Роль актин-миозиновых структур в механизмах подвижности нормальных и трансформированных фибробластов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат биологических наук Шутова, Мария Сергеевна

• Шутова, Мария Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шутова, Мария Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Актуальность проблемы.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна и практическая ценность работы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Организация актинового цнтоскелета нормальных фибробластов.

1.1. Общая организация актина.

1.2. Белки, индуцирующие полимеризацию актина.

1.3. Миозины и их участие в построении актинового цнтоскелета.

1.4. Зональная организация цнтоскелета: состав и молекулярная организация зон активного края.

1.5. Динамика актинового цнтоскелета фибробластов на примере распластывания.

1.6. Ингибиторы полимеризации актина.

1.7. Актиновый цитоскелет и фокальные контакты.

1.8. Rho-ГТФазы и регуляция перестроек цнтоскелета.

2. Микротрубочки и их связь с актиновым цитоскелетом.

2.1. Общая организация системы микротрубочек.

2.2. Роль микротрубочек в разборке фокальных контактов.

2.3. Функциональная связь мнкротрубочек с сократимостью.

3. Трансформация клеток онкогеном ras.

3.1. Белки Ras и их роль в передаче сигнала.

3.2. Фенотииические изменения клеток в результате неопластической трансформации.

3.3. Нарушения структуры и функций фокальных контактов.

3.4. Изменения подвижности клеток при трансформации.

3.5. Возможные пути влияния Ras на цитоскелет.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Клеточная культура.

2. Ингибиторы.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание и микроскопия.

4. Оценка скорости распластывания и морфометрический анализ.

5. DIC-видеомикроскопня.

6. Анализ миграции в рану и направленности движения.

7. Платиновые реплики и электронная микроскопия.

7.1. Коррелятивная электронная микроскопия.

7.2. Удаление актина с помощью гельзолнна.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Глава 1. Эффект ингибиторов сократимости на организацию и локомоторное поведение нетрансформированных фибробластов.

1.1. Контрольные клетки.

1.2. Локомоторный фенотнп клеток с подавленной сократимостью.

1.3. Способность клеток с подавленной сократимостью к поляризации.

1.4. Потеря способности к поляризации и направленному движению при деполимеризации МТ колцемидом.

1.5. Динамика процесса распластывания клеток с подавленной сократимостью.

Глава 2. Эффект ингибиторов сократимости на организацию и локомоторное поведение трансформированных фибробластов.

2.1. Морфологические изменения фибробластов при ЛЛЗ'-трансформации.

2.2. Морфология трансформированных клеток, обработанных ингибиторами сократимости.

2.3. Миграция трансформированных клеток, обработанных ингибиторами сократимости.

2.4. Эффект ингибиторов миозина II на динамику распластывания и поляризацию трансформированных фибробластов.

Глава 3. Ультраструктура цитоскелета клеток при разной степени подавления миозиновой сократимости.

3.1. Ультраструктура контрольных фибробластов.

3.2. Ультраструктура клеток, обработанных блеббистатином (75 мкМ и 100 мкМ).

Глава 4. Восстановление актин-миозпновых структур при отмывке ингибиторов мпознна II.

Глава 5. Эффект ингибиторов полимеризации актина на локомоторное поведение нетрансформированных и трансформированных клеток.

5.1. Морфология клеток, обработанных ингибиторами полимеризации актина.

5.2. Миграция клеток, обработанных ингибиторами полимеризации актина.

5.3. Эффект ингибиторов полимеризации актина на динамику распластывания.

5.4. Восстановление клеток после ингибиторов миозина в присутствии латрункулина А.

ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Подавление сократимости в нетрансформированных клетках.

1.1. Почему повышается подвижность?.

1.2. Ускорение распластывания.

1.3. Механизм поляризации клеток с пониженной сократимостью.

1.4. Два локомоторных фенотипа (сократимый и несократимый).

2. Трансформация.

2.1. Изменения в сократимости и организации актин-мпозиновых пучков.

2.2. Изменения поляризации, направленности движения и распластывания.

2.3. Почему эффект ингибиторов сократимости на трансформированные клетки меньше?.

2.4. Изменения в регуляции полимеризации актина.

3. Для чего нужен миозин.

3.1. Поляризация.

3.2. Прикрепление и протрузия.

3.3. Скорость движения.

3.4. Построение актин-мпозиновых пучков.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль актин-миозиновых структур в механизмах подвижности нормальных и трансформированных фибробластов»

Актуальность проблемы.

При трансформации и опухолевой прогрессии нарушаются не только механизмы нормальной пролиферации клеток, но и их локомоторная активность, что приводит к таким проявлениям «асоциального» поведения опухолевых клеток, как инвазивный рост и метастазирование.

На клеточном уровне основой возникновения этих свойств являются генетические изменения, приводящие к нарушению регуляции адгезии и подвижности клеток (Yamazaki et al., 2005). Установлено, что в этих процессах определяющую роль играют перестройки цитоскелетных структур. Трансформированные клетки зачастую отличаются от нормальных по своей морфологии и организации цитоскелета (Bershadsky and Vasiliev, 1988). Реорганизации цитоскелета, особенно изменения клеточной сократимости, регулируемой актин-миозиновым комплексом, имеют центральное значение для развития фенотипа морфологически трансформированных клеток с инвазивным поведением. Редукция стресс-фибрилл, характерная для многих типов трансформированных клеток, сопряжена с нарушением созревания контактных структур (Ровенский и Васильев, 2004) и часто коррелирует с повышением локомоторной активности и/или метастатического потенциала опухолевых клеток (Pokorna et al., 1994; Sahai and Marshall, 2003).

Таким образом, изучение механизмов нормальной подвижности клетки и нарушений этих механизмов является одной из важнейших задач современной клеточной биологии.

Согласно современным данным, главную роль в определении локомоторного фенотипа играет динамическое взаимодействие двух основных систем цитоскелета, микротрубочек и актин-миозиновой системы, создающей внутри клетки и в окружающем ее матриксе механическое натяжение, регулируемое молекулярной системой малых ГТФ-аз семейства Rho. Предыдущие работы нашей лаборатории дают основание предположить, что одним из ключевых событий в приобретении способности к инвазии является Rho-зависимое снижение актин-миозиновой контрактильности при сохранении структуры и активности системы микротрубочек. Заслуживает внимания дальнейшее исследование механизмов КЬо-зависимой регуляции реорганизаций цитоскелета и посредством них - формы, адгезии и движений в одном из основных морфологических типов клеток - в фибробластах.

Цели и задачи исследования.

Целью работы является изучение роли актин-миозиновой системы в определении морфологии и подвижности фибробластов в норме и при ras-трансформации.

Мы использовали клетки линии REF52tetRas с тетрациклин-регулируемой экспрессией онкогена ras (Gille and Downward, 1999; Boettner and Van Aelst, 2002), в которых отмывка тетрациклина приводит к синтезу конститутивно активного белка и к морфологической трансформации клеток (Kopnin et al., 2003; Alexandrova et al., 2006). В качестве характеристик клеточной подвижности мы рассматривали динамику процесса распластывания клеток и миграцию в экспериментальную рану.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать изменения морфологии, подвижности и направленности движения ^трансформированных фибробластов при подавлении актин-миозиновой сократимости (с помощью ингибиторов Y27632 и блеббистатина) по следующим пунктам:

- исследование строения цитоскелетных структур и фокальных контактов иммунофлуоресцентными методами;

- видеонаблюдение с целью изучения поведения индивидуальных клеток;

- оценка скорости и степени распластывания клеток с помощью компьютерного морфометрического анализа;

- оценка эффективности направленной миграции клеток в экспериментальную рану;

- ультраструктурное исследование цитоскелета методом платиновых реплик;

- исследование динамики восстановления актин-миозиновых структур после отмывки ингибиторов сократимости.

2. Охарактеризовать изменения в морфогенезе и подвижности фибробластов при ras-трансформации.

3. Сравнить изменения в морфогенезе и локомоторном поведении трансформированных и ^трансформированных клеток в присутствии агентов, изменяющих организацию актин-миозинового цитоскелета (Y27632, блеббистатин, латрункулин А, цитохалазин D).

Научная новизна и практическая ценность работы.

Необходимость дальнейших исследований молекулярных и клеточных механизмов морфологической трансформации и инвазивных миграций опухолевых клеток не подлежит сомнению. Взаимодействие различных компонентов цитоскелета и регуляторные пути при развитии инвазивного фенотипа еще не достаточно изучены.

В настоящей работе впервые проведен детальный анализ динамики актин-миозинового цитоскелета и локомоторного поведения трансформированных фибробластов в сравнении с ^трансформированными, а также проанализирована роль двух основных процессов - полимеризации актина и актин-миозинового сокращения — в клеточной подвижности.

В последние годы получены новые соединения, избирательно меняющие активность регуляторных белков и, вследствие, динамику цитоскелета, это Y27632, ингибитор активирующей миозин Rho-киназы (Ishizaki et al., 2000), и блеббистатин, ингибитор немышечного миозина II (Straight et al., 2003). В нашей работе впервые проведено сравнение локомоторных реакций нормальных и трансформированных фибробластов в присутствии этих агентов, а также сравнение реакций на ингибиторы полимеризации актина (латрункулин А и цитохалазин D).

Мы показали, что трансформированные клетки имеют сходство с клетками, обработанными ингибиторами сократимости: это усиление локомоторной активности на фоне ослабления/разрушения системы актин-миозиновых пучков. Однако, в отличие от трансформированных клеток, нормальные фибробласты сохраняют способность к направленному движению и под действием ингибиторов сократимости, которое поддерживается системой микротрубочек.

Показано, что трансформированные клетки иначе реагируют на низкие концентрации ингибиторов полимеризации актина, а именно утрачивают актинмиозиновые пучки, но не псевдоподиальную активность. Напротив, нормальные клетки утрачивают активность края, но сохраняют мощные пучки.

Впервые показано, что минимальная активность немышечного миозина II играет ключевую роль в первичном прикреплении и эффективной протрузии клеточного края. Также показано, что агрегация миозина в «рабочие единицы» - биполярные филаменты -зависит от степени и характера развития стресс-фибрилл в клетке.

Таким образом, ослабление актин-миозиновой системы в значительной мере обуславливает усиление подвижности ras-трансформированных клеток, хотя, вероятно, ненаправленность движения обусловлена активацией других сигнальных путей, ведущих от протоонкогена г as к цитоскелету.

Изучение механизмов регуляции перестроек цитоскелета и подвижности клеток, возможно, в дальнейшем откроет подходы к направленному исправлению молекулярных и клеточных нарушений, приводящих к инвазии, например, через нормализацию функций регуляторных белков, в частности, Rho-системы.

Обзор литературы

В основе движения клеток лежат перестройки актинового цитоскелета. Инициальным шагом перестроек является формирование так называемого ведущего (активного) края, на котором образуются протрузии и первичные контакты клетки с внеклеточным матриксом. Протрузия ведущего края обеспечивается силой полимеризации актина в зоне ламеллиподии. В зоне ламеллы происходит дальнейшая перестройка актина - формирование актин-миозиновых пучков. Образование контактов с субстратом инициируется в ламеллиподии, а созревание происходит в зоне ламеллы с участием стресс-фибрилл (Bershadsky et al., 2006, Alexandrova et al, 2008). Натяжение, создаваемое миозином, воздействует на инициальные фокальные комплексы, индуцируя их рост и превращение в фокальные контакты (Ingber, 1991; Riveline et al., 2001; Rottner et al., 2001; Krendel and Mooseker, 2005).

Ключевую роль в изменении и поддержании формы клеток и их движении играет цитоскелет. Он представлен тремя типами структур: актиновыми филаментами, микротрубочками и промежуточными филаментами, среди которых именно перестройки системы актина являются движущей силой в процессе движения клетки.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Шутова, Мария Сергеевна

Выводы.

1. При трансформации фибробластов онкогеном RAS актин-миозиновые пучки и фокальные контакты становятся менее выражены. Площадь трансформированных клеток снижается в два раза, они становятся мультиполярны, усиливается подвижность, но клетки двигаются менее направленно.

2. ^трансформированные фибробласты при ингибировании миозин-зависимой сократимости утрачивают зрелые фокальные контакты и стресс-фибриллы, их подвижность существенно повышается. Однако такие клетки сохраняют способность к развитию поляризации и направленной миграции, что, вероятно, обеспечивается взаимодействием системы микрофиламентов и микротрубочек.

3. Фибробласты, трансформированные онкогеном RAS, имеют общие признаю! с клетками, обработанными ингибиторами сократимости. Это нарушение образования стресс-фибрилл и фокальных контактов, усиление псевдоподиальной активности и подвижности, увеличение степени поляризации.

4. В контрольных нетрансформированных клетках миозиновые филаменты имеют высокую степень структурной организации. При ^^-трансформации они становятся менее упорядоченными. При разборке пучков под действием ингибиторов миозина миозиновые филаменты пропадают. Таким образом, в клетке агрегация миозина в биполярные филаменты зависит от того, в какой мере он задействован в стресс-фибриллах, хотя в условиях in vitro миозиновые филаменты могут собираться и без участия актина.

5. В нетрансформированных клетках стресс-фибриллы и фокальные контакты разрушаются при неполном подавлении активности миозина II (45 мкМ блеббистатина). Максимальное подавление активности миозина (100 мкМ бллеббистатина) ведет к ингибированию образования ламеллиподии и фокальных комплексов. Эти процессы взаимозависимы и требуют минимальной активности миозина II. При отмывке блеббистатина первыми восстанавливаются ламеллиподии и фокальные комплексы. Для восстановления и ламеллиподий, и стресс-фибрилл при отмывке необходима полимеризация актина.

6. В нетрансформированных клетках при частичном подавлении полимеризации актина в первую очередь нарушается образование ламеллиподии, а в трансформированных клетках - образование пучков. Таким образом, при RAS-трансформации происходят изменения регуляции полимеризации актина в сторону усиления псевдоподиальной активности и одновременного нарушения построения пучков.

7. Таким образом, онкоген RAS вызывает, во-первых, нарушение регуляции полимеризации актина и снижение актин-миозиновой сократимости, что приводит к усилению подвижности клеток, и, во-вторых, потерю направленности движения, очевидно, обусловленную нарушением других сигнальных путей.

4. Заключение.

В нашей работе мы подробно рассмотрели роль актин-миозинового сокращения в организации движения нормальных и трансформированных клеток. Понижение сократимости является частым характерным признаком клеток, подвергшихся трансформации, и наблюдается, в частности, в случае трансформации фибробластов онкогеном RAS. Мы увидели, что снижение (но не абсолютное подавление) сократимости коррелирует с усилением клеточной подвижности (добавление 45 мкМ блеббистатина, ^^-трансформация) (рис. 64). С другой стороны, мы показали, что минимальная активность миозина необходима для успешного прикрепления клетки к субстрату и эффективной протрузии клеточного края.

Мы показали, что нарушения поляризации и направленности движения трансформированных клеток не являются следствием ослабления системы актин-миозиновых пучков (подавление сократимости в нормальных клетках не приводит к нарушению поляризации), но, очевидно, являются следствием нарушения других сигнальных путей, контролируемых онкобелком Ras. Так, снижение сократимости -только один из признаков ^«^-трансформированных клеток. Локомоторное поведение трансформированных клеток оказывается менее чувствительным к действию ингибиторов миозина II и полимеризации актина.

Возможно, повышенная активация многих сигнальных путей у трансформированных клеток, в частности за счет постоянной активации Ras, приводит к тому, что они менее эффективно реагируют на внешние сигналы. Меньшая реактивность трансформированных клеток по сравнению с нормальными проявляется также при реакции их на различные субстраты (Moizhess and Vasiliev, 2001). Такая пониженная реакция трансформированных клеток на регуляторные сигналы, поступающие извне (в нашем случае на воздействие ингибиторов) является существенным адаптационным механизмом, позволяющим опухолевым клеткам инвазировать в соседние ткани, прикрепляться и образовывать новые колонии в условиях, в которых нормальные клетки существовать не могут.

CD I блебб ЮОмкМ блебб 45мкМ блебб 75м кМ <

RAS-трансформация норма сократимость

Рис. 64. Условная схема зависимости клеточной подвижности от сократимости актин-миозинового цитоскелета. При снижении сократимости нормальных клеток с помощью ингибиторов миозина (зеленые точки на схеме) клеточная подвижность повышается, но при максимальном ингибировании миозина (добавлении высоких доз ингибитора) нарушается формирование и прикрепление ламеллиподий, что негативно сказывается на клеточной подвижности. При /WS-трансформации также снижается сократимость актин-миозина по сравнению с нормой, что усиливает подвижность, кроме того, происходят нарушения регуляции направленности движения, видимо, не зависящие от изменений сократимости.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шутова, Мария Сергеевна, 2010 год

1. Гиоева Ф.К. и Минин А.А. 2003. Моторный белок кинезин: молекулярные основы многофункциональности. Вестник РОНЦ 3: 42-49.

2. Домнина J1.B., Иванова О.Ю. и Васильев Ю.М. 2001. Изменение поляризации фибробластов при изменении контрактильности актинового цитоскелета. Цитология 43(2): 133-141.

3. Каверина И. и Смолл Д.В. 2003. Направленная подвижность: микротрубочки указывают путь. Вестник РОНЦ (3): 59-67.

4. Копнин Б.П. 2004. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения. Канцерогенез. М.: Медицина. 86-102.

5. Ломакина М.Е., Александрова А.Ю. 2009. Анализ изменений, вызываемых экспрессией онкогена N-rav, в характере и распределении псевдоподиальной активности фибробластов. Онтогенез 40(4): 282-293.

6. Минина С.А., Александрова А.Ю. и Васильев Ю.М. 2003. Изменения формы клеток и актинового цитоскелета при трансформации, вызванной онкогеном ras; возможная роль Rho-киназы. Доклады Академии Наук 388: 1-3.

7. Нейфах А.А. 1985. Фокальные контакты нормальных и опухолевых клеток: исследование с помощью моноклональных антител. Автореферат диссертации на соискание ученой степени к. б. н. Москва.

8. Ровенский Ю.А., Васильев Ю.М. 2004. Морфогенетические реакции клеток и их нарушения при опухолевой трансформации. Канцерогенез. Под ред. Д.Г. Заридзе. М.: Медицина. 376-414.

9. Свиткина Т.М. 1990. Динамическая организация цитоскелета культивируемых клеток: ультраструктурное исследование. Автореферат на соискание ученой • степени доктора биологических наук. Москва.

10. Abercrombie М. 1970. Contact inhibition in tissue culture. In Vitro 6: 128-142.

11. Agapova L.S., Ivanov A.V., Sablina A.A., Kopnin P.B., Sokova O.I., Chumakov P.M. and Kopnin B.P. 1999. p53-dependent effects of RAS oncogene on chromosome stability and cell cycle checkpoints. Oncogene 18: 3135-3142.

12. Alberts В., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K. and Walter P. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Garland Science, New York.

13. Alexandrova A.Y., Kopnin P.B., Vasiliev J.M., Kopnin B.P. 2006. ROS up-regulation mediates Ras-induced changes of cell morphology and motility. Exp Cell Res 312(11): 2066-73.

14. Amano M., Ito M., Kimura K., Fukata Y., Chihara K., Nakano Т., Matsuura Y. and Kaibuchi K.1996. Phosphorylation and activation of myosin by Rho-associated kinase (Rho-kinase). J Biol Chem 271: 20246-9.

15. Ballestrem C., Wehrle-Haller В., Hinz B. and Imhof B.A. 2000. Actin-dependent lamellipodia formation and micro tubule-dependent tail retraction control-directed cell migration. Mol Biol Cell 11: 2999-3012.

16. Baum B. and Kunda P: 2005. Actin nucleation: spire-actin nucleator in a class of its own. CurrBiol 15: R305-R308.

17. Ben-Ze'ev A. 1997. Cytoskeletal and adhesion proteins as tumor supressors. Current Opinion in Cell Biology. 9: 99-108.

18. Bershadsky A.D. and Vasiliev J.M. 1988. Cytoskeleton. New York: Plenum Press.

19. Boettner B. and Van Aelst L. 2002. The RASputin effect. Genes and Development 16:2033-2038. '

20. Borisy G.G. and Svitkina T.M. Actin machinery: pushing the envelope. 2000. Curr Opin Cell Biol 12(1): 104-112.

21. Bos J.L. 1989. Ras oncogenes in human cancer: A review. Cancer Res 49: 46824689.

22. Breckenridge M.T., Dulyaninova N.G. and Egelhoff T.T. 2009. Multiple regulatory steps control mammalian nonmuscle myosin II assembly in live cells. Mol Biol Cell 20(1): 338-347.

23. Brenner S.L. and Korn E.D. 1979. Substoichiometric concentrations of cytochalasin D inhibit actin polymerization. Additional evidence for an F-actin treadmill. J Biol Chem 254(20): 9982-5.

24. Brown A.F., Dugina V.B., Dunn G.A. and Vasiliev J.M. 1989. A quantitative analysis of alterations in the shape of cultured fibroblasts induced by tumour-promoting phorbol ester. Cell Biology International Reports 13(4): 357-366.

25. Burridge K. 1999. Crosstalk between Rac and Rho. Science 283: 2028-29.

26. Burridge K. and Wennerberg K. 2004. Rho and Rac take center stage. Cell 116: 167-179.

27. Burridge K., Chrzanowska-Wodnichka M. and Zhong C. 1997. Focal adhesion assembly. Trends Cell Biol 7: 342-347.

28. Campbell P.M. and Der C.J. 2004. Oncogenic Ras and its role in tumor cell invasion and metastasis. Semin Cancer Biol 14: 105-114.

29. Cox E.A. and Huttenlocher A. 1998. Regulation of integrin-mediated adhesion during cell migration. Microsc Res Tech 43: 412-419.

30. Craig R., Smith R. and Kendrick-Jones J. 1983. Light-chain phosphorylation controls the conformation of vertebtate non-muscle and smooth muscle myosin molecules. Nature 302: 436-439.

31. Craig S.W. and Chen H. 2003. Lamellipodia protrusion: moving interactions of vinculin and Arp2/3. Curr Biol 13(6): R236-238.

32. Cramer L.P. 1999. Organization and polarity of actin filament networks in cells: implications for the mechanism of myosin-based cell motility. Biochem Soc Symp 65: 173-205.

33. Cukierman E., Pankov R. and Yamada K.M. 2002. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol 14: 633-639.

34. DeMali K.A., Barlow C.A. and Burridge K. 2002. Recruitment of the Arp2/3 complex to vinculin: coupling membrane protrusion to matrix adhesion. J Cell Biol 159(5): 881-891.

35. DesMarais V., Ghosh M., Eddy R. and Condeelis J. 2005. Cofilin takes the lead. J Cell Sci 118: 19-26.

36. Domnina L.V., Ivanova O.Y. and Vasiliev J.M. 1995. Effect of microtubule-specific drugs upon spatial organization of extracellular matrix in fibroblastic cultures. Cell Biol Int 19(9): 743-748.

37. Downward J. Mechanisms and consequences of activation of protein kinase B/Akt. 1998. Curr Opin Cell Biol 10: 262-267.

38. Dugina V.B., Alexandrova A.Y., Lane K., Bulanova E. and Vasiliev J.M. 1995. The role of the microtubular system in the cell response to HGF/SF. J Cell Sci 108: 16591667.

39. Dunn G.A. and Brown A.F. 1986. Alignment of fibroblasts on grooved surfaces described by a simple geometric transformation. J Cell Sci 83: 313-340.

40. Dunn GA and Zicha D. 1995. Dynamics of fibroblast spreading. J Cell Sci 108: 1239-1249.

41. Duxbury M.S., Ashley S.W. and Whang E.E. 2004. Inhibition of pancreatic adenocarcinoma cellular invasivness by blebbistatin: a novel myosin II inhibitor. Biochem Biophys Res Commun 313(4): 992-997.

42. Euteneuer U. and Schliwa M. 1984. Persistant, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature 310: 58-61.

43. Even-Ram S., Doyle A.D., Conti M.A., Matsumoto K., Adelstein R.S. and Yamada K.M. 2007. Myosin IIA regulates cell motility and actomyosin-microtubule crosstalk. Nat Cell Biol 9: 299-309.

44. Fukata M., Nakagawa M. and Kaibuchi K. 2003. Roles of Rho-family GTPases in cell polarisation and directional migration. Curr Opin Cell Biol 15: 590-597.

45. Giannone G., Dubin-Thaler B.J., Rossier O., Cai Y., Chaga O., Jiang G., Beaver W., Dobereiner H.G., Freund Y., Borisy G. and Sheetz M.P. 2007. Lamellipodial actin mechanically links miosin activity with adhesion-site formation. Cell 128: 561-575.

46. Gille H. and Downward J. 1999. Multiple ras effector pathways contribute to G1 cell cycle progression. J Biol Chem 274: 22033-40.

47. Goley E.D. and Welch M.D. 2006. The Arp2/3 complex: an actin nucleator comes of age. Mol Cell Biol 7: 713-726.

48. Goode B.L. and Eck M.J. 2007. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annu Rev Biochem 76: 593-627.

49. Gundersen G.G., Khawaja S. and Bulinsky S.C. 1987. Postpolymerization detyrosination of of a-tubulin: a mechanism of subcellular differentiation of microtubules J Cell Biol 105(1): 251-264.

50. Gundersen G.G., Wen Y., Eng C.H., Schmoranzer J., Cabrera-Poch N., Morris E.J., Chen M. and Gomes E.R. 2005. Regulation of microtubules by Rho GTPases in migrating cells. Novartis Found Symp. 269: 106-16; discussion 116-26, 223-230.

51. Hall A. 1998. Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton. Science 279: 509-514.

52. Hirata H., Tatsumi H. and Sokabe M. 2008. Mechanical forces facilitate actin polymerization at focal adhesions in a zyxin-dependent manner. J Cell Sci 121(17): 2795-2804.

53. Hotulainen P. and Lappalainen P. 2006. Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells. J Cell Biol 173(3): 383-394.

54. Hotulainen P., Paunola E., Vartiainen M.K. and Lappalainen P. 2005. Actin-depolymerizing factor and cofilin-1 play overlapping roles in promoting rapid F-actin depolymerization in mammalian nonmuscle cells. Mol Biol Cell 16: 649-664.

55. Ingber D.E. 1991. Integrins as mechanochemical transducers. Curr Opin Cell Biol 3: 841-848.

56. Ishizaki Т., Morishima Y., Okamoto M., Furuyashiki Т., Kato T. and Narumiya S. 2001. Coordination of microtubules and the actin cytoskeleton by the Rho effector mDial. Nat Cell Biol3: 8-14.

57. Ishizaki Т., Uehata M., Tamechika I., Keel J., Nonomura K., Maekawa M. and Narumiya S. 2000. Pharmacological properties of Y-27632, a specific inhibitor of rho-associated kinases. Mol Pharmacol 57: 976-983.

58. Jaffe A.B. and Hall A. 2005. Rho GTPases: biochemistry and biology. Annu Rev Cell Dev Biol 21: 247-269.

59. Jedeszko C., Victor B.C., Podgorski I. and Sloane B.F. 2009. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res 69(23): 9148-9155.

60. Joneson Т., White M.A., Wigler M.H. and Bar-Sagi D. 1996. Stimulation of membrane ruffling and MAP kinase activation by distinct effectors of RAS. Science 271: 810-812.

61. Katoh K., Kano Y. and Ookawara S. 2007. Rho-kinase dependent organization of stress fibers and focal adhesions in cultured fibroblasts. Genes to Cells 12: 623-638.

62. Kaverina I., Krylishkina O. and Small J.V. 1999. Microtubule targeting of substrate contacts promotes their relaxation and dissotiation. J Cell Biol 146(5): 1033-1044.

63. Kaverina I., Krylyshkina O. and Small J.V. 2002. Regulation of substrate adhesion dynamics during cell motility. Int J Biochem Cell Biol 34: 746-761.

64. Kawasaki Y., Senda Т., Ishidate Т., Koyama R., Morishita Т., Iwayama Y., Higuchi O. and Akiyama T. 2000. Asef, a link between the tumour supressor APC and G-protein signaling. Science 289(5482): 1194-1197.

65. Keller H.U., Naef A. and Zimmermann A. 1984. Effects of colchicine, vinblastine and nocodazole on polarity, motility, chemotaxis and с AMP level of human polymorphonuclear leukocytes. Exp Cell Res 153: 173-185.

66. Kimura K., Ito M., Amano M., Chihara K., Fukata Y., Nakafuku M., Yamamori В., Feng J., Nakano Т., Okawa K., Iwamatsu A. and Kaibuchi K. 1996. Regulation of Myosin Phosphatase by Rho and Rho-Associated Kinase (Rho-Kinase). Science 273: 245-248.

67. Kolega J. 2004. Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light. Biochemical and Biophysical Research Communications 320 (3): 1020-1025.

68. Kopnin P.B., Ivanov A.V., Il'inskaia G.V., Sablina A.A., Kopnin B.P. and Chumakov P.M. 2003. The protective role of p53 in Ras-induced transformation of REF52 cells. Mol Biol (Mosk.) 37(3): 458-471.

69. Kovar D.R. 2006. Molecular details of formin-mediated actin assembly. Curr Opin Cell Biol 18: 11-17.

70. Kozlov M.M. and Bershadsky A.D. 2004. Processive capping by formin suggests a force-driven mechanism of actin polymerization. J Cell Biol 167: 1011-1017.

71. Krendel M. and Mooseker M.S. 2005. Myosins: Tails (and Heads) of Functional Diversity. Physiology 20: 239-251.

72. Krendel M., Zenke F.T. and Bokoch G.M. 2002. Nucleotide exchange factor GEF-H1 mediates cross-talk between microtubules and the actin cytoskeleton. Nat Cell Biol 4: 294-301.

73. Krylyshkina O., Anderson K.I., Kaverina I., Upmann I., Manstein D.J., Small J.V. and Toomre D.K. 2003. Nanometer targeting of microtubules to focal adhesions.1. J Cell Biol 161: 853-859.

74. Le Clainche C. and Carlier M.-F. 2008. Regulation of Actin Assembly Associated With Protrusion and Adhesion in Cell Migration. Physiol Rev 88: 489-513.

75. Lebensohn A.M. and Kirschner M.W. 2009. Activation of the WAVE complex by coincident signals controls actin assembly. Mol Cell 36(3): 512-524.

76. Levina E.M., Kharitonova M.A., Rovensky Y.A. and Vasiliev J.M. 2001. Cytoskeletal control of fibroblasts length: experiments with linear strips of substrate. J Cell Sci 114: 4335-4341.

77. Li Z.H. and Bresnick A.R. 2006. The S100A4 metastasis factor regulates cellular motility via a direct interaction with myosin-IIA. Cancer Res 66: 5173-5180.

78. Limouze J., Straight A.F., Mitchison T. and Sellers J.R. 2004. Specificity of blebbistatin, an inhibitor of myosin II. J Muscle Res Cell Motil 25(4-5): 337-41.

79. Lo C.M., Buxton D.B., Chua G.C., Dembo M., Adelstein R.S. and Wang Y.L. 2004. Nonmuscle myosin IIB is involved in the guidance of fibroflast migration. Mol Biol Cell 5: 982-989.

80. Matson S., Markoulaki S. and Ducibella T. 2006. Antagonists of Myosin Light Chain Kinase and of Myosin II Inhibit Specific Events of Egg Activation in Fertilized Mouse Eggs. Biol Reprod 74(1): 169-176.

81. Medeiros N.A., Burnette D.T. and Forscher P. 2006. Myosin II functions in actin-bundle turnover in neuronal growth cones. Nat Cell Biol 8(3): 215-226.

82. Meshel A.S., Wei Q., Adelstein R.S. and Sheetz M.P. 2005. Basic mechanism of three-dimensional collagen fibre transport by fibroblasts. Nat Cell Biol 7: 157-164.

83. Minina S.A., Alexandrova A.Y. and Vasiliev J.M. 2003. Cell shape and actin cytoskeleton in Ras-induced transformation: possible role of Rho-kinase. Doklady AcademiiNauk 338: 1-3.

84. Mitchison T.J. and Kirschner M.W. 1987. Some thoughts on the partitioning of tubulin between monomer and polymer under conditions of dynamic instability. Cell Biophys 11: 35-55.

85. Moizhess T.G. and Vasiliev J.M. 2001. Substrate-induced polarization of cultured epithelyocites and fibroblasts: non-reactivity of ray-transformed cells. Cell Biol Int 9: 931-934.

86. Mullins R.D., Heuser J.A. and Pollard T.D. 1998. The interaction of Arp2/3 complex with actin: nucleation, high affinity pointed end capping, formation of branching networks of filaments. PNAS 95: 6181-6186.

87. Nobes C.D. and Hall A. 1999. Rho GTPases control polarity, protrusion and adhesion during cell movement. J Cell Biol 144: 1235-1244.

88. Orlando K.A., Stone N.L. and Pittman R.N. 2005. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Exp Cell Res 312(1): 5-15.

89. Ostap E.M. 2002. 2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor. J Muscle Res Cell Motil 23 (4): 305-308.

90. Palazzo A.F., Cook T.A., Alberts A.S. and Gundersen G.G. 2001. mDia mediates Rho-regulated formation and orientation of stable microtubules. Nat Cell Biol3: 723-729.

91. Pletjushkina O.J., Ivanova O.J., Kaverina I.N. and Vasiliev J.M. 1994. Taxol-treated fibroblasts acquire an epithelioid shape and a circular pattern of actin bundles. Exp Cell Res 212: 201-208.

92. Рокота E., Jordan P. W. O'Neill С. H., Zicha D., Gilbert C. S. and Vesely P. 1994. Actin cytoskeleton and motility in rat sarcoma cell populations with different metastatic potential. Cell Motil Cytoskeleton 28(1): 25-33.

93. Pollard T.D. and Borisy G.G. 2003. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell 112: 453-465.

94. Pollard T.D. and Weihing R.R. 1974. Actin and myosin and cell movement. CRC Crit Rev Biochem 2: 1-65.

95. Pollock C.B., Shirasawa S., Sasazuki Т., Kolch W. and Dhillon A.S. 2005. Oncogenic K-RAS Is Required to Maintain Changes in Cytoskeletal Organization, Adhesion and Motility in Colon Cancer Cells. Cancer Res 65(4): 1244-1250.

96. Ponti A., Machacek M., Gupton S.L., Waterman-Storer C.M. and Danuser G. 2004. Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells. Science 305: 1782-1786.

97. Quilliam L.A., Lacal J.C. and Bokoch G.M. 1989. Identification of rho as a substrate for botulinum toxin C3-catalyzed ADP-ribosylation. FEBS Lett. 247(2): 221-226.

98. Rhee S., Jiang H., Ho C.H. and Grinnell F. 2007. Microtubule function in fibroblast spreading is modulated according to the tension state of cell-matrix interactions. PNAS 104: 5425-5430.

99. Ridley A J. and Hall A. 1992. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell 70: 389-399.

100. Rodriguez O.C., Schaefer A.W., Mandato C.A., Forsher P., Bement W.M. and Waterman-Storer C.M. 2003. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nat Cell Biol 5: 599-609.

101. Rohatgi R., Ma L., Miki H., Lopez M., Kirchhausen Т., Takenawa T. and Kirschner M.V. 1999. The interaction between N-WASP and the Arp2/3 complex links Cdc42-dependent signals to actin assembly. Cell 97(2): 221-231.

102. Ronen D. and Ravid S. 2009. Myosin II Tailpiece Determines Its Paracrystal Structure, Filament Assembly Properties, and Cellular Localization. J Biol Chem 284(37): 24948-57.

103. Rovensky Y.A. 1998. Cellular and molecular mechanisms of tumor invasion. Biochemistry (Mosc) 63(9): 1029-1043.

104. Sahai E. and Marshall C.J. 2002. Rho-GTPases and cancer. Nature Reviews Cancer 2: 132-142.

105. Sahai E. and Marshall C.J. 2003. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nature Cell Biol 5: 711-720.

106. Sakamoto Т., Limouze J., Combs C.A., Straight A.F. and Sellers J.R. 2005. Blebbistatin, a myosin II inhibitor, is photoinactivated by blue light. Biochem 44(2): 584-588.

107. Sasaki A.T., Chun C., Takeda K. and Firtel R.A. 2004. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol 167(3): 505-518.

108. Sasse R., Glyn M.C., Birkett C.R. and Gull K. 1987. Microtubules containing acetylated alpha-tubulin in mammalian cells in culture J Cell Biol 104(1): 41-49.

109. Sastry S.K. and Burridge. K. 2000. Focal Adhesions: A Nexus for Intracellular Signaling and Cytoskeletal Dynamics. Exp Cell Res 261: 25-36.

110. Schliwa M. and Нбпег В. 1993. Microtubules, centrosomes and intermediate filaments in directed cell movement. Trends in Cell Biology 3: 377-380.

111. Schmidt C.E., Horwitz A.F., Lauffenburger D.A. and Sheetz M.P. 1993. Integrin-cytoskeletal interactions in migrating fibroblasts are dynamic, asymmetric and regulated. J Cell Biol. 123: 977-991.

112. Shemesh T. and Kozlov M. 2007. Actin polymerization upon processive capping by formin: a model for slowing and acceleration. Biophys J 92(5): 1512-21.

113. Shewan A.M., Maddugoda M., Kaemer A., Stehbens S.J., Verma S., Kovacs E. M. and Yap A.S. 2005. Myosin 2 is a key rho kinase target necessary for the local concentration of e-cadherin at cell-cell conacts Mol Biol Cell 10: 4531-42.

114. Shutova M.S., Alexandrova A.Y., Vasiliev J.M. 2008. Regulation of polarity in cells devoid of actin bundle system after treatment with inhibitors of myosin II activity. Cell Motil. Cytoskeleton. 65(9): 734-746.

115. Small J.V., Geiger В., Kaverina I. and Bershadsky A. 2002. How do microtubules guide migrating cells? Nat Rev Mol Cell Biol. 3: 957-964.

116. Small J.V., Herzog M.and Anderson K. 1995. Actin filament organization in the fish keratocyte lamellipodium. J Cell Biol 129: 1275-1286.

117. Small J.V. and Kaverina I. 2003. Microtubules meet substrate adhesions to arrange cell polarity. Curr Opin Cell Biol 15: 40-47.

118. Somlyo A.V., Bradshaw D., Ramos S., Murphy C., Myers C.E. and Somlyo A.P. 2000. Rho-kinase inhibitor retards migration and in vivo dissemination of human prostate cancer cells. FEBS Lett. 269: 652-659.

119. Spector I., Shochet N.R., Blasberger D. and Kashman Y. 1989. Latrunculins-Novel Marine Macrolides That Disrupt Microfilament Organization and Affect Cell Growth: I. Comparison with Cytochalasin D. Cell Motil Cytoskeleton 13: 127-144.

120. Straight A.F., Cheung A., Limouze J., Chen I., Westwood N.J., Sellers J.R. and Mitchison T.J. 2003. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science 299: 1743-1747.

121. Svitkina Т. 2007. (a) Electron microscopic analysis of the leading edge in migrating cells. Methods Cell Biol 79: 295-319.

122. Svitkina T. 2007. (b) N-WASP generates a buzz at membranes on the move. Cell 128(5): 828-830.

123. Svitkina T.M. and Borisy G.G. 1998. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods Enzymol 298: 570-592.

124. Svitkina T.M., Bulanova E.A., Chaga O.Y., Vignjevic D.M., Kojima S., Vasiliev J.M. and Borisy G.G. 2003. Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network. J Cell Biol 160: 409-421.

125. Svitkina T.M., Neyfakh A.A. Jr. and Bershadsky A.D. 1986. Actin cytoskeleton of spread fibroblasts appears to assemble at the cell edges. J Cell Sci 82: 235-248.

126. Svitkina, T.M. and G.G. Borisy. 1999. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. J Cell Biol 145: 1009-1026.

127. Tanenbaum S.W. 1978. Cytochalasins. Biochemical and Cell Biological Aspects. Amsterdam: Elsevier, North Holland. P. 1-564.

128. Valster A., Tran N.L., Nakada M., Berens M.E., Chan A.Y. and Symons M. 2005. Cell migration and invasion assays. Methods 37: 208-215.

129. Vasiliev J.M. 1985. Spreading of non-transformed and transformed cells. Biochim Biophys Acta 780: 21-65.

130. Vasiliev J.M. 2004. Cytoskeletal mechanisms responsible for invasive migration of neoplastic cells. Int J Dev Biol 48: 425-439.

131. Vasiliev J.M. and Gelfand I.M. 1976. Effects of colcemid on morfogenetic processes and locomotion of fibroblasts. Goldmam R. (ed.) Cell Motility. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory. 279-304.

132. Vasiliev J.M. and Gelfand I.M. 1976. Morphogenic reactions and locomotory behavior of transformed cells in culture. In: Fundamental Aspects of Metastasis, ed. L Weiss, Amsterdam: North-Holland, 71-98.

133. Vasiliev J.M., Gelfand I.M., Domnina L.V., Ivanova O.Y., Komm S.G. and Olshevskaya L.V. 1970. Effect of colcemid on the locomotory behavior of fibroblasts. J Embriol Exp Morphol 24: 625-640.

134. Vasiliev J.M., Omelchenko Т., Gelfand I.M., Feder H.H. and Bonder E.M. 2004. Rho overexpression leads to mitosis-associated detachment of cells from epithelial sheets: a link to mechanism of cancer dissemination. PNAS 101: 12526-12530.

135. Verkhovsky A.B., Surgucheva I.G., Svitkina T.M., Tint I.S. and Gelfand V.I. 1987. Organization of stress fibers in cultured fibroblasts after extraction of actin with bovine brain gelsolin-like protein. Exp Cell Res 173: 244-255.

136. Vial E., Sahai E. and Marshall C.J. 2003. ERK-MAPK signaling coordinately regulates activity of Rac 1 and Rho A for tumor cell motility. Cancer Cell 4: 67-79.

137. Vicente-Manzanares M., Zareno J., Whitmore L., Choi C.K. and Horwitz A.F. 2007. Regulation of protrusion, adhesion dynamics, and polarity by myosins IIA and IIB in migrating cells. J Cell Biol 176: 573-580.

138. Wakatsuki Т., Wysolmerski R. B. and Elson E. L. 2003. Mechanics of cell spreading: role of myosin II. J Cell Sci 116(Pt 8): 1617-1625.

139. Wang H.B., Dembo M., Hanks S.K. and Wang Y. 2001. Focal adhesion kinase is involved in mechanosensing during fibroblast migration. PNAS 98(20): 11295-300.

140. Watanabe N. and Higashida C. 2004. Formins: processive cappers of growing actin filaments. Exp Cell Res 301(1): 16-22.

141. Watanabe N., Kato Т., Fujita A., Ishizaki T. and Narumiya S. 1999. Cooperation between mDial and ROCK in Rho-induced actin reorganization. Nat Cell Biol 1: 136-143.

142. Waterman-Storer C.M. and Salmon E. 1999. Positive feedback interactions between microtubule and actin dynamics during cell motility. Curr Opin Cell Biol. 11:61-67.

143. Welte M.A. 2004. Bidirectional transport along microtubules. Curr Biol 14(13): R525-537.

144. Wolfenson H., Henis Y.I., Geiger B. and Bershadsky A.D. 2009. The Heel and Toe of the Cell's Foot: A Multifaceted Approach for Understanding the Structure and Dynamics of Focal Adhesions. Cell Motil Cytoskeleton 66: 1017-1029.

145. Worthylake R.A, Lemoine S., Watson J.M. and Burridge K. 2001. RhoA is required for monocyte tail retraction during transendothelial migration. J Cell Biol 154: 147-160.

146. Wu K.Y., Hengst U., Cox L.J., Macosko E.Z., Jeromin A., Urquhart E.R. and Jaffrey S.R. 2005. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature 436: 1020-1024.

147. Yamazaki D., Kurishu S. and Takenawa T. 2005. Regulation of cancer cell motility through actin reorganization. Cancer Sci 96(7): 379-336.

148. Yang C., Czech L., Gerboth S., Kojima S., Scita G. and Svitkina T. 2007. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biol 5(11): e317.

149. Zamir E. and Geiger B. 2001. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci 114: 3583-3590.1. Благодарности.

150. Автор выражает глубокую благодарность Антонине Юрьевне Александровой за активное участие и помощь на всех этапах работы, а также Татьяне Михайловне Свиткиной за предоставленную возможность проведения электронно-микроскопических исследований.