.10. Интерферометрия биокомплексов

3.11. Аптаферментный анализ

3.12. Расчёт констант скоростей ассоциации и диссоциации и константы диссоциации

3.13. Филогенетический анализ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

В диссертационной работе использованы обозначения структурных компонентов нуклеиновых кислот в соответствии с рекомендациями Межведомственного комитета по терминологии, номенклатуре и символике Международного союза теоретической и прикладной химии (IUPAC), а также следующие обозначения:

GQ G-квадруплекс

EDAC 1 -этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид

IC50 концентрация полумаксимального ингибирования

MDCK клеточная линия почки собаки Майдин-Дерби

рНп pH полуперехода

SELEX метод селективной эволюции аптамеров путём

экспоненциального обогащения (англ. Selective Evolution of Ligands by EХponential enrichment)

s-NHS сульфо-Ы-гидроксисукцинимид

АФА аптаферментный анализ

вирГА гемагглютинин в составе вирусной частицы

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ГА гемагглютинин

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ИБК интерферометрия биокомплексов

КД круговой дихроизм

ППР поверхностный плазмонный резонанс

РГА реакция гемагглютинации

рекГА рекомбинантный гемаглютинин

РНК рибонуклеиновая кислота

СА стрептавидин

УФ-спектроскопия ультрафиолетовая спектроскопия

ЯМР ядерный магнитный резонанс

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Аптамерные неканонические ДНК к гемагглютинину вируса гриппа А»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы

Респираторные вирусные инфекции являются одной из важнейших угроз здоровью человека из-за отсутствия ранней детекции и специфических противовирусных препаратов с доказанной эффективностью. Особое место в ряду острых респираторных вирусных инфекций занимает вирус гриппа А, который регулярно вызывает сезонные эпидемии и пандемии. Заболевания гриппом сопровождаются серьёзными осложнениями, при этом варианты вируса уходят от специфического иммунного ответа ввиду высокой вариабельности первичной структуры белков. Первый этап заражения клетки вирусом гриппа - прикрепление к сиаловым кислотам на поверхности клетки - выполняет белок гемагглютинин (ГА), который составляет треть всех белков в составе вирусной частицы. Именно поэтому ГА вируса гриппа является популярной мишенью для поиска противовирусных агентов, например антител или аптамеров.

Аптамер - это олигонуклеотид, обладающий способностью специфически связываться с мишенью за счет своей уникальной третичной структуры. Типичными мишенями для аптамеров являются белки, такие аптамеры впоследствии могут служить как узнающие элементы диагностических аптасенсоров и биомедицинские препараты. Стандартная процедура получения аптамера - селекция из рандомизированной библиотеки олигонуклеотидов, или SELEX (от англ. Systematic Evolution of Ligand by EXponential enrichment - систематическая эволюция лиганда путём экспоненциального обогащения). Крайне редко аптамер, полученный при таком первичном отборе, имеет оптимальные характеристики: высокую специфичность к мишени, высокую аффинность, наличие единственной конформации, небольшую длину, устойчивость при физиологических

условиях. Изучение свойств аптамера обычно сводится к попыткам минимизации его длины и изучению аффинности и функции.

Необходимым этапом исследования аптамера является поиск функциональной детерминанты, то есть участка структуры, ответственного за узнавание мишени. Лишь единичные работы посвящены установлению ключевых взаимоотношений «структура - аффинность» для известных аптамеров. Так, для тромбин-связывающего аптамера TBA характерна структура G-квадруплекса (ОР) антипараллельной топологии с двумя узнающими латеральными петлями, в данном случае ОР является только каркасом. Гипотезу о функциональной роли петель аптамера в узнавании белковой мишени предлагается проверить на примере ДНК-аптамеров к ГА.

Степень разработанности проблемы

На настоящий момент известно несколько ДНК- и РНК-аптамеров к ГА вируса гриппа, в их числе ДНК-аптамеры RHA0385 ^7) и RHA006 ^6) к ГА вируса И5Ш (A/Anhui/1/2005) и Бу42 (15) как результат оптимизации первичного аптамера, полученного SELEX к вирусу И3№. Известна только первичная структура этих аптамеров и аффинность: для О6 и О7 - к некоторым рекомбинантным ГА (рекГА) и вирусам (вирГА) серотипов Н1, Н3, Н5 (для 15 исследовано только взаимодействие с вирГА серотипов Н1 и Н3). Аптамеры 15, О7 и О6 использованы в аптасенсорах. Особый интерес исследователей к аптамерам G7 и G6 связан с их способностью узнавать девять различных штаммов вируса гриппа А. Ранее в нашей лаборатории методом кругового дихроизма определили только тип неканонических структур этих аптамеров: ОР для G7 и G6, ьмотив для 15, а также их термическую стабильность. Роль отдельных элементов структуры: предполагаемого каркаса и петель, как в формировании структуры аптамеров, так и в комплексообразовании с белком исследованы не были.

Целью данной работы являлся поиск структурно-функциональных взаимоотношений для ДНК-аптамеров к ГА вируса гриппа А, которые обладают предполагаемыми каркасами с неканоническими структурами разного типа: 0Р параллельной и гибридной топологии, а также ьмотивом.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучение структуры ДНК-аптамеров к ГА: 07, 06 и 15.

2. Определение склонности ДНК-аптамеров к олигомеризации.

3. Исследование комплексообразования аптамеров с различными ГА: рекомбинантными (рекГА) и в составе инактивированных вирусных частиц (вирГА).

4. Изучение роли элементов неканонических структур ДНК: каркаса, петель и фланкирующих последовательностей - в связывании с ГА.

Объект исследования

ДНК-аптамеры к ГА вируса гриппа: 06, 07, 15.

Предмет исследования

Структура ДНК-аптамеров к ГА и их производных; комплексы ДНК-аптамеров с рекомбинантными ГА (рекГА) и с инактивированными вирусными частицами (вирГА).

Впервые установлены детали неканонической структуры ДНК-аптамеров к ГА вируса гриппа А. Впервые при помощи оригинальной методики эксклюзионной ВЭЖХ, разработанной в нашей лаборатории, установлена степень олигомеризации для ДНК-аптамеров к ГА вируса гриппа А. Впервые при помощи метода интерферометрии биокомплексов получены константы скоростей и равновесия для комплексов ДНК-аптамеров и их производных с рекГА и вирГА различных штаммов. Расширена панель штаммов вируса гриппа, которые способны узнавать аптамеры: для 07 показано связывание как с рекГА, так и с вирГА серотипов Н7, Н9, а также с вирГА Н12; для 06 - с рекГА Н7, Н9 и вирГА Н12. 15 связывается как с рекГА, так и с вирГА Н5, а также с рекГА Н7 и Н9.

Теоретическая значимость исследования

Поиск элементов структуры аптамера, ответственных за узнавание мишени, на примере ДНК-аптамеров к ГА вируса гриппа А является новым и актуальным исследованием, выполненным на мировом уровне, и вносит вклад в понимание механизмов взаимодействия аптамеров с белковыми мишенями. В данной работе проверяется функциональная роль каркаса и петель аптамера в узнавании белковой мишени - ГА, на примере ДНК-аптамеров с неканоническими структурами. У 0Р аптамеров к ГА сам каркас играет существенную роль в узнавании. Полученные результаты определяют стратегию и тактику моделирования и экспериментальных исследований в разработке аптамеров к ГА вируса гриппа А.

Практическая значимость исследования

Исследовано взаимоотношение между структурными и функциональными характеристиками аптамеров к ГА вируса гриппа А.

Аптамерные нуклеиновые кислоты разных неканонических структур могут иметь высокую аффинность к ГА вируса гриппа А. Кроме того, возможно получение коротких аптамерных ДНК (длиной 15 и 19 нуклеотидов), обладающих топологией параллельного или гибридного GQ, узнающих ГА вируса гриппа А. Разработана методика интерферометрии биокомплексов для исследования взаимодействия аптамеров с рекомбинантными ГА и инактивированными вирусными частицами, позволяющая исследовать как константу равновесия Kd, так и, что более важно, константы скорости ассоциации и диссоциации комплекса (kon и koff). Данная методика исследования параметров аффинности комплексообразования между G-квадруплексами и белками-мишенями разработана при поддержке субсидии Министерства высшего образования и науки от 09.10.2020 г. № 075-15-2020809. Из исходных аптамеров сконструированы производные с низкими константами скорости диссоциации koff порядка 10-5 - 10-4 с-1, которые могут послужить перспективными молекулярными узнающими элементами для аптасенсоров с широкой специфичностью к различным штаммам вируса гриппа А.

Методология диссертационного исследования

Методология основана на использовании следующих методов. Спектры кругового дихроизма и поглощения ультрафиолетового света для исследования вторичной структуры и стабильности аптамеров в различных условиях получены на спектрометре Chirascan, НИИ ФХБ им.

A.Н.Белозерского. Спектры ядерного магнитного резонанса получены на приборах Bruker AVANCE III HD 300 и Bruker AVANCE III 400, ИМБ РАН им.

B.А.Энгельгардта. Олигомерный состав образцов аптамеров исследовали при помощи эксклюзионнной высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Agilent 1200 HPLC с колонкой TSKgel G2000SWXL.

Комплексообразование исследовали на приборах ProteOn XPR36 (поверхностный плазмонный резонанс), BLItz, ForteBIO Octet Red96 и Sartorius Octet R2 (интерферометрия биокомплексов). Поглощение продукта пероксидазной реакции в процессе аптаферментного анализа регистрировали на планшетном ридере TECAN Spark 10M. Обработку данных выполняли при помощи программного обеспечения Pro-Data Chirascan, ProteOn Manager Software, BLItz Pro 1.3, Data Acquisition v.10.0, Microsoft Excel 2019 и OriginPro.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Каркасы ДНК-аптамеров G6 и G7 — это мономерные, стабильные при комнатной температуре GQ параллельной и гибридной топологии.

2. Аптамеры способны специфически связываться с ГА разных штаммов вируса гриппа А, в том числе далёких по первичной структуре (рекГА и в составе инактивированных вирусных частиц).

3. Для узнавания ДНК-аптамеров G6 и G7 важным является наличие каркасной структуры.

4. Изменение предполагаемых петель и фланкирующих участков аптамера G7 не отменяет связывание с ГА, но модулирует аффинность при изменении констант скорости ассоциации и диссоциации, и селективности относительно родственных ГА.

5. Для связывания аптамера I5 с ГА не обязательна фиксированная конформация i-мотива.

Достоверность результатов подтверждается воспроизводимостью экспериментов и статистической обработкой данных. Все экспериментальные процедуры соответствуют поставленным целям и задачам. Результаты получены на современном научном оборудовании с использованием реактивов, произведенных ведущими мировыми компаниями.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на заседании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, а также на следующих научных мероприятиях и конференциях:

1. Международная зимняя школа «Interaction Wins 2021», Павия, Италия;

2. 45th FEBS Congress, 2021, Любляна, Словения;

3. 6th International Symposium «Aptamers 2019», Оксфорд, Великобритания;

4. Четыре международные научные конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», 2017, 2018, 2019, 2020 гг., Москва, Россия;

5. 5th ISIRV AVG Conference, 2017, Шанхай, Китай.

Публикации

Основные результаты диссертационной работы представлены в 3 публикациях в международных рецензируемых журналах, индексируемых в системах Web of Science и Scopus. В научных публикациях (Bizyaeva A.A., Bunin D.A., Moiseenko V.L., et al., Int. J. Mol. Sci. 2021) и (Novoseltseva (Bizyaeva) A.A., Ivanov N.M., Novikov R.A., et al. Biomolecules. 2020) автор

принимал активное участие в постановке задач, выполнении экспериментов (в том числе в исследовании структуры и функции аптамеров, составлении филогенетического дерева гемагглютининов), анализе данных и подготовке публикаций, включая переписку с редакцией и рецензентами (при поддержке грантов РФФИ 19-315-90100, РНФ 18-74-10019). В публикации (Kukushkin V.I., Ivanov N.M., Novoseltseva (Bizyaeva) A.A., et al., PLoS ONE. 2019) описаны эксперименты по определению аффинности аптамера G7 к рекомбинантным ГА, выполненные автором (при поддержке гранта РНФ 1874-10019).

Личный вклад автора

Личный вклад автора в диссертационное исследование заключался в сборе и анализе данных литературы, в планировании и проведении экспериментов, в обработке, анализе и оформлении полученных результатов, подготовке материалов к печати, в представлении результатов на научных мероприятиях.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: Введение, Обзор литературы, Результаты и обсуждение, Материалы и методы, Заключение, Выводы и Список литературы, состоящий из 142 наименований. Работа содержит 58 рисунков и 16 таблиц.

ГЛАВА 1. АПТАМЕРЫ К ВИРУСУ ГРИППА (ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Гемагглютинин

Гемагглютинин (ГА) вируса гриппа - один из основных гликопротеинов оболочки вируса, который отвечает за прикрепление и проникновение вируса гриппа в клетку [1]. ГА составляет треть всех белков в составе вирусной частицы [2]. ГА состоит из двух субъединиц, ГА1 и ГА2, соединённых дисульфидной связью [3]. Субъединица ГА1 отвечает за связывание с сиаловыми кислотами на поверхности клетки, а субъединица ГА2 имеет трансмембранный домен. На поверхности вирусной частицы гемагглютинин существует в виде тримера (Рис. 1).

Рисунок 1. Структура гомотримера гемагглютинина штамма А/сЫскеп/АпЬш/1089/2007 (Н5Ш) (РББ ГО 4KWM [4]). Субъединицы ГА1 окрашены в зеленый цвет, а ГА2 - в оранжевый.

Известно, что первичные структуры ГА разных штаммов сильно различаются, однако пространственная структура ГА консервативна [5]. Для различных серотипов гемагглютинина, выделенных на основе антигенных свойств, приняты сокращения Нп, где 1 < п < 18 для вируса гриппа А [6,7]. Среди прочих белков вируса гриппа ГА на данный момент является самой популярной мишенью для молекулярных узнающих элементов различной химической природы [8]. Недавно были идентифицированы несколько моноклональных антител к ГА с широкой штамм-специфичностью [9], однако ещё раньше были обнаружены аптамеры с аналогичными свойствами [10].

1.2. Аптамеры к белкам вируса гриппа

Аптамеры - это олигонуклеотиды, обладающие способностью специфически связываться с мишенью за счет своей уникальной третичной структуры. Аптамеры как молекулярные узнающие элементы являются перспективными компонентами для биосенсоров, в том числе для вирусных заболеваний [11-15]. Одно из направлений получения и изучения аптамеров связано с вирусом гриппа: на данный момент известно более 60 ДНК- и РНК-аптамеров к таким белкам, как гемагглютинин и нуклеопротеин. При этом основной мишенью является рекомбинантный гемагглютинин (серотипов Н1, Н3, Н5, Н9 вируса гриппа А, а также ГА из вируса гриппа В) [8], хотя аптамеры часто отбирают к другим белкам вируса гриппа и даже целым вирусам. Для селекции аптамеров применяют в основном штаммы НШ1, Н3К2 и Н5Ш, поскольку они обладают способностью заражать человека и вызывать эпидемии [16], таким образом, полученные аптамеры могут оказаться полезными при диагностике опасных штаммов гриппа с потенциально высоким эпидемиологическим риском [17-23]. Вероятно, с этим связано стремление получить аптамеры, строго специфичные к одному серотипу вируса гриппа [24]. В связи с этим были даже предприняты попытки наряду с

SELEX провести негативную селекцию относительно других штаммов вируса [25].

Первые аптамеры к ГА вируса гриппа А получены в 2004 году методом селективной эволюции лигандов путём экспоненциального обогащения (SELEX, от англ. selective evolution of ligands by exponential enrichment [26]) к рекомбинантному гемагглютинину (рекГА) штамма A/Port Chalmers/1/73 (H3N2) [27]. На основе последовательностей аптамеров A21 и А22 (68 н. каждый) авторы предположили, что они имеют структуру несовершенной шпильки (Рис. 2 цитируется по [8], где положение нуклеотидов в предполагаемой структуре совпадает с предложенным авторами [27]). Эти аптамеры обладают также способностью ингибировать взаимодействие вируса гриппа А с клетками [27]. На основе аптамера A22 создан целый ряд систем детекции вируса гриппа [28-31].

А 22 А21

Рисунок 2. Предполагаемые шпилечные структуры ДНК-аптамеров А21 и А22 [8], где основания окрашены в соответствии с позиционной энтропией, которая равна 0, если вероятность равна 1.

Мисоно и Кумар использовали SELEX на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР) для отбора РНК-аптамеров к рекГА штамма A/Panama/2007/1999 (H3N2); для лидера этой серии (Clone B) определили его константу диссоциации в комплексе с этим белком, которая составила

Kd = 0,12 ± 0,02 нМ [32]. Для Clone B и другого высокоаффинного аптамера из того же пула, Clone A, авторы обнаружили консенсусную последовательность 5'-GUCGNCNU(N)2-3GUA-3', где N обозначает любой нуклеотид. Предварительные компьютерные расчёты при помощи программного обеспечения RNAfold предлагают для Clone B шпилечную структуру [8]. Эта же группа авторов отобрала РНК-аптамеры к целому вирусу того же штамма, A/Panama/2007/1999 (H3N2) [33]. Лидерный аптамер, P30-10-16 (Рис. 3А), высокоаффинно связывается с рекГА данного штамма (Kd = 0,19 нМ, константы скорости ассоциации kon и диссоциации koff составили 0,21 мкМ-1хс-1 и 3,4 х 10-5 с-1, соответственно). Аффинность аптамера P30-10-16 к ГА H3N2 вируса гриппа A в 15 раз выше, чем для моноклонального антитела к ГА из-за различий в константе скорости диссоциации на порядок [24]. Интересно, что консенсусный участок 5'-GUCGNCNU(N)2-3GUA-3' также характерен для данного аптамера и частично находится в одноцепочечном фрагменте шпилечной структуры (Рис. 3А). Этот аптамер был применён в биосенсорах на основе просвечивающей электронной микроскопии [33] и микрофлюидных систем [20].

Получен также целый ряд ДНК-аптамеров с наномолярной аффинностью к свиному гриппу A/swine/Minnesota/SG-00235/2007 (H3N2) и высокой специфичностью к штаммам H3N2, не взаимодействующих с ГА серотипов H1, H2, H5, H6, H7, H9 [34]. Методом футпринтинга для одного из лидерных аптамеров, HA68, определена предположительная область связывания ГА с 8 по 40 н. (Рис. 3Б).

* I

5 . G-G-G-A-G-A С 111111е

3'-UCUUCUCCU U-C-C-U-C-U - т Л-

с 10 rS

VC-G С ,Q g

U-A I I/ \

С CGTCAT Т

с r III

С « G - С- Т G -Т A G

</л«й

и *

С 9 с у

Q

Л *

1 . А С

Т \ в

» V Л

А *>

А и С

P30-10-16 <• .

. с , 0

А л

U С

с г '

G Gc а

У -А

Рисунок 3. Предполагаемые структуры аптамеров (А) P30-10-16 [24] и (Б) HA68 [34], построенные при помощи компьютерных расчётов.

Путём химической модификации ДНК-аптамера D26, то есть введением фтора по 2'-положению пиримидинов, получили молекулярный узнающий элемент (Рис. 4Б) с высокой специфичностью и фемтомолярной аффинностью к рекГА A/California/07/2009 (H1N1) (Kd = 6,7 х 10-14 М, измерена методом ППР), а также способностью ингибировать реакцию гемагглютинации (Рис. 4А) [35]. Реакцию гемагглютинации с вирусом A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1), как и заражение клеток почки собаки Майдин-Дерби (MDCK) ингибирует аптамер 1 (Рис. 4В) [36].

Методом селекции на бакуловирусе с экспрессированным гемагглютинином получен 60-звенный аптамер, специфичный к ГА серотипа H1N1 и содержащий 5-бензилдезоксиуридин (Bn) и 3'-концевой тимидин, присоединённый 3'-3'-фосфодиэфирной межнуклеотидной связью (CCTGCCTTTGG Bn Bn Bn AACC Bn Bn Bn Bn GACCGC Bn Bn Bn C Bn Bn AGGCCG Bn Bn AGGAAAGGCACCGACAGC-3'-3'-dT) [37]. На основе конъюгата РНК-аптамера, специфичного к вирусу гриппа H1N1 (GGCAGGAAGACAAACAGCCAGCGTGACAGCGACGCGTAGGGACCGGC ATCCGCGGGTGGTCTGTGGTGCTGT, 72 н., с предполагаемой структурой

шпильки, К = 60 ± 20 нМ получена методом проточной цитофлуориметрии), с магнитными наночастицами были созданы системы детекции, чувствительность в 100-1000 раз выше стандартных клинических тест-систем на основе антител [38-40], а для электрохимического сенсора на основе ДНК-аптамера Ар1-03 (Рис. 5А) диапазон детекции рекГА штаммов Н1Ш находится в диапазоне 0,4-100 мкг/мл [41].

Б

А

А ¥

Agglutinât ion

Anti-HA Aptamer

Agglutination inhibition

В

9

о

Рисунок 4. (А) Схема реакции гемагглютинации и её ингибирования при помощи аптамера [35]. (Б) Предполагаемая структура аптамера Б26, построенная при помощи компьютерных расчётов [35]. (В) Предполагаемая структура аптамера 1, построенная при помощи компьютерных расчётов; серым отмечен консенсусный участок, встречающийся в других аптамерах из данного пула [36].

го

A G

( V

I 1

л с

L

С G

V, V

G—С— эо А-Т ю G-C А-т А-C-G---

/ ч

С G-C-i""' "Я

G ¿-¿-¿^ /

\ J ^т-'

,А Д-ч „

3'

г

cr Т л

A20S

Рисунок 5. (А) Предполагаемая структура аптамера Apt-03, построенная при помощи компьютерных расчётов [41]. (Б) Предполагаемые структуры ДНК-аптамеров, узнающих вирусы H3N2 и H1N1, построенные при помощи компьютерных расчётов [42].

Для применения в электрохимических биосенсорах создан ряд ДНК-аптамеров с высокой аффинностью к вирусам H3N2 и H1N1, показанной методами аптаферментного анализа (АФА) и интерферометрии биокомплексов (ИБК) (Рис. 5Б) [42].

ДНК-аптамеры I, II и III (Рис. 6) прошли SELEX к рекГА серотипа H1 и отрицательную селекцию по отношению к рекГА серотипа H5 [43]. Методами АФА и ППР показано, что они действительно обладают высокой специфичностью и наномолярной аффинностью к целевому белку, а спектроскопия кругового дихроизма (КД) позволила определить присутствие в структуре аптамеров G-квадруплекса (GQ) параллельной топологии (Рис. 6).

В дальнейшем аптамер Ар I был применён для создания электрохимического аптасенсора [44].

Ар I — с^тдштдетлй^йт^лоттттезсйттесАСССАСЛстсс —

+ и »А* А * * А А А ........

Ар II — тсттстбатазюжтбсбтесдсттасссв — .... .. + *** *++

Ар Ш — с^тсеос^йаг^оаеотеаоодддтоаессатсасААТАссстс —

200 220 24fl 2<М1 2W) JBO J20 Wavelenfith, nm

Рисунок 6. Последовательности и спектры кругового дихроизма (КД) ДНК-аптамеров I, II и III, свидетельствующие об образовании GQ параллельной топологии [43]. Гуанозины, предположительно участвующие в образовании GQ, выделены жирным шрифтом и подчёркнуты.

РНК-аптамер HAS15-5 (Рис. 7А) к рекГА штамма A/wild-duck/Korea/ES/2004 (H5N2) ингибирует реакцию гемагглютинации [45]. ДНК-аптамер А10 к рекГА штамма A/Anhui/1/2005 (H5N1) (Рис. 7Б) [46] и РНК-аптамер HA12-16 к рекГА A/wild-duck/Korea/ES/2004 (H5N2) (Рис. 7В) [47] блокируют связывание целевых белков с клетками MDCK. Аптамер 2 (Рис. 7Г), полученный в результате SELEX к рекГА штамма A/Vietnam/1203/04 (H5N1), имеет высокую аффинность к целевому белку (^d = 4,65 нМ), определённую методом поверхностного плазмонного резонанса, достаточно низкую константу скорости диссоциации koff = 2,18 х 10-4 с-1, и не узнаёт ГА вируса гриппа А других серотипов [48], что послужило основой для создания ППР, импедансных, магнитофоретических и пр. биосенсоров [49-57].

1Ь

* % *

%

Ж

мг

и-ч

I I

НАЭ15-5

В

ииСЛиССБС

НА12-16

Т7

—¿-¿-А.. N

/

"О

' 5 XV"

А10

V I

чч

V4*

V

Г

/

я*

-с» :<

N

\

¡-«-«-й'

"-т.«.т .с \

\ Э' 5'

Рисунок 7. Предполагаемые структуры аптамеров: (А) НАБ15-5 [45], (Б) А10 [48], (В) НА12-16 [49] (серым отмечены консенсусные участки, встречающиеся в других аптамерах из данного пула), (Г) 2 [50], построенные при помощи компьютерных расчётов.

На основе аптамеров, специфичных к рекГА штаммов Н5Ш, хотя и с высокими К около 70-100 нМ (метод тушения и регенерации флуоресценции), созданы различные системы детекции [58] (Рис. 8А), так же, как и для аптамеров, узнающих только вирусы Н5№ [59]. Серия высокоаффинных аптамеров с предполагаемой структурой шпильки, узнающих разные штаммы вирусов Н5ЫХ, была применена при создании

сэндвич-системы биосенсоров на основе ППР [60]. Чувствительность этого двойного сенсора на основе аптамера многократно увеличивалась, когда вторичный аптамер конъюгировали с наночастицами золота. Для лидеров последних двух серий аптамеров методом спектроскопии КД показано изменение конформации при комплексообразовании с вирусом [59,60].

А

Б

Чу,

V Ч "

■ ] \ с . с ¿'Ч

* 4-4-и--1 Р

а

^с-о-т-А ' с-а э ¿-С С-&

» с-а

и

\ /

с - о

т А

С. с

т о

<; - с

с — с

с - в

В А Т О

о

<х

л

/

-

р

\ / о — е

I

т А

/ \

а — т

I

с — о

[ I а — с

с а

I I о с ! I с — о

I

-С , ,я

1-1 -1 -с 1111

I /в

ГИ

|

1

Ч

3' — д

Рисунок 8. Предполагаемые структуры (А) аптамеров из пула ББЬБХ к рекГА Н5Ш [59], (Б) аптамера 4О [61], построенные при помощи компьютерных расчётов.

Разные штаммы вирусов Н9№ узнают высокоспецифичные ДНК-аптамеры, послужившие основой для создания тест-системы на основе ПЦР [61] (предполагаемая структура лидера 4О приведена на Рис. 8Б). Заражение клеток МОСК ингибируют 80-звенные аптамеры А9 и В4 (в их структуре присутствуют О-блоки, см. Рис. 9), обладающие специфичностью к вирусам Н9№ (Ка, полученные методами капиллярного электрофореза и АФА, составили около 40 и 10 нМ, соответственно) [62,63], а также 35-звенный

аптамер C7-35M (GGT AGT TAT AGT ATA TGG AAG GGG GTG TCG TAT GG), который сконструирован на основе консенсусной последовательности после SELEX к рекГА A/ck/Korea/ms96/96 (H9N2) [64].

Рисунок 9. Предполагаемые структуры аптамеров A9 (слева) и B4 (справа) [62], вычисленные при помощи программного обеспечения.

Аптамеры RHA0006 (G6, GGG TTT GGG TTG GGT TGG GTT TTT GGG TTT GGG TTG GGT TGG GAA AAA, 48 н.) и RHA0385 (G7, TTG GGG TTA TTT TGG GAG GGC GGG GGT T, 28 н.) с G-блоками, полученные к ГА штамма A/Anhui/1/2005 (H5N1) [10], обладают уникальной способностью узнавать гемагглютинины различных штаммов вируса гриппа А (A/California/04/2009 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Georgia/20/2006 (H1N1), A/New Caledonia/20/1999 (H1N1), A/Aichi/2/1968 (H3N2),

A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Moscow/10/1999 (H3N2), A/Mississippi/1/1985 (H3N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/JWEye/HK/1038/06 (H5N1)). Авторы исходной статьи сделали первый шаг к обнаружению G-квадруплекса (GQ) в аптамере, показав, что для эффективного связывания необходимо присутствие катионов калия. Обоснованное предположение о G-квадруплексной пространственной структуре G6 и G7 было выдвинуто в нашей лаборатории [8], а впоследствии и экспериментально определено на основе спектров КД и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [65]. Аптамеры G6 и G7 широко используются в прототипах сенсорных систем для детекции вируса гриппа [19, 66-68], однако попыток оценить влияние различных элементов структуры на аффинность аптамеров не было сделано.

Кроме упомянутых аптамеров G6 и G7, узнавание гемагглютининов разных штаммов отмечается для некоторых других аптамеров. Так, РНК-аптамер 8-3S (GGA GCU CAG CCU UCA CUG CGA GAU UGU UCU GAC CGA GUU GCC UAG CAG GGC AAC CGC UGG AAC UUG AAG UCG GUA AUG CGA GCG GAA AGC CUU GGC ACC ACG GUC GGA UCC AC, 113 н.) связывается с вирусами H5N1 и H7N7 (A/Vietnam/1194/2004, A/Indonesia/05/2005, A/Netherlands/219/2003) с Kd порядка десятых долей нМ и константами скорости диссоциации koff порядка 10-4 с-1 (ППР), препятствует взаимодействию вируса с сиаловыми кислотами и отличает их от других серотипов вируса гриппа А [69]. На основе аптамера A22 [27] методом количественной характеристики взаимоотношений между структурой и аффинностью был создан аптамер Bv42 (I5, AACGCTCACT CCCCC AAGAAGAA CCCCC CCC CCCCC CCCC CCCCC AGTGAGCGTT, 55 н.) [70], который ингибирует связывание с клетками MDCK вирусов таких разных штаммов, как A/Texas/1977 (H3N2), A/Perth/265/2009 (H1N1pdm09) и B/Perth/211/2001 с наномолярными концентрациями полумаксимального

ингибирования (/C50). На примере данного аптамера созданы сенсоры для определения разных штаммов вируса гриппа [66].

Известно несколько аптамеров к вирусу гриппа B. Например, получен специфичный РНК-аптамер Class A-20 (Рис. 11 А) к ГА штамма B/Johannesburg/05/1999 (для комплекса с ГА Kd = 44 ± 6 нМ), блокирующий проникновение вируса в клетки [71,72]. РНК-аптамеры предположительно шпилечной структуры, узнающие штаммы B/Tokio/53/99 и B/Jilin/20/2003, использовали в качестве молекулярных узнающих элементов в сенсорах на основе метода спектроскопии ППР с чувствительностью 8 нг/мл и отсутствием сигнала на вирусы гриппа А [73].

Добиться узнавания аптамерами различных штаммов вируса гриппа можно используя мишени менее вариабельные, чем ГА. Так, ДНК-аптамер PAN2 к N-концевому эндонуклеазному домену полимеразы (PAN), несмотря на Kd около 200 нМ (получена методом изотермической титрационной калориметрии), ингибирует инфицирование клеток вирусами штаммов H1N1, H5N1, H7N7 и H7N9 с IC50 около 10 нМ (Рис. 10) [74].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бизяева Анастасия Александровна, 2022 год

Список литературы

1. Suzuki Y., Nei M. Origin and evolution of influenza virus hemagglutinin genes. // Mol. Biol. Evol. 2002. Vol. 19. P. 501-509.

2. Oxford J.S., Corcoran T., Hugentobler A.L. Quantitative analysis of the protein composition of influenza A and B viruses using high resolution SDS polyacrylamide gels. // J Biol Stand. 1981. Vol. 9. P. 483-491.

3. Wilson I.A., Skehel J.J., Wiley D.C. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. // Nature 1981. Vol. 289. P. 366-373.

4. Shore D.A., Yang H., Balish A.L., et al. Structural and antigenic variation among diverse clade 2 H5N1 viruses. // PLoS One 2013. Vol. 8. P. e75209.

5. Fields Virology / Knipe D.M., Howley P.M. - 6th ed. Philadelphia, PA, USA: Lippincott Williams & Wilkins, Wolters Kluwer Business, 2013 - 2582 p.

6. Righetto I., Milani A., Cattoli G., Filippini F. Comparative structural analysis of haemagglutinin proteins from type A influenza viruses: Conserved and variable features. // BMC Bioinform. 2014. Vol. 15, 363.

7. Kapoor S., Dhama K. Insight into Influenza Viruses of Animals and Humans. / Kapoor S., Dhama K. Cham, Switzerland: Springer, 2014. - 222 p.

8. Kirkpatrick E., Qiu X., Wilson P.C., Bahl J., Krammer F. The influenza virus hemagglutinin head evolves faster than the stalk domain. // Sci. Rep. 2018. Vol. 8. P. 10432.

9. Zavyalova E., Kopylov A. Aptamers to hemagglutinin: a novel tool for influenza virus recognition and neutralization // Current Pharmaceutical Design. 2016. Vol. 22. P. 4835-4853.

10. Shiratori I., Akitomi J., Boltz D. A., et al. Selection of DNA aptamers that bind to influenza A viruses with high affinity and broad subtype specificity. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014. Vol. 443. P. 37-41.

11. González V.M., Martín M.E., Fernández G., García-Sacristán A. Use of Aptamers as Diagnostics Tools and Antiviral Agents for Human Viruses. // Pharmaceuticals 2016. Vol. 9. P. 78.

12. Vidic J., Manzano M., Chang C.M., Jaffrezic-Renault N. Advanced biosensors for detection of pathogens related to livestock and poultry. // Vet. Res. 2017. Vol. 48. P. 1-22.

13. Saylan Y., Erdem O., Unal S., Denizli A. An Alternative Medical Diagnosis Method: Biosensors for Virus Detection. // Biosensors 2019. Vol. 9. P. 65.

14. W<?drowska E., Wandtke T., Piskorska E., Kopinski P. The Latest Achievements in the Construction of Influenza Virus Detection Aptasensors. Viruses 2020. Vol. 12. P. 1365.

15. Kim S.M., Kim J., Noh S., Sohn H., Lee T. Recent Development of Aptasensor for Influenza Virus Detection. // Biochip J. 2020. Vol. 16. P. 1-13.

16. Allen J.D., Ross T.M. H3N2 influenza viruses in humans: Viral mechanisms, evolution, and evaluation. // Hum Vaccin Immunother. 2018. Vol. 14. P. 1840-1847.

17. Asha K., Kumar P., Sanicas M., Meseko C.A., Khanna M., Kumar B. Advancements in Nucleic Acid Based Therapeutics against Respiratory Viral Infections. // J. Clin. Med. 2019. Vol. 8. P. 6.

18. Negri P., Chen G., Kage A., et al. Direct optical detection of viral nucleoprotein binding to an anti-influenza aptamer. // Anal Chem. 2012. Vol. 84. P. 5501-5508.

19. Diba F.S., Kim S., Lee H.J. Amperometric bioaffinity sensing platform for avian influenza virus proteins with aptamer modified gold nanoparticles on carbon chips. // Biosens Bioelectron. 2015. Vol. 72. P. 355-361.

20. Le T.T., Chang P., Benton D.J., McCauley J.W., Iqbal M., Cass A.E.G. Dual Recognition Element Lateral Flow Assay Toward Multiplex Strain Specific Influenza Virus Detection. // Anal Chem. 2017. Vol. 89. P. 6781-6786.

21. Park J.A., Kim J., Kim S.M., et al. Fabrication of Electrochemical Influenza Virus (H1N1) Biosensor Composed of Multifunctional DNA Four-Way Junction and Molybdenum Disulfide Hybrid Material. // Materials (Basel). 2021. Vol. 14. P. 343.

22. Wang F., Gopinath S.C., Lakshmipriya T. Aptamer-Antibody Complementation On Multiwalled Carbon Nanotube-Gold Transduced Dielectrode Surfaces To Detect Pandemic Swine Influenza Virus. // Int J Nanomedicine. 2019. Vol. 14. P. 8469-8481.

23. Bhardwaj J., Chaudhary N., Kim H., Jang J. Subtyping of influenza A H1N1 virus using a label-free electrochemical biosensor based on the DNA aptamer targeting the stem region of HA protein. // Anal Chim Acta. 2019. Vol. 1064. P. 94-103.

24. Gopinath S.C., Misono T.S., Kawasaki K., et al. An RNA aptamer that distinguishes between closely related human influenza viruses and inhibits haemagglutinin-mediated membrane fusion. // J. Gen. Virol. 2006. Vol. 87. P. 479-487.

25. Woo H.M., Lee J.M., Yim S., Jeong Y.J. Isolation of single-stranded DNA aptamers that distinguish influenza virus hemagglutinin subtype H1 from H5. // PLoS One. 2015. Vol. 10. P. 0125060.

26. Tuerk C., Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. // Science. 1990. V. 249. P. 505-510.

27. Jeon S.H., Kayhan B., Ben-Yedidia T., Arnon R. A DNA aptamer prevents influenza infection by blocking the receptor binding region of the viral hemagglutinin. // J Biol Chem. 2004. V. 279. P. 48410-48419.

28. Chen C., Zou Z., Chen L., Ji X., He Z. Functionalized magnetic microparticle-based colorimetric platform for influenza A virus detection. // Nanotechnology. 2016. Vol. 27. P. 435102.

29. Cui Z.Q., Ren Q., Wei H.P., et al. Quantum dot-aptamer nanoprobes for recognizing and labeling influenza A virus particles. // Nanoscale. 2011. Vol. 3(6):2454-2457.

30. Kiilerich-Pedersen K., Dapra J., Cherre S., Rozlosnik N. High sensitivity point-of-care device for direct virus diagnostics. // Biosens Bioelectron. 2013. Vol. 49. P. 374-379.

31. Kirkegaard J., Rozlosnik N. Screen-Printed All-Polymer Aptasensor for Impedance Based Detection of Influenza A Virus. // Methods Mol Biol. 2017. Vol. 1572. P. 55-70.

32. Misono T.S., Kumar P.K. Selection of RNA aptamers against human influenza virus hemagglutinin using surface plasmon resonance. // Anal Biochem. 2005. Vol. 342. P. 312-317.

33. Le T.T., Adamiak B., Benton D.J., et al. Aptamer-based biosensors for the rapid visual detection of flu viruses. // Chem Commun (Camb). 2014. Vol. 50. P. 15533-15536.

34. Wongphatcharachai M., Wang P., Enomoto S., et al. Neutralizing DNA aptamers against swine influenza H3N2 viruses. // J Clin Microbiol. 2013. Vol. 51. P. 46-54.

35. Gopinath S.C., Kumar P.K. Aptamers that bind to the hemagglutinin of the recent pandemic influenza virus H1N1 and efficiently inhibit agglutination. // Acta Biomater. 2013. Vol. 9. P. 8932-8941.

36. Li W., Feng X., Yan X., Liu K., Deng L. A DNA Aptamer Against Influenza A Virus: An Effective Inhibitor to the Hemagglutinin-Glycan Interactions. // Nucleic Acid Ther. 2016. Vol. 26. P. 166-172.

37. Narayan C., Kwon J., Kim C., Kim S.J., Jang S.K. Virus-based SELEX (viro-SELEX) allows development of aptamers targeting knotty proteins. // Analyst. 2020. Vol. 145. P. 1473-1482.

38. Lai H.C., Wang C.H., Liou T.M., Lee G.B. Influenza A virus-specific aptamers screened by using an integrated microfluidic system. // Lab Chip. 2014. Vol. 14. P. 2002-2013.

39. Lu P.H., Ma Y.D., Fu C.Y., Lee G.B. A structure-free digital microfluidic platform for detection of influenza a virus by using magnetic beads and electromagnetic forces. // Lab Chip. 2020. Vol. 20. P. 789-797.

40. Tseng Y.T., Wang C.H., Chang C.P., Lee G.B. Integrated microfluidic system for rapid detection of influenza H1N1 virus using a sandwich-based aptamer assay. // Biosens Bioelectron. 2016. Vol. 82. P. 105-111.

41. Kushwaha A., Takamura Y., Nishigaki K., Biyani M. Competitive non-SELEX for the selective and rapid enrichment of DNA aptamers and its use in electrochemical aptasensor. // Sci Rep. 2019. Vol. 9. P. 6642.

42. Bai C., Lu Z., Jiang H., et al. Aptamer selection and application in multivalent binding-based electrical impedance detection of inactivated H1N1 virus. Biosens Bioelectron. // 2018. Vol. 110. P. 162-167.

43. Woo H.M., Lee J.M., Yim S., Jeong Y.J. Isolation of single-stranded DNA aptamers that distinguish influenza virus hemagglutinin subtype H1 from H5. // PLoS One. 2015. Vol. 10. P. e0125060.

44. Lee J.M., Kim J., Ryu I., et al. An Aptamer-Based Electrochemical Sensor That Can Distinguish Influenza Virus Subtype H1 from H5. // J Microbiol Biotechnol. 2017. Vol. 27. P. 2037-2043.

45. Park S.Y., Kim S., Yoon H., et al. Selection of an antiviral RNA aptamer against hemagglutinin of the subtype H5 avian influenza virus. // Nucleic Acid Ther. 2011. Vol. 21. P. 395-402.

46. Cheng C., Dong J., Yao L., et al. Potent inhibition of human influenza H5N1 virus by oligonucleotides derived by SELEX. // Biochem Biophys Res Commun. 2008. Vol. 366. P. 670-674.

47. Kwon H.M., Lee K.H, Han B.W., Han M.R., Kim D.H., Kim D.E. An RNA aptamer that specifically binds to the glycosylated hemagglutinin of avian

influenza virus and suppresses viral infection in cells. // PLoS One. 2014. Vol. 9. P. e97574.

48. Wang R., Zhao J., Jiang T., et al. Selection and characterization of DNA aptamers for use in detection of avian influenza virus H5N1. // J Virol Methods. 2013. Vol. 189. P. 362-369.

49. Bai H., Wang R., Hargis B., Lu H., Li Y. A SPR aptasensor for detection of avian influenza virus H5N1. // Sensors (Basel). 2012. Vol. 12. P. 12506-12518.

50. Lee T., Kim G.H., Kim S.M., et al. Label-free localized surface plasmon resonance biosensor composed of multi-functional DNA 3 way junction on hollow Au spike-like nanoparticles (HAuSN) for avian influenza virus detection. // Colloids Surf B Biointerfaces. 2019. Vol. 182. P. 110341.

51. Wang Y., Li Y., Wang R., Wang M., Lin J. Three-dimensional printed magnetophoretic system for the continuous flow separation of avian influenza H5N1 viruses. // J Sep Sci. 2017. Vol. 40. P. 1540-1547.

52. Lum J., Wang R., Hargis B., et al. An Impedance Aptasensor with Microfluidic Chips for Specific Detection of H5N1 Avian Influenza Virus. // Sensors (Basel). 2015. Vol. 15. P. 18565-18578.

53. Kwon J., Lee Y., Lee T., Ahn J.H. Aptamer-Based Field-Effect Transistor for Detection of Avian Influenza Virus in Chicken Serum. // Anal Chem. 2020. Vol. 92. P. 5524-5531.

54. Lee T., Park S.Y., Jang H., et al. Fabrication of electrochemical biosensor consisted of multi-functional DNA structure/porous au nanoparticle for avian influenza virus (H5N1) in chicken serum. // Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2019. Vol. 99. P. 511-519.

55. Karash S., Wang R., Kelso L., Lu H., Huang T.J., Li Y. Rapid detection of avian influenza virus H5N1 in chicken tracheal samples using an impedance aptasensor with gold nanoparticles for signal amplification. // J Virol Methods. 2016. Vol. 236. P. 147-156.

56. Wang R., Xu L., Li Y. Bio-nanogate controlled enzymatic reaction for virus sensing. // Biosens Bioelectron. 2015. Vol. 67. P. 400-407.

57. Fu Y., Callaway Z., Lum J., Wang R., Lin J., Li Y. Exploiting enzyme catalysis in ultra-low ion strength media for impedance biosensing of avian influenza virus using a bare interdigitated electrode. // Anal Chem. 2014. Vol. 86. P. 1965-1971.

58. Kim S.H., Choi J.W., Kim A.R., Lee S.C., Yoon M.Y. Development of ssDNA Aptamers for Diagnosis and Inhibition of the Highly Pathogenic Avian Influenza Virus Subtype H5N1. // Biomolecules. 2020. Vol. 10. P. 1116.

59. Kim S.H., Lee J., Lee B.H., Song C.S., Gu M.B. Specific detection of avian influenza H5N2 whole virus particles on lateral flow strips using a pair of sandwich-type aptamers. // Biosens Bioelectron. 2019. Vol. 134. P. 123-129.

60. Nguyen V.T., Seo H.B., Kim B.C., Kim S.K., Song C.S., Gu M.B. Highly sensitive sandwich-type SPR based detection of whole H5Nx viruses using a pair of aptamers. // Biosens Bioelectron. 2016. Vol. 86. P. 293-300.

61. Hmila I., Wongphatcharachai M., Laamiri N., et al. A novel method for detection of H9N2 influenza viruses by an aptamer-real time-PCR. // J Virol Methods. 2017. Vol. 243. P. 83-91.

62. Zhang Y., Yu Z., Jiang F., et al. Two DNA aptamers against avian influenza H9N2 virus prevent viral infection in cells. // PLoS One. 2015. Vol. 10. P. e0123060.

63. Zhang Y.W., Yan H.Y., Fu P., et al. Modified capillary electrophoresis based measurement of the binding between DNA aptamers and an unknown concentration target. // Anal Bioanal Chem. 2013. Vol. 405. P. 5549-5555.

64. Choi S.K., Lee C., Lee K.S., et al. DNA aptamers against the receptor binding region of hemagglutinin prevent avian influenza viral infection. // Mol Cells. 2011. Vol. 32. P. 527-533.

65. Kopylov A., Legatova V., Novoseltseva A., et al. Aptamers to hemagglutinin: a novel tool for influenza virus recognition and neutralization // 5 th ISIRV AVG Conference Abstract book. Shanghai, China: ISIRV. 2017. P. 103-104.

66. Gribanyov D., Zhdanov G., Olenin A., et al. SERS-Based Colloidal Aptasensors for Quantitative Determination of Influenza Virus. // Int J Mol Sci. 2021. Vol. 22. P. 1842.

67. Pang Y., Rong Z., Wang J., Xiao R., Wang S. A fluorescent aptasensor for H5N1 influenza virus detection based-on the core-shell nanoparticles metal-enhanced fluorescence (MEF). // Biosens Bioelectron. 2015. Vol. 66. P. 527-532.

68. Zhao Q., Du P., Wang X., et al. Upconversion Fluorescence Resonance Energy Transfer Aptasensors for H5N1 Influenza Virus Detection. // ACS Omega. 2021. Vol. 6. P. 15236-15245.

69. Suenaga E., Kumar P.K. An aptamer that binds efficiently to the hemagglutinins of highly pathogenic avian influenza viruses (H5N1 and H7N7) and inhibits hemagglutinin-glycan interactions. // Acta Biomater. 2014. Vol. 10. P. 1314-1323.

70. Musafia B., Oren-Banaroya R., Noiman S. Designing anti-influenza aptamers: novel quantitative structure activity relationship approach gives insights into aptamer-virus interaction. // PLoS One. 2014. Vol. 9. P. e97696.

71. Gopinath S.C., Kawasaki K., Kumar P.K. Selection of RNA-aptamer against human influenza B virus. // Nucleic Acids Symp Ser (Oxf). 2005. Vol. 49. P. 85-86.

72. Gopinath S.C., Sakamaki Y., Kawasaki K., Kumar P.K. An efficient RNA aptamer against human influenza B virus hemagglutinin. // J Biochem. 2006. Vol. 139. P. 837-846.

73. Lakshmipriya T., Fujimaki M., Gopinath S.C., Awazu K. Generation of antiinfluenza aptamers using the systematic evolution of ligands by exponential

enrichment for sensing applications. // Langmuir. 2013. Vol. 29. P. 15107-15115.

74. Yuan S., Zhang N., Singh K., et al. Cross-protection of influenza A virus infection by a DNA aptamer targeting the PA endonuclease domain. // Antimicrob Agents Chemother. 2015. Vol. 59. P. 4082-4093.

75. Aira C., Klett-Mingo J.I., Ruiz T., et al. Development of an antigen Enzyme-Linked AptaSorbent Assay (ELASA) for the detection of swine influenza virus in field samples. // Anal Chim Acta. 2021. Vol. 1181. P. 338933.

76. Kang J., Yeom G., Jang H., Park C.J., Kim M.G. Highly sensitive and universal detection strategy based on a colorimetric assay using target-specific heterogeneous sandwich DNA aptamer. // Anal Chim Acta. 2020. Vol. 1123. P. 73-80.

77. Lee I., Kim S.E., Lee J., et al. A self-calibrating electrochemical aptasensing platform: Correcting external interference errors for the reliable and stable detection of avian influenza viruses. // Biosens Bioelectron. 2020. Vol. 152. P. 112010.

78. Leblebici P., Leirs K., Spasic D., Lammertyn J. Encoded particle microfluidic platform for rapid multiplexed screening and characterization of aptamers against influenza A nucleoprotein. //Anal Chim Acta. 2019. Vol. 1053. P. 70-80.

79. Negri P., Kage A., Nitsche A., Naumann D., Dluhy R.A. Detection of viral nucleoprotein binding to anti-influenza aptamers via SERS. // Chem Commun (Camb). 2011. Vol. 47. P. 8635-8637.

80. Woo H.M., Lee J.M., Kim C.J., Lee J.S., Jeong Y.J. Recovery of TRIM25-Mediated RIG-I Ubiquitination through Suppression of NS1 by RNA Aptamers. // Mol Cells. 2019. Vol. 42. P. 721-728.

81. Woo H.M., Kim K.S., Lee J.M., et al. Single-stranded DNA aptamer that specifically binds to the influenza virus NS1 protein suppresses interferon antagonism. // Antiviral Res. 2013. Vol. 100. P. 337-345.

82. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 3406-3415.

83. Hofacker I.L. Vienna RNA secondary structure server. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 3429-3431.

84. Kikin O., D'Antonio L., Bagga P.S. QGRS Mapper: a web-based server for predicting G-quadruplexes in nucleotide sequences. // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 676-682.

85. Hatzakis E., Okamoto K., Yang D. Thermodynamic stability and folding kinetics of the major G-quadruplex and its loop isomers formed in the nuclease hypersensitive element in the human c-Myc promoter: Effect of loops and flanking segments on the stability of parallel-stranded intramolecular G-quadruplexes. // Biochemistry. 2010. Vol. 49. P. 91529160.

86. Bock L.C., Griffin L.C., Latham J.A., Vermaas E.H., Toole J.J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. // Nature. 1992. Vol. 355. P. 564-566.

87. Macaya R.F., Schultze P., Smith F.W., Roe J.A., Feigon J. Thrombin-binding DNA aptamer forms a unimolecular quadruplex structure in solution. // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. Vol. 90. P. 3745-3749.

88. Zavyalova E., Tagiltsev G., Reshetnikov R., Arutyunyan A., Kopylov A. Cation Coordination Alters the Conformation of a Thrombin-Binding G-Quadruplex DNA Aptamer That Affects Inhibition of Thrombin. // Nucleic Acid Ther. 2016. Vol. 26. P. 299-308.

89. Adrian M., Heddi B., Phan A.T. NMR spectroscopy of G-quadruplexes. // Methods. 2012. Vol. 57. P. 11-24.

90. Alieva R.R., Zavyalova E.G., Tashlitsky V.N., Kopylov A.M. Quantitative characterization of oligomeric state of G-quadruplex antithrombin aptamers by size exclusion HPLC. // Mendeleev Commun. 2019. Vol. 29. P. 424-425.

91. Largy E., Mergny J.L. Shape matters: Size-exclusion HPLC for the study of nucleic acid structural polymorphism. // Nucleic Acids Res. 2014. Vol. 42. P. e149.

92. Dailey M.M., Miller C.M., Bates P.J., Lane A.N., Trent J.O. Resolution and characterization of the structural polymorphism of a single quadruplex-forming sequence. // Nucleic Acids Res. 2010. Vol. 38. P. 4877-4888.

93. Riccardi C., Musumeci D., Russo Krauss I., Piccolo M., Irace C., Paduano L., Montesarchio D. Exploring the conformational behaviour and aggregation properties of lipid-conjugated AS1411 aptamers. // Int. J. Biol. Macromol. 2018. Vol. 118. P. 1384-1399.

94. Kolesnikova S., Hubalek M., Bednarova L., Cvacka J., Curtis E.A. Multimerization rules for G-quadruplexes. // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 45. P. 8684-8696.

95. Smargiasso N., Rosu F., Hsia W., et al. G-quadruplex DNA assemblies: Loop length, cation identity, and multimer formation. // J. Am. Chem. Soc. 2008. Vol. 130. P. 10208-10216.

96. Guedin A., Gros J., Alberti P., Mergny J.L. How long is too long? E ects of loop size on G-quadruplex stability. // Nucleic Acids Res. 2010. Vol. 38. P. 7858-7868.

97. Kypr J., Kejnovská I., Renciuk D., Vorlícková M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. P. 1713-1725.

98. Karsisiotis A.I., Hessari N.M., Novellino E., Spada G.P., Randazzo A., Webba da Silva M. Topological characterization of nucleic acid G-quadruplexes by UV absorption and circular dichroism. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2011. Vol. 50. P. 10645-10648.

99. Del Villar-Guerra R., Trent J.O., Chaires J.B. G-Quadruplex Secondary Structure Obtained from Circular Dichroism Spectroscopy. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2018. Vol. 57. P. 7171-7175.

100. Vorlickova M., Kejnovska I., Sagi J., Renciuk D., Bednarova K., Motlova J., Kypr J. Circular dichroism and guanine quadruplexes. // Methods. 2012. Vol. 57. P. 64-75.

101. Parkinson G., Lee M., Neidle S. Crystal structure of parallel quadruplexes from human telomeric DNA. // Nature. 2002. Vol. 417. P. 876-880.

102. Wang Y., Patel D.J. Solution structure of the human telomeric repeat d[AG3(T2AG3)3] G-tetraplex. // Structure. 1993. Vol. 1. P. 263-282.

103. Bugaut A., Balasubramanian S. A sequence-independent study of the influence of short loop lengths on the stability and topology of intramolecular DNA G-quadruplexes. // Biochemistry 2008. Vol. 47. P. 689-697.

104. Kelley S., Boroda S., Musier-Forsyth K., Kankia B.I. HIV-integrase aptamer folds into a parallel quadruplex: A thermodynamic study. // Biophys. Chem. 2011. Vol. 155. P. 82-88.

105. Mergny J.-L., Lacroix L. Analysis of thermal melting curves. // Oligonucleotides 2003. Vol. 13. P. 515-537.

106. Mergny J.L., Phan A.T., Lacroix L. Following G-quartet formation by UV-spectroscopy. // FEBS Lett. 1998. V. 435. P. 74-78.

107. Hazel P., Huppert J., Balasubramanian S., Neidle S. Loop-length-dependent folding of G-quadruplexes. // J. Am. Chem. Soc. 2004. Vol. 126. P. 1640516415.

108. Cheng M., Cheng Y., Hao J., Jia G., Zhou J., Mergny J.L., Li C. Loop permutation affects the topology and stability of G-quadruplexes. // Nucleic Acids Res. 2018. Vol. 46. P. 9264-9275.

109. Lou X., Egli M., Yang X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. // Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2016. Vol. 67, 7-25.

110. Plach M., Schubert T. Biophysical Characterization of Aptamer-Target Interactions. // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2019. Vol. 174. P. 1-15.

111. Zavyalova E., Turashev A., Novoseltseva A., Legatova V., Antipova O., Savchenko E., Balk S., Golovin A., Pavlova G., Kopylov A. Pyrene-Modified DNA Aptamers with High Affinity to Wild-Type EGFR and EGFRvIII. // Nucleic Acid Ther. 2020. Vol. 30. P. 175-187.

112. Zavyalova E.G., Legatova V.A., Alieva R.S., et al. Putative mechanisms underlying high inhibitory activities of bimodular DNA aptamers to thrombin. // Biomolecules. 2019. Vol. 9. P. 41

113. Dolot R., Lam C.H., Sierant M., et al. Crystal structures of thrombin in complex with chemically modified thrombin DNA aptamers reveal the origins of enhanced affinity. // Nucleic Acids Res. 2018. Vol. 46. P. 4819-4830.

114. Dereeper A., Guignon V., Blanc G., et al. Phylogeny.fr: Robust phylogenetic analysis for the non-specialist. // Nucleic Acids Res. 2008. Vol. 36. P. W465-W469.

115. Zavyalova E., Kopylov A. Energy Transfer as A Driving Force in Nucleic AcidProtem Interactions. // Molecules. 2019. Vol. 24. P. 1443.

116. Di Bucchianico A. Coefficient of determination (R 2). // In Encyclopedia of Statistics in Quality and Reliability. New York, NY, USA: John Wiley & Sons, Ltd., 2008. - p. 1.

117. Benjamin D.J., Berger J.O. Three recommendations for improving the use of p-values. // Am. Stat. 2019. Vol. 73. P. 186-191.

118. Magbanua E., Zivkovic T., Hansen B., et al. d(GGGT) 4 and r(GGGU) 4 are both HIV-1 inhibitors and interleukin-6 receptor aptamers. // RNA Biol. 2013. Vol. 10. P. 216-227.

119. Jing N., De Clercq E., Rando R.F., et al. Stability-activity relationships of a family of G-tetrad forming oligonucleotides as potent HIV inhibitors. A basis for anti-HIV drug design. // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 3421-3430.

120. Jing N., Li Y., Xu X., Sha W., Li P., Feng L., Tweardy D.J. Targeting Stat3 with G-quartet oligodeoxynucleotides in human cancer cells. // DNA Cell Biol. 2003. Vol. 22. P. 685-696.

121. Ambrus A., Chen D., Dai J., Bialis T., Jones R.A., Yang D. Human telomeric sequence forms a hybrid-type intramolecular G-quadruplex structure with mixed parallel/antiparallel strands in potassium solution. // Nucleic Acids Res. 2006. Vol. 34. P. 2723-2735.

122. Dai J., Carver M., Yang D. Polymorphism of human telomeric quadruplex structures. // Biochimie. 2008. Vol. 90. P. 1172-83.

123. Bing T., Zheng W., Zhang X., et al. Triplex-quadruplex structural scaffold: a new binding structure of aptamer. // Sci. Rep. 2017. Vol. 7. P. 5467.

124. Belleperche M., DeRosa M.C. pH-Control in Aptamer-Based Diagnostics, Therapeutics, and Analytical Applications. // Pharmaceuticals (Basel). 2018. Vol. 11. P. 80.

125. Li L., Jiang Y., Cui C., et al. Modulating Aptamer Specificity with pH-Responsive DNA Bonds. // J. Am. Chem. Soc. 2018. Vol. 140. P. 1333513339.

126. Dembska A. The analytical and biomedical potential of cytosine-rich oligonucleotides: A review. // Anal. Chim. Acta. 2016. Vol. 930. P. 1-12.

127. Naimuddin M., Kitamura K., Kinoshita Y., et al. Selection-by-function: efficient enrichment of cathepsin E inhibitors from a DNA library. // J. Mol. Recognit. 2007. Vol. 20. P. 58-68.

128. Yoshida C., Kuniwake A., Naimuddin M., Nishigaki K. Molecular design guided by a local map of sequence space: DNA aptamers that inhibit cathepsin E. // Oligonucleotides. 2008. Vol. 18. P. 1-8.

129. Mergny J.-L., Lacroix L., Han X., Leroy J.-L., Helene C. Intramolecular Folding of Pyrimidine Oligodeoxynucleotides into an i-DNA Motif // J. Am. Chem. Soc. 1995. Vol. 117. P. 8887-8898.

130. Benabou S., Ferreira R., Avino A., et al. Solution equilibria of cytosine- and guanine-rich sequences near the promoter region of the n-myc gene that contain stable hairpins within lateral loops // Biochim Biophys Acta. 2014. Vol. 1840. P. 41-52.

131. Lannes L., Halder S., Krishnan Y., Schwalbe H. Tuning the pH Response of i-Motif DNA Oligonucleotides. // Chembiochem. 2015. Vol. 16. P. 16471656.

132. Lycksell P.O., Gräslund A., Claesens F., McLaughlin L.W., Larsson U., Rigler R. Base pair opening dynamics of a 2-aminopurine substituted Eco RI restriction sequence and its unsubstituted counterpart in oligonucleotides. // Nucleic Acids Res. 1987. Vol. 15. P. 9011-9025.

133. Choi J., Kim S., Tachikawa T., Fujitsuka M., Majima T. pH-induced intramolecular folding dynamics of i-motif DNA. // J. Am. Chem. Soc. 2011. Vol. 133. P. 16146-16153.

134. McKim M., Buxton A., Johnson C., Metz A., Sheardy R.D. Loop Sequence Context Influences the Formation and Stability of the i-Motif for DNA Oligomers of Sequence (CCCXXX)4, where X = A and/or T, under Slightly Acidic Conditions. // J. Phys. Chem. B 2016. Vol. 120. P. 7652-7661.

135. Cheng M., Qiu D., Tamon L., et al. Thermal and pH Stabilities of i-DNA: Confronting in vitro Experiments with Models and In-Cell NMR Data. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2021. Vol. 60. P. 10286-10294.

136. Marky L.A., Breslauer K.J. Calculating thermodynamic data for transitions of any molecularity from equilibrium melting curves. // Biopolymers. 1987. Vol. 26. P. 1601-1620.

137. Kim B.G., Chalikian T.V. Thermodynamic linkage analysis of pH-induced folding and unfolding transitions of i-motifs. // Biophys Chem. 2016. Vol. 216. P. 19-22.

138. Tataurov A. V., You Y., Owczarzy R. Predicting ultraviolet spectrum of single stranded and double stranded deoxyribonucleic acids. // Biophys. Chem. 2008. V. 133. P. 66-70.

139. Kramberger P., Ciringer M., Strancar A., Peterka M. Evaluation of nanoparticle tracking analysis for total virus particle determination. // Virol. J. 2012. Vol. 9. P. 265.

140. Harris A., Cardone G., Winkler D.C., et al. Influenza virus pleiomorphy characterized by cryoelectron tomography. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006. Vol. 103. P. 19123-19127.

141. O'Shannessy D.J., Brigham-Burke M., Soneson K.K., Hensley P., Brooks I. Determination of rate and equilibrium binding constants for macromolecular interactions using surface plasmon resonance: use of nonlinear least squares analysis methods. // Anal. Biochem. 1993. Vol. 212. P. 457-468.

142. Козлов Л.В., Баталова Т.Н., Фаддеева Т.В., Панурина Р.Л. Иммуноферментный метод характеристики антител к полисахаридному антигену по их аффинности и эпитопной специфичности. // Биоорг. Химени 1997. Т. 23. С. 635-641.