Влияние экспрессии гена легтемоглобина A сои на рост, дыхание и антиоксидантное состояние трансформированных растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.05, кандидат биологических наук Дмитрюкова, Марина Юрьевна

• Дмитрюкова, Марина Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Дмитрюкова, Марина Юрьевна

Оглавление

Список сокращений

Введение

I. Обзор литературы

Глава 1. История открытия, классификация и структура леггемоглобинов

1.1 История открытия и изучения леггемоглобинов

1.2 Классификация и структура гемоглобинов

Глава 2. Эволюция гемоглобинов

Глава 3. Физиологическая роль леггемоглобина

в клубеньке

Глава 4. Реакции с двухатомными молекулами

4.1 Взаимодействие с кислородом

4.2 Взаимодействие с монооксидом азота

4.3 Реакции с органическими лигандами

Глава 5. Окисление и восстановление леггемоглобина

5.1 Окисление леггемоглобина

5.2 Восстановление леггемоглобина

5.2.1 Ферментативное восстановление

5.2.1 Неферментативное восстановление

Глава 6. Основные кислород - зависимые процессы в растительной клетке

6.1 Дыхание

6.2 Соотношение темнового дыхания

и фотосинтеза

6.3 Альтернативные биохимические пути дыхательного обмена растений

6.4 Фотодыхание

II. Объекты и методы исследования

Глава 7. Реактивы и материалы

7.1 Объекты исследования и бактериальные

штаммы

7.2 Реактивы и материалы

Глава 8. Методы исследования

8.1 Создание генетической конструкции

для трансформации растений

8.2 Приготовление и трансформация компетентных клеток Е. соП и А&ч)Ьас1егшт Бр

8.3 Получение трансгенных «бородатых» корней

8.4 Трансформация растений табака

8.5 Выделение тотальной растительной ДНК

8.6 Выделение тотальной растительной РНК

8.7 Проведение полимеразной цепной реакции

с обратной транскриптазой

8.8 Гистохимический анализ

8.9 Измерение физиологических параметров

8.9.1 Условия выращивания растений

8.9.2 Измерение ростовых параметров

8.9.3 Определение интенсивности дыхания манометрическим методом

8.9.4 Ингибиторный анализ

8.9.5 Определение содержания продуктов ПОЛ

по реакции с тиобарбитуровой кислотой

8.9.6 Определение активности катал азы

8.9.7 Определение активности гваяколпероксидазы

8.9.8 Измерение содержания пигментов фотосинтетического аппарата

8.9.9 Определение содержания эндогенного N0

III. Результаты и обсуждение

Глава 9. Исследование полученной генетической конструкции

Глава 10. Анализ роста и устойчивости к действию кадмия

трансгенных «бородатых» корней

Глава 11. Создание трансгенных растений табака

11.1 Исследование экспрессии гена леггемоглобина

у трансгенных растений табака

11.2 Исследование морфофизиологических параметров трансформированных растений

Глава 12. Влияние экзогенного источника N0 (нитропруссида натрия) на рост, дыхание и антиоксидантный статус

трансформированных растений табака

Глава 13. Устойчивость трансгенных и нетрансгенных растений табака к окислительному стрессу, вызванному действием

солей кадмия

Заключение

Выводы

Список литературы

Список сокращений

GSH - глутатион

GUS - ß-глюкуронидаза

LB-среда - среда Лурия-Бертани

MlbR - метлеггемоглобинредуктаза

N0 - монооксид азота

Pg - гроссфотосинтез

R - интенсивность дыхания

Ra - адаптационная составляющая дыхания

SNP - нитропруссид натрия

ТЕ - трис-ЭДТА буфер

W - сухая масса растения

АО - альтернативная оксидаза

АФК- активные формы кислорода

БАП - бензиламинопурин

Гб - гемоглобин

ДДС- натрия (SDS) додецилсульфат натрия

ИМК- индолилмасляная кислота

Лг - леггемоглобин

оксиЛг- оксигенированный Лг (Лг02)

метЛг- метлеггемоглобин (ЛгЗ+)Мг миоглобин

МДА- малоновый диальдегид

MC - среда Мугасиге-Скуга

НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный НУК- нафтилуксусная кислота ОСР - относительная скорость роста

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой ПБМ - перибактериальная мембрана ПОЛ - перекисное окисление липидов

ППЭ - промежуточный переносчик электронов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СГК - салицилгидроксамовая кислота

ТМ - тяжелый металл

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние экспрессии гена легтемоглобина A сои на рост, дыхание и антиоксидантное состояние трансформированных растений»

Введение

Актуальность темы. Оксигенный фотосинтез и аэробное дыхание - два фундаментальных процесса, обеспечивающих энергией клетки растений. Оба эти процесса связаны с окислительно-восстановительными превращениями молекулярного кислорода, в ходе которых, с одной стороны, происходит запасание энергии, с другой, постоянное образование активных форм кислорода (АФК) (Karuppanapandian et al., 2011). В фотосинтезирующих органах растений кислород определяет оксигеназную активность рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы, лежащую в основе гликолатного пути, функции и значимость которого в последнее время переосмысливаются (Hurry et al., 2005, Peterhansel et al., 2010). Так показано, участие фотодыхания в редокс-регуляции энергетического обмена (Foyer et al., 2009; Рахманкулова, 2009), в антиоксидантной защите и продуцировании АФК, установлено влияние гликолатного пути на рост, продуктивность и урожай растений (Foyer, Noctor, 2009, Peterhansel, Maurino, 2011).Для стимулирования таких кислород-зависимых реакций необходимо повысить доступность кислорода в клетке, для чего могут быть использованы кислород - переносящие белки - гемоглобины (Гб) (Bulow et al., 1999). Гб широко распространены в природе и встречаются у представителей всех царств живых организмов (Weber, Vinogradov, 2001). Растительные гемоглобины встречаются у всех представителей царства и обладают различным сродством к кислороду. Гемоглобины растений делят на две группы - симбиотические и несимбиотические. Симбиотические гемоглобины (леггемоглобины) синтезируются в клубеньках бобовых растений и служат для переноса кислорода, необходимого для дыхания бактеродов, вместе с тем поддерживая концентрацию 02 на безопасном для нитрогеназы уровне. Наиболее изученным представителем этого семейства является леггемоглобин А сои, накапливающийся в больших количествах в инфицированной ткани и обладающий очень большим сродством к кислороду (Arredondo -Peter, 1998). Несимбиотические гемоглобины растений делят на 2

класса: гемоглобины первого класса, имеющие очень высокое сродство к кислороду и второго класса, схожие с симбиотическими, с меньшим сродством к кислороду (Dordas, 2009).

Хотя основной функцией леггемоглобинов по-прежнему считается перенос кислорода к азотфиксирующим бактероидам, однако в свете последних открытий, функция Лг, видимо, этим не ограничивается (Космачевская, Топунов, 2009). Кроме транспортной функции, Лг может участвовать в модулировании N0 сигнала, защите от окислительного инитрозативного стресса. Так, есть данные, что леггемоглобин, вместе с несимбиотическими гемоглобинами может эффективно снижать содержание NO в клубеньках (Shimoda et al., 2005; Baudouin et al., 2006). Кроме того, имеются данные, что Лг может переносить кислород и к митохондриям растений (Топунов, Петрова, 2001). В свете этих данных представляет интерес изучение влияния экспрессии гена Лг на основные кислород - зависимые процессы в растении, не только при нормальных условиях, но и при внесении в среду источника оксида азота(Н).

Основной функцией для большинства несимбиотических Гб является защита от разнообразных неблагоприятных факторов, в тоже время участие симбиотического Гб на метаболизм растения в неблагоприятных условиях, в частности, в условиях окислительного стресса, мало изучено. Одним из факторов, индуцирующих окислительный стресс в клетке, являются тяжелые металлы (ТМ). Повреждающее действие ТМ разнообразно и связано с ингибированием ферментов, нарушением проницаемости мембран и работы ЭТЦ и пр. Одним из наиболее токсичных металлов является кадмий, не имеющий биологических функций и потому вызывающий повреждения даже в небольших концентрациях (Hatata et al., 2008). В настоящее время известны несколько конститутивных механизмов устойчивости к тяжелым металлам (белки теплового шока, лиганды, фитохелатины, металлотионеины и др.), позволяющих растениям аккумулировать токсичные элементы в метаболически

инертных органах и органеллах или включать их в хелаты и тем самым переводить в физиологически безопасные формы (Серегин, 2001).

Особое внимание при создании растений, устойчивых к тяжелым металлам, уделяется фитохелатинам. Однако из-за недостаточной прочности комплексов фитохелатинов с металлами и специфичности их образования, эти соединения не всегда могут играют существенной роли в детоксикации тяжелых металлов (Серегин, 2001).

В свете этих данных представляет интерес изучение влияния экспрессии гена Лг на основные кислород-зависимые процессы в растении, не только при нормальных условиях, но и при внесении в среду источника оксида азота(П) и токсических концентраций тяжелых металлов.

Целью работы явилось изучение влияния экспрессии гена леггемоглобина А сои на рост, кислородный обмен и антиоксидантное состояние тканей трансформированных растений в норме и при стрессе.

Задачи

1. Клонирование кодирующей области гена леггемоглобина А сои под управлением 358 промотора вируса мозаики цветной капусты в векторе рСатЫа1301.

2. Получение трансгенных «бородатых» корней на растениях рапса и их использование в качестве модельной системы с целью проведения поисковых исследований и предварительного анализа наличия влияния экспрессии гена леггемоглобина А на рост и устойчивость растений к повреждающему действию кадмия.

3. Создание трансгенных растений табака путем агробактериальной трансформации.

4. Исследование влияния экспрессии гена Лг А сои на рост, кислородный и энергетический обмен трансгенных растений.

5. Изучение изменения антиоксидантного состояния (содержания конечных продуктов ПОЛ, показателей активности ферментов

антиоксидантной защиты) под влиянием источника экзогенного NO (нитропруссида натрия) и солей кадмия у трансформированных и ^трансформированных растений табака.

Научная новизна. Получены трансгенные по гену Iba леггемоглобина А сои растения табака. Впервые изучено влияние экспрессии гена леггемоглобина на энергетический статус растительных клеток не только в нормальных условиях, но и при внесении источника экзогенного N0 и окислительного стресса. Впервые показана повышенная устойчивость трансгенных растений к повреждающему действию кадмия, на фоне некоторого снижения скорости роста

Научно-практическая значимость. Полученные данные расширяют представление о функциях леггемоглобина. Впервые показано влияние экспрессии гена леггемоглобина на энергетический статус растительных клеток.

Обнаружено, что трансгенным растениям свойственна более высокая устойчивость к повреждающему действию солей кадмия, по сравнению с ^трансформированными растениями. Поскольку эти результаты связаны не со специфическими факторами защиты, такими как фитохелатины, которые из-за недостаточной прочности комплексов с металлами и специфичности образования, не всегда могут играть существенную роль в детоксикации тяжелых металлов, экспрессия гена леггемоглобина может способствовать повышению устойчивости растений к широкому спектру загрязнителей. Создание трансгенных растений, способных расти при достаточно высоких концентрациях ТМ в почве, позволит проводить фиторемедиацию промышленно загрязненных районов, а также найдет применение в цветоводстве, ландшафтном дизайне и других областях, где в первую очередь имеет значение устойчивость растений.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Школе-семинаре молодых ученых «Биомика-наука XXI века» (Уфа, 2007),

XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2009), симпозиуме «Растение и Стресс» (Москва, 2010), VII съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 12 печатных изданиях, из них 3 - из перечня ВАК.

Структура работы. Диссертация изложена на 138 страницах, содержит 30 рисунков, 2 таблицу. Состоит из введения, части I (Обзор литературы), части II (описания методов исследования), части III (результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы, включающего 233 источника.

I. Обзор литературы

Глава 1. История открытия, классификация и структура леггемоглобинов

1.1 История открытия и изучения леггемоглобина

Впервые гемоглобин из клубеньков сои был описан в 1939 г. Тогда был представлен спектр абсорбции изолированного белка и высказано предположение о его гемопротеидной природе (Kubo, 1939). Позднее было доказано, что обнаруженный белок может функционировать как гемоглобин (Kellin, Wang, 1945), однако вплоть до середины 60-х годов существовала теория, что он может непосредственно участвовать в восстановлении азота. Дальнейшие исследования показали, что Гб с азотом не взаимодействует, а бактероиды способны фиксировать азот и без него (Appleby, 1961). Эти данные были подтверждены в работе В.Л. Кретовича с соавт. на бесклеточных экстрактах из бактероидов люпина и сои (Кретович и др., 1970). Позднее гемоглобины из клубеньков бобовых растений были названы леггемоглобинами (Лг) от английского названия бобовых растений (legume).

Окончательно роль Лг как переносчика кислорода к бактероидам была доказана в работе Бергерсена с сотрудниками в 1973 году. В ней было показано, что концентрация растворенного кислорода, при которой азотфиксирующая активность бактероидов максимальна, соответствует условиям, при которых максимальна и скорость диссоциации Лг02 (Bergersen et al., 1973). Полученные данные свидетельствовали о наличии двух связанных между собой функциях леггемоглобинов: защита бактероидов от избыточного количества кислорода и снабжение бактероидов кислородом, необходимым для энергетических нужд.

Это представление начинает меняться, когда появились данные о наличии локализированного барьера в коре клубенька, ограничивающего доступ кислорода в центральную зону. Сильное сопротивление диффузии в коре клубенька было впервые определено в 1972 году (Tjepkema, Yokum, 1972),

однако лишь с середины 80-х годов началось систематическое изучение барьера газовой диффузии.

Было показано, что концентрация кислорода резко снижается при прохождении барьерной зоны в коре клубенька (Witty et al., 1986), причем он не распределен равномерно по коре клубенька, а локализован во внутренней ее части. Концентрация кислорода понижается настолько резко, вероятнее лимитирование нитрогеназы по кислороду, нежели ее ингибирование. Было показано, что концентрация кислорода в инфицированное клетке может даже несколько увеличиваться, при этом будет возрастать и активность нирогеназы, и только после прохождения «максимума» активность начинает снижаться (Layzell et al., 1992).

Позднее были проведены работы по моделированию ситуации в клубеньке на основе предположения, что клетка имеет не сферическую, а кубическую форму, что более соответствует соотношению объемов самих клеток и межклеточных пространств. Эти работы показали, что концентрация кислорода у поверхности инфицированной клетки может быть существенно выше, чем предполагалось ранее, то есть дальнейшее понижение концентрации кислорода должно происходить уже в самой клетке. Таким образом, произошло возвращение к мысли, что Лг может играть защитную функцию.

1.2 Классификация и структура гемоглобинов

Гемоглобины — белки, содержащие в качестве простетической группы Fe-протопорфирин IX (гем), содержащие пять-восемь а-спиралей (обозначаемых буквами А-Н), с инвариантным гистидином в позиции F8, являющимся проксимальным лигандом гема. Гем, как правило, присоединен к глобиновой части нековалентно (Космачевская, Топунов, 2009).

Количество известных гемоглобинов значительно выросло начиная с 1970-х годов. Тогда знание о Гб было ограничено а-, |3- глобинами, миоглобином и симбиотическими гемоглобинами растений. В последующие года были обнаружены новые представители семейства: симбиотические Гб небобовых растений, несимбиотические у множества видов растений; флавогемоглобины, химерные белки (ок. 400 а.к.), несущие глобиновый домен на N-конце и FAD- и NAD- связывающий домен на С-конце, схожие с ферредоксин-NADP" редуктазой, обнаруженные у E.coli и дрожжей. Позднее у простейших, цианобактерий, немертин и бактерий были обнаружены так называемые «усеченные» гемоглобины (содержащие меньше 130 аминокислотных остатков). У растений и зеленых водорослей были обнаружены гемоглобины, схожие с «усеченными», но несущие больше 160 аминокислотных остатков. (Vinogradov et al., 2006).

К настоящему времени известны первичные структуры около 600 гемоглобинов различных организмов (Vinogradov et al., 2007). Были предложены следующие названия для разных групп: цитоглобины (Cygb -cytoglobin), нейроглобины (Ngb - neuroglobin), симбиотические (Sgb - symbiotic Hb) и несимбиотические гемоглобины (Nsgb - nonsymbiotic Hb), однодоменные гемоглобины (SDgb - single domain Hb), протоглобины (Pgb - protoglobin), «усеченные» гемоглобины (Trgb - truncated), флавогемоглобины (Fgb -flavohemoglobin), двойные глобиновые сенсоры (GCS - globin-coupled sensor) (Vinogradov, Moens, 2001).

В зависимости от пространственной укладки белковой цепи, гемоглобины делят на два типа «2/2 спиральный сэндвич» и «3/3 спиральный сэндвич». В первом случае имеется в виду, что в верхнем слое расположены две а-спирали над двумя а-спиралями в нижнем слое и аналогично для 3/3 сэндвича. В растениях обнаружены симбиотические и несимбиотические однодоменные 3/3 гемоглобины и 2/2 гемоглобины (Vinogradov et al., 2005).

После открытия новых групп гемоглобинов стало известно, что некоторые из них и в обычном состоянии являются гексакоординированными, как и цитохромы. К ним относятся нейроглобины, цитоглобины, несимбиотические и 2/2 Гб. В таких Гб присоединение внешнего лиганда может осуществляться только в случае поворота дистального гистидина. В дополнение к уменьшению сродства к внешнему лиганду, конкурирование с внутренним лингандом ведет к снижению зависимости сродства от температуры, так как различие в энергии равновесия для двух лигандов гораздо ниже, чем при связывании пентакоординированным глобином. Этот эффект, вероятно, имеет значение для определенных организмов, так как обеспечивает глобином с независящим от температуры сродством к кислороду (Uzan et al., 2005).

Существует данные, что дистальный гистидин может облегчать связывание лигандов. Дело в том, что дистальный гистидин, связываясь с железом, способствует образованию низкоспиновой формы, при которой железо располагается в плоскости порфиринового кольца, что отчасти способствует снижению энергетического барьера при связывании экзогенного лиганда. Несмотря на то, что лиганды этих гемоглобинов конкурируют с дистальным гистидином за место связывания с железом гема, они обладают высоким сродством к экзогенным лигандам и связывают их с высокой скоростью (Космачевская, Топунов, 2009).

Несгшбиотические гемоглобины

Впервые несимбиотические гемоглобины растений были обнаружены в растениях семейства ильмовых (Ulmaceae), Trema tomentosa и Celtis australis. Эти виды не обладают способностью к клубенькообразованию, в отличие от своего близкого родственника, Parasponia, образующего симбиоз с клубеньковыми бактериями (Bogusz et al., 1988). Позднее они были обнаружены у представителей как класса двудольных, так и однодольных, а так же у несосудистых растений (печеночников и мхов) (Taylor, et al., 1994; Ross et al., 2001; Hunt et al., 2001).

Несимбиотические гемоглобины растений делятся на 2 класса: гемоглобины первого класса, и второго класса, схожие с симбиотическими (Dordas, 2009).

Для несимбиотических Гб первого класса характерны средняя величина константы связывания кислорода (около 25 mkM'V1), очень низкая величина константы диссоциации (около 0.16 с"1) и очень высокое сродство к кислороду (около 2 нМ), что свидетельствует о том, что основной функцией Гб этой группы является удаление избытка Ог и NO. Гб второй группы характеризуются низкой величиной реакции диссоциации (около 1мк M'V1), относительно низкой скоростью диссоциации (около 1 с"1) и средней величиной сродства к кислороду (около 340 нМ), что говорит о возможной сенсорной функции этих Гб при низких концентрациях кислорода (Smagghe et al., 2009).

Гб первого класса экспрессируются в условиях гипоксии и повышенного содержания N0, осмотического и холодового стресса, ризобиальной и грибковой инфекции (Igamberdiev et al., 2005). Эти гемоглобины предоставляют альтернативный путь дыхания в электрон транспортной цепи в митохондриях при концентрациях кислорода, ниже насыщения цитохром с оксидазы. Они являются частью растворимой терминальной N0 диоксигеназной системы, образующей нитрат-ион при реакции оксигемоглобина с монооксидом азота (Igamberdiev et al., 2011).

Клеточная локализация несимбиотических гемоглобинов растений остается неясной. В частности, было показано, что Гб первого класса локализован в ядре и цитозоле, хотя основная активность Гб, вовлеченных в деградацию NO, обнаруживается в основном в растворимой фракции цитозоля, что согласуется с предыдущими данными по изучению несимбиотических гемоглобинов класса 1 риса и арабидопсиса (Perazzolle et al., 2005).

Синтез несимбиотических гемоглобинов класса 2 происходит в корнях, листьях, соцветиях в течение развития растения, индуцируется низкими температурами и в ответ на обработку цитокинами (Hunt et al., 2001; Топунов, Космачевская, 2009). Благодаря своему сходству по аминокислотной последовательности с леггемоглобинами и низкому сродству к кислороду, предполагается, что они могут выполнять функцию переноса и хранения кислорода (Trevaskis, 1997).

Также несимбиотические гемоглобины имеют пероксидазную активность, и, вероятно, защищают от нитрозативного стресса при взаимодействиях с патогеном и при симбиотических реакциях (Dordas, 2009).

Вероятно, что все двудольные имеют оба класса несимбиотических гемоглобинов, тогда как у однодольных обнаружены только гемоглобины класса1. Симбиотические гемоглобины бобовых растений и Casuarina близки к Гб второго класса, a Sgb Parasponia - к Гб первого класса. Вероятно, существовало два независимых пути приобретения гемоглобинами в симбиотической роли, связанные с вариациями экспрессии гена, приведшими к накоплению гемоглобина в клубеньках и изменением сродства к кислороду (Trevaskis et al., 1997).

Симбиотические гемоглобины

Легоглобин — миоглобинподобный кислородпереносящий гемопротеид, играющий в клубеньках бобовых важную для азотфиксации роль. Он является одним из регуляторов кислородного режима, поддерживая условия, оптимальные для процесса фиксации азота. Содержание Jlr в клубеньках

велико и составляет до 30-40% всех растворимых белков цитозоля растительной клетки (Verma, Bal, 1976). Необходимость леггемоглобина для фиксации была доказана в опытах на трансгенных растениях Lotus japonicus, несущих антисенс последовательность гена леггемоглобина. В клубеньках таких растений накапливался свободный кислород, наблюдалась потеря нитрогеназы и отсутствовала фиксация азоты (Ott et al., 2005).

Аминокислотная последовательность легоглобинов изменяется от вида к виду (Becana et al., 1994). Молекулярная масса леггемоглобинов -около 16 кДа (молекулярный вес Лг А сои составляет 15, 775 кДа (Appleby et al., 1976), Лг люпина -16,6 кДа, Лг Leucania esculenta - 16,4 кДа) (Lira-Ruan et al., 2000).

Четвертичная структура легоглобина имеет восемь а-спиралей (А, В, ..Н) и пять неспиральных сегментов (АВ, CD, ..GH), расположенных между спиральными участками. Пятая координационная связь железа, расположенная над плоскостью гема занята гистидином и шестая (под плоскостью гема) пуста (Лг3+), или занята молекулой кислорода (окисленный Лг3+) или водой (Лг2+) (Becana et al., 1994).

Рис. 1 Четвертичная структура леггемоглобина А сои (Protein Data Bank (PDB) 1BIN, Brucker et al, 1994). А, С.. ..G -цепи глобулы.

Аминокислотная последовательность леггемоглобина сои, так же, как и JIr других представителей бобовых, имеет много общего с аминокислотной последовательностью миоглобинов и гемоглобинов позвоночных и еще более высокую степень гомологии с типом аминокислот. Лг А сои, наиболее изученный представитель Лг, имеет два дистальных гистидина (в положении 61 (цепь Е7) и 92 (цепь F7)) аналогично проксимальному и дистальному гистидину миоглобина и гемоглобина млекопитающих. Первый, прокисмальный (ближний) гистидин, предоставляет единственную ковалентную связь с железом гема. Второй, дистальный (удаленный) гистидинР7, расположен достаточно близко к сайту связывания кислорода и выступает в качестве донора протона водорода (Lee et al., 1993). Расположение некодирующих участков в них так же очень схоже. Однако, между Лг и животными гемоглобинами есть ключевые различия, результатом которых являются высокое сродство к кислороду у Лг и их способность связывать более крупные лиганды (Kundu, Hargrove, 2004)

В клубеньках бобовых леггемоглобины кодируются семейством генов, было получено множество изомеров Лг (¡боЛг). Количество ¡боЛг различается от вида к виду: восемь у сои (Glycine max), пять у гороха (Pisum sativum), девять у люцерны (Medicago sativa), три у вигны (Vigna uniguiculata), семь у сесбании (Sesbania rostrata). Гетерогенность Лг свойственна и примитивному бобовому Leucaena esculenta. До настоящего времени неизвестно, выполняют ли ¡боЛг различные или схожие функции (Kawashima et al., 2001).

Лг а и Лг IV, основные изолеггемоглобины сои и гороха соответственно, имеют более высокое сродство к кислороду, чем другие основные ¡боЛг, Лг с и Лг I. В обоих растениях, Лг а и Лг I более эффективны для поддержания фиксации азота и потребления кислорода изолированными бактероидами, чем Лг с и Лг I. Более того, соотношение двух АбоЛг, а именно Лг а/Лг с у сои и Лг IV/Лг I у гороха, изменяется в ходе развития клубенька. Лг а и Лг IV синтезируются в основном в зрелых клубеньках, активно фиксирующих азот.

Было высказано предположение, что гетерогенность леггемоглобинов способствует эффективной фиксации азота в ходе изменений количества проникающего кислорода (Kawashima et al., 2001). Об этом также косвенно свидетельствует тот факт, что время оборота интактного легоглобина относительно невелико, и составляет в среднем два дня для главных изоформ Лг в клубеньках гороха. Это значительно меньше периода жизни нитрогеназы. Поэтому должен существовать механизм постоянного синтеза и деградации Лг в цитоплазме клетки-хозяина, в ходе которого происходит значительное изменение в соотношении изоформ Лг (Davies et al., 1996). Однако в работе (Dakora et al., 1991) было показано, что изменение парциального давления кслорода в среде не приводило к изменению соотношения изоформ леггемоглобина в клубеньке. Другими словами, дальнейшего подтверждения физиологическая значимость гетерогенности Лг не получила, хотя из клубеньков различных видов растений было выделено множество кДНК клонов (Kawashima et al., 2001).

Интересные данные были получены для тропического бобового растения Sesbania rostrata. У данного растения имеются как корневые, так и стеблевые клубеньки. Гетерогенность клубеньков обнаружена в обоих типах клубеньков, однако они несколько различаются по составу компонентов (Топунов, Петрова, 2001).

Кроме симбиотических гемоглобинов, в клубеньках обнаруживается активная экспрессия усеченных (2/2) гемоглобинов и незначительная -несимбиотических Гб. Для усеченных Гб предполагается наличие функций, схожих с функциями Лг - перенос кислорода и детоксикация NO (Pawlowski, 2008).

Глава 2. Эволюция гемоглобинов

Гемоглобины были обнаружены у прокариот и всех царств эукариот. Изучение гемоглобинов у водорослей семейства празинофиты, Micromonas pusilla, показало их сходство с несимбиотическими Гб наземных растений. Вместе с тем, Гб водорослей близки к бактериальным Гб и Гб мхов. Таким образом, подтверждается предположение о происхождении Гб от бактериального предка (Fernandez et al., 2010).

Считается, что несимбиотические гемоглобины класса 1 возникли раньше, поскольку они обнаруживаются как у однодольных так и у двудольных растений. Кроме того, гемоглобины 1 класса одно- и двудольных ближе друг к другу, нежели к классу 2 того же отдела. Это свидетельствует о том, что разделение Гб класса 1 и 2 произошло после расхождения несосудистых и сосудистых растений, но до расхождения одно- и двудольных. Известно, что симбиотический гемоглобин Parasponia частично бифункционален, поскольку синтезируется как в нормальной корневой ткани, так и в клубеньках. Это свидетельствует о том, что симбиотические гемоглобины происходят от единственного гена несимбиотического гемоглобина общего предка азот-фиксирующих растений (Andersson et al., 1996), и, вероятно, возникли в результате дупликации гена предшественника после расхождения специализированных функций в клубеньках (Hardisson, 2001). Хотя растительные симбиотические Гб отличаются по своему аминокислотному составу на 80% от Гб животного происхождения, им так же свойственна 3-х складчатая структура (Vainstein et al., 1975).

Для изучения изменений, произошедших в ходе эволюции Jlr, была проведена работа по изучению Лг из клубеньков бобового растения Chamaecrista fasciculata (ррНЪ), представителя древнего подсемейства цезальпиевых. Аминокислотная последовательность, данные по компьютерному моделированию и спектральному анализу показали, что ррНЬ обладает свойствами, промежуточными между несимбиотическими Гб и Лг. В

результате чего был сделан вывод, что ррНЬ схож с возможным предком древних Лг. Таким образом, было предположено, что Лг в ходе эволюции претерпели следующие изменения: укорочение петли CD, уменьшение подвижности дистального гистидина, что снизило возможность образования связи с железом тема и привело к формированию пентакоординированных глобинов. Кроме того, изменения привели к укорочению N- и С- концов, компактизации белка в глобулу, исчезновение положительного заряда вокруг гема и локализация отрицательного заряда между N- и С- концами. Главным результатом этих изменений стало снижение сродства к кислороду и, как следствие, появление симбиотической функции (Gopalasubramaniam et al., 2008).

Расхождение генов Лг происходило у каждой таксономической группы отдельно. Основные изоформы Лг люпина ближе между собой, чем соответствующие Лг сои или гороха. Было рассчитано, что расхождение двух генов Лг люпина произошло примерно 20 млн. лет назад, а расхождение Лг люпина и сои - около 32 млн. лет назад (Топунов, Петрова, 2001).

На примере Гб сои и фасоли было предположено, что первоначальный ген глобина был дважды дуплицирован, в результате чего возник локус, несущий четыре гена Лг, окруженный двумя различными последовательностями, один с 3' конца, другой - с 5'. После расхождения родов сои и фасоли, из последнего из четырех генов мог возникнуть усеченный псевдоген . После хромосомной дупликации (тетраплоидизации) образовались два локуса, несущие четыре гена Лг и две идентичные усеченные последовательности (Lee, Verma, 1984). Это, вероятно, произошло раньше расхождения видов Glycine soya и G. max. У вида G. max делеция в одном из генов привела к формированию локуса Лг С2, несущего функционирующий и усеченный (псевдо) ген (Brisson, Verma, 1982).

*

E?

G6

лет вазЕ

Растения

El 4 Об

ж

ТЦ

1~ВДГ

несимбиошческих гемоглобшюв ? хмгмлнлет

назад

Несимбиотичесзше

гемоглобины ИМИ II

однодольных Несимбиотические

гемоглобины дв\гдольных

I

Животные

I I I I I I М

симоиотических гемоглобннов

■-i

Симбиотические

гемоглобины двудольных

Рис. 2. Схема эволюции генов гемоглобинов (по Harrison R., 1998). Пояснение в тексте.

Глава 3. Физиологическая роль леггемоглобина в клубеньке

Основная функция легоглобинов - поддержание оптимальной для азотфиксации и жизнедеятельности бактероидов концентрации кислорода. Эффективному выполнению этой функции способствует также распределение леггемоглобина в клубеньке.

Синтез леггемоглобина начинается в клубеньке de novo на стадии формирования симбиосом - визикул, содержащих бактероиды. Известно, что апопротеин синтезируется на свободных полисомах в клетках растения хозяина (Verma et al., 1976). В целом предполагается, что гем синтезируется ризобией, но остается вероятность того, что растительные органеллы по крайней мере частично ответственны за этот процесс. Кроме того, в клубеньках сои был обнаружен повышенный уровень синтеза фермента копропорфириноген оксидазы, катализирующей превращение копропорфириногена III в протопорфириноген IX, что свидетельствует об увеличении активности синтеза гема в клетках клубеньках (Madsen et al., 1993).

Наблюдения, показавшие, что синтез гема в изолированных бактериях Bradyrhizibium japonicum значительно стимулируется микроаэробными условиями, подтверждает, что экспорт гема из развивающихся бактероидов в цитоплазму растительной клетки может быть главным стимулом синтеза апопротеина (O'Brian et al., 1987). Однако было показано, что неэффективные клубеньки, образованные некоторыми мутантными формами Bradyrhizibium japonicum, не синтезирующими гем, в целом содержат нормальное количество апопротеина. Это свидетельствует о том, что контроль над синтезом протеина не регулируется только синтезом гема. Видимо, сборка голопротеина происходит раньше и независимо от наличия функционирующей нитрогеназы. Однако, синтез последней, вероятно, зависит от самого голопротеина, как результат влияния легоглобина на парциальное давление кислорода, что препятствует повреждению нитрогеназы (Davies et al., 1996).

В инфицированной растительной клетке возрастает количество мембранных структур, которые участвуют в формировании перибактериальной мембраны и биосинтетических процессах (Ра\у1о\¥зк1 ег а1., 1996). После многолетних споров в литературе было принято, что леггемоглобины находятся в цитоплазме клетки хозяина и не проникает в перибактериальное пространство, окружающее бактероид или в сам бактероид. Природа мембраны, окружающей бактероид, и ее развитие были изучены в деталях, поскольку она участвует в регуляции транспорта веществ из и в бактероид. Локальная концентрация Лг может быть достаточно высокой (до 2-3 мМ) в очень активных клубеньках, в среднем концентрация Лг в клубеньке составляет примерно 300 рМ.

У бобовых растений, в зависимости от вида, формируются детерминированные (у сои, фасоли, вигны) и недерминированные (люцерна, клевер, горох) клубеньки. В типичном зрелом клубеньке бобовых выделяют три структурно и физиологически отличающихся зон: внешняя кора, внутренняя кора и центральная зона. Внутренняя кора отделена от внешней слоем клеток -эндодермисом, служащим физическим барьером для кислорода. Центральный регион образуют в основном инфицированные клетки, содержащие симбиосомы. Для детерминированных клубеньков, свойственных характерна сложная морфология, выражающаяся в наличии 1) стабильно функционирующей апикальной меристемы, 2) гистологически

дифференцированных зон в центральной части, соответствующих разным этапам эндосимбиоза, 3) интегрированной системы компартментов, обеспечивающих переход бактерий из межклеточного (в инфекционных нитях) во внутриклеточное (в симбиосомах) состояние. В то же время, у многих мотыльковых, например, у сои, фасоли (триба РкаяеоЬлсеае) и лядвенца (триба Ьо1асеаё) образуются структурно более простые детерминированные клубеньки. В них меристема существует лишь в течение нескольких дней, а после ее исчезновения рост клубенька и образование азотфиксирующей ткани

прекращаются. В центральной части отсутствует зональность, а между инфицированными клетками (где фиксируется азот) вкраплены неинфицированные (здесь образуются транспортные формы азота) (Проворов, 2002).

Диффузия кислорода в межклеточном пространстве определяется концентрацией кислорода, тогда как диффузия внутри инфицированной клетки также зависит от градиента окисленного леггемоглобина.

Уровень окисленного леггемоглобина снижается при продвижении от меристематической верхушки к основанию. Существует две гипотезы, объясняющие такое распределение окисленного леггемоглобина в клубеньке. Во-первых, проницаемость кислорода в клубеньке выше у верхушки, что обеспечивает быстрый поток кислорода внутрь. Эта гипотеза согласуется с анатомией клубенька. Либо, снижение окисленного гемоглобина в сторону основания клубенька происходит за счет большей интенсивности дыхания. Соотношение этих процессов в клубеньках различных видов бобовых обеспечивает продольный градиент окисленного леггемоглобина (БешБоп, Окапо, 2003).

Глава 4. Реакции с двухатомными молекулами

4.1 Взаимодействие с кислородом

Очень высокая кислородсвязывающая активность JIr важна для их биологического функционирования. Константа равновесия Кр (концентрация 02, при которой окислено 50% Лг при равновесных скоростях диссоциации) имеет значение в пределах от 36 до 78 нМ в зависимости от происхождения Лг и pH среды (Wittenberg et al., 1972). Константа диссоциации Лг сои уменьшается в четыре раза при снижении pH с 7 до 4 при рКа 5,46. Тонкая настройка величины сродства к кислороду и другим двухатомным лигандам (СО, NO) достигается через образование водородной связи между связанным лигандом и белком и в результате небольших смещений цепей, окружающих гем (Саресе et al., 2006). Кроме того, на сродство к лиганду могут влиять искажения в самом геме, например, сжатие-растяжение порфиринового кольца (Bikiel et al., 2010).

Изменение сродства к кислороду и другим лигандам в зависимости от pH среды получило название эффект Бора (Топунов, Петрова, 2001). Эффект Бора свойственен не всем леггемоглобинам и наиболее ярко проявляется при реакции с никотиновой кислотой. (Appleby et al., 1973).

В неповрежденных клубеньках, соотношение количества Лг02 к общему содержанию леггемоглобина (Y), вместе с константой равновесия связывания кислорода, позволяют высчитать содержание свободного кислорода (Oi). Высчитанные значения концентрации свободного кислорода для клубеньков донника при Y = 25%, когда активность нирогеназы максимальна, концентрация свободного кислорода составляет 45 нМ (Monroe et al., 1989). Содержание свободного кислорода в клубеньках снижается при стрессе в результате снижения проницаемости кислородного барьера. Наблюдения показали, что средняя величина Oi гораздо выше в старых клубеньках, чем в молодых; а в пределах одного клубенька выше в проксимальных, более старых участках по сравнению с дистальными, более молодыми (Becana, Klukas, 1992).

Табл. 1 Основные константы связывания кислорода гемоглобинов различного происхождения. коп - константа ассоциации, к0д- - константа диссоциации, К02 - константа равновесия.

1г k0ff s-1 Ko2~kor/k0ff jiM"1 Ссылка

Миоглобин кита 15 18 0,83 Weber, Vinogradov, 2001

а-глобин человека 50 28 1,73 Davies, Mathieu, 1996

Лг сои 120 5,6 21 Weber, Vinogradov, 2001

Jlr I люпина 540 20 27,7 Davies, Mathieu, 1996

Лг II люпина 320 25 19,2 Davies, Mathieu, 1996

Для Лг сои было показано, что в стабилизации лиганда принимают участие тирозин-30 В1° и гистидин-61Е7, при этом связанный кислород оказывается менее стабилизированным, чем у Mr (Kundu, Hargrove, 2003).

ро

В миоглобине ближайшей к проксимальному гистидину аминокислотой является серинР7. Гидроксиметиленовая боковая цепь образует водородную

ро

связь с атомом Ne гистидина , при этом имидазольное кольцо закрывается пиррольными атомами, что препятствует смещению атома железа в плоскости гема, и в результате - снижает сродство к лиганду. Для компенсирования этой невыгодной конформации, образуется сильная водородная связь между дистальным гистидиномЕ7 и связанным кислородом, при этом наблюдается стабилизация молекулы лиганда. Замена дистального гистидина на неполярную аминокислоту ведет к повышению константы диссоциации (с 15 с"1 до 5000 с"1) и константы равновесия (с 1 до 100 мкМ) (Olson, Phillips, 1997).

В леггемоглобине на месте серинаР7 расположен валинЕ7 (Кипёи et а1., 2002). Из-за отсутствия водородной связи, фиксирующей ориентацию боковой цепи гистидина, имидазольное кольцо может перемещаться между атомами азота пиррольного кольца и к плоскости гема, в результате чего резко возрастает реакционная активность атома железа и, как следствие, сродство к кислороду. В Лг боковая цепь дистального гистидинаЕ7 смещается от связанного кислорода в результате формирования водородной связи тирозином-30В1°. Такая конформация снижает электростатическую стабильность связанного лиганда (Кипс1и ек а1., 2004).

Рис. 3 Стабилизация кислорода в молекулах миоглобина и леггемоглобина (пояснение в тексте) (по Smagghe et al., 2009)

Способность дистальной части протеина к множественным конформационным изменениям также участвует в регуляции сродства белка к связанному лиганду (Marti et al., 2007). кроме того, проксимальный карман Лг образован таким образом, что бы способствовать формированию сильной координационной связи между железом гема и лигандом. Таким образом, высокое сродство Лг к кислороду происходит из преимущественно

неподвижной геометрии проксимального гистидина. Взаимодействие между

Р П R 1 Л

гистидином и тирозином препятствует чрезмерной стабилизации связанного кислорода. Если водородная связь от гистидинаЕ7 была бы столь же сильной, как у миоглобина млекопитающих, то слишком высокое сродство к кислороду препятствовало бы его транспорту в клубеньке (Kundu et al., 2004).

По сравнению с другими мономерными глобинами, молекула Лг имеет единственный главный консервативный канал для кислорода (и в целом для монооксида углерода и окиси азота) рядом с гемом. Он образован аминокислотными остатками: Ала-37, Лей-43, Гис-106, Вал-109; Лг сои: Про-38, Лей-43, Гли-101, Вал-104. Другой возможный канал энергетически менее доступен и расположен в непосредственной близости справа от главного канала. Это свойство полностью отличает леггемоглобины от других гемоглобинов, которые имеют множество проходов для кислорода. Наличие единственного канала, вероятно, снижает возможность потери кислорода леггемоглобином в процессе транспорта (Cohen, Schulten, 2007)

4.2 Взаимодействие с монооксидом азота

К настоящему времени имеется большое число публикаций, в которых показано, что первичная функция гемоглобинов, вероятно, заключается в защите клеток от нитрозативного стресса и модулировании сигнальной функции NO. Например, общей для основных групп известных гемоглобинов является реакция превращения NO в N03 (Топунов, Космачевская, 2009).

NO (окись азота) - высокореактивная сигнальная молекула, широко распространенная в растительной клетке. Благодаря своей липофильной природе легко проникает через мембраны клеток. Существует два ферментативного пути образования оксида азота в растениях - NO синтазный при окислении аргинина и нитрат редуктазный из нитрата через нитрит (Perazzolli М., 2006). Неферментативное образование NO у растений посредством дисмутации нитрита в NO и нитрат преобладает при значениях pH

< 7 (Arasimowicz M., 2007). В кислой среде нитрит восстанавливается аскорбиновой кислотой с образованием N0, полугидроаскорбат-радикала и дегидроаскорбата, что наблюдается в хлоропластах и апопласте при наличии достаточных количеств аскорбата (Arasimowicz et al., 2007). Имеет место и светозависимая конверсия N02 в N0 каротиноидами (Wilson et al., 2008). Также обнаружен апопластный синтез N0 путем неферментативного восстановления нитрита из культуральной среды in vitro в алейроновом слое ячменя и, кроме того, вследствие разложения азотистой кислоты (Bethke et al., 2004).

В растениях NO участвует в различных физиологических процессах, таких как рост и развитие, а также формирование устойчивости к болезням, ответ на абиотический стресс (Siddiqui et al., 2011). В передаче NO сигнала включает различные сигнальные молекулы - cGMP, cADP рибозы и Ca (Parani, 2004). Они прямо или косвенно влияют различные физиологические процессы и изменяют экспрессию различных генов. Кроме того, передача сигнала NO включает посттрансляционные изменения целевых белков, такие как NO-зависимое нитрирование тирозина и обратимое S - нитрозилирование цистеина, в результате чего происходит изменение активности и функций различных белков (Romero - Puertas et al., 2004).

В растениях было описано как цитотоксическое, так и защитное действие N0. Поэтому, большое количество источников окиси азота и его участие во многих процессах предполагает необходимость наличия механизмов обезвреживания для контроля его уровня, реактивности и сигнальных функций.

Оксид азота может ингибировать железосеросодержащие белки, но токсический эффект в основном определяется его способностью взаимодействовать с супероксидным радикалом с образованием пероксинитрита. Это соединение может инициировать перекисное окисление липидов, а также приводить к нитрозилированию и нитрированию беков и окислительному повреждению тканей. С другой стороны, N0 способен

непосредственно взаимодействовать с возникающими в ходе окислительного стресса феррилгемопротеидами и органическими радикалами в соответствии с реакциями (Bastian et al., 2002):

reM-FeIV=0+ NO* -> reM-Felll-ONO -»гем-FeIII + N02- (1)

NO* + ROz* ROONO (2)

Оксид азота также способен реагировать с гидроксильным радикалом: NO* + «ОН —> HN02 <-> NO2- + Н+ (3)

Авторы работы (Herold, Puppo, 2005) показали, что размеры дистального кармана оказывают влияние на скорость распада пероксинитритного комплекса. Как известно, Лг в отличие от Hb и Mb, имеет больший по размеру и более гибкий гемовый карман, поэтому и ЛгРе(Ш)-OONO распадается со значительно большей скоростью, по сравнению с пероксинитритными комплексами Mb и Hb.

NO образует прочную связь с железом гема Лг, образуя нитрозил-Лг (Лг(П)-Ж)). В экстрактах клубеньков сои и бобов, выращенных с добавками нитрата, были обнаружены существенные количества Лг(П)-Ж). Средняя концентрация Лг в клубеньках -300 мкМ. Локальная концентрация в активных клубеньках может достигать 2-3 мМ (Davies et al., 1999). Как было указано выше, в клубеньке только 20-К30% Лг находится в оксигенированной форме (Becaena, Klukas, 1992), остальной Лг — в с1еохуЛг форме. Поэтому, если даже большая часть NO свяжется с ёеохуЛг, активность охуЛг по дезактивации оксида азота будет заметна. Оба эти процесса могут быть направлены на защиту нитрогеназы, ингибируемой NO и 02.

Было показано, что в некоторых случаях индукция генов, кодирующих Лг, может происходить на ранних стадиях развития симбиоза, до начала экспрессии нитрогеназы (Downie, 2005). На этой стадии концентрация кислорода в клубеньке достаточно высока и, следовательно, большая часть Лг может находиться в оксигенированной форме. В этих условиях NO-диоксигеназная функция Лг будет вносить заметный вклад в регулирование

концентрации NO и останавливать некоторые запускаемые с помощью активных форм азота и кислорода защитные реакции в растении.

Наличие комплекса JIr(II)-NO было показано в клубеньках сои, бобов и люцерны (Топунов, Космачевская, 2009), что говорит о синтезе в них оксида азота. Образование NO было так же подтверждено с помощью N0-специфической флуоресцентной пробы (с 4,5-диаминофлюоресцеин диацетатом) с применением конфокальной микроскопии (Baudouin et al., 2006).

В литературе обсуждается возможная роль NO в функционировании бактероидов. Так, предполагается, что NO в функционирующих клубеньках может выполнять роль регулятора переноса 02 в бактероиды через образование комплекса с леггемоглобином (Herouart et al., 2002). Однако уровень NO в этом случае должен быть на достаточно низком уровне, не позволяющем ингибировать активность нитрогеназы (Kanayama et al., 1990; Trichant, Rigaud, 1992) и доставку кислорода в бактероиды путем образования комплекса с леггемоглобином. Для этого в клубеньках должен функционировать механизм, эффективно обезвреживающий избыток NO. Предполагается, что один из таких механизмов, снижающих содержание NO, может осуществляться с помощью несимбиотических гемоглобинов и вовлекать леггемоглобин (Shimoda et al., 2005; Vieweg et al., 2005). В литературе было показано, что гиперэкспрессия несимбиотических гемоглобинов класса 1 повышает эффективность формирования бобово-ризобиального симбиоза в результате снижения уровня NO, который является ингибитором нитрогеназы (Shimoda et al., 2009). Таким образом, не исключено, что еще одной функцией Лг является детоксикация NO, как в случае Hb, Mb и некоторых бактериальных гемоглобинов.

4.3 Реакции с органическими лигандами

Леггемоглобины, как и гемоглобины животных, способны связывать небольшие неорганические и органические лиганды. Установлено, что Лг формируют стабильные комплексы с такими веществами, как азиды, цианиды, алкилцианиды, фториды (Краснобаева, 1978). Кроме того, в отличие от миоглобинов, Лг формируют комплексы с небольшими карбоновыми кислотами, в том числе - ацетатами, пропионатами, бутиратами, валератами (Ellfolk, 1961b). Реакция с ацетатом имеет, видимо, протон-зависимый характер с рКа 4,8 и ведет к образованию высоко-спинового комплекса. Этот комплекс може быть восстановлен под действием сильных восстановителей, таких как гидросульфит натрия. Величина рКа указывает на то, что недиссоциированная уксусная кислота реагирует с железом гема. Эти наблюдения легли в основу модели «электростатических ворот», описывающую реакцию Лг с различными лигандами при высоких значениях pH, при которой электронные взаимодействие ионизированной группы и анионного лиганда ограничивают его доступ к белку (Davis et al., 1996). Подобный эффект описан для температурных изменений. Лг представляет собой подвижную молекулу, в котором участок цепи между Е и F спиралями может выполнять роль «калитки», приоткрываясь при высоких температурах, тогда молекула находится в высокоспиновом состоянии. При низких температурах она закрывается, переходя во второе стабильное, низкоспиновое состояние, в результате чего Е спираль смещается так, что дистальный гистидин становится основным шестым лигандом (Appleby et al., 1976).

Способность легоглобинов в феррисостояниях образовывать высокоспиновые комплексы с алифатическими кислотами и низкоспиновые с никотиновой кислотой в ферри- и ферро-состояниях объясняется, кроме того, особенностями строения гемового кармана в этих белках. Благодаря смещению гема к G- и Н-спиралям, по сравнению с гемоглобинами животных, высвобождается свободное пространство на его функциональной (дистальной)

стороне, достаточное для размещения лигандов без конформационных перестроек молекулы. Таким образом, гемовый карман достаточно велик для того, чтобы вмещать крупные лиганды, такие как имидазолы, никотиновую кислоту (пиридин-3-карбоновую кислоту) и различные производные (например, 5-бром и 5-фтор формы), пиридин и близкие формы, и широкий ряд аминокислот, включая длинноцепочечные виды и изохинолин (Арутюнян, 1981).

Особо пристальное внимание исследователи уделяли никотиновой кислоте. В цитозоле клубеньков и в бактероидах был обнаружен фермент — никотинамиддеамидаза, который катализирует образование никотината из никотинамидных коферментов (Klucas et al., 1991). Связываясь с Лг, никотиновая кислота замещает кислород в Лг-кислородном комплексе, при этом реакция происходит тем быстрее, чем ниже рН среды. Этот эффект свойственен практически всем Лг, при этом наблюдается повышение рК с 0,6 дл 1,1 при снижении рН на одно значение (Атаносов, 1973). По поводу биологического значения комплекса Лг-NA была высказана гипотеза, что никотиновая кислота, образуя комплекс с Лг, выводит часть белка из процесса связывания и транспорта кислорода, что приводит к изменению кислородной емкости среды (Appleby et al., 1973b). Однако, принимая во внимание количества Лг и никотината в цитозоле, даже при условии, что весь никотинат свяжется с Лг, не более 11% легоглобина утратит способность к связыванию кислорода (Klucas et al., 1991). Однако, при старении клубенька, происходит понижение рН, что способствует автоокислению Лг(П) и оксиЛг до метЛг и увеличению сродства метШг к никотиновой кислоте (Klucas, Агр, 1977). Вопрос о физиологическом значении комплекса Лг-NA остается открытым.

Сродство леггемоглобинов к низкомолекулярным лигандам зависит от видового происхождения. Среди легоглобинов наибольшее сродство к лигандам и наибольшую стабильность при действии физических факторов

обнаруживает легоглобин сои. Так, было показано, что стабильность комплексов легоглобинов меняется в следующем порядке (Кудрявцева, 1986): JIrl люпина < Лг1 фасоли < Л та сои (4)

Эта закономерность сохраняется для любой лигандной формы (Appleby et al., 1973b).

Сродство различных легоглобинов к никотиновой кислоте определяется особенностями строения гемового кармана. Имеется много работ, в которых сообщается, что Лг отличается большим содержанием ароматических аминокислот внутри глобулы, чем Гб и Мг (Краснобаева, Атанасов, 1978). Следовательно, взаимодействие Лг с объемными неполярными лигандами происходит с меньшими стерическими и термодинамическими затруднениями. Большую доступность гема легоглобина по сравнению с другими гемоглобинами при связывании лигандов можно объяснить тем, что у легоглобина связывание лиганда в большей степени индуцирует структурные изменения кармана гема.

С такими веществами как 2-деоксирибоза и маннитол формирования комплекса не наблюдается, либо идет очень медленно. В ряде случаев обнаруживаются реакции с радикалами - аскорбат-, цистеин- и глутатион-тииловым радикалами. В случае глутатиона, полной потери феноксильного радикала не происходит, тогда как в случае цистеина его количество эквивалентно количеству цистеина. Это доказывает, что доступ к радикалу лигандов может быть ограничен. Это подтверждается и молекулярным моделированием леггемоглобина сои, где видно, что тирозин-133 лишь частично выступает над поверхностью белка (Cohen, Schulten, 2007).

Глава 5. Окисление и восстановление леггемоглобина

Химическая природа леггемоглобина, а так же условия внутри клубенька, такие как слабо кислая среда, наличие ионов металлов, хелатов и токсичных метаболитов (нитриты, супероксид радикалы, пероксиды) способствуют оксилению Лг (II) и его соединения с кислородом (Лг02) до нефункциональных форм Лг (III) и Лг(1У). Поскольку в клубеньках, видимо, не содержится Лг(Ш), у растений имеется механизмы поддержания Лг в восстановленном состоянии. Восстановительно-окислительные реакции с гемоглобином обычно проходят с участием АФК:

а) Окисление Лг02 до Лг(Ш) с участием супероксида;

б) Избыток пероксида окисляет Лг 02 и Лг(Ш) до Лг (IV), может привести к выделению железа гема и образованию гидроксильных радикалов;

в) Ферментативное восстановление требует наличия флавиновых тиолов и сопровождается образованием гидрокисльных радикалов;

г) Прямое восстановление Лг (III) флавинами, с участием суперокисда или пероксида.

5.1 Окисление леггемоглобинов

В начале исследования взаимодействия леггемоглобина с АФК, большое внимание уделяли процессу спонтанного автоокисления ЛЮ2 (оксигенированный Лг, оксиЛг), в результате которого образуется метЛг (Лг3+) и 02'\ Автоокисление оксиЛг индуцируется различными стрессовыми факторами, а также при старении клубенька. Было показано, что одним из основных факторов, оказывающим влияние на скорость этого процесса, является закисление цитоплазмы. Скорость автоокисления минимальна при рН 8,5. Физиологическое значение рН в молодых клубеньке = 6,4. При старении и действии стрессовых факторов значение рН может понижаться до 5,5 и, следовательно, приводить к усиленной генерации 02". С одной стороны, 02*-

может окислять Лг02, с другой — восстанавливать метЛг, хотя скорость этой реакции очень низкая (Рирро еЛ. а1., 1981):

Лг02 + 02«- + 2Н+ Лг3+ + 02 +Н202 (5)

Лг3++ 02*- -> Лг02 (6)

Какая из реакций будет преобладать, зависит от многих условий, в том числе и от концентрации Лг02 и метЛг.

В результате реакции дисмутации 02*- образуется Н202. Взаимодействие Лг с Н202 или органическими пероксидами приводит к двухэлектроному окислению теШг с образованием высокоокисленной оксоферрил-формы (Лг 4+) с катион радикалом порфиринового кольца, который мигрирует на белок с образованием тирозинового радикала (Могеаи е1 а1., 1996): Ре(Ш)-порфирин-глобин + Н202 —> Ре(1У)=0-порфирин*+ - глобин + Н20 (7) Ре(1У)=0-порфирин* + ... Туг —» Ре(1У)=0-порфирин.. .Туг* (8)

Лг сои, гороха, фасоли, бобов содержат три остатка тирозина в позициях 25, 30 и 133, люпина - только один остаток тирозина в позиции 133, тирозин 30 (В 10) заменен на фенилаланин (Аггеёопёо-Ре1ег, ЕэсатШа, 1991). тирозин 25 и тирозин 30 располагаются в В-спирали. Тирозин 30 контактирует с гемом, а тирозин 25 — с крупными заряженными лигандами в шестом координационном положении гема. Например, остаток тирозина 25 может образовывать водородную связь с карбоксильной группой никотиновой кислоты в метЛг-ЫА комплексе, тирозин 25 находится в Н-спирали и контактирует с винильной группой пиррольного кольца. Считают, что феноксильный радикал, вероятнее всего, образуется на тирозин 25. Однако нельзя исключить, что радикал локализуется на остатке тирозин 30, который также контактирует с гемом и, следовательно, с кислородом Лг(1У)=0 (Оау1ез, Рирро, 1992). Феноксильные радикалы играют ключевую роль в инактивации белка, участвуя в образовании сшивки гем-тирозин. Образование такой сшивки с участием радикала тирозин 25 было показано в метЛг (Ре3+), обработанном

Н202. Феноксильный радикал тирозина может взаимодействовать с оставшейся гидроперекисью:

Туг-О + Н202 -» Туг-ОН + Н02* (9)

В случае 5-10 кратного избытка гидроперекиси происходит выделение большого количества продуктов перекисного окисления в результате реакции: Лг(1У)=0 + ЯООН Лг (III) + НО- + БЮО» (10)

В этом случае перекисное окисление липидов усиливается в результате выделения ионов железа и генерации перекисных радикалов в ходе реакции Фентона:

Ре2+ + Н202 -> Ре3+ + ОН- + ОН" (11)

Ре3+ + Н202 Ре2+ + ООН- + Н+ (12)

Схожие же реакции с Ре(П) не дают схожего эффекта. Принимая во внимание, что Ре (II) боле эффективный предшественник Ре(1У)=0, было предположено, что Ре(1У)=0 не инициирует перекисное повреждение мембран, что было подтверждено на изолированных симбиосомах из фасоли (Негаёа е1 а1., 1993). Изолированные симбиосомы, обработанные двукратным избытком перекиси водорода, не проявляли признаков окислительного повреждения (мониторинг вели по поглощению сукцината). Однако усиленное потребление сукцината наблюдалось при 6-кратном избытке перекиси, за счет, видимо, высвобождения железа из гема.

Скорость образования Лга(1У)=0 в 5 раз превышает скорость образования Мг(1У)=0. Аналогично, значения максимальной скорости пероксидазной реакции с гваяколом для Лга ~ в 7 раз больше, чем для Мг ^еуеге, ЯоплЬе^, 1978). Глобиновые радикалы могут инициировать реакции ПОЛ в клеточных и перебактероидных мембранах (Могеаи е! а1., 1996), поэтому пероксидазы в клубеньке играют важную роль в сохранении азотфиксирующей активности.

Однако следует отметить, что специфические продукты гидроксильной атаки обнаружено не было, и возможно, что наблюдаемое окисление диметил сульфоксида может быть связано с образованием других радикалов (Puppo, Halliwell, 1983). Другие данные так же свидетельствуют о том, что гидроксильный радикал не вовлечен в этот процесс. Недавние опыты по изучению гашения флуоресценции, подтвердили, что леггемоглобин может взаимодействовать с перибактероидной мембраной, вероятно, через специфичные сайты связывания (Bergersen, Appleby, 1981). Наличие подобных рецепторов, вероятно, усиливают повреждающий эффект, вызванный белковым радикалом или АФК.

Окисленные Липиды

липиды метбран

Рис. 4 Автоокисление гемопротеида (HP), реакции с пероксидом и катализ окисления липидов мембран. НР-Х - белок - гемовый комплекс (по: (Vinogradov, Moens, 2008)).

Если некоторые из глобиновых радикалов на поверхности белка, образованные при реакции Fe(III) с перекисью водорода может реагировать с низкомолекулярными соединениями и другими белками, возникает вопрос, могут ли они передавать повреждение на мембрану (т.е. инициировать ПОЛ). В частности, могут ли радикалы - производные Лг инициировать повреждение перибактериальной мембраны (ПБМ), окружающей микросимбионты in vivo и

играет ли этот процесс роль в потери азотфиксирующей способности при старении клубенька. ПБМ, видимо, более чувствительна к окислительному повреждению, чем другие (например, микросомы, выделенные из тех же клубеньков), вероятно из-за различного состава этих мембран (для перибактериальной мембраны характерно более высокое соотношение липиды / белки) (Puppo et al., 1991).

Исследование степени сшивки молекул Jlr после инкубации очищенной перибактериальной мембраны со смесью Лг3++Н202 показало, что наличие ПБМ снижает (в зависимости от дозы перекиси) степень димеризации. Добавление ПБМ (>0,3 мг белка/мл) показало значительное снижение концентрации феноксильного радикала. Это косвенно подтверждает взаимодействие радикала, вовлеченного в сшивку протеина с ПБМ. (Moreau S., 1996).

Как было показано в работе (Sievers, Ronnberg, 1978) легоглобин может восстанавливать Н202, окисляя различные вещества. Поскольку константа скорости пероксидазной реакции, катализируемой Л г, намного меньше констант скоростей реакций известных растительных пероксидаз, эту активность Лг обычно называют «псевдопероксидазной». По мнению некоторых исследователей, вклад псевдопероксидазной реакции Лг в общую антиоксидантную защиту клубенька незначителен, так как Лг только в окисленной форме проявляет пероксидазную активность. Однако в присутствии достаточного количества восстановителей, леггемоглобин способен проявлять значительную активность (Puppo et al., 1980). Учитывая восстановление Лг метлегоглобинредуктазой и низкомолекулярными восстановителями (NAD(P)H, аскорбат, восстановленный глютатион, цистеин), количество met Л г в клубеньке довольно низкое. В эффективных клубеньках концентрация Лг ~ 23 мМ, в этом случае доля Лг02 составляет только 20-30%, и оставшаяся (большая) часть Лг вполне может выполнять и другие функции (Puppo and Halliwell, 1988).

Наибольший вклад в антиоксидантную функцию Лг вносит реакция охуЛг с пероксинитритом (Hunt et al., 1988). Время полужизни пероксинитрита в присутствии 1 мМ Лг02 ~ 10 мс. Было показано, что концентрация 02 в активных клубеньках -1,3 мМ. В присутствии же 1,2 мМ С02 1 мМ ЛЮ2 реагирует с пероксинитритом за время полужизни -1 мс. Механизм реакции Лг02 с пероксинитритом идентичен таковому для oxyHb (Romero et al., 2003). (рис. 5)

щрщ q2

О-Щ

ЫО N03-

HfFefll d&Oxy

SO"

Рис. 5 Реакции гемовой группы (Н): реакция 1- деоксигенирование, 2-оксигенирование, 3 - N0 деоксигенирование, 4- нитрозилирование, 5-восстановление N0, 6 - 02 нитрозилирование (нитрозилирование гема), 7-восстановление нитрита, 8- восстановление метГб (по: Vinogradov, Moens, 2008).

Есть данные, что реакции деоксиМг и деоксиГб с пероксинитритом протекают с теми же скоростями, что и реакции с участием их оксигенированных форм (Boccini, Herold, 1995). Таким образом, даже если Лг находится преимущественно в деоксигенированной форме, он все еще может эффективно катализировать реакцию изомеризации пероксинитрита в нитрат. В этих реакциях также должен образовываться метЛг. Таким образом, не только оксиЛг, но и метЛг может играть защитную роль против активных форм азота в клубеньках.

5.2. Восстановление легоглобина

В клубеньке содержится большое количество ферментов, защищающих от окислительного стресса (Matamoros, 2003).

Поскольку легоглобин способен связывать кислород только в восстановленном состоянии, при изучении функционирования легоглобина большое внимание уделяют процессам его восстановления. Известны два пути восстановления JIr: ферментативный и неферментативный.

5.2.1 Ферментативное восстановление

Фермент, восстанавливающий Лг — «leghemoglobin reductase» (ЕС 1.6.2.6.) (IUBMB Enzyme Nomenclature), метлегоглобинредуктаза (MLbR)— был впервые выделен из клубеньков люпина в лаборатории В.Л. Кретовича в Институте биохимии А.Н. Баха РАН. (Голубева и др., 1988). Были достаточно хорошо изучены MLbR из клубеньков люпина желтого (.Lupinus luteus L.) (Голубева и др., 1988), сои обыкновенной (Glycine max (L.) Merr.) (Ji et al., 1991) и вигны китайской (Vigna unguiculata L.) (Luan et al., 2000). Данные о свойствах MLbR из различных видов бобовых оказались противоречивыми. Было показано, что MLbR люпина является мономером с мол. массой около 60 кДа, а сои и вигны - димерами с мол. массой около 110 кДа (масса субъединицы -55 кДа). Расшифрована первичная структура MLbR из клубеньков сои и вигны (Luan et al., 2000). В их составе имеются NADH-связывающий и FAD-связывающий домены и дисульфидный активный центр. В клубеньках желтого люпина был обнаружен и негемовый железопротеид, который был способен восстанавливать Лг3+ (Бороденко и др., 1990). Все изученные ферменты были флавопротеидами и использовали в качестве донора электронов восстановленные пиридиннуклеотиды.

В клубеньках люпина было обнаружено наличие двух форм MLbR. Один из ферментов - мономерный FAD-содержащий белок с мол. массой около 62 кДа, который ингибировался реагентами на сульфгидрильные группы. В его

составе металлы отсутствовали. FAD природа выделенного фермента подтверждалась наличием пика при 460 нм в спектре оптического поглощения (Голубева и др., 1988). Другой фермент являлся гомодимером с мол. массой 120 кДа и был сходен по своим свойствам с редуктазами сои и вигны. Исследования показали наличие в нем негемового железа (2 атома на молекулу фермента). Его ферментативная активность ингибировалась о-фенантролином, что указывало на присутствие железа в активном центре фермента. Значительные отличия имелись и во вторичной структуре обоих белков, что было показано методом КД-спектроскопии. Несмотря на схожесть нерегулярных участков, были обнаружены значительные отличия в а - спиральной и (3 - структурной укладке белков (Topunov et al., 2000). Более активной являлась мономерная форма MLbR.

Фермент из клубеньков гороха был близок по своим свойствам к редуктазам сои и вигны. Необходимо отметить, что из этих трех видов бобовых была выделена только димерная MLbR. Можно сделать предположение, что обе изоформы MLbR, катализирующие реакции восстановления легоглобина in vivo могут существовать в цитозоле клеток клубеньков бобовых растений. Остается неясным, является ли наличие обеих или только одной формы MLbR видовой характеристикой растения или это зависит от каких-то других факторов (Шлеев и др., 2001).

Известно, что реакции окисления-восстановления, катализируемые флавин- и SH- содержащими ферментами обычно являются двухмолекулярными (Topunov et al., 2000):

NADH + H+ + 2Лг3+ 2Лг2+ + NAD+ + 2Н+ (13)

MLbR является двухэлектронным акцептором электронов при связывании с восстановленным NADH и одноэлектронного донора при восстановлении Лг3+. Это предположение согласуется с полученными данными о парном

наличии в активном центре фермента сульфидных групп (в случае SH-флавинсодержащей MLbR сои и вигны) или железосерного кластера (в случае железосерной флавинсодержащей MLbR люпина). Авторы (Topunov et al., 2000) сделалали предположение, что после связывания NADH + Н+ два электрона проходят через внутримолекулярному проходу к окисленному FAD+, восстанавливая его до FAD*H2. косвенным подтверждением этого предположения является тот факт, что стандартный окислительно-

восстановительный потенциал FAD-связывающего белка (--0,09 V) занимает

среднее значение между потенциалами пиридиннуклеотида ( - 0,28 V) и легоглобина (+0,24 V). Спектрофотометрические исследования MLbR в условиях, исключающих окисление, также подтвердили это предположение. Спектр поглощения нативной редуктазы имеет максимум при 450 нм, что соотносится с FAD+. FAD*H2 затем восстанвливает либо SH- либо Fe-S содержащий активный центр, от которого электрон переносится к Лг.

Известно, что ферментативное восстановление НЬ млекопитающих идет с участием промежуточного переносчика электронов (ППЭ), которым является цитохром Ь5. Природный ППЭ при восстановлении Лг3+ в клубеньках пока не найден. В опытах in vitro восстановление Лг3+ могло идти при участии в качестве ППЭ метиленовой сини или цитохрома Ь5, при этом скорость восстановления Лг3+ очищенной MLbR без ППЭ была ниже, чем в их присутствии. В связи с этим было высказано предположение о возможном участии ППЭ в ферментативном восстановлении Лг in vivo, однако и прямой перенос электронов от фермента на Лг не исключен.

Таким образом, схема возможного механизма ферментативного восстановления Лг3+ in vivo может быть представлена следующим образом: 1. NADH + ЬГ + +F AD-MLbR-A2+ ->

-> 2H*FAD-MLbR-A2+ + NAD+, (14)

2.2H*FAD-MLbR-A2+ +FAD-MLbR-A° + 2H+, (15)

с/без переносчика Лг3+

3. +Р АБ-МЬ ЬЯ-А° -► || , (16)

-+рао-мьы1-а2+ Лг2+

где А0 и А2+ - восстановленный и окисленный активный центр фермента. Эта схема достаточно условна. Для точного количественного и качественного описания механизма ферментативного восстановления Лг3+ требуются дальнейшие исследования структуры и функционирования МЬЬЯ. (Торипоу е1 а!., 2000).

5.2.2. Неферментативное восстановление

В клубеньках представлен целый ряд низкомолекулярных соединений, которые могут восстанавливать леггемоглобин Fe(III). В качестве восстановителей описывались индолилуксусная кислота, восстановленные флавины, цистеин, аскорбиновая кислота. В зрелых клубеньках присутствует значительное количество NADH и HADPH (150-200 цМ), свободного цистеина (200 ¡íM), восстановленного глутатиона (40 - 150 jiM), восстановленного аскорбата (1-2 мМ) (Matamoros, 2003). Данные зависят от метода определения и возраста клубенька.

Неферментативное восстановление Лг зависит от рН среды. Было обнаружено, что восстановление Fe(III) Лг высокими концентрациями NADH и HADPH (1мМ) возрастает при изменении рН с 7,0 до 5,2 с максимумом при минимальном значении рН. Восстановление зависит от наличия кислорода и ингибируется супероксид дисмутазой и каталазой. Эти результаты предполагают вовлечение супероксид и/или гидроксид - радикала в качестве восстановителя. Однако, при высоких значениях рН и физиологических концентрациях (400 мкМ), константы равновесия очень низки.

Аскорбат является ключевым антиоксидантом в метаболизме АФК (Noctor, Foyer, 1998). Было показано, что по сравнению с незараженными

корнями, клубеньки бобовых растений содержат либо аскорбат в больших концентрациях, либо для них характерна повышенная активность ферментов антиоксидантной защиты, либо то и другое вместе (Matamoros et al., 2003).

Ряд нефизиологических тиолов так же может осуществлять восстановление JIr. В ряде случаев, в том числе и при реакции с цистеином, наблюдается конкурентное образование соединений Лг с серой. Обнаружение подобных соединений в интактных клубеньках может служить показателем наличия и важности восстановления цистеином Fe(III) (и Fe(IV)=0) Лг in vivo.

Трипептид у-глутамилцистеинилглицина (GSH), или глутатион является широко распространенным метаболитом растений. Глутатион может действовать сам как антиоксидант, либо как субстрат для ферментов глутатион редуктазы и глутатион пероксидазы (Matamoros et al., 2003).

Защитная реакция глутатиона может происходить двумя путями. Во-первых, через глутатион-аскорбатный цикл, либо напрямую восстанавливая Лг (IV) до Лг(Ш) (Puppo et al., 1993). Реакция восстановления Лг выглядит следующим образом:

Fe(IV)-OH+GSH Fe(III)+H20+GS* (17)

GS*+ GS* GSSG (18)

Дальнейшее восстановление Лг(Ш) до Лг(И) не происходит. Реакция схожа с пероксидазными, и может быть сравнена с псевдопероксидазной активностью леггемоглобина. Так же этот процесс носит характер защиты гемопротеида, так как полученный Лг (IV) может быть легко восстановлен до Лг(П) леггемоглобин-редуктазами, присутствующими в клубеньке. Кроме того, GSH-зависимое восстановление пероксидов met-легоглобином защищает Лг от образования внутримолекулярных ковалентных сшивок и последующей инактивации белка. Этот защитный механизм с большой вероятностью может реализовываться in vivo. С другой стороны, глутатион препятствует образованию побочных продуктов при реакции Лг с Н202-

В некоторых растениях глутатион полностью или частично заменяется на гомоглутатион (yGlu-Cys-(3Ala). Так, гомоглутатион является основным трипептидом в клубеньках сои, фасоли и фасоли золотистой. Глутатион же преобладает в клубеньках гороха, люцерны. В каждом случае концентрация основного трипептида составляет 0,5-1 мМ (Matamoros et al., 2003).

Дисульфиды не проявляют восстанавливающей способности по отношению к Лг. Реакции с сульфидами разнообразны и в результате образуются в основном Ре(Ш)-сульфидные комплексы. Однако этот комплекс может быть восстановлен сильными восстановителями, такими как гидросульфиты и аскорбиновая кислота.

Константы этих реакций зависят от многих факторов - рН среды, наличия ионов металлов и кофакторов. Так, сообщалось, что восстановление Fe(III) NADH стимулируется ионами Mn (И) (Zal et al., 1996а). Предположительно, что реакция протекает с образованием супероксид радикала, который затем восстанавливает Fe(III).

Флавины также стимулируют восстановление Лг, являясь переносчиком электронов между HAD(P)H. Таким образом, в присутствии NADH и HADPH, свободные флавины восстанавливают Лг без образования супероксидрадикала. Этот процесс может быть физиологически значимым из-за высокого содержания флавинов в корнях и стимулирующего влияния микроанаэробных условий. (Becana et al., 1996).

Расчеты показывают, что наибольший вклад в поддержание Лг в восстановленном состоянии вносит ферментативное восстановление. В то же время благодаря наличию нескольких восстановителей ферментативной и неферментативной природы в клубеньках наблюдается сильное смещение равновесия Лг3+/Лг2+ в сторону образования восстановленного Лг , расширяется норма физиологической реакции системы, т.е. поддерживается оптимальный для азотфиксации кислородный режим в изменяющихся условиях.

Глава 6. Основные кислород - зависимые процессы в растительной клетке

Функция леггемоглобинов тесно связана с дыханием бактероидов в азотфиксирующих клубеньках. Однако, в ходе исследования влияния Лг на дыхание суспензии митохондрий было показано усиление поглощение кислорода (Suganuma et al., 1987), что свидетельствует о возможности переноса кислорода с Лг к органоидам растительной клетки.

6.1 Дыхание

Энергетичекий обмен в растении складывается из основных энерготрансформирующих процессов - фотосинтеза и дыхания, т.е. биохимических путей, в ходе которых энергия запасается и реализуется (Рахманкулова, 2009). Дыхание является основным источником энергии в растении для обеспечения роста и поддержания функциональной целостности биомассы. В результате этого существенная доля ассимилированного при фотосинтезе углерода окисляется до СОг-

Дыхание растений представляет собой сложный комплекс, который может быть подразделен на ряд метаболических путей: метаболизм соединений углерода (гликолиз, пентозофосфатный путь, цикл Кребса), транспорт электронов и оборот фосфорилированных и восстановленных продуктов (АТФ и НАДФН).

Если на первых стадиях дыхания - в гликолизе и цикле Кребса - синтез АТФ связан с окислением субстрата и протекает по механизму субстратного фосфорилирования, то на терминальных стадиях дыхания синтез АТР связан с работой электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий и происходит за счет окислительного фосфорилирования (цитохромный путь окисления). ЭТЦ локализована во внутренней мембране митохондрий и служит для передачи электронов по от восстановленных субстратов на кислород, что сопровождается трансмембранным переносом протонов водорода. В состав ЭТЦ входит более

чем два десятка переносчиков и значительное число белков, составляющие крупные ферментативные комплексы. В целом, ЭТЦ растений включает те же компоненты, что и ЭТЦ других организмов. Это четыре основных комплекса: NADH2 - KoQ-оксидоредуктаза (комплекс I), сукцинат-КоС>-оксидоредуктаза (комплекс II), KoQ-цитохром с-оксидоредуктаза (комплекс III) и цитохром с-оксидаза, а также два небольших по молекулярной массе компонента -убихинон (кофермент Q) и цитохром с, выполняющих функцию переноса электронов между ферментными комплексами. Кроме того, ЭТЦ растений включает альтернативную оксидазу и четыре НАДФН дегидрогеназы (Rasmusson et al., 2008). Транспорт электронов по ЭТЦ сопровождается активным трансмембранным переносом Н+ компонентами I, III и IV из матрикса в межмембранное пространство митохондрий. Транспорт Н+ с одной стороны внутренней мембраны на другую обеспечивается энергией электронов, движущихся по ЭТЦ. Передача пары электронов от NADH к кислороду сопровождается образованием трех молекул АТФ (Р/0=3). При окислении сукцината задействуются лишь два участка, в которых функционирует протонная помпа и при переносе электронной пары образуются две молекулы АТФ (Moller, 2001).

За исключением сукцинат-КоС)-оксидоредуктазы, все комплексы электрон-транспортной цепи объединены в суперкомплексы. Наиболее крупные суперкомплексы включает комплексы I и III. (Eubel et al., 2004).

Связь темнового дыхания с процессами роста описывается формулой Маккри (МсСгее, 1970, цит. по: Усманов и др., 2001), которая представляет дыхание как функцию из двух составляющих, одна из которых пропорциональна фотосинтезу, другая - биомассе:

R=aPg+bM, (19)

где R - темновое дыхание, Pg - истинный фотосинтез, М - сухая масса растения, а, b - коэффициенты дыхания роста и дыхания поддержания соответственно. Несмотря на то, что за последние годы данная формула

многократно дополнялась и усовершенствовалась, по сути она не претерпела существенных изменений.

Модель двухкомпонентного темнового дыхания описывает дыхательный газообмен целого растения как сумму дыхания роста и дыхания поддержания. Дыхание роста характеризует дыхательные затраты на создание новой структурной биомассы растения и пропорционально дневной сумме истинного фотосинтеза (Р§). Дыхание поддержание характеризует затраты веществ и энергии на поддержание функционального состояния уже сформированных структур, эта составляющая пропорциональна сухой массе растения В корнях иногда выделяют третью компоненту, связанную с поглощением ионов (ЬашЬегз е! а1., 1983), в донорных фотосинтезирующих тканях - дыхание экспорта, обеспечивающее транспорт и запасание продуктов фотосинтеза в специализированных органах (Мурей, Рахманкулова, 1990). В двухкомпонентной модели две последние составляющие суммарного темнового дыхания включаются обычно в дыхание поддержания.

Для активного роста растительный организм должен часть синтезированных в ходе фотосинтеза субстратов окислять в процессе дыхания для получения интермедиатов и энергии с целью поддержания биосинтеза и связанных с ним процессов, в частности, транспорта субстратов. Дыхание также необходимо для поддержания биомассы в активном состоянии. Отсюда следует, что всестороннее изучение связей между фотосинтезом, дыханием и ростом необходимо для понимания морфофизиологических механизмов лежащих в основе реакции растений на неблагоприятные воздействия окружающей среды, особенностей организации и регуляции донорно-акцепторной системы в ходе онтогенеза и для определения потенциальной продуктивности растений (Рахманкулова, 2001).

Часто вместо коэффициента дыхания роста (а) (выражение 19) используется показатель эффективности роста (Yg), указывающий долю углерода субстрата, включенного в биомассу растений в виде С-скелетов, и

связанный с коэффициентом дыхания роста следующим выражением (ТЬогЫеу, СаппеИ, 2000):

1/(1+а) (20)

Теоретически величина дыхания роста зависят от состава синтезируемой биомассы. Чем выше содержание белка и липидов в биомассе и чем больше глюкозы используется для восстановления нитратов, тем больше потери углерода на дыхание и ниже эффективность роста. Дополнительные потери углерода при синтезе биомассы с высокой долей белка и липидов обусловлены необходимостью затрат энергии на реакции восстановления (Головко, 1999).

Синтез вторичных углеродсодержащих соединений (пигментов, лигнинов, восков, фенолов и др.) так же требует больших энергетических затрат. Особенно высокое содержание этих соединений отмечается у медленнорастущих растений с преобладанием признаков адаптивной стратегии 8-типа. Напротив, у 11-стратегов большая доля ассимилированного при фотосинтезе углерода используется для синтеза функциональных соединений -белков и углеводов (Пьянков и др., 2001).

Экспериментальные данные величины коэффициента дыхания поддержания варьируют в более широких пределах по сравнению с теоретически рассчитанными величинами, чем величина эффективности роста. Это связано, в первую очередь, с тем, что сущность дыхания поддержания к настоящему времени раскрыта гораздо хуже, чем сущность дыхания роста. По существу эта составляющая темнового дыхания включает в себя все остальные энергетические затраты растительного организма, связанные с дыхательным газообменом. Дыхание поддержания является показателем метаболической активности системы, оно пропорционально произведенной работе и количеству выделившегося С02 в процессе работы. Дыхательная цена адаптации (также как дыхание экспорта и дыхание связанное с поглощением ионов) обычно включается в дыхание поддержания и с ней связано увеличение коэффициента дыхания поддержания (т.е. дыхание поддержания единицы количества

биомассы) при неблагоприятных условиях. Это увеличение коэффициента выявляют путем сопоставления его величины у экспериментального образца и у контрольного растения того же вида или у ряда других видов, растущих в оптимальных условиях, для которых этот коэффициент найден или рассчитан.

Показано, что усиление дыхания поддержания происходит во время адаптации растения к стрессу, тогда как растения, уже адаптированные к неблагоприятным условиям обитания, не проявляют дополнительных дыхательных затрат. Чем больше при стрессе увеличивается дыхание поддержания, тем менее устойчиво данное растение к данному виду стресса. Одна из целей адаптации - так изменить структурно-функциональную организацию растения, чтобы максимально уменьшить или компенсировать дыхательную цену процессов поддержания (Семихатова, 1995).

6.2 Соотношение дыхания и фотосинтеза

С одной стороны, в ходе дыхания окисляется субстрат, полученный при фотосинтезе, с другой - для фотосинтеза необходима энергия для синтеза Сахаров и восстановления компонентов фотосинтетического аппарата. В результате этого соотношения дыхание/фотосинтез (ЕИУР§) в отдельных листьях величина достаточно постоянная (А1кт е1 а1., 2007).

В зависимости от вида растения, фазы роста и условий среды величина соотношения Я / Pg может варьировать в пределах от 0,1 до 0,8, и в среднем у большинства видов растений в период активного роста равна 0,4 - 0,6 (Головко, 1983, 1999). Исследования, проведенные в строго контролируемых условиях фитотрона на моновидовых посевах без нарушения целостности растения, показали, что в вегетативную фазу роста при оптимальных условиях выращивания соотношение ЭДЛ^ составляет около 40 % (Мурей, Рахманкулова, 1990). Подобные данные были получены и другими авторами на различных видах растений, что свидетельствует о видонеспецифичности этого показателя.

Как правило, у зрелых растений величина ER/Pg выше, чем у молодых. У активно растущих растений доля дыхания от гросс-фотосинтеза обычно не превышает 30 - 35 %. С возрастом в биомассе растения начинает преобладать доля гетеротрофных тканей, что приводит к повышению величины ER/Pg. Как правило, подобное увеличение затрат на дыхание связано с переходом растений в репродуктивную фазу онтогенеза, связанную с возрастанием доли гетеротрофных процессов (Головко, 1999). Изменение соотношения ER/Pg может служить для включения механизмов адаптивных реакций, обеспечивающих максимально возможную в данных условиях скорость роста растений (Головко, Гармаш, 1997). Степень изменения величины ER/Pg от его значения при оптимальных условиях характеризует уровень устойчивости растения. В рамках данного подхода процесс адаптации растения следует рассматривать как способность к сохранению согласованности основных процессов: фотосинтеза, дыхания и роста.

Влияние изменения различных параметров среды по-разному отражается на величине ER/Pg. При неблагоприятных для растения внешних условиях ER/Pg как правило возрастает за счет повышения дыхательных затрат (дыхание поддержания) (Головко, Семихатова, 1980) или подавление фотосинтеза (Головко, 1999). Так же изменение ER/Pg может быть обусловлено снижением фотосинтеза вследствие старения части листьев или перераспределением ассимилятов на синтез структурной биомассы и запасание продуктов фотосинтеза (Головко, 1999). Подобные изменения величины ER/Pg, сопряженные с усилением запасания ассимилятов у растений Oxyria digyna (Кайбияйнен, Семихатова, 1987), свидетельствуют о неоднозначности влияния изменения соотношений долей автотрофных и гетеротрофных органов. Вероятно, более важным является учет дыхательной цены процессов в отдельных органах растения (Кайбияйнен, Семихатова, 1987).

Достаточно близко по физиологическому содержанию к показателю ER/Pg приближается показатель CUE (англ. carbon use efficiency -

эффективность использования углерода), т.е. первичная нетто-продуктивность отнесенная к количеству ассимилированного в процессе фотосинтеза углерода (Cannell, Thornley, 2000). При различных внешних условиях CUE изменяется в ограниченных пределах 0,4-0,6.

6.3 Альтернативные биохимические пути дыхательного обмена растений

Дыхание растений представляет собой сложный комплекс, который может быть подразделен на ряд метаболических путей: метаболизм соединений углерода (гликолиз, пентозофосфатный путь, цикл Кребса), транспорт электронов и оборот фосфорилированных и восстановленных продуктов (АТФ и НАДФН).

В митохондриях растении присутствует также второй путь переноса электронов от убихинона на кислород - альтернативный или цианидрезистентный путь, обеспечиваемого работой цианидрезистентной (альтернативной) оксидазы (АО). АО катализирует перенос электронов от восстановленного убихинона на кислород в обход основной цитохромной цепи (Juszchuk, Rychter, 2003). В отличие от цитохромного пути, цианидрезистентный путь не сопряжен с генерацией протонного градиента (Vanlerberghe and Mcintosh, 1997). Включение альтернативной оксидазы в какой-либо из суперкомплексов не обнаружено, однако не исключается возможность непрямого регулирования альтернативного пути дыхания через изменение потока электронов (Eubel et al., 2004).

В качестве одной из универсальных физиологических функций АО рассматриваться защита от повреждающего действия АФК. Известно, что АФК, образующиеся при нормальных режимах работы цитохромной цепи, в случае накопления их в митохондриях способны вызывать деструктивные реакции (Juszchuk, Rychter, 2003).

6.4 Фотодыхание

Считается, что окислительные процессы, протекающие в митохондриях, являются необходимой предпосылкой для высокой активности фотосинтеза (Padmasree et al., 2002, Atkin, Macherel, 2009). Так, соединения, образованные в ходе фотохимических реакций могут накапливаться в строме хлоропластов и нарушать транспорт электронов, что ведет к усиленной генерации АФК и подавлять фотосинтез (Foyer, Noctor, 2002). Существует четыре основных пути, позволяющих снижать содержание NADPH и удалять излишки восстанавливающих агентов из хлоропластов: 1) выделение гликолата и поглощение глицерата (фотодыхание, или гликолатный путь), 2) выделение малата (малатный путь), 3) поглощение оксиглутарата и образование глутамата, 4) выделение в цитозоль триозофосфатов и их превращение в сахара. Митохондрии вовлечены во все четыре этих процесса (Raghavendra, Padmasree, 2003).

Особое место в регуляции редокс-баланса занимает фотодыхание (Foyer et al., 2009;. Atkin, Macherel, 2009). Фотодыхание представляет собой стимулируемое светом поглощение 02 и вызванное этим окисление промежуточных продуктов фотосинтеза с выделением С02. Как и фотосинтез, фотодыхание инициируется ключевым ферментом хлоропластов - рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксидаза (РуБИСКО). Карбоксилирование рибулозобисфосфата (РуБФ) ведет к образованию 3-фосфоглицерата (3-ФГК), а оксигенирование дает одну молекулу 3-ФГК и фосфогликолата. Гликолатный путь включает в себя реакции, протекающие в хлоропластах, пероксисомах и митохондриях, которые в конечном итоге ведут к превращению двух молекул гликолата в ФГК, который возвращается в цикл Кальвина (Maurino, Peterhansel, 2010). Фотодыхание, также как и фотосинтез, с которым он тесно связан, может динамично изменяться в зависимости от освещения, концентрации 02 и С02, температуры и других условий. Связь фотодыхания с митохондриальным дыханием также значительна. Наиболее изучены два пути взаимодействия -

через аллостерическое ингибирование цикла трикарбоновых кислот продуктами реакции, катализирумых ферментом глицин декарбоксилаза, и конкурирование за восстановление HAD+ этим же ферментом и компонентами ЭТЦ (Bauwe et al., 2010).

До недавнего времени считалось, что фотодыхание - процесс исключительно убыточный для растений и потому предпринимались попытки снизить интенсивность этого процесса теми или иными способами. Однако нарушение какой-либо стадии фотодыхания вело к значительным нарушениям метаболизма растений (Foyer et al., 2009). Большинство таких мутантов было неспособно к росту при нормальном содержании кислорода в атмосфере (21%), но выживало при повышенной концентрации углекислого газа (Peterhansel, Maurino, 2010). Интересное решение было предложено в работе Keibish et al., (2007) - перенести в растения бактериальный путь окисления гликолата. Процесс состоял из трех стадий, протекал в хлоропластах и представлял собой побочный путь фотодыхания. В результате трансгенные растения накапливали большую биомассу по сравнению с растениями дикого типа, что свидетельствует о роли фотодыхания в предотвращении накопления токсичных промежуточных продуктов (фосфогликолат, глиоксилат).

Хотя окончательно функции фотодыхания не определены, ясно, что этот путь оказывает влияние на множество процессов, протекающих в клетке, как то: энергетический статус, работа фотосистемы II, обмен углерода, усвоение азота, дыхание и другие. Через продуцирование перекиси и взаимодействие между пиридиновыми нуклеотидами, фотодыхание вносит большой вклад в поддержание редокс-баланса в клетке (Foyer et al., 2009), особенно при стрессе (Atkin, Macherel, 2009).

Известно, что практически все стрессорные факторы, как биотического, так и абиотического происхождения, вызывает в клетке окислительный стресс, и способность растения контролировать уровень оксидантов в значительной степени определяет устойчивость растения (Cheeseman, 2007). В результате

этого обмен АФК является важной частью метаболизма целого растения. Клеточная система редокс-регуляции объединяет информацию о процессах, протекающих как в клетке, так и на уровне целого растения, в изменяющихся условиях окружающей стреды. Редокс-регуляция осуществляется двумя путями: с помощью низкомолекулярных антиоксидантов (аскорбата, глутатиона), ограничивающими время жизни АФК, и переносчиков электронов (убихиноны и пластохиноны), принимающих участие в быстрой реакции на изменения окружающей среды (Foyer, Noctor, 2009).

Образование АФК в ходе фотосинтеза происходит постоянно, но процесс усиливается при условиях, когда емкость ЭТЦ превышает способность клетки перерабатывать образованные HADPH и АТФ, например, при повышенной солнечной радиации или низкой концентрации углекислого газа. При этом в первую очередь, защита от АФК обуславливается ксантофилловым циклом (Young et al., 1997), а так же циклом «вода-вода», включающим реакцию Мелера и работу аскорбатпероксидаз (Heber, 2002). Важным путем снижения содержания АФК в митохондриях служит альтернативная оксидаза. Основной функцией АО является поддержание ЭТЦ в относительно окисленном состоянии и снижении количества индивидуальных переносчиков электронов (Baxter et al., 2007). Кроме того, расход энергии при фотодыхании предотвращает гипервосстановление хлоропласта, ведущее к фотоингибированию фотосинтеза, то есть, фотодыхание является местом диссипации энергии в хлоропласте, не связанным с запасанием энергии (Рахманкулова, 2009).

Таким образом, изменения в интенсивности фотодыхания и альтернативного пути дыхания позволяют растениям быстро адаптироваться к изменениям окружающей среды за счет регулирования содержания АФК и восстановленных пиридиновых соединений.

II. Объекты и методы исследования

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Дмитрюкова, Марина Юрьевна

Выводы

1. Получена генетическая конструкция на основе вектора рСатЫа1301, содержащая в области Т-ДНК ген леггемоглобина А сои под управлением промотора 358 вируса мозаики цветной капусты.

2. На трансгенных «бородатых» корнях показано меньшее подавление роста растений, а также снижение накопления кадмия в органах при внесении в среду ацетата кадмия, на фоне некоторого торможения роста в нормальных условиях. Подтверждена возможность использования «бородатых» корней как модельной системы для исследования влияния экспрессии чужеродных генов на устойчивость к тяжелым металлам.

3. Созданы трансгенные растения табака, несущие ген леггемоглобина А сои. Показано торможение роста, возрастание окислительных процессов (альтернативного цианидрезистентного дыхания и фотодыхания) и снижение процессов ПОЛ у трансгенных растений.

4. Внесение экзогенного источника оксида азота (нитропруссида натрия) оказывало меньший, по сравнению с нетрансгенными, стимулирующий эффект на рост, энергетические процессы и уровень ПОЛ у трансгенных растений табака.

5. Показано, что в условиях повреждающего действия солей кадмия трансгенные растения проявляли большую устойчивость, чем нетрансгенные растения табака.

Заключение

Получение трансгенных растений является на данный момент одной из перспективных и наиболее развивающихся направлений агропромышленное™. Существуют проблемы, которые не могут быть решены такими традиционными направлениями как селекция, кроме того, на подобные разработки требуются годы, а иногда и десятилетия. Создание трансгенных растений, обладающих нужными свойствами, требует гораздо меньшего времени и позволяет получать растения с заданными хозяйственно ценными признаками, а также обладающими свойствами, не имеющими аналогов в природе. Однако, в свою очередь, трансформация растений чужеродными генами - процесс достаточно сложный и далеко не всегда ведущий к положительному результату. Поэтому необходим быстрый и недорогой способ, позволяющий отбирать наиболее подходящие продукты экспрессии генов для решения той или иной проблемы. В качестве такого способа могут быть использованы трансформированные «бородатые» корни, благодаря которым можно без особенных затрат исследовать влияние экспрессии того или иного гена на корневую систему.

Исследования, проведенные на модельных образцах рапса посевного, несущих трансгенные по гену леггемоглобина А сои корни, показали снижение роста и повышение устойчивости к повреждающему действию кадмия у трансгенных «бородатых» корней. Но поскольку объективная оценка требует получения полностью трансгенных растений, дальнейшие исследования проводились на трансгенных растениях табака.

В ходе проведенных нами экспериментов установлено, что для трансгенных растений характерно снижение интенсивности роста и повышение устойчивости, а так же возрастание активности цианидрезистентного пути дыхания и фотодыхания, что свидетельствует о приобретении трансгенными растениями некоторых черт, свойственных стресс-толерантам. Стимуляция цианидрезистентного дыхания и фотодыхания ведет к снижению накопления биомассы, но, вместе с тем, стабилизирует регуляторные механизмы и способствует повышению устойчивости организма. Как известно, фотодыхание и альтернативный цианидрезистентный путь являются важными факторами редокс-регуляции в растении (Рахманкулова, 2009, Foyer et al., 2009), которые способствуют поддержанию редокс-баланса в фотосинтезирующих органах в норме и при стрессе.

Поскольку в последнее время широко обсуждается вопрос участия Jlr в регуляции содержания NO в ходе развития клубеньков, был интересен вопрос о влиянии экспрессии гена Лг на эндогенное содержание N0, а также о росте трансформированных растений в условиях экзогенного источника монооксида азота. Наши исследования показали, что в трансформированных тканях, по сравнению с нетрансгенными, содержание монооксида азота снижено. Кроме того, внесение экзогенного источника N0 (нитропруссида натрия) оказывало меньший эффект на трансгенные растения. Это подтверждает способность Лг регулировать содержание N0 в клубеньке. Учитывая тот факт, что N0, как сигнальная молекула, участвует также в формировании корней, можно предположить, что торможение роста трансформированных «бородатых» корней связано с реакцией Л г с N0.

Итак, можно сказать, что ген леггемоглобина А сои может быть использован для получения трансгенных растений, обладающих повышенной устойчивостью к повреждающим факторам среды. И, хотя в нормальных условиях таким растениям характерно некоторое снижение ростовых параметров и нарушение энергетического баланса, в неблагоприятных условиях им свойственна большая устойчивость, нежели ^трансформированным образцам. Повышение устойчивости растений, на фоне некоторого снижения продуктивности, может найти применение в таких областях, как городской ландшафтный дизайн, озеленение, цветоводство и других, где первостепенное значение имеет именно устойчивость растений.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Дмитрюкова, Марина Юрьевна, 2012 год

Список литературы

1. Арутюнян Э.Г. Структура леггемоглобина // Молекулярная биология. 1981. Т. 15. вып. 1 С. 27-43

2. Барсукова В. С. // Аналит. обзор (Сер. "Экология". Вып. 47). СО РАН. ГПНТБ. Ин-т почвоведения и агрохимии. Новосибирск. 1997. -63 с.

3. Бороденко Л.И., Генина О.С., Жизневская Г.Я., Измайлов С.Ф. Редуктазные свойства негеминового железофлавопротеида из клубеньков люпина желтого //Физиология растений. 1990. Т. 37. № 6. С. 1131-1137.

4. Вершинина З.Р., Баймиев А.Х., Чемерис A.B. Симбиотические реакции корней облепихи, трансгенных по гену лектина гороха посевного//Физиология растений. 2010. Т.57. С.108-116.

5. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии растений. Фотосинтез. Дыхание. Учеб. пособие. М., «Высш. школа», 1975 г. 392 с.

6. Гармаш Е.В., Головко Т.К. Влияние кадмия на рост и дыхание ячменя при двух температурных режимах дыхания//Физиология растения. 2009. Т.56. С. 382-387.

7. Глянько А.К., Васильева Г.Г., Митанова Н.Б. и др. Влияние минерального азота на бобово-ризобиальный симбиоз // Известия РАН, Серия биол. 2009а. Т. 36, №3. С.302-312.

8. Головко Т.К. Дыхание растений (физиологические аспекты). - СПб. Наука, 1999.-204 с.

9. Головко, Т. К. , Гармаш Е. В. С02 - газообмен и рост Rhaponticum carthamoides в условиях подзоны средней тайги // Физиология растений. 1997. -Т. 44. - № 6. - С. 864- 872.

10. Голубева Л.И., Топунов А.Ф., Гончарова С.С., Асеева К.Б., Кретович В.Л. Получение и свойства гомогенного препарата метлеггемоглобинредуктазы цитозоля клубеньков люпина//Биохимия. 1988. Т. 53. № 10. С. 1712-1717.

11. Голубева Л.И., Топунов А.Ф., Талызин В.В., Кретович В.Л. Взаимодействие метлегоглобинредуктазы цитозоля клубеньков люпина с кислородпереносящими гемопротеидами. //Докл. АН СССР. 1987. Т. 294. С. 1489-1492.

12. Егоров Ц.А., Козаков В.А., Шахпаронов М.И., Кранобаева H.H., Кудрявцева H.H., Жизневская Г.Я. Выделение леггемоглобинов I и II из клубеьков желтого люпина. Их характеристика//Биоорганическая химия. 1980. Т. 6. С. 366-371.

13. Емец А.И., Красиленко Ю.А., Шеремет Я.А., Блюм Я.Б. Реорганизация микротрубочек как ответ на реализацию сигнальных каскадов оксида азота (II) в растительной клетке // Цитология и генетика. 2009. Т. 43. № 2. С. 3-12.

14. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П., Перуанский Ю.В., Луковникова Г.А., Иконникова М.И. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиздат, 1987. С.41-43.

15. Жизневская Г.Я. Леггемоглобин в клубеньках бобовых растений. // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1976. N 3. С.386-398.

16. Жизневская Г.Я., Бороденко Л.И., Федорова Е.Э., Кудрявцева H.H., Андреева И.Н., Измайлов С.Ф. Исследование локализации леггемоглобина в клубеньках люпина желтого//Физиология растений. 1994. Т. 41.С.70-79.

17. Жизневская Г.Я., Бороденко Л.И., Кудрявцева H.H., Лоув Д.Дж., Ванин А.Ф., Измайлов С.Ф. Изучение негеминового железосодержащего белка из корневых клубеньков люпина методом электронного парамагнитного резонанса//Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 738-741.

18. Кайбияйнен Э. Л., Семихатова О. А. Отношение дыхания к гросс-фотосинтезу у растений Oxyria digyna (Polygonaceae) в течение вегетационного периода в различных условиях произрастания // Ботан. журн. 1987. Т. 72. № 4. С. 489-496.

19. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе//Успехи современной биологии. 1993.Т.113. №4. С. 456-470.

20. Космачевская О.В., Топунов А.Ф. Гемоглобины - разнообразие структур и функций// Прикладная биохимия и микробиология. 2009. N. 45. С. 627-653.

21. Королюк М. А., Иванова Л. И., Майорова И. Г., Токарев В. Е. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. 1988. №1. С. 16-19.

22. Красиленко Ю. А., Емец А. И., Блюм Я. Б. Функциональная роль оксида азота у растений//Физиология растений. 2010. V.57. №4. С.483-494.

23. Краснобаева H.H., Атанасов Б.П. Изучение сродства леггемоглобина люпина к лигандам. Влияние pH и природы буфера. // Молекулярная биология. 1978. Т. 12. С. 1239-1245.

24. Кретович В.Л., Евстигенеева З.Г., Асеева К.Б., Заргарян О.Н., Мочалкина H.A. Фиксация азота бесклеточными экстрактами из бактероидов люпина и сои //Докл АН СССР. 1970. т. 190. №5. С. 1235-1237.

25. Кудрявцева H.H. Сравнение исследований леггемоглобинов из корневых клубеньков различных бобовых растений // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 1986.

26. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи современной биологии. 1993. Т. 113, Вып. 4. с. 442-455.

27. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и жизнедеятельность растений //Соросовский образовательный журнал. 1999. № 9. С. 20-26.

28. Мурей И.А., Рахманкулова З.Ф. Соотношение фотосинтеза и составляющих дыхания у сахарной свеклы в вегетативную фазу роста // Фмзиология растений. 1990. Т. 37. С. 468-475.

29. Осипов А.Н., Борисенко Г.Г., Владимиров Ю.А. Биологическая роль нитрозильных комплексов гемопротеидов// Успехи биологической химии. 2007. Т.49. С. 259-292.

30. Попов В. Н., Антипина О. В., Трунова Т. И. Перекисное окисление липидов при низкотемпературной адаптации листьев и корней теплолюбивых растений //Физиология растений. 2010. Т.57. С.153-156.

31. Проворов Н.А., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Сравнительная генетика и эволюционная морфология симбиозов растений с микробами -азотфиксаторами и эндомикоризными грибами //Журнал общей биологии, 2002. Т.63.С. 451-472.

32. Пьянков В. П. Иванов JI.A., Ламберс X. Конструкционная цена растительного материала у типов бореальной зоны с разными типами экологических стратегий // Физиология растений. 2001.- Т. 48.- С. 81-88.

33. Семихатова О.А. Дыхание поддержания и адаптация растений// Физиология растений. 1995.Т.42.С.312-319.

34. Рахманкулова З.Ф. Взаимосвязь дыхания и фотосинтеза в норме и при стрессе у разных видов растений// Вестник БашГУ. 2001. №2. С. 68-70.

35. Топунов А.Ф., Мелик-Саркисян С.С., Лысенко Л.А. MLbR клубеньков люпина. Некоторые свойства//Биохимия. 1980. Т.45. С.2053.

36. Топунов А.Ф., Петрова Н.Э. Гемоглобины: эволюция, распространение и гетерогенность// Успехи биологической химии, т.41, 2001, с. 199-228.

37. Шлеев С.В., Петрова Н.Э., Топунов А.Ф. Ферментативное и неферментативное восстановление легоглобина в клубеньках бобовых //Вестник Башкирского университета 2001. № 2 С.90-91

38. Яруллина Л.Г. Трошина Н.Б., Сурина О.Б. Сигнальные молекулы в регуляции взаимоотношений растений пшеницы с грибными патогенами // Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам среды. Материалы Всерос. конференции, Иркутск, 2009, С. 542-544.

39. АН С., Reda D.M., Rachid R., Houria В. Cadmium induced changes in metabolic function of mitochondrial isolated from potato tissue {Solarium tuberosum L.)//Am. J. Biochem. & Biotech. 2009. V. 5. P. 35-39.

40. Aljanabi S.M., Martinez I. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques // Nucleic Acids Research. 1997. V. 25. P. 4692-4693.

41. Anderssen C.R., Jenssen E.O., Llewellyn D.J., Dennis E.S., Peacock W.J. A new hemoglobin gene from soybean: a role for hemoglobin in all plants//Proc., Natl., Acad. Sci. USA. 1996. V. 93.P.5682-5687.

42. Appleby C.A. Properties of leghaemoglobin in vivo, and its isolation as ferrous oxyleghaemoglobin // Biochim. Biophis. Acta. 1969c. Vol. 188. No. 2. P. 222-229.

43. Appleby C.A. Leghemoglobin and Rhizobium respiration // Ann. Rev. Plant Physiol. 1984. V. 35. P. 443-478.

44. Appleby C.A., Bogusz D., Dennis E.S., Peacock W.J. A role for hemoglobin in all plant roots? // Plant, Cell and Environment. 1988. V. 11. N 5. P. 359-367.

45. Appleby C.A., Blumberg W.E., Peisach J., Wittenberg B.A., Wittenberg J.B., Leghemoglobin: an electron paramagnetic resonance and optical spectral study of the free protein and its complexes with nicotinate and acetate // The Journal of biol. chemistry, 1976. № 251 (19). pp. 6090-6096.

46. Appleby C.A., Nicola N.A., Hurrell J.G.R., Leach S.J. Characterisation and improved separation of soybean leghemoglobin. // Biochemistry. 1975a. Y. 14. N 20. P.4444- 4450.

47. Appleby C.A., Tjepkema J.D., Trinick M J. Hemoglobin in a nonleguminous plant, Parasponia: possible genetic origin and function of nitrogen fixation. // Science. 1983. V.220. N 4600. P.951-953.

48. Appleby C.A., Turner G.L., Macnicol P.K. Involvement of leghemoglobin and cytochrome P-450 in an efficient oxidative phosphorylation pathway which supports nitrogen fixation in Rhizobium. // Biochim. Biophys. Acta. 1975b. V. 387. N 3. P.461-474.

49. Appleby C.A., Wittenberg B.A., Wittenberg J.B. Nicotinic acid as a ligand affecting leghemoglobin structure and oxygen reactivity // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1973b. V. 70. P. 564-568.

50. Arasimowicz M., Floryszak-Wieczorek J. Nitric Oxide as a Bioactive Signalling Molecule in Plant Stress Responses // Plant Sci. 2007. V. 172. P. 876-887.

51. Arora A., Sairam R.K., Srivastana G.C. Oxidative stress and antioxidative system in plants// Current Science. 2002. V.82. P.1227-1238.

52. Arrendo-Peter R., Hargrove M.S., Moran J.F., Sarath G., Klucas R. Plant hemoglobins// Plant Physiol. 1998. V.l 18. P. 1121-1125.

53. Atkin O.K., Macharel D. The crucial role of plant mitochondria in orchestrating drought tolerance// Annals of Botany. 2009. V. 103. P. 581-597.

54. Atkin O.K., Scheurwater I., Pons T.L. Respiration as a percentage of daily photosynthesis in whole plants is homeostatic at moderate, but not high, growth temperatures//New Phytologist. 2007. P. 1-14.

55. Aviram I., Wittenberg B.A., Wittenberg J.B. The reaction of ferrous leghemoglobin with hydrogen peroxide to form leghemoglobin (IV)// J. Biol. Chem. 1978. Vol. 253. No 16. P. 5685-5689.

56. Barata R.M., Chapparro-Giraldo A., Chabregas S.M., Gonzales R., Labate C.A., Azevedo R.A., Sarath G., Lea P.J., Silva-Filho M.C. Targeting of soybean leghemoglobin to tobacco chloroplasts: effects on aerobic metabolism in transgenic plants/ZPlant Sci. 2000. Vol. 155. Pp. 193-202

57. Bastian N.R., Foster J.P., Ballantyne M., Lu Yanxiang. Nitrogen oxides, the good, the bad, and the ugly // Current Topics in Biophysics. 2002. V. 26. P. 115-127.

58. Baudouin E., Pieuchot L., Engler G. et al. Nitric oxide is formed in Medicago truncatula - Sinorhizobium meliloti functional nodules // Mol. Microbe-Plant Interact. 2006. V. 19, №9. P. 970-975.

59. Bauwe H., Hagemann M., Fernie A,R. Photorespiration: players, partners, origin// Trends in plant science. 2010. V. 15. P. 330-336.

60. Baxter C.J., Redestig H., Schauer N., Repsilber D., Patil K.R., Nielsen J., Selbig J., Liu J.L., Fernie A.R., Sweetlove L.J. The metabolic response of heterotrophic Arabidopsis cells to oxidative stress.// Plant Physiology. 2007. V.143. P. 312-325.

61. Becaena M., Klukas R.V. Oxidation and reduction of leghemoglobin in root nodules of leguminous plants//Plant. Physiol. 1992. V.98. P. 1217-1221.

62. Becaena M., Moran J.F., Iturbe-Ormaexte I., Gogorcena Y., Escuredo Structure and function of leghemoglobins//An. Estac.Exp.Aula Dei (Zaragoza).1994. V. 21. №3. P. 203-208.

63. Becana M., Salin M.L. Superoxide dismutases in nodules of leguminous plants. // Can. J. Bot. 1989. V. 67. P. 415-421.

64. Becaena M., Salin M.L., Ji L., Klukas R.V. Flavin-mediated reduction of ferric leghemoglobin from soybean nodules // Planta. 1991. Vol. 183. No 3. P. 575-583.

65. Bergmeyer H.U.: Methods of Enzymatic Analysis 1, Academic Press, New York. 2nd Edition (1974), page 495

66. Bergersen F.J., Appleby C. Leghaemoglobin within bacteroid-enclosing membrane envelopes from soybean root nodules//Planta. 1981. V. 152. P. 534-543.

67. Bergersen F.J., Turner G.L. Nitrogen fixation by the bacteroid fraction of breis of soybean root nodules. // Biochim. Biophys. Acta. 1967. V.141. P. 507-515.

68. Bergersen F.J., Turner G.L. Leghaemoglobin and supply of 02 to nitrogen-fixing root nodule bacteroids: presence of two oxidase systems and ATP production at low free 02 concentration//!. Gen. Microbiol. 1975. V. 2.P. 345-354.

69. Bergersen F.J., Turner G.L., Appleby C.A. Studies of the physiological role of leghemoglobin in soybean root nodules. // Biochim. Biophys. Acta. 1973. V.292. P. 272.

70. Bethke P.C., Badger M.R., Jones R.L. Apoplastic Synthesis of Nitric Oxide by Plant Tissues // Plant Cell. 2004. V. 16. P. 332-341.

71. Bikiel D.E., Forti F., Boechi L., Nardini M., Luque F. J., Marti M.A., Estrin D.A. Role of heme distortion on oxygen affinity in heme proteins: the protoglobin case// J. Phys. Chem. B. 2010. V. 114.P.8536-8543.

72. Boccini F., Herold S. Mechanistic studies of the oxidation of oxyhemoglobin by peroxynitrite//Biochemistry. 2004 V. 28.P. 16393-16404.

73. Bogusz D., Appleby C.A., Landsmann J., Dennis E.S., Trinick M.J., Peacock W.J. Functioning haemoglobin genes in non-nodulating plants//Nature, 1988. Vol. 331. P. 178-180.

74. Borutaite Y., Budriunaite A., Brown G.C. Reversal of Nitric Oxide, Peroxynitrite-and S-Nitrosothiol-Induced Inhibition of Mitochondrial Respiration or Complex I Activity by Light and Thiols // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1459. P. 405-412.

75. Boveris A.D., Galatro A., Puntarulo S. Effect of nitric oxide and plant antioxidants on microsomal content of lipid radicals//Biol. Res. 2000.V.33.P.159-165.

76. Brisson N., Verma D.P.S., Soybean leghemoglobin gene family: normal, pseudo, and trunicated genes// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V.79. P. 4055-4059.

77. Bulow 1., Holmberg N., Lilius G., Bailey J.E. The metabolic effects of native and transgenic hemoglobins on plants// Trends biotech. 1999. V.17. P.21-24.

78. Capece L., Marti M.A., Crespo A., Doctorovich F., Estrin D.A. Heme protein oxygen affinity regulation exerted by proximal effects//J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 12455-12461.

79. Castro-Guerrero N. A., Rodríguez-Zavala J. S., Marín-Hernández A., Rodriguez-Enríquez S., Moreno-Sánchez R. Enhanced alternative oxidase and antioxidant enzymes under Cd2+ stress in Euglena//Jour. of Bioenergetics and Biomembranes. 2008. V. 40. P. 227-235.

80. Cevahir G., Aytamka E., Elor G. The role of nitric oxide in plants// Biotechnol. Biotechnol. Equipment. 2007. V.21, № 1. P. 13-17.

81. Chaparro-Giraldo A., Barata R.M., Chabergas S.M., Azevedo R.A., Silva-Filho M.C. Soybean leghemoglobin targeted to potato chloroplasts influences growth and development of transgenic plants//Cell plant reports. 2000. Vol. 19. Pp. 961-965.

82. Cheeseman J.M. Hydrogen peroxide and plant stress: A challenging relationship//Plant Sterss. 2007. V.l. P. 4-15.

83. Cohen J., Schulten K. 02 migration pathways are not conserved across proteins of a similar fold// Biophysical Journal. 2007. № 93, pp. 3591-3600

84. Dakora F.D., Appleby C.A., Atkins C.A. Effect of p02 on formation and status of leghemoglobin in nodules of cowpea and soybean//Plant Phys. 1991. V.95.P.723-730.

85. Dalton D.A., Harms F.J., Russel S. A., Evans H.J. Purification, properties, and distribution of ascorbate peroxidase in legume root nodules// Plant Physiol. 1987. V. 83. P.789-794.

86. Davis M.J., Mathieu C., Puppo A. Leghemoglobin: properties and reactions// Advances in inorganic chemistry. №46. Edited by A.G. Sykes. Academic Press, 1998. pp 495-538.

87. Denison R.F., Layzell D.B. Measurement of legume nodule respiration and 02 permeability by nonuinvasive spectrophotometry of leghemoglobin. // Plant Physiol. 1991. V.96.N l.P.137-143.

88. Denison R.F., Okano Y. Leghemoglobin oxygenation gradients in alfalfa and yellow sweetclover nodules//Jour. of exp. botany. 2003. V.54. N. 384. P.1085-1091

89. Dordas C. Nonsymbiotic hemoglobins and stress tolerance in plants//Plant Sci. 2009.V.176. P.433-460.

90. Dordas C., Hasinoff B.B., Rivoal J., Hill R.D. Class-1 hemoglobins , nitrate and NO levels in anoxic maize cells-suspension cultures// Planta. 2004. V.219. P.66-72.

91. Downie J.A. Legume hemoglobin: Symbiotic nitrogen fixation needs bloody nodules//Curr. Biol. 2005. V.15. P.196-198

92. Durner J., Gow A.J., Stamler J.S., Glazebrook J. Ancient origins of nitric oxide

signaling in biological systems // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 14206-14207.

93. Ellfolk N. Crystalline leghemoglobin. IV. Spectroscopic studies of the two main metleghemoglobin components and some of their fatty acid complexes //Acta Chem. Scand. 1961b. V. 15. P. 975-984.

94. Eubel H., Heinemeyer J., Sunderhaus S., Braun H.-P. Respiratory chain supercomplexes in plant mitochondria// Plant Physiol, and Biochem. 2004. V. 42. P.934-942.

95. Fernandez I., Vinogradov S. N., Arrendo-Peter R. Identification and in silico characterization of a putative ancestor to land plant non-symbiotic hemoglobins from

the prasinophyceae algae Micromonas and OstreococcusllGXobdX J. Biochem. 2010. V.l.P. 18-30.

96. Foyer C. H., Noctor G. Oxygen processing in photosynthesis: regulation and signaling//New Phytol. 2002. V. 146. P. 359-388.

97. Foyer C.H., Noctor G. Redox regulating in photosinthetic organisms: signaling, acclimation, and practical implications// Antioxidants & redox signaling. 2009. V.l 1. P. 861-905.

98. Foyer C.H., Bloom A.J., Queval G., Noctor G. Photorespiratory metabolism: genes, mutants, energetics, and redox signaling// Annu Rev. Plant. Biol. 2009. V.60. P. 455-484.

99. Frey A.D., Oberle B.T., Ferres Y., Kallio P.T. Expression of Vitreoscilla haemoglobin in tobacco cell culture relieves nitrosative stress in vivo and protects from NO in vitro// Plant Biotech.J. 2004. V. 2. P. 221-231.

100. Gardner P.R. Nitric oxide dioxygenase function and mechanism of flavohemoglobin, hemoglobin, myoglobin and their associated reductases//J.Inorg. Biochem. 2005. Vol.99. P. 247-266.

101. Garrocho-Villegas V., Arrendo-Peter R. Molecular Cloning and Characterization of a Moss (Ceratodon purpureus) Nonsymbiotic Hemoglobin Provides Insight into the Early Evolution of Plant Nonsymbiotic Hemoglobins//Mol. Biol. &Evol. 2008. V.25. P.1482-1487.

102. González E. M., Gálvez L., Arrese-Igor C. Abscisic acid induces a decline in nitrogen fixation that involves leghaemoglobin, but is independent of sucrose synthase activity//Jour. Of Exp. Botany. V. 52. P. 285-293.

103. Gopalasubramaniam S.K., Kovasc F., Violante-Mota F,, Twigg P., Arrendo-Peter R., Sarath G. Cloning and characterization of a caesalpinoid (Chamaecrista fasciculate) hemoglobin: The structural transition from a nonsymbiotic hemoglobin to a leghemoglobin//Proteins. 2008. V.72.P.252-260.

104. Gratao P.L., Monteiro C.C., Antunes A.M., Peres L.E.P., Azevedo R.A. Acquired tolerance of tomato (.Lycopersicon esculentum cv. Micro-Tom) plants to cadmium-induced stress// Ann. Appl. Biol. 2008.V. 153.P. 321-333.

105. Green L. C., Wagner D. A., Glogowski J., Skipper P. L., Wishnok J. S., Tannenbaum S. Analysis of nitrate, nitrite and [15N] nitrate in biological fluids// Anal. Biochem. 1982. V.126. P.131-134.

106. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals, and disease//Biochem. J. 1984. V. 219, N. 1. P. 1-14.

107. Herada G., Puppo A., Moreau S., Day D.A., Rigaud J. How is leghemoglobin involved in peribacteroid membrane degradation during nodule senescence?// FEBS Lett. 1993 V.12. P.33-38.

108. Hardisson R. Hemoglobin from bacteria to man: evolution of different patterns of gene evolution//J. Exp. Biol. 1998. V.201. P. 1099-1117.

109. Hargrove M.S., Barry J.K., Bruckner E.A., Berry M.B., Phillips G.N., Olson J.S., Arredondo-Peter R., Dean J.M., Klucas R.V., Sarath G. Characterization of recombinant soybean leghemoglobin a and aporal distal histidine mutants. // J. Mol. Biol. 1997. V. 267. P. 1032-1042.

110. Hebelstrup K.H., Igamberdiev A.U., Hill R.D. Metabolic effects of hemoglobin gene expression in plants// Gene Funct. Genom. 2007. V. 398. P.86-93.

111. Heber U. Irrungen, Wirrungen? The Mehler reaction in relation to cyclic electron transport in C3 plants.//Photosynthesis Research. 2002. V. 73. P. 223-231.

112. Heckmann A.B., Hebelstrup K.H., Larsen K., Micaelo N.M., Jensen E.O. A single hemoglobin gene in Myrica gale retains both symbiotic and non-symbiotic specificity// Plant Mol. Biol. 2006. V.61. P.769- 779.

113. Herold, S., Puppo, A. Oxyleghemoglobin scavenges nitrogen monoxide and peroxynitrite: a possible role in functioning nodules? // J. Biol. Inorg. Chem. 2005. V.10. P.935-945.

114. Herouart D., Bandouin E., Frendo P. et al. Reactive oxygen species, nitric oxide and glutathione: key role in the legume - Rhizobium symbiosis // Plant Physiol. Biochem. 2002. V. 40, N. 6-8. P. 619-624.

115. Hodges D.M., DeLong J.M., Forney C.F., Prange R.K. Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds // Planta. 1999. Vol. 207. Pp. 604-611.

116. Holmberg N., Lilius G., Bailey J.E., Bulow L. Transgenic tobacco expressing Vitreoscilla hemoglobin exhibits enhanced growth and altered metabolite production//Nat. biotechnol. 1997. Vol. 15. Pp. 244-247.

117. Hunt S., Gaito S.T., Layzell D.B. Model of gas exchange and diffusion in legume nodules//Planta. 1988. Vol. 173. P. 128-141.

118. Hunt P.W., Watts R.A., Trevaskis B., Llewelyn D.J., Burnell J., Dennis E.S., Peacock W.J. Expression and evolution of functionally distinct haemoglobin genes in plants//Plant mol. biol. 2001. V.47.P. 677-692.

119. Igamberdiev A.U., Baron K., Manac'h N., Stoimenova M., Hill R.D. The haemoglobin/Nitric Oxide Cycle: Involvement in flooding stress and effects on hormone signaling//Annals of Botany. 2005. V.96. P.557-564.

120. Igamberdiev A.U., Bykova N.V., Hill R.D. Structural and functional properties of class 1 plant hemoglobin//IUBMB Life. 2011. V. 3. P. 146-152.

121. Iturbe-Ormaetxe I., Matamoros M. A., Rubio M. C., Dalton D. A., Becana M. The antioxidants of legume nodule mitochondria//MPMI. 2001. V. 14. P. 1189-1196.

122. Jacobsen-Lyon K,, Jensen E.J., Jorgensen P., Marcker K.A., Peacock W.J., Dennis E.S. Symbiotic and nonsymbiotic hemoglobin genes of Casuarina glauca. II Plant Cell. 1995. V. 7. P. 213-223.

123. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.V. GUS-fusion: Gluoronidase as a sensitive and versatile gene-fusion marker in higher plants//EMBO J. 1987. V.6. P. 3901-3907.

124. Ji L., Becana M., Sarath G., Klucas R.V. Cloning and sequence analysis of a cDNA encoding ferric leghemoglobin reductase from soybean nodules// Plant Physiol. 1994. V.104. P. 453-459

125. Ji L., Becaena M., Klucas R.V. Involvement of molecular oxygen in the enzyme-catalyzed NADH oxidation and ferric leghemoglobin reduction//Microbe-Plant Interactions. 1992. V.100. P.33-39.

126. Ji L., Wood S., Becana M., Klucas R.V. Purification and characterization of soybean root nodule ferric leghemoglobin reductase. // Plant Physiol. 1991. V. 96. P.32-37.

127. Jin, X., Yang, X., Islam, E., Liu, D., Mahmood, Q. Effects of cadmium on ultrastructure and antioxidative defense system in hyperaccumulator and non-hyperaccumulator ecotypes of Sedum alfredii Hance//Journal of Hazardous Materials. 2008. V.156. P.387-397.

128. Juszczuk I.M., Rychter A.M. Alternative oxidase in higher plants//Acta Biochimica Polonica. 2003. V50. P.1257-1271.

129. Kanayama Y., Watanabe I., Yamamoto Y. Inhibition of nitrogen fixation in soybean plants supplied with nitrate. I. Nitric accumulation and formation of nitrosylleghemoglobin in nodules // Plant Cell Physiol. 1990. V. 31, N. 3. P. 341-346.

130. Kanner J., Ben-Gera I., Berman Sh. Nitric-oxide myoglobin as an inhibitor of lipid oxidation. // Lipids. 1980. V. 15. N 11. P. 944-947.

131. Karuppanapandian T., Moon J.-C., Kim Ch., Manoharan K., Kim W. Reactive oxygen species in plants: their generation, signal transduction, and scavenging mechanisms//ALCS. 2011. V.5. P.709-729.

132. Kawashima K., Suganuma N., Tamaoki M., Kouchi H. Two types of pea leghemoglobin genes showing different 02-binding affinities and distinct patterns of spatial expression in nodules. //Plant Physiol. 2001, Vol, 125 pp. 641-651.

133. Keilin D., Wang Y.L. Hemoglobin in the root nodules of leguminous plants. // Nature. 1945. Vol.155. No 3956. P.227-229.

134. Klucas R.V., Appleby C.A. Nicotinate, nicotinamide, and the reactivity of leghemoglobin in soybean root nodules // Plant. Physiol. 1991. V. 95. P. 551-555.

135. Klucas R.V., Arp D. Physiological and biochemical studies on senescing tap root nodules of soybeans // Can. J. Microbiol. 1977. V. 23. P. 1426-1432.

136. Kubo H. Uber das Hemoprotein aus den Wurrelknollchen von Leguminosen. // Acta. Phytochim. 1939. V.ll. P. 195-200.

137. Kundu S., Blouin G.C., Premer S.A., Sarath G., Olson J.S., Hargrove M.S. Tyrosine B10 inhibits stabilization of bound carbon monoxide and oxygen in soybean leghemoglobin // Biochemistry. 2004. № 43, pp. 6241-6252.

138. Kundu S., Hargrove M.S Distal heme pocket regulation of ligand binding and stability in soybean leghemoglobin // Proteins 2003. Vol. 50. P. 239-248.

139. Kundu S., Snyder B., Das K., Chowdhury P., Park J., Petrich J.W., Hargrove M.S. The leghemoglobin proximal heme pocket directs oxygen dissociation and stabilizes bound heme//Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2002. V. 46. P. 268277.

140. Lambers H., Szaniawski R.K., de Visser R. Respiration for growth, maintenance and ion uptake. An evaluation of concept, methods, values and their significance // Physiol Plant. 1983. V. 58. P.556.

141. Layzell D.B, Diaz del Castillo L., Hunt S., Kuzma M., VanCauwenberghe O., Oresnik I. New Horizons in Nitrogen Fixation. Proc. IX Int. Congr. on Nitrogen Fixation, Kluwer Acad. Publ., Dordrecht, Boston, London (1992), pp. 393-398

142. Lee K. K., Klucas R.V. Reduction of ferric leghemoglobin in soybean root nodules // Plant Physiol. 1984. V. 74. P. 984-988.

143. Lee K. K., Shearman L.L., Erickson B.K., Klucas R.V. Ferric leghemoglobin in plant-attached leguminous nodules // Plant. Physiol. 1995. V. 109. P. 261-267.

144. Lee J.S., Verma D.P.S. Structure and chromosomal arrangement of leghemoglobin genes in kidney bean suggest divergence in soybean gene loci following tetraploidization// The EMBO Jour. 1984. V.3. P.2754-2752.

145. Lee C.H., Wittenberg J.B., Peisach J. Role of hydrogen bonding to bound dioxygen in soybean leghemoglobin // Biochemistry. 1993. V.32. P. 11500-11506.

146. Leitner M., Vandelle E., Gaupels F., Bellin D., Delledonne M. NO Signals in the Haze. Nitric Oxide Signalling in Plant Defence // Curr. Opin. Plant Biol. 2009. V. 12. P. 451-458.

147. Levy A., Walker J.C., Rifkind J.M. Identification of a low spin state associated with conformational equilibria in methemoglobin// J. Appl.Phys. 1982. V.53. P. 2066 -2068.

148. Lira-Ruan K., Sarath G., Klucas R.V., Arredondo-Peter R. Characterization of leghemoglobin from a mimozoid legume, Leucaena esculenta, root nodules. // Brazil. J. Plant Physiol. 2000. Vol. 12. No 1. P. 37-44.

149. Luan P., Arechaga-Ocampo E., Sarath G., Arredondo-Peter R., Klucas R.V. Analysis of a ferric leghemoglobin reductase from cowpea (Vigna unguiculata) root nodules. //Plant Science. 2000. V. 154. № 2. P. 161-170.

150. Madsen O., Sandal L., Sandal N.N., Marcker K.A. A soybean coproporphyrinogen oxidase gene is highly expressed in root nodules// Plant Mol. Biol. 1993. V.23. P. 3543.

151. Makino A., Miyake C., Yokota A. Physiological functions of the water-water Cycle (Mehler Reaction) and the cyclic electron flow around PSI in rice leaves// Plant Cell Physiol. 2002 V. 43. P. 1017-1026.

152. Matamoros M.A., Dalton D.A., Ramos J., Clemente M.R., Rubio M.C., Becana M. Biochemistry and molecular biology of antioxidants in the rhizobia-legume symbiosis// Plant Physiol. 2003. V. 133. P. 499-509.

153. Mathieu C., Swaraj K., Davies M. J., Trinchant J.-C., Puppo A. Absence of synproportionation between oxy- and ferrylleghemoglobin//Free Radical Research. 1997. V. 27. P. 165-171.

154. Marti M.A., Capece L., Bikiel D.E., Falcone B., Estrin D.A. Oxygen affinity controlled by dynamical distal conformations: The soybean leghemoglobin and the Paramecium caudatum hemoglobin cases// Proteins. 2007. V. 68.P. 480-487.

155. Maurino Y.G., Peterhansel C. Photorespiration: current status and approaches for metabolic engineering// Current Opinion in Plant Biology. 2010. V. 13. P. 249-256.

156. Maxwell D.P., Wang Y., Mcintosh L. The alternative oxidase lowers mitochondrial reactive oxygen production in plant cells// Proc Natl Acad Sci 1999 V.96. P.8271-8276.

157. Mediouni, C., Benzarti, O, Tray, B., Ghorbel, M.H.,Jemal, F. Cadmium and copper toxicity for tomato seedlings//Agronomy for Sustainable Development. 2006. V. 26. P.227-232.

158. Milani M., Pesce A., Nardini M., Oellet H., Oullet Y., Dewilde S., Bocedi A., Ascenzi P., Guertin M., Moens L., Friedman J.M., Wittenberg J.B., Bolognesi M. Structural bases for heme-binding and diatomic ligand recognition in trunicated hemoglobins//Journal of Inorganic Biochemistry. 2005. V. 99. P.97-109.

159. Mohammad M., Karr A.L. Membrane lipid peroxidation, nitrogen fixation and leghemoglobin content in soybean root nodules//Plant Phys. 2001. V.158. P.9-19.

160. Monroe J.D. Owens T.G., LaRue T.A. Measurement of the fractional oxygenation of leghemoglobin in intact detached pea nodules by reflectance spectroscopy// Plant Phys. 1989.V.91.P.598-602.

161. Moller I.M. Plant mitochondria and oxidative sress: Electron transport, NADPH turnover, and metabolism of reactive oxygen species//Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. V. 52. P. 561-591.

162. Moreau S., Davies M.J., Mathieu C.m, Herourart D. Leghemoglobin-derived radicals: evidence for multiple protein - derived radicals and the initiations od peribacteroid damage//Journal of biological chemistry. 1996. V. 271. P. 2557-32562.

163. Neill S. J., Barroso R., Bright J., Desikan R., Hancock J., Harrison J., Morris P., Ribeiro D., Wilson J. Nitric oxide, stomatal closure, and abiotic stress // J. Exp. Bot. 2008. V. 59. P. 165-176.

164. Neill S. J., Desikan R., Hancock J.T. Nitric oxide signalling in plants//New Phytologist. 2003. V.159. P. 11-35.

165. Noctor G., Foyer C. H. Ascorbate and glutathione: Keeping active oxygen under control// Annu. Rev. Plant Phys. 1998. V. 49. P.249-279.

166. Noctor G., De Paepe R., Foyer C.H., Mitochondrial redoxbiology and homeostasis in plants// Trends in Plant Science. 2007. V. 12. P. 125-134.

167. O'Brian M.R., Kirshbom P.M., Maier R.J. Bacterial heme synthesis is required for expression of the leghemoglobin holoprotein but not the apoprotein in soybean root nodules//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1987. V.84. P.8390-8393.

168. Ollis D.L., Appleby C.A., Colman P.M., Cutten A.E., Guss J.M., Vencatappa M.P., Freeman H.C. Crystal structure of soybean ferric leghemoglobin a nicotinate at a resolution of 3.3 .//Aust. J. Chem. 1983. V.36. N 3. P.451-468.

169. Olson J.S., Phillips G.N. Jr. Myoglobin discriminates between 02, NO and CO by electrostatic interaction with bound ligand //JBIC. 1997. V.2. P.544-552.

170. Ott T., van Dongen J.T., Gunther C., Krusell L., Desbrosses G., Vigeolas H., Bock V., Czechowski T., Geigenberger P., Udvardi M.K. Symbiotic leghemoglobins are crucial for nitrogen fixation in legume root nodules but not for general plant growth and development// Curr. Biol. 2005. V. 15.P. 531-535.

171. Ott T., Sallivan J., James E.K., Flemetakis E., Gunter K., Gibon Y., Ronson C., Udvardi M. Absence of symbiotic leghemoglobins alters bacteroid and plant cell differentiation during development of Lotus japonicus root nodules//MPMI.2009. V.22. P.800-808.

172. Pagnussat G.C., Simontacchi M., Puntarulo S. and Lamattina L. Nitric Oxide is required for root organogenesis // Plant Physiol. 2002. V. 129. P. 954-956.

173. Parani M., Rudrabhatla S., Myers R., Weirich H., Smith B., Leaman D.W., Goldman S.L. Microarray analysis of nitric oxide responsive transcripts in Arabidopsis/fPlmt Biotechnology Journal. 2004. V.2. P. 359-366.

174. Pauly N., Pucciariello C., Mandon K., Innocenti G., Jamet A., Baudouin E., Herouart D., Frendo P., Puppo A. Reactive oxygen and nitrogen species and glutathione: key players in the legume-Rhizobium symbiosis// J. Exp. Botany. 2006. V. 57. P. 1769-1776.

175. Pawlowski K. Nodules and oxygen// Plant Biotech. 2008. V.25. P.291-298.

176. Pawlowski K., Bisseling T. Rhizobial and actinorhizal symbiosis: what are the shared features? // The Plant Cell. 1996. V.8. P1899-1913.

177. Perazzolli M., Romero-Puertas M.C., Delledonne M. Modulation of nitric oxide bioactivity by plant haemoglobins//Journal of Experimental Botany. 2006. V. 57. №3. P.479-488.

178. Pitzschke A., Fornazi C., Hirt H. Reactive oxygen species signalling in plants// Antioxidants & Redox Signaling. 2006. V. 8P. 1757-1764.

179. Puppo A., Halliwell B. Oxidation of dimethylsulphoxide to formaldehyde by oxyhaemoglobin and oxyleghaemoglobin in the presence of hydrogen peroxide is not mediated by "free" hydroxyl radicals// Free Radie. Res. Commun. 1989. V.5. P. 277281.

180. Puppo A., Herrada G., Rigaud J. Lipid peroxidation in peribacteroid membranes from French-bean nodules//Plant Physiol. 1991. V96 (3).P.826-830.

181. Puppo A., Monny C., Davies M.J. Glutation-dependent conversion of ferryl leghemoglobin into the ferric form: a potential protective process in soybean (Glycine max) root nodules// Biochem. J.1993.Y.289.P.435-438.

182. Puppo A., Rigaud J. Indole-3-acetic acid (IAA) oxidation by leghemoglobin from soybean nodules. //Physiol.Plantarum. 1975. V. 35. P. 181-185.

183. Puppo A., Rigaud J. Superoxide dismutase: an esssential role in the protection of the nitrogen fixation process? // FEBS Letters. 1986. Y. 210. P. 187-189.

184. Puppo A., Rigaud L., Job D., Ricard J., Zeba B. Peroxidase content of soybean root nodules// Biochem. biophys. Acta. 1980. V. 614. P. 303-312.

185. Raghavendra A.S., Padmasree K., Beneficial interactions of mitochondrial metabolism with photosynthetic carbon assimilation// Trends Plant Sci. 2003. V. 8. P. 546-553.

186. Rasmusson A.G., Geisler D.A., Moller I. M. The multiplicity of dehydrogenases in the electron transport chain of plant mitochondria/Mitochondrion. 2008. V.8. P. 47-60.

187. del Rio L.A., Corpas F.J., Barrosa J. H. Nitric oxide and nitric oxide synthase activity in plants// Phytochemistry. 2004. V. 65. P.783-792.

188. Rizhsky L., Liang H., Mittler R. The Water-Water Cycle Is Essential for Chloroplast Protectionin the Absence of Stress// J. Biol. Chem. 2003. V. 278.P. 38921-38925.

189. Romero -Puertas M.C., Perazzolli M., Zago E.D., Delledonne M. Nitre oxide signaling functions in plant - pathogen interaction//Cellular Microbiology. 2004. V. 9. P.795-803.

190. Ross E.J., Shearman L., Mathiesen M., Zhou Y.J., Arrendo-Peter R., Sarath G., Klukas R.V. Nonsynbiotic hemoglobins in rice are synthesized during germination and in differentiating cell types//Protoplasma. 2001. V. 218. P.125-133.

191. Saari L.L., Klucas R.V. Ferric leghemoglobin reductase from soybean root nodules//Arch Biochem Biophys. 1984. V. 15. P. 102-13.

192. Sang J., Jiang M., Lin F., Xu S., Zhang A., Tan M. Nitric oxide reduces hydrogen peroxide accumulation involved in water stress-induced subcellular antioxidant defense in maize plants//J. Integr. Plant Biol. 2008. V. 50. P.231-243.

193. Siddiqui M.H., Al-Whaibi M.H., Basalah M.O. Role of nitric oxide in tolerance of plants to abiotic stress// Protoplasma. 2011 V.248.P. 447-455.

194. Sievers G., Ronnberg M. Study of pseudoperoxidatic activity of soybean leghemoglobin and sperm whale myoglobin// Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 553. P. 293-301.

195. Sharkey T.D. Estimating the rate of photorespiration in leaves//Phisiologia Plantarum. 1988. V.73. P.147-152.

196. Shi S., Wang G., Wang Y., Zhang L., Zhang L. Protective effect of nitric oxide against oxidative stress under ultraviolet-B radiation//Nitric Oxide. 2005. V. 13. P. 19.

197. Shimoda Y., Nagata M., Suzuki A. et al. Simbiotic rhizobium and nitric oxide induce gene expression of non-symbiotic hemoglobin in Lotus japonicus II Plant Cell Physiol. 2005. V. 46, N. 1. P. 99-107.

198. Shimoda Y., Shimoda-Sasakura F., Kucho K., Kanamori N., Nagata M., Suzuki A., Abe M., Higashi S., Uchiumi T. Overexpression of class 1 plant hemoglobin genes enhances symbiotic nitrogen fixation activity between Mesorhizobium loti and Lotus japonicas//Plant J. 2009. V.57. P. 264-263.

199. Smagghe B.J., Hoy J.A., Percifield R., Kundu S., Hargrove M.S., Sarath G., Hilbert J.-LWatts R.A., Dennis E.S., Peacock W.J., Dewilde S., Moens L., Blouin G.C., Olson J.S., Appleby C.A. Correlation between oxygen affinity sequence classification of plant hemoglobins//Biopolymers. 2009. V. 91. P. 1083-1096.

200. Spyrakis F., Luque F.J., Viappiani C. Structural analysis in nonsymbiotic hemoglobins: what can we learn from inner cavities?// Plant Sci. 2011. V. 181. P. 813.

201. Suganuma N., Kitou M., Yamamoto Y. Carbon metabolism in relation to cellular organization of soybean root nodules and respiration of mitochondria aided by leghemoglobin//Plant Cell Physiol. 1987. V.28. P. 113-122.

202. Swarai K., Garg O.P. The Effect of Ageing on the Leghemoglobin of Cowpea Nodules//Physiologia plantarum. 2006. V.39. P.185-189

203. Szal B., Jolivet Y., Hasenfratz-Sauder M.-P., Dizengremel P., Rychter A.M. Oxygen concentration regulates alternative oxidase expression in barley roots during hypoxia and post-hypoxia//Physiologia Plantarum.2003. V. 119. P. 494-502.

204. Taylor E.R., Nie X.Z., MacGregor A.W., Hill R.D. A cereal haemoglobin gene is expressed in seed and root tissues under anaerobic conditions// Plant mol. biol. 1994. V. 24.P.853-862.

205. Thornley J.H.M., Cannell M.G.R. Modelling the components of plant respiration: representation and realism// Ann. Bot .2000. V. 85. P. 55-67.

206. Tjepkema J.D. Hemoglobin in the nitrogen-fixing root nodules of actinorhisal plants. // Can. J. Bot. 1983. Vol. 61. No 11. P.2924-2929.

207. Topunov A. F., Shleev S. V., Petrova N. E., Rozov F. N., Zhabaeva M. U. Reductases reducing plant Hemoglobins and Possible mechanism of their action // Vestnik moskovskogo universiteta. Khimia. 2000. Vol.41. Supplement

208. Trevaskis B., Watts R.A., Andersson C.R., Llewellyn D.J., Hargrove M. S., Olson J.S., Dennis E.S., Peacock W.J. Two haemoglobin genes in Arabidopsis thaliana: The evolutionary origins of leghemoglobins//Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P.12230-12234

209. Trinchant J.V., Rigard J. Nitrite and nitric oxide as inhibitors of nitrogenase from soybean bacteroids // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 44, N. 6. P. 1385-1388.

210. Uheda E., Syono K. Physiological role of leghaemoglobin heterogeneity in pea root nodule development. // Plant Cell Physiol. 1982b . V.23. N 1. P.75-84.

211. Uzan J., Dewilde S., Burmester T., Hankeln T., Moens L., Hamdane D., Marden M., Kiger L. Neuroglobin and other hexacoordinated hemoglobins show a weak temperature dependence of oxygen binding// Biophysical journal. 2004. V. 87. P. 1196-1204.

212. Vainstein B.K., Harutyunyun E.H., Kuranova I.P., Borisov V.V., Pavlovsky A.G., Grebenko A.I., Konareva N.V. Structure of leghemoglobin from lupin root nodules at 5 angstrom resolution//Nature. 1975. V. 254. P. 163-164.

213. Valderrama R., Corpas F.J., Carreras A., Fernandez- Ocana A., Chaki M., Luque L., Gomez-Rodriguez M.V., Colmenero-Varea P., del Rio L.A. and Barroso J.B. Nitrosative stress in plants// FEBS Lett. 2007. V. 581. P. 453-461.

214. Vanlerberghe G.C., Mcintosh L. Alternative oxidase: from gene to function// Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. V. 48. P. 703-734.

215. Verbruggen N., Hermans C., Schat H. Mechanisms to cope with arsenic or cadmium excess in plants// Current Opinion in Plant Biology. 2009. V. 12. P. 64-372.

216. Verma D.P.S., Bal A.K. Intracellular site of synthesis and localization of leghemoglobin in root nodules. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. Vol. 73. No 11. P. 3843-3847.

217. Vieweg M.F., Hohnjec N., Kuster H. Two genes encoding different truncated hemoglobins are regulated during root nodule and arbuscular mycorrhiza symbioses of Medicago truncatula.il Planta. 2005. V.220. P.757-766.

218. Vinogradov S.N., Hoogewijs D., Bailly X., Arrendo-Peter R., Gough J., Dewilde S., Moens L., Vanfletern J.R. A phylogenomic profile of globins//BMS Evolutionary biology. 2006. V.6. №3. p

219. Vinogradov S. N., Hoogewijs D., Bailly X., Mizuguchi K., Dewilde S., Moens L., Vanfleteren J. R. A model of globin evolution//Gene. 2007. V.398.P. 132-142.

220. Vinogradov S.N., Moens L. Diversity of Globin Function: Enzymatic, Transport, Storage,and Sensing//J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 8773-8777.

221. Vitha S., Benes K., Phillips Y.P. Gartland K.M.A. Histochemical GUS analysis// Methods Mol. Biol. 1995. V.44. P. 185-193.

222. Weber R.E., Vinogradov S.N. Nonvertebrate hemoglobins: Functions and molecular adaptation// Physiological reviews. 2001. V.81. P.569-628.

223. von Wettstein D., Gough S., Kannangara C.G. Chlorophyll biosynthesis// Plant Cell. 1995. V. 7. P.1039-1057

224. Wildner G.F. The effect of oxygen on ribulose-l,5-biphosphate carboxylase and oxygenase. //Bert. Dtsch. Bot. Ces. 1981. V. 94. N 1-2. P. 151-159.

225. Wilson I.D., Neil S.J., Hancock D.T. Nitric Oxide Synthesis and Signalling in Plants // Plant Cell Environ. 2008. V. 31. P. 622-631.

226. Wittenberg J.B., Appleby C.A., Wittenberg B.A. The kinetics of the reactions of leghenloglobin with oxygen and carbon monoxide // J. Biol. Chem. 1972. Vol. 247.P.527-531.

227. Witty J.F., Minchin F.R., Skot L., Sheehy J.E. Oxford Surveys of Plant molecular and Cell Biology. 1986. V. 3. P. 275-314.

228. Yamasaki H., Shimoji H., Ohshiro Y., Sakihama Y. Inhibitory effects of nitric oxide on oxidative phosphorylation in plant mitochondria//Nitric Oxide. 2001. V.5. P.261-270.

229. Yip J.Y.H., Vanlerberghe G.C. Mitochondrial alternative oxidase acts to dampen the generation of active oxygen species during a period of rapid respiration induced to support a high rate of nutrient uptake// Physiol Plant. 2001. V. 112. P. 327-33.

230. Young A. J., Phillipa D., Rubanb A. V., Hortonb P., Frank FI. A. The xanthophyll cycle and carotenoid-mediated dissipation of excess excitation energy in photosynthesis//Pure &Appl. Chem. 1997. V. 69. P. 2125-2130.

231. Zal F., Lallier F.H., Wall J,S., Vinogradov S.N., Toulmond A. Multi-hemoglobin system of the hydrothermal vent tube worm Riftia pachyptila I. Reexamination of the number and masses of its constituents // J. Biol. Chem. 1996a V.. 271. P. 8869-8874.

232. Zelitch I. Plant productivity and the control of photorespiration// Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1973. V.70. P. 579-584.

233. Zelitch I., Berlyn M. Altered glycine decarboxylation inhibition in isonicitinic acid hydrazine-resistant mutant callus lines and in regenerated plants and seed progeny// Plant Physiol. 1982. V. 69. P. 198-204.