Структура аптамерных ДНК/РНК - как основа для создания лекарственных препаратов и регуляторных элементов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, доктор биологических наук Спиридонова, Вера Алексеевна

• Спиридонова, Вера Алексеевна
• доктор биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации доктор биологических наук Спиридонова, Вера Алексеевна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Метод SELEX.

1.1.2. Укороченные аптамеры.

1.1.3. Сравнение свойств антител с аптамерами.

1.2. Аптамеры как инструменты в биохимических исследованиях.

1.3. Аптамеры к антибиотикам.

1.3.1. Аптамеры к тетрациклину.

1.3.2. Аптамеры к стрептомицину.

1.3.3. Аптамеры к хлорамфениколу.

1.3.4 Аптамеры к аминогликозидам.

1.4. Аптамеры как биосенсоры.

1.5.Свойства аптамеров, ингибирующих биологическую активность белков

1.6. Аптамеры к белкам, не связывающим нуклеиновые кислоты.

1.6.1. Аптамеры к тромбину.

1.6.2. Аптамеры к фактору Vila.

1.6.3. Аптамеры к фактору 1Ха.

1.6.4. Аптамеры к протеиназе вируса гепатита С - NS3 (HSV-NS3).

1.6.5. Аптамеры к эластазе нейтрофилов человека.

1.6.6. Аптамеры к VEGF.

1.6.7. Аптамеры к основному ростовому фактору фибробластов.

1.6.8. Аптамеры к ростовому фактору PDGF.

1.6.9. Аптамеры к интерферону у человека.

1.6.10. Аптамеры к ангиопоэтину-2.

1.6.11. Аптамеры к белкам вируса гриппа.

1.7. Аптамеры к белкам, связывающим нуклеиновые кислоты.

1.7.1. Аптамеры к Та1>белку.

1.7.2. Аптамеры к ШУ-1 Яеу (ревертаза).

1.7.3. Аптамеры к ШУ обратной транскриптазе.

1.7.4. Транскрипционный фактор Е2Р.

1.7.5 Аптамеры к фактору МБ-кВ.

1.8. Аптамеры к антителам, к иммуноглобулинам.

1.8.1. Аптамеры к антителу МА20 к инсулиновому рецептору.

1.8.2.Аптамеры к моноклональному антителу (МаЬ) к ацетилхолиновому рецептору.

1.8.3.Аптамеры к иммуноглобулину Е.

1.8.4.Аптамеры к цитотоксичному антигену Т4.

1.9.Аптамеры к адгезивным молекулам.

1.9.1 .Аптамеры к Р-Селектину.

1.9.2.Аптамеры к Ь-селектину.

1.10.Аптамеры к антигену РБМА.

1.11.Аптамеры к белкам комплемента С5 человека.

1.12.Аптамеры к липопротеинам (не-панкреатическая секреторная фосфолипаза А2 человека.

1.13.Аптамеры к прионовым белкам -РгР50.

1.14.Аптамеры к патогенам (к трипанозоме).

2. Результаты и обсуждение.

2.1. Компьютерная аннотация зоны контакта белка ТШБ7 с ТіЬ 168 рРНК в составе ТШЗОБ, компьютерное моделирование третичной структуры белка Есо87.

2.2. Изучения структуры и термодинамики природной системы, дифференциального узнавания различных РНК рибосомным белком

Б7 прокариот.

2.2.2. Создание суперпродуцентов рибосомных белков S7 из различных организмов: Escherichia coli (EcoS7), Thermus thermophilics (TthS7). Отработка методов сворачивания белковой молекулы.

2.2.3. Изучение комплексообразование рибосомных белков S7 из Escherichia coli (EcoS7) и Thermus thermophilics (TthS7) с фрагментами 16S pPHK Е. coli и делеционными фрагментами sir мРНК£. coli.

2.2.3.1. Взаимодействие фрагмента Ecol6S pPHK с белками EcoS7, TthS7.

2.2.3.2. Изучение влияния белков EcoS7 и TthS7 на структуру фрагмента Ecol6S pPHK.

2.2.3.3. Взаимодействие фрагмента EcoStr мРНК с белками EcoS7 и TthS7.

2.2.3.4. Изучение влияния белков EcoS7 и TthS7 на структуру фрагмента

EcoStr мРНК.

2.2.4. Делеционный анализ str мРНК Е. Coli.

2.2.5. Анализ связывания делеционных фрагментов межцистрона str мРНК

Е. coli с белками EcoS7 и TthS7.

2.2.6. Селекция аптамеров РНК на основе фрагмента EcoStr мРНК.

2.2. Создание аптамерных ДНК к тромбину, обладающих стабильной пространственной структурой и способностью связывать тромбин с высокой эффективностью и специфичностью in vitro. Оценка эффективности ингибирующего действия аптамеров на активность тромбина в реакциях фибринолиза и агрегации тромбоцитов в условиях in vitro.

2.2.1. Создание ДНК-аптамеров к тромбину.

2.2.2. Компьютерное моделирование структур ДНК-аптамеров.

2.2.3. Изучение ДНК-аптамеров методом кругового дихроизма.

2.2.4. Комплексы ДНК-аптамеров с тромбином.

2.2.5. Изучение взаимодействия аптамера RE31 с тромбином методом плазмонного резонанса (ППР).

2.2.6. Тромбин - ключевой белок свертывания крови.

2.2.7. Ингибирование процессов свертывания крови ДНК-аптамерами.

2.2.8. Влияние мутантного аптамера на процесс свертывания крови.

2.2.9. Влияние аптамеров на агрегацию тромбоцитов.

2.3.Создание модифицированных производных аптамеров. Оценка эффективности ингибирующего действия модифицированных аптамеров на активность тромбина и возможность подавления тромбообразования в модели in vivo.

2.3.1. Свойства модифицированных аптамеров.

2.3.2. Действие модифицированных аптамеров на тромбининдуцированную агрегацию тромбоцитов.

2.3.3.Изучение влияния ДНК-аптамеров на коагуляционную способность плазмы крови на животных моделях.

2.3.4. Оценка ингибирующего действия модифицированных аптамеров на модели артериального тромбоза in vivo

2.4. Создание антидота к аптамерной ДНК. Изучение конкурентного взаимодействия аптамера к тромбину с антидотом в нуклеопротеидном комплексе аптамер-тромбин.

2.4.1. Структура антидота.

2.4.2. Изучение конкурентного взаимодействия аптамера к тромбину с антидотом в нуклеопротеидном комплексе аптамер-тромбин.

3. Материалы и методы.

3.1. Программы и схемы, использованные при компьютерном моделировании рибосомного белка EcoS7.

3.2. Клонирование рибосомных белков.

3.2.1. Клонирование TthS7.

3.2.2. Клонирование EcoS7.

3.3. Подготовка компетентных клеток и трансформация рекомбинантными плазмидами.

3.4. Определение наличия вставки в векторе.

3.5. Выделение рибосомных белков EcoS7 TthS7.

3.6. Синтез РНК in vitro с фрагментов ДНК, полученных ПЦР.

3.7. Выделение фрагмента 16S рРНЕС и фрагментов EcoStr мРНК Е. coli.

3.8. Работа с комбинаторной библиотекой РНК.

3.9. Комплексообразование РНК с рибосомным белком.

3.10. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов РНК через секвенирование ДНК по Сэнгеру.

3.11. Реакции радиоактивного мечения олигодезоксирибонуклеотидов.

3.12. Химическая модификация РНК.

3.13. Картирование модификаций и расщепления РНК, а также контрольное секвенирование.

3.14. УФ - индуцируемое «сшивание» комплекса РНК с белком.

3.15. Иммобилизация тромбина на CNBr-активированной сефарозе.

3.16. Работа с комбинаторной библиотекой ДНК.

3.17. Анализ фрагментов ДНК электрофорезом в агарозном геле.

3.18. Разделение цепей ДНК с помощью стрептавидиновых частиц.

3.19. Селектирование алтамеров к тромбину первым способом.

3.20. Селекция аптамеров к тромбину вторым способом.

3.21. Определение степени комплексообразования ДНК с тромбином.

3.22. Рестрикция нуклеиновых кислот.

3.23. Лигирование обогащенной фракции аптамеров с плазмидными ДНК.

3.24. Секвенирование аптамеров в составе плазмид.

3.25. Дизайн и структура базовых ДНК-аптамеров, взаимодействующих с тромбином.

3.26. Аптамеры к тромбину.

3.27. Исследования структур аптамеров с помощью метода кругового дихроизма.

3.28. Работа с тромбином.

3.29. Методика исследования связывания аптамеров с тромбином.

3.30. Иммобилизация аптамера RE31.

3.31 Модель артериального тромбоза у животных.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура аптамерных ДНК/РНК - как основа для создания лекарственных препаратов и регуляторных элементов»

Прошедшее десятилетие ознаменовалось существенным прорывом в использовании фундаментальных знаний о ДНК в прикладных работах. Прошло около 20 лет с того момента, как появились первые публикации, в которых был описан новый метод селекции нуклеиновых кислот SELEX, и появился термин «аптамер». Метод SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) был разработан одновременно и независимо друг от друга в лабораториях Шостака и Голда (США) в 1990 году [1, 2]. Аптамеры представляют собой небольшие однотяжевые молекулы ДНК и РНК длиной 40100 нуклеотидов с достаточно сложной трехмерной структурой.

Именно сложная структура фрагментов нуклеиновых кислот обеспечивает способность аптамеров специфически связывать различные молекулы, в том числе и белки. Данный метод иррационального дизайна базируется на одновременном использовании такого огромного количества разнообразных мутантов (более 1018), которое трудно сопоставить с набором молекул, имеющих точечные мутации, при рациональном дизайне. Селекцию, проводимую с помощью метода SELEX, можно сравнить со сложнейшим процессом биосинтеза и отбора белковых «узнающих» элементов - антител, который природа создавала тысячелетиями. Получаемые аптамеры обладают высоким сродством к белкам-мишеням, сравнимым со сродством природных комплексов антиген-антитело.

На сегодняшний день имеется более 100000 ссылок на статьи, в которых используется термин аптамер. Это подчеркивает большой интерес к методу, к его возможностям, к получению таких аптамеров, которые можно использовать, как медицинские препараты, в тест-системах, как биосенсоры.

В 1990 году селекция in vitro была использована в работах Голда, Шостака, [1, 2], которые идентифицировали уникальные РНК структуры с новыми свойствами с измененной функциональностью: связывание с молекулами-мишенями, с энзиматической активностью. В публикации в журнале Nature Эллингтон и Шостак ввели понятие «аптамеры» [2]. В тоже время Голд [1] опубликовал работу о получении РНК с помощью процесса, названного SELEX.

В последующие годы аптамеры были получены для огромного количества мишеней: пептидов, малых молекул, гормонов и, конечно, белков. В качестве мишеней выбирались такие белки, которые играли центральную роль в развитии ряда болезней, в различных патологических процессах. Это создало прикладное направление для использования аптамеров в терапии.

На сегодняшний день показано, что класс аптамеров многолик. Параллельно с лекарственными средствами стало развиваться исследование мотивов РНК, названных «рибосвитчами». Эти природные «рибосвитчи» встроены в мРНК и под действием разных молекул могут влиять на экспрессию генов, т.е. могут служить регуляторными элементами, контролируя экспрессию генов как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции.

В настоящее время идея, согласно которой аптамеры могут регулировать (ингибировать) активность белков, сейчас перешла из стадии фундаментальных разработок в плоскость решения практических задач.

Целью данной работы было создание ДНК/РНК аптамеров, изучение их структуры с помощью компьютерного моделирования, спектральных методов. Исследование процессов комплексообразования аптамеров с белками с использованием различных видов хроматографии, электрофорезов, поверхностного плазмонного резонанса, методов меченых атомов.

С одной стороны, существуют белки, которые образуют природные специфические нуклеопротеидные комплексы, с другой стороны, огромное количество белков не имеют природных комплексов с НК.

Было поставлено две задачи: во-первых, исследовать структуру и термодинамику природной системы дифференциального узнавания рибосомным белком 87 различных РНК, и с помощью метода 8ЕЬЕХ сконструировать РНК-аптамеры к нему. Во-вторых, создать и изучить структуру искусственной системы аптамер-тромбин. Как известно, тромбин не взаимодействует с нуклеиновой кислотой.

В практическом аспекте целью работы было создание ДНК-аптамеров, ингибирующих тромбин, что может в дальнейшем стать основой для создания лекарственных антитромботических препаратов.

1. Обзор литературы «Селекция in vitro с целью получения функциональных ДНК/РНК аптамеров»

Одной из актуальнейших проблем в молекулярной биологии является изучение специфичности взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами (НК), которые регулируют жизненно важные процессы в клетке. В клетке ДНК/РНК-белковые взаимодействия служат основой её жизнедеятельности: репликация генома, экспрессия генов, транскрипция (синтез РНК), трансляция (синтез белка). Нуклеиновые кислоты обладают различными функциями, включая сохранение информации, узнавание различных белков, лигандов, катализ. Хорошо известно, что информация может сохраняться в последовательности нуклеотидов и прочитываться как последовательность азотистых оснований.

Согласно общепринятому мнению, за регуляцию всех метаболических и катаболических путей отвечают белки. В последнее десятилетие появились примеры обратного представления: управлять экспрессией и функцией белков можно с помощью НК, создавая генно-инженерные конструкции, или структуры типа триплексов, или антисенсовые последовательности, либо рибозимы, либо аптамеры. Аптамеры - небольшие молекулы РНК/ДНК, способные взаимодействовать с различными молекулами — мишенями. Они складываются в сложные трехмерные структуры, которые наделяют молекулы РНК/ДНК различными функциями, включая способность катализировать ряд химических реакций. Процесс селекции in vitro позволяет выделить из большого разнообразного набора молекул, называемого комбинаторной библиотекой, те последовательности НК, которые имеют высокое сродство к своей мишени.

Селекция in vitro — это экспериментальный метод, использующий пространственную структуру олигонуклеотида как объект исследования. Гибкость, которой обладают фрагменты однотяжевой РНК/ДНК, позволяет создавать набор шпилек, петель, выпячиваний, которые все вместе создают сложные трехмерные структуры, наделяющие молекулы новыми свойствами. Достаточно 25-30 нуклеотидов, чтобы сложить несколько отличных друг от друга вторичных структур. Например, молекула тРНК длиной 74 нуклеотида может быть представлена 1043 различными вариантами молекул [3]. Именно сложная структура обеспечивает способность аптамеров специфически связывать различные молекулы, в том числе и белки.

Комбинаторика или комбинаторный подход получил свое развитие как научное направление в математике, изучающей дискретные объекты, множества, сочетания, перестановки. В настоящее время комбинаторика широко используется, как составляющая любого исследования. Математический термин «комбинаторный» стал теперь и химико-биологическим. Использование основ комбинаторной химии нуклеиновых кислот позволило разработать метод иррационального дизайна полинуклеотидов (метод SELEX) для исследования проблем нуклеиново-белкового узнавания.

1.1. Метод SELEX

Термины: алтамер, SELEX появились около 20 лет назад и сразу приковали к себе внимание, т.к. давали возможность изучать фундаментальные процессы нуклеиново-белкового взаимодействия как для белков, образующих комплексы с нуклеиновыми кислотами, так и для белков, не имеющих природных комплексов с ДНК/РНК, путем одновременного введения большого числа мутаций в одном эксперименте. Эту селекцию in vitro, авторы назвали «эволюцией в пробирке» [1]. Метод SELEX предоставляет возможность подобрать комплементарного партнера, используя комбинаторную библиотеку НК.

Селекция начинается с генерации большой библиотеки НК с фиксированными 5'- и 3Л-концами и вырожденным районом длиной 30-60 нуклеотидов (рис.1). Такая библиотека содержит 1014—1015 вариантов молекул, которые сворачиваются в сложные трехмерные структуры. Химический синтез библиотеки проводят на синтезаторах в гетерогенной фазе, где первый нуклеотид цепочки прикреплен к стенке реактора. На начальных ступенях синтеза в реактор подаются однотипные модифицированные нуклеотидтрифосфаты (синтоны), которые четко направляют синтез по заданной программе. Когда синтез приближается к району, где должна присутствовать рандомизированная последовательность, то в реактор подаются сразу все четыре вида синтонов, и растущие монотонные цепочки нуклеотидов начинают приобретать черты многообразия. Если рандомизировать одну нуклеотидную позицию, то вариантов будет четыре, если рандомизировать два последовательных нуклеотида, разнообразие молекул возрастает до 16 вариантов, если три нуклеотида, то возникнет 64 варианта и т.д. При рандомизации района в 30 нуклеотидов число вариантов составляет 1017. Такая библиотека НК молекул, которые сворачиваются в сложные трехмерные структуры, инкубируется с белком.

Комбинаторную библиотеку РНК можно получить с помощью Т7РНК-полимеразы, вводя для неё промотор в константный район. Полученную РНК инкубируют с белком, и те молекулы РНК, которые связались с белковой мишенью, отделяют от несвязавшихся (рис.2). Связавшиеся РНК молекулы далее отделяют от белка и амплифицируют с помощью обратной транскриптазы и ПЦР, чтобы получить новый пул молекул с увеличенным сродством. Процесс повторяется обычно 10-15 раз до тех пор, пока максимальное количество аптамеров, имеющих сродство к мишени, в обогащенной фракции не будет ощутимо заметным. Далее аптамеры клонируют, как правило, в бактериальный вектор и секвенируют.

КОМБИНАТОРНАЯ БИБЛИОТЕКА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ константная часть вырожденный район константная часть

ДНК вССААТССА! ССАСАТСТ АСЬ'ААТТО I ГСАСТССАСАСТТОАСиААиС! Г

ИНК сасААио(ЗАиа^АСАисидссААиис иисАсиосАСАсиивдеоАдссии

- любой из А, С, С, Т (и)

Количество вариантов п

Длина вырожденной Количество вариантов последовательности

4 10

10 102

20 106

30 1017

40 ю23

60 ю37

120 ю72

Рис.1. Комбинаторная библиотека нуклеиновых кислот. Красным цветом выделен район, в котором буквой п обозначены последовательности случайных нуклеотидов. Любую позицию может занимать одно из азотистых оснований в, А, Т, С. Белым цветом отмечены нуклеотиды постоянного состава. Количество вариантов рассчитывают по формуле 4П, где п -длина вырожденной последовательности.

Полученные семейства аптамеров к данной мишени исследуют, сравнивая последовательности, складывая вторичные структуры. Аптамеры создают сложные структуры в виде стеблей с петлями, с карманами, используя необычные неканонические пары, искажения остова или повороты.

Для ДНК селекция начинается с комбинаторной библиотеки ДНК, у которой рандомизированный район фланкирован фиксированными последовательностями на 5'- и 3Л- концах. Для получения однотяжевых молекул используют либо асимметричный ПЦР, либо один из праймеров несет биотиновую метку, с помощью которой отделяют одну цепь ДНК от другой на колонках со стрептавидином.

Изучая семейства аптамеров, Голд с сотр. [4] отмечают существование оснований, которые однотипны и которые обеспечивают консервативную вторичную структуру доменов. Некоторые основания абсолютно консервативны. Последние очень часто встречаются у нуклеотидов в однотяжевой форме или в неканонической паре. Они непосредственно взаимодействуют с мишенью. Заранее предсказать детали формы этих участков (или большие поверхности, которые взаимодействуют с белком) очень трудно. Области олигонуклеотидов с наиболее характерными чертами всегда располагаются при областях связывания с белком и всегда используют, как правило, изгибы неканонических взаимодействий [4].

Сродство аптамеров к белкам, не имеющих природных комплексов с НК, пожалуй, не слабее, чем сродство аптамеров к белкам, связывающих НК [4].

Ключевой стадией метода 8ЕЬЕХ является отбор целевых аптамеров, способных связываться с молекулой-мишенью (рис.2). Функциональные целевые молекулы составляют лишь незначительную часть исходной

9 12 комбинаторной библиотеки: 1 аптамер приходится на 10 - 10 молекул.

ПЦР Амплификация * *

Исходная библиотека

ДНК

ДНК или транскрипция для РНК

Повторное связывание

Связывание с иммобилизованным тромбином

Ф*

Разделение цепей для ДНК или транскрипция для РНК знкзн Я

Жесткая элюция связавшихся молекул

ПЦР

Амплификация

Иммобилизация на С№г-сефарозе

Несвязавшаяся ДНК или РНК

Обогащенная фракция - Двутяжевая ДНК

- Однотяжееая ДНК или РНК

Рис.2. Схема метода БЕЬЕХ для получения ДНК- или РНК-аптамеров. Исходную рандомизированную библиотеку ДНК переводят в о дно цепочечную ДНК (оцДНК) и вводят в реакцию связывания с белком, предварительно иммобилизованным на колонке. РНК получают транскрипцией из исходной библиотеки, в структуру которой включена последовательность промотора для фаговой Т7 РНК полимеразы.

Селекция аптамеров основана на отличительных физических (или функциональных) свойствах комплекса аптамер - мишень. Большинство методов отбора аптамеров основано на возможности их физического отделения в виде комплекса с молекулой-мишеныо от основной фракции молекул библиотеки. Обычно при проведении селекции используются либо метод аффинной хроматографии, либо фильтрацию растворов комплекса на нитроцеллюлозных мембранах, либо различные виды электрофорезов [5-7].

При использовании аффинной хроматографии мишень-лиганд, как правило, иммобилизуют на полимерном носителе. Целевые олигонуклеотиды сорбируются на колонке с носителем и, таким образом, отделяются от исходных не связавшихся молекул. В качестве полимерного носителя чаще всего используется агароза и ее производные.

При использовании нитроцеллюлозных фильтров комплекс аптамера с белком сорбируется на мембране,- а несвязавшиеся аптамеры проходят, не задерживаясь. В методе гель-электрофореза используется различие в подвижности в полиакриламидном геле молекул исходной библиотеки и ее комплексов с мишенью. Так как РНК/ДНК аптамеры мечены радиоактивным фосфором, то поведение аптамеров контролируется методом радиоактивных индикаторов. В результате нескольких циклов селекции получается обогащенная фракция аптамеров, которая связывается с молекулой-мишеныо на несколько порядков сильнее, чем исходная библиотека (сравнивают кажущиеся константы диссоциации полученных комплексов).

На сегодняшний день опубликовано много обзоров с детальным описанием всех этапов данного метода [5-16].

Ряд авторов делали попытки исследовать, может ли новая функция быть получена из предсуществующей структуры [17]. Для этого использовали дизайн комбинаторных библиотек, в которые вводили определенные

Ар(юг ЛшгМоп сопйаш (К^ 10 цИ 300 «М 1пМ

-► I

I ' I

Рис.3. По оси абсцисс показано увеличение информационной сложности. На рисунке представлена вторичная структура каждой серии ГТФ-связывающих аптамеров. Они расположены согласно уменьшению констант диссоциации. Двигаясь слева направо, аптамеры приобретают все более сложные вторичные структуры. Звездочками указаны те элементы структуры, которые исходно были включены в комбинаторную библиотеку [17]. стабильные элементы структур: стебли, четырехнуклеотидные петли, псевдоузлы и шпильки, с целью повысить шанс получения структур с активной функцией.

В одном удачном примере была сконструирована библиотека из 2,5 х1014 молекул с внутренним стеблем и стабильной четырехнуклеотидной петлей, фланкированной 26-ю полностью случайными основаниями [17] Частично сконструированная библиотека была смешана с библиотекой, имеющей полноразмерный район со случайной последовательностью 2,5 х1014 молекул той же длины. Смесь библиотек была подвергнута селекции для высокоаффинного связывания с молекулами СГР . Было получено 11 различных семейств аптамеров с константами диссоциации комплексов с ОТР, которые варьировали от 8 мкМ до 9 нМ. Все они были выделены, охарактеризованы и показано, что с усложнением структуры увеличивается сродство к ОТР (рис. 3) [17].

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Спиридонова, Вера Алексеевна

Выводы

1. Методами компьютерного анализа и моделирования in silico показано, что два белка-аналога EcoS7 и TthS7 по первичной структуре идентичны на 52 %, а в зоне РНК-белковых контактов в 30S субчастице — на 83 %. Получены гомологичные и гетерологичные комплексы EcoS7, TthS7 с фрагментом 16S рРНК с использованием белков EcoS7, TthS7, выделенных из суперпродуцентов E.coli. Определены константы диссоциации комплексов, что позволило сделать вывод о консервативности РНК-связывающего центра белков.

2. Делеционный анализ межцистронного фрагмента S12-S7 str мРНК показал, что для взаимодействия как с белком EcoS7, так и с TthS7 необходим фрагмент РНК около 84 нуклеотидов длиной, заключенный между терминирующим кодоном цистрона S12 и инициирующим кодоном цистрона S7.

3. Используя комбинаторную библиотеку на основе межцистронного регуляторного участка Ecostr мРНК с рандомизированной пентануклеотидной последовательностью, создан фрагмент РНК, связывающий белок TthS7, который в начале эксперимента не обладал сродством к данному белку. Тем самым показана принципиальная возможность создания регуляторных участков трансляции рибосом в клетке.

4. Созданы ДНК-аптамеры к тромбину, которые обладали G-квадруплексной пространственной структурой и ингибировали прокоагулянтную активность фермента Изучена их структура методами молекулярной динамики и кругового дихроизма. Подтверждено наличие структуры «кресла» как для 15ТВА, так и для 31 ТВ A, SGK52, SGK53, RSG54, RSG55, RE31 и ST43. Показано, что в присутствии комплементарной последовательности структура «кресла» раскрывается и переходит в двухтяжевую структуру.

5. С помощью электрофореза в неденатурирующих условиях показано образование комплексов аптамерных ДНК с тромбином in vitro, рассчитаны кажущиеся константы диссоциации, величины которых свидетельствуют о высоком сродстве данных аптамеров к тромбину.

6. Исследовано влияние 15ТВА и 31 ТВ A, RE31, ST43, SG52, SGK53, RGS54, RGS55 и их модифицированных производных на активность тромбина. Показано, что при добавлении к плазме крови человека аптамеры вызывали зависимое от дозы удлинение тромбинового времени, протромбинового времени и активированного частичного тромбопластинового времени. Это свидетельствует о влиянии аптамеров на процессы свертывания крови и тромбообразования.

7. Показано, что аптамеры ингибируют не только гидролиз фибриногена, но и активацию PAR-1 рецептора тромбоцитов. Это приводит к ингибированию процесса агрегации тромбоцитов человека и дополнительно замедляет процессы свертывания крови. В то же время аптамеры не влияют на амидолитическую активность тромбина.

8. Таким образом, исследуемые антитромбиновые ДНК-аптамеры, не влияя на активный центр тромбина, способны эффективно подавлять его две ключевые реакции - образование фибрина и стимуляцию агрегации тромбоцитов. Испытания на животных подтвердили антитромбиновую активность ДНК-аптамеров в процессах свертывания крови.

Получены патенты: Спиридонова В.А., Головин A.B., Копылов A.M., Добровольский А.Б., Мазуров A.B. «ДНК аптамеры - ингибиторы тромбина», патент № 2401306, дата приоритета 17 декабря 2008 г и

Спиридонова В.А., Головин A.B., Копылов A.M., Добровольский А.Б., Мазуров A.B. «Модифицированные ДНК аптамеры, ингибирующие активность тромбина», патент РФ № 2410432, дата приоритета 23 ноября 2009 г.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Спиридонова, Вера Алексеевна, 2011 год

1. Tuerk С., GoldL. Systematic evolution ofligands by exponential enrichment RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase // Science. 1990. V. 249. № 4968. P. 505-510.

2. Ellington A.D., SzoztakJ. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands //Nature. 1990. V. 346. № 6287. P. 818-822.

3. Spiegelman S. An approach to the experimental analysis of precellular evolution // Q. Rev. Biophys. 1971. V. 4. № 2. P. 213-253.

4. GoldL., Brown D., He Y., Shtatland Т., Singer В., Wu Y. From oligonucleotide shapes to genomic SELEX: Novel biological regulatory loops // Proc. Natl. Acad. Sei USA. 1997. V. 94. №1.P. 59-64.

5. Wilson D.S., SzostakJ.W. In vitro selection of functional nucleic acids //

6. Annu.Rev.Biochem. 1999. V. 68. P. 611-647.

7. FamulokM., HartigJ.S., Mayer G. Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy // Chem.Rev. 2007. V. 107. № 9. P. 3715-3743.

8. Gold L., Polisky В., Uhlenbeck O., Yarns M. Diversity of oligonucleotide functions //Annu.Rev.Biochem. 1995. V. 64. P. 763-797.

9. Nimjee S.M., Rusconi C.P., Harriington R.A., Sullenger B.Ä. The Potential of aptamers as anticoagulants // Trends Cardiovasc Med. 2005. V. 15. № 1. P.41-45.

10. Brody E.N., GoldL. Aptamers as therapeutic and diagnostic agents // J Biotechnol. 2000. V. 74. № 1. P. 5-13.

11. Shamah S.M., HealyJ.M., CloadS.T. Complex target SELEX//Acc. Chem, Res. 2008. V. 41. № 1. P. 130-138.

12. Копылов A.M., СпиридоноваB.A. Применение аптамеров в медицинской диагностике и терапии // Молекулярная биология. 2000. V. 34. № 6. С. 1097-1113;

13. Кулъбачинский А.В. Методы отбора аптамеров к белковым мишеням // Успехи биологической химии. 2006. Т. 46. С. 193-224.

14. Радъко СЛ., Рахметова С.Ю., Бодоев Н.В., Арчаков А.И. Аптамеры как перспективные аффинные реагенты для клинической протеомики // Биомедицинская химия. 2007. Т. 53. № 1. С. 5-24.

15. Спиридонова В. А. Молекулярные узнающие элементы — ДНК/РНК-аптамеры к белкам // Биомедицинская химия. 2010. Т. 56. № 6. С. 639-656.

16. Davis J.D., Szostak J. W. Isolation of high affinity GTP aptamers from partially-structured RNA libraries // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 2002. V. 99. № 18. P. 11616-11621.

17. Jayasena S.D. Aptamers: An Emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics // Clinical Chemistry. 1999. V. 45. № 9. 1628-1650.

18. Zhou J., Soontornworajit В., Snipes M.P., Wang Y. Development of a novel pretargeting system with bifunctional nucleic acid molecules // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 386. № 3. P. 521-525.

19. Green L.S., JellinekD., JenisonR, OstmanA., Heldin C.H., JanjicN. Inhibitory DNA ligands to platelet-derived growth factor B-chain // Biochemistry. 1996. V. 35. № 45. P. 14413-14424. 25.Sayer N.M., CubinM., RhieA., Bullock M„ Tahiri-Alaoui A., James W.

20. White RR, Sullenger B.A., Rusconi C.P. Developing aptamers into therapeutics // J. Clin. Invest. 2000. V. 106. № 8. P. 929-934;

21. Doudna J.A., Cech T.R, Sullenger B.A. Selection of an RNA molecule that mimics a major autoantigenic epitope of human insulin receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. № 6. P. 2355-2359;

22. Rusconi C.P., Scardino E., Layzer J., Pitoc G.A., Ortel T.L., Monroe D., Sullenger B.A. RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor IXa//Nature. 2002. V. 419. № 6902. P. 90-94;

23. Rimmele M. Nucleic acid aptamers as tools and drugs: recent developments // Chembiochem. 2003. V. 4. № 10. P. 963-971;

24. Kimoto M., Shirouzu M., Mizutani S., Koide IL, Kaziro Y., Hirao I., Yokoyama S. Anti-(Raf-l) RNA aptamers that inhibit Ras-induced Raf-1 activation // Eur J.Biochem. 2002. V. 269 № 2. P. 697-704;

25. Shi H., Hoffmann B.E., Lis J.T. RNA aptamers as effective protein antagonists in a multicellular organism // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1999. 96. № 18. P. 10033-10038;

26. Golovina A.Y., Bogdanov A.A., Dontsova O.A., Sergiev P.V., Purification of 39S ribosomal subunit by streptavidin affinity chromatography // Biochimie. 2010. V. 92. № 7. P. 914-917;

27. Famulok M., Blind M., Mayer G. Intramers as promising new tools in functional proteomics // Chem.Biol. 2001. V. 8. № 10. P. 931-939;

28. Cassiday L.A., Maher L.J. 3rd Yeast genetic selections to optimize RNA decoys for transcription factor NF-kappa B // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. № 7. P. 3930-3935;

29. Martell R.E., Nevins J.R., Sullenger B.A. Optimizing aptamer activity for gene therapy applications using expression cassette SELEX // Mol. Ther. 2002. V. 6. № 1. P. 30-34;

30. AA.Kreneva R.A., Perumov D.A. Genetic mapping of regulatory mutations of Bacillus subtilis riboflavin operon // Mol. Gen. Genet. 1990. V. 222. № 2-3. 467-469;

31. Nudler E., Mironov A.S. The riboswitch control of bacterial metabolism // Trends Biochem. Sci. 2004. V. 29. № 1. P. 11-17;

32. A6.Gelfand M.S., Mironov A.S., Jomantas J., Kozlov Y.I., Perumov D.A. A conserved RNA structure element involved in the regulation of bacterial riboflavin synthesis genes // Trends Genet. 1999. V. 15. № 4. P. 439-442;

33. Al.Nou X., Kadner R.J. Adenosylcobalamin inhibits ribosome binding to htuB RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 13. P. 7190-7195;

34. St or mo G.D., Ji Y. Do mRNA act as direct sensors of small molecules to control their expression? II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. № 17. P. 9465-9467;

35. Werstuck G., Green M.R Controlling gene expression in living cells through small molecule-RNA interactions II Science. !998. V. 282. № 5387. P. 296-298;

36. Nahvi A., Sudarsan N., Ebert M.S., Zou X., Brown K.L., Breaker R.R. Genetic control by a metabolite binding mRNA // Chem. Biol. 2002. V. 9. № 9. P. 1043-1049;

37. Winkler W., Nahvi A., Breaker R.R. Thiamine derivatives bind messenger RNAs directly to regulate bacterial gene expression // Nature. 2002. V. 419. № 6910. P. 952-956;

38. Anokhina M.M., Barta A., Nierhans K.H., Spiridonova V.A., Kopylov A.M., Mapping of the second tetracycline binding site on the ribosomal small subunit of E.coli //Nucleic acids Res. 2004. V. 32. № 8. P. 2594-2597;

39. Berens C., Thain A., Schroeder R. A tetracycline-binding RNA aptamer // Bioorg.Med.Chem. 2001. V. 9. № 10. P. 2549-2556;

40. Suess B., Hanson S., Berens C., Fink B., Schroeder R., Hillen W., Conditional gene expression by controlling translation with tetracycline-binding aptamers // Nucleic acids Res. 2003. V. 31. № 7. P. 1853-1858;

41. Davies J., Gorini L., Davis B.D., Misreading of RNA codewords induced by aminoglycoside antibiotics // Mol. Pharmacol. 1965. V. 1. № 1. P. 93-106;

42. Tereshko V., Skripkin E., Patel D.J. Encapsulating streptomycin within a small 40-mer RNA // Chem.Biol. 2003. V. 10. № 2. P.175-185;

43. Burke D.H., Hoffmann D.C., Bown A., Hansen M., Pardi A., Gold L. RNA aptamers to the peptidyl transferase inhibitor chloramphenicol // Chem.Biol. 1997. V. 4. № 11. P. 833-843;

44. Moazed D., Noller H.F. Interaction of antibiotics with functional sites in 16S ribosomal RNA // Nature. 1987. V. 327. № 6121. P. 389-394;

45. Ramakrishman V., Ribosome structure and the mechanism of translation // Cell. 2002. V. 108 № 4. P. 557-572;

46. Q.Wang Y., Rando RR, Specific binding of aminoglycoside antibiotics to RNA //

47. Hartmuth K., Vornlocker H.P., Luhrmann R. Tobramycin affinity tag purification of spliceosomes // Methods Mol. Biol. 2004. V. 257. P. 47-64;

48. Tombelli S., Minunni M., Luzi E., Mascini M. Aptamer-based biosensors for the detection of HIV-1 Tat protein // Bioelectrochemistiy. 2005. V. 67. № 2. P. 135-141;

49. Ferreira G.N., da-Silva A.C., Tomé B. Acoustic wave biosensors: physical models and biological applications of quartz crystal microbalance // Trends Biotechnol. 2009. V. 27. № 12. P. 689-697;

50. Hianik T., Ostatnâ V., Zajacovâ Z, Stoikova E., Evtugyn G. Detection of aptamer-protein interactions using QCM and electrochemical indicator methods // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005. V. 15. № 2. P. 291-295;

51. Yao C., Qi Y, Zhao Y., Xiang Y., Chen Q., Fu W. Aptamer-based piezoelectric quartz crystal microbalance biosensor array for the quantification of IgE // Biosens. Bioelectron. 2009. V. 24. № 8. P. 2499-2503;

52. Treitz G., Gronewold T.M., Quandt E., Zabe-Kuhn M. Combination of a SAW-biosensor with MALDI mass spectrometric analysis // Biosens. Bioelectron. 2008. V. 23. № 10. P. 1496-1502;,

53. Li D., Song S., Fan C. Target-responsive structural switching for nucleic acid-based sensors // Acc. Chem. Res. 2010. V. 43. № 5. P. 631-641;

54. ST.Kara P., de la Escosura-Muniz A., Maltez-da Costa M, Guix M., Ozsoz M., Merkoci A. Aptamers based electrochemical biosensor for protein detection using carbon nanotubes platforms // Biosens Bioelectron. 2010. V. 26. № 4. P. 1715-1718;

55. SS.Tombelli S., Mascini M. Aptamers biosensors for pharmaceutical compounds // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2010. V. 13. № 7. P. 641-649;

56. Z/ B., Dong S., Wang E. Homogeneous analysis: label-free and substrate-free aptasensors // Chem. Asian. J. 2010. V. 5. № 6. P. 1262-1272;

57. Eyetech study Group Anti-vascular endothelial growth factor therapy for subfoveal choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration: phase II study results // Ophthalmology. 2003. V. 110. № 5. P. 879-881;

58. White R., Rusconi C., Scardino E, Wolberg A., Lawson J., Hoffman M., Sullenger B.A. Generation of species cross-reactive aptamers using "toggle" SELEX // Mol. Ther. 2001. V. 4. № 6. P. 567-573;

59. Rusconi C.P., Roberts J.D., Pitoc G.A., Nimjee S.M., White R.R., Quick G.Jr., Scardino E., Fay W.P., Sullenger B.A. Antidote-mediated control of an anticoagulant aptamer in vivo // Nat Biotechnol. 2004. V. 22. № 11. P. 14231428;

60. Aurup II, Siebert A., Benseier F., Williams D., Eckstein F. Translation of 2'-modified mRNA in vitro and in vivo I I Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. № 23. P. 4963-4968;

61. Eaton B.E., GoldL., Zichi D.A. Lef s get specific: the relationship between specificity and affinity // Chem. Biol. 1995. V. 2. № 10. P. 633-638;

62. EatonB.E., GoldL., Hicke B.J., JanjicN., Jucker F.M., SebestaD.P., Tarasow T.M., Willis M.C., Zichi D.A. Post-SELEX combinatorial optimization of aptamers // Bioorg. Med. Chem. 1997. V. 5. № 6. P. 1087-1096; '

63. Eaton B.E., Pieken W.A. Ribonucleosides and RNA I I Annual Review of Biochemistry. 1995. V. 64. P. 837-863;

64. Kusser W. Chemically modified nucleic acid aptamers for in vitro selections: evolving evolution // Molec. Biotechnol. 2000. V. 74. № 1. P. 27-3 8;

65. NolteA., Klussmann S., BaldR., Erdmann V.A., FursteJ.P. Mirror-design of L-oligonucleotide ligands binding to L-arginine//Nat.Biotechnol. 1996. V. 14. № 9. P. 1116-1119;

66. Klussmann S., NolteA., BaldR., Erdmann V.A., FursteJ.P. Mirror-image RNA that binds D-adenosine // Nat.Biotechnol. 1996. V. 14. № 9. P. 1112-1115;

67. EulbergD., Klussmann S: Spiegelmers: Biostable aptamers // Chembiochem. 2003. V. 4. № 10. P. 979-983;

68. Hornby P.J. Designing spiegelmers to antagonise ghrelin // Gut. 2006. V. 55. № 6. P. 754-755;

69. Williams K.P., LiuX.-H., Schumacher T.N., Lin H.Y., Ausiello D.A., Kim P.S., Bartel D P. Bioactive and nuclease-resistant L-DNA ligand of vasopressin // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V. 94. № 21. P. 11285-11290;

70. Leva S., Lichte A., Burmeister J., Muhn P., JahnkeB., Fesser D., ErfurthJ., Burgstaller P., Klussmann S. Spiegelmers: a novel approach toward GnRH antagonism // Chem. Biol. 2002. V. 9. № 3. p. 351-359;

71. НО.Панченко Е.П., Добровольский А.Б. В кн. Тромбозы в кардиологии. Механизмы развития и возможности терапии. Изд. «Спорт и культура». Москва. 1999. С. 55-74;

72. Струкова С.М. Тромбин регулятор процессов воспаления и репарации тканей //Биохимия. 2001. Т. 66. № 1. С. 8-18;

73. Coughlin S.K Thrombin signalling and protease-activated receptors // Nature. 2000. V. 407. № 6801. P. 258-264;

74. TsiangM., Jain A.K, Dunn K.E., Rojas M.E., LeungL.L., Gibbs C.S. Functional mapping of the surface residues of human thrombin // J.Biol.Chem. 1995. V.270. № 28. P.16854-16863;

75. Pechnik I., Madrazo J., Mosesson M. W., Hernandez I., Gilliland G.L., Medvad L. Crystal structure of the complex between thrombin and the central "E" region of fibrin // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 2004. V. 101. № 9. P. 2718-2723;

76. BockL.C., Griffin L.C., Latham J.A., Vermaas E.H., Toole J.J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin //Nature. 1992. V. 355. №> 6360. P. 564-566;

77. Wu Q., TsiangM., Sadler J.E. Localization of the single-stranded DNA binding site in the thrombin anion-binding exosite // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. № 34. P. 24408-24412;

78. Macaya R.F., Schultze P., Smith F. W., Roe J.A., Feigon J. Thrombin-binding DNA aptamer forms a unimolecular quadruplex structure in solution // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1993. V. 90. № 8. P, 3745-3749;

79. Ikebukuro K., Okumura Y., Sumikara K, Karube I. A novel method of screening thrombin-inhibiting DNA aptamers using an evolution-mimicking algorithm //Nucl. Acid Res. 2005. V. 33. № 12. P. el08;

80. Paborsky L.R, McCurdy S.N., Griffin L. C., Toole J. J., Leung L.L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. №28. P. 20808-20811;

81. Wang K Y., McCurdy S., Shea R.G., Swaminathan S., Bolton P.H. A DNA aptamer which binds to and inhibits thrombin exhibits a new structural motif for DNA // Biochemistry. 1993. V. 32. № 8. P. 1899-1904;

82. Tasset D.M., KubikM.F., Steiner W. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes // J. Mol. Biol. 1997. V. 272. № 5. P. 688-698;

83. Bonder M.A., Koziolkiewicz M., Watala C. Aptamer inhibits degradation of platelet proteolytically activatable receptor, PAR-1, by thrombin // Thrombosis Research. 2001. V.' 104. № 3. P. 215-222;

84. Li W.X., Kaplan A. V., Grant G. W., Toole J. J., Leung L.L.K. A Novel Nucleotide-Based Thrombin Inhibitor Inhibits Clot-Bound Thrombin and Reduces Arterial Platelet Thrombus Formation // Blood. 1994. V. 83. № 3. P. 677-682;

85. Reyderman L., Stavchansky S. Pharmacokinetics and Biodistribution of a nucleotide-based thrombin inhibitor in rats // Pharmacetical Research. 1998. V. 15. № 6. P. 904-910;

86. KubikM.F., Stephens A. W., Schneider D., Marlar RA., Tasset D. High-affinity RNA ligands to human a-thrombin // Nucleic Acid Res. 1994. V. 22. № 13. P. 2619-2626;

87. Becker RC., Povsic 71, CohenM.G., Rusconi C.P., Sullenger B. Nucleic acid as antithrombotic agents; Opportunities in extracellular therapeutics // Thrombosis andHaemostasis. 2010. V. 103. № 3. P. 586-595;

88. Hwang J., Fauzi II, Fukuda K, Sekiya S., Kakiuchi N., Shimotohno K., Taira K, Kusakabe I., Nishikawa S. The RNA aplamer-binding site of hepatitis C virus

89. NS3 protease // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 279. № 2. P. 557-562;

90. Hwang J., Fauzi H., Fukuda K., Sekiya S., Kakiuchi N., Taira K, Kusakabe I., Nishikawa S., Analysis of aptamer binding site for HCV-NS3 protease by alanine scanning mutagenesis // Nucleic Acids Symp Ser. 2000. V. 44. P. 253-254;

91. Doring G. The role of neutrophil elastase in chronic inflammation // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1994. V. 150. № 6. P. 114-117;

92. Oleksyszyn J., Powers J. C. Irreversible inhibition of serine proteases by peptide derivatives of (alpha-aminoalkyl)phosphonate diphenyl esters // Biochemistry. 1991. V. 30. №2. P. 485-493;

93. Smith D., Kirschenheuter G.P., Charlton J., Guidot D.M., Repine J.E. In vitro selection of RNA-based irreversible inhibitors of human neutrophil elastase // Chem. Biol. 1995. V. 2. № 11. P. 741-750;

94. Charlton J., Kirschenheuter G.P., Smith D. Highly potent irreversible inhibitors of neutrophil elastase generated by selection from a randomized DNA-valine phosphonate libraiy// Biochemistry. 1997. V. 36. № 10. P. 3018-3026;

95. Bless N.M., Smith D., Charlton J., Czermak B.J., SchmalH., FriedlH.P., Ward P. A. Protective effects of an aptamer inhibitor of neutrophil elastase in lung inflammatory injury // Curr. Biol. 1997. V. 7. № 11. P. 877-880;

96. Rosen L.S., VEGF-targeted therapy: therapeutic potential and recent advances // Oncologist. 2005. V. 10. № 6. P. 382-391;

97. Pierce E.A., Avery R.L., Foley E.D., Aiello L.P., Smith L.E. Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor expression in a mouse model of retinal neovascularization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. № 3. P. 905-909;

98. Robinson G.S., Pierce E.A., Rook S.L., Foley E., Webb R, Smith L.E. Oligodeoxynucleotides inhibit retinal neovascularization in a murine model of proliferative retinopathy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. № 10. P. 4851-4856;

99. KvantaA., Algvere P. V., Berglin I., Seregard S., Subfoveal fibrovascular membranes in age-related macular degeneration express vascular endothelial growth factor// Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996. V. 37. № 9. P. 1929-1934;

100. Holash J., Maisonpierre P.C., Compton D., BolandP., Alexander C.R., Zagzag D., Yancopoulos G.D., WiegandS.J. Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF // Science. 1999. V. 284. № 5422. P. 1994-1998;

101. Ikebukuro K., Hasegawa II., Sode K. Selection and characterization of DNA aptamers against VEGF (165) with aptamer blotting method and its application // Nucleic Acids Symposium Series. 2007. V. 51. P. 399-400.

102. JellinekD., Green L.S., Bell C., Janjic N. Inhibition of receptor binding by high-affinity RNA ligands to vascular endothelial growth factor // Biochemistry. 1994. V. 33. № 34. P. 10450-10456;

103. Gragoudas E.S., Adamis A.P., Cunningham E. T. Jr., FeinsodM., Guyer D.R. Pegaptanib for neovascular age-related macular degeneration // N. Engl. J. Med. 2004. V. 351. № 27. P. 2805-2816;

104. JellinekD., Lynott C.K, Rifldn D.B., Janjic N. High-affinity RNA ligands to basic fibroblast growth factor inhibit receptor binding // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. V. 90. №23. P. 11227-11231;

105. Heldin C.H. Structural and functional studies on platelet-derived growth factor // EMBO J. 1992. V. 11. № 12. P. 4251-4259;

106. Lindner V., Reidy M.A. Platelet-derived growth factor ligand and receptor expression by large vessel endothelium in vivo // Am. J. Pathol. 1995. V. 146. № 6. P. 1488-1497;

107. Green L.S., JellinekD., JenisonR., OstmanA., Heldin C.H., Janjic N. Inhibitory DNA ligands to platelet-derived growth factor B-chain // Biochemistry. 1996. V. 35. № 45. P. 14413-14424;

108. РойтА., Бростофф Дж., Meiui Д., Иммунология, М, «Мир», 2000, с.210;

109. KubikM.F., Bell С., Fitzwater Т., Watson S.R., Tasset D.M. Isolation and characterization of 2'-fluoro-, 2'-amino-, and 2'-fluoro-/amino-modified RNAligands to human IFN-gamma that inhibit receptor binding.// J. Immunol. 1997. V. 159. № l.P. 259-267;

110. J eon S.H., Kayhan B., Ben-Yedidia T., Arnon R.A. DNA aptamer prevents influenza by blocking the receptor binding region of the viral hemagglutinin // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 46. P. 48410-48419;

111. Sullenger B.A., Gallardo H.F., Ungers G.E., GilboaE., Overexprcssion of TAR sequences renders cells resistant to human immunodeficiency virus replication// Cell. 1990. V. 63. № 3. P. 601-608;

112. Sullenger B.A., Gallardo H.F., Ungers G.E., GilboaE,. Analysis of trans-acting response decoy RNA-mediated inhibition of human immunodeficiency virus type 1 transactivation// J. Virol. 1991. V. 65. № 12. P. 6811-6816;

113. Matsugami A., Tamura Y, Kudo M., UesugiS., Yamamoto R, Kumar P., Katahira M. Structure of RNA aptamer for HIV Tat complexed with Tat-derived peptide // Nucleic Acids Symp Ser (Oxf). 2004. V. 48. P. 111-112;

114. BohjanenP.R, ColvinRA., Puttaraju M., Been M.D., Garcia-Blanco M.A. A small circular TAR RNA decoy specifically inhibits Tat-activated HIV-1 transcription //Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. № 19. P. 3733-3738;

115. Lee T.C., Sullenger B.A., Gallardo H.F., Ungers G.E., GilboaE. Overexpression of RRE-derived sequences inhibits HIV-1 replication in CEM cells // New Biol. 1992. V. 4. № 1. P. 66-74;

116. Tuerk C., MacDougal S., Gold L. RNA pseudoknots that inhibit human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. № 15. P. 6988-6992;

117. Jaeger J., Restle T., Steitz T.A. The structure of HIV-1 reverse transcriptase' complexed with an RNA pseudoknot inhibitor // EMBO J. 1998. V. 17. № 15. P. 4535-4542;

118. Martell R.E., Nevins J.R\ Sullenger B.A., Optimizing aptamer activity for gene therapy applications using expression cassette SELEX // Mol. Ther. 2002. V. 6. № l.P: 30-34;

119. Mann M.J., Gibbons G.H., Hutchinson H., Poston RS., Hoyt E.G., Robbins R.C., Dzau V.J. Pressure-mediated oligonucleotide transfection of rat and human cardiovascular tissues //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. № 11. P. 64116416;

120. Ishizaki J., Nevins J.R, Sullenger B.A. Inhibition of cell proliferation by an RNA ligand that selectively blocks E2F function // Nat. Med. 1996. V. 2. № 12. P. 1386-1389;

121. Verma I.M., Stevenson J.K, Schwarz E.M., Van Antwerp D., Miyamoto S. Rel/NF-kappaB/I kappa B family: intimate tales of association and dissociation // Genes Dev. 1995. V. 9. № 22. P. 2723-2735;

122. Lebruska L.L., Maher L.J. Selection and characterization of an RNA decoy for transcription factor NF-kappa B // Biochemistry. 1999. V. 38. № 10. P. 3168-3174;

123. Zhang B., Roth R.A. A region of the insulin receptor important for ligand binding (residues 450-601) is recognized by patients' autoimmune antibodies and inhibitory monoclonal antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. № 21. P. 9858-9862;

124. Lee S. W., Sullenger B.A. Isolation of a nuclease-resistant decoy RNA that selectively blocks autoantibody binding to insulin receptors on human lymphocytes // J. Exp. Med. 1996. V. 184. № 2. P. 315-324;

125. Hwang B., Lee S. W, Improvement of RNA aptamer activity against myasthenic autoantibodies by extended sequence selection // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 290. № 2. P. 656-662;

126. Hwang B., Han K., Lee S. W. Prevention of passively experimental autoimmune myasthenia gravis by an in vitro selected RNA aptamer // FEBS Lett. 2003. V. 548. №1-3. P. 85-89.

127. Sutton B.J., Gould H.J. The human IgE network // Nature. 1993. V. 366. № 6454. P. 421-428;

128. Wiegand T. W., Williams P.B., Dreskin S.C., Jouvin M.H., Kinet J.P., Tasset D. High-affinity oligonucleotide ligands to human IgE inhibit binding to Fc epsilon receptor// J. Immunol. 1996. V. 157. № 1. P. 221-230;

129. Chambers C.A., Kuhns M.S., Egen J. G., Allison J.P. CTLA-4-mediated inhibition in regulation of T cell responses: mechanisms and manipulation in tumor immunotherapy // Annu. Rev. Immunol. 2001. V. 19. P. 565-594;

130. Santulli-Marotto S., Nair S.K, Rusconi C., Sullenger B., Gilboa E. Multivalent RNA aptamers that inhibit CTLA-4 and enhance tumor immunity // Cancer Res. 2003. V. 63. № 21. P. 7483-7489;

131. Bevilacqua M.P., Nelson RM., Endothelial-leukocyte adhesion molecules in inflammation and metastasis // Thromb Haemost. 1993. V. 70. № 1. P. 152-154;

132. Jenison R.D., Jennings S.D., Walker D. W., Bargatze RF., Parma D., Oligonucleotide inhibitors of P-selectin-dependent neutrophil-platelet adhesion // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1998. V. 8. № 4. P. 265-279;

133. O'Connell D., KoenigA., Jennings S., Iiicke B., Han H.L., Fitzwater T., Chang Y.F., VarkiN., Parma D., VarkiA. Calcium-dependent oligonucleotide antagonists specific for L-selectin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. № 12. P. 58835887;

134. Watson S.R, Chang Y.F., Anti L-selectin aptamers: binding characteristics, pharmacokinetic parameters and activity against an intravascular target in vivo // Antisence Nucleic drug Dev. 2000. V. 10. № 2. P. 63-75;

135. LupoidS.E., Hicke B.J. Identification and characterization ofnuclease-stabilized RNA molecules that bind human prostate cancer cells via prostate-specific membrane antigen// Cancer res. 2002. V. 62. № 14. P. 4029-4033;

136. Nimjee S.M., Rusconi C.P., Sullenger B.A. B kh. «The aptamer handbook», ed. S.Klussmann, Wiley-VCH Verlag, Wienheim, 2006, P. 156-157;

137. Biesecker G., Dihel L., Derivation of RNA aptamer inhibitors of human complement C5 // Immunopharmacology. 1999. V. 42. № 1-3. P. 219-230;

138. Rintala E.M., Nevalainen T.J. Group phospholipase A2 in sera of febrile patients with microbiologically or clinically documented infections // Clin. Infect.Dis. 1993. V. 17. № 5. P. 864-879;

139. Bridonneau P., Chang Y.F., High-affinity aptamers selectively inhibit human nonpancreatic secretory phospholipase A2 // J.Med.Chem. 1998. V. 41. № 6. P. 778-786;

140. Proske D., GilchS., Wopfner F., SchatzlH.M., Winnacker E.L., FamulokM., Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation // Chembiochem. 2002. V. 3. № 8. P. 717-725;

141. Фролов A.O. Класс Kinetoplastidea. В юн.: Руководство по зоологии. Протесты. Часть 1. СПб, Наука, 2000, 211-256;

142. Ulrich Н., Magdesian М.Н. In vitro selection of RNA aptamers that bind to cell adhesion receptors of Trypanosoma cruzi // J.Biol.Chem. 2002. V. 277. № 23. P. 20756-20762,

143. Wimberly В. Т., White S. W., Ramakrishnan V. The structure of ribosomal protein S7 at 1.9A resolution reveals a beta-hairpin motif that binds double-stranded nucleic acids // Structure. 1997. V. 5. № 9. P. 1187-1198;

144. WimberlyB.T., Brodersen, D.E., Clemons W.M., Jr., Morgan-Warren, R.J., Carter A.P., Vonrhein C., Hartsch Т., Ramakrishnan V. Structure of the 30S ribosomal subunit//Nature. 2000. V. 407. № 6802. P. 327-339;

145. Guex K, Peitch M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling// Electrophoresis. 1997. V. 18. № 15. P. 2714-2723;

146. Hosaka H. Ribosomal protein S7: a new RNA-binding motif with structural similarities to a DNA architectural factor // Structure. 1997. V. 5. № 9. P. 11991208;

147. Головин А.В. Исследование бинарных комплеков РНК и рибосомного белка S7 эубактерий. Кандидатская диссертация. 2002. Москва. С. 44-49;

148. Studier F. W., Moffatt В. A. Use of bacteriophage Т7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes // J. Mol. Biol. 1986. V. 189. № 1. P. 113-130;

149. Steen R, DahlbergA.E., Lade B.N., Studier F. W., Dunn J.J., T7 RNA polymerase directed expression of the Escherichia coli rrnB operon. // EMBO J. 1986. V. 5. № 5. P. 1099-1103;

150. Dragon F., Brakier-Gingras L., Interaction of Escherichia coli ribosomal protein S7 with 16SRrna//Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. № 5. P. 1199-1203;

151. RussellR., ZhuangX., BabcockH.P., Millettl.S., Doniach S., Chu S., Herschlag D. Exploring the folding landscape of a structured RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. № 1. P. 155-160;

152. Chen S.J., Dill К.A., RNA folding energy landscapes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 2. P. 646-651,

153. Saito K, Mattheakis L.C., Nomura M, Post-transcriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Ribosomal protein S7 inhibits coupled translation of S7 but not its independent translation // J. Mol. Biol. 1994. V". 235. № 1. P. 111-124; ~

154. Saito K, Nomura M., Post-transcriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Structural and mutational analysis of the target site for translational repressor S7 // J. Mol. Biol. 1994. V. 235. № 1. P. 125-139;

155. Dragon F., Pay ant C, Brakier-Gingras L Mutational and structural analysis of the RNA binding site for Escherichia coli ribosomal protein S7 // J. Mol. Biol. 1994. V. 244. № 1. P. 74-85;

156. Golovin A.V., Spiridonova V.A., Kraal В., Кору lov A.M. Mapping of contact of S12 — S7 intercistronic region of E. coli streptomycin mRNA with recombinant ribosomal protein S7 // FEBS Lett. 2006. V. 580. № 25. P. 5858-5862;

157. Сурдина A.B., Рассохин Т.И., Головин A.B., Спиридонова В.А, Копылов A.M. Картирование регуляторного участка связывания рибосомного белка S7 со стрептомициновой мРНК E.coli II Биохимия. 2010. Т. 75. № 7. С. 841-850;

158. Leontis N.B., Westhof Е. The 5S rRNA loop E: chemical probing and phylogenetic data versus crystal structure // RNA. 1998. V. 4. № 9. P. 1134-1153.

159. Tsiang, M., Gibbs C.S., Griffin L.C., Dunn K.E., Leung L.K. Selection of a suppressor mutation that restores affinity of an oligonucleotide inhibitor forthrombin using in vitro genetics // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 33. P. 1937019376;

160. Tsiang M, Jain A.K., Dunn K.E., Rojas M.E., Leung L.L., Gibbs C.S. Functional mapping of the surface residues of human thrombin // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 28. P. 16854-16863;

161. Schultze P., Macaya R.F., Feigon J. Three-dimensional solution structure of the thrombin-binding DNA aptamer d(GGTTGGTGTGGTTGG) // J.Mol.Biol. 1994. V. 235. № P. 1532-1547;

162. Wang К Y., McCurdy S., Shea R.G., Swaminathan S., Bolton P.H. A DNA4aptamer which binds to and inhibits thrombin exhibits a new structural motif for DNA // Biochemistry. 1993. V. 32. № 8. P. 1899-1904;

163. Padmanabhan K, Padmanabhan K.P., Ferrara J.D., Sadler J.E., Tulinsky A., The structure of alpha-thrombin inhibited by a 15-mer single-stranded DNA aptamer//J.Biol.Chem. 1993. V. 268. №. 24. P. 17651-17654;

164. Lipps H., Rhodes D. G-quadruplex structures: in vivo evidence and function // Trends in Cell Biol. 2009. V. 19. № 8. P. 414-422;

165. Wang К Y., Swaminathan S., Bolton P.H., Tertiary structure motif of Oxytricha telomere DNA// Biochemistry. 1994. V. 33. № 24. P. 7517-7527;

166. Спиридонова B.A., Рог E.B., Дугина Т.Н. Струкова С.М., Копылов A.M., Аптамерные ДНК ингибиторы тромбина нового типа // Биоорган. Химия. 2003. Т. 29. № 5. С. 495-498;

167. Сердюк И.Н., Заккаи Н., Заккаи Дж. В кн. Методы в молекулярной биофизике. Изд-во «Книжный дом Университет». 2009. Москва. Т.1. С. 260272:

168. Добровольский А.Б., Титаева Е.В., Хаспекова С.Г., Спиридонова В.А., Копылов A.M., Мазуров А.В. Ингибирование активности тромбина аптамерами ДНК// Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2009. Т. 148. № 1. С. 41-45;

169. Мазуров А.В., Хаспекова С.Г. Титаева Е.В., Спиридонова В А., Копылов A.M., Добровольский А.Б. Свойства нового ДНК аптамера — прямого ингибитора тромбина //Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2010. Т. 150. № 10. С. 394397;

170. Bairoch A., Apweiler R. The SWISS-PROT protein sequence data bank and its supplement TrEMBL // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. № 1. P. 49-54;

171. PeitchM.C. ProMod and Swiss-Model: Internet-based tools for automated comparative protein modeling//Biochem. Soc.Trans. 1996. V. 24. № 1. P. 274279;

172. Laemmli V.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685;

173. Маниатис Т., Фрич Э., СэмбрукД. Молекулярное клонирование, ed. А.А. Баев. 1984, Москва: "Мир";

174. Непсо К. The QIAexpressionist: The High-Level Expression & Protein Purification SystemQIAGEN. 1992, Hamburg;

175. Спиридонова В.А., Лыгина А.С., Анохина M.M., Тупицын Н.Н., Получение функционально активного рекомбинантного интерлейкина-6 человека // Биохимия. 2007. Т. 72. № 4. С. 525-532;

176. Spiridonova V.A., Golovin А. V., Drygin Ju., Kopylov A.M., An extremely high conservation of RNA-protein interactions during prokariotic str operon regulation // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. V. 44. № 6. P. 1141-1146;

177. Будкер В.Г:, Гиршович А.С., Гринева II.И., Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г. Специфическая химическая модификация рибосом около мРНК-связывающего центра// Доклады АН СССР. 1973. Т. 211. № 3. С. 725-728;

178. Ellington A.D., Yarns М. "RNA-Protein Interactions: A Practical Approach, ed. C.Smith , Oxford University Press. 1998. P. 285-302;

179. Решетников Р.В., Головин A.B., Копылов A.M. Сравнение моделей 15-звенного ДНК-аптамера к тромбину с помощью симуляции молекулярной динамики // Биохимия. 2010. V. 75. № 8. С. 1124-1132;

180. Reshetnikov R., GolovinA., Spiridonova V, Kopylov A., SponerJ. Structural dynamics of thrombin-binding DNA aptamer d(GGTTGGTGGTTGG) quadruplex DNA studied by large-scale explicit solvent simulations // J Chem.Theory Comput. 2010. V. 6. P. 3003-3014;