Роль структуры поверхностных белков оболочечных вирусов в формировании вирионов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Кордюкова, Лариса Валентиновна

• Кордюкова, Лариса Валентиновна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Кордюкова, Лариса Валентиновна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вирус гриппа

1.1 .Классификация штаммов

1.2. Структурная организация еириона вируса гриппа

1.3. Оболочка еириона: липиды клеточной мембраны

и вирус-специфические белки

1.3.1 .Гемагглютинин

1.3.1.1.Пространственная структура эктодомена

1.3.1.2. Эволюционные группы гемагглютинина

1.3.1.3.Перестройка при кислом рН

1.3.1.4. «Внутренняя структурная неупорядоченность»

1.3.1.5.3аякоривающий (С-концевой) сегмент

1.3.2.Нейраминидаз а

1.3.3.Мембранный белок М2

1.3.4.Матриксный белок М1 и взаимодействие с гемагглютинином

2. Липидиая модификации вирусных белков - 8-ацилирование

2.1.Методы идентификации Б-ацилирования

2.2.Локализация сайтов 8-ацилирования в белке

2.3.Энзимология Б-ацилирования на примере клеточных белков

2.4.Компартменты Б-ацилирования в клетке

2.5.Биологическая роль Б-ацилирования

2.6. Типы остатков жирных кислот, присоединяемые к белку

3. Масс-спектрометрические подходы в изучении вируса гриппа

3.1.Принципы и разновидности масс-спектрометрии

3.2.Идентификация белков

3.3.Протеомика вирионов

3.4. Тестирование вакцин

3.5.Мониторинг штаммов: гено- и протеотипирование

3.6.Пост-трансляционные модификации

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Р

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Структурная организация линкерных последовательностей гемагглютинина вируса гриппа

1.1 .Протеолиз гемагглютинина вируса гриппа в интактных вирионах

1.1.1.Действие различных протеолитических ферментов на

вирионы вируса гриппа

1.1.2.Действие бромелаина на вирионы вируса гриппа

в отсутствие восстанавливающих реагентов

1.1.2.1. Феномен фрагментации белка М1 в составе вирионов

1.1.3.Идентификация сайтов гидролиза гемагглютинина

в составе вирионов при помощи масс-спектрометрии

1.2.Биоинформатические подходы для анализа упаковки

линкерных последовательностей в составе «ножки» «шипа»

2. Структурная организация трансмембранных доменов гемагглютинина вируса гриппа

2.1 .Протеолиз гемагглютинина вируса гриппа в составе мицелл

2.2.Компьютерное моделирование гомотримерной

ассоциации трансмембранных доменов

3. S-ацилирование поверхностных белков

3.1 Дифференциальное S-ацилирование — характерная черта

«сливающих» белков оболочечных вирусов

3.1.1.Гемагглютинин (НА) природных штаммов вируса гриппа А

3.1.2.Мутанты НА вируса гриппа А с заменами сайтов ацилирования

3.1.3.НА вируса гриппа В и гемагглютинин-эстераза-фъюжин

(HEF) вируса гриппа С

3.1.4.Белки других оболочечных вирусов

3.2.Анализ биологической значимости S-ацилирования -

новые подходы

3.2.1 .Аминокислотные замены вблизи от сайтов ацилирования

3.2.2. Лабораторные реассортанты - экспериментальная модель для исследования влияния других белков вириона на S-стеарилирование НА вируса гриппа А

3.2.3.Дифференциальное ацилирование важно для локализации вирусного белка в рафтах?

3.2.4. Синтетический пептид, имитирующий Б-ацилированный

С-концевой сегмент НА, — модель для исследования структурной

роли ковалентно связанных остатков жирных кислот

3.3.Гипотеза об участии остатков жирных кислот в

гомотримерной ассоциации трансмембранных доменов НА

4. Заключение

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А.о. - аминокислотный остаток

БСА - бычий сывороточный альбумин

БОВ - большие однослойные везикулы

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГФИП - гексафторизопропанол (англ. HFIP, hexafluoroisopropanol)

ДГФХ - дигексаноилфосфатидилхолин

ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние

ДМФХ - димиристоилфосфатидилхолин

Ж.к. - жирная кислота

КД - круговой дихроизм

МС - масс-спектрометрия

МГП - молекулярный гидрофобный потенциал (расчетные гидрофобно-

гидрофильные свойства поверхности белка)

ПААГ - полиакриламидный гель

РСА - рентгеноструктурный анализ

СБСС - сопряженная бесклеточная система синтеза

ТХУ - трихлоруксусная кислота

УФ - ультрафиолет

ФС - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатидилхолин

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ЯМР -ядерномагнитный резонанс

АРТ - Acyl-protein thioesterase

ВНА - bromelain treated НА, удаленный бромелаином эктодомен НА (3-МЕ - (3-меркаптоэтанол

СТ - cytoplasmic ta.il, цитоплазматический «хвост» (домен)

DRM - Detergent Résistant Membranes, устойчивые к детергенту мембраны

DHHC - мотив Asp-His-His-Cys в активном центре пальмитоил-ацил-трансфераз

Е-64 - Ь-гаранс-эпоксисукцинил-лейциламидо(4-гуанидино)бутан

ESI - Electro-Spray Ionization, электроспрей

Glp-Phe-Ala-pNA - пироглутамил- РЬе-А1а-/7-нитроанилид

GPI - glycosyl phosphatidylinositol, гликозилфосфатидилинозитол

НА - гемагглютинин

НА-ТМД-СТ - пептид, соответствующий последовательности С-концевого сегмента НА A/FPV/34 (H7N1), включая линкер, ТМ и СТ-домены (а.о. 518-563) НА-ТМДС21S-CT - пептид с заменой Cys21Ser в пептиде НА-ТМД-СТ Hd-MTS - hexadecyl-methanethiosulfonate, гексадецил-метантиосульфонат HEF - hemagglutinin esterase fusion, белок гемагглютинин-эстераза-фьюжин HIV - human immunodeficiency virus, вирус иммунодефицита человека HSQC - спектры гетероядерного одноквантового переноса когерентности MALDI - Matrix-Assisted Laser Desorption, МАЛДИ - матрично-активированная лазерная десорбционная ионизация MDCK - Madin-Darby canine kidney, клетки почки собаки NA-нейраминидаза

NDV - Newcastle Disease Virus, вирус болезни Ньюкасла PMSF - фенилметилсульфонилфторид

SARS-CoV - sudden acute respiratory syndrome coronavirus, коронавирус,

вызывающий острый респираторный синдром («атипичную пневмонию»)

SAS - solvent accessible surface, доступная растворителю поверхность

SFV - Semliki Forest Virus, вирус леса Семлики

ТСЕР - tris(2-carboxyethyl)phosphine, трис(2-карбоксиэтил)фосфин

ТМ - трансмембранный

TOF - Ionization Time-Of-Flight, времяпролетная 3D - трехмерный

TSP - trimethylsilyl propanoic acid, триметилсилилпропановая кислота

VSV — Vesicular Stomatitis Virus, вирус везикулярного стоматита

5

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль структуры поверхностных белков оболочечных вирусов в формировании вирионов»

ВВЕДЕНИЕ

К группе оболочечных вирусов относятся многие опасные патогены, в том числе вирусы гриппа и респираторных инфекций, а также гепатитов, герпеса, геморрагических лихорадок, иммунодефицита человека и многие другие. Вирус гриппа (не считая, пожалуй, вируса иммунодефицита человека) на сегодняшний день является наиболее изученным из вирусных патогенов человека. Тем не менее, накопленных в науке данных явно недостаточно как для полного представления о механизмах инфицирования организма, так и для обеспечения надежной защиты человеческой популяции от ежегодных вспышек заболевания, эпидемий и пандемий.

Сегментированная организация генома вируса гриппа способствует обмену генетической информацией между различными штаммами при смешанной инфекции. Этот процесс называется реассортацией. В природе реассортация генов (генетический «шифт», англ. shift) при одновременном заражении организма вирусами разного происхождения может привести к появлению новых штаммов, обладающих пандемическим потенциалом. История XX-XXI веков знает четыре пандемии: 1918, 1957, 1968 и 2009 годов. Вирусы, вызвавшие пандемии 1957 (H2N2, азиатский грипп), 1968 (H3N2, Гонг Конг) и 2009 (HINlv) появились в результате реассортации генов вирусов гриппа человека и птиц. Пандемия 1918 года (H1N1, испанка) была наиболее сильной; она унесла несколько десятков миллионов жизней. Не ликвидирована угроза распространения в человеческой популяции высокопатогенного штамма H5N1, а весной 2013 года появилось сообщение из Китая о случаях заражения людей штаммами H7N9 (Lamb, 2013). Общее количество случаев заболеваемости и смертности на протяжении периодов между пандемиями на самом деле превосходит эти показатели для пандемий.

Средств борьбы с заболеваемостью недостаточно. Несмотря на неустанный активный поиск и дизайн новых антивирусных препаратов (Vanderlinden & Naesens, 2013), проблема лечения вирусных инфекций не

решена. Даже к наиболее эффективным из противогриппозных препаратов, к которым в настоящее время относятся ингибиторы нейраминидазы -занамивир (коммерческий препарат Реленза) и озелтамивир (Тамифлю) -достаточно быстро возникает резистентность. Вакцино-профилактика в случае вируса гриппа А осложнена высокой изменчивостью поверхностных антигенов. В связи с этим не ослабевает актуальность фундаментального изучения патогенеза вируса гриппа в плане анализа структуры отдельных компонентов вириона и их взаимодействий, с целью разработки в дальнейшем новых антивирусных стратегий.

Оболочечные вирусы проникают в клетку-хозяина в результате слияния вирусной мембраны с клеточной (Eckert & Kim, 2001). Вирусная оболочка может сливаться с плазматической мембраной клетки при нейтральном pH (парамиксо-, ретровирусы). Вирусные частицы других семейств (ортомиксо-, рабдо-, альфа-, флавивирусов) проникают внутрь клетки путем опосредованного клеточными рецепторами эндоцитоза, вслед за которым, при закислении среды, происходит слияние вирусной и эндосомальной мембран, приводящее к высвобождению вирусного нуклеокапсида в цитоплазму клетки (Hernandez и др., 1996; Lesear и др.,

2001). В случае вируса гриппа как взаимодействие с клеткой-хозяином, так и слияние мембран опосредуется трансмембранным белком гемагглютинином (Skehel & Wiley, 2000).

Согласно гипотезе последнего десятилетия, механизмы реакций слияния (англ. fusion) и деления (англ. fission) мембран, участвующие во множестве клеточных процессов, во многом сходны, но реализуются в обратном порядке (Chernomordik & Kozlov, 2003; Kozlov Sc Chernomordik,

2002). В случае оболочечных вирусов этап входа вируса в клетку,

сопровождающийся «разборкой» целостного вириона на отдельные

компоненты, в каком-то смысле «обратен» формированию вирионов. В

частности, матриксный слой, располагающийся под вирусной мембраной,

должен диссоциировать в процессе или после слияния мембран, пропуская

7

сегменты нуклеокапсида в цитоплазму. С другой стороны, взаимодействие вновь синтезированных в клетке белков Ml и гемагглютинина на этапе сборки необходимо для морфогенеза полноценных вирионов.

Несмотря на огромные достижения в области изучения механизма слияния мембран под воздействием вирусных белков-фузогенов, далеко не все детали этого процесса понятны. В частности, в то время как эктодомен гемагглютинина при кислом значении pH радикально перестраивается, гомотримерный комплекс трансмембранных доменов, по-видимому, сохраняет свою структурную целостность, создавая необходимое напряжение для расширения поры слияния. Пространственная организация гомотримера трансмембранных доменов гемагглютинина не определена. Отсутствует информация и об архитектуре «ножки» «шипа», локализованной в пограничной зоне между закристаллизованным эктодоменом и комплексом трансмембранных доменов. Линкерные последовательности, гомотример которых формирует «ножку» «шипа», также несут функциональную нагрузку при слиянии мембран (Park и др., 2003; Kim и др., 2011). Вероятно, по аналогии с эктодоменами структурная организация линкерных областей и трансмембранных доменов различается у разных антигенных подтипов гемагглютинина вируса гриппа А, что может быть одной из причин наблюдаемых различий в протекании реакции слияния в случае подтипов HI, Н2 и НЗ (Körte и др., 1997, 1999). Однако этот вопрос систематически не изучался.

Важной особенностью гемагглютинина является пост-трансляционная

модификация консервативных остатков цистеина в С-концевой области

остатками высших жирных кислот. Эта модификация - пальмитилирование,

или S-ацилирование - была впервые обнаружена более 30 лет назад именно у

вирусных, а немного позднее и у клеточных белков (Schmidt & Schlesinger,

1979; Schmidt и др., 1980). Достижения протеомики последних лет позволили

аннотировать от 300 до 500 пальмитилированных белков в клетках разных

типов (Ivaldi и др., 2012; Martin и др., 2011; Tom & Martin, 2013), указывая на

8

распространенность этой модификации. Регуляция пальмитилирования определяет протекание как физиологически нормальных, так и патологических процессов в клетке, включая канцерогенез и развитие многих нейродегенеративных заболеваний (Linder & Deschenes, 2007).

В отличие от клеточных, S-ацилирование вирусных белков необратимо (не изменяется на протяжении времени «жизни» белка). Поэтому эта липидная модификация вряд может играть у вирусов регуляторную, но, скорее, структурную роль. Показано, что пальмитилирование НА важно для репликации вируса. Рекомбинантные частицы, содержащие мутантные молекулы НА с заменой более одного сайта ацилирования, либо очень плохо продуцируются в клетке, либо вовсе не могут быть получены методом обратной генетики (Chen и др., 2005; Wagner и др., 2005). В связи с этим, идея в перспективе попытаться блокировать S-ацилирование вирусных белков (например, подавив соответствующие ферменты) представляется актуальной. Но в отличие от большого потока работ, посвященных DHHC-ацил-трансферазам, выполняющим перенос и ковалентное присоединение остатков жирных кислот на белки эукариотических клеток, пока не был охарактеризован ни один фермент, выполняющий эту работу для вирусов.

До сих пор нет четкого понимания, на какой стадии жизненного цикла вируса необходимо пальмитилирование: участвуют ли ковалентно связанные остатки жирных кислот в процессе слияния мембран и/или сборки дочерних вирионов и вовлечены ли они во взаимодействия с другими белками вириона. Ситуация осложняется разноречивыми экспериментальными данными, полученными для разных антигенных подтипов НА. Тип остатка жирной кислоты представляет особенный интерес, поскольку углеводородные цепи, различающиеся по длине только на два углеродных атома, демонстрируют значительную разницу в гидрофобности, что может влиять на силу белок-мембранных и белок-белковых взаимодействий.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является исследование структуры С-концевой области (заякоривающего сегмента) гемагглютинина вируса гриппа и поверхностных белков других оболочечных вирусов и ее роли в формировании вирионов.

Для достижения вышеописанной цели решались следующие задачи:

1. Предложить подход для исследования структурных свойств надмолекулярного комплекса линкерных последовательностей - «ножки» «шипа» гемагглютинина вируса гриппа разных антигенных подтипов/типов;

2. Разработать методологию изучения гомотримерной ассоциации трансмембранных доменов гемагглютинина вируса гриппа с применением экспериментальных подходов и компьютерного моделирования;

3. Отработать протокол анализа пост-трансляционной модификации остатками высших жирных кислот (8-ацилирования) поверхностных белков, выполняющих функцию слияния мембран. Использовать в качестве объекта гемагглютинин вируса гриппа и ряд белков других семейств оболочечных вирусов. Сформулировать концепцию о полноте и гетерогенности 8-ацилирования белка в составе вириона;

4. Создать экспериментальные модели для исследования структурной и биологической значимости 8-ацилирования вирусных белков в формировании вирионов, включая (1) серию лабораторных реассортантов вируса гриппа А с поверхностными и внутренними белками, полученными от разных родительских штаммов/хозяев; (2) синтетический пептид, стехиометрически алкилированный гексадекановыми алифатическими цепями (имитирующими пальмитилирование), встроенный в липидные везикулы;

5. Изучить с применением современных методик молекулярного моделирования принципиальную возможность участия остатков жирных кислот в образовании гомотримерного комплекса трансмембранных доменов гемагглютинина при формировании вирионов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вирус гриппа

1.1. Классификация штаммов

Семейство Orthomixoviridae включает 4 рода вирусов: Influenzavirus А, Influenzavirus В, Influenzavirus С, а также Thogotovirus. Люди могут быть инфицированы вирусами гриппа типов А, В и С.

Вирус гриппа А подвержен наибольшей изменчивости поверхностных антигенов - гемагглютинина (НА или Н) и нейраминидазы (NA или N). На сегодняшний день известно 17 подтипов гемагглютинина (HI-HI7) и 10 подтипов нейраминидазы (N1-N10) (Pica & Palese, 2013; Tong и др., 2012). В природе встречаются различные (но не любые) антигенные комбинации НА и NA. Человека поражали в разные исторические периоды вирусы гриппа подтипов H1N1, H2N2, H3N2 и (несколько сотен случаев) H5N1. Основной «резервуар», в котором персистирует вирус гриппа А - водоплавающие птицы. Как правило, обычные (не высоко патогенные штаммы) не вызывают у птиц заболевания. Кроме птиц и человека, вирус гриппа А инфицирует большой спектр хозяев, включая свиней, хорьков, лошадей, собак, кошек, тигров, леопардов, куниц, верблюдов, летучих мышей (из последних недавно выделено два штамма с эволюционно отличными от всех других вирусов НА и NA - подтип H17N10) (Tong и др., 2012). Вирус видо-специфичен, то есть, как правило, вирус птиц не может поражать человека и наоборот.

Вирус гриппа В, как и вирус А, может вызывать сезонные вспышки заболеваний, но не вызывает пандемий. Этот вирус инфицирует только человека и тюленей (из последних выделено несколько штаммов). Вирус гриппа С достаточно мало изучен. Он выделен от людей и свиней. В отличие от вирусов гриппа А, вирусы гриппа В и С на подтипы не подразделяют.

Основные сведения о каждом новом выделенном штамме содержатся в его названии, например А/утка/Бангкок/1/79 (H3N2):

обозначение типа вируса (А, В или С) = А; организм (хозяин), из которого выделен вирус = утка (если этот параметр не указан, то подразумевается человек), географическое место выделения вируса = Бангкок; порядковый номер выделенного в данной лаборатории изолята = 1; год выделения = (19)79; «антигенная формула» = (H3N2) состоит из номера подтипа гемагглютинина (НЗ) и нейраминидазы (N2).

1.2. Структурная организация вириона вируса гриппа

Вирионы вируса гриппа полиморфны (их форма разнообразна), однако, более 75% вирионов представляют собой сферические или слегка вытянутые структуры со средним диаметром 80-120 нм (Fujiyoshi и др, 1994; Harris и др., 2006). В первичных изолятах вируса и у некоторых штаммов иногда преобладают так называемые филаментозные частицы, длина которых достигает нескольких микрометров (Calder и др., 2010). Есть данные, что такая форма частиц сопряжена с мутациями в матриксном белке Ml (Burleigh и др., 2005).

На Рис. 1 схематично представлена структура вириона вируса гриппа А. Нуклеокапсид окружен липопротеиновой оболочкой, включающей липиды плазматической мембраны клетки и вирус-специфические белки.

Рис. 1. Схематическое представление вириона

вируса гриппа типа А.

Указаны: липидный бислой, в который встроены «шипы» гликопротеинов НА и NA, ионный канал М2 и слой матриксного белка Ml. Геном включает 8 сегментов РНК (представлены согласно их общепринятой нумерации и с указанием кодируемых

белков).

Геном вируса гриппа А сегментирован; он состоит из восьми фрагментов однонитевой РНК «негативной» полярности, кодирующей 11 полипептидов (Lamb, 1989; Stegman & Helenius, 1993). Девять из этих полипептидов входят в состав вирионов. Гемагглютинин (НА), 1000-1500 копий/вирион (Skehel, 1986); в 5-6 раз менее представленная нейраминидаза (NA) и минорный белок М2, формирующий ионные каналы (14-68 копий/вирион) (Zebedee & Lamb, 1988; Sugrue & Hay, 1991) являются интегральными белками оболочки. Главный структурный белок вириона -матриксный белок Ml (1100-3000 копий/вирион) подлежит под липидной мембраной и образует «капсулу» вокруг нуклеокапсида (Ruigrok и др., 2000; Harris и др., 2006; Calder и др., 2010). Рибонуклеопротеиновый комплекс (англ. Ribo Nucleoprotein Particles, RNPs) включает сегменты геномной РНК, ассоциированной с нуклеопротеином (NP), а также по тримеру РНК-полимеразы (субъединицы РВ1, РВ2 и РА) на каждый сегмент РНК (Ng и др., 2008; Ruigrok и др., 2010; Varich и др., 2009; Ye и др., 2006). Фосфорилирование может регулировать полимеризацию NP и его связывание с РНК в инфицированной клетке (Chenavas и др., 2013). Также найдены в вирионе небольшие количества белка NEP/NS2 (Akarsu и др., 2003). Согласно данным протеомики, минорные количества различных белков клетки также могут входить в состав вирионов (Shaw и др., 2008). Два белка - неструктурный белок NS1 (Bornholdt & Prasad, 2008; Romanova и др., 2009) и фактор патогенности PB1-F2 (Chen и др., 2001; Conenello & Palese, 2007) обнаруживают только в зараженной клетке.

Поверхностные гликобелки вируса гриппа выполняют три функции: узнавание рецептора на поверхности клетки, опосредование слияния вирусной и клеточной мембран и разрушение рецептора. У вирусов гриппа А и В первые две активности осуществляются НА, а третья - вторым белком, NA. В случае вируса гриппа С гликопротеин HEF (англ. hemagglutinin-esterase-fusion) выполняет все три функции поверхностных гликобелков (Vlasak и др., 1987).

В отличие от вируса гриппа А, у вируса гриппа В есть два типа ионных каналов: один из них образуется белком ВМ2, сходным по функции и происхождению с белком М2, а второй - белком NB - продуктом сегмента 6, отвечающего за синтез нейраминидазы (Betakova & Kollerova, 2006). В оболочке вируса гриппа С ионный канал образован минорным белком СМ2.

1.3. Оболочка вириона: липиды клеточной мембраны и вирус-специфические белки

Вирион приобретает оболочку на стадии «выпочковывания». В зависимости от компартмента клетки, где происходит сборка вирионов, разные клеточные мембраны могут участвовать в этом процессе. Так, в случае вируса гепатита С ЭПР и специфические органеллы - «липидные капли» (англ. lipid droplet) могут служить местом сборки вирионов (Miyanari и др., 2007). Многие другие семейства оболочечных вирусов, включая ортомиксовирусы, выпочковываются с апикальной поверхности плазматической мембраны клетки, которая согласно популярной теории последнего десятилетия гетерогенна — включает кластеры липидных молекул и белков с разными физико-химическим свойствами (Gerl и др., 2012).

Гипотетические домены мембраны - «рафты» (от англ. raft - плот) (Simons & Ikonen, 1997) характеризуются плотной упорядоченной (англ. liquid-ordered) упаковкой липидных молекул (Lingwood & Simons, 2010; Risselada & Marrink, 2008). Такую упаковку рафтам обеспечивают в первую очередь молекулы с «жесткой» структурой - холестерин и сфинголипиды, а также глицерофосфолипиды с остатками ж.к. без двойных связей (Epand и др., 2010). Напротив, менее упорядоченные жидко-кристаллические (англ. liquid-disordered) области не-рафтовых областей бедны холестерином и обогащены глицерофосфолипидами с остатками полиненасыщенных ж.к. (Рис. 2). Полагают, что рафты клеточных мембран - динамичные структуры, размер которых может варьировать (10-200 нм). В клетках в их формировании принимает участие актиновый цитоскелет.

Сфинголипид

7 Глицеро-фосфолипид

Рис. 2. Липиды и мембранные рафты. А: Представлена химическая структура представителя класса глицерофосфолипидов с ненасыщенной связью в одном «хвосте» (пальмитоил-олеоил-фосфатидилхолин), сфинголипидов (сфингомиелин) и молекулы холестерина. Заряженные головки липидных молекул обведены овальными контурами. Б: Сфинголипиды и холестерин характеризуются склонностью образовывать упорядоченную мембранную структуру - липидный рафт. Адаптировно из (Veit & Thaa, 201 lb).

Существуют многочисленные доказательства того, что рафтовые домены мембраны вовлечены в сборку инфекционных частиц вируса гриппа (Fiedler и др., 1993; Harder и др., 1998; Scheiffele и др., 1997, 1999; Shvartsman и др., 2003; Zhang и др., 2000). Если это так, то оболочка вириона должна быть обогащена холестерином и сфинголипидами (относительно состава липидов клеточной мембраны). Количественный анализа «липидома» вируса гриппа подтвердил эту гипотезу. Соотношение холестерин/ глицерофосфолипиды/ сфинголипиды (в мольных %) в оболочке вириона гриппа составило 52/29/19, а во фракции апикальных мембран и суммарной фракции мембран клеток линии МДСК - 45/41/14 и 28/64/8, соответственно (Gerl и др., 2012). Вирионы HIV, как и вирионы гриппа, обогащены липидами, образующими рафтовые домены (Brugger и др., 2006). Напротив, липидный состав вирионов SFV и VSV (выпочковывающихся не из рафтов) практически не отличался от суммарных липидов плазматической мембраны фибробластов линии ВНК (Kalvodova и др., 2009).

Сборка вирионов вируса гриппа инициируется кластеризацией в рафтах двух основных интегральных белков оболочки - НА и NA (Hess и др., 2005, 2007; Zhang и др., 2000; Schmitt & Lamb, 2005). Третий интегральный белок оболочки - М2 - локализован на краю зоны выпочковывания и, по недавним данным, играет ведущую роль в «отшнуровке» вириона от клеточной мембраны (Schroeder и др., 2005; Rossman и др., 2010). Матриксный белок Ml, по-видимому, «рекрутируется» в рафты взаимодействиями с «рафтовыми» белками НА и NA (Рис. 3).

Ж* к*

vRNP M1

плазматическая мембрана

Рис. 3. Схематическое изображение сборки вирусных белков и рибонуклеопротеидных частиц (vRNP) у сайта отпочковывания. Обозначены остатки жирных кислот (ж.к.), присоединенные к гемагглютинину. Серым цветом на мембране обозначены рафтовые домены, где предположительно осуществляется сборка вирусных белков. Адаптировано из (Veit & Schmidt, 2006).

На Рис. 4 схематически представлены первичная структура (А) и топология (Б) белков оболочки вируса гриппа. Наряду с интегральными белками НА, NA, М2, к белкам оболочки мы относим и мембран-ассоциированный белок Ml. Отметим, что во всех интегральных белках обнаружены сигналы локализации в рафтах: гидрофобные а.о. на N-конце TM-домена (Scheiffele и др., 1997; Tall и др., 2003; Takeda & Lamb, 2003) и S-ацилирование (Melkonian и др., 1999) НА; С-концевая область ТМ-домена NA (Barman и др., 2000); S-ацилирование и холестерин-связывающий мотив в амфифильной a-спирали М2 (Thaa и др., 2010, 2011, 2012).

Аминокислотные остатки |-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-Г—>

О 100

НА

200 300 400 300

TMR

II "А,

1-S-«-1 II

NA

М2

М1

Г~~■ I I

Б

НА

Рис. 4. Схематичное изображение белков, входящих в состав оболочки вириона вируса гриппа. А: Первичная структура гемагглютинина (НА, включает цепи НА1 и НА2; при этом отщепляется N-концевой сигнальный пептид — белый прямоугольник), нейраминидазы (NA), М2 (амфифильная а-спираль показана черным прямоугольником) и мембран-асоциированного белка М1. TM-домены показаны серыми прямоугольниками, S-ацилирование НА и М2 обозначено линиями в виде зигзагов, сигнальный пептид и пептид слияния в полипептиде НА обозначены белым и голубым прямоугольниками, соответственно. Б: Топология НА (белок I типа), NA (II типа), М2 (III типа) и М1 в мембране; красными овалами указаны области, где расположены охарактеризованные сигналы локализации белка в липидных доменах - рафтах: (1) гидрофобные а.о. во внешней части ТМ-домена; (2) S-ацилирование НА; (3) наружная область TM-домена NA; (4) S-ацилирование и холестерин-связывающий мотив в амфифильной а-спирали М2. Модель структуры белка М1 показана согласно (Shishkov и др., 2009); предположительно обращенная к мембране область показана красным. Для облегчения восприятия изображены мономеры интегральных белков. Адаптировано из (Veit & Thaa, 201 lb).

Описанию структуры НА и его свойств уделено особое внимание в обзоре литературы. В конце главы будут кратко охарактеризованы другие белки оболочки и их взаимодействия с НА.

1.3.1. Гемагглютинин

Молекула НА синтезируется в инфицированной клетке как интегральный белок I типа и включает 561-568 аминокислотных остатков (а.о.) Первые 17 а.о. образуют сигнальный пептид, который ко-трансляционно отрезается после транспорта полипептидной цепи в люмен эндоплазматического ретикулума (ЭПР) как в случае экзоцитоза клеточных белков I типа (Лузиков, 2006; Luo, 2012). В люмене ЭПР происходит фолдинг и тримеризация большого N-концевого эктодомена НА. Гомотример НА следует по секреторному пути к апикальной поверхности (эпителиальной) клетки, после чего он оказывается в экстраклеточном пространстве. В ЭПР и аппарате Гольджи эктодомен НА пост-трансляционно N-гликозилируется, а к специфическим остаткам цистеина в С-концевой области молекулы присоединяются остатки насыщенных жирных кислот (S-ацилирование) (Veit, 2012).

Молекула-предшественник НАО подвергается протеолитическому процессингу - расщеплению на цепи НА1 и НА2, которые остаются связанными одной дисульфидной связью. Этот этап является необходимым в патогенезе вируса, поскольку в результате процессинга высвобождается «пептид слияния», локализованный на N-конце НА2-цепи. Расщепление НАО выполняется внутри- или экстраклеточными протеазами организма-хозяина, либо протеазами бактерий (Bertram и др., 2010; Böttcher-Friebertshäuser и др., 2013; Chaipan и др., 2009; Kido и др., 2007; Okumura и др., 2010). У низкопатогенных штаммов сайт протеолиза включает один остаток аргинина, который элиминируется после расщепления предшественника (Klenk & Rott, 1988). Увеличение числа основных а.о. в сайте расщепления является важным фактором патогенности (Vey и др., 1992; Klenk, 2007).

1.3.1.1. Пространственная структура эктодомена

Гемагглютинин вируса гриппа А

На ранних этапах изучения белкового состава и структуры вирионов вируса гриппа успешно применяли ограниченный протеолиз различными протеолитическими ферментами (Compans и др., 1970; Schulze, 1970). Эктодомены НА для их дальнейшей кристаллизации получали с помощью цистеиновой протеиназы бромелаина из стебля ананаса (Brand & Skehel, 1972). Фрагмент ВНА (от англ. Bromelain-treated НА) включает полную цепь НА1 (а.о. 1-328 у подтипа НЗ) и область эктодомена НА2 (а.о. 1-175) (Dopheide & Ward, 1891).

Структура трех конформаций ВНА вируса A/Hong Kong/1968 (H3N2) была определена методом рентгеноструктурного анализа (РСА), включая нерасщепленный одноцепочечный предшественник, НАО (Chen и др., 1998); метастабильную конформацию белка в составе вирусной оболочки при нейтральном pH (Wilson и др., 1981) и растворимый фрагмент при кислом pH (без «пептида слияния», гидрофобного N-концевого пептида цепи НА2) (Bullough и др., 1994; Chen и др., 1999; Park и др., 2003).

При нейтральном pH в закристаллизованном фрагменте ВНА локализованы позиции а-С-атомов 4-328 НА1 и 1-175 HLA2. «Шип» НА представляет собой вытянутый цилиндр протяженностью 135Ä с треугольным поперечным сечением переменного радиуса от 15 до 40Ä и имеет мол. вес 225 kDa (Wilson и др., 1981; Рис. 5). Структура разделена на два участка: (1) длинная нитевидная область, содержащая остатки и НА2, и НА1, которая центрирована на трехнитевой супер-спирали из а-спиралей протяженностью 76Ä, простирающейся от поверхности мембраны; на N-конце НА2 цепи содержится т.н. пептид слияния; (2) глобулярная область, содержащая только остатки НА1, расположенная на вершине стержня и включающая 8-тяжевую ß-структуру. В данной области локализованы сайт

связывания с рецепторами клетки-хозяина и антигенные детерминанты, т.е. участки молекулы, задействованные в связывании с антителами.

Рис. 5. Схематическое изображение трехмерной структуры гемагглютинина вируса гриппа A/Hong Kong/1968 (подтип НЗ) (Wilson и др., 1981) с указанием антигенных сайтов согласно (Wiley и др., 1981).

Каждая мономерная молекула содержит шесть дисульфидых связей, только одна из которых соединяет цепи НА1 и НА2 (Waterfield и др., 1981). Положение этих связей было определено в трехмерной структуре гемагглютинина с разрешением 3 Ä (Wilson и др., 1981). Каждая мономерная молекула эктодомена гемагглютинина содержит семь сайтов гликозилирования (Рис. 5) с общей массой углеводных остатков 13000 Да (19 % по массе) (Wilson и др., 1981).

После публикации 3-D-структуры гемагглютинина подтипа НЗ при

нейтральном pH в 1981 году последовал более чем 20-летний перерыв до

кристаллизации эктодоменов гемагглютинина других подтипов. При этом

20

было понятно, что НА подтипов НЗ, Н2 и HI настолько сильно различаются по структуре, что «наложение» карты антигенных детерминант, например, НА подтипа HI на известную ЗБ-структуру подтипа НЗ сопряжено со значительными погрешностями/искажениями (Catón и др., 1982). Новый виток интереса в этой области диктовался эпидемической ситуацией, особенно с возникновением опасности эпидемии «птичьего» гриппа подтипа Н5, а также из-за вспышек инфицирования вирусами подтипов Н7 и Н9. На сегодняшний день в базе данных PDB представлены 3D-структуры для многих антигенных подтипов НА вируса гриппа A: Hl, Н2, НЗ, Н5, Н7, Н9, HI4, включая РСА-структуры нерасщепленных предшественников и тримера НА1-НА2 субъединиц, связанных дисульфидной связью (На и др., 2002, 2003; Stevens, 2004; Yang и др., 2010b), а также антиген последней пандемии (2009 HINlpdm), разрешенный с помощью криоэлектронной томографии неаосредственно на поверхности вирусных частиц (Harris и др., 2013). В обзор (Skehel, 2007) дополнительно включены ЗО-структуры Н4, Н6 и Н13 НА. Различные антигенные подтипы НА закристализованы в комплексе с аналогами клеточных рецепторов (Eissen и др., 1997; На и др., 2001; Liu и др., 2009; Stevens и др., 2006; Skehel & Wiley, 2000; Xiong, 2013а, 2013b, 2013с; Yang и др., 2010а, 2010b, 2012), нейтрализующими антителами (Sui и др., 2008; Xu и др., 2013); ингибитором слияния терт-бутилгидрохиноном {tert-butyl hydroquinone, TBHQ (Russell и др., 2008)).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кордюкова, Лариса Валентиновна, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Арбатский НП, Желтова АО, Юртов ДВ, Деревицкая ВА, Кочетков НК. Последовательное выделение гемагглютинина и нейраминидазы из вируса гриппа А/Краснодар/101/59 (Н2Ы2) с помощью бромелаина. Доклады Академии Наук СССР. 1989; 306(6): 1490-1493.

2. Боравлева ЕЮ, Ломакина НФ, Кропоткина ЕА, Руднева ИА, Ямникова СС, Руденко ЛГ, Дрыгин ВВ, Гамбарян АС. Получение и характеристика реассортантного вируса гриппа А с гемагглютинином Н5 и остальными генами от апатогенного вируса Н6Ы2. Вопросы вирусологии. 2011; 56(6):9-14.

3. Игнатьева АВ, Руднева ИА, Тимофеева ТА, Шилов АА, Забережный АД, Алипер ТИ, Каверин НВ, Львов ДК. Высокопродуктивный вирус-реассортант, содержащий гемагглютинин и нейраминидазу пандемического вируса гриппа А/Мозсо\¥/01/2009(НШ1). Вопросы вирусологии. 2011; 56(4):9-14.

4. Килбурн Э. Будущие гриппозные вакцины и использование генетических рекомбинантов. Бюллетень ВОЗ. Грипп Гонконг. 1969; 41(3-5): 657-659.

5. Крылов ПС, Руднева ИА, Тимофеева ТА, Шилов АА, Игнатьева АВ, Говоркова ЕА, Каверин НВ. Аминокислотные замены в гемагглютинине вируса гриппа подтипа Н5, влияющие на антигенную специфичность и вирулентность вируса. Вопросы вирусологии. 2009; 54(5):14-19.

6. Ксенофонтов АЛ, Добров ЕН, Федорова НВ, Радюхин ВА, Бадун ГА, Арутюнян АМ, Богачева ЕН, Баратова ЛА. Неупорядоченные области в структуре С-домена белка М1 вируса гриппа. Молекулярная биология. 2011; 45(4):689-696.

7. Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии. Москва: Изд-во БИНОМ, Лаборатория знаний. 2003; 493 с.

8. Лузиков В.Н. Экзоцитоз белков. Москва: ИКЦ «Академкнига». 2006; 253 с.

9. Степанов В. М., Лысогорская Е. Н., Филиппова И. Ю., Оксенойт Е. С., Люблинская Л. А. // А. с. 1198082 (СССР). Заявл. 02. 07. 84 № 3762288/23-04. Опубл. в Б.И. 1985; № 46.

10. Тимофеева ТА, Игнатьева AB, Руднева ИА, Мочалова ЛВ, Бовин HB, Каверин HB. Влияние мутаций, меняющих антигенную специфичность, на рецептор-связывающую активность гемагглютинина вирусов гриппа А подтипов HI и Н5. Вопросы вирусологии. 2013; 58(1):24-27.

11. Хабибуллина НФ, Люкманова ЕН, Копеина ГС, Шенкарев ЗО, Арсеньев АС, Долгих ДА, Кирпичников МП. Разработка и оптимизация сопряженной бесклеточной системы синтеза трансмембранного домена рецепторной тирокиназы ЕгЬВЗ. Биоорганическая химия. 2010; 36(5):654-660.

12. Acharya R, Carnevale V, Fiorin G, Levine BG, Polishchuk AL, Balannik V, Samish I, Lamb RA, Pinto LH, DeGrado WF, Klein ML. Structure and mechanism of proton transport through the transmembrane tetrameric M2 protein bundle of the influenza A virus. Proc Natl Acad Sei U S A. 2010; 107(34): 15075-15080.

13. Air GM. Sequence relationships among the hemagglutinin genes of 12 subtypes of influenza A virus. Proc Natl Acad Sei USA. 1981; 78(12):7639-7643.

14. Akarsu H, Burmeister WP, Petosa C, Petit I, Müller CW, Ruigrok RW, Baudin F. Crystal structure of the Ml protein-binding domain of the influenza A virus nuclear export protein (NEP/NS2). EMBO J. 2003; 22(18):4646-4655.

15. Ali A, Avalos RT, Ponimaskin E, Nayak DP. Influenza virus assembly: effect of influenza virus glycoproteins on the membrane association of Ml protein. J Virol. 2000; 74(18):8709-8719.

16. An Y, Cipollo JF. An unbiased approach for analysis of protein glycosylation and application to influenza vaccine hemagglutinin. Anal Biochem. 2011; 415(l):67-80.

17. Armstrong RT, Kushnir AS, White JM. The transmembrane domain of influenza hemagglutinin exhibits a stringent length requirement to support the hemifusion to fusion transition. J Cell Biol. 2000; 151(2):425-437.

18. Arnold K, Bordoli L, Kopp J, Schwede T. The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics. 2006; 22(2):195-201.

19. Arzt S, Baudin F, Barge A, Timmins P, Burmeister WP, Ruigrok RW. Combined results from solution studies on intact influenza virus Ml protein and from a new crystal form of its N-terminal domain show that Ml is an elongated monomer. Virology. 2001; 279(2):439-446.

20. Baker AT, Varghese JN, Laver WG, Air GM, Colman PM. Three-dimensional structure of neuraminidase of subtype N9 from an avian influenza virus. Proteins. 1987; 2(2): 111-117.

21. Baker NA, Sept D, Joseph S, Hoist MJ, McCammon JA. Electrostatics of nanosystems: application to microtubules and the ribosome. Proc Natl Acad Sci USA. 2001; 98(18):10037-10041.

22. Barman S, Adhikary L, Chakrabarti AK, Bernas C, Kawaoka Y, Nayak DP. Role of transmembrane domain and cytoplasmic tail amino acid sequences of influenza a virus neuraminidase in raft association and virus budding. J Virol. 2004; 78(10):5258-5269.

23. Barman S, Ali A, Hui EK, Adhikary L, Nayak DP. Transport of viral proteins to the apical membranes and interaction of matrix protein with glycoproteins in the assembly of influenza viruses. Virus Res. 2001; 77(l):61-69.

24. Barman S, Nayak DP. Analysis of the transmembrane domain of influenza virus neuraminidase, a type II transmembrane glycoprotein, for apical sorting and raft association. J Virol. 2000; 74(14):6538-6545.

25. Baudin F, Petit I, Weissenhorn W, Ruigrok RW. In vitro dissection of the membrane and RNP binding activities of influenza virus Ml protein. Virology. 2001; 281(1): 102-108.

26. Berger M, Schmidt MF. Cell-free fatty acid acylation of Semliki Forest viral polypeptides with microsomal membranes from eukaryotic cells. J Biol Chem. 1984; 259(11):7245-7252.

27. Bertram S, Glowacka I, Steffen I, Kiihl A, Pôhlmann S. Novel insights into proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutinin. Rev Med Virol. 2010; 20(5):298-310.

28. Bijlmakers MJ, Marsh M. The on-off story of protein palmitoylation. Trends Cell Biol. 2003; 13(l):32-42.

29. Betâkovâ T, Kollerovâ E. pH modulating activity of ion channels of influenza A, B, and C viruses. Acta Virol. 2006; 50(3): 187-193.

30. Bizebard T, Gigant B, Rigolet P, Rasmussen B, Diat O, Bôsecke P, Wharton SA, Skehel JJ, Knossow M. Structure of influenza virus haemagglutinin complexed with a neutralizing antibody. Nature. 1995; 376(6535):92-94.

31. Blake TA, Williams TL, Pirkle JL, Barr JR. Targeted N-linked glycosylation analysis of H5N1 influenza hemagglutinin by selective sample preparation and liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Anal Chem. 2009; 81(8):3109-118.

32. Blaskovic S, Blanc M, van der Goot FG. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS J. 2013; 280(12):2766-2774.

33. Boriskin YS, Leneva IA, Pécheur EI, Polyak SJ. Arbidol: a broad-spectrum antiviral compound that blocks viral fusion. Curr Med Chem. 2008; 15(10):997-1005.

34. Bornholdt ZA, Prasad BV. X-ray structure of NS1 from a highly pathogenic H5N1 influenza virus. Nature. 2008; 456(7224):985-988.

35. Borrego-Diaz E, Peeples ME, Markosyan RM, Melikyan GB, Cohen FS. Completion of trimeric hairpin formation of influenza virus hemagglutinin

promotes fusion pore opening and enlargement. Virology. 2003; 316(2):234-244.

36. Böttcher C, Ludwig K, Herrmann A, van Heel M, Stark H. Structure of influenza haemagglutinin at neutral and at fusogenic pH by electron cryo-microscopy. FEBS Lett. 1999; 463(3):255-259.

37. Böttcher-Friebertshäuser E, Klenk HD, Garten W. Activation of influenza viruses by proteases from host cells and bacteria in the human airway epithelium. PathogDis. 2013; doi: 10.1111/2049-632X. 12053.

38. Boulay F, Doms RW, Webster RG, Helenius A. Posttranslational oligomerization and cooperative acid activation of mixed influenza hemagglutinin trimers. J Cell Biol. 1988; 106(3):629-639.

39. Brand CM, Skehel JJ. Crystalline antigen from the influenza virus envelope. Nat New Biol. 1972; 238(83):145-147.

40. Brewer CB, Roth MG. A single amino acid change in the cytoplasmic domain alters the polarized delivery of influenza virus hemagglutinin. J Cell Biol. 1991; 114(3):413-421.

41. Brown JN, Palermo RE, Baskin CR, Gritsenko M, Sabourin PJ, Long JP, Sabourin CL, Bielefeldt-Ohmann H, García-Sastre A, Albrecht R, Tumpey TM, Jacobs JM, Smith RD, Katze MG. Macaque proteome response to highly pathogenic avian influenza and 1918 reassortant influenza virus infections. J Virol. 2010; 84(22): 12058-12068.

42. Brügger B, Glass B, Haberkant P, Leibrecht I, Wieland FT, Kräusslich HG. The HIV lipidome: a raft with an unusual composition. Proc Natl Acad Sei U S A. 2006; 103(8):2641-2646.

43. Bullough PA, Hughson FM, Skehel JJ, Wiley DC. Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. Nature. 1994; 371(6492):37-43.

44. Burleigh LM, Calder LJ, Skehel JJ, Steinhauer DA. Influenza a viruses with mutations in the ml helix six domain display a wide variety of morphological

phenotypes. J Virol. 2005; 79(2): 1262-1270.

195

45. Burmeister WP, Ruigrok RW, Cusack S. The 2.2 A resolution crystal structure of influenza B neuraminidase and its complex with sialic acid. EMBO J. 1992; ll(l):49-56.

46. Caballero M, Carabaña J, Ortego J, Fernández-Muñoz R, Celma ML. Measles virus fusion protein is palmitoylated on transmembrane-intracytoplasmic cysteine residues which participate in cell fusion. J Virol. 1998; 72(10):8198-8204.

47. Calder LJ, Wasilewski S, Berriman JA, Rosenthal PB. Structural organization of a filamentous influenza A virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010; 107(23): 10685-10690.

48. Carr CM, Kim PS. A spring-loaded mechanism for the conformational change of influenza hemagglutinin. Cell. 1993; 73(4):823-832.

49. Catón AJ, Brownlee GG, Yewdell JW, Gerhard W. The antigenic structure of the influenza virus A/PR/8/34 hemagglutinin (HI subtype). Cell. 1982; 31(2 Pt 1):417-427.

50. Chaipan C, Kobasa D, Bertram S, Glowacka I, Steffen I, Tsegaye TS, Takeda M, Bugge TH, Kim S, Park Y, Marzi A, Pohlmann S. Proteolytic activation of the 1918 influenza virus hemagglutinin. J Virol. 2009; 83(7):3200-3211.

51. Chang DK, Cheng SF, Kantchev EA, Lin CH, Liu YT. Membrane interaction and structure of the transmembrane domain of influenza hemagglutinin and its fusion peptide complex. BMC Biol. 2008; 6:2.

52. Charollais J, Van Der Goot FG. Palmitoylation of membrane proteins (Review). Mol Membr Biol. 2009; 26(l):55-66.

53. Chen BJ, Leser GP, Jackson D, Lamb RA. The influenza virus M2 protein cytoplasmic tail interacts with the Ml protein and influences virus assembly at the site of virus budding. J Virol. 2008; 82(20): 10059-10070.

54. Chen BJ, Leser GP, Morita E, Lamb RA. Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase, but not the matrix protein, are required for assembly and budding of plasmid-derived virus-like particles. J Virol. 2007; 81(13):7111-7123.

55. Chen BJ, Takeda M, Lamb RA. Influenza virus hemagglutinin (H3 subtype) requires palmitoylation of its cytoplasmic tail for assembly: Ml proteins of two subtypes differ in their ability to support assembly. J Virol. 2005; 79(21): 13673-13684.

56. Chen J, Lee KH, Steinhauer DA, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC. Structure of the hemagglutinin precursor cleavage site, a determinant of influenza pathogenicity and the origin of the labile conformation. Cell. 1998; 95(3):409-417.

57. Chen J, Skehel JJ, Wiley DC. N- and C-terminal residues combine in the fusion-pH influenza hemagglutinin HA(2) subunit to form an N cap that terminates the triple-stranded coiled coil. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96(16):8967-8972.

58. Chen W, Calvo PA, Malide D, Gibbs J, Schubert U, Bacik I, Basta S, O'Neill R, Schickli J, Palese P, Henklein P, Bennink JR, Yewdell JW. A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death. Nat Med. 2001; 7(12):1306-1312.

59. Chenavas S, Estrozi LF, Slama-Schwok A, Delmas B, Di Primo C, Baudin F, Li X, Crepin T, Ruigrok RW. Monomeric nucleoprotein of influenza A virus. PLoS Pathog. 2013; 9(3):el003275.

60. Chernomordik LV, Kozlov MM. Protein-lipid interplay in fusion and fission of biological membranes. Annu Rev Biochem. 2003; 72:175-207.

61. Choe Y, Leonetti F, Greenbaum DC, Lecaille F, Bogyo M, Bromme D, Ellman J A, Craik CS. Substrate profiling of cysteine proteases using a combinatorial peptide library identifies functionally unique specificities. J Biol Chem. 2006; 281(18):12824-12832.

62. Collins PJ, Haire LF, Lin YP, Liu J, Russell RJ, Walker PA, Martin SR, Daniels RS, Gregory V, Skehel JJ, Gamblin SJ, Hay AJ. Structural basis for oseltamivir resistance of influenza viruses. Vaccine. 2009; 27(45):6317-6323.

63. Collins PJ, Haire LF, Lin YP, Liu J, Russell RJ, Walker PA, Skehel JJ, Martin SR, Hay AJ, Gamblin SJ. Crystal structures of oseltamivir-resistant influenza virus neuraminidase mutants. Nature. 2008; 453(7199): 1258-1261.

64. Colman PM. New antivirals and drug resistance. Annu Rev Biochem. 2009; 78:95-118.

65. Colman PM, Varghese JN, Laver WG. Structure of the catalytic and antigenic sites in influenza virus neuraminidase. Nature. 1983; 303(5912):41-44.

66. Compans RW, Klenk HD, Caliguiri LA, Choppin PW. Influenza virus proteins. I. Analysis of polypeptides of the virion and identification of spike glycoproteins. Virology. 1970; 42(4):880-889.

67. Conenello GM, Palese P. Influenza A virus PB1-F2: a small protein with a big punch. Cell Host Microbe. 2007; 2(4):207-209.

68. Coombs KM, Berard A, Xu W, Krokhin O, Meng X, Cortens JP, Kobasa D, Wilkins J, Brown EG. Quantitative proteomic analyses of influenza virus-infected cultured human lung cells. J Virol. 2010; 84(20):10888-10906.

69. Copeland CS, Doms RW, Bolzau EM, Webster RG, Helenius A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. J Cell Biol. 1986; 103(4):1179-1191.

70. Cross KJ, Burleigh LM, Steinhauer DA. Mechanisms of cell entry by influenza virus. Expert Rev Mol Med. 2001; 3(21):1-18.

71. Cross TA, Dong H, Sharma M, Busath DD, Zhou HX. M2 protein from influenza A: from multiple structures to biophysical and functional insights. Curr Opin Virol. 2012; 2(2): 128-133.

72. de Vries RP, Smit CH, de Bruin E, Rigter A, de Vries E, Cornelissen LA, Eggink D, Chung NP, Moore JP, Sanders RW, Hokke CH, Koopmans M, Rottier PJ, de Haan CA. Glycan-dependent immunogenicity of recombinant soluble trimeric hemagglutinin. J Virol. 2012; 86(21):11735-11744.

73. Deyde VM, Sampath R, Garten RJ, Blair PJ, Myers CA, Massire C, Matthews

H, Svoboda P, Reed MS, Pohl J, Klimov AI, Gubareva LV. Genomic

signature-based identification of influenza A viruses using RT-PCR/electro-

198

spray ionization mass spectrometry (ESI-MS) technology. PLoS One. 2010; 5(10):el3293.

74. Deyde VM, Sampath R, Gubareva LV. RT-PCR/electrospray ionization mass spectrometry approach in detection and characterization of influenza viruses. Expert Rev Mol Diagn. 2011; ll(l):41-52.

75. Dolinsky TJ, Czodrowski P, Li H, Nielsen JE, Jensen JH, Klebe G, Baker NA. PDB2PQR: expanding and upgrading automated preparation of biomolecular structures for molecular simulations. Nucleic Acids Res. 2007; 35(Web Server issue):W522-525.

76. Dopheide TA, Ward CW. The location of the bromelain cleavage site in a Hong Kong influenza virus Haemagglutinin. J Gen Virol. 1981; 52(Pt 2):367-370.

77. Dosztanyi Z, Csizmok V, Tompa P, Simon I. IUPred: web server for the prediction of intrinsically unstructured regions of proteins based on estimated energy content. Bioinformatics. 2005; 21(16):3433-3434.

78. Downard KM. Proteotyping for the rapid identification of influenza virus and other biopathogens. Chem Soc Rev. 2013a; 42(22):8584-8595.

79. Downard KM. An immunoproteomics approach to screen the antigenicity of the influenza virus. Methods Mol Biol. 2013b; 1061:141-153.

80. Downard KM, Morrissey B, Schwahn AB. Mass spectrometry analysis of the influenza virus. Mass Spectrom Rev. 2009; 28(l):35-49.

81. Drisdel RC, Green WN. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 2004; 36(2):276-285.

82. Duncan JA, Gilman AG. Autoacylation of G protein alpha subunits. J Biol Chem. 1996; 271(38):23594-23600.

83. Eckert DM, Kim PS. Mechanisms of viral membrane fusion and its inhibition. Annu Rev Biochem. 2001; 70:777-810.

84. Edgar RC. MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity. BMC Bioinformatics. 2004; 5:113.

85. Eisen MB, Sabesan S, Skehel JJ, Wiley DC. Binding of the influenza A virus to cell-surface receptors: structures of five hemagglutinin-sialyloligosaccharide complexes determined by X-ray crystallography. Virology. 1997; 232(1): 19-31.

86. Enami M, Enami K. Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase glycoproteins stimulate the membrane association of the matrix protein. J Virol. 1996; 70(10):6653-6657.

87. Engel S, Scolari S, Thaa B, Krebs N, Korte T, Herrmann A, Veit M. FLIM-FRET and FRAP reveal association of influenza virus haemagglutinin with membrane rafts. Biochem J. 2010; 425(3):567-573.

88. Epand RM, Epand RF. Thermal denaturation of influenza virus and its relationship to membrane fusion. Biochem J. 2002; 365(Pt 3):841-848.

89. Epand RM, Thomas A, Brasseur R, Epand RF. Cholesterol interaction with proteins that partition into membrane domains: an overview. Subcell Biochem. 2010; 51:253-278.

90. Fiedler K, Kobayashi T, Kurzchalia TV, Simons K. Glycosphingolipid-enriched, detergent-insoluble complexes in protein sorting in epithelial cells. Biochemistry. 1993; 32(25):6365-6373.

91. Filippova IYu, Lysogorskaya EN, Oksenoit ES, Rudenskaya GN, Stepanov VM. L-Pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-leucine-p-nitroanilide—a chromogenic substrate for thiol proteinase assay. Anal Biochem. 1984; 143(2):293-297.

92. Fleming EH, Kolokoltsov AA, Davey RA, Nichols JE, Roberts NJ Jr. Respiratory syncytial virus F envelope protein associates with lipid rafts without a requirement for other virus proteins. J Virol. 2006; 80(24): 1216012170.

93. Fontana J, Cardone G, Heymann JB, Winkler DC, Steven AC. Structural changes in Influenza virus at low pH characterized by cryo-electron tomography. J Virol. 2012; 86(6):2919-2929.

94. Fontana J, Steven AC. At low pH, influenza virus matrix protein Ml undergoes a conformational change prior to dissociating from the membrane. J Virol. 2013; 87(10):5621-5628.

95. Forrester MT, Hess DT, Thompson JW, Hultman R, Moseley MA, Stamler JS, Casey PJ. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. J Lipid Res. 2011; 52(2):393-398.

96. Fujiyoshi Y, Kume NP, Sakata K, Sato SB. Fine structure of influenza A virus observed by electron cryo-microscopy. EMBO J. 1994; 13(2):318-326.

97. Fukata Y, Fukata M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nat Rev Neurosci. 2010; 11(3): 161-175.

98. Gambaryan AS, Karasin AI, Tuzikov AB, Chinarev AA, Pazynina GV, Bovin NV, Matrosovich MN, Olsen CW, Klimov AI. Receptor-binding properties of swine influenza viruses isolated and propagated in MDCK cells. Virus Res. 2005a; 114(1-2): 15-22.

99. Gambaryan AS, Matrosovich TY, Philipp J, Munster VJ, Fouchier RA, Cattoli G, Capua I, Krauss SL, Webster RG, Banks J, Bovin NV, Klenk HD, Matrosovich MN. Receptor-binding profiles of H7 subtype influenza viruses in different host species. J Virol. 2012; 86(8):4370-4379.

100. Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G, Bovin N, Balish A, Klimov A. Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses. Virology. 2006; 344(2):432-438.

101. Gambaryan A, Yamnikova S, Lvov D, Tuzikov A, Chinarev A, Pazynina G, Webster R, Matrosovich M, Bovin N. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 2005b; 334(2):276-283.

102. Gamblin SJ, Haire LF, Russell RJ, Stevens DJ, Xiao B, Ha Y, Vasisht N, Steinhauer DA, Daniels RS, Elliot A, Wiley DC, Skehel JJ. The structure and receptor binding properties of the 1918 influenza hemagglutinin. Science. 2004; 303(5665): 1838-1842.

103. Garten W, Will C, Buckard K, Kuroda K, Ortmann D, Munk K, Scholtissek C, Schnittler H, Drenckhahn D, Klenk HD. Structure and assembly of hemagglutinin mutants of fowl plague virus with impaired surface transport. J Virol. 1992; 66(3): 1495-1505.

104. Ge M, Freed JH. Two conserved residues are important for inducing highly ordered membrane domains by the transmembrane domain of influenza hemagglutinin. Biophys J. 2011; 100(l):90-97.

105.Gerl MJ, Sampaio JL, Urban S, Kalvodova L, Verbavatz JM, Binnington B, Lindemann D, Lingwood CA, Shevchenko A, Schroeder C, Simons K. Quantitative analysis of the lipidomes of the influenza virus envelope and MDCK cell apical membrane. J Cell Biol. 2012; 196(2):213-221.

106. Getie-Kebtie M, Chen D, Eichelberger M, Alterman M. Proteomics-based characterization of hemagglutinins in different strains of influenza virus. Proteomics Clin Appl. 2009; 3(8):979-988.

107. Getie-Kebtie M, Sultana I, Eichelberger M, Alterman M. Label-free mass spectrometry-based quantification of hemagglutinin and neuraminidase in influenza virus preparations and vaccines. Influenza Other Respir Viruses. 2013; 7(4):521-530.

108. Gibbons DL, Kielian M. Molecular dissection of the Semliki Forest virus homotrimer reveals two functionally distinct regions of the fusion protein. J Virol. 2002; 76(3): 1194-1205.

109. Goh GK, Dunker AK, Uversky VN. Protein intrinsic disorder toolbox for comparative analysis of viral proteins. BMC Genomics. 2008 Sep 16; 9 Suppl 2:S4.

110. Goh GK, Dunker AK, Uversky VN. Protein intrinsic disorder and influenza virulence: the 1918 H1N1 and H5N1 viruses. Virol J. 2009 Jun 3; 6:69.

111. Gomez-Puertas P, Albo C, Perez-Pastrana E, Vivo A, Portela A. Influenza virus matrix protein is the major driving force in virus budding. J Virol. 2000; 74(24):11538-11547.

112. Gonzalez ME, Carrasco L. Viroporins. FEBS Lett. 2003; 552(l):28-34.

202

113. Gosalia DN, Salisbury CM, Maly DJ, Ellman JA, Diamond SL. Profiling serine protease substrate specificity with solution phase fluorogenic peptide microarrays. Proteomics. 2005; 5(5): 1292-1298.

114. Greaves J, Chamberlain LH. DHHC palmitoyl transferases: substrate interactions and (patho)physiology. Trends Biochem Sci. 2011; 36(5):245-253.

115. Greaves J, Prescott GR, Gorleku OA, Chamberlain LH. The fat controller: roles of palmitoylation in intracellular protein trafficking and targeting to membrane microdomains (Review). Mol Membr Biol. 2009; 26(l):67-79.

116. Gregoriades A. Interaction of influenza M protein with viral lipid and phosphatidylcholine vesicles. J Virol. 1980; 36(2):470-479.

117. Gregoriades A, Frangione B. Insertion of influenza M protein into the viral lipid bilayer and localization of site of insertion. J Virol. 1981; 40(l):323-328.

118.Gruenke J A, Armstrong RT, Newcomb WW, Brown JC, White JM. New insights into the spring-loaded conformational change of influenza virus hemagglutinin. J Virol. 2002; 76(9):4456-4466.

119. Ha JW, Downard KM. Evolution of H5N1 influenza virus through proteotyping of hemagglutinin with high resolution mass spectrometry. Analyst. 2011a; 136(16):3259-3267.

120. Ha JW, Schwahn AB, Downard KM. Proteotyping to establish gene origin within reassortant influenza viruses. PLoS One. 201 lb; 6(1):e 15771.

121. Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC. X-ray structures of H5 avian and H9 swine influenza virus hemagglutinins bound to avian and human receptor analogs. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(20): 11181-11186.

122. Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC. H5 avian and H9 swine influenza virus haemagglutinin structures: possible origin of influenza subtypes. EMBO J. 2002; 21(5):865-875.

123. Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC. X-ray structure of the hemagglutinin of a potential H3 avian progenitor of the 1968 Hong Kong pandemic influenza

virus. Virology. 2003; 309(2):209-218.

203

124. Hach JC, McMichael T, Chesarino NM, Yount JS. Palmitoylation on conserved and nonconserved cysteines of murine IFITM1 regulates its stability and anti-influenza A virus activity. J Virol. 2013; 87(17):9923-9927.

125. Hai R, Krammer F, Tan GS, Pica N, Eggink D, Maamary J, Margine I, Albrecht RA, Palese P. Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes. J Virol. 2012; 86(10):5774-5781.

126. Harder T, Scheiffele P, Verkade P, Simons K. Lipid domain structure of the plasma membrane revealed by patching of membrane components. J Cell Biol. 1998; 141(4):929-942.

127. Harris A, Cardone G, Winkler DC, Heymann JB, Brecher M, White JM, Steven AC. Influenza virus pleiomorphy characterized by cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103(50): 19123-19127.

128. Harris A, Forouhar F, Qiu S, Sha B, Luo M. The crystal structure of the influenza matrix protein Ml at neutral pH: Ml-Ml protein interfaces can rotate in the oligomeric structures of Ml. Virology. 2001; 289(l):34-44.

129. Harris AK, Meyerson JR, Matsuoka Y, Kuybeda O, Moran A, Bliss D, Das SR, Yewdell JW, Sapiro G, Subbarao K, Subramaniam S. Structure and accessibility of HA trimers on intact 2009 H1N1 pandemic influenza virus to stem region-specific neutralizing antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013; 110(12):4592-4597.

130. Harrison SC. Viral membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 2008; 15(7):690-698.

131. Harvey DJ. Proteomic analysis of glycosylation: structural determination of N-and O-linked glycans by mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 2005; 2(1):87-101.

132. Hernandez LD, Hoffman LR, Wolfsberg TG, White JM. Virus-cell and cell-cell fusion. Annu Rev Cell Dev Biol. 1996; 12:627-661.

133. Hess B, Kutzner C, van der Spoel D, Lindahl E. GROMACS 4: algorithms for highly efficient, load-balanced, and scalable molecular simulation. J Chem Theory Comput. 2008; 4:435-447.

134. Hess ST, Gould TJ, Gudheti MV, Maas SA, Mills KD, Zimmerberg J. Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104(44): 17370-17375.

135. Hess ST, Kumar M, Verma A, Farrington J, Kenworthy A, Zimmerberg J. Quantitative electron microscopy and fluorescence spectroscopy of the membrane distribution of influenza hemagglutinin. J Cell Biol. 2005; 169(6):965-976.

136. Hoffmann E, Neumann G, Kawaoka Y, Hobom G, Webster RG. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97(11):6108-6113.

137. Humphrey W, Dalke A, Schulten K. VMD: visual molecular dynamics. J Mol Graph. 1996; 14(l):33-38, 27-28.

138. Ilyushina NA, Bovin NV, Webster RG. Decreased neuraminidase activity is important for the adaptation of H5N1 influenza virus to human airway epithelium. J Virol. 2012; 86(9):4724-4733.

139. Ilyushina N, Rudneva I, Gambaryan A, Bovin N, Kaverin N. Monoclonal antibodies differentially affect the interaction between the hemagglutinin of H9 influenza virus escape mutants and sialic receptors. Virology. 2004a; 329(l):33-39.

140. Ilyushina NA, Rudneva IA, Gambaryan AS, Tuzikov AB, Bovin NV. Receptor specificity of H5 influenza virus escape mutants. Virus Res. 2004b; 100(2):237-241.

141. Ilyushina NA, Rudneva IA, Khalenkov AM, Timofeeva TA, Krylov PS,

Webster RG, Kaverin NV. Readaptation of a low-virulence influenza H9

escape mutant in mice: the role of changes in hemagglutinin as revealed by

site-specific mutagenesis. Arch Virol. 2010; 155(1): 107-110.

205

142. Ilyushina NA, Rudneva IA, Shilov AA, Klenk HD, Kaverin NV. Postreassortment changes in a model system: HA-NA adjustment in an H3N2 avian-human reassortant influenza virus. Arch Virol. 2005; 150(7): 1327-1338.

143. Imai M, Watanabe S, Kawaoka Y. The cytoplasmic tail domain of influenza B virus hemagglutinin is important for its incorporation into virions but is not essential for virus replication in cell culture in the presence of compensatory mutations. J Virol. 2012; 86(21 ): 11633-11644.

144.1sin B, Doruker P, Bahar I. Functional motions of influenza virus hemagglutinin: a structure-based analytical approach. Biophys J. 2002; 82(2):569-581.

145. Ito T, Gorman OT, Kawaoka Y, Bean WJ, Webster RG. Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the Ml and M2 proteins. J Virol. 1991; 65(10):5491-5498.

146.1valdi C, Martin BR, Kieffer-Jaquinod S, Chapel A, Levade T, Garin J, Journet A. Proteomic analysis of S-acylated proteins in human B cells reveals palmitoylation of the immune regulators CD20 and CD23. PLoS One. 2012; 7(5):e37187.

147. Iwatsuki-Horimoto K, Horimoto T, Noda T, Kiso M, Maeda J, Watanabe S, Muramoto Y, Fujii K, Kawaoka Y. The cytoplasmic tail of the influenza A virus M2 protein plays a role in viral assembly. J Virol. 2006; 80(11):5233-5240.

148.Jeng K, Massire C, Zembower TR, Deyde VM, Gubareva LV, Hsieh YH, Rothman RE, Sampath R, Penugonda S, Metzgar D, Blyn LB, Hardick J, Gaydos CA. Monitoring seasonal influenza A evolution: rapid 2009 pandemic H1N1 surveillance with an reverse transcription-polymerase chain reaction/electro-spray ionization mass spectrometry assay. J Clin Virol. 2012; 54(4):332-336.

149. Jennings BC, Linder ME. DHHC protein S-acyltransferases use similar ping-pong kinetic mechanisms but display different acyl-CoA specificities. J Biol Chem. 2012; 287(10):7236-7245.

150. Jin H, Leser GP, Zhang J, Lamb RA. Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase cytoplasmic tails control particle shape. EMBO J. 1997; 16(6):1236-1247.

151. Jin H, Subbarao K, Bagai S, Leser GP, Murphy BR, Lamb RA. Palmitylation of the influenza virus hemagglutinin (H3) is not essential for virus assembly or infectivity. J Virol. 1996; 70(3): 1406-1414.

152.Kalvodova L, Sampaio JL, Cordo S, Ejsing CS, Shevchenko A, Simons K. The lipidomes of vesicular stomatitis virus, semliki forest virus, and the host plasma membrane analyzed by quantitative shotgun mass spectrometry. J Virol. 2009; 83(16):7996-8003.

153.Kaverin NV, Gambaryan AS, Bovin NV, Rudneva IA, Shilov AA, Khodova OM, Varich NL, Sinitsin BV, Makarova NV, Kropotkina EA. Postreassortment changes in influenza A virus hemagglutinin restoring HA-NA functional match. Virology. 1998; 244(2):315-321.

154.Kaverin NV, Matrosovich MN, Gambaryan AS, Rudneva IA, Shilov AA, Varich NL, Makarova NV, Kropotkina EA, Sinitsin BV. Intergenic HA-NA interactions in influenza A virus: postreassortment substitutions of charged amino acid in the hemagglutinin of different subtypes. Virus Res. 2000; 66(2):123-129.

155.Kaverin NV, Rudneva I A, Govorkova EA, Timofeeva TA, Shilov AA, Kochergin-Nikitsky KS, Krylov PS, Webster RG. Epitope mapping of the hemagglutinin molecule of a highly pathogenic H5N1 influenza virus by using monoclonal antibodies. J Virol. 2007; 81(23): 12911-12917.

156. Kaverin NV, Rudneva IA, Ilyushina NA, Lipatov AS, Krauss S, Webster RG. Structural differences among hemagglutinins of influenza A virus subtypes are reflected in their antigenic architecture: analysis of H9 escape mutants. J Virol. 2004; 78(l):240-249.

157. Kaverin NV, Rudneva IA, Ilyushina NA, Varich NL, Lipatov AS, Smirnov YA, Govorkova EA, Gitelman AK, Lvov DK, Webster RG. Structure of antigenic sites on the haemagglutinin molecule of H5 avian influenza virus

and phenotypic variation of escape mutants. J Gen Virol. 2002; 83(Pt 10):2497-2505.

158.Keil W, Geyer R, Dabrowski J, Dabrowski U, Niemann H, Stirm S, Klenk HD. Carbohydrates of influenza virus. Structural elucidation of the individual glycans of the FPV hemagglutinin by two-dimensional 1H n.m.r. and methylation analysis. EMBO J. 1985; 4(10):2711-2720.

159.Kemble GW, Danieli T, White JM. Lipid-anchored influenza hemagglutinin promotes hemifusion, not complete fusion. Cell. 1994; 76(2):383-391.

160.Kido H, Okumura Y, Yamada H, Le TQ, Yano M. Proteases essential for human influenza virus entry into cells and their inhibitors as potential therapeutic agents. Curr Pharm Des. 2007; 13(4):405-414.

161. Kim CS, Epand RF, Leikina E, Epand RM, Chernomordik LV. The final conformation of the complete ectodomain of the HA2 subunit of influenza hemagglutinin can by itself drive low pH-dependent fusion. J Biol Chem. 2011; 286(15): 13226-13234.

162. Kim MJ, Yamamoto D, Matsumoto K, Inoue M, Ishida T, Mizuno H, Sumiya S, Kitamura K. Crystal structure of papain-E64-c complex. Binding diversity of E64-c to papain S2 and S3 subsites. Biochem J. 1992; 287(Pt 3):797-803.

163.Kiselar JG, Downard KM. Preservation and detection of specific antibody-peptide complexes by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 2000; 11(8):746-750.

164. Klenk H-D. Proteolytic cleavage of the influenzavirus hemagglutinin and other viral glycoproteins, in: Schmidt, M.F.G. (Ed.), Influenza Viruses - Facts and Perspectives. Grosse Verlag, Berlin, 2007, pp. 80-84.

165.Kokame K, Fukada Y, Yoshizawa T, Takao T, Shimonishi Y. Lipid modification at the N terminus of photoreceptor G-protein alpha-subunit. Nature. 1992; 359(6397):749-752.

166. Korte T, Ludwig K, Booy FP, Blumenthal R, Herrmann A. Conformational intermediates and fusion activity of influenza virus hemagglutinin. J Virol. 1999; 73(6):4567-4574.

167.Korte T, Ludwig K, Krumbiegel M, Zirwer D, Damaschun G, Herrmann A. Transient changes of the conformation of hemagglutinin of influenza virus at low pH detected by time-resolved circular dichroism spectroscopy. J Biol Chem. 1997; 272(15):9764-9770.

168.Kozlov MM, Chernomordik LV. The protein coat in membrane fusion: lessons from fission. Traffic. 2002; 3(4):256-267.

169. Kozlov MM, McMahon HT, Chernomordik LV. Protein-driven membrane stresses in fusion and fission. Trends Biochem Sci. 2010; 35(12):699-706.

170.Klenk HD, Rott R. The molecular biology of influenza virus pathogenicity. Adv Virus Res. 1988; 34:247-281.

171.Krammer F, Pica N, Hai R, Margine I, Palese P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 2013; 87(12):6542-6550.

172. Kummel D, Heinemann U, Veit M. Unique self-palmitoylation activity of the transport protein particle component Bet3: a mechanism required for protein stability. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103(34): 12701-12706.

173. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259):680-685.

174. Lakkaraju AK, Abrami L, Lemmin T, Blaskovic S, Kunz B, Kihara A, Dal Peraro M, van der Goot FG. Palmitoylated calnexin is a key component of the ribosome-translocon complex. EMBO J. 2012; 31(7):1823-1835.

175.Laliberte JP, McGinnes LW, Peeples ME, Morrison TG. Integrity of membrane lipid rafts is necessary for the ordered assembly and release of infectious Newcastle disease virus particles. J Virol. 2006; 80(21): 1065210662.

176. Lamb R.A. Genes and proteins of the influenza viruses. In: The Influenza viruses, ed. R.M. Krug (Plenum Press, New York/London). 1989; pp. 1-87.

177. Lamb RA. Deadly H7N9 influenza virus: a pandemic in the making or a warning lesson? Am J Respir Crit Care Med. 2013; 188(1): 1-2.

178. Lamb RA, Jardetzky TS. Structural basis of viral invasion: lessons from paramyxovirus F. Curr Opin Struct Biol. 2007; 17(4):427-436.

179. Lee KK. Architecture of a nascent viral fusion pore. EMBO J. 2010; 29(7): 1299-1311.

180. Leneva IA, Russell RJ, Boriskin YS, Hay AJ. Characteristics of arbidol-resistant mutants of influenza virus: implications for the mechanism of antiinfluenza action of arbidol. Antiviral Res. 2009; 81(2): 132-140.

181. Lescar J., Roussel A., Wien M.W., Navaza J., Fuller S.D., Wengler G., Wengler G., Rey F.A. (2001) The Fusion glycoprotein shell of Semliki Forest virus: an icosahedral assembly primed for fusogenic activation at endosomal pH. Cell, 105:137-148.

182.Levental I, Grzybek M, Simons K. Greasing their way: lipid modifications determine protein association with membrane rafts. Biochemistry. 2010a; 49(30):6305-6316.

183.Levental I, Lingwood D, Grzybek M, Coskun U, Simons K. Palmitoylation regulates raft affinity for the majority of integral raft proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 2010b; 107(51):22050-22054.

184. Li L, Dong L, Xia L, Li T, Zhong H. Chemical and genetic probes for analysis of protein palmitoylation. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2011; 879(17-18): 1316-1324.

185. Li M, Yang C, Tong S, Weidmann A, Compans RW. Palmitoylation of the murine leukemia virus envelope protein is critical for lipid raft association and surface expression. J Virol. 2002; 76(23): 11845-11852.

186. Li N, Shaw AR, Zhang N, Mak A, Li L. Lipid raft proteomics: analysis of insolution digest of sodium dodecyl sulfate-solubilized lipid raft proteins by liquid chromatography-matrix-assisted laser desorption/ionization tandem mass spectrometry. Proteomics. 2004; 4(10):3156-3166.

187. Li ZN, Lee BJ, Langley WA, Bradley KC, Russell RJ, Steinhauer DA. Length requirements for membrane fusion of influenza virus hemagglutinin peptide

linkers to transmembrane or fusion peptide domains. J Virol. 2008; 82(13):6337-6348.

188.Liao SY, Fritzsching KJ, Hong M. Conformational analysis of the full-length M2 protein of the influenza A virus using solid-state NMR. Protein Sci. 2013; doi: 10.1002/pro.2368.

189. Lin S, Nairn HY, Rodriguez AC, Roth MG. Mutations in the middle of the transmembrane domain reverse the polarity of transport of the influenza virus hemagglutinin in MDCK epithelial cells. J Cell Biol. 1998; 142(1):51-57.

190. Lin YP, Gregory V, Collins P, Kloess J, Wharton S, Cattle N, Lackenby A, Daniels R, Hay A. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment? J Virol. 2010; 84(13):6769-6781.

191.Linder ME, Deschenes RJ. Palmitoylation: policing protein stability and traffic. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007; 8(l):74-84.

192.Linder ME, Jennings BC. Mechanism and function of DHHC S-acyltransferases. Biochem Soc Trans. 2013; 41(l):29-34.

193.Lingwood D, Simons K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 2010; 327(5961):46-50.

194. Liu J, Stevens DJ, Haire LF, Walker PA, Coombs PJ, Russell RJ, Gamblin SJ, Skehel JJ. Structures of receptor complexes formed by hemagglutinins from the Asian Influenza pandemic of 1957. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106(40): 17175-17180.

195. Liu N, Song W, Wang P, Lee K, Chan W, Chen H, Cai Z. Proteomics analysis of differential expression of cellular proteins in response to avian H9N2 virus infection in human cells. Proteomics. 2008; 8(9): 1851 -1858.

196. Lun AT, Wong JW, Downard KM. FluShuffle and FluResort: new algorithms to identify reassorted strains of the influenza virus by mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 2012; 13:208.

197. Luo M. Influenza virus entry. Adv Exp Med Biol. 2012; 726:201-221.

198. Maes D, Bouckaert J, Poortmans F, Wyns L, Looze Y. Structure of chymopapain at 1.7 A resolution. Biochemistry. 1996; 35(50):16292-16298.

199. Markosyan RM, Cohen FS, Melikyan GB. The lipid-anchored ectodomain of influenza virus hemagglutinin (GPI-FLA) is capable of inducing nonenlarging fusion pores. MolBiol Cell. 2000; 11(4):1143-1152.

200. Martin BR, Wang C, Adibekian A, Tully SE, Cravatt BF. Global profiling of dynamic protein palmitoylation. Nat Methods. 2011; 9(l):84-89.

201. Mayer D, Molawi K, Martinez-Sobrido L, Ghanem A, Thomas S, Baginsky S, Grossmann J, Garcia-Sastre A, Schwemmle M. Identification of cellular interaction partners of the influenza virus ribonucleoprotein complex and polymerase complex using proteomic-based approaches. J Proteome Res. 2007; 6(2):672-682.

202. McBride CE, Machamer CE. Palmitoylation of SARS-CoV S protein is necessary for partitioning into detergent-resistant membranes and cell-cell fusion but not interaction with M protein. Virology. 2010; 405(1): 139-148.

203.Meldal M, Svendsen I, Breddam K, Auzanneau FI. Portion-mixing peptide libraries of quenched fluorogenic substrates for complete subsite mapping of endoprotease specificity. Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91(8):3314-3318.

204. Melikyan GB, Jin H, Lamb RA, Cohen FS. The role of the cytoplasmic tail region of influenza virus hemagglutinin in formation and growth of fusion pores. Virology. 1997; 235(1): 118-128.

205. Melikyan GB, Lin S, Roth MG, Cohen FS. Amino acid sequence requirements of the transmembrane and cytoplasmic domains of influenza virus hemagglutinin for viable membrane fusion. Mol Biol Cell. 1999; 10(6): 1821-1836.

206. Melikyan GB, Markosyan RM, Roth MG, Cohen FS. A point mutation in the transmembrane domain of the hemagglutinin of influenza virus stabilizes a hemifusion intermediate that can transit to fusion. Mol Biol Cell. 2000; 11(11):3765-3775.

207. Melkonian KA, Ostermeyer AG, Chen JZ, Roth MG, Brown DA. Role of lipid modifications in targeting proteins to detergent-resistant membrane rafts. Many raft proteins are acylated, while few are prenylated. J Biol Chem. 1999; 274(6):3910-3917.

208. Mineev KS, Khabibullina NF, Lyukmanova EN, Dolgikh DA, Kirpichnikov MP, Arseniev AS. Spatial structure and dimer—monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim Biophys Acta. 2011; 1808(8):2081-2088.

209. Mir-Shekari SY, Ashford DA, Harvey DJ, Dwek RA, Schulze IT. The glycosylation of the influenza A virus hemagglutinin by mammalian cells. A site-specific study. J Biol Chem. 1997; 272(7):4027-4036.

210. Miyanari Y, Atsuzawa K, Usuda N, Watashi K, Hishiki T, Zayas M, Bartenschlager R, Wakita T, Hijikata M, Shimotohno K. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 2007; 9(9):1089-1097.

211.Morozova D, Weiss M. On the role of acylation of transmembrane proteins. Biophys J. 2010; 98(5):800-804.

212. Mora R, Rodriguez-Boulan E, Palese P, García-Sastre A. Apical budding of a recombinant influenza A virus expressing a hemagglutinin protein with a basolateral localization signal. J Virol. 2002; 76(7):3544-3553.

213.Naeve CW, Williams D. Fatty acids on the A/Japan/305/57 influenza virus hemagglutinin have a role in membrane fusion. EMBO J. 1990; 9(12):3857-3866.

214. Nairn HY, Amarneh B, Ktistakis NT, Roth MG. Effects of altering palmitylation sites on biosynthesis and function of the influenza virus hemagglutinin. J Virol. 1992; 66(12):7585-7588.

215. Nasser ZH, Swaminathan K, Müller P, Downard KM. Inhibition of influenza hemagglutinin with the antiviral inhibitor arbidol using a proteomics based approach and mass spectrometry. Antiviral Res. 2013; 100(2):399-406.

216.Nayak DP, Hui EK, Barman S. Assembly and budding of influenza virus. Virus Res. 2004; 106(2): 147-165.

217.Nayak DP, Balogun RA, Yamada H, Zhou ZH, Barman S. Influenza virus morphogenesis and budding. Virus Res. 2009; 143(2):147-161.

218.Newhouse EI, Xu D, Markwick PR, Amaro RE, Pao HC, Wu KJ, Alam M, McCammon JA, Li WW. Mechanism of glycan receptor recognition and specificity switch for avian, swine, and human adapted influenza virus hemagglutinins: a molecular dynamics perspective. J Am Chem Soc. 2009; 131(47):17430-17442.

219. Nguyen AP, Downard KM. Subtyping of influenza neuraminidase using mass spectrometry. Analyst. 2013; 138(6): 1787-1793.

220.Nobusawa E, Aoyama T, Kato H, Suzuki Y, Tateno Y, Nakajima K. Comparison of complete amino acid sequences and receptor-binding properties among 13 serotypes of hemagglutinins of influenza A viruses. Virology. 1991; 182(2):475-485.

221. Noton SL, Medcalf E, Fisher D, Mullin AE, Elton D, Digard P. Identification of the domains of the influenza A virus Ml matrix protein required for NP binding, oligomerization and incorporation into virions. J Gen Virol. 2007; 88(Pt 8):2280-2290.

222. Ng AK, Zhang H, Tan K, Li Z, Liu JH, Chan PK, Li SM, Chan WY, Au SW, Joachimiak A, Walz T, Wang JH, Shaw PC. Structure of the influenza virus A H5N1 nucleoprotein: implications for RNA binding, oligomerization, and vaccine design. FASEB J. 2008; 22(10):3638-3647.

223. Okumura Y, Takahashi E, Yano M, Ohuchi M, Daidoji T, Nakaya T, Bottcher E, Garten W, Klenk HD, Kido H. Novel type II transmembrane serine proteases, MSPL and TMPRSS13, Proteolytically activate membrane fusion activity of the hemagglutinin of highly pathogenic avian influenza viruses and induce their multicycle replication. J Virol. 2010; 84(10):5089-5096.

224. Park HE, Gruenke JA, White JM. Leash in the groove mechanism of membrane fusion. Nat Struct Biol. 2003; 10(12): 1048-1053.

225. Patel M, Kayani IS, Mellor GW, Sreedharan S, Templeton W, Thomas EW, Thomas M, Brocklehurst K. Variation in the P2-S2 stereochemical selectivity towards the enantiomeric N-acetylphenylalanylglycine 4-nitroanilides among the cysteine proteinases papain, ficin and actinidin. Biochem J. 1992; 281(Pt2):553-559.

226. Paulson JC, de Vries RP. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 2013 Apr 22. doirpii: S0168-1702(13)00119-6.

227. Peitzsch RM, McLaughlin S. Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry. 1993; 32(39):10436-10443.

228. Peterson GL. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Anal Biochem. 1977; 83(2):346-356.

229. Philipp HC, Schroth B, Veit M, Krumbiegel M, Herrmann A, Schmidt MF. Assessment of fusogenic properties of influenza virus hemagglutinin deacylated by site-directed mutagenesis and hydroxylamine treatment. Virology. 1995; 210(l):20-28.

230. Philpott M, Hioe C, Sheerar M, Hinshaw VS. Hemagglutinin mutations related to attenuation and altered cell tropism of a virulent avian influenza A virus. J Virol. 1990; 64(6):2941-2947.

231. Pielak RM, Chou JJ. Solution NMR structure of the V27A drug resistant mutant of influenza A M2 channel. Biochem Biophys Res Commun. 2010; 401(l):58-63.

232. Pielak RM, Chou JJ. Influenza M2 proton channels. Biochim Biophys Acta. 2011; 1808(2):522-529.

233. Pierce CL, Williams TL, Moura H, Pirkle JL, Cox NJ, Stevens J, Donis RO, Barr JR. Quantification of immunoreactive viral influenza proteins by immunoaffinity capture and isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Chem. 2011; 83(12):4729-4737.

234. Pica N, Palese P. Toward a universal influenza virus vaccine: prospects and

challenges. Annu Rev Med. 2013; 64:189-202.

215

235. Pickl WF, Pimentel-Muinos FX, Seed B. Lipid rafts and pseudotyping. J Virol. 2001; 75(15):7175-7183.

236. Ping J, Li C, Deng G, Jiang Y, Tian G, Zhang S, Bu Z, Chen H. Single-amino-acid mutation in the HA alters the recognition of H9N2 influenza virus by a monoclonal antibody. Biochem Biophys Res Commun. 2008; 371(1):168-171.

237.Politis EG, Roth AF, Davis NG. Transmembrane topology of the protein palmitoyl transferase Akrl. J Biol Chem. 2005; 280(11): 10156-10163.

238.Polyansky AA, Volynsky PE, Efremov RG. Structural, dynamic, and functional aspects of helix association in membranes: a computational view. Adv Protein Chem Struct Biol. 2011; 83:129-161.

239. Ponimaskin E, Schmidt MF. Domain-structure of cytoplasmic border region is main determinant for palmitoylation of influenza virus hemagglutinin (H7). Virology. 1998; 249(2):325-335.

240. Pyrkov TV, Chugunov AO, Krylov NA, Nolde DE, Efremov RG. PLATINUM: a web tool for analysis of hydrophobic/hydrophilic organization of biomolecular complexes. Bioinformatics. 2009; 25(9):1201-1202.

241. Quevillon-Cheruel S, Leulliot N, Muniz CA, Vincent M, Gallay J, Argentini M, Cornu D, Boccard F, Lemaitre B, van Tilbeurgh H. Evf, a virulence factor produced by the Drosophila pathogen Erwinia carotovora, is an S-palmitoylated protein with a new fold that binds to lipid vesicles. J Biol Chem. 2009; 284(6):3552-3562.

242.Reid AH, Fanning TG, Janczewski TA, McCall S, Taubenberger JK. Characterization of the 1918 "Spanish" influenza virus matrix gene segment. J Virol. 2002; 76(21): 10717-10723.

243. Ren J, Wen L, Gao X, Jin C, Xue Y, Yao X. CSS-Palm 2.0: an updated software for palmitoylation sites prediction. Protein Eng Des Sel. 2008; 21(11):639-644.

244. Reverey H, Veit M, Ponimaskin E, Schmidt MF. Differential fatty acid selection during biosynthetic S-acylation of a transmembrane protein (HEF)

and other proteins in insect cells (Sf9) and in mammalian cells (CV1). J Biol Chem. 1996; 271(39):23607-23610.

245. Risselada HJ, Marrink SJ. The molecular face of lipid rafts in model membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(45): 17367-17372.

246. Roberts KL, Leser GP, Ma C, Lamb RA. The amphipathic helix of influenza A virus M2 protein is required for filamentous bud formation and scission of filamentous and spherical particles. J Virol. 2013; 87(18):9973-9982.

247. Rocks O, Gerauer M, Vartak N, Koch S, Huang ZP, Pechlivanis M, Kuhlmann J, Brunsveld L, Chandra A, Ellinger B, Waldmann H, Bastiaens PI. The palmitoylation machinery is a spatially organizing system for peripheral membrane proteins. Cell. 2010; 141(3):458-471.

248. Romanova J, Krenn BM, Wolschek M, Ferko B, Romanovskaja-Romanko E, Morokutti A, Shurygina AP, Nakowitsch S, Ruthsatz T, Kiefmann B, Konig U, Bergmann M, Sachet M, Balasingam S, Mann A, Oxford J, Slais M, Kiselev O, Muster T, Egorov A. Preclinical evaluation of a replication-deficient intranasal DeltaNSl H5N1 influenza vaccine. PLoS One. 2009; 4(6):e5984.

249. Rosenthal PB, Zhang X, Formanowski F, Fitz W, Wong CH, Meier-Ewert H, Skehel JJ, Wiley DC. Structure of the haemagglutinin-esterase-fusion glycoprotein of influenza C virus. Nature. 1998; 396(6706):92-96.

250. Rossman JS, Jing X, Leser GP, Balannik V, Pinto LH, Lamb RA. Influenza virus m2 ion channel protein is necessary for filamentous virion formation. J Virol. 2010a; 84(10):5078-5088.

251. Rossman JS, Jing X, Leser GP, Lamb RA. Influenza virus M2 protein mediates ESCRT-independent membrane scission. Cell. 2010b; 142(6):902-913.

252. Rossman JS, Lamb RA. Influenza virus assembly and budding. Virology. 2011; 411(2):229-236.

253. Rossman JS, Lamb RA. Viral membrane scission. Annu Rev Cell Dev Biol. 2013; 29:551-569.

254. Rowan AD, Buttle DJ, Barrett AJ. The cysteine proteinases of the pineapple plant. Biochem J. 1990; 266(3):869-875.

255.Ruan B, London V, Fisher KE, Gallagher DT, Bryan PN. Engineering substrate preference in subtilisin: structural and kinetic analysis of a specificity mutant. Biochemistry. 2008; 47(25):6628-6636.

256.Rudneva I, Ignatieva A, Timofeeva T, Shilov A, Kushch A, Masalova O, Klimova R, Bovin N, Mochalova L, Kaverin N. Escape mutants of pandemic influenza A/H1N1 2009 virus: variations in antigenic specificity and receptor affinity of the hemagglutinin. Virus Res. 2012; 166(l-2):61-67.

257.Rudneva IA, Kovaleva VP, Varich NL, Farashyan VR, Gubareva LV, Yamnikova SS, Popova I A, Presnova VP, Kaverin NV. Influenza A virus reassortants with surface glycoprotein genes of the avian parent viruses: effects of HA and NA gene combinations on virus aggregation. Arch Virol. 1993; 133:437-450.

258. Rudneva IA, Kushch AA, Masalova OV, Timofeeva TA, Klimova RR, Shilov AA, Ignatieva AV, Krylov PS, Kaverin NV. Antigenic epitopes in the hemagglutinin of Qinghai-type influenza H5N1 virus. Viral Immunol. 2010; 23(2): 181-187.

259. Rudneva IA, Timofeeva TA, Shilov AA, Kochergin-Nikitsky KS, Varich NL, Ilyushina NA, Gambaryan AS, Krylov PS, Kaverin NV. Effect of gene constellation and postreassortment amino acid change on the phenotypic features of H5 influenza virus reassortants. Arch Virol. 2007; 152(6): 11391145.

260. Ruigrok RW, Barge A, Durrer P, Brunner J, Ma K, Whittaker GR. Membrane interaction of influenza virus Ml protein. Virology. 2000; 267(2):289-298.

261. Ruigrok RW, Crépin T, Hart DJ, Cusack S. Towards an atomic resolution understanding of the influenza virus replication machinery. Curr Opin Struct Biol. 2010; 20(1): 104-113.

262.Russ G, Bennink JR, Bâchi T, Yewdell JW. Influenza virus hemagglutinin

trimers and monomers maintain distinct biochemical modifications and

218

intracellular distribution in brefeldin A-treated cells. Cell Regul. 1991; 2(7):549-563.

263.Russell CJ, Kantor KL, Jardetzky TS, Lamb RA. A dual-functional paramyxovirus F protein regulatory switch segment: activation and membrane fusion. J Cell Biol. 2003;163(2):363-374.

264. Russell RJ, Gamblin SJ, Haire LF, Stevens DJ, Xiao B, Ha Y, Skehel JJ. HI and H7 influenza haemagglutinin structures extend a structural classification of haemagglutinin subtypes. Virology. 2004; 325(2):287-296.

265. Russell RJ, Haire LF, Stevens DJ, Collins PJ, Lin YP, Blackburn GM, Hay A J, Gamblin SJ, Skehel J J. The structure of H5N1 avian influenza neuraminidase suggests new opportunities for drug design. Nature. 2006; 443(7107):45-49.

266. Russell RJ, Kerry PS, Stevens DJ, Steinhauer DA, Martin SR, Gamblin SJ, Skehel JJ. Structure of influenza hemagglutinin in complex with an inhibitor of membrane fusion. ProcNatl Acad Sci USA. 2008; 105(46): 17736-17741.

267. Russell RJ, Stevens DJ, Haire LF, Gamblin SJ, Skehel JJ. Avian and human receptor binding by hemagglutinins of influenza A viruses. Glycoconj J. 2006; 23(l-2):85-92.

268. Sakai T, Ohuchi R, Ohuchi M. Fatty acids on the A/USSR/77 influenza virus hemagglutinin facilitate the transition from hemifusion to fusion pore formation. J Virol. 2002; 76(9):4603-4611.

269. Sampath R, Russell KL, Massire C, Eshoo MW, Harpin V, Blyn LB, Melton R, Ivy C, Pennella T, Li F, n ^p. Global surveillance of emerging Influenza virus genotypes by mass spectrometry. PLoS One. 2007; 2(5):e489.

270. Schechter I, Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain. Biochem Biophys Res Commun. 1967; 27(2):157-162.

271. Scheiffele P, Rietveld A, Wilk T, Simons K. Influenza viruses select ordered lipid domains during budding from the plasma membrane. J Biol Chem. 1999; 274(4):2038-2044.

272. Scheiffele P, Roth MG, Simons K. Interaction of influenza virus haemagglutinin with sphingolipid-cholesterol membrane domains via its transmembrane domain. EMBO J. 1997; 16(18):5501-5508.

273. Schlesinger MJ, Magee AI, Schmidt MF. Fatty acid acylation of proteins in cultured cells. J Biol Chem. 1980; 255(21): 10021-10024.

274. Schmidt MF. The transfer of myristic and other fatty acids on lipid and viral protein acceptors in cultured cells infected with Semliki Forest and influenza virus. EMBO J. 1984; 3(10):2295-2300.

275. Schmidt MF, Schlesinger MJ. Fatty acid binding to vesicular stomatitis virus glycoprotein: a new type of post-translational modification of the viral glycoprotein. Cell. 1979; 17(4):813-819.

276. Schmitt AP, Lamb RA. Influenza virus assembly and budding at the viral budozone. Adv Virus Res. 2005; 64:383-416.

277. Scholtissek C. Stability of infectious influenza A viruses at low pH and at elevated temperature. Vaccine. 1985; 3(3 Suppl):215-218.

278. Scholtissek C, Stech J, Krauss S, Webster RG. Cooperation between the hemagglutinin of avian viruses and the matrix protein of human influenza A viruses. J Virol. 2002; 76(4): 1781-1786.

279. Schroeder C. Cholesterol-binding viral proteins in virus entry and morphogenesis. Subcell Biochem. 2010; 51:77-108.

280. Schroeder C, Heider H, Moncke-Buchner E, Lin TI. The influenza virus ion channel and maturation cofactor M2 is a cholesterol-binding protein. Eur Biophys J. 2005; 34(l):52-66.

281. Schulze IT. The structure of influenza virus. I. The polypeptides of the virion. Virology. 1970; 42(4):890-904.

282. Schwahn AB, Downard KM. Proteotyping to establish the lineage of type A H1N1 and type B human influenza virus. J Virol Methods. 2011; 171(1): 117122.

283. Schwahn AB, Downard KM. Antigenicity of a type A influenza virus through comparison of hemagglutination inhibition and mass spectrometry immunoassays. J Immunoassay Immunochem. 2009; 30(3):245-261.

284. Schwahn AB, Wong JW, Downard KM. Signature peptides of influenza nucleoprotein for the typing and subtyping of the virus by high resolution mass spectrometry. Analyst. 2009; 134(11):2253-2261.

285. Schwahn AB, Wong JW, Downard KM. Typing of human and animal strains of influenza virus with conserved signature peptides of matrix Ml protein by high resolution mass spectrometry. J Virol Methods. 2010a; 165(2): 178-185.

286. Schwahn AB, Wong JW, Downard KM. Rapid typing and subtyping of vaccine strains of the influenza virus with high resolution mass spectrometry. Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 2010b; 16(3):321-329.

287. Schwahn AB, Wong JW, Downard KM. Rapid differentiation of seasonal and pandemic H1N1 influenza through proteotyping of viral neuraminidase with mass spectrometry. Anal Chem. 2010c; 82(11):4584-4590.

288. Scolari S, Engel S, Krebs N, Plazzo AP, De Almeida RF, Prieto M, Veit M, Herrmann A. Lateral distribution of the transmembrane domain of influenza virus hemagglutinin revealed by time-resolved fluorescence imaging. J Biol Chem. 2009; 284(23):15708-15716.

289. Sha B, Luo M. Structure of a bifunctional membrane-RNA binding protein, influenza virus matrix protein Ml. Nat Struct Biol. 1997; 4(3):239-244.

290. Sharma M, Yi M, Dong H, Qin H, Peterson E, Busath DD, Zhou HX, Cross TA. Insight into the mechanism of the influenza A proton channel from a structure in a lipid bilayer. Science. 2010; 330(6003):509-512.

291. Shaw ML, Stone KL, Colangelo CM, Gulcicek EE, Palese P. Cellular proteins in influenza virus particles. PLoS Pathog. 2008; 4(6):el000085.

292. Shishkov AV, Bogacheva EN, Dolgov AA, Chulichkov AL, Knyazev DG, Fedorova NV, Ksenofontov AL, Kordyukova LV, Lukashina EV, Mirsky VM, Baratova LA. The in situ structural characterization of the influenza A

virus matrix Ml protein within a virion. Protein Pept Lett. 2009; 16(11): 14071413.

293. Shishkov A, Bogacheva E, Fedorova N, Ksenofontov A, Badun G, Radyukhin V, Lukashina E, Serebryakova M, Dolgov A, Chulichkov A, Dobrov E, Baratova L. Spatial structure peculiarities of influenza A virus matrix Ml protein in an acidic solution that simulates the internal lysosomal medium. FEBS J. 2011; 278(24):4905-4916.

294. Shishkov AV, Goldanskii VI, Baratova LA, Fedorova NV, Ksenofontov AL, Zhirnov OP, Galkin AV. The in situ spatial arrangement of the influenza A virus matrix protein Ml assessed by tritium bombardment. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96(14):7827-7830.

295. Shvartsman DE, Kotler M, Tall RD, Roth MG, Henis YI. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J Cell Biol. 2003; 163(4):879-888.

296. Siezen RJ, Leunissen JA. Subtilases: the superfamily of subtilisin-like serine proteases. Protein Sci. 1997; 6(3):501-523.

297. Simons K, Ikonen E. Functional rafts in cell membranes. Nature. 1997; 387(6633):569-572.

298. Simpson DA, Lamb RA. Alterations to influenza virus hemagglutinin cytoplasmic tail modulate virus infectivity. J Virol. 1992; 66(2):790-803.

299. Skehel J. Influenza hemagglutinin structure and antogenicity. Experientia. 1986; 42:89. Birkhaeuser Verlag. CH-4010 Basel/Switzerland.

300. Skehel J J, Wiley DC. Structure of the haemagglutinin-esterase-fusion glycoprotein of influenza C virus. Nature. 1998; 396(6706):92-96.

301. Skehel JJ, Wiley DC. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 2000; 69:531-569.

302. Skehel JJ. Recent structural studies of influenza haemagglutinin, in: Schmidt, M.F.G. (Ed.), Influenza Viruses - Facts and Perspectives. Grosse Verlag, Berlin, 2007, pp. 88-94.

303. Sklyanskaya EI, Shie M, Komarov YS, Yamnikova SS, Kaverin NV. Formation of mixed hemagglutinin trimers in the course of double infection with influenza viruses belonging to different subtypes. Virus Res. 1988; 10(2-3): 153-165.

304. Smotrys JE, Linder ME. Palmitoylation of intracellular signaling proteins: regulation and function. Annu Rev Biochem. 2004; 73:559-587.

305. Song JM, Choi CW, Kwon SO, Compans RW, Kang SM, Kim SI. Proteomic characterization of influenza H5N1 virus-like particles and their protective immunogenicity. J Proteome Res. 2011; 10(8):3450-3459.

306. Steel J, Lowen AC, Wang TT, Yondola M, Gao Q, Haye K, Garcia-Sastre A, Palese P. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. MBio. 2010; 1(1).

307. Stegmann T, Helenius A. In: Viral Fusion Mechanisms, ed. Bentz J. (CRC, Boca Raton, FL). 1993; pp.89-111.

308. Steinhauer DA, Wharton SA, Wiley DC, Skehel JJ. Deacylation of the hemagglutinin of influenza A/Aichi/2/68 has no effect on membrane fusion properties. Virology. 1991; 184(l):445-448.

309. Steinmetz AC, Demuth HU, Ringe D. Inactivation of subtilisin Carlsberg by N-((tert-butoxycarbonyl)alanylprolylphenylalanyl)-0-benzoylhydroxyl-amine: formation of a covalent enzyme-inhibitor linkage in the form of a carbamate derivative. Biochemistry. 1994; 33(34): 10535-10544.

310. Stevens J, Blixt O, Tumpey TM, Taubenberger JK, Paulson JC, Wilson IA. Structure and receptor specificity of the hemagglutinin from an H5N1 influenza virus. Science. 2006; 312(5772):404-410.

311. Stevens J, Corper AL, Basler CF, Taubenberger JK, Palese P, Wilson IA. Structure of the uncleaved human HI hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 2004; 303(5665):1866-1870.

312.Sugrue RJ, Belshe RB, Hay AJ. Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein. Virology. 1990; 179(1):51-56.

313. Sugrue RJ, Hay AJ. Structural characteristics of the M2 protein of influenza A viruses: evidence that it forms a tetrameric channel. Virology. 1991; 180(2):617-624.

314. Sui J, Hwang WC, Perez S, Wei G, Aird D, Chen LM, Santelli E, Stec B, Cadwell G, Ali M, Wan H, Murakami A, Yammanuru A, Han T, Cox NJ, Bankston LA, Donis RO, Liddington RC, Marasco WA. Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Mol Biol. 2009; 16(3):265-273.

315. Swaminathan K, Downard KM. Anti-viral inhibitor binding to influenza neuraminidase by MALDI mass spectrometry. Anal Chem. 2012; 84(8):3725-3730.

316. Swaminathan K, Dyason JC, Maggioni A, von Itzstein M, Downard KM. Binding of a natural anthocyanin inhibitor to influenza neuraminidase by mass spectrometry. Anal Bioanal Chem. 2013; 405(20):6563-6572.

317.Takeda M, Leser GP, Russell CJ, Lamb RA. Influenza virus hemagglutinin concentrates in lipid raft microdomains for efficient viral fusion. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100(25):14610-14617.

318. Tall RD, Alonso MA, Roth MG. Features of influenza HA required for apical sorting differ from those required for association with DRMs or MAL. Traffic. 2003; 4(12):838-849.

319. Tatu U, Hammond C, Helenius A. Folding and oligomerization of influenza hemagglutinin in the ER and the intermediate compartment. EMBO J. 1995; 14(7):1340-1348.

320. Tatulian SA, Tamm LK. Secondary structure, orientation, oligomerization, and lipid interactions of the transmembrane domain of influenza hemagglutinin. Biochemistry. 2000; 39(3):496-507.

321.Thaa B, Herrmann A, Veit M. The polybasic region is not essential for membrane binding of the matrix protein Ml of influenza virus. Virology. 2009; 383(1):150-155.

322. Thaa B, Herrmann A, Veit M. Intrinsic cytoskeleton-dependent clustering of influenza virus M2 protein with hemagglutinin assessed by FLIM-FRET. J Virol. 2010; 84(23): 12445-12449.

323. Thaa B, Levental I, Herrmann A, Veit M. Intrinsic membrane association of the cytoplasmic tail of influenza virus M2 protein and lateral membrane sorting regulated by cholesterol binding and palmitoylation. Biochem J. 2011; 437(3):389-397.

324. Thaa B, Tielesch C, Moller L, Schmitt AO, Wolff T, Bannert N, Herrmann A, Veit M. Growth of influenza A virus is not impeded by simultaneous removal of the cholesterol-binding and acylation sites in the M2 protein. J Gen Virol. 2012; 93(Pt 2):282-292.

325. Tom CT, Martin BR. Fat chance! Getting a grip on a slippery modification. ACS Chem Biol. 2013; 8(l):46-57.

326. Tomatis VM, Trenchi A, Gomez GA, Daniotti JL. Acyl-protein thioesterase 2 catalyzes the deacylation of peripheral membrane-associated GAP-43. PLoS One. 2010; 5(1 l):el5045.

327. Tong S, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DA, Chen LM, Recuenco S, Ellison JA, Davis CT, York IA, h ^p., A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci USA. 2012; 109(11):4269-4274.

328. Tsuchiya E, Sugawara K, Hongo S, Matsuzaki Y, Muraki Y, Li ZN, Nakamura K. Antigenic structure of the haemagglutinin of human influenza A/H2N2 virus. J Gen Virol. 2001; 82(Pt 10):2475-2484.

329. Turk D, Guncar G, Podobnik M, Turk B. Revised definition of substrate binding sites of papain-like cysteine proteases. Biol Chem. 1998; 379(2): 137147.

330. Turk D, Turk B, Turk V. Papain-like lysosomal cysteine proteases and their inhibitors: drug discovery targets? Biochem Soc Symp. 2003; (70): 15-30.

331.Ujike M, Nakajima K, Nobusawa E. Influence of acylation sites of influenza B virus hemagglutinin on fusion pore formation and dilation. J Virol. 2004; 78(21):11536-11543.

332. Uversky VN. Natively unfolded proteins: a point where biology waits for physics. Protein Sei. 2002; 11(4):739-756.

333. Vanderlinden E, Naesens L. Emerging Antiviral Strategies to Interfere with Influenza Virus Entry. Med Res Rev. 2013; doi: 10.1002/med.21289.

334. Varghese JN, Laver WG, Colman PM. Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neuraminidase at 2.9 A resolution. Nature. 1983; 303(5912):35-40.

335. Varich NL, Kochergin-Nikitsky KS, Usachev EV, Usacheva OV, Prilipov AG, Webster RG, Kaverin NV. Location of antigenic sites recognized by monoclonal antibodies in the influenza A virus nucleoprotein molecule. J Gen Virol. 2009; 90(Pt 7):1730-1733.

336. Veit M. Palmitoylation of the 25-kDa synaptosomal protein (SNAP-25) in vitro occurs in the absence of an enzyme, but is stimulated by binding to syntaxin. Biochem J. 2000; 345(Pt 1):145-151.

337. Veit M. Palmitoylation of virus proteins. Biol Cell. 2012; 104(9):493-515.

338. Veit M, Engel S, Thaa B, Scolari S, Herrmann A. Lipid domain association of influenza virus proteins detected by dynamic fluorescence microscopy techniques. Cell Microbiol. 2013; 15(2): 179-189.

339. Veit M, Herrler G, Schmidt MF, Rott R, Klenk HD. The hemagglutinating glycoproteins of influenza B and C viruses are acylated with different fatty acids. Virology. 1990; 177(2):807-811.

340. Veit M, Klenk HD, Kendal A, Rott R. The M2 protein of influenza A virus is acylated. J Gen Virol. 1991a; 72(Pt 6):1461-1465.

341. Veit M, Kretzschmar E, Kuroda K, Garten W, Schmidt MF, Klenk HD, Rott R. Site-specific mutagenesis identifies three cysteine residues in the cytoplasmic tail as acylation sites of influenza virus hemagglutinin. J Virol. 1991b; 65(5):2491-2500.

342. Veit M, Ponimaskin E, Schmidt MF. Analysis of S-acylation of proteins. Methods Mol Biol. 2008; 446:163-182.

343. Veit M, Reverey H, Schmidt MF. Cytoplasmic tail length influences fatty acid selection for acylation of viral glycoproteins. Biochem J. 1996; 318(Pt 1 ): 163172.

344. Veit M, Schmidt MF. Enzymatic depalmitoylation of viral glycoproteins with acyl-protein thioesterase 1 in vitro. Virology. 2001; 288(l):89-95.

345. Veit M, Schmidt MF. Palmitoylation of influenza virus proteins. Berl Munch Tierarztl Wochenschr. 2006; 119(3-4):112-122.

346. Veit M, Schmidt MF. Timing of palmitoylation of influenza virus hemagglutinin. FEBS Lett. 1993; 336(2):243-247.

347. Veit M, Thaa B. Association of influenza virus proteins with membrane rafts. Adv Virol. 2011a; 2011:370606.

348. Veit M, Thaa B. Protein Association with Membrane Rafts. In: eLS. (John Wiley & Sons, Ltd: Chichester). 2011b. doi: 10.1002/9780470015902.a0023404.

349.Vester D, Rapp E, Gade D, Genzel Y, Reichl U. Quantitative analysis of cellular proteome alterations in human influenza A virus-infected mammalian cell lines. Proteomics. 2009; 9(12):3316-3327.

350. Vester D, Rapp E, Kluge S, Genzel Y, Reichl U. Virus-host cell interactions in vaccine production cell lines infected with different human influenza A virus variants: a proteomic approach. J Proteomics. 20105; 73(9):1656-1669.

351. Vey M, Orlich M, Adler S, Klenk HD, Rott R, Garten W. Hemagglutinin activation of pathogenic avian influenza viruses of serotype H7 requires the protease recognition motif R-X-K/R-R. Virology. 1992; 188(1):408-413.

352. Vincent S, Gerlier D, Manié SN. Measles virus assembly within membrane rafts. J Virol. 2000; 74(21):9911-9915.

353. Vlasak R, Krystal M, Nacht M, Palese P. The influenza C virus glycoprotein (HE) exhibits receptor-binding (hemagglutinin) and receptor-destroying (esterase) activities. Virology. 1987; 160(2):419-425.

354. Wagner R, Herwig A, Azzouz N, Klenk HD. Acylation-mediated membrane anchoring of avian influenza virus hemagglutinin is essential for fusion pore formation and virus infectivity. J Virol. 2005; 79(10):6449-6458.

355. Wagner R, Matrosovich M, Klenk HD. Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections. Rev Med Virol. 2002; 12(3):159-166.

356. Wan J, Roth AF, Bailey AO, Davis NG. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nat Protoc. 2007; 2(7): 1573-1584.

357. Wang J, Qiu JX, Soto C, DeGrado WF. Structural and dynamic mechanisms for the function and inhibition of the M2 proton channel from influenza A virus. Curr Opin Struct Biol. 2011; 21 (1 ):68-80.

358. Wang Q, Cheng F, Lu M, Tian X, Ma J. Crystal structure of unliganded influenza B virus hemagglutinin. J Virol. 2008; 82(6):3011-3020.

359. Wang Q, Tian X, Chen X, Ma J. Structural basis for receptor specificity of influenza B virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104(43): 16874-16879.

360. Wang K, Xie S, Sun B. Viral proteins function as ion channels. Biochim Biophys Acta. 2011; 1808(2):510-515.

361. Ward JJ, McGuffin LJ, Bryson K, Buxton BF, Jones DT. The DISOPRED server for the prediction of protein disorder. Bioinformatics. 2004; 20(13):2138-2139.

362. Waterfield M, Scrace G, Skehel J. Disulphide bonds of haemagglutinin of Asian influenza virus. Nature. 1981; 289(5796):422-424.

363. Weis W, Brown JH, Cusack S, Paulson JC, Skehel JJ, Wiley DC. Structure of the influenza virus haemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid. Nature. 1988; 333(6172):426-431.

364. Wiley DC, Wilson IA, Skehel JJ. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation. Nature. 1981; 289(5796):373-378.

365. Williams TL, Luna L, Guo Z, Cox NJ, Pirkle JL, Donis RO, Barr JR. Quantification of influenza virus hemagglutinins in complex mixtures using isotope dilution tandem mass spectrometry. Vaccine. 2008; 26(20):2510-2520.

366. Williams TL, Pirkle JL, Barr JR. Simultaneous quantification of hemagglutinin and neuraminidase of influenza virus using isotope dilution mass spectrometry. Vaccine. 2012; 30(14):2475-2482.

367. Wilson IA, Skehel JJ, Wiley DC. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 1981; 289(5 796):366-373.

368. Wong JW, Schwahn AB, Downard KM. FluTyper-an algorithm for automated typing and subtyping of the influenza virus from high resolution mass spectral data. BMC Bioinformatics. 2010; 11:266.

369. Wu CY, Yeh YC, Yang YC, Chou C, Liu MT, Wu HS, Chan JT, Hsiao PW. Mammalian expression of virus-like particles for advanced mimicry of authentic influenza virus. PLoS One. 2010; 5(3):e9784.

370. Xiong X, Coombs PJ, Martin SR, Liu J, Xiao H, McCauley JW, Locher K, Walker PA, Collins PJ, Kawaoka Y, Skehel JJ, Gamblin SJ. Receptor binding by a ferret-transmissible H5 avian influenza virus. Nature. 2013a; 497(7449):392-396.

371. Xiong X, Martin SR, Haire LF, Wharton SA, Daniels RS, Bennett MS, McCauley JW, Collins PJ, Walker PA, Skehel JJ, Gamblin SJ. Receptor binding by an H7N9 influenza virus from humans. Nature. 2013b; 499(7459):496-499.

372. Xiong X, Tuzikov A, Coombs PJ, Martin S, Walker PA, Gamblin SJ, Bovin N, Skehel JJ. Recognition of sulphated and fucosylated receptor sialosides by A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) influenza virus. Virus Res. 2013c; doi:pii: SO 168-1702( 13)00286-4. 10.1016/j .virusres.2013.08.007.

373. Xu R, Krause JC, McBride R, Paulson JC, Crowe JE Jr, Wilson IA. A recurring motif for antibody recognition of the receptor-binding site of influenza hemagglutinin. Nat Struct Mol Biol. 2013; 20(3):363-370.

374. Xu R, McBride R, Nycholat CM, Paulson JC, Wilson IA. Structural characterization of the hemagglutinin receptor specificity from the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 2012a; 86(2):982-990.

375. Xu R, McBride R, Paulson JC, Basler CF, Wilson IA. Structure, receptor binding, and antigenicity of influenza virus hemagglutinins from the 1957 H2N2 pandemic. J Virol. 2010; 84(4): 1715-1721.

376. Xu R, Zhu X, McBride R, Nycholat CM, Yu W, Paulson JC, Wilson IA. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 2012b; 86(17):9221-9232.