Структурные основы противовирусного действия N-концевого пептида субъединицы PB1 вируса гриппа A тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Забродская Яна Александровна

• Забродская Яна Александровна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Забродская Яна Александровна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цели и задачи

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вирус гриппа A и противовирусные препараты

1.1.1 Строение вируса гриппа А

1.1.2 Существующие препараты против гриппа

1.1.3 Полимеразный комплекс вируса гриппа A как потенциальная мишень для разработки противовирусных препаратов

1.2 Пептидные препараты

1.2.1 Пептиды как модуляторы белок-белковых взаимодействий

1.2.2 Лекарственные соединения на основе пептидов

1.2.3 Пептиды, воздействующие на полимеразный комплекс вируса гриппа

1.3 Методы изучения белок-белковых взаимодействий

1.3.1 Выявление неизвестных белковых партнёров

1.3.2 Эффект поверхностного плазмонного резонанса

1.3.3 Микромасштабный термофорез

1.3.4 Малоугловое рассеяние

1.3.5 Атомно-силовая микроскопия

1.3.6 Изучение белок-белковых взаимодействий, приводящих к конформационным переходам

1.4 Заключение

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.1.1 Пептиды и белки

2.1.2 Антитела

2.1.2 Клетки и вирусы

2.1.3 Плазмиды

2.1.4 Животные

2.2 Методы

2.2.1 Моделирование молекулярной динамики (МД)

2.2.2 Регистрация масс-спектров и спектров фрагментации

2.2.3 Электронная микроскопия (ЭМ)

2.2.4 Лазерная корреляционная спектроскопия (ЛКС)

2.2.5 Круговой дихроизм (КД)

2.2.6 Атомно-силовая микроскопия (АСМ)

2.2.7 Конго красный (КК)

2.2.8 Малоугловое рассеяние нейтронов (МУРН)

2.2.9 Приготовление пептида в различных агрегационных состояниях

2.2.10 Поверхностный плазмонный резонанс (ППР)

2.2.11 Микромасштабный термофорез (MST)

2.2.12 Времяразрешённое малоугловое рентгеновское рассеяние (ВР-МУРР)

2.2.13 Конфокальная микроскопия

2.2.14 Определение концентрации белков

2.2.15 Электрофоретическое разделение белков в полиакриаламидном геле (ЭФ в ПААГ)

2.2.16 Масс-спектрометрическая идентификация белков

2.2.17 Аффинная хроматография

2.2.18 Вестерн блоттинг

2.2.19 Выделение рибонуклеопротеинового комплекса

2.2.20 Определение противовирусной активности пептида на модели клеточных культур

2.2.21 Определение противовирусной активности пептида in vivo

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Модельная пептидная система

3.1.1 Моделирование полимеразного комплекса вируса гриппа А человека

3.1.2 Выбор пептидов и обоснование модельной пептидной системы

3.1.3 Характеристика коротких пептидов

3.1.4 Выводы из Раздела

3.2 Взаимодействие коротких пептидов и PB1n в модельной пептидной системе

3.2.1 Взаимодействие коротких пептидов и PB1n приводит к образованию агрегатов

3.2.2 Константа взаимодействия PB1n и коротких пептидов

3.2.3 Временные параметры образования структур в результате взаимодействия

3.2.4 Гипотеза об индукции конформационного перехода

3.2.5 Выводы из Раздела

3.3 Поиск партнёра среди вирусных белков in vitro

3.3.1 Связывание вирусных белков с коротким пептидом in vitro

3.3.2 Связывание короткого пептида и рибонуклеопротеина вируса гриппа A

3.3.4 Выводы из Раздела

3.4 Взаимодействие коротких пептидов PB1n на модели клеточных культур

3.4.1 Взаимодействие модифицированного пептида PB16-14 и PB1n на модели клеточных культур

3.4.2 Выводы из Раздела

3.5 Особенности применения коротких пептидов in vivo

3.5.1 Пептиды PB16-13 и PBU-25 образуют амилоидоподобные фибриллы

3.5.2 Получение пептида в различных агрегационных состояниях

3.5.3 Кинетика образования амилоидоподобных фибрилл

3.5.4 Противовирусная активность пептида на модели клеточных культур

3.5.5 Противовирусная активность пептида in vivo

3.5.6 Выводы из Раздела

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурные основы противовирусного действия N-концевого пептида субъединицы PB1 вируса гриппа A»

Актуальность темы исследования

Белок-белковые взаимодействия (ББВ) лежат в основе большей части биологических процессов как нормальных, так и патологических, в связи с чем они рассматриваются как мишени для воздействия лекарственных препаратов [1]. В качестве одного из наиболее специфичных агентов, способных модулировать ББВ, рассматриваются пептиды или их химические модификации [2]. Для всесторонней оценки специфичности и механизмов взаимодействия важно использовать широкий спектр адекватных биофизических методов.

В настоящее время пептиды-модуляторы ББВ рассматриваются и в качестве потенциальных противовирусных препаратов. Задача терапии гриппа не теряет своей актуальности, несмотря на интенсивные исследования в области создания профилактических и лечебных препаратов. Ежегодные эпидемии, вызванные постоянно изменяющимися штаммами вируса гриппа, приобретающими устойчивость к существующим противовирусным препаратам, стимулируют исследования, направленные на разработку новых лекарственных средств. Перспективной мишенью для разработки новых противовирусных препаратов, является полимеразный комплекс вируса гриппа ввиду достаточной консервативности его первичной структуры. Одним из структурных элементов, критических для функционирования полимеразного комплекса, является контакт между субъединицами PA и PB1. Модулирование данного межсубъединичного взаимодействия способно привести к разобщению полимеразного комплекса и, как следствие, к ингибированию репликации вируса гриппа. В литературе представлен ряд пептидов-кандидатов, способных воздействовать на указанную область, однако, ни один из них до сих пор не применяется в клинической практике.

Данное исследование посвящено определению структурных основ механизма противовирусного действия пептида из ^концевого участка субъединицы PB1 (PB1N) полимеразного комплекса вируса гриппа А с применением адекватных биофизических и биохимических методов, продиктованных особенностями исследуемого объекта, а именно способности изучаемого пептида к индукции конформационного перехода в этом же домене. Согласно «Руководству по проведению доклинических испытаний лекарственных средств» изучение механизма действия является неотъемлемым этапом разработки препаратов [3]. Это обусловливает актуальность установления механизмов действия противовирусного препарата пептидной природы.

Степень разработанности темы исследования

Полимеразный комплекс вируса гриппа является перспективной мишенью для разработки противовирусных препаратов. В настоящее время единственным препаратом, ингибирующим активность полимеразного комплекса, разрешённым к применению в некоторых странах, является Фавипиравир. В то же время, известен ряд экспериментальных пептидов, действующих по конкурентному механизму, для которых показана противовирусная активность на модели клеточных культур [4—6], однако, в настоящее время ни один из этих пептидов не был разрешён для клинического применения. В работе [7] была также показана противовирусная активность на модели клеточных культур ряда пептидов из N-концевого участка субъединицы PB1 полимеразного комплекса вируса гриппа А человека. Однако механизм действия этих пептидов оставался невыясненным.

Данное исследование, проведённое с применением обширного арсенала современных биофизических методов, позволило установить механизм действия пептида из N-концевого участка субъединицы PB1 полимеразного комплекса вируса гриппа А человека, отличный от предложенных ранее в [4—6].

Цели и задачи

Целью данной работы являлось определение структурных основ противовирусного действия пептида из N-концевого участка субъединицы PB1 полимеразного комплекса вируса гриппа A.

Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:

1. С использованием компьютерного моделирования полноразмерного гетеротримера полимеразного комплекса вируса гриппа А человека обосновать выбор модельной пептидной системы для изучения взаимодействия N-концевого участка субъединицы PB1 полимеразного комплекса вируса гриппа A и пептидов PB16-13 и PB16-14.

2. Определить структурные и кинетические параметры взаимодействия пептидов PB16-13 и PB16-14 с N-концевым участком субъединицы PB1 полимеразного комплекса вируса гриппа A на модельной пептидной системе, применяя адекватные методы изучения белок-белковых взаимодействий в растворе с учётом специфики изучаемых объектов.

3. Идентифицировать белки вируса гриппа, способные к специфическому взаимодействию с пептидами PB16-13 и PBI6-14 in vitro, и охарактеризовать изменение структурных характеристик выявленных белков под воздействием пептидов.

4. Определить возможность взаимодействия модифицированного пептида PB16-14 и модельного белка, содержащего N-концевой участок субъединицы PB1 полимеразного комплекса вируса гриппа A, на модели клеточных культур.

5. Определить влияние коротких пептидов на размножение вируса гриппа in vivo для оценки перспективы дальнейшей разработки лекарственного средства на основе модифицированного пептида PB16-14.

Научная новизна

В ходе выполнения данной работы впервые была получена модель гетеротримера полимеразного комплекса вируса гриппа А человека методом молекулярной динамики.

На основании полученных данных впервые была разработана модельная пептидная система, в которой с использованием комплекса биофизических методов были охарактеризованы in vitro структурные и кинетические параметры взаимодействия исследуемого пептида с его потенциальной мишенью — N-концевым фрагментом субъединицы PB1 полимеразы вируса гриппа.

В совокупности с результатами, полученными на модели клеточных культур, впервые была подтверждена гипотеза о механизме действия исследуемых пептидов, альтернативная предложенным в литературе.

Возможность реализации принципиально нового механизма действия, а именно индукции конформационного перехода в N-концевом участке субъединицы PB1 полимеразного комплекса вируса гриппа А под действием пептида-фрагмента этого же участка, приводящей к разобщению комплекса и ингибирующей его активность, впервые показана для противовирусных препаратов пептидной природы.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы обусловлена важностью разработанного методического подхода, включающего в себя создание модельной пептидной системы и применение совокупности биофизических методов, направленных на изучение белок-белковых взаимодействий, приводящих к конформационным переходам. В данной работе показана принципиальная возможность влияния пептида, соответствующего по первичной структуре фрагменту белка, на его функции.

Обоснование возможности применения in vivo и перспектива дальнейшей разработки противовирусного препарата на основе исследуемого пептида с учётом структурных особенностей его действия определяет практическую значимость работы.

Методология и методы исследования

В данной работе был использован комплекс биофизических и биохимических методов для изучения ББВ, приводящих к конформационным переходам и агрегации белков, а именно: моделирование молекулярной динамики, MALDI масс-спектрометрическая идентификация белков, круговой дихроизм, лазерная корреляционная спектроскопия, электронная микроскопия, оптическая спектроскопия с применением красителя Конго красный, поверхностный плазмонный резонанс, микромасштабный термофорез, времяразрешённое малоугловое рентгеновское рассеяние с последующей обработкой набора спектров с использованием метода сингулярного разложения, аффинная хроматография в объёме, электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле, вестерн блоттинг, выделение рибонуклеопротеинового комплекса вируса гриппа, атомно-силовая микроскопия, конфокальная микроскопия, малоугловое рассеяние нейтронов, обращённо-фазная хроматография, определение противовирусной активности на модели клеточных культур и in vitro. Структурные основы противовирусного действия исследуемого пептида были исследованы на всех возможных уровнях: in silico, in vitro и на модели клеточных культур, в результате чего in vivo была показана перспектива дальнейшей разработки исследуемого пептида в качестве потенциального противовирусного препарата.

Положения, выносимые на защиту

1. Пептиды PB16-13 и PB16-14 способны вызывать амилоидоподобную агрегацию N-концевого участка субъединицы PB1 полимеразного комплекса вируса гриппа A в модельной пептидной системе.

2. Пептиды PB16-13 и PB16-14 способны вызывать специфическую агрегацию рибонуклеопротеинового комплекса in vitro и N-концевого участка субъединицы PB1 полимеразного комплекса вируса гриппа A в составе модельного белка слияния с зелёным флуоресцентным белком на модели клеточных культур.

3. Модифицированный пептид PB16-14 в модели гриппозной инфекции in vivo снижает титр вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm) в лёгких мышей при применении

в оптимальных концентрациях и растворителе, выбранных на основании

экспериментов in vitro.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных результатов обусловлена соответствием используемых методов поставленным задачам с учётом особенностей изучаемых объектов, воспроизводимостью результатов и применением методов статистического анализа данных.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 10 тезисов. Результаты доложены на 4 конференциях (2 устных и 2 постерных доклада).

Работа поддержана 4 грантами (в том числе 2 гранта на измерения на источниках нейтронов и синхротронного излучения):

1. Грант РФФИ №14-24-01103 офи_м «Метод структурно-динамической диагностики нуклеопротеидных мультимолекулярных комплексов в растворе, путем верификации структур, полученных методами молекулярной динамики, в спектрах малоуглового рентгеновского и нейтронного рассеяния» (2014-2016 гг.)

2. «Доклинические исследования противовирусного препарата пептидной природы, подавляющего репликацию вирусов гриппа человека А (H1N1)». ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу», ГК №14.N08.11.0080, 2016-2018 гг.

3. Эксперимент #LS-2508, экспериментальная станция @ID02 (1-3 июля 2016 г.), «Mechanisms of peptide-peptide interaction in model system for pb1 subunit of influenza polymerase complex», ESRF (European Synchrotron Radiation Facility, Европейский источник синхротронного излучения), Гренобль, Франция (времяразрешённое малоугловое рентгеновское рассеяние) .

4. Эксперимент #2017-10-14-18-31-59, инструмент ЮМО (22-24 января 2018 г.), «Antiinfluenza PB1-derived peptide action mechanism», Объединённый институт ядерных исследований, реактор ИБР-2, Дубна, Россия (малоугловое рассеяние нейтронов).

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ВИРУС ГРИППА A И ПРОТИВОВИРУСНЫЕ ПРЕПАРАТЫ

1.1.1 Строение вируса гриппа A

Гриппоподобные заболевания были впервые описаны ещё Гиппократом в 412 г. до н.э. В настоящее время грипп вносит значительный вклад в заболеваемость и смертность людей по всему миру. Ежегодные эпидемии гриппа, серьёзные осложнения, вызванные этой вирусной инфекцией, постоянная изменчивость штаммов приводит к необходимости постоянного совершенствования существующих препаратов и разработки новых. Белок-белковые взаимодействия играют главную роль в жизненном цикле вируса гриппа. Определение структурных особенностей вируса, ББВ как между вирусными белками, так и между вирусными и клеточными белками, является основой для создания эффективных препаратов [8].

Вирус гриппа относится к семейству Orthomyxoviridae и представляет собой частицу диаметром около 100 нм, окружённую липидной мембраной и несущую в своей структуре 8 одноцепочечных (-)РНК сегментов [9]. Сегменты РНК находятся в комплексе с нуклеопротеином (nucleoprotein, NP), на каждый сегмент в среднем приходится порядка 100 белковых субъединиц. Также на каждом сегменте располагается гетеротример полимеразного комплекса, состоящий из субъединиц: PB1, PB2 и PA (polymerase basic 1 и 2, основные полимеразы 1 и 2; polymerase acid, кислая полимераза). Комплекс одноцепочечной РНК, гомоолигомера NP и полимеразный комплекс составляют вирусный рибонуклеопротеиновый комплекс (вРНП) [10]. Изнутри липидная мембрана выстлана матриксным белком 1 (matrix protein 1, M1), в саму мембрану интегрирован ионный канал M2 (matrix protein 2, матриксный белок 2) [11]. Также в липидную мембрану вируса гриппа встроены белки гемагглютинин (hemagglutinin, HA) и нейраминидаза (neuraminidase, NA). В зависимости от сочетания подтипов поверхностных антигенов HA и NA вирусы гриппа разделяют на подтипы, обозначающиеся как, например, H1N1, H3N2, H7N9 и т.д [12].

Также геном вируса гриппа кодирует неструктурные белки 1 и 2 (nonstructural protein 1, NS1 и NS2 соответственно.) После того, как белок NS2 был обнаружен в структуре вириона [13,14], ему было дано альтернативное название — NEP (nuclear export protein, белок ядерного экспорта) [15]. В последнее время появляются данные об

обнаружении небольших количеств белка NS1 в структуре вириона [16], однако, не исключена вероятность его случайного захвата при формировании вирусных частиц.

В общей сложности РНК вируса гриппа кодирует более 12 белков [17]. Некоторые белки предсказаны на уровне обнаружения in silico альтернативных рамок считывания, однако факт их экспрессии не подтвержден экспериментально. Структура вируса гриппа представлена на Рисунке 1.1.1.

Рисунок 1.1.1 — Структура вируса гриппа (адаптировано из [18]). Отмечены поверхностные

белки НА (синий) и NA (оранжевый), ионный канал М2 (зелёный), коровый белок М1 (бежевый). Внутри вириона представлены восемь сегментов РНК (синие спирали), обвитые вокруг NP (коричневый), на концах которых расположен полимеразный комплекс (РА, РВ1

и РВ2)

Список основных белков вируса гриппа, а также их функции представлены в Таблице 1.1.1 [9,11,17].

Таблица 1.1.1 — Основные белки вируса гриппа (адаптировано из [9,11,17])

Сегмент Белок Функции

1 PB2 Субъединица полимеразного комплекса, напрямую связывается с другой субъединицей — РА. РВ2 вовлечён в узнавание 5'-кэппированных хозяйских пре-мРНК.

2 PB1 Является каталитической субъединицей полимеразного комплекса, которая ответственна за элонгацию цепи РНК и необходима как для репликации, так и для транскрипции вирусного генома. Взаимодействует с двумя другими субъединицами комплекса — РА и РВ2.

Сегмент Белок Функции

3 PA Данная субъединица полимеразного комплекса обладает эндонуклеазной активностью, «похищает кэпы» хозяйских пре-мРНК.

4 ИЛ Интегральный мембранный гликопротеин, является одним из главных антигенов. Отвечает за связывание с рецепторами на поверхности клеток, содержащими сиаловые кислоты. В нативной структуре представляет собой тример.

5 ОТ Нуклеопротеин неспецифично связывается с одноцепочечной РНК с шагом 20 нуклеотидов, является главным компонентом вРНП. Осуществляет контроль ядерно-цитоплазматического транспорта РНК.

6 ^ Интегральный мембранный гликопротеин, является одним из главных антигенов. Отщепляет остатки сиаловых кислот с поверхности гликопротеинов у вирусных частиц и клеток хозяина, тем самым облегчая выход вируса из инфицированных клеток и освобождая вирусы от рецепторов клеточных мембран.

7 M1 Слой белка М1 располагается под липидной мембраной. Является самым многочисленным белком вириона. Обеспечивает процессы самосборки вирусных частиц и их почкование. Участвует в ядерно-цитоплазматическом транспорте вРНП, контролирует его транскрипционную функцию.

7 M2 Трансмембранный белок, образует протонную помпу, которая активируется в условиях низких значений рН, способствует «раздеванию» вируса и высвобождению вРНП в цитоплазму.

8 Белок NS1 участвует в подавлении интерферонового и противовирусного ответа клетки, угнетении процессинга и экспорта клеточных мРНК, способствует трансляции вирусных мРНК, регулирует активность вирусной полимеразы.

8 NEP/ №2 Белок ядерного экспорта, способствует транспорту вРНП из ядра в цитоплазму, участвует в регуляции синтеза РНК.

1.1.2 Существующие препараты против гриппа

Для профилактики и лечения гриппозной инфекции в настоящее время доступны два класса этиотропных препаратов: направленные на ионный канал М2 и на нейраминидазу [10]. M2-блокаторы, амантадин и римантадин, ингибируют репликацию вируса гриппа A, блокируя протонный канал М2. Однако, в настоящее время они не применяются в клинической практике в связи с распространённостью адамантан-устойчивых штаммов вируса гриппа. Вторая группа препаратов, ингибиторы нейраминидазы, предотвращают выход вируса гриппа из клеток. Занамивир применяется

ингаляционно, в то время как озельтамивир применяется перорально. В период с 2007 по 2009 год наблюдалось распространение озельтамивир-устойчивых штаммов вируса гриппа Н^1. Напротив, устойчивость к занамивиру встречалась редко [19].

Вследствие непрерывной изменчивости вируса гриппа появляются штаммы, устойчивые к существующим препаратам. Это приводит как к необходимости разработки новых лекарственных препаратов к уже существующим мишеням, так и к поиску новых мишеней [20]. Известны препараты, воздействующие на гемагглютинин вируса гриппа и обладающие противовирусной активностью [21]. В качестве наиболее перспективных мишеней в настоящее время рассматриваются полимеразный комплекс вируса гриппа [22,23] и нуклеопротеин [24—27], обладающие, в отличие от НА, относительно консервативными аминокислотными последовательностями.

1.1.3 Полимеразный комплекс вируса гриппа А как потенциальная мишень для разработки противовирусных препаратов

Полимеразный комплекс вируса гриппа состоит из трех субъединиц: РА, РВ1 и РВ2. На каждый сегмент вРНП приходится один гетеротример полимеразного комплекса (Рисунок 1.1.2) [19]. Впервые структуру целого комплекса удалось получить в 2014 году [28,29] для вируса гриппа летучей мыши.

РВ2

Рисунок 1.1.2 — Строение вРНП вируса гриппа А [19]. Гетеротример полимеразного комплекса (РВ1, РВ2 и РА) соединён с вРНП: двойная спираль вРНК имеет форму шпильки, состоящую из двух антипараллельных цепей вРНК, обвитых вокруг олигомера

нуклеопротеина ^Р)

Полимеразный комплекс осуществляет функции транскрипции и репликации вРНК. В реакции транскрипции роль субъединицы РВ2 заключается в узнавании кэпа хозяйской мРНК, после чего происходит его «похищение» — отщепление субъединицей РА и перенос

на вирусную РНК. Элонгацию РНК как при транскрипции, так и при репликации осуществляет РВ1 [19].

РНК в составе вРНП могут служить матрицей для новых мРНК и для кРНК (которые, в свою очередь, служат матрицей для вРНК новых вирионов). Ряд исследований был посвящен изучению механизма регуляции участия вРНК в трансляции и в репликации. Были предложены разнообразные модели, предполагающие как участие в регуляции вирусных факторов ^Р, РНК-полимераза, NEP, NS1, малые вирусные РНК), так и клеточных [30]. В последнее время было установлено, что транскрипция вирусной мРНК осуществляется так называемой цис-действующей вирусной РНК-полимеразой (непосредственно связана с вРНП), а репликация — транс-действующей РНК-полимеразой, которая не ассоциирована с поступившими в клетку при заражении вРНП и вновь синтезирована в клетке [31].

После публикации структуры полимеразного комплекса, полученной при помощи рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии [28,32,33] произошёл всплеск исследований, посвящённых разработке препаратов, воздействующих на полимеразный комплекс. В качестве мишеней для таких препаратов помимо воздействия на участки, отвечающие за функцию субъединиц, рассматриваются межсубъединичные интерфейсы взаимодействия внутри полимеразного комплекса (Рисунок 1.1.3).

1

197

258

716

Эндонуклеазная активность Связывание с РВ1

1 15 286 483 678 757

I_I Связывание с РА Каталитиче ский домен Связывание с РВ2

1 35 318 483 535 684 757

РА

РВ1

РВ2

Связывание с РВ1

кэп- РНК- Ядерный

связывающий связывающий импорт

участок

З^гасток

Рисунок 1.1.3 — Сегменты вируса гриппа, кодирующие субъединицы РА, РВ1 и РВ2 полимеразного комплекса вируса гриппа A (адаптировано из [10] и (UniProtKB - P03431)). Цифрами указан порядковый номер нуклеотида в последовательности. Также подписаны некоторые области, отвечающие за функционирование субъединиц и за связывание между

ними

N-концевой участок PB2 состоит из нескольких доменов, в полимеразном комплексе расположенных вокруг C-концевого участка PB1 [28]. Показано, что белок слияния PB21-37 (с 1 по 37 а.о. PB2) c зелёным флуоресцентным белком (green fluorescent protein, GFP) обладает ингибирующей активностью в отношении полимеразы вируса гриппа A [35].

C-концевой домен PA (PAc) контактирует с N-концевым доменом PB1: участок с 1-го по 15-ый а.о. субъединицы PB1 полимеразного комплекса вируса гриппа (PB11-15) находится в межсубъединичном интерфейсе субъединиц PB1 и PA, при этом он находится в конформации альфа-спирали [32,33]. Короткий альфа-спиральный участок PB1 окружён четырьмя практически параллельными альфа-спиралями и одной бета-шпилькой PAC. Такая структура ответственна за формирование стабильного комплекса между субъединицами и крайне консервативна среди штаммов вируса гриппа A (H1N1, H5N1 и другие) [10]. Следует отметить, что замены ключевых а.о. в данном участке [10] или использование пептидов PB11-25 и PB11-15, доставленных внутрь клетки, приводит к ингибированию вирусной репликации и транскрипции [5]. Таким образом, данный межсубъединичный интерфейс является перспективной мишенью для разработки противовирусных препаратов.

Также в качестве мишеней для разработки препаратов рассматриваются и функционально активные участки субъединиц: эндонуклеазный домен PA, кэп-связывающий участок PB2, активный сайт PB1, а также участки, ответственные за связывание с РНК и с нуклеопротеином [8]. Схематически, потенциальные мишенные области отмечены на Рисунке 1.1.4.

В настоящее время в разной степени разработки находятся противовирусные соединения, направленные на полимеразный комплекс вируса гриппа. Среди них можно выделить препараты, направленные непосредственно или опосредованно на работу субъединицы PB1 [19]. Особое место занимает препарат фавипиравир (T-705), который находится на третьей фазе клинических испытаний и уже разрешён к применению в Японии [23,36]. Фавипиравир — нуклеотидный ингибитор, вызывающий терминацию роста цепи РНК и вирусный мутагенез. Также следует отметить ещё два препарата, находящиеся на второй фазе испытаний — VX-787 (JNJ-872) и S-033188, блокирующий кэп-связывающий домен PB2 и ингибирующий PA соответственно [20]. В обзоре [19] всего указано порядка 100 препаратов, мишенью для которых является полимеразный комплекс, главным образом, находящихся на экспериментальной стадии разработки. В том числе, около 20 соединений направлены на ингибирование взаимодействия субъединиц PA и PB1.

Рисунок 1.1.4 — Трёхмерная структура полимеразного комплекса (адаптировано из [37]), на которой отмечены потенциальные мишенные области для разработки лекарственных препаратов. РА — зелёный, РВ1 — синий, РВ2 — розовый

1.2 ПЕПТИДНЫЕ ПРЕПАРАТЫ

1.2.1 Пептиды как модуляторы белок-белковых взаимодействий

Благодаря своей фундаментальной роли в функционировании клетки, белок-белковые взаимодействия становятся привлекательной мишенью для разработки лекарственных препаратов. Среди подходов к разработке таких модуляторов ББВ особо следует отметить рациональный дизайн, основанный на знании о структурных элементах, участвующих во взаимодействии [38].

Модуляторы белок-белковых взаимодействий можно разделить по их химическому строению (низкомолекулярные вещества, пептиды или макромолекулы небелковой природы); по характерному эпитопу, на который они направлены (первичная, вторичная или третичная структуры); по рассчитанному физико-химическому и фармакологическому профилю; по топологии интерфейса [39]. Описаны как ортостерический, так и аллостерический тип модуляции белок-белковых взаимодействий (Рисунок 1.2.1), причём в обоих случаях это может привести как к распаду (ингибированию), так и к стабилизации комплекса, в то же время оказанный эффект на биологическую функцию может быть как стимулирующий, так и ингибирующий [38].

Ингибирование Стабилизация

Рисунок 1.2.1 — Схема работы различных модуляторов белок-белковых взаимодействий

(адаптировано из [38])

В связи с тем, что многие белки взаимодействуют достаточно обширными областями, иногда возникают трудности в разработке низкомолекулярных соединений (до

500 Да) которые покрывали бы такие области и эффективно связывались с белками, поэтому соединения среднего размера (около 1000-2000 Да), в частности, пептиды, оказываются более перспективными. Среди преимуществ пептидов можно выделить их общую химическую природу с белками, что позволяет использовать стандартные пути биодеградации в клетке, доступный синтез и возможность включения большого разнообразия функциональных групп. Однако, пептиды обладают низкой устойчивостью к протеолитическому расщеплению, что делает их менее предпочтительными кандидатами в лекарственные средства [40]. Основными химическими модификациями, призванными увеличить стабильность основанных на пептидах соединений, являются циклизация пептидов и модификация основной цепи (Рисунок 1.2.2).

Циклизация Модификация основной цепи

О Н О ОРНО

боковая цепь к пеитоиды

голове /хвост*'

Рисунок 1.2.2 — Модификации основанных на пептидах соединений (адаптировано из [40]).

Существует несколько подходов к рациональному дизайну пептидных модуляторов белок-белковых взаимодействий. Во-первых, это идентификация общей последовательности у несвязанных между собой белков, которые при этом взаимодействуют с каким-либо общим белком. Пептид, соответствующий этой последовательности, может представлять собой сайт связывания общего белка и оказывать влияние на его функцию. Во-вторых, это идентификация консервативной последовательности в гомологичных доменах разных белков, выполняющих сходные функции (например, у сигнальных белков). Наиболее консервативная последовательность среди таких доменов может определять их функцию. В-третьих, это поиск эволюционно

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Забродская Яна Александровна, 2018 год

- - 1.4

1.2

- 1.0^ £

Я

4)

0.8 Я

я о н и

0.6 о

СЧ

0.4

100

100 200 300 400

Номер а.о. РА

500

н у» —_т

600

700

0.2

0.0

Рисунок 3.1.2 — (А) Карта контактов субъединиц PA, PB1 и PB2 полимеразы вируса гриппа по данным компьютерного моделирования. Центральный сегмент соответствует карте контактов внутри субъединицы PB1. (Б) Карта контактов субъединиц PA и PB1 полимеразы вируса гриппа по данным компьютерного моделирования

Взаимодействующими считали остатки, ^-атомы которых находятся на расстоянии менее 5А. Из детального рассмотрения таких а.о. между и внутри субъединиц полимеразного комплекса можно заключить, что ^концевая область субъединицы РВ1, задействованная в образовании гетеродимера с РА, находится в участке с 1 по 37 а.о., а также этот ^концевой участок РВ11-37 в составе комплекса не контактирует как с другими остатками самой субъединицы РВ1, так и с какими-либо а.о. субъединицы РВ2.

Таким образом, ^концевой участок субъединицы РВ1 полимеразного комплекса вируса гриппа A человека находится в контакте только с С-концевым участком субъединицы РА, и на формирование его структуры взаимодействия с а.о. из других доменов РВ1 непосредственно не влияют. Как было ранее показано в работах [28,33,49], в структуре комплекса этот участок находится в конформации альфа-спирали.

3.1.2 Выбор пептидов и обоснование модельной пептидной системы

Как уже было отмечено ранее (Раздел 1.2.3) в работе [7] был синтезирован и протестирован на противовирусную активность ряд пептидов-фрагментов субъединицы РВ1 полимеразного комплекса вируса гриппа А. В том числе, для некоторых пептидов, соответствующих по первичной структуре фрагментам PB1N, а именно РВ16-13, PBl6-l4, а также ряд их модификаций — FITC-PBl6-l4-NH2, Ac-PBl6-l4-NH2, была показана противовирусная активность в отношении вируса гриппа А/СаЖогша/07/09 (H1N1pdm), а также в отношении некоторых других штаммов вируса гриппа A. Однако, механизм действия этих пептидов оставался неясен. В диссертации [48] была высказана гипотеза о стабилизации бета-конформации PBlN, представляющего собой зеркально-симметричный мотив, указанными выше пептидами. В настоящей работе гипотеза была расширена и сформулирована как гипотеза об индукции конформационного перехода в PB1N под действием коротких пептидов. Данные пептиды как наиболее перспективные соединения были выбраны в настоящей работе для определения структурных основ их противовирусного действия.

Проверка гипотезы о том, что короткие пептиды (РВ16-13, PBl6-l4 и их модификации) способны взаимодействовать РВ1^ вызывая его конформационный переход из альфа-спирали в бета-структуру и стабилизируя эту бета-структуру, препятствуя тем самым корректной сборке полимеразного комплекса или же приводя к его разобщению, на первом этапе была осуществлена на модельной пептидной системе. По результатам моделирования молекулярной динамики (Раздел 3.1.1), которые полностью согласуются с

литературными данными [28,32,33], было показано, что как минимум первые 25 а.о. РВ^ находятся в контакте только с субъединицей РА, и на формирование его структуры взаимодействия с а.о. из других доменов РВ1 непосредственно не влияют. В связи с этим, участок PB1l-25 может быть рассмотрен в качестве модели изолированного ^концевого домена. Таким образом, изучение взаимодействия коротких пептидов и PBlN проводили на модельной пептидной системе, в которой в качестве ^концевого участка РВ1 выступали его фрагменты: РВ1б-25 (упомянутый ранее зеркально-симметричный мотив, Раздел 1.2.3) и РВ11-25.

3.1.3 Характеристика коротких пептидов

В Таблице 3.1.1 представлены исследуемые в данной работе короткие пептиды с показанной противовирусной активностью на клетках МОСК.

Таблица 3.1.1 — Характеристика коротких пептидов

Название соединения Формула М(*), Да

PBl6-lз TLLFLKVP 929.595

PBl6-14 TLLFLKVPA 1000.632

FITC-PBl6-l4-NH2 ^-концевое амидирование) 1501.776

Ac-PBl6-l4-NH2 TLLFLKVPA, ацетилированный по Оконцу и амидированный по C-концу 1041.659

(*) М — молекулярная масса

Масса всех пептидов была подтверждена масс-спектрометрически. Фрагменты соответствующих масс-спектров представлены на Рисунке 3.1.5.

3 x1

с - Ч£ : С - '' : о : . А . PB1 6-13 iL

: - - с _: с PB1 6-14 3 1 .. .

- Ч£ _ Ч£ - С - т| - С i Ac - PB1 6-14 - NH2 1

ОО FITC - PB1 6-14 - NH2 : I-- <N : о - LO L._____L_

3 x1

3 x105

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700 m/z

Рисунок 3.1.5 — Фрагменты MALDI масс-спектров исследуемых пептидов (сверху вниз) — PB16-13, PBl6-l4, Ac-PBl6-l4-NH2, FITC-PBl6-l4-NH2. По оси абсцисс отложено отношение m/z (массы к заряду), Да; по оси ординат — интенсивность ионов (отн.е.)

0

На фрагментах представленных спектров m/z обнаруженных ионов на 1 Да больше моноизотопной массы пептидов (Таблица 3.1.1), так как все пептиды представлены ионами, присоединившими один протон. Небольшие ионы справа от отмеченных представляют собой пептиды, присоединившие Na+ и K+. Для подтверждения аминокислотной последовательности пептида Ac-PB16-14-NH2 и наличия модификаций для иона с m/z = 1042.66 был зарегистрирован спектр фрагментации (Рисунок 3.1.6).

Полученные спектры фрагментации иона m/z = 1042.66 позволяют достоверно идентифицировать его как фрагмент белка PB1 вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm), TLLFLKVPA c N-концевым ацетилированием и C-концевым амидированием, Score = 57 (при превышении порогового значения Score = 56 идентификация считается достоверной, p < 0.05). Таким образом, первичная структура пептида и его модификации были подтверждены.

Abs. Int b

У

150

100

50

1000 m/z

T L L F L K V P A Thr Leu Leu Phe Leu Lys Val Pro Ala

Ion 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9

a b T L L F L K V P A 116.07 229.15 342.24 489.31 602.39 730.49 829.55 926.61 996.66

T L L F L K V P A 144.07 257.15 370.23 517.30 630.39 758.48 857.55 954.60 1024.66

y T L L F L K V P A 89.07 186.12 285.19 413.29 526.37 673.44 786.52 899.61 1042.67

9 8 7 6 5 4 3 2 1 Ala R-o Val Lys Leu Phe Leu Leu Thr

Рисунок 3.1.6 — Спектр фрагментации иона с m/z — 1042.66. В таблице красным выделены

идентифицированные в спектрах ионы

0

3.1.4 Выводы из Раздела 3.1

В результате компьютерного моделирования гетеротримера полимеразного комплекса вируса гриппа А человека, проведённого впервые, было показано, что первые 37 а.о. ^концевого участка РВ1 определяют его взаимодействие с РА. Причём этот участок РВ1 не взаимодействует ни с самим РВ1, ни с РВ2. В составе полимеразного комплекса PB1l-з7 находится в конформации альфа-спирали.

Модельная пептидная система — участки субъединицы РВ16-25 и РВ11-25 — может быть использована для изучения взаимодействия коротких пептидов и N-концевого участка РВ1. Выбранные фрагменты соответствуют участку РВ1, критичному для взаимодействия с РА и, следовательно, функционирования полимеразного комплекса вируса гриппа А, в то же время, они не участвуют в других взаимодействиях, и, в рамках данной модели, могут рассматриваться независимо.

3.2 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ И PB1n В МОДЕЛЬНОЙ

ПЕПТИДНОЙ СИСТЕМЕ

3.2.1 Взаимодействие коротких пептидов и PB1n приводит к образованию агрегатов

Как было указано ранее (Раздел 3.1.2) изучение структурных основ механизма действия коротких пептидов (PB16-13 и PBI6-14) начали с проверки гипотезы о стабилизации бета-конформации N-концевого участка субъединицы PB1 полимеразного комплекса вируса гриппа A на модельной пептидной системе PB16-25 и PBI1-25.

При растворении пептида PBU-25 в PBS и регистрации спектров кругового дихроизма (КД) было обнаружено, что 35% молекулы пептида PB16-25 находится в бета-конформации (Рисунок 3.2.1, А), в то время как пептид PBU-13 не образует характерной вторичной структуры. Полученный результат подтверждает данные компьютерного моделирования пептида PB16-25 [48], указывающие на то, что пептид способен образовывать бета-шпильку. При добавлении к пептиду PB16-25 пептида PBU-13 увеличивается содержание бета-структур в образце, о чём свидетельствуют результаты обработки разностного спектра, представленные на Рисунке 3.2.1, Б) [47].

0.5 -,

(А)

'////Л РВ1б-25

РВ1б-25 + РВ16-13

длина волны (нм) Спираль /3-А/П /3-П /3-изгиб Клубок

Рисунок 3.2.1 — (А) Спектр кругового дихроизма (КД) пептида РВ1б-25. (Б) Влияние пептида РВ1б-1з на вторичную структуру пептида РВ1б-25. «Спираль» — альфа-спираль, «в-А/П» — антипараллельная бета-структура, «в-П» — параллельная бета-структура, нерегулярные структуры: «в-изгиб», «Клубок» (неструктурированный пептид) (адаптировано из [47])

Увеличение количества добавляемого пептида РВ1б-1з к РВ1б-25 приводит к образованию агрегатов, которые были изучены методами электронной микроскопии (Рисунок 3.2.2, А) и лазерной корреляционной спектроскопии (Рисунок 3.2.2, Б) [47]. Диаметр агрегатов составлял порядка 500 нм по данным ЭМ и 500-1000 нм по данным ЛКС. Следует отметить, что в исходных растворах агрегаты не наблюдались.

(А)

1 10 100 1000 Гидродинамический диаметр (нм)

10000

Рисунок 3.2.2 — (А) Электронная микрофотография смеси пептидов РВ1б-1з и РВ1б-25. Масштабный отрезок соответствует 500 нм. (Б) Распределение гидродинамического диаметра частиц в растворе, полученное по данным лазерной корреляционной спектроскопии смеси пептидов (адаптировано из [47])

Таким образом, было показано, что фрагмент PB16-25, который в составе полимеразного комплекса находится в конформации альфа-спирали, in vitro способен образовывать бета-структуру. К тому же, взаимодействие пептида PB16-13 с N-концевым участком PB1 в пептидной модели приводит к образованию крупных агрегатов, что указывает на их способность к взаимодействию.

Для выяснения природы образовавшихся агрегатов пептиды PB16-13 и PB16-25 по-отдельности и их смесь были протестированы на наличие бета-структурированных амилоидоподобных агрегатов с использованием специфичного красителя Конго красный (Рисунок 3.2.3) [99].

Агрегаты, образующиеся в результате взаимодействия пептидов, имеют амилоидоподобную природу. Исходные растворы пептидов не связывают КК. Таким

образом, пептид PB16-13 способен индуцировать конформационный переход в ^концевом участке субъединицы PB1 полимеразы вируса гриппа в модельной пептидной системе.

кк

РВ1М5КК

400 500 600

А, (нм)

Рисунок 3.2.3 — Спектр поглощения пептида PB16-13 в присутствии Конго красного — синяя кривая, исходный спектр Конго красного — красная кривая, спектр поглощения пептида PB16-25 в присутствии Конго красного — зелёная кривая, смесь пептидов в присутствии Конго красного — чёрная кривая. В смеси пептидов наблюдается характерный для бета-структурированных амилоидоподобных агрегатов сдвиг максимума поглощения Конго

красного вправо (ДА,) (адаптировано из [99])

3.2.2 Константа взаимодействия PB1n и коротких пептидов

Константу взаимодействия коротких пептидов c N-концевым участком субъединицы PB16-25 определяли методами поверхностного плазмонного резонанса и MST. Аналогично работе [100] пептид PBU-14 был иммобилизован на поверхность чипа. Уровень иммобилизации составил 3100 RU (1 RU = 1 пг/мм2), что примерно соответствует 0.13 нмоль пептида. В качестве аналита выступал пептид PB16-25 в различных концентрациях (59-89-133-200-300 [M), растворённый в 2% EtOH/HEPES. При изучении равновесной константы диссоциации Kd методом поверхностного плазмонного резонанса отклик (response) прямо пропорционален концентрации биомолекул на поверхности чипа. Программная коррекция так называемых эффектов объёма и дрейфа позволяет снизить различие между показателями преломления отмывочного буфера и буфера для образца, а

также учесть дрейф базовой линии [65]. Сенсограмма, полученная методом ППР, представлена на Рисунке 3.2.4.

Общая сенсограмма---- АВ ......Коррекция

-1-'-1-'-1-1-1-1-1-1-1-1-1-'-1-1-1-1-1

О 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

t(c)

Рисунок 3.2.4 — Сенсограмма (зависимость отклика Response от времени t) взаимодействия

пептидов PB16-14 и PB16-25 (чёрная сплошная кривая), приближения при помощи кинетического уравнения Лэнгмюра, взаимодействие 1: 1 (красная кривая) с образованием комплекса AB, «Коррекция» — поправка на эффекты объёма и дрейфа, (чёрная пунктирная кривая). Kd — равновесная константа диссоциации. RU — reflective units, резонансные

единицы (адаптировано из [99])

Характер взаимодействия пептидов PBl6-l4 и PBl6-25 может быть описан кинетикой Лэнгмюра (формула 1.3.2), указывающей на эквимолярное соотношение двух пептидов. В результате, сенсограмма может быть приближена уравнением 1.3.5, из которой вычисляют значение Ка = kd/ka. Равновесная константа взаимодействия пептидов PBl6-l4 и PBl6-25, определённая методом ППР, составила 41 ± 9 ¡¡М.

ка

А+В ^ АВ , где (1.3.2)

ка

А — аналит, В — лиганд, АВ — комплекс аналит-лиганд, ка — константа ассоциации, [М-1 •с-1], ка — константа диссоциации, [с-1].

к СЯ

Я = аС^аХ -(1 - е-(к*с+ка>), где (1.3.5)

ка-С + ка ( )з д ( )

R — сигнал, получаемый на сенсограмме (отражает изменение концентрации комплекса аналита и лиганда AB), C — концентрация аналита, Rmax — максимально возможный сигнал R в случае насыщения для данной пары аналит-лиганд.

Для определения константы взаимодействия коротких пептидов и N-концевого участка субъединицы PB1 в растворе использовали метод микромасштабного термофореза (MST). В этих экспериментах была определена термофоретическая подвижность флуоресцентно меченой молекулы (FITC-меченый пептид PB16-14) в одной концентрации (500 нМ) в зависимости от концентрации аналита, в качестве которого выступал пептид PB11-25 в 16 различных концентрациях. Использование FITC-меченого пептида как аналога пептида PB16-14 допустимо, поскольку эти пептиды обладают сравнимой противовирусной активностью, как было показано ранее в работе [7].

Следует отметить, что при изучении методом MST взаимодействия аналита и лиганда, описываемого уравнением (1.3.2), нормированная величина флуоресценции Fnorm снижается в точке локального повышения температуры с течением времени (Рисунок 1.3.4, Б). При проведении данного эксперимента, наоборот, наблюдалось увеличение Fnorm в точке измерения. Это обычно связывают с компактизацией образующихся в процессе взаимодействия комплексов, что свойственно для изменения пространственной структуры реагирующих молекул после взаимодействия, характерного для конформационных переходов.

Зависимость относительной интенсивности флуоресценции смеси пептидов FITC-PB16-14-NH2 и PB11-25 от различных концентраций аналита, полученная методом микромасштабного термофореза в растворе, представлена на Рисунке 3.2.5.

График зависимости нормированной флуоресценции Fnorm от концентрации лиганда был использован для определения Kd в соответствии с формулой 1.3.16.

Fnorm (C)=Fnorm (unbound)+ (Fnorm(bound)-Fnorm МюиП^

2

x (Cfiuo+C+ Kd- J(Cfluo+C+ Kd)2-4Cwc), где (1.3.16)

Fnorm(bound) и Fnorm(unbound) — нормированная флуоресценция связанного и несвязанного состояния соответственно, Cfluo — концентрация лиганда (пептида FITC-PBU-14), [M], C — концентрация аналита (пептида PBK-25) [M], Kd — равновесная константа диссоциации [M].

Рисунок 3.2.5 — Зависимость относительной интенсивности флуоресценции смеси пептидов FITC-PB16-14-NH2 и PB1i_25 от концентрации аналита, полученная методом MST

(адаптировано из [99])

В экспериментах по MST равновесная константа диссоциации пептидов составила 1.01 ± 0.26 ¡¡М. Увеличение аффинности взаимодействия на порядок по сравнению с результатами, полученными методом ППР, может быть связано с влиянием иммобилизации на конформацию пептида, с близостью поверхности чипа и с повышенной локальной концентрацией лиганда на границе раздела фаз. Это может оказаться критически важным при изучении взаимодействий, приводящих к конформационным переходам в полипептидах. Также нельзя исключить роль дополнительных остатков PB11-5 и флуоресцентной метки во взаимодействии, наблюдаемом методом MST. Также следует отметить, что метод ППР обычно используется для определения Kd взаимодействия антиген-антитело, молекулярная масса которых много больше массы пептидов [65,101]. Низкая масса пептидов обусловливает низкую величину отклика, что приводит к неточному измерению взаимодействия.

Таким образом, значение равновесной константы диссоциации, полученное методом MST, более точно характеризует взаимодействие короткого пептида и N-концевого участка PB1 в растворе.

3.2.3 Временные параметры образования структур в результате взаимодействия

На следующем этапе изучили взаимодействие пептидов PB16-13 и PBl6-25 методом времяразрешённого малоуглового рентгеновского рассеяния (ВР-МУРР), который позволяет не только качественно установить наличие или отсутствие взаимодействия и описать полученные структуры, но также оценить характерные времена образования структур в результате взаимодействия. Набор из 100 спектров МУРР, полученный в течение первых пяти минут после смешивания пептидов, был обработан методом SVD (программа создана Клоповым Н.В., НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ) для выявления наиболее изменяющихся компонент сингулярного разложения спектров.

Форма и динамика изменения такой компоненты разложения в диапазоне измерения q от 0.1 до 1.0 нм-1 на растворе смеси пептидов PB16-13 и PBl6-25 представлена на Рисунке 3.2.6, A. Восстановленные начальное и конечное состояния системы представлены на Рисунке 3.2.6, Б.

(А)

0.01 Т

; 1Е-з-

1Е-4-:

Смесь пептидов РВ1( п и РВ1Г —■— начальное состояние конечное состояние

I] (нм"')

-1—

0.1

Ч (нм"')

Рисунок 3.2.6 — (А) Uo(q) — Форма наиболее изменяющейся (нулевой) компоненты сингулярного разложения спектров МУРР в диапазоне измерения q от 0.1 до 1.0 нм-1 на растворе смеси пептидов PBl6-lз и PBl6-25; "оф — изменение нулевой компоненты в зависимости от времени. Характерное время (Т1/2, время полупревращения) составило 39.4 ± 5.1 с. (Б) Спектры МУРР начального ^ = 0) и конечного ^ = го) состояний системы смеси пептидов РВ16-13 и РВ16-25, восстановленные на основании изменения единственной нулевой компоненты сингулярного разложения. I — интенсивность рассеяния (отн.е.), q — вектор рассеяния (нм-1), q = (4тат0)Д (20 — угол рассеяния)

Изменение нулевой компоненты от времени было приближено

экспоненциальным уравнением вида у = Ае /+у0, причём константа скорости k = 1/tl, а характерное время превращения Т1/2 = Ы2/к Восстановленные на основе SVD зависимости интенсивности рассеяния I от д в начальный ^ = 0) и конечный ^ = ю) моменты времени были построены в логарифмических координатах и аппроксимированы методом наименьших квадратов степенной функцией = 0.99 для начального и конечного состояний).

Изменение нулевой компоненты сингулярного разложения, по-видимому, связано с падением интенсивности кривых, что может свидетельствовать о быстрой агрегации пептидов при смешивании. Это соответствует данным, полученным нами ранее (Раздел 3.2.1). Следует отметить, что при измерении каждого пептида, смешанного с буфером, подобных изменений не происходит.

Аналогичные расчёты были проведены при изучении спектров МУРР пептидов PBl6-lз и PBl6-25 на интервале q от 0.01 до 0.2 нм-1. Изменения нулевой и первой компонент сингулярного разложения представлены на Рисунке 3.2.7, A и Б соответственно, начальное и конечное состояния системы — на Рисунке 3.2.7, В (при аппроксимации методом наименьших квадратов степенной функцией начальных участков кривых величина R2 также составила 0.99 для начального и конечного состояний).

В данном случае также изменение нулевой компоненты можно связать с падением общей интенсивности спектров МУРР. Однако, изменение первой компоненты, по-видимому, отражает увеличение наклона начальных участков кривых с характерным временем около 120 с. Изменение показателя степени с -2 на -3 можно интерпретировать как появление крупных агрегатов в образце в результате взаимодействия пептидов.

(А)

10-

0.1 -

0.01 ■

Ч (нм1)

Рисунок 3.2.7 — (А) ио(ф — Форма нулевой компоненты сингулярного разложения спектров МУРР в диапазоне измерения ц от 0.01 до 0.2 нм-1 на растворе смеси пептидов РВ1б-1з и РВ1б-25; — изменение нулевой компоненты в зависимости от времени. Характерное время (и/2, время полупревращения) составило 147.5 ± 32.8 с. (Б) и^ц) — Форма первой компоненты сингулярного разложения спектров МУРР в диапазоне измерения ц от 0.01 до

0.2

нм-

-1

на растворе смеси пептидов РВ1б-1з и РВ1б-25; Vl(t) — изменение первой компоненты

в зависимости от времени. Характерное время (Т1/2, время полупревращения) составило 121.6 ± 75.0 с. (В) Спектры МУРР начального ^ = 0) и конечного ^ = ю) состояний системы смеси пептидов РВ1б-1з и РВ1б-25, восстановленные на основании изменения нулевой и первой компонент сингулярного разложения. I — интенсивность рассеяния (отн.е.), д — вектор рассеяния (нм-1), ц = (4^т0)Д (20 — угол рассеяния) (адаптировано из

[99])

3.2.4 Гипотеза об индукции конформационного перехода

Возможность индукции конформационного перехода в белках при взаимодействии с пептидами обсуждается в обзоре [81]. Гипотеза о таком механизме взаимодействия пептида PB16-13 c N-концевым участком субъединицы PBU-25 была рассмотрена в работе [47], однако наблюдаемое явление не рассматривалось как амилоидоподобная передача конформации. В свете полученных в Разделе 3.2 данных можно предположить, что пептид РВ1б-1з взаимодействует с PB1n (с Kd порядка 1 [M по данным MST в растворе), стабилизируя конформацию бета-структуры. В экспериментах in vitro методом кругового дихроизма (Раздел 3.2.1, [47]) было показано, что N-концевой участок РВ1б-25 способен принимать бета-конформацию. Методами МУРР, изучением связывания с красителем Конго красный, а также методами ЭМ и ЛКС было показано, что взаимодействие пептида РВ1б-1з c N-концевым участком субъединицы РВ1 ведёт к образованию крупных бета-структурированных агрегатов с характерным временем около 120 с [99] (Раздел 3.2.3). Увеличение содержания антипараллельных бета-структур в смеси пептидов было установлено методом КД.

Полученные данные позволяют сделать предположение о том, что под воздействием коротких пептидов N-концевой участок субъединицы РВ1 полимеразного комплекса вируса гриппа А приобретает бета-конформацию и теряет способность к взаимодействию с субъединицей РА, поскольку его альфа-конформация критична для осуществления такого взаимодействия [32,33]. В результате происходит разобщение работы полимеразного комплекса вируса гриппа, что и обусловливает противовирусную активность коротких пептидов, показанную в [7].

Полученная в данной работе Kd порядка 1 [M для взаимодействия РВ1б-14 с РВ^ сопоставима с Kd, опубликованной для взаимодействия РВК-15 c РАс (1.6 [M) [6]. Это указывает на то, что высказанная нами гипотеза об индукции конформационного перехода в РВ^ под действием короткого пептида из этого же участка субъединицы РВ1 и гипотеза о конкурентном механизме действия, высказанная в [6] , равноправны. В пользу механизма амилоидоподобной передачи конформации, предложенного для исследуемых в данной работе коротких пептидов, говорит также и то, что FITC-меченый и немеченые пептиды обладают сходной противовирусной активностью, показанной на модели клеточных культур [7], в то время как при осуществлении конкурентного механизма N-концевая FITC-метка препятствовала бы встраиванию пептида в карман РАс для разобщения работы полимеразного комплекса.

3.2.5 Выводы из Раздела 3.2

Пептид, соответствующий участку PB16-25, способен принимать бета-конформацию in vitro, что было показано методом кругового дихроизма.

Под воздействием пептида PB16-13 на PB1n увеличивается содержание бета-структур, что затем приводит к образованию крупных агрегатов, имеющим амилоидоподобную природу, диаметром около 500 нм, что было показано методами КД, ЛКС, ЭМ и связыванием со специфическим красителем Конго красный.

Короткие пептиды способны к взаимодействию с N-концевым участком PB1 в модельной пептидной системе с Kd = 1.01 ± 0.26 ¡¡М и характерным временем около 120 с.

3.3 ПОИСК ПАРТНЁРА СРЕДИ ВИРУСНЫХ БЕЛКОВ IN VITRO

3.3.1 Связывание вирусных белков с коротким пептидом in vitro

На следующем этапе работы было изучено связывание коротких пептидов и белков вируса гриппа A in vitro. Подготовка вирусных белков для эксперимента заключалась в мягком лизисе вирионов при помощи NP-40, который облегчает освобождение белков от липидных мембран. В результате, в образце были представлены отдельные вирусные белки (HA, NA, M1 и т.д.), освобождённые от мембран, а также цельные рибонуклеопротеиновые комплексы, состоящие из NP, РНК и РНК-полимеразы [102].

Для подтверждения наличия в образце после лизиса вирусных белков было проведено ЭФ в ПААГ с последующей масс-спектрометрической идентификацией окрашенных зон. На Рисунке 3.3.1 представлены результаты ЭФ в ПААГ, а в Таблице 3.3.1 — список идентифицированных белков.

kDa. М Б

250

150

100

75

#1 (NA). #2 (ОТ), #3 (НА1) #4 (актин) #5 (аннексии А2)

#6 (НА2), #7 (Ml)

20

15

10

Рисунок 3.3.1 — Результаты ЭФ в ПААГ лизированного при помощи NP-40 вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm). M — маркер молекулярных масс. Стрелками указаны

вырезанные для идентификации зоны

Таблица 3.3.1 — Список идентифицированных белков

Номер образца Белок Происхождение Score (порог) (*)

#1 Нейраминидаза (NA) [Influenza A virus (A/Dublin/01/2009(H1N1))] и аналогичные ему 79 (76)

#2 Нуклеопротеин (NP) [Influenza A virus (A/reassortant/NYMC X-179 A(California/07/2009 x NYMC X-157)(H1N1))] и аналогичные ему 218 (76)

#4 Актин [Gallus gallus] 167 (70)

#5 Аннексин A2 [Gallus gallus] 195 (93)

#3, #6 Гемагглютинин (HA1, HA2) [Influenza A virus (A/reassortant/NYMC X-181 (California/07/2009 x NYMC X-157)(H1N1))] и аналогичные ему 176 (76)

#7 Белок M1 [Influenza A virus (A/Henry/1936(H1N1))] и аналогичные ему 132 (76)

(*) — Идентификация считается достоверной в случае, если Score превышает пороговое значение (p < 0.05)

Таким образом, после мягкого лизиса вирусных частиц при помощи NP-40 в образце сохранились все стандартные вирусные белки, которые обычно наблюдаются при ЭФ в ПААГ белков вируса гриппа (Рисунок 3.3.1). Все представленные Таблице 3.3.1 белки были идентифицированы достоверно, на что указывает величина Score, превышающая пороговое значение. Вирусные белки принадлежат штамму A/California/07/09 (H1N1pdm) или аналогичным ему, что согласуется с предоставленной информацией о происхождении используемого в данном исследовании штамма вируса гриппа A. Следует также отметить, что в структуре вируса присутствуют некоторые невирусные белки (аннексин А2 и актин), что также совпадает с литературными данными о включении хозяйских белков в структуру вирионов [16].

Связывание пептида и вирусных белков изучалось при помощи аффинной хроматографии в объёме. На инертный носитель был иммобилизирован пептид PBI6-14-NH2, содержащий не только N-, но C-концевую аминогруппу для повышения эффективности его иммобилизации на NHS-активированную сефарозу. Качественный контроль иммобилизации осуществлялся масс-спектрометрически: сефарозу с пептидом обрабатывали трипсином, который, в случае наличия пептида, расщеплял его после

лизина, в результате чего могло образоваться два пептидных фрагмента — VPA-NH2 (m/z = 285.19) и TLLFLK (m/z = 734.48). Зарегистрированные спектры представлены на Рисунке 3.3.2.

rf x104-

£ 4 Н а

3 -2 -j

^ 0,-

rf x104

«

3Н

сл

а

<и

а

2-

1-

0-1

so

О

Ы <м

SO

iL

L_L

PB1 6-14 NH2 HCCA

<vrfijk>

600

650

700

750

800

850

m/z

Рисунок 3.3.2 — Фрагмент MALDI масс-спектра после ферментативного гидролиза трипсином иммобилизованного на NHS-активированную сефарозу пептида РВ1б-14^Н (сверху) и матрица, на которую был нанесён пептид для анализа (снизу)

Как следует из Рисунка 3.3.2, в образце, содержащем пептид, присутствуют ионы, отличные от матрицы HCCA (m/z 734.47 и группа пептидов 842.51, 856.53 и 870.55). По -видимому, ион 734.47, как было предположено ранее, соответствует пептиду TLLFL, а группа ионов — автопротеолизу трипсина. В диапазоне меньших m/z ионов, отличных от матрицы, обнаружено не было. Таким образом, пептид был успешно иммобилизован на инертный носитель, при этом можно предположить, что связывание с NHS-активированной сефарозой прошло преимущественно по C-концевой аминогруппе, поскольку в спектре обнаруживается только N-концевой фрагмент пептида.

На следующем этапе была проведена аффинная хроматография в объёме: к иммобилизованному на инертный носитель пептиду были добавлены вирусные белки, после чего тщательно отмыты 0.5% NP-40/PBS для исключения возможности

неспецифичных или ионных взаимодействий (Методы, Раздел 2.2.17). После хроматографии потенциально связавшиеся с пептидом вирусные белки были идентифицированы масс-спектрометрически (трипсин был добавлен непосредственно к инертному носителю, минуя этап элюирования белков, для достижения их максимальной концентрации). Результаты масс-спектрометрической идентификации белков представлены на Рисунке 3.3.3.

Abs. Int. * 1000

250

200

150

100 -

50 -

Дч

JwLI

761.40 417- 422

708.38 385-389

1273.70 20-31

1739.80 447-461

1693.83 247-261

2339.09 362-382

1223.63 66-75

1186.69 56-65

1594.84 107-118

1482.72 423-436

1689.91 401-416

2225.11 417-436

2066.00 244-261

750

1000

1250

1500

1750

2000

iAIIIWWVA^IAJUJLaiwJU

I ' ' 2250 m/z

Рисунок 3.3.3 — Результат идентификации вирусного белка, связавшегося с иммобилизованным на NHS-активированную сефарозу пептидом PBI6-14-NH2. Сверху представлен фрагмент MALDI масс-спектра белка, красным выделены ионы, для которых указаны m/z и номера а.о. в последовательности идентифицированного белка. Снизу

представлено покрытие последовательности

В результате, в образце был достоверно идентифицирован NP вируса гриппа A (Score составил 137 при пороговом значении 76; в случае, если Score превышает пороговое значение, идентификация считается достоверной, p < 0.05). Помимо ионов, относящихся к NP, в спектре были выявлены пики автопротеолиза трипсина и ион m/z = 734.47, по-видимому, соответствующий фрагменту TLLFL иммобилизованного пептида PBI6-14-NH2.

Поскольку в условиях данного эксперимента (при лизировании вируса гриппа в присутствии NP-40) нуклеопротеин находится в составе вРНП [102], где помимо него присутствует и полимеразный комплекс вируса гриппа (Рисунок 1.3.2), можно заключить, что из всех вирусных белков пептид специфично взаимодействует с одним из компонентов вРНП. То, что в растворе не были выявлены компоненты полимеразного комплекса вируса гриппа, может быть объяснено его низкой концентрацией в образце: на один сегмент вРНП приходится порядка 100 молекул NP и всего один гетеротример полимеразного комплекса.

3.3.2 Связывание короткого пептида и рибонуклеопротеина вируса гриппа A

Ранее в данной работе была высказана гипотеза об индукции конформационного перехода в субъединице PB1 полимеразного комплекса под действием N-концевого пептида из PB1 (Раздел 3.2.4). Известно, что прионоподобные агрегаты не растворяются в присутствии додецилсульфата натрия при пробоподготовке к ЭФ в ПААГ [103], поэтому ЭФ в ПААГ может быть использован для выявления амилоидоподобной агрегации белков [104]. Предварительно исследуемый агент смешивают с белком, в котором может произойти конформационный переход, приводящий к агрегации белка. Образцы далее готовят по стандартному протоколу денатурирующего ЭФ в ПААГ. В случае образования устойчивых агрегатов (сохраняющихся в процессе денатурации белка, восстановления дисульфидных связей и других этапов пробоподготовки), они не способны войти в ПААГ, в результате чего исходная зона белка исчезает, а вместо неё на входе в ПААГ образуется новая окрашенная зона агрегатов. Модификация данного метода была применена для изучения связывания коротких пептидов из N-концевого участка PB1 и белков вируса гриппа A. Результаты ЭФ в ПААГ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях представлены на Рисунке 3.3.4. Вирус гриппа был подготовлен, как описано выше, с использованием NP-40.

kDa M Б 6-13 6-14 ПК OK kDa М В 6-13 ПК

Рисунок 3.3.4 — Результаты ЭФ в ПААГ смеси коротких пептидов и белков вируса гриппа в восстанавливающих (слева) и в невосстанавливающих условиях (справа). Все отмеченные стрелками белки были вырезаны и достоверно идентифицированы методом MALDI масс-спектрометрии (во всех случаях полученная величина Score превышала пороговое значение). М — маркер молекулярных масс, В — вирус, 6-13 и 6-14 — вирус гриппа, смешанный с пептидом PB16-13 и PB16-14 соответственно, ПК и ОК — положительный и

отрицательный контроль соответственно

Зона, соответствующая по электрофоретической подвижности белку с молекулярной массой 56 кДа, в восстанавливающих условиях содержит два белка — нуклеопротеин и субъединицу HA1 гемагглютинина. В невосстанавливающих условиях лёгкая и тяжёлая цепь гемагглютинина связанны дисульфидной связью, вследствие чего их электрофоретическая подвижность составляет около 65 кДа (HA0). Можно заметить, что при добавлении пептидов, интенсивность зон, соответствующих NP, снижается, а на входе в ПААГ окрашиваются не вошедшие агрегаты. При многократном повторении этого эксперимента было показано, что добавление пептидов PB16-13 и AC-PBI6-14-NH2 снижает количество NP, вошедшего в гель, примерно в 2 раза (на 53 ± 11%).

Снижение содержания NP и полимеразного комплекса вируса гриппа A под воздействием коротких пептидов полуколичественно было подтверждено методом вестерн

блоттинга с использованием антител к NP и субъединицы РА полимеразного комплекса вируса гриппа А (Рисунок 3.3.5).

Ша М Б 6-13 ПК М Б 6-13 ПК

М Б 6-13 ПК

250 150

I

100

75

М

37

25

20

15

Рисунок 3.3.5 — Вестерн-блот с использованием антител к NP (слева), РА (посередине) и НА (справа, отрицательный контроль). М — маркер молекулярных масс, В — вирус, 6-13 —

вирус гриппа, смешанный с пептидом РВ1б-1з, ПК — положительный контроль

Под действием коротких пептидов снижается количество NP и полимеразного комплекса вируса гриппа в областях, соответствующих их электрофоретической подвижности, в то же время ни количество, ни электрофоретическая подвижность НА не изменяются.

Следует отметить, что связывание пептидов с вРНП приводит не к изменению электрофоретической подвижности, соответствующей большей молекулярной массе комплексов белков с пептидом, а снижает количество белка в данной зоне. Это указывает не просто на взаимодействие коротких пептидов с вРНП, показанное в Разделе 3.2, а на образование устойчивых к денатурации агрегатов, что не противоречит гипотезе об индукции конформационного перехода в РВ1 под действием коротких пептидов.

Наличие агрегации в образце было показано методом атомно-силовой микроскопии (Рисунок 3.3.6). Для этого из вирусных частиц был выделен и охарактеризован вРНП [105], после чего были получены изображения топографии поверхности образца, содержащего интактные вРПН и вРНП, инкубировавшиеся с коротким пептидом в течение 30 мин.

(А)

1 цгп

(В)

Ч ^ 1300,ПШ

~20.0 пт

"18.0

"16.0

"14.0

"12.0

"10.0

~ 8.0

Г б.о

Г 4.0

|_ 0.0

15.0 пт

14.0

12.0

"ю.о

' 8.0

' 6.0

" 4.0

" 2.0

0.0

(Б) ^ * ч - д ф И ^ - • в

А М ' - _ 4 Л И л 1Г 41

т Д. ** % £ д 4 1 цт ---1

(Г) щ ш.' % ш

9 т Л * • # -

* . ;

ф 300 пт

■р1:;| (е)

смесь вРНП и Р151

20.0 пт '18.0 '16.0 '14.0 '12.0 '10.0 8.0 6.0 4.0

0.0 15.0 пт 14.0

12.0

10.0

8.0

6.0

4.0

2.0 0.0

вРПП смесь вРПП и РВ1.

15 511 24 25

Высота, им

10(1 150 2011 2=41

Радиус эквивалентною диска (им)

Рисунок 3.4.6 — Топография поверхности образца, содержащего интактные вРНП (А и В) и вРНП с коротким пептидом (Б и Г). Для (А) и (Б) масштабный отрезок соответствует 1 ¡хм, для (В) и (Г) — 300 нм. Линейка псевдоцвета указывает на высоту объектов (нм). (Д) и (Е) —

Распределение частиц, обнаруженных в образцах, по высоте и радиусу эквивалентного диска (нм) соответственно. Количество частиц N (вРНП) = 574, N (вРНП и РВ1б-1з) = 688

В образце с чистым мономером пептида не было обнаружено никаких частиц (данные не представлены).

Высоты обнаруженных при атомно-силовой микроскопии частиц увеличиваются под действием пептида PB16-13 (частиц с высотами более 20 нм становится достоверно больше), в то же время число частиц с высотами от 10 до 15 нм снижается, что можно трактовать как агрегацию более мелких частиц, соответствующих одиночным вРНП. Данный эффект проявляется в меньшей степени при анализе изменений радиусов эквивалентного диска, однако также наблюдается тенденция к его увеличению под действием пептида PB16-13. Таким образом, можно заключить, что короткие пептиды вызывают частичную агрегацию вРНП, что согласуется с полученными в этом Разделе результатами, указывающими на взаимодействие коротких пептидов и вРНП, приводящее к образованию устойчивых агрегатов.

Следует отметить, что в результате экспериментов по изучению связывания пептида PB16-14 и мономерной формы нуклеопротеина методом ППР было установлено, что пептид не взаимодействует с NP в данной форме (данные не представлены). Таким образом, можно сделать вывод о том, что агрегация вРНП вызвана взаимодействием пептида и полимеразного комплекса в составе частицы вРНП.

3.3.4 Выводы из Раздела 3.3

Короткие пептиды взаимодействуют с вРПН вируса гриппа in vitro, что было показано при изучении связывания иммобилизированного на инертный носитель пептида PB16-14-NH2 и лизированного вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm) методом аффинной хроматографии с последующей масс-спектрометрической идентификацией белков.

Обнаруженное взаимодействие вызывает агрегацию вРНП, в результате чего снижается количество белка в зонах, соответствующих электрофоретической подвижности NP (по данным ЭФ в ПААГ) и полимеразного комплекса (по данным вестерн-блоттинга с использованием антител к PA). Агрегация показана также для выделенных рибонуклеопротеиновых частиц методом атомно-силовой микроскопии, при этом по данным ППР мономер NP вне вРНП не способен взаимодействовать с коротким пептидом.

Короткие пептиды вызывают агрегацию вРНП за счёт взаимодействия с полимеразным комплексом вируса гриппа в его составе.

3.4 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ PB1n НА МОДЕЛИ КЛЕТОЧНЫХ

КУЛЬТУР

3.4.1 Взаимодействие модифицированного пептида PBK-u и PB1n на модели клеточных культур

В дальнейшей части работы на модели клеточных культур и in vivo был использован модифицированный пептид PB16-14 (Ac-PB16-14-NH2), поскольку внесённые модификации обеспечивают большую устойчивость пептидов к экзопротеазам, что, возможно, привело к наибольшей противовирусной активности этой модификации пептида в [7], показанной на клетках MDCK.

Для подтверждения наличия взаимодействия коротких пептидов и N-концевого участка PB1 на модели клеточных культур, а именно агрегации белка за счёт изменения конформации последнего под действием коротких пептидов, были проведены следующие эксперименты. Клетки MDCIK были трансфицированы двумя плазмидами по-отдельности: PB16-25-GFP и GFP. После экспрессии белка к клеткам был добавлен AC-PBU-14-NH2. В случае, если короткие пептиды способны вызывать конформационный переход в N-концевом участке PB1, что приводит к агрегации этого белка, то меченый GFP N-концевой участок PB1 в клетках также будет агрегировать под действием пептида, что можно зафиксировать методом конфокальной микроскопии. Для контроля отсутствия агрегации самих рекомбинантных белков в клетках и белков под действием используемого растворителя для пептида (5% DMSO/ 5% EtOH, обоснование выбора растворителя приведено в Разделе 3.5.2), были проанализированы трансфицированные клетки MDCIK в культуральной среде и после добавления 5% DMSO/ 5% EtOH без пептида соответственно. Для того чтобы подтвердить, что агрегация белков в клетках происходит благодаря взаимодействию AC-PBU-14-NH2 и N-концевого участка PB1 была использована плазмида, кодирующая только GFP.

В данном эксперименте для контроля проникновения коротких пептидов в нетрансфицированные клетки MDCIK был использован пептид FITC-PBU-14-NH2 (Рисунок 3.4.1, А). Возможность использования FITC-меченого пептида показали в работе [7] на клетках MDCK, поскольку эти формы пептида обладают сходной противовирусной активностью. В той же работе было показано проникновение этого пептида в клетки MDCIK через 30 мин методом флуоресцентной микроскопии. На Рисунке 3.4.1, Б представлены клетки, трансфицированные контрольной плазмидой, кодирующей GFP.

Рисунок 3.4.1 — Результаты конфокальной микроскопии клеток MDCK (оптический срез, проходящий через ядро): (А) — инкубировавшихся в течение часа с пептидом FITC-PBl6-l4-NH2, растворённым в 0.25% DMSO/ 0.25% ЕЮН до конечной концентрации

30 ¡¡М; (Б) — трансфицированных контрольной плазмидой, кодирующей GFP.

Масштабный отрезок соответствует 25 ¡ам. Синим цветом показаны окрашенные DAPI ядра, а красным — флуоресцентно меченый пептид

Как видно из Рисунка 3.4.1, А, пептид FITC-PBl6-l4-NH2 достаточно равномерно проникает в клетки МОСК через час инкубации, диффузно распределяясь по цитоплазме. Ярко-красные области, по-видимому, соответствуют нерастворившимся агрегатам пептида на поверхности клеток во внеклеточном пространстве.

В свою очередь, плазмида, кодирующая GFP, эффективно трансфицировала некоторые клетки МОСК, что привело к экспрессии белка. GFP равномерно распределён как по цитоплазме, так и, в некоторых случаях, наблюдается в ядре. Следует отметить, что в данном случае конфокальные изображения трансфицированных клеток не отличались при различных последующих условиях инкубации (в среде, в растворителе пептида и с добавлением пептида): во всех случаях зелёная флуоресценция клеток была диффузной.

На Рисунке 3.4.2 представлены конфокальные изображения клеток МОСК, трансфицированных плазмидой PBl6-25-GFP.

(А) (Б) V V

А

0 мт 25 0 |лп

(В)

Рисунок 3.4.2 — Результаты конфокальной микроскопии клеток МОСК (срез через середину ядра), трансфицированных плазмидой, кодирующей PBl6-25-GFP, и (А) инкубировавшихся в течение часа без пептида и (Б) с пептидом Ac-PBl6-l4-NH2. (В) — проекция трёхмерного изображения клеток, содержащих агрегаты белка, обнаруженные в (Б). Синим цветом показаны окрашенные DAPI ядра, а зелёным — GFP. На верхних изображениях масштабный отрезок соответствует 25 ¡м, на нижнем — 10 ¡м

В клетках, трансфицированных плазмидой PBl6-25-GFP и инкубировавшихся в среде или в растворителе пептида (Рисунок 3.4.2, А), также наблюдается диффузное

распределение GFP по клетке. В то же время под действием пептида Ac-PBl6-l4-NH2 наблюдается заметное число клеток, в которых белок находится в агрегировавшем состоянии (Рисунок 3.4.2, Б). Причём агрегаты белка наблюдаются только в цитоплазме. Следует отметить, что во всех клетках, трансфицированных плазмидой, кодирующей PBl6-25-GFP, встречаются единичные клетки со спонтанно агрегировавшим белком, однако при добавлении пептида число таких клеток заметно возрастает.

3.4.2 Выводы из Раздела 3.4

Взаимодействие коротких пептидов и ^концевого участка субъединицы PB1 полимеразного комплекса вируса гриппа A было показано на модели клеток MDCK, трансфицированных плазмидой, кодирующей белок слияния PBl6-25-GFP (выступавшего в роли субъединицы PB1), к которым был добавлен пептид Ac-PBl6-l4-NH2. Под действием пептида происходила агрегация экспрессировавшегося в клетке белка слияния, что подтверждает возможность индукции конформационного перехода в ^концевом участке PB1 под действием пептида Ac-PBl6-l4-NH2, показанную в Разделе 3.2 на модельной пептидной системе.

3.5 ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ IN VIVO

3.5.1 Пептиды PB16-13 и PBU-25 образуют амилоидоподобные фибриллы

На следующем этапе работы необходимо было оценить способность коротких пептидов оказывать вирус-ингибирующее действие in vivo. Однако, при использовании стандартных параметров для такого рода экспериментов, в частности, возникает необходимость применения пептида в концентрациях выше 1 мМ, короткие пептиды образовали осадок. При этом по данным обращённо-фазной хроматографии (Методы, Раздел 2.2.9) было установлено, что в данных условиях агрегирует практически весь пептид, и лишь малая его часть остаётся в виде мономеров. Данное наблюдение справедливо также и для пептида PBU-25. На Рисунке 3.5.1 представлены результаты электронной микроскопии агрегатов пептида PBU-25, а на Рисунке 3.5.2, А представлены результаты атомно-силовой микроскопии агрегатов пептида PB16-13. Обнаруженные агрегаты сходны по своему строению с амилоидоподобными фибриллами. Для проверки амилоидоподобной природы агрегатов был проведён тест на связывание агрегатов со специфическим красителем Конго красный, спектр которого сдвигается вправо при связывании с амилоидоподобными фибриллами [106]. Спектр связывания осадка пептида PBU-13 с красителем Конго красный приведен на Рисунке 3.5.2, Б.

Рисунок 3.5.1 — Электронная микрофотография агрегатов, образовавшихся при растворении пептида PB16-25 в концентрации 1 mM в PBS. Масштабный отрезок

соответствует 500 нм

(Б)

о

2

3

7 go.6-

5

и w

0.0-

400 450 500 550 600

X (нм)

- кк

-РВ1ЫЗКК

Рисунок 3.5.2 — (А) Результаты атомно-силовой микроскопии агрегатов, образовавшихся при растворении пептида PB16-13 в концентрации 1 mM в PBS. Масштабный отрезок соответствует 5 мкм. Линейка псевдоцвета указывает высоту объектов (нм). (Б) Спектр поглощения пептида PB16-13 в присутствии Конго красного (КК) — чёрная сплошная кривая, исходный спектр КК — красная пунктирная кривая. В присутствии пептида наблюдается характерный сдвиг максимума поглощения КК вправо (ДА). к — длина волны (нм)

(адаптировано из [99])

Таким образом, было показано, что при растворении как пептида PB16-13, так и PB16-25 в PBS в концентрации 1мМ, они образуют амилоидоподобные фибриллы.

Данные малоуглового рассеяния нейтронов (МУРН) также указывают на то, что в образцах присутствуют не отдельные молекулы пептида, а агрегаты (Рисунок 3.5.3, А). Построенный в логарифмическом масштабе, начальный участок спектра МУРН был аппроксимирован по методу наименьших квадратов степенной функцией. Значение показателя степени данной функции может указывать на присутствие в образце полимерной цепи в плохом растворителе. В логарифмическом масштабе (зависимость lgI от от Igq) функция, которой приближается спектр, принимает вид прямой: y = Ax + B. Значение показателя степени A в данном случае указывает на характер рассеивающих структур. Значение показателя степени порядка -2 обычно трактуют как цепи в плохом растворителе. Следует отметить, что величина -1 > A > -3 соответствует массовому фракталу.

Также методом МУРН изучили взаимодействие пептида PBU-13 в форме фибрилл и N-концевого участка субъединицы PB1 (Рисунок 3.5.3, Б).

Рисунок 3.5.3 — (А) Спектры МУРН на растворе пептидов PBl6-25 (красные круги) и PB16-13 (чёрные квадраты). Данные аппроксимированы по методу наименьших квадратов степенными функциями с показателями 1.86 ± 0.05 (Я2 = 0.97) и 2.84 ± 0.04 (Я2 = 0.99)

соответственно. (Б) Спектры МУРН на растворе смеси пептидов РВ1б-25 и РВ1б-1з в фибриллярной форме (чёрные точки) и нормированная математическая сумма кривых

рассеяния для РВ1б-25 и РВ1б-1з по-отдельности (красная кривая) (Я2 = 0.98). I — интенсивность рассеяния (см-1), д — вектор рассеяния (А-1), q = (4п^т0)/Х (20 — угол рассеяния между падающим и рассеянным пучком) (адаптировано из [99])

При анализе данных МУРН было установлено, что спектр смеси пептидов (Рисунок 3.5.3, Б, чёрные точки) соответствует математической сумме спектров отдельных компонентов (Рисунок 3.5.3, Б, красная кривая). Из этого можно заключить, что после образования амилоидоподобных фибрилл самим пептидом РВ1б-1з, он уже не способен вступать во взаимодействие с ^концевым участком субъединицы РВ1б-25. Таким образом, пептид должен находиться в мономерной форме для индукции конформационного перехода в ^концевом участке субъединицы РВ1 вируса гриппа.