Активность промотора гена фитохелатинсинтазы риса и псевдофитохелатинового гена в модельных трансгенных растениях табака тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Постригань, Богдан Нилович

• Постригань, Богдан Нилович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Постригань, Богдан Нилович

Список условных обозначений.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. История открытия, биосинтез, структура и функции фитохел атинов.

1.1. Механизмы ответа растений на воздействие тяжелых металлов.

1.1.1. Органические кислоты и аминокислоты.

1.1.2. Металл - связывающие пептиды.

1.2. Открытие и краткая характеристика металлотионеинов.

1.2.1. Структура металлотионеинов.

1.2.2. Консервативность аминокислотной последовательности металлотионеинов.

1.2.3. Кластеры металлов и их структура.

1.3. Структура и биосинтез фитохелатинов.

1.4. Физиологические функции фитохелатинов.

1.4.1. Участие фитохелатинов в поддержании гомеостаза.

1.4.2. Участие в детоксикации кадмия с образованием комплексов, устойчивость растений к кадмию.

1.5. Индуцируемая экспрессия фитохелатинсинтаз растений на генном уровне.

1.6 Эксперименты по созданию синтетических псевдофитохелатиновых генов.

Глава 2. Фиторемедиация, фитоэкстракция и фитомайнинг.

ЧАСТЬ 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Реактивы и материалы.

3.1. Объекты исследований, бактериальные штаммы, плазмиды и фагмидные векторы.

3.2. Реактивы и материалы.

3.3. Составы использованных стандартных растворов.

Глава 4. Методы исследований.

4.1. Выделение и очистка ДНК растений.

4.2. Выделение и очистка РНК растений.

4.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

4.4. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

4.5. Ферментативное фосфорилирование олигонуклеотидов.

4.6. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирую щих условиях.

4.7. Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирую щих условиях.

4.8. Элюция ДНК из агарозных и полиакриламидных гелей.

4.9. Подготовка компетентных клеток E.coli.

4.10. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной

4.11. Трансформация Agrobacterium tumefaciens плазмидными конструкциями.

4.12. Автоматическое секвенирование ДНК.

4.13. Синтез к ДНК.

4.14. Полимеразная цепная реакция.

4.15. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

4.16. Технология циклирующей пробы.

4.17. Приготовление компетентных клеток E.coli и

Agrobacterium tumefaciens.

4.18. Электропорация компетентных клеток E.coli и

Agrobacterium tumefaciens.

4.19. Агробактериальная трансформация листовых пластинок табака.

4.20. Выделение тотального белка из растений.

4.21. Флюорометрическое определение активности репортерного гена GUS.

4.22. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

Часть 3. Результаты и обсуждение.

Глава 5. Клонирование и экспрессия в трансгенных растениях промоторной гена фитохелатинсинтазы риса Oryza sativa.

5.1. Оценка экспрессии промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса.

5.2. Клонирование и секвенирование промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса.

5.3. Создание экспрессионной конструкции на основе промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса.

5.4. Создание трансгенных растений табака, несущих промоторную область гена фитохелатинсинтазы риса и ее экспрессия в них.

5.5. Создание делеционного варианта промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса и его экспрессия в трансгенных растениях табака.

Глава 6. Конструирование, клонирование и экспрессия псевдофитохелатинового гена.

6.1. Конструирование и клонирование псевдофитохелатинового гена.

6.2. Создание трансгенных растений, несущих псевдофитохелатиновый ген и его экспрессия в них.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Активность промотора гена фитохелатинсинтазы риса и псевдофитохелатинового гена в модельных трансгенных растениях табака»

Актуальность работы. Одной из наиболее актуальных проблем нескольких последних десятилетий является неизбежно нарастающее техногенное загрязнение окружающей среды, в частности, тяжелыми металлами, в число которых входят ртуть, кадмий, свинец, цинк, медь и некоторые другие. Попадая различными путями в атмосферу и почву в повышенных концентрациях, они поступают сначала в растения, а затем с продуктами питания, в организм человека и животных (Wei, Zhou, 2008). Загрязнение плодородного слоя почвы тяжелыми металлами представляет собой серьезную проблему, поскольку такие металлы, как цинк, свинец и особенно кадмий обычно присутствуют в минеральных удобрениях, из-за чего с каждым годом растет их содержание в почве и увеличиваются площади загрязненных ими земель (Vassilev at al., 2002).

На протяжении многих лет во всём мире уделяется значительное внимание проблеме устойчивости растений к тяжелым металлам, поскольку они являются опасными экотоксикантами, что вызывает повышенный интерес к выяснению механизмов устойчивости растений к тяжелым металлам. Хотя в природе постоянно происходит естественная самоочистка загрязненных территорий, скорость данного процесса и его качество уже не позволяют полностью утилизировать токсичные отходы. Участки почв, загрязненные тяжелыми металлами, часто утрачивают растительность, что приводит к их эрозии и позволяет металлам распространяться с воздушными потоками, что расширяет площади загрязнений. В настоящее время используются механические, химические и биологические способы очистки загрязненных территорий. Однако общепринятые технологии рекультивации земель требуют больших капиталовложений и могут сопровождаться возникновением нежелательных побочных эффектов. Более того, эти технологии разрушают структуру почв и приводят к ее биологической инактивации (Raskin, Ensley, 2000; Mulligan et al., 2001;

Alkorta et al., 2004; Ghosh, Singh, 2005; Van Slycken et al., 2009). Большинство этих методов нельзя использовать для очистки территорий, где плодородие почв имеет большое значение (Chaney et al., 2007).

В связи с этим, для очистки и стабилизации загрязненных участков наиболее привлекательным выглядит применение растений, или так называемая "фиторемедиация" (Pilon-Smits, 2005; Stearns et al., 2007; Memon A.R., Schroder P., 2009). При этом стоимость всего комплекса мероприятий по очистке снижается, а какой-либо дополнительный ущерб окружающей среде отсутствует. Фиторемедиация не только способствует удалению из почвы загрязнителей, но и препятствует процессу выщелачивания почв, что приводит к улучшению, или, по крайней мере, к сохранению их структуры, повышению плодородия и сохранению возможности переработки загрязняющих веществ. Данный способ может использоваться для очистки больших территорий, где метод экскавации не приемлем, а также для очистки подземных и сточных вод. Однако на сверхзагрязненных территориях он ограничивается устойчивостью самих растений, применяемых при очистке (Witters at al., 2009). Проблема устойчивости растений к тяжелым металлам- имеет как теоретическое, так и практическое значение. Существуют естественные растения-аккумуляторы, которые могут накапливать тяжелые металлы в высоких концентрациях. Однако, чаще всего, они растут медленно и имеют низкую биомассу (Whiting et al., 2004). В последнее время разрабатываются различные подходы, обеспечивающие повышение эффективности фиторемедиационных мероприятий путем увеличения- скорости роста и биомассы^ растений-гипераккумуляторов, в? основном, при помощи генно-инженерных; приемов, таких как введение генов, кодирующих- признаки,;

I 1 1 ~ t характерные для< растений-гипераккумуляторов (Nagata at al.,' 2009). Одним из таких свойств является синтез металл-связывающих пептидов. Изучение механизма работы соответствующих- генов и создание трансгенных растений, способных накапливать без ущерба для своего развития значительные количества тяжелых металлов, и, таким образом, способствовать их выведению из почвы, позволит осуществлять очистку загрязнённых территорий, где уровень неорганических экотоксикантов особенно высок (Tong et al., 2004). За связывание тяжелых металлов в растениях отвечают, помимо прочих механизмов, специализированное семейство генов, кодирующих ферменты глутамилцистеинилдипептидил-транспептидазы (фитохелатинсинтазы), при помощи которых происходит нематричный синтез металл-связывающих пептидов-фитохелатинов с общей структурой [y-Glu(Cys)]n-Gly, где п = 2—11 (Clemens et al., 1999; Vatamaniuk et al., 2000). При создании растений, пригодных для использования в фиторемедиации, видится перспективным использование регуляторных элементов генов фитохелатинсинтаз, их кодирующей части, а также синтетических "псевдофитохелатиновых" генов, непосредственно кодирующих фитохелатины с несколько измененной структурой, характеризующейся отсутствием у-пептидной связи глутамина в силу матричной природы их синтеза.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования явилось создание модельных трансгенных растений табака, несущих полноразмерный и делеционный вариант промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса, псевдофитохелатиновый ген и изучение экспрессии данных конструкций в трансгенных растениях.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать эффективные методы оценки экспрессии эукариотических генов с помощью технологии циклирующей пробы и ПЦР-РВ* в присутствии РНКазы Н.

2. Создать на основе клонированной последовательности промотора фитохелатинсинтазы риса генно-инженерные конструкции в векторе pCAMBIA 1291Z с маркерным геном (3-глюкуронидазы GUS под контролем клонированного промотора.

3. Путем агробактериальной трансформации создать трансгенные растения табака, несущие промоторную область гена фитохелатинсинтазы риса и определить ее границы.

4. Провести количественную оценку транскрипционной активности промотора фитохелатинсинтазы риса.

5. Сконструировать олигонуклеотиды для создания псевдофитохелатинового гена с последующим клонированием его в бинарном векторе pCAMBIA 1305.1.

6. Создать трансгенные растения табака, содержащие псевдофитохелатиновый ген, и оценить сравнительную устойчивость таких растений к тяжелым металлам.

Научная новизна. Разработаны и на примере гена фитохелатинсинтазы риса опробованы два новых подхода к определению и оценке экспрессии безынтронных эукариотических генов, применимых также для анализа экспрессии генов, для которых отсутствует точная информация об интронах. Впервые созданы трансгенные растения табака, несущие генетическую конструкцию на основе промотора фитохелатинсинтазы риса и его делеционного варианта в рамках системы гетерологической экспрессии, в которых промоторная область одного вида растения функционирует в другом. Проведен количественный анализ экспрессии промотора фитохелатинсинтазы и его делеционного варианта в трансгенных растениях табака. Сконструированы олигонуклеотиды, на основе которых создан псевдофитохелатиновый ген, кодирующий фитохелатины матричного синтеза или псевдофитохелатины с последовательностью аминокислот Met(a-GluCys)4Gly. Созданы трансгенные растения, продуцирующие псевдофитохелатины, повышающие устойчивость растений к тяжелым металлам. Проведена оценка устойчивости к кадмию трансгенных растений табака, экспрессирующих псевдофитохелатины.

Практическая значимость. Создание трансгенных растений, способных накапливать без ущерба для своего развития значительные количества тяжелых металлов, связанных псевдофитохелатинами, и, таким образом, способствовать их выведению из почвы, позволит осуществлять очистку загрязнённых территорий, где уровень неорганических экотоксикантов особенно высок. Исследование промотора фитохелатинсинтазы риса служит отправным этапом для создания трансгенных растений в тех случаях, когда необходима не конститутивная, а индуцибельная экспрессия, например при возможной токсичности псевдофитохелатинов с большим числом повторяющихся мотивов (а-GluCys)n.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2006), на Школе-семинаре молодых ученых «Биомика-наука XXI века» (Уфа, 2007), молодежной научной школе-конференции «Современные методы и подходы в биологии и экологии» (Уфа, 2008).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 6 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 24 рисунка и 2 диаграммы. Состоит из, введения, обзора литературы (Часть 1), описания методов исследования (Часть 2), результатов исследования и их обсуждения (Часть 3), заключения, выводов и списка литературы, включающего 161 источник.

Конкурсная-поддержка работы: Исследования выполнены в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ НШ 1003.2006.4, НШ-649.2008.4 и Государственного контракта 02.740.11.0290

Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Постригань, Богдан Нилович

Выводы

1. Показана эффективность методов оценки экспрессии эукариотических генов с помощью технологии циклирующей пробы и ПЦР-РВ в присутствии РНКазы Н при определении индукции промотора фитохелатинсинтазы риса в растениях Oryza sativa.

2. На основе клонированной последовательности промотора фитохелатинсинтазы риса созданы экспрессируемые конструкции в векторе pCAMBIA 1291Z, в которых под контролем данного промотора находится маркерный ген (3-глюкуронидазы GUS.

3. Созданы трансгенные растения табака, несущие промоторную область гена фитохелатинсинтазы риса и показано, что регуляторные элементы находятся в пределах исследуемой промоторной последовательности гена фитохелатинсинтазы риса и активность промотора носит индуцибельный характер при воздействии различных концентраций кадмия.

4. Обнаружено, что трансгенные растения табака, содержащие делеционный вариант промоторной последовательности до положения -711 п.н. от старт-кодона гена фитохелатинсинтазы риса содержат достаточные для транскрипции регуляторные элементы

5. Показано, что полученные трансгенные растения табака, содержащие псевдофитохелатиновый ген, кодирующий пептид Met(GluCys)4Gly, обладают повышенной устойчивостью к действию тяжелых металлов.

Заключение

Для обезвреживания ядовитых органических веществ, попадающих в окружающую среду с отходами химических предприятий, уже давно и довольно успешно используют различные микроорганизмы. Однако они не способны удалять из почвы и воды вредные для здоровья тяжелые металлы - например, мышьяк, кадмий, медь, ртуть, селен, свинец, а также радиоактивные изотопы стронция, цезия, урана и другие радионуклиды. В связи с этим, остро стоит вопрос очистки загрязненных тяжелыми металлами территорий. В настоящее время для этого используются дорогостоящие, малоэффективные технологии, основанные на механическом удалении таких загрязнителей и химической обработке почв. Однако, для зеленых растений характерен процесс извлечения из окружающей среды и концентрирования в своих тканях различных элементов, кроме того, растительную массу не составляет особого труда собрать и сжечь, а образовавшийся пепел захоронить, или использовать как вторичное сырье.

Фиторемедиация, или использование растений для очистки окружающей среды, стала эффективным и экономически выгодным методом борьбы с загрязнением только после того, как обнаружили растения-гипераккумуляторы тяжелых металлов, способные накапливать в своих листьях до 5% никеля, цинка или меди в пересчете на сухой вес - то есть в десятки раз больше, чем обычные растения. Биологическое значение этого феномена еще до конца не раскрыто: можно, например, предположить, что высокое* содержание токсичных элементов защищает растения от вредителей и делает их более устойчивыми к болезням. Устойчивость к воздействию- тяжелых металлов у гипераккумуляторов обусловлена биосинтезом такими растениями специальных металл-связывающих веществ различной природы, в основном коротких пептидов, синтезируемых ферментативным путем - фитохелатинов.

Использование гипераккумуляторов для очистки почвы и воды предложено еще в начале 80-х годов. Однако, биомасса этих растений невелика, кроме того, не была разработана технология их выращивания. Ключевую позицию в этом вопросе заняла генная инженерия, при помощи которой можно перенести гены, кодирующие металл - связывающие пептиды гипераккумуляторов в растения, производящие большие количества биомассы, и обладающие значительным потенциалом для экспрессии таких конструкций. Помимо исследований с генами фитохелатинсинтаз проводились работы по созданию синтетических генов, кодирующих аналогичные фитохелатинам пептиды, способные синтезироваться матричным путем на рибосомах. Экспрессия этих генов показана в прокариотах, главным образом E.coli, с целью оценки возможности использования таких микроорганизмов в биоремедиации загрязненных сточных вод.

Перед нами стояла задача исследовать свойства промотора фитохелатинсинтазы риса для оценки перспективы, его использования в качестве промотора псевдофитохелатинового гена, в экспериментах по фиторемедиации. С этой целью промоторная последовательность фитохелатинсинтазы риса была клонирована в бинарный вектор pCAMBIA 1291Z, в котором под ее контролем находился маркерный ген р-глюкуронидазы GUS. Затем, в трансформированых полученными конструкциями растениях табака была исследована активность промотора гена фитохелатинсинтазы. В ходе исследований было показано, что промоторная область гена фитохелатинсинтазы риса обладает такими полезными качествами, как индуцибельность при действии кадмия в различных- его концентрациях и сравнительно высокая «промоторная сила».

Дальнейшей задачей по изучению экспрессионных свойств промоторной области явилось более точное определение расположения в-ней регуляторных элементов, обеспечивающих ее активность. Для этого от промоторной области с 5'-конца была удалена последовательность размером 189 п.н. до положения -711 п.н. и создана серия трансгенных растений табака, несущих образовавшийся делеционный вариант промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса, в которых под его контролем находился маркерный ген GUS. В результате оказалось, что регуляторные элементы лежат в пределах этой оставшейся после произведенной делеции последовательности, помимо этого «промоторная сила» этого участка была даже несколько выше, чем у полноразмерной промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса. Таким образом, можно заключить, что данная промоторная область удовлетворяет необходимым условиям по созданию генетических конструкций, которые в трансгенных модельных растениях табака будут пригодны для использования в экспериментах по фиторемедиации.

В результате проведенных экспериментов был создан синтетический псевдофитохелатиновый ген, кодирующий аналог фитохелатина с формулой Met(GluCys)4Gly, и синтезирующийся матричным путем. Генно-инженерная конструкция в векторе pCAMBIA 1305.1 на основе этого гена под управлением вирусного конститутивного промотора 35S обуславливала повышенную устойчивость несущих ее трансгенных растений табака при воздействии кадмия. В перспективе, следующим этапом исследований будет создание трансгенных растений табака, несущих псевдофитохелатиновый ген под контролем промотора гена фитохелатинсинтазы риса с ожидаемой индуцибельной экспрессией такой генетической конструкции при воздействии тяжелых металлов. Этот вариант экспрессии предпочтительнее в силу возможной токсичности для самого растения большого количества нарабатываемых псевдофитохелатинов при конститутивной экспрессии, особенно в случае наличия в ожидаемых конструкциях псевдофитохелатинового гена с различным числом повторяющихся мотивов (GluCys).

Создание генно-инженерными методами растенийгипераккумуляторов тяжелых металлов, пригодных для очистки загрязненных территорий представляет значительный практический интерес, с учетом того, что доля генетически модифицированных растений, используемых в сельском хозяйстве, постепенно растет. Такой подход имеет ряд преимуществ, поскольку он прост, не требует значительных затрат денежных средств и времени по сравнению с классическими методами механической и химической ремедиации. Помимо этого, такие растения, в перспективе, могут успешно применяться при фитоэкстракции накопленных в их биомассе тяжелых или даже драгоценных металлов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Постригань, Богдан Нилович, 2009 год

1. Серегин И.В. Фитохелатины и их роль в детоксикации кадия у высших растений // Успехи биологической химии. 2001. - Т.41. - С. 281300.

2. Assun9ao A.G., Martins P.D., De Folter S., Vooijs R., Schat H., Aarts M.G. Elevated expression of metal transporter genes in three accessions of the metal hyperaccumulator Thlaspi caerulescens // Plant, Cell and Environment. -2001.-V. 24.-P. 217-226.

3. Assunijao A.G., Peiper В., Vromans J., Lindhout P., Aarts M.G., Schat H. Construction of a genetic linkage map of Thlaspi caerulescens and quantitative trait loci analysis of zinc accumulation 11 New Phytologist. 2006. - V. 170. - P. 21-32.

4. Beck A., Lendzian K., Oven M., Christmann A., Grill E. Phytochelatin synthase catalyzes key step in turnover of glutathione conjugates // Phytochemistry. 2003. - V. 62. - P. 423-431.

5. Bae W., Mehra R.K. Metal-binding characteristics of a phytochelatin analog (Glu-Cys)2Gly // J. Inorg. Biochem. 1997. - V. 68. - P. 201-210.

6. Baker A.J.M., McGrath S.P., Reeves R.D., Smith J.A.C. Metal hyperaccumulator plants // A review of the ecology and physiology of abiological resource for phytoremediation of metal-polluted soils. 2000. - P. 85107.

7. Banuelos G.S. Phyto-products may be essential for sustainability and implementation of phytoremediation // Environ. Pollut. 2006. - V. 144. - P. 1923.

8. Blakeley S.D., Robaglia Ch., Brzezinski R., Thirion J.P. Induction of low molecular weight cadmium-binding compound in soybean roots // J. Exp. Bot. 1986. Vol. 37. P. 956—964.

9. Blum R., Beck A., Korte A., Stengel A., Letzel Т., Lendzian K., Grill E. Function of phytochelatin synthase in catabolism of glutathioneconjugates // Plant J. 2007. - V. 49. - P. 740-749.

10. Bartolf M., Brennan E., Price C.A. Partial Characterization of a Cadmium-binding Protein from the Roots of Cadmium-treated Tomato. // Plant Physiol. 1980. Vol. 66. P. 438—441.

11. Callahan D.L., Baker A.J., Kolev S.D., Wedd A.G. Metal ion ligands in hyperaccumulating plants // J. Biol. Inorg. Chem. 2006. - V. 11. - P. 2-12.

12. Cazale A.C., Clemens S. Arabidopsis thaliana expresses a second functional phytochelatin synthase // FEBS Letters. 2001. - V. 507. - P. 215219.

13. Chaney R.L., Angle J.S., Mcintosh M.S., Reeves R.D., Li Y.M., Brewer E.P., et al. Using hyperaccumulator plants to phytoextract soil Ni and Cd // Zeitschrift fur Naturforschung. 2005. - V. 60. - P. 190-198.

14. Chaney R.L., Angle J.S., Broadhurst C.L., Peters C.A., Tappero R.V., Sparks D.L. Improved Understanding of Hyperaccumulation Yields Commercial Phytoextraction and Phytomining Technologies // J. Environ. Qual. 2007. - V. 36.-P. 1429-1443.

15. Chen J., Goldsbrough P.B. Increased activity of g-glutamylcysteine synthetase in tomato cells selected for cadmium tolerance // Plant Physiol. -1994.-V. 106.-P. 233-239.

16. Chen S., Wilson D. B. Construction and characterization of Escherichia coli genetically engineered for bioremediation of Hg2 contaminated environments // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - V. 63. - P. 2442-2445.

17. Chen J., Zhou J., Goldsbrough P.B. Characterization of phytochelatin synthase from tomato // 1997. Physiol Plant V. 101. - P. 165-172.

18. Clemens S., Kim E.J., Neumann D., Schroeder J.I. Tolerance to toxic metals by a gene family of phytochelatin synthases from plants and yeast. // EMBO J. 1999. Vol. 18. P. 3325—3333.

19. Clemens S., Schroeder J., Degenkolb T. 2001 Caenorhabditis elegans expresses a functional phytochelatin synthase // Eur. J. Biochem. V. 268. - P. 3640-3643.

20. Clemens S. Evolution and function of phytochelatin synthases. // 2006.-J. Plant Physiol.-V. 163.-P. 319-332.

21. Cobbett C.N., May M.J., Howden R., Rolls B. The glutathione-deficient, cadmium-sensitive mutant, cad2-1, of Arabidopsis thaliana is deficient in y-glutamylcysteine synthetase. // Plant J. 1998. Vol. 16. P. 73—78.

22. Cobbett C.S. Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification. // Plant Physiol. 2000. - V. 123. - P. 825-832.

23. Cobbett C.S. Phytochelatin biosynthesis and function in heavy-metal detoxification // Curr. Opin. Plant. Biol. 2000. - V. 3. - P. 211-216.

24. Cobbett C., Goldsbrough P. Phytochelatins and metallothioneins: roles in heavy metal detoxification and homeostasis // Annu Rev Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2002-V. 53.-P. 159-182.

25. Cunningham S.D., Berti W.R., Huang J.W.W. Phytoremediation of contaminated soils // Trends Biotechnol. 1995. - V. 13. - P. 393-397.

26. Danuta M.A. Overexpression of phytochelatin synthase in tobacco: distinctive effects of AtPCS 1 and CePCS genes on plant response to cadmium // Journal of Experimental Botany. 2008. - V. 59, N 8. - P. 2205-2219

27. Dameron C.T., Winge D.R. Peptide-mediated formation of quantum semiconductors // Trends Biotechnol. 1990. - V. 8, N 1. - P. 3-6.

28. Delhaize E., Jackson P.J., Lujan L.D., Robinson N.J. Poly(gamma-glutamylcysteinyl)glycine Synthesis in Datura innoxia and Binding with Cadmium : Role in Cadmium Tolerance // Plant Physiol. 1989. Vol. 89. P. 700— 706.

29. Deniau A.X., Peiper В., Ten Bookum W.M., Lindhout P., Aarts M.G., Schat H. QTL analysis of cadmium and zinc accumulation in the heavy metal hyperaccumulator Thlaspi caerulescens // Theoretical and Applied Genetics. -2006.-V. 113.-P. 907-920.

30. Dietz A.C., Schnoor J.L. Advances in phytoremediation // Environ. Health Perspect.-2001.-V. 109.-P. 163-168.

31. Eapen S., Singh S., D'Souza S.F. Advances in development of transgenic plants for remediation of xenobiotic pollutants // Biotechnol. Adv. -2007.-V. 25.-P. 442-451.

32. Ernst W.H.O. Phytochelatins in Cadmium-Sensitive and Cadmium-Tolerant Silene vulgaris // Plant Physiol. 1994. Vol. 104. P. 255—261.

33. Ernst W.H.O. // Biomarkers: A Prag matic Basis for Remediation of Severe Pollution in Eastern Europe / Ed: Peakall D.B., Walker C.H., Migula P. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. 1999. - P. 135—151.

34. Gadd G.M., White C. Microbial treatment of metal pollution: a working biotechnology? // Trends Biotechnol. 1993. - V. 11. - P. 353-359.

35. Gairola C.G., Wagner G.J., Diana J.N. Tobacco, Cd and health // Journal of Smoking-Related Disorders. 1992. - V. 3. - P. 3-6.

36. Gasic K., Korban S.S. Expression of arabidopsis phytochelatin synthase in indian mustard (brassica juncea) plants enhances tolerance for Cd and Zn // Planta. 2007. - V. 225. - V. 1277-1285.

37. Ghosh M., Singh S.P. A review on phytoremediation of heavy metals and utilization of its byproducts // Appl. Ecol. Environ. Res. 2005. — V. 3. - P. 1-18.

38. Raskin I., Ensley B.D. Phytoremediation of toxic metals: using plants to clean up the environment // Wiley, New York. 2000.

39. Gries G.E., Wagner G.J. Association of nickel versus transport of cadmium and calcium in tonoplast vesicles of oat roots // Planta. 1998. Vol. 204. P. 390—396.

40. Grill E., Winnacker E.L., Zenk M.H. Phytochelatins: the principal heavy-metal complexing peptides of higher plants // Science. 1985. — V. 230. -P. 674-676.

41. Grill E., Gekeler W.K., Winnacker E.L., Zenk M.H. Homo-phytochelatins are heavy metal-binding peptides of homo-glutathione containing Fabales. //FEBS. Lett. 1986. Vol. 205. P. 47—50.

42. Grill E., Winnacker E.L., Zenk M.H. Phytochelatins, a class of heavy-metal-binding peptides from plants, are functionally analogous to metallothioneins //Proc. Natl. Acad. Sci. 1987. Vol. 84. P. 439—443.

43. Grill E., Loffler S., Winnacker E.L., Zenk M.N. Phytochelatins, a, class of heavy metal-binding peptides from plants, are functionally analogous to metallothioneins//Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. Vol. 86. P. 6838—6842.

44. Grotz N., Guerinot M.L. Molecular aspects of Cu, Fe and Zn homeostasis in plants // Biochim. Biophys. Acta. 2006. -V. 1763. -P. 595.

45. Ha S.B., Smith A.P., Howden R., Dietrich W.M., Bugg S., O'Connell M.J., Goldsbrough P.B., Cobbett C.S. Phytochelatin synthase genes from Arabidopsis and the yeast Schizosaccharomyces pombe // Plant Cell. 1999. -V. 11.-P. 1153-1163.

46. Hall J.L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance // J. Exp. Bot. 2002. - V. 53. - P. 1-11.

47. Hayashi Y., Nakagawa C.W., Muton N., Isobe V., Goto T. Two pathways in the biosynthesis of cadystins (gamma EC)nG in the cell-free system of the fission yeast. // Biochem. Cell Biol. 1991. Vol. 69. - P. 115—121.

48. Hell R., Bergmann L. Glutamylcysteine synthetase in higher plants: catalytic properties and subcellular localization // Planta 1990. Vol. 180. - P. 603—612.

49. Horsh R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholtz D., Rogers S.C., Fraley R.T. A simple and general method for transferring genes into plants // Science. 1985.-V. 227.-P. 1229-1231.

50. Howden R., Cobbett C.S. Cadmium-sensitive mutants of Arabidopsis thaliana //Plant Physiol. 1992.- V.99. - P. 100-107.

51. Howden R., Goldsbrough P.B., Andersen C.S., Cobbett C.S. Cadmium-sensitive, cadi mutants of Arabidopsis thaliana are phytochelatin deficient // Plant Physiol. 1995. - Vol. 107. - P. 1059—1066.

52. Juang R.H., McCue K.F., Ow D.W. wo purine biosynthetic enzymes that are required for cadmium tolerance in Schizosaccharomyces pombe utilize cysteine sulfinate in vitro // Arch. Biochem. Biophys. 1993. - Vol. 304. - P. 392-—401.

53. Kagi JHR. Overview of metallothionein // Methods Enzymol. 1991. -V. 205.-P. 613-626.

54. Kim J.H., Lee S. Overexpression of Arabidopsis phytochelatin synthase (AtPCSl) does not change the maximum capacity for non-protein thiol production induced by cadmium // J. of Plant Biology. 2007. - V. 502. - P. 220-223.

55. Klapheck S., Fliegner W., Zimmer I. Hydroxymethyl-phytochelatins (gamma-glutamylcysteine)n-serine. are metal-induced peptides of the Poaceae. // Plant Physiol. 1994. - Vol. 104. - P. 1325—1332.

56. Kobayashi R., Yoshimura E. Differences in the binding modes of phytochelatin to cadmium and zinc ions // Biol. Trace Elem. Res. 2006. - V. 114.-P. 313-318.

57. Kotrba P., Doleckova L., de Lorenzo V., Ruml T. Enhanced bioaccumulation of heavy metal ions by bacterial cells due to surface display of short metal binding peptides // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - P. 1092-1098.

58. Krotz R.M., Evangelou B.P., Wagner G.J. Relationships between Cadmium, Zinc, Cd-Peptide, and Organic Acid in Tobacco Suspension Cells. // Plant Physiol. 1989. - V. 91. - P. 780—787.

59. Kuboi Т., Noguchi A., Yazaki J. Relationship between tolerance and accumulation characteristics of cadmium in higher plants // Plant Soil. 1987. -V. 104. - P. 275—280.

60. Kubota H.5 Sato K.5 Yamada Т., Maitani T. Phytochelatin homologs induced in hairy roots of horseradish. // Phytochemistry. 2000. - V. 53. - P. 239—245.

61. Lasat M.M. Phytoextraction of toxic metals: A review of biological mechanisms//J. Environ.,Qual. -2002. V. 31.-P. 109-120.

62. Lee S., Moon J.S., Ко T.S., Petros D., Goldsbrough P.B., Korban S.S. Overexpression of Arabidopsis phytochelatin synthase paradoxically leads tohypersensitivity to cadmium stress // Plant Physiology. 2003. - V. 131. - P. 656-663.

63. Leoffler S., Hochberger A., Grill E., Winnaacker E.L., Zenk M.H. Termination of the phytochelatin synthase reaction through sequestration of heavy metals by the reaction product // FEBS Lett. 1989. - V. 258. - P. 42-46.

64. Li Z.S., Szczypka M., Lu Y.P., Thiele D.J., Rea P.A. The yeast cadmium factor protein (YCF1) is a vacuolar glutathione S-conjugate pump. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 6509—6517.

65. Li Z.S., Lu Y.P., Zhen R.G., Szczypka M., Thiele D.J., Rea P.A. A new pathway for vacuolar cadmium sequestration in Saccharomyces cerevisiae: YCF1 -catalyzed transport of bis(glutathionato)cadmium // Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. - Y. 94.-P. 42—47.

66. Liang Zhu Y., Pilon-Smits E.A.H., Tarun A.S., Weber S.U., Jouanin L., Terry N. Overexpression of Glutathione Synthetase in Indian Mustard Enhances Cadmium Accumulation and Tolerance // Plant Physiol. 1999. V. 121.-P. 1169—1177.

67. Li Y., Dhankher O.P., Carreira L., Lee D., Chen A., Schroeder J.I., Balish R.S.,

68. Mattison P.L. Metal biosorbents / In P. L. Mattison (ed.) Bioremediation of metals // Cognis, Santa Rosa, Calif. 1992.

69. May M.J., Leaver C.J. Arabidopsis thaliana gamma-glutamylcysteine synthetase is structurally unrelated to mammalian, yeast, and Escherichia coli homologs //Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. - V. 91. - P. 10059—10063.

70. May M.J., Vernoux Т., Sanchez-Fernandez R., Van Montagu M., Inze D. Evidence for posttranscriptional activation of gamma-glutamylcysteine synthetase during plant stress responses // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. - P. 12049—12054.

71. May M.J., Vernoux Т., Leaver C., Van Montague M., Inze D. Glutathione homeostasis in plants: implications for environmental sensing and plant development // J. Exp. Bot. 1998. - V. 49. - P. 649-667.

72. Mazen A.M. A., El Maghraby O.M.O. Accumulation of cadmium, lead and strontium, and a role of calcium oxalate in water jacinth tolerance // Biol. Plant. 1997/98. - V. 40. - P. 411—417.

73. Mazess R., Barden H. Bone density in premenopausal woman; effect of age, dietary intake, physical activity, smoking and birth control pills // American Journal of Clinical Nutrition. 1991. - V. 53. - P. 132-142.

74. McGrath S.P., Zhao F.J., Lombi E. Phytoremediation of metals, metalloids, and radionuclides // Adv. Agron. 2002. - V. 75. - P. 1-56.

75. McGrath S.P., Lombi E., Gray C.W., Caille N., Dunham S.J., Zhao F.J. Field evaluation of Cd and Zn phytoextraction potential by the hyperaccumulators Thlaspi caerulescens and Arabidopsis halleri // Environmental Pollution. 2006. - V. 141.-P. 115-125.

76. Meagher R.B. Overexpression of phytochelatin synthase in Arabidopsis leads to enhanced arsenic tolerance and cadmium hypersensitivity // Plant and Cell Physiology. 2004. - V. 45. - P. 1787 - 1797.

77. Meagher R.B., Heaton A.C.P. Strategies for the engineered phytoremediation of toxic element pollution: Mercury and arsenic // J: Ind. Microbiol. Biotechnol. 2005. - V. 32. - P. 502-513.

78. Mejare M., Bulow L. Metal-binding proteins and peptides in bioremediation and phytoremediation of heavy metals // Trends Biotechnol. -2001.-V. 19.-P. 67-73.

79. Memon AR, Aktoprakligil D, Ozdemir A, ve Vertii A (2000) Heavy metal accumulation and detoxification mechanisms in plants. Turk J Bot 25:111— 121

80. Memon A.R., Schroder P. Implications of metal accumulation mechanisms to phytoremediation // Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2009. - V. 16, N2.-P. 162-175.

81. Meister A, Anderson ME (1983) Glutathione. Annu Rev Biochem 52:711-760

82. Meuwly P., Thibault P., Schwan A.L., Rauser W.E. Three families of thiol peptides are induced by cadmium in maize // Plant J. 1995. - V. 7. - P. 391—400.

83. Meuwly P., Thibault P., Rauser W.E. gamma-Glutamylcysteinylglutamic acid~a new homologue of glutathione in maize seedlings exposed to cadmium. // FEBS Lett. 1993. - V. 336. - P. 472—476.

84. Milner M J., Leon V. Kochian Investigating Heavy-metal Hyperaccumulation using Thlaspi caerulescens as a Model System // Annals of Botany.-2008.-V. 102,N 1.-P. 3-13.

85. Mulligan C.N., Yong R.N., Gibbs B.F. Remediation technologies for metal-contaminated soils and groundwater: an evaluation. Eng. Geol. 2001. -V. 60.-P. 193-207.

86. Nagata Т., Nakamura A., Akizawa Т., Pan-Hou H. Genetic engineering of transgenic tobacco for enhanced uptake and bioaccumulation of mercury II Biol. Pharm. Bull. 2009. - V. 32, N 9. - P. 1491-1495.

87. Nishizono H., Ichikawa H., Suzuki S., Ishii F. // Plant Soil. 1987. -V. 101.-P. 15—20.

88. Nriagu J.О., Pacyna J.M. Quantitative assessment of worldwide contamination of air, water and soils by trace metals // Nature. 1988. - V. 333. -P. 134-139.

89. Ortiz D.F., Kreppel L., Speiser D.M., Scheel G., McDonald G., Ow D.W. Heavy metal tolerance in the fission yeast requires an ATP-binding cassette-type vacuolar membrane transporter // EMBO J. 1992. - V. 11. - P. 3491—3499.

90. Ortiz D.F., Ruscitti Т., McCue K.F., Ow D.W. Transport of metal-binding peptides by HMT1, a fission yeast ABC-type vacuolar membrane protein // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 4721—4728.

91. Oven M., Page J.E., Zenk M.H., Kutchan T.M. Molecular characterization of the homo-phytochelatin synthase of soybean Glycine max. Relation to phytochelatin synthase // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 47474754.

92. Padmavathiamma PK, Li LY (2007) Phytoremediation technology: hyper accumulation of metals in plants. Water Air Soil Pollut 184:105-126

93. Pollard A.J., Powell K.D., Harper F.A., Smith J.A.C. The genetic basis of metal hyperaccumulation in plants // Crit. Rev. Plant Sci. 2002. - V. 21. -P. 539-566.

94. Pilon-Smits E.A.H. Phytoremediation.// Ann. Rev. Plant Biol. 2005. -V. 56.-P. 15-39.

95. Rai U.N., Tripathi R.D., Gupta M., Chandra P. Induction of phytochelatins in Hydrilla verticillata (l.f.) royle under cadmium stress // J. Environ. Sci. Health. 1996. - V. 30. - P. 2007—2026.

96. Rauser W.E. Compartmental Efflux Analysis and Removal of Extracellular Cadmium from Roots // Plant physiol. 1987. - V. 51. - P. 171— 175.

97. Rauser W.E. Phytochelatins // Annu. Rev. Biochem. 1990. - V.59. -P. 61-86.

98. Rauser W.E., Schupp R., Rennenberg H. Cysteine, gamma-Glutamylcysteine, and Glutathione Levels in Maize Seedlings : Distribution and Translocation in Normal and Cadmium-Exposed Plants // Plant Physiol. 1991. -Vol. 97. - P. 128—138.

99. Rauser W.E. Phytochelatins and related peptides. Structure, biosynthesis, and function // Plant Physiol. 1995. - V. 109. - P. 1141—1149.

100. Rauser W.E., Meuwly P. Retention of cadmium in roots of maize seedlings. Role of complexation by phytochelatins and related thiol peptides. // Plant Physiol. 1995. - V. 109. - P. 195—202.

101. Rauser W. E. Structure and function of metal chelators produced by plants: the case for organic acids, amino acids, phytin, and metallothioneins. // Cell Biochem. Biophys. 1999. - V. 31. - P. 19—48.

102. Reese R.N., Wagner G.J. Properties of tobacco (Nicotiana tabacum) cadmium-binding peptide(s). Unique non-metallothionein cadmium ligands. // Biochem. J. 1987. - V. 241. - P. 641—647.

103. Reese R.N., White C.A., Winge D.R. Cadmium-Sulfide Crystallites in Cd-(gammaEC)(n)G Peptide Complexes from Tomato // Plant Physiol. 1992. -V. 98. - P. 225—229.

104. Reeves R.D. The hyperaccumulation of nickel by serpentine plants. 1992. P. 253-277. / In Baker A.J.M. et al. (ed.). Th e vegetation of Ultramafi с (Serpentine) soils. Intercept Ltd., Andover, Hampshire, UK.

105. Ritter J.A., Bibler J.P. Removal of mercury from waste water: large scale performance of an ion exchange process // Water Sci. Technol. 1992. V. 25.-P. 165-172.

106. Robinson N.J., Tommey A.M., Kuske C., Jackson P.J. Plant metallothioneins // Biochem. J. 1993. - V. 295. - P. 1—10.

107. Robinson N.J., Wilson J.R., Turner J.S., Fordham-Skelton A.P., Groom Q.J. // Plant Root-From Cells to Systems / Ed: H.M. Anderson et al. Kluwer Academic Publishers. Netherlands. 1997. - P. 117—130.

108. Robinson В., Fernandez J-E., Madejon Т., Murillo J.M., Green S., Clothier B. Phytoextraction: an assessment of biogeochemical and economic viability // Plant Soil. 2003. - V. 249. - P. 117-125.

109. Ruegsegger A., Schmutz D., Brunold C. Regulation of Glutathione Synthesis by Cadmium in Pisum sativum L // Plant Physiol. 1990. - V. 93. - P. 1579—1584.

110. Ruegsegger A., Brunold C. Effect of Cadmium on gamma-Glutamylcysteine Synthesis in Maize Seedlings. // Plant Physiol. 1992. - V. 99. -P. 428—433.

111. Ryan J.A., Pahren H.R., Lucas J.B. Controlling cadmium in the human food chain: a review and rationale based on health effects // Environmental Research. 1982. - V. 28. - P. 251-302.

112. Salt D.E., Blaylok M., Nanda Kumar P.B.A., Dushenkov V., Ensley B.D., Chet I., et al. Phytoremediation: a novel strategy for the removal of toxic metals from the environment using plants // Biotechnology. 1995. - V. 13. - P. 468^474.

113. Salt D.E., Rauser W.E. MgATP-Dependent Transport of Phytochelatins Across the Tonoplast of Oat Roots. // Plant Physiol. 1995. - V. 107.-P. 1293—1301.

114. Salt D.E., Wagner G.J. Cadmium transport across tonoplast of vesicles from oat roots. Evidence for a Cd2+/H+ antiport activity. // J. Biol. Chem. -1993. V. 268. - P. 12297—12302.

115. Sanita di Toppi L., Gabbrielli R. Response to cadmium in higher plants. // Environ. Exp. Bot. 1999. - V. 41. - P. 105—130.

116. Scheller H.V., Huang В., Hatch E., Goldssbrough P.B. Phytochelatin Synthesis and Glutathione Levels in Response to Heavy Metals in Tomato Cells. //Plant Physiol. 1987. - V. 85. - P. 1031—1035.

117. Semane В., Cuypers A., Smeets K., Van Belleghem F., Horemans N., Schat H., Vangronsveld J. Cadmium responses in Arabidopsis thaliana:glutathione metabolism and antioxidative defence system // Physiologia Plantarum. 2007. - V. 129.-P. 519-528.

118. Speiser D.M., Abrahamson S.L., Banuelos G., Ow D.W. Brassica juncea produces a phytochelatin-cadmium-sulfide complex. // Plant Physiol. -1992.-V. 99.-P. 817—821.

119. Speiser D.M., Ortiz D.F., Kreppel L., Scheel G., McDonald G., Ow D.W. Heavy metal tolerance in the fission yeast requires an ATP-binding cassette-type vacuolar membrane transporter // Mol. Cell Biol. 1992. - V. 12. -P. 5301—5310.

120. Stafford D.W., Bieber D. Concentration of DNA solutions by extraction with 2-butanol // Biochim Biophys Acta. 1975. - V. 378, N 1. - P. 18-21.

121. Stearns J.C., Shah S., Glick B.R. Increasing plant tolerance to metals in the environment / In: Willey N (ed) Methods in biotechnology. Phytoremediation. Methods and review // Humana, New Jersey. 2007. - V. 23. -P. 15-26.

122. Steffens J.C., Hunt D.F., Williams B.J. Accumulation of non-protein metal binding polypeptides (-glutamyl-cysteinyl)n-glycine in selected cadmium-resistant tomato cells. // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - P. 13879—13882.

123. Tennstedt P., Peisker D., Bottcher C., Trampczynska A., Clemens S. Phytochelatin Synthesis Is Essential for the Detoxification of Excess Zinc and Contributes Significantly to the Accumulation of Zinc // Plant Physiol. 2009. -V. 149.-P. 938-948.

124. Tong Y.P., Kneer R., Zhu Y.G. Vacuolar compartmentalization: a second generation approach to engineering plants for phytoremediation // Trends Plant Sci. 2004. - V. 9. - P. 7-9.

125. Vassilev A., Schwitzguebel J-P., Thewys Т., van der Lelie D., Vangronsveld J. The use of plants for remediation of metal contaminated soils // ScientificWorldJournal. 2004. - V. 4. - P. 9-34.

126. Vassilev A., Vangronsveld J., Yordanov I. Cadmium phytoextraction: present state, biological backgrounds and research needs // Bulg. J. Plant Physiol. 2002. - V. 28. - P.68-95.

127. Vatamaniuk O.K., Mari S., Lu Y.P., Rea P.A. AtPCSI, a phytochelatin synthase from Arabidopsis: isolation and in vitro reconstitution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 6. - P. 7110-7115.

128. Vatamaniuk O.K., Mari S., Lu Y.P., Rea P.A. Mechanism of heavy metal ion activation of phytochelatin (PC) synthase // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275.-P. 31451-31459.

129. Vatamaniuk O.K., Bucher E.A., Ward J.T., Rea P.A. A new pathway for heavy metal detoxification in animals: phytochelatin synthase is required for cadmium tolerance in Caenorhabditis elegans // J. Biol. Chem. 2001. — V. 276. -P. 20817-20820.

130. Vestergaard M., Matsumoto S., Nishikori S., Shiraki K., Hirata K., Takagi M. Chelation of Cadmium Ions by Phytochelatin Synthase: Role of the Cystein-rich C-Terminal // analytical sciences. 2008. - V. 24. - P. 277-281.

131. Vogeli-Lange R., Wagner G.J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves: implication of a transport function for cadmiumbinding peptides // Plant Physiol. 1990. - V. 92. - P. 1086-1093.

132. Wagner G.J. Accumulation of cadmium in crop plants and its consequences to human health // Adv. Agron. 1993. - V. 51. - P. 173-212.

133. Wei S., Zhou Q. Trace elements in agro-ecosystems / In: Prasad MNV (ed) Trace elements as contaminants and nutrients—consequences in ecosystems and human health // Wiley, New Jersey, USA. 2008. - P. 55-80.