Анализ динамики межклеточных взаимодействий нормальных и трансформированных клеток в культуре тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Алиева, Наила Омар Кайям гызы

• Алиева, Наила Омар Кайям гызы
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Алиева, Наила Омар Кайям гызы

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цель и задачи работы

Научная новизна и практическая значимость работы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Фибробласты и эпителиоциты. Морфология и организация

цитоскелета

1. Фибробластоподобные поляризованные клетки

2. Эпителиальные неполяризованные клетки

3. Изменение морфологии клетки под действием факторов

трансформации

II. Действие онкогена Ras :

1. Ras - представитель семейства малых GTPa3,

эффекторы Ras

2. Rho, Rae и Cdc42 и организация актина

III. Адгезия с внеклеточным матриксом, межклеточные контакты

1. Фокальная адгезия

2. Адгезионные соединения. Кадхериновая адгезия

2.1 Организация кадхеринового межклеточного контакта

2.2. Сигнальная транедукция в межклеточном адгезионном

комплексе

2.2.1. Кадхерины как опухолевые супрессоры

2.2.2. ß-катенин - центральный элементрегуляции

межклеточной адгезии

2.2.3. Роль малых GTPa3 в функционировании

межклеточного контакта

3. Другие виды межклеточных взаимодействий

3 3.1. Десмосома

3.2. Плотные контакты

IV. Контактное торможение движения

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

I. Описание клеточных культур, использованных в работе

1. Клетки линии IAR-2

2. Клетки линии IAR-2(C4) ras

3. Клетки линии AGO 1523

4. Клетки линии Rat-1

5. Клетки линии Rat-1 ras

II. Дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия

III. Анализ псевдоподиальной активности

IV. Движение латексных частиц по поверхности клеток

V. Иммунофлуоресцентная микроскопия

РЕЗУЛЬТАТЫ

I. Динамика установления межклеточного контакта

^трансформированными эпителиоцитами

1. Морфологические характеристики эпителиальных клеток

IAR-2

2. Анализ видеозаписи формирования межклеточного контакта

эпителиальными клетками IAR-2

2.1. Нестабильный контакт

2.2. Начальный стабильный контакт

2.3. Расширяющийся стабильный контакт. Угнетение

псевдоподиальной активности

3. Движение покрытых СопА латексных частиц по поверхности 51 эпителиальных клеток IAR-2

3.1. Движение латексных частиц на свободном крае

эпителиальных клеток IAR-2

3.2. Особенности движения СопА-покрытых латексных частиц

по поверхности ламеллы в области межклеточного контакта клеток IAR-2

4. Анализ актинового цитоскелета эпителиальных клеток IAR-2

4.1 Организация актинового цитоскелета эпителиальных

клеток IAR-2

4.2 Изменение динамики актинового цитоскелета в ходе

формирования межклеточного контакта эпителиоцитами IAR-2

II. Межклеточный контакт в культурах ras-трансформированных

эпителиоцитов

1. Поляризованный фенотип трансформированных

эпителиоцитов IAR-2(C4)-ras

2. Анализ видеозаписи формирования межклеточного контакта

ras-трансформированными эпителиоцитами

2.1. Перекрывание ламелл

2.2. Ретракция ламеллы и поворот клетки

3. Движение покрытых Con-А латексных частиц по поверхности

клеток на свободном крае и в области формирования межклеточного

контакта трансформированными эпителиоцитами линии IAR-2(C4)-ras

4. Динамика актинового скелета в ходе межклеточного

взаимодействия ras-трансформированных эпителиоцитов

4.1. Организация актинового цитоскелета ras-

трансформированных эпителиоцитов

4.2. Организация актинового цитоскелета ras-трансформированных эпителиоцитов в ходе формирования межклеточного контакта

III. Динамика установления межклеточного контакта

фибробластами

1. Морфологические характеристики фибробластов линий

AGO 1523 и Rat-1

1.1. Фибробласты линии AGO 1523

1.2. Фибробласты линии Rat-1

2. Анализ видеозаписи формирования межклеточного контакта

фибробластами

2.1. Перекрывание ламелл

2.2. Ретракция и формирование новой ламеллы

3. Движение Con A-покрытых латексных частиц по поверхности

ламеллы в области межклеточного контакта фибробластов

4. Анализ динамики актинового цитоскелета фибробластов во

время установления межклеточного контакта

4.1. Организация актинового цитоскелета фибробластов

4.1.1. Линия AGO 1523

4.1.2. Линия Rat-1

4.2. Организация актинового цитоскелета в участках

межклеточных контактов

IV. Межклеточные взаимодействия ras-трансформированных

фибробластов

1. Морфология трансформированных фибробластов линии

Rat-1 ras

2. Анализ межклеточных столкновений в культуре

трансформированных фибробластов линии Rat-1 ras

2.1. Перекрывание ламеллярных участков

6 2.2. Ретракция и формирование боковой ламеллы

3. Перемещение покрытых СопА латексных частиц по

поверхности трансформированных фибробластов

4. Динамика актинового скелета в ходе межклеточного

взаимодействия ras-трансформированных фибробластов

4.1. Организация актина в фибробластах линии Rat-1 ras

4.2. Организация актина в ходе межклеточного контакта

ОБСУЖДЕНИЕ

I. Два типа контактного торможения движения

1. Контактное торможение движения в культурах

нетрансформированных эпителиоцитов

2. Контактное торможение в культурах фибробластов и

фибробластоподобных клеток

II. Роль актинового цитоскелета в формировании межклеточного

контакта эпителиоцитами

III. Роль актинового цитоскелета в формировании межклеточного

контакта фибробластами

IV. Контактное торможение движения - свойство как

нетрансформированных, так и трансформированных клеток

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ динамики межклеточных взаимодействий нормальных и трансформированных клеток в культуре»

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Одной из важнейших проблем современной онкологии является изучение механизмов инвазии опухолевых клеток в окружающие ткани. До настоящего времени существовала широко распространенная точка зрения, что в основе приобретения клеткой способности к инвазии лежит утрата так называемого контактного торможения движения. Феномен контактного торможения движения был впервые определен Аберкромби и соавторами (11) как свойство ^трансформированных клеток реагировать на столкновения в культуре остановкой направленного движения одной клетки по поверхности другой. Однако убедительных доказательств угнетения контактного торможения движения в ходе неопластической трансформации в то время получено не было. В настоящее время, используя современные методы видео микроскопии с высоким разрешением, представляется важным исследовать динамику межклеточных взаимодействий и механизмы осуществления контактного торможения движения в культурах нормальных и трансформированных клеток.

Одной из внутриклеточных систем, претерпевающей значительные изменения в ходе трансформации, является цитоскелет и, в частности, система актиновых микрофиламентов. Так, гаБ-индуцируемая трансформация вызывает значительные модуляции в распределении актиновых филаментов в клетке и обуславливает превращение неполяризованных эпителиальных клеток в поляризованные фибробластоподобные. С другой стороны, было показано, что система актиновых микрофиламентов играет важнейшую роль в установлении и поддержании межклеточных адгезионных соединений. Важно выяснить, каким образом изменения в организации актиновых микрофиламентов, вызванные трансформирующим действием онкогена, проявляются в ходе осуществления межклеточного контакта.

Изложенные соображения определили цель и задачи нашей работы. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью настоящей диссертационной работы являлось детальное изучение динамики ламелл и актинового цитоскелета в ходе межклеточных взаимодействий нормальных и трансформированных эпителиоцитов и фибробластов. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить динамику межклеточных взаимодействий в гомотипических культурах нетрансформированных и гав-трансформированных эпителиоцитов и фибробластов, используя методы видео микроскопии с высоким разрешением.

2. Исследовать распределение актин-содержащих структур в вышеозначенных культурах как до, так и после межклеточного взаимодействия.

3. Исследовать динамические изменения организации актинового цитоскелета в ходе межклеточных контактных взаимодействий при помощи актино-зависимого движения связанных с конканавалином А латексных частиц по поверхности клеток в области межклеточных контактов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Анализ динамики гомотипических межклеточных взаимодействий в культурах нетрансформированных и гав-трансформированных эпителиоцитов и фибробластов был осуществлен с использованием современных методов видео микроскопии с высоким разрешением, что позволило детально охарактеризовать особенности этого процесса, в частности, впервые определить дискретные стадии в процессе межклеточной адгезии для каждого исследуемого типа клеток. На основании полученных нами данных было описано два различных способа осуществления контактного торможения

движения в культурах неполяризованных эпителиоцитов и фибробластоподобных клеток.

Впервые был проведен сравнительный компьютерный анализ изменений псевдоподиальной активности в ходе осуществления межклеточного контакта. Было достоверно показано угнетение псевдоподиальной активности в областях клеточного края, непосредственно прилегающих к зоне межклеточного контакта у дискоидных нетрансформированных эпителиоцитов и отсутствие подобного угнетения в культурах фибробластоподобных клеток.

Динамика актинового цитоскелета была изучена при помощи методики с использованием связанных с конканавалином А латексных частиц, осуществляющих актинозависимые перемещения по поверхности клеток. Такой экспериментальный подход позволил изучить распределение сил натяжения в актиновом цитоскелете. Впервые подобные движения были исследованы в области межклеточных контактов. Было обнаружено формирование нового вектора натяжения в ходе осуществления межклеточного контакта ^трансформированными неполяризованными эпителиоцитами,

обеспечивающего расширение контакта. Было показано, что при межклеточных взаимодействиях фибробластоподобных клеток характер движения латексных частиц не изменяется.

Методом иммунофлуоресценции была впервые показана реорганизация актинового цитоскелета в ходе формирования межклеточного контакта неполяризованными эпителиоцитами, в частности впервые было обнаружено, что установление межклеточной адгезии нетрансформированными эпителиоцитами сопровождается разрушением кольцевого периферического пучка актиновых микрофиламентов. В ходе межклеточных взаимодействий в культурах фибробластоподобных клеток распределение актиновых микрофиламентов в клетке принципиально не изменялось.

Таким образом, теоретическое значение диссертационной работы состоит в том, что выявлены два различных способа осуществления феномена

контактного торможения движения, основанных на различиях в изначальной организации актинового цитоскелета ^трансформированных эпителиоцитов с неполяризованной псевдоподиальной активностью и поляризованных фибробластоподобных клеток.

Наряду с теоретическим значением полученные данные имеют научно-прикладное значение, поскольку расширяют понимание механизмов, лежащих в основе приобретения неподвижными неполяризованными клетками способности направленно перемещаться, что в конечном итоге приводит к инвазивности и метастазированию.

и

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. ФИБРОБЛАСТЫ И ЭПИТЕЛИОЦИТЫ. МОРФОЛОГИЯ И ОРГАНИЗАЦИЯ ЦИТОСКЕЛЕТА.

В нашей работе мы использовали два различных морфологичкских типа клеток: поляризованные фибробластоподобные клетки и неполяризованные эпителиоциты. В данном случае термин поляризация относится к характеру распределения псевдоподиальной активности по периметру клетки.

1. Фибробластоподобные поляризованные клетки.

Фибробластоподобные клетки имеют вытянутую поляризованную форму, которая возникает благодаря неравному распределению псевдоподий по периметру клетки. Клеточный край распластанной поляризованной клетки можно разделить на две зоны: активную ведущую ламеллу, формирующую псевдоподии, и стабильный край. Активный край формирует псевдоподии различных форм, от плоских ламеллоподий до нитеобразных филоподий. В результате такого распластывания клетка приобретает удлиненную поляризованную форму. Движение поляризованного фибробласта - это анизотропное распластывание только в одном из выбранных направлений. Прикрепление псевдоподии и подтягивание тела клетки в направлении выбрасываемой псевдоподии двигает фибробласт вперед. Направление движения регулируется несколькими группами внешних факторов (186): структурой субстрата, контактами с соседними клетками и хемотаксисом. К позитивным внешним факторам относятся хемотаксис и адгезивные субстраты, а негативным - контакт с соседними клетками и неадгезивные субстраты.

Выбрасывание псевдоподий на активном крае является результатом локальной полимеризации актина, сопровождающейся формированием сети микрофиламентов (40, 41). Активный край считается основной зоной полимеризации микрофиламентов в клетке.

В настоящее время общепризнанной является теория постоянного тока или круговорота актина в клетке между клеточным краем и эндоплазмой (57, 181). Актиновая сеть формируется на клеточном крае движущийся клетки и перемещается центростремительно, в то время как деполимеризованный актин двигается в обратном направлении к краю клетки. Этот факт нашел свое подтверждение во многих экспериментальных моделях (13, 59, 60, 181).

Активное движение вперед клеток также часто сопровождается центростремительным транспортом внутриклеточного содержимого, а также частиц, расположенных на поверхности клеток и связанных с актиновым цитоскелетом через мембранные гликопротеиновые рецепторы. В экспериментах часто используются связанные с конканавалином микросферы, 0.5 мкм в диаметре (111). Частицы спонтанно или при помощи лазерной ловушки, прикрепленные к поверхности клетки, двигаются центростремительно. Скорость движения частиц коррелирует со скоростью центростремительного транспорта актин-содержащих структур в цитоплазме (59). Подобное движение наблюдается только у клеток, способных к локомоции. Эти наблюдения показывают особую функциональную роль активного края ламеллы.

Если частица прикреплена к какой либо другой части ламеллы за пределами активного края, ее движение ограничивается медленным диффундированием на одном месте.

Использование латексных частиц для исследования оказалось очень продуктивным, т.к. таким образом можно оценивать направление сил натяжения в актиновом цитоскелете, а также их изменения во время различных процессов, таких как, например, установление межклеточного контакта.

Важно подчеркнуть, что кругооборот актин-содержащих структур в фибробласте способствует поляризации псевдоподиальной активности. Постоянное перераспределение актиновых структур приводит к тому, что псевдоподиальный материал направляется в те области клетки, в которых в

данный момент времени существуют оптимальные внешние условия для формирования псевдоподий. Таким образом, возникает поляризация клетки -

и 1 __V/ и V

создание такой морфологии, при которой активный край, на котором формируются псевдоподии, располагается с одной стороны фибробласта, что приводит к его направленному движению. Поляризация псевдоподиальной активности, вызванная внешними факторами, стабилизируется за счет реорганизации актинового цитоскелета (186).

Таким образом, возникает зональная организация актинового цитоскелета у фибробластов (9, 5, 7). Исследования тонкой структуры системы микрофиламентов, проведенные с использованием метода платиновых реплик, показали, что в фибробластах актиновый скелет имеет следующие зоны:

1.) Самая дистальная зона активного края, содержащая густую сеть микрофиламентов;

2.) Зона ламеллы, следующая по направлению к центру клетки и содержащая многочисленные сократимые структуры - стрессфибриллы;

3.) Зона эндоплазмы, самая проксимальная, закрытая дорзальным пластом микрофиламентов.

Важным аспектом функционирования актинового цитоскелета является его взаимодействие с системой микротрубочек. Если актиновый кортекс отвечает за движение клеток, то система микротрубочек - за организацию этого движения (187).

По данным иммунофлуоресцентной микроскопии в поляризованных клетках, имеющих часто протяженные стабильные участки клеточного края, микротрубочки ориентируются параллельно этим стабильным краям (8).

Процессы, сопряженные с высокой степенью поляризации псевдоподий, такие как движение фибробластов по субстрату или рост нейронов, в большой степени зависят от интактности системы микротрубочек. Деполимеризация системы микротрубочек специфическими агентами ингибирует направленное движение фибробластов (65, 189). Под действием этих агентов фибробласты

утрачивают поляризованную форму, начинают выбрасывать псевдоподии в разных направлениях, все участки клеточного края становятся активными.

Деполимеризация микротрубочек сопровождается также увеличением сократимости актинового кортекса. При этом происходит увеличение количества стрессфибрилл и возрастает способность клеток, распластанных на эластичном субстрате, формировать складки этого субстрата (49). Возможно, система микротрубочек понижает сократимость актинового кортекса, способствуя вытягиванию псевдоподии на активном крае клетки.

Иммунофлуоресцентные исследования распределения промежуточных филаментов в фибробластах показали, что они образуют радиальную густую сеть по всей цитоплазме, несколько разрежающуюся к периферии (173, 191).

2. Эпителиальные неполяризованные клетки.

Одиночные эпителиоциты в ходе распластывания приобретают дискоидную форму и не двигаются направленно по субстрату. Псевдоподиальная активность в таких клетках распределена по всему периметру. Псевдоподиальная активность в эпителиальном островке или в монослое, заживляющем рану распределена по внешнему периметру, на участках края, не образующих контакта с соседними клетками. Таким образом, псевдоподиальная активность эпителиальных клеток не является поляризованной в каком-либо определенном направлении.

Характерной особенностью эпителиальных клеток является их способность образовывать обширные и прочные межклеточные контакты. Множество эпителиоцитов, контактирующих друг с другом, формируют монослой, сцепленных между собой клеток. В составе клеточных пластов эпителиальные клетки оказываются поляризованными относительно базоапикальной оси (161, 162). Клеточная поверхность разделяется на апикальную и базо-латеральную при помощи адгезионных поясов, полосы

межклеточных контактов, опоясывающих каждую клетку в составе эпителиального пласта или островка.

При флуоресцентной окраске на актин в эпителиальных клетках выделяется несколько видов структур: кольцевой пучок актиновых микрофиламентов и расположенные под разными углами к клеточному краю пучки, стресс-фибриллы.

Главная особенность организации актина в эпителиальных клетках -кольцевой пучок актина. В одиночных эпителиальных клетках с псевдоподиальной активностью, распределенной по всему клеточному периметру, такой пучок замкнут в кольцо. В периферических клетках эпителиального островка или на краю монослоя, имеющими псевдоподиальную активность лишь в тех участках клеточного края, которые не образуют контактов с соседними клетками, такой пучок имеет вид незамкнутой дуги.

Еще один тип структур - прямые пучки актиновых филаментов, стресс-фибриллы, располагающиеся в цитоплазме под разными углами к краю клетки и заканчивающиеся фокальными контактами с субстратом, в которых выявляются винкулин и другие специфические белки. Стрессфибриллы имеются в одиночных дискоидных эпителиоцитах и в клетках, организованных в монослой. Межклеточные контакты адгезионного типа, ассоциированы с актиновыми филаментами, поэтому при флуоресцентном окрашивании на актин эти контакты выглядят как тонкий ободок вокруг клетки в апикальной части (67).

В одиночных эпителиоцитах, в краевых клетках эпителиального островка или пласта, движущегося в рану, где имеется свободный край с псевдоподиальной активностью, актиновый цитоскелет имеет зональную организацию (6). Самой дистальной является зона активного края, содержащая густую сеть микрофиламентов и примыкающую к ней зону разрежения. Следующей в направлении от периферии к центру клетки является зона

собственно ламеллы. Она содержит прямые пучки актиновых филаментов или стрессфибриллы.

Центром организации микротрубочек культивируемых эпителиоцитов является центросома, локализованная около ядра. От нее цитоплазматические микротрубочки расходятся радиально к клеточной периферии, где либо заканчиваются, либо изгибаются и поворачивают.

В результате функциональной базоапикальной поляризации эпителиальных клеток в ходе образования эпителиальных пластов распределение микротрубочек меняется (17, 161). В ходе поляризации центросомы смещаются к апикальной мембране, микротрубочки оказываются организованными в сеть, расположенную в апикальной части клетки, и пучки микротрубочек, вытянутых вдоль базолатеральной оси клетки, минус и плюс концы которых расположены в апикальной и базальной частях клеток, соответственно.

Промежуточные филаменты в эпителиоцитах формируют густую сеть и прикреплены к плазматической мемране в области десмосом (132, 173,191).

3. Изменения морфологии клетки под действием факторов

трансформации.

Изменения морфологии клетки может происходить под воздействием действием ряда факторов. Например, показано, что под действием цитокина НОБ^ нормальные эпителиальные клетки теряют контакты с соседями, поляризуются и приобретают способность направленно двигаться (54, 149, 174). При распластывании на малоадгезивном или неоднородно адгезивном субстрате, в норме дисковидные, хорошо распластанные клетки линии 1АЯ-2 поляризуются, а степень их распластанности существенно снижается (52).

При неопластической трансформации морфология культивируемых клеток также меняется: происходит ухудшение распластывания клеток,

нарушение межклеточных контактов, вытягивание и поляризация клеток (2, 188). Подобные изменения удобно изучать, используя линии, имеющие общее происхождение, но находящиеся на различных стадиях опухолевой прогрессии, будучи трансформированными спонтанно или посредством канцерогенных веществ. Примером такой линии являются длительно культивируемые линии клеток крысиной печени IAR-2, полученные Монтесано (133, 134,18)

В эпителиальных культурах в зависимости от степени трансформации, клетки последовательно утрачивают признаки, присущие эпителию в норме (102, 3, 4). На начальных этапах опухолевой прогрессии ослабевают межклеточные контакты, клетки приобретают способность расти поодиночке, при этом сохраняя дискоидную форму и псевдоподиальную активность, распределенную по всему периметру клетки. На следующих этапах появляются стабильные участки края, доля которых по отношению к псевдоподиально активным участкам с возрастанием степени трансформации клеток увеличивается. Клетки при этом приобретают фибробластоподобный поляризованный фенотип. Все эти изменения происходят последовательно и сопровождаются возрастанием опухолеродного потенциала клеток (133,134).

Аналогичные изменения морфологии претерпевают эпителиальные клетки с трансдуцированными онкогенами (20). Эпителиоциты линии IAR-2 устойчиво экпрессирующие экзогенный онкоген Ras, утрачивают дисковидную форму, приобретая фибробластоподобный поляризованный фенотип, степень их распластанности уменьшается (71, 72).

Морфология фибробластов также изменяется под действием факторов трансформации. Конститутивная экспрессия активированных онкогенов вызывает резкое повышение локомоторной активности и стоикие морфологические изменения, характерные для неопластических клеток (73).

Молекулярные механизмы, определяющие возникновение локомоторного фенотипа, как в нормальных клетках при митогенных сигналах, так и при неоплпстической трансформации, пока не ясны. В нашей работе были

использованы линии эпителиоцитов и фибробластов, стабильно экспрессирующие экзогенный мутантный онкоген N-Ras. Далее будет подробно охарактеризовано действие онкогена Ras в клетке.

II. ДЕЙСТВИЕ ОНКОГЕНА RAS.

Онкогены v-Ras являются мутантной формой клеточных онкогенов с-Ras (Ras: N-Ras, H-Ras и K-Ras) и впервые были обнаружены как онкогены трансформирующих ретровирусов. Активированные онкогены Ras были идентифицированы в различных злокачественных опухолях человека, включающих эпителиальные карциномы легких, толстого кишечника и поджелудочной железы (19). Клетки этих опухолей, также как и клетки, которые были трансформированы в экспериментальных условиях активированными Ras, характеризовались значительными морфологическими изменениями. Считается общепринятым, что Ras воздействует на цитоскелет и, в частности на клеточную адгезию, через изменения в процессах проведения сигнала. Очень многие рецепторы в клетках эукариот используют путь активации Ras для передачи сигнала внутрь клетки.

Чтобы осветить конкретную роль Ras в определении морфологии и жизнедеятельности клетки, в частности в функционировании актинового цитоскелета в процессах клеточной адгезии, остановимся подробнее на некоторых внутриклеточных системах трансдукции сигнала.

1. Ras - представитель семейства малых GTPa3, эффекторы Ras.

Ras-белки - суперсемейство малых GTPa3, регулирующих различные аспекты клеточной пролиферации, дифференцировки и морфологии. Суперсемейство Ras включает, по крайней мере, 9 различных семейств: Ras, Rab, Rho, Ran, Rheb, Rad/Gem, Rin/Rit и Arf (200).

Семейство малых СГРаз использует для реализации своих функций цикл связывания/гидролиза GTP и может существовать в двух формах: неактивной GDP- и активной GTP-связанной (122). вТРазный цикл включает также несколько известных белков-регуляторов. К таким белкам относятся факторы-катализаторы двух типов: GAPs (GTPase Activating Proteins, повышающих константу гидролиза связанного GTP) и GEFs (Guanine nucleotide Exchange Factors, ускоряющих диссоциацию комплекса Ras/GDP) (36,113).

Предполагается, что несколько эффекторов Ras, в первую очередь Raf и GTPa3bi семейства Rho (Rho, Rae и Cdc42) ответственны за проявление морфологической трансформации и стимуляцию локомоторной активности неопластических клеток (33, 200, 160, 85). Ключевую роль здесь, по-видимому, играет активация двух сигнальных каскадов: Ras-Raf-ERK и Ras-PI3K-Rac (200, 33).

Киназы семейства Raf (c-Raf-1, A-Raf, B-raf) - одни из непосредственных мишеней Ras (50, 126, 197). Предполагается, что роль Ras (подмембранного белка) в активации Raf заключается в изменении локализации последнего. Активированный Raf фосфорилирует и тем самым активирует MAP (Mitogen-Activated Protein) киназные каскады, конечные продукты которых, такие как ERK (МАРК), р38 и JNK (SAPK), транслоцируются из цитоплазмы в ядро, где они фосфорилируют и активируют множество субстратов, в том числе такие транскрипционные факторы как Jun, Tcf, Elkl и др. Это, в свою очередь, вызывает активацию ряда других факторов транскрипции (34, 121). Такой киназный каскад во много раз усиливает начальный сигнал.

Другими известными субстратами Ras являются: PI3K (Phosphatidil-Inositol-3-OH Kinase), главный фермент фосфатидилинозитол-3-киназного пути (159); Ral - стимулятор диссоциации гуаниновых нуклеотидов (170, 120); Rinl (связанный с Ras белок) (81) и AF-6 (ALL-1 Fusion partner from chromosome 6) (198). Следующим звеном в сугнальном пути Ras-PI3K-Rac являются Rae, Rho и Cdc42, контролирующие организацию актинового цитоскелета (80, 120). Rho

играет важную роль в Ras-индуцируемой трансформации фибробластов (148, 150) и эпителиоцитов. При трансформации последних Rho-индуцируемое повышение сократимости оказалось одним из условий для установления фибробластоподобного фенотипа (199).

В следующем разделе будет подробно рассмотрено, каким образом представители семейства Rho влияют на организацию актинового цитоскелета.

2. Rho, Rae и Cdc42 и организация актина.

В настоящее время идентифицированно по крайней мере 14 белков семейства Rho у млекопитающих (200). Наиболее изученными к настоящему времени являются Racl, RhoA, и Cdc42.

Было показано, что Rho, Rae и Cdc42 индуцируют различные морфологические изменения в клетках линии Swiss ЗТЗ, основанные на перестройках F-актина. Так, инъекция Cdc42 в клетку вызывала формирование филоподий, Rae индуцировал раффлинг, a Rho - формирование стресс фибрилл (140). Эти специфические морфологические изменения, в случае их индукции внешними агентами, можно заблокировать введением доминантно-негативной формы соответствующего белка. Инъекция доминантно-негативного Cdc42 блокировала формирование филоподий, индуцированное брадикилином (140, 110). Действие EGF (Epidermal Growth Factor), РМА (Phorbol Miristin Acetate) и бомбезина, индуцирующих формирование раффлов, было блокированно введением доминантно-негативного Rae (151). Инактивация Rho специфической СЗ экзотрансферазой из Clostridium botulinum блокировала формирование стресс фибрилл, вызванное LPA (Lisophosphatidic Acid) (156, 152). Таким образом, Rho, Rae и Cdc42 определяют морфологические изменения, вызванные различными внешними сигналами. Кроме того, перечисленные внешние агенты могут активировать более, чем одну Rho GTPa3y, и каждая Rho GTPa3a может активировать другую. Например, Cdc42 может активировать Rae, а Rae - Rho.

За последние годы достигнут определенный прогресс в идентификации внутриклеточных мишеней для Rho, Rae и Cdc42, через которые осуществляется передача сигнала вниз, в частности на актиновый цитоскелет. Остановимся подробнее на некоторых из этих мишеней.

Манзером и соавторами в качестве субстратов как для Rae, так и для Cdc42, были выделены две киназы: р65РАК, серин/треониновая киназа, и р120АСК, тирозиновая киназа (119). Причем, связывание с Rae или с Cdc42 повышает киназную активность р65РАК в 50 раз. Детальное исследование сайта взаимодействия р65РЛК с Cdc42/Rac выявило, что этот сайт представляет собой мотив протяженностью в 18 аминокислот, называемый CRIB (Cdc42/Rac Interactive Binding) мотив (29). Известно большое количество белков из разных организмов, содержащих CRIB последовательность и, следовательно, потенциальный сайт связывания с Cdc42/Rac. У млекопитающих обнаружено по крайней мере три таких белка, называемых MSE55, WASP (продукт локуса синдрома Вискотт-Алдрича) и MLK2/3 (серин/треониновая киназа) (107, 176).

Среди других белков-субстратов Rae и Cdc42 следует отметить IQGAP (1 и 2). IQGAP обнаруживается в области мембранного раффлинга. Это большой белок (190 kDa), содежащий много функциональных доменов, в частности калмодулин-связывающий и RasGAP домен. Однако ни GAP активности, ни взаимодействия с Ras для IQGAP обнаружено не было (28, 83). Другой белок, POR-1 (Partner of Rac-I), является субстратом исключительно Rae. При микроинъецировании неполной формы белка мембранный раффлинг угнетается, что выявляет определенную роль POR-1 в Rac-индуцированном мембранном раффлинге (185).

Одним из важнейших последствий гиперфункции Rae является стимуляция еще одного MAP киназного каскада, конечный продукт которого JNK, вызывает активацию транскрипционных факторов Jun и ATF2, функция которых представляется весьма важной для индукции морфологических изменений (141,116, 53).

Большинство белков, известных как мишени Rho, взаимодействуют с GTP-связанной (активной) формой Rho. К настоящему времени, известны некоторые из таких белков. Один из них Rho-K, или ROKa, (р164 Rho-associated kinase). Другой - ROCK, близкий родственник Rho-K, (pi60 Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase) (115, 96, 124). Результатом взаимодействия Rho и Rho-K является небольшое повышение киназной активности, а также перемещение Rho-K из цитозоля к плазматической мембране, где, по-видимому, локализуются ее субстраты (115). Одним из субстратов для Rho-K является миозин-связывающая субъединица (MBS) MLC (Miosin Light Chain) фосфатазы (103). Фосфорилирование MBS приводит к уменьшению фосфатфзной активности MLC-фосфатфзы. Уровень фосфорилирования MLC регулируется позитивно MLC-киназой, а негативно -MLC-фосфатазой. Таким образом, активация Rho приведет к увеличению уровня фосфорилирования MLC.

Увеличение уровня фосфорилирования MLC, возможно, является ключевым пунктом в понимании принципов воздействия Rho на актиновый цитоскелет, а также на формирование фокальных контактов. Многие агенты, известные как активаторы Rho, такие как вазопрессин, эндотелии и LPA, стимулируют сократимость клеток. Было показано, что в фибробластах LPA индуцирует фосфорилирование MLC, которое, в свою очередь, сопровождается формированием стресс-фибрилл, фокальных контактов и повышением сократимости (37). Rho-зависимое сокращение фибробластов можно блокировать «ингибитором сокращения», таким как, например, ингибитор MLC-киназы КТ5926, что приводило к уменьшению уровня фосфорилирования MLC и утрате фокальной адгезии и стресс фибрилл. Таким образом, активация Rho, приводящая к увеличению сократимости, стимулирует формирование стресс-фибрилл и фокальных контактов.

Другим известным субстратом Rho является PKN (Protein Kinase N), в большой степени гомологичная РКС и содержащая серин/треониновый

киназный домен (16, 192). PKN также связывается с GTP-формой Rho и это взаимодействие можно ингибировать СЗ экзотрансферазой. Взаимодействие Rho с PKN приводит к незначительному повышению киназной активности, а также к изменению внутриклеточной локализации последней. О субстратах PKN и о ее возможной роли в передаче сигнала от Rho на цитоскелет известно немного.

Рофилин, ротекин и цитрон также являются мишенями Rho (192, 153, 118). Их роль в передаче сигнала пока неясна.

Таким образом, к настоящему моменту описано уже большое количество белков-мишеней малых GTPa3. Задача будущих исследований заключается в исследовании вклада каждого из этих белков в процесс передачи сигнала и их возможной роли в динамике актинового цитоскелета.

III. КЛЕТОЧНАЯ АДГЕЗИЯ: АДГЕЗИЯ С ВНЕКЛЕТОЧНЫМ МАТРИКСОМ, МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ КОНТАКТЫ.

Функциональными единицами клеточной адгезии явлются примембранные мультибелковые образования, включающие, как правило, три белковых комплекса: молекулы адгезии, или адгезионные рецепторы, примембранный цитоплазматический комплекс белков, который своим дистальным участком (относительно клеточной мембраны) связан с элементами цитоскелета. Рецепторы клеточной адгезии представляют собой трансмембранные гликопротеины, экспонированные на внешней клеточной поверхности и определяющие специфичность узнавания в процессах межклеточной адгезии и адгезии с субстратом. Среди них встечаются члены таких крупных белковых суперсемейств, как интегрины, кадхерины, иммуноглобулины, селектины и протеогликаны. У внутренней поверхности плазматической мембраны, адгезионные рецепторы взаимодействуют с целым комплексом примембранных белков. Эти белки служат для взаимодействия с цитоскелетом, для регулирования функций адгезионных рецепторов, а также для трансдукции сигналов с клеточной поверхности.

В этой главе будут всесторонне охарактеризованы различные виды клеточной адгезии, включающие адгезию с субстратом и межклеточные соединения. Большее внимание будет уделено кадхериновой межклеточной адгезии, что представляется особенно уместным в связи с целью данного исследования. Однако вначале остановимся на адгезии с субстратом, фокальной адгезии, поскольку этот тип контактных взаимодействий наиболее изучен к настоящему моменту.

1. Фокальная адгезия.

Фокальная адгезия прикрепляет клетки к внеклеточному матриксу, который может быть представлен различными гликопротеинами, такими как коллаген, ламинин, фибронектин, протеогликаны и многими другими (135).

Наиболее известными рецепторами фокальной адгезии, взаимодействующими с белками внеклеточного матрикса, являются интегрины, представители большой семьи гетеродимерных трансмембранных белков, а и (3 субъединицы которых в разных сочетаниях формируют более 20 рецепторов к различным белкам внеклеточного матрикса. Так, а5(31 интегрин представляет собой фибронектиновый рецептор, абр4 - ламининовый, алфЗ - витронектиновый (94, 167, 39).

Кластеры интегриновых рецепторов связываются с актиновым цитоскелетом через примембранный комплекс цитоплазматических белков, таких как винкулин, а-актинин, талин, паксиллин, тенсин и другие (101, 76, 45, 31, 194).

Непосредственно с актиновыми филаментами взаимодействуют талин и а-актинин. Винкулин содержит сайты для связывания с актином, талином и а-актинином, и таким образом стабилизирует межбелковые взаимодействия в адгезионном комплексе. Кроме того, винкулин способен самоассоциироваться и находится в такой конформации, когда его сайты связывания с другими белками недоступны. Эти сайты экспонируются после стимуляции Р1Р2 (Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate), который образуется из PIP (PhosphatidyHnositol-4-phosphate) при помощи РГР-5 (Phosphatidylinositol-4-phosphate-5) киназы, известной как субстрат Rho.

Адгезия клетки к внеклеточному матриксу генерирует трансмембранные сигналы, воздействующие на размножение, дифференцировку и выживание клетки. В состав белкового комплекса фокальной адгезии входят нерецепторные тирозиновые и серин/треониновые киназы, такие как, например, ppl25FAK, FAK, (Focal Adhesion Kinase) и изоформы РКС (30).

Активация FAK в процессе адгезии с субстратом приводит к фосфорилированию по тирозину паксиллина, тенсина и P130cas. Далее сигнал передается через адапторные белки и факторы обмена нуклеотидов на Ras и далее через MAP киназный каскад в ядро. В некоторых трансформированных

клетках FAK конститутивно активирована, что, по-видимому, обеспечивает независимый от субстрата рост этих клеток (74). Кроме центральной роли в интегриновой сигнализации, FAK также является супрессором апоптоза в эпителиальных клетках. Интересно, что в этом процессе, по-видимому, не участвует классический каскад MAP киназ (61). Была выделена новая серин/треониновая киназа IGL, которая, возможно и осуществляет эту функцию (82).

Как уже отмечалось, сборка фокальных адгезий зависит от активации Rho (глава 1, 2.2) при помощи ростовых факторов. Происходящее при активации Rho фосфорилирование (или редукция дефосфорилирования) легких цепей миозина II приводит к увеличению сократимости, что, по-видимому, центральное звено в цепи событий, приводящих к формированию фокальной адгезии.

Эволюция индивидуального фокального контакта включает несколько этапов: формирование, созревание и, иногда, разборка. Формирование начального фокального контакта обычно осуществляется на активном краю клетки (99, 24). Взаимодействие с белками внеклеточного матрикса на этой начальной стадии приводит к конформационному изменению цитоплазматического домена интегринового рецептора, что приводит к связыванию со структурными и сигнальными компонентами адгезионного комплекса (194). Начальные фокальные контакты на активном краю движущегося фибробласта выглядят как маленькие точки или пятнышки (100). Во время движения клеточного края вперед фокальные контакты удлиняются и ассоциируются со стресс фибриллами (24).

Была предложена модель, объясняющая процесс созревания фокального контакта (146). В центральных частях актинового кортекса, прикрепленного своими терминальными участками к фокальным контактам, развивается центростремительное натяжение (в результате сокращения индуцируемого внешним сигналом в ответ на начальное прикрепление). В результате

подобного натяжения актиновые филаменты выстраиваются тангенциально относительно плазматической мембраны и прижимают вентральную часть мембраны к субстрату, тем самым приближая внеклеточные участки интегриновых рецепторов к их лигандам и механически способствуя их взаимодействию и сигнализации. Таким образом, удлинение фокальных контактов через усиление натяжения может значительно воздействовать на сигнальную трансдукцию в этих участках.

Натяжение актинового кортекса оказалось важнейшим элементом функционирования фокальной адгезии. Например, изменение натяжения значительно усиливает сборку фокальных контактов под действием ростовых факторов (32, 155, 37) Усиление натяжения клетки при деполимеризации микротрубочек в среде с недостатком сыворотки вызывает сборку фокальных контактов даже при отсутствии ростовых факторов (23).

Последствия изменения натяжения актинового кортекса под воздействием различных агентов, возможно, находят свое отражание и в других клеточных системах. Однако это направление исследований еще ждет своих результатов.

2. Адгезионные соединения. Кадхериновая адгезия.

Способность клеток устанавливать межклеточные соединения - одно из важнейших свойств, определяющее возможность отдельных клеток формировать трехмерные клеточные ансамбли, различные ткани и органы.

2.1. Организация кадхеринового межклеточного контакта.

Межклеточная адгезия определяется

Са + зависимыми, гомотипическим связыванием между трансмембранными гликопротеинами, кадхеринами (179), составляющими семейство белков со сходной первичной структурой. E-, N- и Р- кадхерины - наиболее хорошо охарактеризованные представители семейства классических кадхеринов, которое принадлежит еще более обширному суперсемейству кадхеринов.

Наиболее изученным представителем семейства в отношении формирования стабильных адгезионных структур в эпителиальных тканях является Е-кадхерин (увоморулин) (рис.1). 1Ч-кадхерин экспрессируется в кардиомиоцитах (67), нервных клетках и скелетных мышцах. Было показано, что Ы-кадхерин также экспрессируется в первичных куриных фибробластах, в то время как, Р-кадхерин в нормальных крысиных фибробластах (69, 98). Я-кадхерин обнаружен в клетках сетчатки (95). Сопоставление аминокислотных последовательностей различных кадхеринов показало, что примерно 50% из них консервативно (84). Наиболее консервативен цитоплазматический домен (69-89%). В ТчГ-концевом домене консервативность возрастает от N к С-концу.

F-actn

Рис.1. Межмолекулярные взаимодействия в межклеточном контакте.

Димеры Е-кадхерина непосредственно взаимодействуют с плакоглобином (Pg) или (3-катенином (peat). N-концевой участок Pg/(3cat связывается с N-терминальной половиной а-катенина (acat), который в свою очередь взаимодействует с а-актинином (аА). Далее аА непосредственно взаимодействует с F-актином и винкулином (V).

Звездочками показаны возможные сайты фосфорилирования (см. текст). По Cowin Р, Burke В, 1996 (43).

N-концевая внеклеточная часть белка включает в себя 5 доменов, ЕС1-ЕС5 (рис.1). При исследовании трехмерной структуры было выявлено, что N-терминальный ЕС1, домен, отвечающий также за Са2+ зависимое гомотипическое связывание с соседней клеткой, формирует димер с соседним N-терминальным ЕС 1-доменом. В результате межклеточного контакта формируется структура подобная застежки молнии, где каждый зубец представляет собой димер N-конца кадхерина (168). Однако остается неясным существует ли кадхериновый димер на поверхности до взаимодействия с соседней клеткой или димеризация вызвана межклеточным взаимодействием.

Цитоплазматический С-участок кадхерина непосредственно взаимодействует с р-катенином, плакоглобином (у-катенином) и в некоторых случаях с pl20cas (144, 44, 154). Сайты связывания для каждого из этих белков расположены очень близко друг к другу, что является взаимным стерическим препятствием для одновременного взаимодействия р-катенина, плакоглобина и pl20cas с одной молекулой кадхерина. Взаимодействие плакоглобина/р-катенина с кадхерином позитивно регулируется фосфорилированием по серину (171).

Интересно, что в нормальных клетках только небольшое количество кадхеринов оказывается связанным с pl20cas. Было показано, что частота взаимодействия кадхерина с pl20cas возрастает в шу-трансформированных клеточных линиях млекопитающих (105).

Последовательности плакоглобина и р-катенина на 65% идентичны. Участки гомологии представляют собой 13 последовательных 42аа повторов {armadillo повторы), расположенные между N-и С-концевыми доменами. Эти белки обеспечивают связь между кадхеринами и N-концевым участком а-катенина, еще одним представителем адгезионного комплекса, имеющим гомологию с винкулином (138). Классические кадхерины взаимодействуют с центральным участком молекулы р-катенина и плакоглобина (между 5-8

повторами), в то время как а-катенин - с N-терминальной частью и 1ым повтором (3-катенина или плакоглобина (85, 165).

Ассооциированный с мембраной комплекс белков связывается с актиновым цитоскелетом или непосредственно через а-катенин (при помощи как N-, так и С-терминальных участков), или через а-актинин (108,158).

В адгезионном комплексе а-актинин также часто оказывается связанным с винкулином. Способность молекул винкулина взаимодействовать между собой играет роль в возможности всего комплекса кластеризоваться в подмембранной области. При помощи электронного микроскопа были охарактеризованы электронноплотные участки, прилегающие внутри клетки к плазматической мембране и расположенные напротив друг друга в контактирующих клетках (68).

В большинстве работ указывается, что а-катенин не взаимодействует с pl20cas (48). Таким образом, р120саз/кадхериновый комплекс не взаимодействует с цитоскелетом. Это может служить объяснением слабой адгезии в ras-трансформированных клетках, где р120са8/кадхериновый комплекс доминирует (104).

В межклеточном адгезионном комплексе кроме вышеперечисленных было выделено еще несколько структурных белков. Такими белками являются цихсин, взаимодействующий с а-актинином (46); тенсин и радиксин, кепирующие +концы актиновых филаментов. Тенсин также может взаимодействовать с винкулином. (117,184, 68,22).

Как цитоплазматический домен кадхерина, так и ассоциированные с ним катенины существенны для полной функциональной активности кадхерина. Разрушение кадхерин/катенинового комплекса при помощи делеции цитоплазматического домена кадхерина приводит к неспособности такого мутантного кадхерина связываться с катенинами, а также с цитоскелетом. Кроме того, в этом случае нарушается межклеточное контактирование, несмотря на то, что внеклеточный домен кадхерина остается интактным (139,

143, 144). Эти результаты дают основание предположить, что в процессе межклеточного узнавания и адгезии необходимым условием является взаимодействие адгезионных белков с актиновым кортексом, что может определять компактное расположение кадхеринов и формирование адгезионного контакта (177, 127, 43).

При анализе ранних стадий межклеточного контакта выяснилось (51), что в клетках человеческих эпителиоцитов Е-кадхерин и р-катенин оказывались ассоциированными с Б-актином как до, так и после контакта между клетками. До контакта наличие взаимодействия было обнаружено в специальных выступах ламеллоподии, микроспайках.

Как уже отмечалось, кадхериновая адгезия Са2+-зависима. Кластеризация кадхериновых рецепторов в сайте межклеточного контакта и реорганизация актинового кольцевого пучка, сопровождающих формирование межклеточного контакта в эпителиальных клетках, осуществляется при 2 шМ концентрации ионов Са (77).

Приведенная модель кадхеринового межклеточного контакта представляет собой статическую картину активной динамической структуры. Для понимания роли межклеточной адгезии необходимо определить механизмы, при помощи которых регулируется функционирование адгезионного белкового комплекса в ответ на разнообразные внешние сигналы.

2.2. Сигнальная трансдукция в межклеточном адгезионном комплексе.

Несмотря на важность межклеточных адгезионных взаимодействий в жизнедеятельности организма, модель регуляции этих процессов в настоящее время выглядит весьма фрагментарно. Тем не менее некоторые механизмы, вовлеченные в регулирование функционирования межклеточного контакта были описаны.

2.2.1. Кадхерины как опухолевые супреееоры.

Недавние исследования показали, что трансмембранные рецепторы, кадхерины, вовлеченные в организацию адгезионных соединений, участвуют также в трансдукции сигнала и являются опухолевыми супрессорами, утрата функции которых приводит к трансформации.

Е-кадхерин супрессирует способность к инвазии и метастазированию в эпителиальных опухолевых клетках (26, 178). Утрата экспрессии и фукции Е-кадхерина приводит к увеличению инвазивности клеток в культуре, кроме того, недостаток или мутации Е-кадхерина коррелируют со способностью к инвазии и метастазированию в некоторых человеческих опухолях. Нокаут гена Е-кадхерина у мышей оказываются летальными на очень ранних стадиях развития, что безусловно затрудняет исследование его роли как опухолевого супрессора, но показывает насколько важен этот белок для развития организма (114).

Обнаружилось, что в клетках плоскоклеточного рака человека, экспресирующих N-кадхерин и обладающих распластанным фибробластоподобным фенотипом, подавлена экспрессия Е- и Р-кадхеринов (97). Экспрессия в этих клетках экзогенного антисенс N-кадхерином приводила к реверсии нормального эпителиального фенотипа и увеличению экспрессии Е-и Р-кадхеринов. Кроме того, в нормальных эпителиальных клетках с трансдуцированным N-кадхерином происходило уменьшение экспрессии Е- и Р-кадхеринов, что выражалось в фибробластоподобном фенотипе этих клеток. Во всех случаях, уровни экспрессии N- и Е-кадхеринов были обратно пропорционально взаимосвязаны. Было также показано, что чешуйчатые карциномы, клетки которых экспрессируют N-кадхерин in situ, более инвазивны. Таким образом, экспрессия N-кадхерина эпителиальными клетками может приводить к приобретению менее адгезионного фенотипа, типичного для инвазирующих опухолевых клеток.

Было показано, что в человеческих фибробластах экспрессируется множество кадхеринов: N, Р, РС43, human Fat, FIB1, FIB2, FIB3. FIB1 и FIB2 экспрессируются исключительно в фибробластах. Human Fat - гомолог опухолевого супрессора Fat у Drosophila (125).

2.2.2 ß-катенин - центральный элемент регуляции межклеточной адгезии.

Взаимодействуя непосредственно с кадхеринами и опосредованно с актиновыми филаментами через а-катенин, ß-катенин является одним из важнейших компонентов адгезионного комплекса (рис.2), ß-катенин может подвергаться фосфорилированию по тирозину и ассоциировать с трансмембранной тирозин-фосфатазой, которая, соответственно, способна дефосфорилировать ß-катенин in vitro (112). Фосфорилирование по тирозину ß-катенина коррелирует с уменьшением адгезии в ответ на стимул ростовыми факторами или при трансформации (105). Интересно, что ß-катенин является необязательным элементом в установлении рудиментарной межклеточной адгезии, при которой а-катенин непосредственно взаимодействует с цитоплазматической частью кадхерина (137). Эти факты свидетельствуют о том, что ß-катенин является регуляторным компонентом межклеточного адгезионного комплекса.

В клетках, активированных факторами роста, ß-катенин связывается с белками-членами ErbB семейства тирозин-киназных рецепторов, в том числе и с рецептором EGF (рис.2) (169, 91). Значение этого связывания для активации ErbB сигнального пути пока обсуждается.

Рис.2. Молекулярная организация и сигнальная трансдукция в межклеточном адгезионном комплексе.

Межклеточный контакт осуществляется при помощи кадхериновых трансмембранных рецепторов, которые взаимодействуют с актиновым цитоскелетом (actin) через катенины: а-катенин (а), ß-катенин (ß), у-катенин, или плакоглобин (PI). В этом соединении также принимают участие такие белки, как винкулин (V), а-актинин (a-Act) и зиксин (zyxsin). Радиксин (Rad) и теснин (tesnin) кэпируют концы актиновых микрофиламентов. Сигналы могут генерироваться межклеточным контактом при помощи взаимодействия внеклеточных участков, кадхеринов (Cad), которые внутри клетки связываются с катенинами, что может изменять уровень свободного ß-катенина и плакоглобина, которые также могут взаимодействовать с опухолевых супрессором АРС или факторами транскрипции, такими как, например, LEF-1 (Lymphoid Enhancer Factor-I).

(рис.2 продолжение) Комплекс (3-катенин/ LEF-1 (или плакоглобин/ LEF-1) может перемещаться в ядро и непосредственно связываться с 5' концом гена Е-кадхерина (E-Cad) и другими генами,регулируя их экспрессию. (3-катенин и плакоглобин также участвуют в Wnt-сигнальном пути, который включает рецептор Wnt (Dfz2 у Drozophila), Dsh и GSK3p(GSK). Ассоциация АРС с микротрубочками (Mt) может оказывать негативный эффект на пролиферацию. Взаимодействие с тирозинкиназными рецепторами, такими как EGF рецептор (EGFR) или Erb-B2 рецептор (Erb-B2) с р-катенином и плакоглобином, возможно, также имеет определенное значение для передачи сигнала. С межклеточным контактом оказываются ассоциированы протеин киназы Src, протеин киназа С (РКС).

По Ben-Ze'ev A. Cytoskeletal and adhesion proteins as tumor suppressors. Curr.Opin.Cell Biol., 9, 99-108, 1997 (22).

Обнаружение гомологии ß-катенина и плакоглобина с белком, продуктом гена сегментной полярности у Drosophila Armadillo (Arm), который является компонентом wnt/wingless сигнального пути, контролирующего процессы эмбриогенеза, позволило предположить, что эти адгезионные белки также вовлечены в сходные сигнальные процессы у позвоночных (76, 130). Было показано, что оверэкспрессия ß-катенина в эмбрионах Xenopus вызывала дополнительную закладку дорзальной мезодермы (63). Ингибирование экспрессии ß-катенина подавляло формирование мезодермы как у Xenopus, так и в мышиных эмбрионах (79, 86). Кроме того, как ß-катенин в культивируемых мышиных клетках, так и Arm из Drosophila аккумулируются в цитоплазме при активации wnt/wingless сигнала (145) и оба белка на определенных стадиях развития обнаруживаются в ядре.

/ Под действием сигнала от wnt-рецептора ß-катенин акомулируется в цитоплазме и взаимодействует с LEF-1 (Lymphoid Enhancer Factor-!), фактором транскрипции, роль которого заключается в переносе ß-катенина из цитоплазмы в ядро (рис.2). В ядре комплекс ß-KaTeHHH/LEF-l взаимодействует с промотором гена Е-кадхерина, препятствуя его экспрессии, что приводит к формированию премезенхимных клеток. Таким образом ß-катенин функционирует как фактор транскрипции. Комплекс ß-катенин/ LEF-1 может также оказывать позитивное влияние на транскрипцию мезенхимальных генов (92). Было показано, что закладка мезодермы сопровождается уменьшением экспрессии Е-кадхерина и увеличением экспрессии LEF-1.

Еще одним фактором, конкурирующим с кадхеринами за связывание с ß -катенином является АРС (Adenomatous Polyposis Coli), продукт гена опухолевого супрессора, мутации которого связаны с раком толстого кишечника у человека (147). В SW480 линии раковых клеток, в которых АРС утрачивает свою функцию, уровень цитоплазматического ß-катенина повышен; восстановление функции АРС приводит к уменьшению количества ß-катенина в цитоплазме (136). Предполагается, что АРС играет определенную роль в

контролировании цитоплазматического уровня ß-катенина/плакоглобина и также является участником wnt/wingless сигнального пути. Взаимодействие АРС с ß-катенином регулируется GSK (Glycogen Synthase Kinase), серин/треониновой киназой (164). Функции АРС в клетке недостаточно ясны. Однако, показано связывание АРС и микротрубочек in vitro, что может играть определенную роль во взаимодействии цитоскелетных структур в клетке.

Обнаружилось также, что ß-катенин и плакоглобин взаимодействуют с актин-связывающим белком, фасцином (180). Фасцин вовлечен в формирование пучков F-актина, в частности в сайтах клеточной подвижности, таких как филоподии и ламеллоподии, а также связан с актином стресс-фибрилл. Фасцин и ß-катенин колокализованы в ведущем клеточном крае, так же как и в участках межклеточной адгезии. Это взаимодействие независимо от кадхерина, однако, оказалось, что цитоплазматический домен кадхерина и фасцин конкурируют за один и тот же сайт связывания с ß-катенином.

Согласно всем этим исследованиям ß-катенин - центральный регуляторный компонент адгезионного комплекса, способный взаимодействовать с белками-компонентами различных внутриклеточных систем, такими как кадхерины, АРС, фасцином, факторами транскрипции и EGF-рецепторами (196).

2.2.3. Роль малых GTPa3 в функционировании межклеточного контакта.

Как уже упоминалось члены надсемейства малых GTPa3, играют существеную роль в жизнедеятельности адгезионных структур и ассоциированых с ними актиновых микрофиламентов.

Известно, что малые GTPa3bi Rho и Rae могут локализоваться в сайтах межклеточной адгезии (15). Было показано, что один из факторов обмена нуклеотидов (GEF), smgGDS, содержит armadillo повторы (90), характерные также для белков-членов адгезионного комплекса, ß-катенина, плакоглобина и pl20cas, участвующих также в регулировании межклеточной адгезии. Кроме

того, обнаружилось, что Racl принимает участие в аккумуляции актина и миозина в межклеточных взаимодействиях в процессах развития у Drosophila (58). Таким образом, очевидно, что малые GTPa3bi вовлечены в межклеточное адгезионное взаимодействие, однако до последнего времени оставалось неясным, насколько это участие важно для установления и функционирования межклеточного контакта.

Брага и соавторам удалось показать, что присутствие Rho и Rae в клетках линии нормальных человеческих кератоцитов - необходимее компоненты межклеточной адгезии (27). В этом исследовании, при микроинъекции СЗ трансферазы и N17Rac, ингибиторов Rho и Rae, соответственно, кадхериновый комплекс избирательно удалялся из участков межклеточной адгезии, в то время как десмосомы, содержащие другие члены семейства кадхеринов и не взаимодействующие с актиновыми микрофиламентами, не были разрушены. Причем, «уход» кадхеринов из сайтов межклеточного контакта временно компенсировался CD44 и интегринами, рецепторами, также ассоциированными с актиновыми микрофиламентами. Rho в данном взаимодействии играет более важную роль. Конститутивно активированная форма Rae (L61Rac) оказалась неспособной индуцировать восстановление присутствия кадхеринов в контактах, блокированного СЗ трансферазой. В то время как коинъекция Rho-химерного белка, нечувствительного к ингибирующему эффекту СЗ трансферазы, быстро восстанавливала присутствие кадхеринов в межклеточных взаимодействиях. Возможно, что, роль Rae в данном случае заключается в активации Rho. Кроме того, во время индукции Са2+ -зависимой межклеточной адгезии, наблюдалась быстрая аккумуляция актина в сайтах межклеточного контакта, которая могла быть ингибирована блокированием функции кадхеринов, а также Rho и Rae активности.

Воздействие Ras на межклеточную адгезию также осуществляется хотя бы частично при посредничестве Rho GTPa3. В Ras-трансформированных

эпителиоцитах, с более фиброблаетоподобным фенотипом, наряду с увеличением количества стресс-фибрилл и фокальных контактов, разрушаются кадхериновые межклеточные контакты (104). При блокировании активности Rho микроинъекцированием СЗ трансферазы или доминантно негативного RhoA нормальный эпителиоцитный фенотип восстанавливался лишь частично, межклеточная адгезия оставалась нарушенной.

Таким образом, было показано, что Rho и Rae необходимы для установления кадхериновой межклеточной адгезии. Реорганизация актина необходима для стабилизации рецепторов в контакте, однако механизмы, благодаря которым осуществляются перестройки актина, пока не ясны.

3. Другие виды межклеточных взаимодействий.

3.1. Десмосома.

Десмосомы - наиболее распространенные адгезионные элементы в эпителиях и сердечной мышце. В отличии от кадхериновой адгезии, десмосомы связаны с промежуточными филаментами (в эпителии - с цитокератинами, а в сердце - с десминовыми филаментами). Вместе десмосомы и промежуточные филаменты формируют в тканях непрерывную сеть. Адгезионные рецепторы в десмосомах - члены суперсемейства кадхеринов, десмоглеины и десмоколлины, среди которых встречаются тканеспецифически экспрессирующиеся изоформы (66). Десмоглеины и десмоколлины прикреплены к промежуточным филаментам при помощи нескольких цитоплазматических белков, таких как десмоплакины и плакоглобин. Десмоплакины имеют определенную гомологию с белками промежуточных филаментов и, по-видимому, связаны непосредственно с ними. Плакоглобин связывается с цитоплазматическим участком некоторых десмоглеинов и десмоколлинов и, возможно, является центральным пунктом в формировании десмосомы и прикреплении цитокератиновых филаментов (183). Плакоглобин, имеющий гомологию с ß-катенином, может также участвовать в транедукции

сигналов. Десмосомы и цитокератины обеспечивают механическую прочность, необходимую для поддержания целостности эпидермиса (62). Система десмосом и промежуточных филаментов в других тканях, по-видимому, имеет сходную роль.

Хемидесмосомы отличаются от десмосом тем, что они устанавливают связь не между клетками, а с базальной ламиной. Как и десмосомы, хемидесмосомы прикрепляют промежуточные филаменты, однако основным адгезионным рецептором в данном случае является абр4-интегрин, прикрепляющий ламинин к базальной ламине. Остальные белки, составляющие хемидесмосому также уникальны, хотя и отчасти гомологичны десмосомальным белкам.

3.2. Плотные контакты.

Важнейшим элементом в структуре избирательно проницаемых барьеров эпителиальных и эндотелиальных являются плотные контакты. Избирательная проницаемость варьирует от ткани к ткани, пропуская или целые клетки и макромолекулы, или только протоны и ионы. Интегральным мембранным белком плотного соединения оказался окклудин (64). Окклудин взаимодействует с двумя цитоплазматическими белками, ZO-1 и ZO-2 (Zonula Occludence 1, 2). Их функция окончательно не ясна. Возможно их роль заключается в локализации окклудина в сайтах между апикальной и базолатеральной поверхностями клетки. Некоторые ассоциированные с цитоскелетом белки были также обнаружены в участках плотных контактов. Среди них зингулин, 7Н6 антиген и актин.

Ras играет определенную роль в регулировании функционирования плотных соединений (198). Было показано, что одна из мишеней Ras, AF-6 (ALL-1 Fusion partner from chromosome 6), аккумулируется в сайтах плотных контактов в эпителиальных клетках линии MDCKH. AF-6 взаимодействует с ZO-1 и это взаимодействие ингибируется активированным Ras. Кроме того, AF-

Заключение диссертации по теме «Онкология», Алиева, Наила Омар Кайям гызы

ВЫВОДЫ

1. По данным видео микроскопии в результате формирования межклеточного контакта ^трансформированными неполяризованными эпителиоцитами происходит формирование относительно небольших участков перекрывания ламеллярных краев, "паралич" псевдоподиальной активности в участках края, непосредственно прилегающих к зоне межклеточного контакта и дальнейшая латеральная экспансия межклеточного контакта.

2. Методы видео микроскопии показали, что все поляризованные клетки, использованные в настоящем исследовании (гаБ-трансформированые эпителиоциты, ^трансформированные фибробласты и гав-трансформированые фибробласты) реагируют сходным образом на межклеточные столкновения в культуре и эти реакции включают в себя обширные перекрывания ведущих ламелл, ретракцию ламелл от места контакта и формирование новой ведущей ламеллы.

3. Феномен контактного торможения движения проявляется двумя разными способами в ходе гомотопических столкновений эпителиоцитов, клеток с неполяризованной псевдоподиальной активностью, и поляризованных фибробластоподобных клеток.

4. Методом иммунофлуоресцентной микроскопии в сочетании с использованием конъюгированных с конканавалином А латексных частиц было показано, что в ходе формирования межклеточного контакта эпителиальными клетками происходит локальное разрушение кольцевого актинового пучка и формирование аркообразных пучков актиновых микрофиламентов по обе стороны от расширяющегося контакта; фокальные контакты ориентируются вдоль новой межклеточной границы; латексные частицы в области межклеточного контакта начинают двигаться тангенциально по направлению к свободному краю клетки.

5. Формирование межклеточного контакта фибробластами и фибробластоподобными клетками не сопровождается изменениями в распределении актиновых микрофиламентов, фокальных контактов и движении частиц по поверхности клеток.

6. Основываясь на результатах опытов были предложены две различные модели формирования межклеточного контакта неполяризованными эпителиоцитами и поляризованными фибробластоподобными клетками. Предполагается, что благодаря локальному разрушению кольцевого пучка актиновых микрофиламентов в зоне межклеточного контакта эпителиоцитов происходит формирование тангенциального вектора натяжения, обеспечивающего замыкание межклеточного контакта. В динамике межклеточного контакта фибробластоподобных клеток определяющую роль играет центростремительное натяжение в актиновом цитоскелете, обеспечивающее ретракцию и расхождение клеток.

7. В результате неопластической трансформации эпителия, сопровождающейся изменением морфологического типа клетки, происходит изменение типа контактного торможения движения, а не его утрата.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Алиева, Наила Омар Кайям гызы, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Васильев Ю.М., Гельфанд И.М., Гелыптейн В.И. Результаты межклеточных столкновений в культурах нормальных и трансформированных фибробластов. Цитология, 16, 752-756,1974.

2. Гелыптейн В.И. Ультраструктурные особенности опухолеродных и неопухолеродных культур клеток печени серии IAR-2 по данным растровой электронной микроскопии. Цитология, 23, 510-515,1981.

3. Ровенский Ю.А. Клеточные и молекулярные механизмы опухолевой инвазии. Биохимия, 63, 1204-1221,1998.

4. Светличная Н.И., Свиткина Т.М. Нарушение структуры эндоплазматического пласта микрофиламентов при опухолевой трансформации. Цитология, 30(8), 976- 981,1988.

5. Свиткина Т.М. Формирование эндоплазматического пласта микрофиламентов при распластывании фибробластов. Цитология, 30(7), 861-865, 1988.

6. Свиткина Т.М. Организация цитоскелета эпителиальных клеток в культуре. Цитология, 31,1435-1440,1989.

7. Свиткина Т.М., Шевелев A.A., Бершадский А.Д., Гельфанд В.И. Структура цитоскелета мышиных эмбриональных фибробластов. Электронно-микроскопическое исследование платиновых реплик. Цитология, 25(9), 1004-1011,1983.

8. Тинт И.С. Морфология системы микротрубочек при округлении, распластывании и поляризации нормальных и трансформированных фибробластов. Цитология, 21(10), 1139-1144, 1979.

9. Тинт И.С., Бершадский А.Д., Васильев Ю.М., Иванова О.Ю., Плетюшкина О.Ю. Формирование актинового цитоскелета и адгезионных структур в ходе распластывания культивируемых клеток. Цитология, 30,4, 1988.

10. Abercrombie M. The bases of the locomotory behavior of fibroblasts. Exp. Cell Res., suppl. 8, 188-198,1961.

11. Abercrombie M. Contact inhibition in tissue culture. In Vitro, 6, 128-142,1970.

12. Abercrombie M., Heaysman J.E.M. Social behaviour of cells in tissue culture II. Monolaying of fibroblasts. Exp.Cell Res., 6, 293-306,1954.

13. Abercrombie M., Heaysman J.E.M., Pegrum S.M. The locomotion of fibroblasts in culture. III. Movements of particles on the leading lamella. Exp. Cell Res. 62, 389-398,1970.

14. Abercrombie M., Lamont D.M., Stephenson E.M. The monolayering in tissue culture of fibroblasts from different sources. Proc.Royal Soc.B, 170, 349-360, 1971.

15. Adamson P, Paterson HF, Hall A. Intracellular localization of the p21rho proteins. J.Cell Biol. 119, 617-627,1992.

16. Amano M, Mukai H, Ono Y, Chihaba K, Matsui T, Hamajima Y, Okawa K, Iwamatsu A, Kaibuchi K. Identificationof putative target as the serine-threonine kinase protein kinase N. Science, 271, 648-650, 1996.

17. Bacallao R, Antony C, Dotti C, Karsenti E, Stelzar EH, Simons K. The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium. J. Cell Biol., 109,2817-2832,1989.

18. Bannikov G.A., Saint-Vincent L, Montesano R. Surface protein in normal and transformed cells in culture. Brit.J.Cancer., 42, 596-609,1980.

19. BarbacidM. Ras genes. Ann.Rev.Biochem., 56, 779-827,1987.

20. Behrens J., Mareel M.M., Van Roy F.M., Birchmeier W. Dissecting tumor cell invasion: epithelial cells acquire invasive propeties after the loss of uvomorulin-mediated cell-cell adhesion. J. Cell Biol., 108,2435-2447,1989.

21. Bement W.M., Forscher P., Mooseker M.S. A novel cytoskeletal structure involved in purse string wound closure and cell polarity maintenance. J. Cell Biol., 121(3), 565-578,1993

22. Ben-Ze'ev A. Cytoskeletal and adhesion proteins as tumor suppressors. Curr Opin Cell Biol, 9, 99-108,1997.

23. Berhsadsky A., Chausovsky A., Becker E., Lyubimova A., Geiger B. Involvment of microtubules in the control of adhesion-dependent signal transduction. Curr.Biol., 6, 1279-1289,1996.

24. Bershadsky A.D., Tint I.S., Neyfakh A.A., jr., Vasiliev J.M. Focal contacts in normal and RSV-transformed quail cells. Hypothesis of the transformation-induced deficient maturation of focal contacts. Exp.Cell Res., 158, 433-444, 1985.

25. Bershadsky A.D., Vaisberg E.A., Vasiliev J.M. Pseudopodial activity at the active edge of migrating fibroblast is decreased after drug-induced microtubule depolymerization. CellMotil. Cytosk., 19(3), 152-158, 1991.

26. Birchmeier W, Behrens J. Cadherins expressions in carcinomas: role in the formation of cell junctions and the prevention of invesiveness. Biochim Biophys Acta, 1198,11-26,1994.

27. Braga V, Machesky LM, Hall A, Hotchin NA. The small GTPases Rho and Rac are required for the establishment of cadherin-dependent cell-cell contacts. J.Cell Biol., 137, 1421-1431,1997.

28. Brill S, Lyman CW, Church DM, Wasmuth JJ, Weissbach L, Bernarda A, Snijders AJ. Tha ras GTPase-activating-protein-related human protein IQGAP2 harbors a potential actin binding domain and interact with calmodulin and rho family GTPases. Mol.Cell Biol., 16,4869-4878,1996.

29. Burbelo PD, Drechsel D, Hall A. Aconseved binding motif defines numerouse candidate target proteins for both cdc42 and rac GTPases. J.Biol.Chem., 270, 29071-29074,1995.

30. Burridge K., Chrzanowska-Wodnicka M. Focal adhesions, contractility and signaling. Ann. Rev. Cell Dev. Biol., 12,463-518, 1996.

31. Burridge K., Chrzanowska-Wodnicka M., Zhong C. Focal adhesion assembly. Trends Cell Biol., 7, 342-347, 1997.

32. Burridge K., Turner C.E., Romer L.H. Tyrosine phosphorylation of paxillin and ppl25FAK accompanies cell adhesion to extracellular matrix: a role in cytoskeletal assembly. J.Cell Biol., 119, 893-903,1992.

33. Campbell S.L., Khosravi-Far R., Rossman K.L., Clark G.J., Der C.J. Increasing complexity of Ras signaling. Oncogene, 17,1395-1414,1998.

34. Cano E., Mahadevan L.C. Parallel signal processing among mammalian MAPKs. Trends Biochem. Sci.,20, 117-122,1995.

35. Carter S.B. Haptotaxis and the mechanism of cell motility. Nature, 213(73), 25660, 1967.

36. Cerione RA, Zheng Y. Dbl family of oncogenes. Curr.Opin.Cell Biol., 8, 216222, 1996.

37. Chrzanowska-Wodnicka M, Burridge K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. J.Cell Biol., 133,1403-1415,1996.

38. Chrzanowska-Wodnicka M., Burridge K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. J.Cell Biol., 133, 1403-1415,1996.

39. Clark E.A., Brugge J.S. Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science, 268,233-239,1995.

40. Condeelis J. Are all pseudopods created equal? Cell Motil.Cytoskeleton., 22, 1-6, 1992.

41. Condeelis J. Life at the leading edge: the formation of cell protrusions. Annu.Rev.Cell Biol., 9, 411-444,1993.

42. Conrad P.A., Giuliano K.A., Fisher G., Collins K., Matsudaria P.T., Taylor D.L. Relative distribution of actin, myosin I, and myosin II during the wound healing response of fibroblasts. J. Cell Biol., 120,1382-1891,1993;

43. Cowin P, Burke B. Cytoskeleton-membrane interactions. Curr Opin Cell Biol, 8, 56-65, 1996.

44. Cowin P, Kapprell H-P, Franke WW, Tamkun J, Hynes RO. Placoglobin: a protein common to different kinds of intracellular adhering junctions. Cell, 46, 1063-1073,1986.

45. Craig S.W., Johnson R.P. Assembly of focal adhesions: progress, paradigms, and portents. Curr.Opin.Cell Biol., 8, 74-85,1996.

46. Crawford A.W., Mitchelsen J.W., Beckerle M.C. An interaction between zyxin and a-actinin. J. Cell Biol., 116,1381-1393,1992.

47. Curtis A.C. Regulation of cellular adhesion by molecules similar to immunoglobulins. Zh Obshch Biol., 28(3), 269-77, 1967.

48. Daniel JM, Reynold AB. The tyrosine kinase substrate pl20cas binds directly to E-cadherin but not the APC protein or alpha-catenin. Mol Cell Biol, 15, 48194824,1995.

49. Danowski B.A., Harris A.K. Changes in fibroblast contractility, morphology and adhesion in response to a phorbol ester promoter. Expl.Cell Res., 177, 47-49, 1988.

50. Daum G., Eisenmann-Tappe I., Fries H.-W, Troppmair J, Rapp U.R. The ins and outs of Raf kinases. Trends Biochem. Sci. 19,474-480,1994.

51. DePasquale. Initial stages of cell-cell adhesion formation in human mammary epithelial cells. Suppl. Mol.Biol Cell, 37th ASCB Annual Meeting., 8, 304a, 1997.

52. Domnina L.V., Rovensky J.A., Vasiliev J.M., Gelfand I.M. Effect of microtubule-destroying drugs on the spreading and shape of cultured epithelial cells. J. Cell Sci., 74, 267-282, 1995.

53. Dong Z., Lavrovsky V., Colburn N.H. Transformation reversion induced in JB6 RT101 cells by AP-1 inhibitors. Carcinogenesis., 16(4), 749-56,1995.

54. Dowrick P.G., Prescott A.R., Warn R.M. Scatter factor affects major changes in cytoskeletal organisation of epithelial cell. Cytokine, 3,299-310,1991.

55. Dunn G.A. Mutual contact inhibition of extension of chick sensory nerve fibres in vitro. J.Comp.Neurol., 143, 491-507,1971.

56. Dunn G.A., Brown A.F., Aligment of fibroblasts on grooved surface described by a simple geometric transformation. J. Cell Sci., 83, 313-340,1986.

57. Dunn, G. Mechanisms of fibroblast locomotion. In: "Cell Adhesion and Motility", BSCB Symp. 3, ed. A.Curtis & J.Pitts, pp 409-423, Cambridge Univ. Press., 1980.

58. Eaton S, Auvenen P, Luo L, Jan YN, Simons. Cdc42 and Racl control different actin-dependent processes in the Drosophila wing disc epithelium. J.Cell Biol., 131, 151-164, 1995.

59. Fisher G.W., Conrad P.A., DeBiasio R.L., Taylor D.L. Centripetal transport of cytoplasm, actin, and the cell surface in lamellipodia of fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton, 11,235-247,1988.

60. Forscher P., Smith S. Action of cytochalasins on the organization of actin filaments and microtubules in neuronal growth cone. J. Cell Biol., 107, 15051516,1988.

61. Frisch S.M., Vuori K., Ruoslahti E., Chan-Hui P-Y. Control of adhesion-dependent cell survival by focal adhesion kinase. J.Cell Biol., 134, 793-799, 1996.

62. Fuchs E, Byrne C. The epidermis: rising to the surface. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 725-736,1994.

63. Funayama N, Fagotto F, McCrea P, Gumbiner BM. Embrionic axis induction by the armadillo repeat domain of P-catenin: evidence for intracellular signalins. J.Cell Biol., 128, 959-968,1995.

64. Furuse M, Itoh M, Hirase T, Nagafuchi A, Yonemura S, Tsukita S, Tsukita S. Direct association of occuldin with ZO-1 and its possible involvement in the localization of occludin at tight junction. J. Cell Biol., 5,1617-1626,1994.

65. Gail M.N., Boone C.W. Effects of colcemid on fibroblast motility. Exp.Cell.Res., 65,221-227, 1971.

66. Garrod DR. Desmosoms and hemidesmosoms. Curr Opin Cell Biol, 5, 30-40, 1993.

67. Geiger B, Volk T, Volberg T, Bendory R. Molecular interactions in adherence-type contacts. J.Cell Sci., (Suppl.), 8,251-272,1987.

68. Geiger B, Yehuda-Levenberg S, Bershadsky AD. Molecular interactions in the submembrane plaque of cell-cell and cell matrix adhesions. Acta Anat., 154, 4662,1995.

69. Geiger B, Ginsberg D, Salomon D, Volberg T. The molecular basis for the assembly and modulation of adherens-type junctions. 32(3), 343-53,1990.

70. Geiger B., Volberg T., Ginsberg D., Bitzur S., Sabanay I., Hynes R.O. Broad spectrum pan-cadherin antibodies, reactive with the C-terminal 24 amino acid residues of N-cadherin. Pt 4, 607-14, 1990.

71. Gloushankova N.A., Krendel M.F., Sirotkin V.A., Bonder E.D., Feder H.H., Vasiliev J.M., Gelfand I.M. Dynamics of active lamellae in cultured epithelial cells: Effects of expression of exogenous N-ras oncogene. PNAS USA, 92, 70017004, 1995.

72. Gloushankova N.A., Lyubimova A.V., Tint I.S., Feder H.H., Vasiliev J.M., Gelfand I.M. Role of the microtubula system in morphological organization of normal and oncogene-transfected cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 85978601,1994.

73. Gloushankova N., Ossovskaya V., Vasiliev J., Chumakov P., Kopnin B. Changes in p53 expression can modify cell shape of ras-transformed fibroblasts and epitheliocytes.Oncogene, 16, 536-539,1997.

74. Guan J-L., Shalloway D. Regulation of ppl25FAK both by cellular adhesion and oncogenic transformation. Nature, 358, 690-692,1992.

75. Guelstein V.I., Ivanova O.Yu., Margolis L.B., Vasiliev Ju.M., Gelfand I.M. Contact inhibition of movement in the cultures of transformed cells. PNAS USA, 70,2011-2014,1973.

76. Gumbiner B.M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell, 84, 345-357, 1996.

77. Gumbiner B, Stevenson B, Grimaldi A. The role of the adhesion molecule uvomorulin in the formation and maitenance of epithelial junctional complex. J.Cell Biol., 107,1575-1587,1988.

78. Gustafson T, Wolpert L. Cellular movement and contact in sea urchin morphogenesis. Biol Rev Camb Philos Soc., 42(3), 442-98, 1967.

79. Haegel H, Larue L, Ohsugi M, Fedorov L, Herrenknecht K, Kemler R. Lack of P-catenin affects mouse development at gastrulation. Development, 121, 35293537, 1995.

80. Hall A. Small GTP-binding proteins and the regulation of the actin cytoskeleton. Annu. Rev.Cell Biol., 10, 31-54,1994.

81. Han L., Colicelli J. A human protein selected for interference with Ras function interact directly with Ras and competes with Rail. Mol.Cell Biol., 15, 13181323, 1995.

82. Hannigan G.E., Leung-Haegesteijn C., Fitz-Gibon L. et el. Regulation of cell adhesion and anchorage-dependent growth by a new pi-integrin-linked protein kinese. Nature, 379, 91096,1996.

83. Hart MJ, Callow MG, Souza B, Polakis P. IQGAP1, a calmodulin-binding protein with a rasGAP-related domain, is a potential effector for cdc42Hs. EMBO J., 15,2997-3005,1996.

84. Hatta K, Nose A, Nagafuchi A, Takeichi M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J Cell Biol., 106(3), 873-881,1988.

85. He H., Watanabe T., Zhan X., Huang C., Schuuring E., Fukami K., Takenawa T., Kumar C.C., Simpson R.J., Maruta H. Role of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in Ras/Rac-induced disruption of the cortactin-actomyosin II complex and malignant transformation. Mol. Cell Biol., 18, 3829-3837,1998.

86. Heasman J, Crawford A, Goldstone K, Garner-Hamrick P, Gumbiner B, McCrea P, Kintner C, Noro CY, Wylie C. Overexpression of cadherins and underexpression of P-catenin inhibit dorzal mesoderm induction in early Xenopus embryos. Cell, 79, 791-803,1994.

87. Heasman J.E.M. Non-reciprocal contact inhibition. Experientia, 26,1344,1970.

88. Heaysman J.E.M., Pegrum S.M. Early contacts between normal fibroblasts and mouse sarcoma cells. An ultrastructural study. Exp Cell Res., 78(2), 479-81, 1973.

89. Heldin C.-H., Westermark B., Wasteson A. Spesific receptors for platelet-derived growth factor on cells derived from connective tissue and glia. PNAS USA, 78, 3664-3668,1981.

90. Hiraoka K, Kaibuchi K, Ando S, Musha T, Takaishi K, Mizuno T, Asada M, Menard L, Tomhave E, Didsbury J, et al. Both stimulatory and inhibitory GDP/GTP exchange proteins, smgGDS and rhoGDI, are active on multiple small GTP-binding proteins, smgGDS and rhoGDI, are active on multiple small GTP-binding proteins. Biochem.Biophys.Res.Comm., 182, 921-930,1992.

91. Hoschuetzky H, Aberle H, Kemler R. Beta-catenin mediates the interaction of the cadherin-catenin complex with epidermal growth factor receptor. J.Cell Biol., 127, 1375-1380,1994.

92. Huber O, Bierkamp C, Kemler R. Cadherins and catanins in development. Curr.Opin.Cell Biol., 8, 685-691, 1 Rubinfeld B, Albert I, Porfifi E, Fiol C, Munemitsu S, Polakis P. Binding of GSK3p to the APC-P-catenin complex and regulation of complex assembly. Science, 272,1023-1026,1996.

93. Hulsken J, Birchmeier W, Behrens J. E-Cadherin and APC compete for the interaction with beta catenin and the cytoskeleton. J Cell Biol, 127, 2061-2071, 1994.

94. Hynes R.O. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell, 69, 11-25, 1992.

95. Inuzuka H, Miyatani S, Takeichi M. R-cadherin: a novel Ca(2+)-dependent cell-cell adhesion molecule expressed in the retina. Neuron, 7(1), 69-79,1991.

96. Ishizaki T, Maekawa M, Fujisawa K, Okawa K, Iwamatsu A, Fujita A, Watanabe N, Saito Y, Kakizuka A, Morii N, Narumiya S. The small GTP-binding protein Rho binds to and activates a 160 kDa Ser/ Thr protein kinase homologouse to myotonic dystrophy kinase. EMBO J., 15,1885-1893, 1996.

97. Islam S, Carey T, Wolf G, Wheelock M, Johnson K. Expression of N-cadherin by human squamous carcinoma cells induced a scattered fibroblastic phenotype with dirupted cell-cell adhesions. J.Cell Biol., 135,1643-1654, 1996.

98.Itoh M., Yonemura S., Nagafuchi A., Tsukita S., Tsukita S. A 220-kD undercoat-constitutive protein: its specific localization at cadherin-based cell-cell adhesion sites. J Cell Biol., 115(5), 1449-62,1991.

99. Izzard C.S., Lochner L.R. Formation of cell-to-substrate contacts during fibroblast motility: an interference-reflectionstudy. J.Cell Sci., 42, 81-116,1980.

100. Izzard S.L., Izzard S.C. Actin-associated proteins related to focal and close cell-substrate contacts in murine fibroblasts. Exp.Cell Res., 170, 214-227,1987.

101. Jokusch B.M., Bubeck P., Bubeck P. et al. The molecular archtecture of focal adhesions. Ann.Rev.Cell Dev. Biol., 11, 379-416,1995.

102. Kaighn M.E., Narayan K.S., Lechner J.F. Differential properies among clones of simian virus 40-transformed human epithelial cells. Carcinogenesis, 1, 635646, 1980.

103. Kimura K, Ito M, Amano M, Chihara K, Fukata Y, Nakafuku M, Yamamori B, Feng J, Nakano T, Okawa K et al. Regulation of miosine phosphatase by rho and rho-associated kinase (rho-kinase). Science, 273,245-248,1996.

104. Kinch M.S., Clark G., Der C.J., Burridge K. Tyrosine phosphorilation regulates the adhesions of ray-transfirmed breast epithelia. J.Cell Biol., 130, 161171,1995.

105. Kinch MS, Clark GJ, Der CJ, Burridge K. Tyrosine phosphorilation regulates the adhesions of Ras-transformed breast epithelia. J Cell Biol, 130, 461-471, 1995.

106. Kinch MS, Clark GJ, Der CJ, Burridge K. Tyrosine phosphorylation regulates the adhesions of Ras-transfored breast epithelia. J.Cell Biol., 130,461-471,1996.

107. Kirchhausen T, Rosen FS. Disease mechanism: unravelling Wiskott-Aldrich syndrome. Curr.Biol., 6,676-678,1996.

108. Knudsen KA, Soler AP, Johnson KR, Wheelock MJ. Interaction of alfa-actinin with the cadherin/catenin cell-cell adhesion complex via alpha-catenin. J.Cell Biol., 130, 67-79, 1995.

109. Kolega J. Effect of mecanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. J. Cell Biol., 102(4), 1400-1411, 1986.

110. Kozma R, Ahmed S, Best A, Lim L. The ras-related protein Cdc42Hs and bradykilin promote formation of peripheral actin microspikes and filopodia in Swiss 3T3 fibroblasts. Mol.Cell Biol., 15,1942-1952,1995.

111. Kucik D.F., Kuo C.S., Elson E.L., Sheets MP. Preferential attachment of membrane glycoproteins to the cytoskeleton at the leading edge of lamella. J. Cell Biol, 114,1029-1036,1991.

112. Kypta RM, Su H, Reichard LF. Association between a transmembrane protein tyrosine phosphatase and the cadherin-catenin complex. J.Cell Biol, 134, 15191529, 1996.

113. Lamarche N, Hall A. GAPs for rho-related GTPases. Trends.Genet, 10, 436440, 1994.

114. Laure L, Ohsugi M, Hirchenhain J, Kemler R. E-cadherin null mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium. PNAS USA, 91, 8263-8267,1994.

115. Leung T, Manser E, Tan L, Lim L. A novel serine/threonine kinase binding the ras-related rhoA GTPase which translocates the kinase to peripheral membranes. J.Biol.Chem, 270, 29051-29054,1995.

116. Ljungdahl S, Linder S, FranzenB, Auer G, Shoshan M.C. Down-regulation of tropomyosin-2 expression in c-Jun-transformed rat fibroblasts involves induction of a MEK1-dependent autocrine loop. Cell Growth Differ, 9(7), 56573,1998.

117. Lo S.H, Weisberg E, Chen L.B. Tensin: A potential link between the cytoskeleton and signal transduction. BioEssays, 16, 817-823,1994.

118. Madaule P, Furuyashiki T, Reid T, Ishizaki T, Watanabe G, Morii N, Narumiya S. A novel partner for the GTP-bound forms of rho and rac. FEBS Lett., 377, 243-248,1995.

119. Manser E, Leung T, Salihuddin H, Zhao ZS, Lim L. A brain serine/threonine protein kinase activated by cdc42 and racl. Nature, 367, 40-46,1994.

120. Marshall C J. Ras effectors. Curr. Opin. Cell Biol., 8,197-204,1996.

121. Marshall CJ. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell, 80, 179-185, 1995.

122. Marshall M.S. Ras target proteins in eukaryotic cells. FASEB J., 9, 1311-1318, 1995.

123. Martin P., Lewis J. Actin cable and epidermal movement in embryonic wound healing. Nature, 360(6400), 179-183,1992.

124. Matsui T, Amano M, Yamamoto T, Chihaba K, Nakafuku M, Ito M, Nakano T, Okawa K, Iwamatsu A, Kaibuchi K. Rho-associated kinase, a novel serine/threonine kinase, as a putative target for the small GTP-binding protein Rho. EMBO J., 15, 2208-2216, 1996.

125. Matsuyoshi N, Imamura S. Multiple cadherins are expressed in human fibroblasts. Biochem.Biophis.Res.Commun., 235(2), 355-358, 1997.

126. McCormick F. Activators and effectors of ras p21 protein. Curr.Opin.Genet.Dev., 4, 71-76,1994.

127. McNaill H., Ryan T.A., Smith S.J., Nelson W.J. Spatial and temporal dissection of immediate and early events following cadherin-mediated epithelial cell adhesion. J. Cell Biol., 120,1217-1226,1993.

128. Middleton C.A. Contact inhibition of locomotion in cultures of pigment retina epithelium. Exp.Cell Res., 70, 91-96,1972.

129. Middleton C.A. The effects of cell-cell contact on the spreading of pigment retina epithelial cells in culture. Exp.Cell Res., 109, 349-361,1977.

130. Miller JR, Moon RT. Signal transduction through (3-catenin and spesification of cell fate during embiyogenesis. Genes.Dev, 10, 2527-2539, 1996.

131. Mitchison T.J, Cramer L.P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell, 84(3), 371-379,1996.

132. Moll R, Franke W.W, Schiller D.L, Geiger B, Krepler R. The catalog of human cytokeretins: Pattern of expression in normal epithelia, tumors, and cultured cells. Cell, 31,11-24,1982.

133. Montesano R, Drevon C, Kuroki T, Saint-Vinsent L, Handleman S, Sanford K.K, De Feo D, Weinstein I.B. Test for malignant transformation of rat liver cells in culture: cytology, growth in soft agar and production of plasminogen activator. J. Nat. Cancer Inst, 59,1651-1658,1977.

134. Montesano R, Saint-Vincent L, Drevon C, Tomatis L. Production of epithelial and mesenchymal tumor with rat liver cells transformed in vitro. Int. J. Cancer, 16, 550-558, 1975.

135. Mosher D.F, Sottile J, Wu C, McDonald J.A. Assebly of extracellular matrix. Curr.Opin. Cell Biol, 4, 810-818,1992.

136. Munemitsu S, Albert I, Souza B, Rubinfeld B, Polakis P. PNAS USA, 92, 3046-3050,1995.

137. Nagafuchi A, Ishihara S, Tsukita S. The role of catenins in the cadherin-mediated cell adhesion: functional analysis of E-cadherin/ct-catenin fusion molecules. J.Cell Biol, 127,235-245,1994.

138. Nagafuchi A, Takeichi M, Tsukita S. The 102 kd cadherin-associated protein: similarity to vinculin and posttranscriptional regulation of expression. Cell, 65(5), 849-57,1991.

139. Nagafuchi A, Takeichi M. Cell binding function of E-cadherin is regulated by the cytoplasmic domain. EMBO J, 7(12), 3679-3684,1988.

140. Nobes CD, Hall A. Rho, Rac and Cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia. Cell, 81, 53-62, 1995.

141. Okuno H., Suzuki T., Yoshida T., Hashimoto Y., Curran T., Iba H. Inhibition of jun transformation by a mutated fos gene: design of an anti-oncogene. Oncogene, 6(9), 1491-7,1991.

142. Oldfield F.E. Orientation behavior of chick leucocytes in tissue culture and their interactions with fibroblasts, Exp.Cell Res., 30, 125-138,1963.

143. Ozawa M., Engel J., Kemler R. Single amino acid substitutions in one Ca2+ binding site of uvomorulin abolish the adhesive function. Cell, 63(5), 1033-8, 1990.

144. Ozawa M, Baribault H, Kemler R. The cytoplasmic domain of the cell adhesion molecule uvomorulin associate with three independent proteins structurally related in different species. EMBO J., 8,1711-1717, 1989.

145. Papkoff J, Rubinfeld B, Schryver B, Polakis P. Wnt-1 regulates free pools of catenins and stabilized APC-catenin complexes. Mol.Cell Biol., 16, 2128-2134,

1996.

146. Pletjushkina O.J., Belkin A.M., Ivanova O.J., Oliver T., Vasiliev, Jacobson K. Maturation of cell-substratum focal adhesions induced by depolymerization of microtubules is mediated by increased cortical tension. Cell Adhes.Com., 3, 1-15,

1997.

147. Polakis P. Mutations in APC gene and their implications for protein structure and function. Curr.Opin.Genet.Dev., 5,66-71,1995.

148. Prendergast G.C., Khosravi-Far R., Solski P.A., Kurzava H., Lebowitz P.F., Der C.J. Critical role of Rho in cell transformation by oncogenic Ras. Oncogene, 10(12), 2289-2296,1995

149. Prescott A.R., Dowrick P.G., Warn R.M. Stable and slow-turning over microtubules characterize the processes of motile epithelial cells treated with scatter factor. J. Cell Sci., 102,103-112, 1992.

150. Qiu R., Chen J., McCormick F., Symons M. A role for rho in ras transformation. PNAS USA, 92, 11781-11785, 1995.

151. Qiu R.G, Chen J, Kirn D, McCormick F, Symons M. An essential role for Rac in Ras transformation. Nature, 374(6521), 457-459, 1995.

152. Radkin S, Marii N, Narumiya S, Rozengurt E. Botilinum C3 exoenzyme bloks the tyrosine phosphorylation of pl25FAK and paxillin induced by bombesin and endothelin.FEBS Lett. 354, 315-319,1994.

153. Reid T, Furuyashiki T, Ishizaki T, Watanabe G, Watanabe N, Fujusawa K, Morii N, Madaule P, Narumiya S. Rhotekin, a new putative target for rho bearing homology to a serine/threonine kinase, PKN, and rhophilin in the rho-binding domain. J.Cell Chem, 271,13556-13560,1996.

154. Reynolds AB, Daniel J, McCrea P, Wheelock M, Wu J, Zhang Z. Identification of new catenin: the tyrosine kinase substrate pl20cas associated with E-cadherin complexes. Mol.Cell Biol, 14, 8333-8342,1994.

155. Ridley A J, Hall A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell, 70, 389-399, 1992.

156. Ridley AJ, Hall A. Signal transduction pathways regulating Rho-mediating stress fibers formation: requirement for a tyrosine kinase. EMBO J, 13(suppl 11), 2600-2610, 1994.

157. Rifkin J.J. Tumor promoters induce changes in the chick embryo fibroblast cytoskeleton. Cell, 18,361-369,1979.

158. Rimm DL, Koslov ER, Kebriaeli P, Cianci CD, Morrow JS. alpha(E)-catenin in an actin-binding and bundling protein mediating the attachment of F-actin to the membrane adhesion complex. PNAS USA, 92, 8813-8817,1995.

159. Rodrigeuz-Viciana P, Warne P.H, Dhand R, Vanhaesebroeck B, Gout I, Fry M.J, Waterfield M.D, Downward J. Phosphatidylinosotol-3-OH kinase as a direct target of Ras. Nature (Lond.), 370, 527-532,1994.

160. Rodrigeuz-Viciana P, Warne P.H, Khawaja A, Marte B.M, Pappin D, Das P, Waterfield M.D, Ridley A, Downward J. Role of phosphoinositide 3-OH kinase in cell transformation and control of the actin cytoskeleton by Ras. Cell,

89, 457-467, 1997.

161. Rodriguez-Boulan E, Nelson WJ. Morphogenesis of polarized epithelial cell phenotype. Science (Wash.D.C.), 245, 718-725,1989.

162. Rodriguez-Boulan E, Powell SK. Polarity of neuronal and epithelial cells. Annu.Rev.Cell.Biol., 8, 395-427,1992.

163. Rubin H, The inhibition of chick embryo cell growth by medium obtained from cultures of Rous sarcoma cells. Exp Cell Res., 41(1), 149-61,1966.

164. Rubinfeld B, Albert I, Porfifi E, Fiol C, Munemitsu S, Polakis P. Binding of GSK3P to the APC-P-catenin complex and regulation of complex assembly. Science, 272,1023-1026,1996.

165. Sacco PA, McGranahan M, Wheelock MJ, Johnson KR. Identification of plakoglobin domains required for association with N-cadherin and alpha-catenin. J.Biol.Chem., 270, 20201-20206, 1995.

166. Schoenenberger C.A., Zuk A., Kendall D., Matlin K.S. Multileyering and loss of apical polarity in MDCK cells transformed with viral K-ras. J. Cell Biol., 112(5), 873-889, 1991.

167. Schwartz M.A., Schaller M.D., Ginsberg M.H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annu.Rev.Cell.Dev.Biol., 11, 549-599,1995.

168. Shapiro L, Fannon AM, Kwong PD, Thompson A, Lehmann MS, Grubel G, Legrand J-F, Als-Neilsen J, Colman DR, Hendrickson WA. Nature, 374, 327337, 1995.

169. Shibamoto S, Hayakawa M, Takeuchi K, Hori T, Oku N, Miyazawa K, Kitamura N, Takeichi M, Ito F. Tyrosine phosphorilation of beta-catenin and plakoglobin enhanced by hepatocyte growth factor and epidermal growth factor in human carcinoma cell. Cell Adhes.Commun., 1,295-305,1994.

170. Spaargeren M., Bischoff J.R. Identification of the guanine nucleotide dissociation stimulator for Ral as putative effector molecule of R-ras, H-ras, K-ras, and Rap. PNAS USA., 91,12609-12613, 1994.

171. Stappert J, Kemler R. A short core region of E-cadherin is essential for binding and is highly phosphorylated. Cell Adhesion.Commun, 2,319-327,1994.

172. Steinberg B, Pollack R, Topp W, Botchan M. Isolation and characterization of T antigen-negative revertants from aline of transformed cells containing one copy of the SV40 genome. Cell, 13(1), 19-32,1978

173. Steinert P.M., Jones J.C.R, Goldman R.D. Intermediate filaments. J.Cell Biol, 99(1 pt2), 22s-27s, 1984.

174. Stoker M, Gherardi E, Perryman M, Gray J. Scatter factor is a fibroblast-derived modulator of epithelial cell mobility. Nature, 327,239-242,1987.

175. Stromskaya T.P, Grigorian I.A, Ossovskaya V.S, Rybalkina E.Y, Chumakov P.M., Kopnin B.P. Cell-specific effects of RAS oncogene and protein kinase C agonist TPA on P-glycoprotein function. FEBS Lett, 368(2), 373-376,1995

176. Symons M, Derry JMJ, Karlak B, Jiang S, Lemahieu V, McCormick F, Francke U, AboA. Wiskott-Aldrich syndrome protein, a novel effector for the GTPase cdc42Hs, is implicated in actin polymerization. Cell, 84, 723-734,1996.

177. Takeichi M. Cadherins: a molecular family important in selective cell-cell adhesion. Annu Rev Biochem, 59,237-52,1990.

178. Takeichi M. Cadherins in cancer: implications for invasion and metastasis. Curr.Opin.Cell Biol, 5, 806-811, 1993.

179. Takeichi, M. Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenetic regulator. Sience, 251,1451-1455,1991.

180. Tao Y.S, Edwards R.A, Tubb B, Wang S, Bryan J, McCrea P.D. Beta-catenin associates with the actin-bundling protein fascin in a noncadherin complex. J.Cell Biol, 134,1271-1281,1996.

181. Theriot, J. A, Mitchison T. J. Actin mycrofilament dynamics in locomoting cells. Nature, 352,126-131, 1991.

182. Trinkaus J.P, Betchaku T, Krulikowski L.S. Local inhibition of ruffling during contact inhibition of movement. Exp.Cell Res, 64,291-301,1971.

183. Troyanovsky SM, Eshkind LG, Troyanovsky RB, Leube RE, Franke WW. Contributions of cytoplasmic domains of desmosomal cadherins to desmosome assembly and intermediate filament anchorage. Cell, 72, 561-574,1993.

184. Tsukita S., Tsukita S. Radixin; in Kreis T, R Vale (ends): Guidebook to the cytoskeletal and motor protein. New York, Oxford University Press, 70-71,1993.

185. Van Aelst L, Joneson T, Bar-Sagi D. Identification of novel racl-interacting protein involved in membrane ruffling. EMBO J, 15, 4869-4878, 1996.

186. Vasileiv J.M. Spreading and lokomotion of tissue cells: factors controlling the distribution of pseudopodia. Phil.Trans.R. Soc. Lond., 299,159-167,1982.

187. Vasiliev J.M. Actin cortex and microtubular system in morphogenesis: cooperation and competition. J.Cell.Sci.Suppl., 8,11-18,1987.

188. Vasiliev J.M., Gelfand I.M. Neoplastic and normal cell in culture. Cambrige Univ. Press, 1981.

189. Vasiliev J.M., Gelfand I.M., Domnina L.V., Ivanova O.Y., Komm S.G., Olshevskaja L.V. Effect of colcemid on the locomotory behavior of fibroblasts. J.Embr.Exp.Morph., 24, 625-640, 1970; Gail M.N., Boone C.W. Effects of colcemid on fibroblast motility. Exp.Cell.Res., 65,221-227, 1971.

190. Volberg T., Geiger B., Citi S., Bershadsky A.D. Effect of protein kinase inhibitor H-7 on the contractility, integrity, and membrane anchorage of the microfilament system. Cell. Motil. Cytoskeleton, 29(4), 321-338, 1994.

191. Wang E., Fishman D., Liem R.K.H., Sun T-T. Intermediate filaments. Ann. NY Acad. Sci., 455,1-832,1985.

192. Watanabe G, Saito Y, Madaule P, Ishizaki T, Fujusawa K, Morii N, Mukai H, Ono Y, Kakizuki A, Narumiya S. Protein kinase N (PKN) and PKN-related protein rhophilin as target of small GTPase rho. Science, 271, 645-648,1996.

193. Welch M.D., Mallavarapu A., Rosenblatt J., Mitchison TJ. Actin dynamics in vivo. Curr. Opin. Cell Biol., 9, 54-61, 1997.

194. Yamada K.M., Geiger B. Molecular interactions in cell adhesion complexes. Curr.Opin.Cell Biol., 9,76-85,1997.

195. Yamada K.M, Miyamoto S. Integrin transmembrane signaling and cytoskeletal control. Curr.Opin.Cell Biol, 7, 681-689,1995.

196. Yamada KM, Geiger B. Molecular interactions in cell adhesion complexes. Curr.Opin.Cell Biol, 9, 76-85,1997.

197. Yamamori B, Kuroda S, Shimizu K, Fukui K, Ohtsuka T, Takai Y. Purification of a Ras-dependent mitogen-activated protein kinase kinase from bovine brain cytosol and its identification as a complex of B-Raf and 14-3-3 proteins. J.Biol.Chem, 270,11723-11726,1995.

198. Yamamoto T, Harada N, Kano K, Taya S, Canaani E, Matsuura Y, Mizoguchi A, Chizuka I, Kaibuchi K. The Ras target AF-6 interact with ZO-1 and serves as a peripheral component of tight junctions in epithelial cells. J. Cell Biol. 139, 785795, 1997.

199. Zhong C, Kinch M.S., Burridge K. Rho-stimulated contractility contributes to the fibroblastic phenotype of Ras-transformed epithelial cells. Mol.Biol.Cell, 8, 2329-2344,1997.

200. Zohn I.M, Sharon I.C, Khosravi-Far R, Rossman K.L, Der C.J.D. Rho family proteins and Ras transformation: The RHOad less traveled gets congested. Oncogene, 17,1415-1438,1998.