Роль опухолевого супрессора р53 в регуляции организации цитоскелета и формы нормальных и опухолевых клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Рубцова, Светлана Николаевна

• Рубцова, Светлана Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Рубцова, Светлана Николаевна

Список сокращений, принятых в работе

Введение 7|

Актуальность проблемы

Цели и задами работы

Научная новизна и практическая ценность работы

Обзор литературы

1. Форма и цитоскелет различных типов клеток

Мезенхимальные клетки (фибробласты)

Элителиоциты

Трансформированные клетки

1.1 Цитоскелет и адгезионные структуры

1.1.1 Актиновые микрофиламенты 1!

1.1.2. Микротрубочки

1.1.3 Промежуточные филаменты

1.1.4 Фокальные контакты

1.1.5 Межклеточные контакты 21 1.2. Влияние специфических агентов на организацию и функционирование цитоскелетных структур

1.2.1 Воздействие цитохалазина на актиновый цитоскелет

1.2.2 Воздействие колцемида на систему микротрубочек

2. Переходы между эпителиоидным и фибробластоподобным фенотипами

2.1 Эпителиально-мезенхимальная трансформация клеток

2.2 Мезенхимо-эпителиальная трансформация клеток

3. Антионкоген р53 и его влияние на морфологию клеток

3.1 Структура и функции р

3.2 Активация р

3.3 р53-зависимая остановка клеточного цикла

3.4 р53-зависимый апоптоз 3?

3.5 Регуляция активности р

3.6 Влияние р53 на морфологию клетки

Материалы и методы

1. Культуры клеток

2. Вестерн-блот анализ 39 ' | 3. Определение трансактивационной способности р53 4ф

4; Анализ вхождения клеток в Б-фазу цикла по включению 5бромдезоксиуридина (5-ВгсИ)) в ДНК

5. Апоптотическое фрагментирование ДНК

6. Флуоресцентная окраска

7. Количественный анализ морфологии клеток

Результаты

Глава 1. Нарушения цитоскелета ведут к активации р53 44 Раздел 1. Активация р53 при разборке системы актиновых микрофиламентов

1. Обработка цитохалазином ведет к изменениям формы и цитоскелета ' клеток

2. Обработка цитохалазином приводит к накоплению р53 в клетках

2.1 Вестерн-блот анализ

2.2 Иммунофлуоресцентная окраска

3. Обработка цитохалазином ведет к функциональной активации р53 щ

3.1 Активация репортера хлорамфеникол-ацетил-трансферазы

3.2 Активация репортера Р-галакгозидазы ^

4. р53-зависимое торможение клеточного цикла в ответ на воздействие цитохалазина 5о

4.1 р53-зависимое торможение клеточного цикла в | несинхронизированных культурах 5о

4.2 р53-зависимое торможение клеточного цикла в синхронизированных культурах

5. индукция р53-зависимого апоптоза при обработке цитохалазином 5С

5.1 Иммунофлуоресцентный анализ 5С

5.2 Изменение динамики роста клеток при воздействии цитохалазина 5Ь

5.3 Апоптотическое сегментирование ДНК

Раздел 2. Активация р53 при разборке системы микротрубочек

1. Обработка колцемидом ведет к изменениям формы и цитоскелета клеток ¿Г

2. Обработка колцемидом приводит к накоплению р53 в клетках

3. Обработка колцемидом приводит к функциональной активации р53 Ц

4. р53-зависимая остановка клеточного цикла в ответ на обработку колцемидом ¿

5. Микроядра, индуцируемые колцемидом, вызывают задержку р53-зависимую остановку клеточного цикла ¿

Глава 2. Влияние р53 на форму и цитоскелетную организацию клеток

1. Форма клеток существенно зависит от статуса р

2. Влияние р53 на цитоскелетные системы и адгезионные структуры Зо

2.1 Влияние р53 на актиновые микрофиламенты

2.2 Влияние р53 на микротрубочки Ъо

2.3 Влияние р53 на межклеточные адгезионные контакты ч©

2.4 Влияние р53 на фокальные контакты

Глава 3. Фенотипическая трансформация клеток при инкубации с хелатором железа дефероксамином (ОРО), имитирующим гипоксию Раздел 1. Действие ОРО на клетки карциномы линии НСТ

1. Изменение морфологического фенотипа клеток после воздействия

2. Динамика изменений формы и цитоскелета клеток под воздействием

РРО Ф)

2.1 Изменение морфологии клеток НСТ116 р53+/+ под действием РРО

2.2 Изменение морфологии клеток НСТ116 р53-/- под действием ОРО -»о

3. Исследование псевдоподиальной активности клеток НСТ116 р53+/+ 82.

4. Обратимость изменений формы клеток, вызванных ОРО

5. Изменения цитоскелета и адгезионных структур, вызванные воздействием ОРО

5.1 Влияние ОРО на актиновые микрофиламенты

5.2 Влияние ОРО на межклеточные адгезионные контакты

5.3 Влияние ОРО на фокальные контакты

5.4 Влияние ОРО на микротрубочки Зу 5.4.1 Влияние ОРО на центры организации микротрубочек

6. Обработка DFO не меняет структуру митохондрий

7. Обработка DFO не приводит к значительному увеличению плоидности I клеток ^Зъ"

7.1 Изменения морфологии ядер под действием DFO

7.2 Изменения динамики синтеза ДНК под действием DFO

Раздел 2. Действие DFO на фибробласты крысы линий REF52 и REF52/GSE

1. Изменение морфологического фенотипа клеток после воздействия

2. Изменения цитоскелета и адгезионных структур клеток REF52 и

REF52/GSE22, вызванные DFO <3*

2.1 Влияние DFO на акгиновые микрофиламенты

2.2 Влияние DFO на фокальные контакты ¿

2.3 Влияние DFO на микротрубочки Iс*,

3. Обработка DFO не меняет структуру митохондрий loo

Обсуждение результатов (Од

1. Разрушение цитоскелетных систем с помощью специфических агентов ведет к активации р53 \oi

2. Влияние р53 на морфологический фенотип клеток 1U.

3. р53-независимый механизм мезенхимо-эпителиальной трансформации \\$

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль опухолевого супрессора р53 в регуляции организации цитоскелета и формы нормальных и опухолевых клеток»

Актуальность проблемы

Одной из важнейших задач клеточной биологии является изучение механизмов морфогенеза клеток, тканей и органов, а также патологических изменений морфогенеза, происходящих в процессе опухолевых превращений. В настоящее время выяснены многие черты клеточных механизмов морфогенека и, в особенности, природа динамики цитоскелетных и адгезионных структур клетки, определяющих эти процессы. Вместе с тем, остается малоизученным вопрос контроля этих цитоскелетных изменений основными регуляторными системами клетки.

Особую роль среди таких регуляторных систем играет система гена и белка р53 - важнейшего регулятора процессов клеточного цикла, апоптоза и дифференцировки. Несмотря на огромное число исследований, посвященных структуре и функции р53, вопрос о связи этой системы с функцией цитоскелета остается неясным. Этот вопрос актуален не только для понимания нормальных механизмов морфогенеза, но и для понимания основных механизмов | канцерогенеза, поскольку в динамике канцерогенеза резко нарушаются как • функция р53, так и функции цитоскелетных систем, в особенности актомиозинового контракгильного аппарата. Одним из особых аспектов этой проблемы является изучение связи изменения активности р53 с так называемыми эпителио-мезенхимальными трансформациями, играющими важнейшую роль в морфогенезе многих тканей, а также при злокачественном превращении клеток. I

Цели и задачи работы

Целью настоящей диссертационной работы являлось изучение взаимосвязей между изменением морфологического фенотипа клеток различного происхождения, их цитоскелетных систем, и активностью опухолевого супрес^ора р53.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить, является ли избирательное разрушение цитоскелетных систем -41 актиновых микрофиламентов или микротрубочек - фактором, достаточным для активации р53 в клетках. ч

2. Изучить изменения морфологического фенотипа клеток в зависимости от экспрессии р53.

3. Изучить феномен мезенхимо-эпителиальной трансформации при воздействии на клетки хелатора железа дефероксамина и выяснить, является ли этот фенотипический переход р53-зависимым. I

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые показано, что нарушение целостности цитоскелетных систем клетки с помощью специфических химических агентов влечет за собой активацию онкосупрессора р53 и остановку клеточного цикла или апоптоз клеток с разрушенным цитоскелетом. Разборка пучков актиновых микрофиламентов с помощью цитохалазина й или микротрубочек с помощью колцемида вела к функциональной активации р53 и, как следствие, к остановке клеточного цикла или апоптозу клеток. В линиях клеток, не содержащих р53 или содержащих функционально неактивный р53, остановка цикла или апоптоз в ответ на разрушение цитоскелетных систем были не выражены. Таким образом, впервые было показано, что патологические изменения морфологии клеток и цитоскелетных систем может приводить к активации р53. Полученные нами данные существенно дополняют и расширяют представления о стрессорных воздействиях, приводящих к активации р53.

Показано, что экспрессия р53 меняет морфологический фенотип клеток. Клетки карциномы, лишенные р53, имели более дисковидную, эпителиоидную морфологию, сопровождающуюся образованием эпителиоидных островков, а I также изменениями цитоскелетных систем. Так, в отличие от исходных, р53-содержащих клеток, в клетках с нокаутированным р53 частично восстанавливались краевые пучки актиновых микрофиламентов, отсутствующие у клеток, экспрессирующих р53. Контактные структуры клеток, лишенных р53, т!акже были более ярко выражены. Так, эти клетки образовывали протяженные тангенциальные адгезионные контакты. Фокальные контакты р53-негативных клеток были более многочисленны, чем у р53-позитивных клеток, и располагались по всему периметру клетки. В целом, такая перестройка цитоскелета и изменение морфологического фенотипа клеток говорит о том, что р53 индуцирует переход клетки к более мезенхимальному фенотипу.

Показано также, что переход клеток от фибробластоподобного к » эпителиоидному фенотипу, т.е. мезенхимо-эпителиальная трансформация, может быть вызвана добавлением к культурам хелатора железа дефероксамина, и что I эта морфологическая трансформация не зависит от экспрессии р53 в клетках. В сравнительных опытах с воздействием дефероксамина на клетки, экспрессирующие р53 дикого типа и клетки, где р53 был так или иначе инакгивирован, мы показали, что индукция мезенхимо-эпителиальной ' трансформации не зависит от экспрессии р53.

Таким образом, установлены многообразные реципрокные связи между экспрессией р53 и динамическими перестройками цитоскелета, в том числе, участвующими в мезенхимо-эпителиальной трансформации. Исследование участия р53 в контроле морфологического фенотипа и цитоскелетной организации клеток приобретает все большее значение. Понимание роли р53 в этих процессах может привести к более полному пониманию механизмов канцерогенеза. В • частности, полученные нами данные о таких взаимодействиях могут оказаться ценными для разработки новых методов нормализации морфологического фенотипа и предотвращения процесса инвазии. I

Обзор литературы

В соответствии с задачами работы в обзоре литературы рассмотрены основные данные, касающиеся различной формы клеток и цитоскелетных структур, играющих главную роль в динамике этой морфологической организации. В первой части обзора мы разберем организацию двух типов клеток - эпителия и мезенхимальных клеток (фибробластов). Далее будут рассмотрены данные о механизме взаимных переходов между этими двумя типами организации, а также возможная роль р53 в этих переходах.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Рубцова, Светлана Николаевна

Выводы

1. Дезорганизация актинового компонента цитоскелета специфическим ингибитором (цитохалазином) приводит к активации опухолевого супрессора р53. Эта активация, в свою очередь, ведет к различным последствиям, характерным для повышенной экспрессии этого опухолевого супрессора: остановке клеточного цикла в фазе или апоптозу.

2. Деполимеризация системы микротрубочек специфическим агентом (колцемидом) приводит, наряду с характерными нарушениями митоза и структуры ядер, к активации р53. Следствием такой активации является остановка клеточного цикла в фазе Э1.

3. Полученные данные показывают, что разрушение каждого из основных компонентов цитоскелета - актин-миозиновой системы и системы микротрубочек - приводит к сходному повышению активности опухолевого супрессора р53. Эти данные существенно расширяют представление о спектре нарушений внутриклеточного гомеостаза, вызывающих активацию этого супрессора.

4. Клетки карциномы с нокаутированным р53 резко отличаются по своей морфологии и цитоскелетной организации от гомологичных клеток, экспрессирующих р53. Клетки без р53 имеют морфологию эпителиоидного типа, тогда как клетки с р53 - морфологию типа поляризованных фибробластов. Таким образом, между активностью опухолевого супрессора р53 и цитоскелетной организацией имеется взаимозависимость: эта активность зависит от структуры цитоскелета, но и в свою очередь регулирует эту структуру.

5. Дефероксамин, удаляющий железо из цитоплазмы, вызывает переход клеток от фибробластоподобной к эпителиоидной цитоскелетной структуре и морфологии. Такой переход протекает сходным образом как в клетках с активным р53, так и в клетках, где эта активность подавлена введением генетичского супрессорного элемента или нокаутом.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что структура цитоскелета и активность р53 реципрокно регулируют друг друга. Вместе с тем, определенные перестройки морфологии клеток (переход от поляризованной к эпителиоподобной структуре) могут осуществляться как при участии р53, так и без такого участия. Поскольку поляризованная структура клетки может способствовать опухолевой инвазии, полученные данные существенно раширяют представления о механизмах возникновения злокачественного инвазивного фенотипа в процессе канцерогенеза.

Заключение

В этой работе мы рассмотрели взаимодействие белка-онкосупрессора р53 и цитоскелетных систем: актиновых микрофиламентов и микротрубочек. Эти цитоскелетные системы определяют форму клетки, ее подвижность, а также образование адгезионных структур. Белок р53 является центральным компонентом сигнальных каскадов, активирующихся в ответ на клеточный стресс. Нам удалось показать, что нарушение целостности каждой из цитоскелетных систем, ведущее к изменениям формы клетки, является фактором, достаточным для активации защитной клеточной системы, приводимой в действие р53. Ранее было показано, что р53 активируется в ответ на генетические нарушения, являясь, таким образом, своеобразным «стражем генома». Выявленная нами в различных клеточных системах активация функции р53 при различных цитоскелетных нарушениях существенно дополняет и расширяет круг стрессорных воздействий на клетку, меняющих экспрессию этого гена. р53 можно считать не только «стражем генома», но и стражем всей внутренней организации клетки, в том числе цитоскелетных систем.

Во второй части работы нам удалось показать, что отношения между р53 и цитоскелетными системами являются реципрокными - с одной стороны, нарушение цитоскелетных систем влияет на активность р53; с другой стороны, активность р53 влияет на организацию цитоскелета и морфологический фенотип клеток. В наших экспериментах с клетками карциномы мы наблюдали изменение формы клеток с фибробластоподобной на эпителиоидную при нокауте р53.

В третьей части работы мы рассмотрели переход между эпителиодной и фибробластоподобной формами клеток, поскольку указанные данные свидетельствовали о возможной связи р53 с переходом между мезенхимальной и эпителиоидной структурой. В этой серии экспериментов мы исследовали вопрос о том, является ли такое изменение экспрессии р53 необходимым условием со всех случаях МЭТ. Для этого анализа мы использовали обнаруженный нами феномен: индукцию мезенхимо-эпителиального перехода под действием ОРО, который удаляет железо путем комплексообразования из внутриклеточного пула. В нашей опытной системе, в которой добавление к клеткам карциномы ОРО вызывало драматический сдвиг клеточной формы в эпителиоидном направлении, роль р53 оказалась не столь значимой. Клетки, лишенные р53 и имеющие более эпителиодную морфологию, после обработки DFO не отличались от своих фибробластоподобных предшественников. Клетки обеих линий сильно распластывались и образовывали эпителиоподобные островки. Тогда, чтобы исключить возможность частичной реверсии трансформированного фенотипа под действием DFO, мы повторили эти эксперименты, используя линию фибробластов, то есть клеток совершенно другого происхождения и другой цитоскелетной организации. Результаты оказались сходными - мы наблюдали явный морфологический сдвиг в сторону эпителиоидного фенотипа вне зависимости от активности р53 в клетках. Оказалось, что подавление функциональной активности р53 с помощью генетического супрессорного элемента GSE22 не влияло на переход фибробластоподобных клеток в сторону эпителиоидного фенотипа, вызываемого инкубацией с DFO. Таким образом, р53, по-видимому, участвует в определенных, но не во всех сигнальных путях, модулирующих переходы между фибробластоподобным и эпителиоидным фенотипом. Как уже отмечалось (см. гл 3 раздела Результаты), действие DFO, вероятно, связано с уменьшением количества активных форм кислорода (ROS) в клетке. С другой стороны, накапливающиеся в последнее время данные указывают на существенное значение ROS в морфологической неопластической трансформации. Как показывают полученные нами данные, эти перестройки могут проходить, по-видимому, разными путями: с участием изменения экспрессии р53 и без такого участия. В частности, такие перестройки возможны в неопластических клетках, многие из которых лишены активного гена р53. Таким образом, многообразные связи между активностью р53 и организацией цитоскелетной системы могут иметь существенное значение как для физиологических морфологических реакций, так и для канцерогенеза, в частности для процесса инвазии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Рубцова, Светлана Николаевна, 2005 год

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. "Молекулярная биология клетки", изд. "Мир", 1994

2. Глушанкова Н.А. Действие цитохалазина D на синтез ДНК в культивируемых клетках. Бюл. эксперим. биологии и медицины 5, 564-566 (1986).

3. Кондратов, Р.В., Кузнецов, Н.В., Пугачева, Е.Н., Алмазов, В.П., Прасолов, B.C., Копнин, Б.П., Чумаков, П.М. Функциональная гетерогенность р53-респонсивных элементов. Мол Биол. 30, 613-620 (1996).

4. Alexandrova A.Y., Dugina V.B., Ivanova O.Y., Kaverina I.N., Vasiliev J.M. Scatter factor induces segregation of multinuclear cells into several discrete motile domains. Cell Motil Cytoskeleton 39, 147-158 (1998).

5. Alexandrova A., Ivanov A., Chumakov P., Kopnin В., Vasiliev J. Changes in p53 expression in mouse fibroblasts can modify motility and extracellular matrix organization. Oncogene 19, 5826-5830 (2000).

6. Amano M., Ito M., Kimura K., Fukata Y., Chihara K., Nakano Т., Matsuura Y., Kaibuchi K. Phosphorylation and activation of myosin by Rho-associated kinase (Rho-kinase). J Biol Chem 27, 20246-20249 (1996).

7. Armit C.J., O'Dea S., Clarke A.R., Harrison D.J. Absence of p53 in Clara cells favours multinucleation and loss of cell cycle arrest. BMC Cell Biol 3, 27 (2002).

8. Ashcroft M., Taya Y., Vousden K.H. Stress signals utilize multiple pathways to stabilize p53. Mol Cell Biol 20, 3224-3233 (2000).

9. Attardi L.D., Reczek E.E., Cosmas C., Demicco E.G., McCurrach M.E., Lowe S.W., Jacks T. PERP, an apoptosis-associated target of p53, is a novel member of the PMP-22/gas3 family. Genes Dev 14, 704-718 (2000).

10. Ballestrem C., Hinz В., Imhof B.A., Wehrle-Haller B. Marching at the front and dragging behind: differential alphaVbeta3-integrin turnover regulates focal adhesion behavior. J Cell Biol 155, 1319-1332 (2001).

11. Bamburg J.R., McGough A., Ono S. Putting a new twist on actin: ADF/cofilins modulate actin dynamics. Trends Cell Biol 9, 364-370. (1999).

12. Barasch J. Genes and proteins involved in mesenchymal to epithelial transition. CurrOpin Nephrol Hypertens. 10, 429-436 (2001).

13. Barasch J., Yang J., Ware C.B., Taga Т., Yoshida K., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Parravicini E., Malach S., AranoffT., Oliver J.A. Mesenchymal toepithelial conversion in rat metanephros is induced by LIF. Cell 99, 377-386 (1999).

14. Bartek J., Bartkova J., Lukas J. The retinoblastoma protein pathway in cell cycle control and cancer. Exp Cell Res 237, 1-6 (1997).

15. Barth, A., Nathke, I.S., Nelson, W.J. Cadherins, catenins and APC protein: interplay between cytoskeletal complexes and signaling pathways. Curr. Opin. Cell Biol. 9,683-690 (1997).

16. Bershadsky A.D., Balaban N.Q., Geiger B. Adhesion-dependent cell mechanosensitivity. Annu Rev Cell Dev Biol 19, 677-695 (2003).

17. Bershadsky A., Chausovsky A., Becker E., Lyubimova A., Geiger B. Involvement of microtubules in the control of adhesion-dependent signal transduction. Curr Biol. 6, 1279-1289 (1996).

18. Bershadsky A.D., Vaisberg E.A., Vasiliev J.M. Pseudopodial activity at the active edge of migrating fibroblast is decreased after drug-induced microtubule depolymerization. Cell Motil Cytoskeleton 19, 152-158 (1991).

19. Bershadsky A.D., Vasiliev J.M. Cytoskeleton. Plenum Press, New York (1988).

20. Birchmeier C., Birchmeier W., Gherardi E., Vande Woude G.F. Met, metastasis, motility and more. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 915-925 (2003).

21. Bianchi L., Tacchini L., Cairo G. HIF-1-mediated activation of transferrin receptor gene transcription by iron chelation. Nucleic Acids Res 27, 4223-4227 (1999).

22. Bishop A.L., Hall A. Rho GTPases and their effector proteins. Biochem. J 348, 241-255 (2000).

23. Bokoch G.M. Biology of the p21-activated kinases. Annu Rev Biochem 72, 743781 (2003).

24. Borisy G.G., Svitkina T.M. Actin machinery: pushing the envelope. Curr Opin Cell Biol 12, 104-112 (2000).

25. Bunz F., Dutriaux A., Lengauer C., Waldman T., Zhou S., Brown J.P., Sedivy J.M., Kinzler K.W., Vogelstein B. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science 282, 1497-1501 (1998).

26. Burgess S.A., Knight PJ. Is the dynein motor a winch? Curr Opin Struct Biol 14, 138-146 (2004).

27. Burridge K., Chrzanowska-Wodnicka M. Focal adhesions, contractility, and signaling. Annu Rev Cell Dev Biol 12, 463-518 (1996).

28. Buschmann T., Lin Y., Aithmitti N., Fuchs S.Y., Lu H., Resnick-Silverman L., Manfredi J.J., Ronai Z., Wu X. Stabilization and activation of p53 by the coactivator protein TAFII31. J Biol Chem 276, 13852-13857 (2001).

29. Chernova O.B., Chernov M.V., Agarwal M.L., Taylor W.R., Stark G.R. The role of p53 in regulating genomic stability when DNA and RNA synthesis are inhibited. Trends Biochem Sci 20, 431-434 (1995)

30. Contente A., Dittmer A., Koch M.C., Roth J., Dobbelstein M. A polymorphic microsatellite that mediates induction of PIG3 by p53. Nat Genet 30, 315-320 (2002).

31. Cooper J.A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. J Cell Biol. 105, 1473-1478(1987).

32. Desai A., Mitchison T.J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117. (1997).

33. De Brabander M., De May J., Joniau M., Geuens G. Ultrastructural immunocytochemical distribution of tubulin in cultured cells treated with microtubule inhibitors. Cell Biol Int Rep 1, 177-183 (1977).

34. Di Leonardo A., Khan S.H., Linke S.P., Greco V., Seidita G„ Wahl G.M. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res 57, 1013-1019 (1997).

35. Dowrick P.G., Prescott A.R., Warn R.M. Scatter factor affects major changes in the cytoskeletal organization of epithelial cells. Cytokine 3, 299-310 (1991).

36. Dowrick P.G., Warn R.M. The effects of scatter factor on the cytoskeletal organization of epithelial cells. Cancer Invest. 8, 675-683 (1990).40.41,42,4344,45