Жизнеспособность лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, кандидат медицинских наук Абдуллаев, Руслан Тагирович

• Абдуллаев, Руслан Тагирович
• кандидат медицинских наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Абдуллаев, Руслан Тагирович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ЛЕИКОЦИТОВ И ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕЧЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ И РОДОВ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ И ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ГИПОКСИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ПЛОДА НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ И ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Жизнеспособность лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови»

так же как и к применению новых технологий для уменьшения клеточных потерь. В этом отношении, усилия БПК направлены на улучшение протоколов обработки ПК для сокращения объема сохраняемых единиц и минимизации клеточных потерь. Изучение факторов влияющих на жизнеспособность гемопоэтических клеток позволит определить дополнительные показания и предикторы для успешного забора ГСК пуповинной крови. Определение жизнеспособности, под которой в настоящее время подразумевается определение уровня спонтанного апоптоза и некроза лейкоцитов пуповинной крови в сочетании с изучением эффективности клонирования (ТЧеЮогс! 2006), является актуальной темой для гематологии и педиатрии.

Цель и задачи исследования

Цель работы:

Определить факторы, влияющие на жизнеспособность лейкоцитов пуповинной крови. Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Определить уровни некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов и гемопоэтических клеток пуповинной крови.

2. Изучить жизнеспособность лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток в зависимости от клеточного состава пуповинной крови.

3. Определить влияние на жизнеспособность лейкоцитов пуповинной крови распространенных патологических состояний у матери и плода.

4. Изучить влияние на жизнеспособность лейкоцитов пуповинной крови гипоксии плода при беременности и родах.

5. Изучить влияние на жизнеспособность лейкоцитов пуповинной крови особенностей течения беременности и родов.

6. Изучить влияние на1 жизнеспособность лейкоцитов пуповинной крови пола и антропометрических данных новорожденных.

7. Определить влияние технологических особенностей сбора пуповинной крови на жизнеспособность лейкоцитов пуповинной крови.

Научная новизна

Показано, что уровень некроза лейкоцитов пуповинной крови составил 3,49 ± 0,28 %, при этом, уровень некроза лимфоцитов был ниже значений всех лейкоцитов (2,99 ± 0,34 %) и статистически значимо отличался от уровня некроза моноцитов и гранулоцитов, составлявшего 5,59 ± 0,72 % и 6,12 ± 0,65 % соответственно (р < 0,0001).

Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов составил 9,18 ± 1,19 %, при этом, уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов, был также ниже значений в общей группе (4,32 ± 0,7 %), и также статистически значимо отличался от уровня спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов, составившего 15,35 ± 2,02 % и 28,22 ± 2,51 % соответственно (р < 0,0001). У новорожденных, с задержкой внутриутробного развития уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов статистически значимо выше, чем у доношенных новорожденных с массой тела более 3 кг, в то время как колониеобразующая активность имеет обратную зависимость. Наибольшая степень жизнеспособности клеток пуповинной крови отмечается при 3-х родах. Не меняется в течение 37-40 недели гестации, заметно снижаясь после 41 недели гестации.

Научно-практическое значение

Образцы пуповинной крови с большим количеством лейкоцитов содержат большую долю погибших лейкоцитов и лимфоцитов. Образцы пуповинной крови с большим количеством погибших лейкоцитов и лейкоцитов на разных стадиях апоптоза содержат меньше С034+клеток.

На жизнеспособность лейкоцитов пуповинной крови, в том числе, гемопоэтических стволовых клеток, не оказывает влияния вид родоразрешения, длительность безводного промежутка, длительность периода изгнания, маловодие. Многоводие приводит к повышению уровня спонтанного апоптоза и повышению эффективности клонирования.

При наличии у матери анемии во время беременности отмечается тенденция как к снижению уровня спонтанного апоптоза и некроза клеток пуповинной крови, так и к повышению эффективности клонирования пуповинной крови. Также повышается жизнеспособность лейкоцитов при наличии угрозы прерывания беременности в анамнезе, что, однако, может быть связано с приемом гормональных препаратов с целью коррекции указанного состояния.

Эффективность клонирования и уровень спонтанного апоптоза снижаются при ФПН. При внутриутробной гипоксии повышается как эффективность клонирования, так и уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов пуповинной крови. При острой гипоксии плода жизнеспособность лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови не изменяется. При повышении степени зрелости плаценты, эффективность клонирования имеет тенденцию к снижению, а уровень спонтанного апоптоза к повышению.

Процедура сбора пуповинной крови, проводившаяся позднее 10 минут после пересечения пуповины, приводит к значительному снижению жизнеспособности клеток пуповинной крови. Имеется тенденция к снижению жизнеспособности лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови при удлинении периода ожидания дальнейшей обработки образца пуповинной крови более 20 часов после окончания процедуры сбора.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на X Съезде педиатров России, февраль 2006, и Российском Съезде гематологов и трансфузиологов, апрель 2006.

Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции клинических и лабораторных отделов ФГУ НИИ детской гематологии Росздрава и ГУЗ «Банк стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы».

Внедрение результатов работы Результаты исследования внедрены в работу ГУЗ банка стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы.

Структура и объем диссертации Материал диссертации изложен в одном томе на страницах машинописного текста, содержит таблицу и проиллюстрирован рисунками. Указатель литературы включает источников отечественной и -зарубежной литературы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждение, выводов, практических •рекомендаций и списка литературы.

Работа выполнена в ФГУ Федеральном научно-клиническом центре детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава (директор ФГУ ФНКЦ ДГОИ - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Г.Румянцев), на базе отдела молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и иммунологии (рук. - к.м.н. С.А.Румянцев) и лабораторий контроля количества и жизнеспособности стволовых клеток (зав. — к.м.н. С.А.Румянцев) и физиологии стволовых клеток (зав. -к.м.н. Г.М.Сухин) ГУЗ «Банк стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы» (директор - доктор медицинских наук, профессор О.А.Майорова).

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Абдуллаев, Руслан Тагирович

выводы

1. Уровень некроза лейкоцитов пуповинной крови составил 3,49 ± 0,28 %, при этом, уровень некроза лимфоцитов был ниже значений всех лейкоцитов (2,99 ± 0,34 %) и статистически значимо отличался от уровня некроза моноцитов и гранулоцитов, составлявшего 5,59 ± 0,72 % и 6,12 ± 0,65 % соответственно (р < 0,0001). Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов составил 9,18 ± 1,19 %, при этом, уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов, был также ниже значений в общей группе (4,32 ± 0,7 %), и также статистически значимо отличался от уровня спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов, составившего 15,35 ± 2,02 % и 28,22 ± 2,51 % соответственно (р < 0,0001).

2. Образцы пуповинной крови с большим количеством лейкоцитов содержат большую долю погибших лейкоцитов и лимфоцитов. Образцы пуповинной крови с большим количеством погибших лейкоцитов и лейкоцитов на разных стадиях апоптоза содержат меньше С034+клеток.

3. При наличии у матери анемии во время беременности отмечается тенденция как к снижению уровня спонтанного апоптоза и некроза клеток пуповинной крови, так и к повышению эффективности клонирования пуповинной крови. Также повышается жизнеспособность лейкоцитов при наличии угрозы прерывания беременности в анамнезе, что, однако, может быть связано с приемом гормональных препаратов с целью коррекции указанного состояния.

4. Эффективность клонирования и уровень спонтанного апоптоза снижаются при ФПН. При внутриутробной гипоксии повышается как эффективность клонирования, так и уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов пуповинной крови. При острой гипоксии плода жизнеспособность лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови не изменяется. При повышении степени зрелости плаценты, эффективность клонирования имеет тенденцию к снижению, а уровень спонтанного апоптоза к повышению. На жизнеспособность лейкоцитов пуповинной крови, в том числе, гемопоэтических стволовых клеток, не оказывает влияния длительность безводного промежутка, длительность периода изгнания, маловодие. Многоводие приводит к повышению уровня спонтанного апоптоза и повышению эффективности клонирования.

Жизнеспособность лейкоцитов пуповинной крови снижается при увеличении массы плаценты более 700 г. Вид родоразрешения не,оказывает влияния на жизнеспособность клеток пуповинной крови.

Наибольшая степень жизнеспособности клеток пуповинной крови отмечается при 3-х родах, не меняется в течение 37 - 40 недели гестации, заметно снижаясь после 41 недели гестации.

Количество погибших клеток и клеток, находящихся на различных стадиях апоптоза у мальчиков и девочек не различается. Колониеобразующая активность пуповинной крови новорожденных мальчиков и девочек также не отличается.

У доношенных новорожденных с внутриутробной задержкой развития плода-уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов статистически значимо выше, чем у новорожденных с массой тела более 3 кг, в то время как колониеобразующая активность пуповинной крови имеет обратную зависимость.

Сбор пуповинной крови после отделения плаценты приводит к повышению эффективности клонирования. Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов и лимфоцитов пуповинной крови уменьшается при увеличении времени между г родами и сбором пуповинной крови более 10 минут, тогда как эффективность клонирования уменьшается.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Процедуру сбора пуповинной крови рекомендуется проводить не позднее 10 минут после пересечения пуповины.

Для сохранения максимальной жизнеспособности клеток пуповинной крови процедуру обработки пуповинной крови для подготовки к криоконсервации рекомендуется проводить не позднее, чем через 20 часов после сбора пуповинной крови.

Зависимость жизнеспособности клеток пуповинной крови от различных состояний при беременности и родах рекомендуется использовать при определении показаний и противопоказаний для сбора пуповинной крови с целью безвозмездного донорства.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Абдуллаев, Руслан Тагирович, 2006 год

1. Б.В.Афанасьев, Л.М.Фрегатова, Э.И.Подольцева и соавт. Роль трансплантациистволовых клеток периферической крови в лечении онкогематологических больных. Материалы III Всероссийского съезда гематологов и трансфузиологов, 1996.

2. Владимирская Е.Б., Масчан А.А., Румянцев А.Г. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста. Гематол трансфузиол 1997; 5: 4-9.

3. Владимирская Е.Б. , Кисляк Н.С. , Румянцев А.Г. Причины и пути преодоления лекартвенной резистентности при лейкозах и лимфомах у детей. // Гематология и трансфузиология, 1998, №6, стр. 3-8.

4. Владимирская Е.Б., Майорова О.А., Румянцев С.А., Румянцев А.Г. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. М. ИД Медпрактика, 2005

5. Птушкин В.В. Трансплантация костного мозга в современной химиотерапии злокачественных новообразований. // Российский медицинский журнал.- 2001.том 9. №22. С.84-89.

6. Румянцев А.Г., Масчан А.А. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей. // М. И. Медицинское информ. Агентство, 2003.

7. Abboud M, Xu F, LaVia M, Laver J. Study of early hematopoietic precursors in human cord blood. Exp Hematol 1992;20(9):1043-7.

8. Aguila HL, Weissman IL. Hematopoietic stem cells are not direct cytotoxic targets of natural killer cells. Blood 1996; 87: 1225-1231.

9. Alenzi FQ. Induction of apoptosis in myeloid progenitors by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Br J Biomed Sci. 2004;61(4):200-5.

10. Arends MJ, Morris RG, Wyllie AH: Apoptosis: The role of endonuclease. Am J Pathol 136:593-608,1990.

11. Barcena A, Muench MO, Song KS, Ohkubo T, Harrison MR. Role of CD95/Fas and its ligand in the regulation of the growth of human CD34(++)CD38(-) fetal liver cells. Exp Hematol 1999; 27:1428-1439.

12. Barcena A, ParkSW, Banapour B, Muench MO, Mechetner E. Expression of Fas/CD95 and Bcl-2 by primitive hematopoietic progenitors freshly isolated from human fetal liver. Blood 1996; 88:2013-2025.

13. Barth E, Malorgio C, Tamaro P. Allogeneic bone marrow transplantation in hematologic disorders of childhood: new trends and controversies. Haematologica. 2000 Nov;85(ll Suppl):2-8.

14. Bayer-Zwirello LA, Hoffman DE, Adams LA, Wilder PT, Reece MT. The effect of processing and cryopreservation on nucleated umbilical cord blood cells. J Perinat Med. 2004;32(5):430-3.

15. Brady HJ, Gil-Gomez G, Kirberg J, Beras AJ. Bax alpha perturbs T cell development andaffects cell cycle entry of T cells. Embo J1996; 15: 6991-7001.

16. Broxmeyer HE, Douglas GW, Hangoc G, Cooper S, Bard J, English D, Amy M, Thomas L, Boyse EA. Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem / progenitor cells. Proc Natl Acad Sci USA 1989;86:3828-32.

17. Broxmeyer HE, Srour EF, Hangoc G, Cooper S, Anderson SA, Bodine DM. Highefficiency recovery of functional hematopoietic progenitor and stem cells from human cord blood cryopreserved for 15 years. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100(2):645-50.

18. Brunet De La Grange P, Barthe C, Lippert E, Hermitte F, Belloc F, Lacombe F, Ivanovic Z,

19. Praloran V. Oxygen concentration influences mRNA processing and expression of the cd34 gene. J Cell Biochem. 2006 Jan 1;97(1): 135-44.

20. Cai J, Yang J, Jones DP. Mitochondrial control of apoptosis: The role of cytochrome c. Biochim Biophys Acta 1998; 1366: 139-149.

21. Carow CE, Hangoc G, Cooper SH, Williams DE, Broxmeyer HE. Mast cell growth factor (c-kit ligand) supports the growth of human multipotential progenitor cells with a high replating potential. Blood 1991;78(9):2216-21.

22. Castedo M, Hirsch T, Susin SA, Zamzani N, Marchetti P, Macho A, Kroemer G: Sequential acquisition of mitochondrial and plasma membrane alterations during early lymphocyte apoptosis. J Immunol 157:512-521, 1996.

23. Chan FK, Chun HJ, Zheng L, Siegel RM, Bui KL, Lenardo MJ. A domain in TNF receptors that mediates ligandindependent receptor assembly and signaling. Science 2000; 288: 2351— 2354.

24. Chen WC, Liu Q, Fu JX, Kang SY: Expression of survivin and its significance in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 2004 Oct l;10(19):2886-9.<

25. Cohen JJ: Apoptosis. Immunol Today 14:126-130,1993.

26. Compton MM: A biochemical hallmark of apoptosis: Internucleosomal degradation of the genome. Cancer Metast Rev 11:105-119,1992.

27. Cotter TG: Induction of apoptosis in cells of the immune system by cytoxic stimuli. Seminars Immunol 4:399-406,1992.

28. Desplat V, Faucher JL, Mahon FX, Dello Sbarba P, Praloran V, Ivanovic Z. Hypoxia modifies proliferation and differentiation of CD34(+) CML cells. Stem Cells. 2002;20(4):347-54.

29. Domen J, Cheshier SH,Weissman IL. The role of apoptosis in the regulation of hematopoietic stem cells: Overexpression of Bcl-2 increases both their number and repopulation potential. J Exp Med 2000; 191:253-264.

30. Domen J, Gandy KL,Weissman IL. Systemic overexpression of BCL-2 in the hematopoietic system protects transgenic mice from the consequences of lethal irradiation. Blood 1998; 91: 2272-2282.

31. Du C, Fang M, Li L,Wang X. Smac, a Mitochondrial Protein that Promotes Cytochrome c-Dependent Caspase Activation by Eliminating IAP Inhibition. Cell 2000; 102: 33-42.

32. Eaves C, Lambie K, ed. Atlas of human hematopoietic colonies. Vancouver: StemCell Technologies Inc.; 1995.

33. Endersen PC, Prytz PS, Aarbakke J: A new flow cytometric method for, discrimination of apoptotic cells and detection of their cell cycle specificity through staining of F-actin and DNA. Cytometry 20:162-171, 1995.

34. Fadok VA, Voelker DR, Cammpbell PA, Cohen JJ, Bratton DL, Henson PM: Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol 148:2207-2216, 1992.

35. Geissler K, Geissler W, Hinterberger W, Lechner K, Wurnig P. Circulating committed and' pluripotent haemopoietic progenitor cells, in infants. Acta Haematol 1986;75:18-22.

36. Gil-Gomez G, Berns A, Brady HJ. A link between cell cycle and cell death: Bax and Bcl-2 modulate Cdk2 activation during thymocyte apoptosis. Embo J1998; 17: 7209-7218.

37. Gluckman E., Broxmeyer H.E. Hematopoietic Stem-Cell transplants using umbilical- cord blood. N Engl J Med 2001; 344(24): 1860-1.

38. Gluecksmann, A. "Cell death in normal vertebrate ontogeny." Biological Reviews. 26: 5986, 1951

39. Gong J, Traganos F, Darzynkiewicz Z: A selective procedure for DNA extraction from apoptotic cells applicable for gel electrophoresis and flow cytometry. Anal Biochem 218:314-319, 1994.

40. Harris D.T. Experience in autologous and allogeneic cord blood banking. J. Hematother 1996, 5; 123-128.

41. Hausmann G, O'Reilly LA, van Driel R, et al. Pro-apoptotic apoptosis protease-activating factor 1 (Apaf-1) has a cytoplasmic localization distinct from Bcl-2 or Bcl-x(L). J Cell Biol 2000; 149: 623-634.

42. Hedley DW, McCulloch EA: Generation of oxygen intermediates after treatment of blasts of acute myeloblastic leukemia with cytosine arabinoside: Role of bcl-2. Leukemia 10:11431149,1996.

43. Hows JM, Bradley BA, Marsh JC, Luft T, Coutinho L, Testa NG, Dexter TM. Growth of human umbilical cord blood in longterm haemopoietic cultures. The Lancet 1992;340(8811):73-6.

44. Huang DC, O'Reilly LA, Strasser A, Cory S. The antiapoptosis function of Bcl-2 can be genetically separated from its inhibitory effect on cell cycle entry. Embo J 1997; 16: 46284638.

45. Ivanovic Z, Belloc F, Faucher J-L et al. Hypoxia maintains and interleukin-3 reduces the pre-colony-forming cell potential of dividing CD34+ murine bone marrow cells. Exp Hematol2002;30:67-73.

46. Ivanovic Z, Dello Sbarba PD, Trimoreau F et al. Primitive human HPCs are better maintained and expanded in vitro at 1 percent oxygen than at 20 percent. Transfusion 2000;40:1482-1488.

47. Ivanovic Z, Dello SP, Trimoreau F, Faucher JL, Praloran V. Primitive human HPCs are better maintained and expanded in vitro at 1 percent oxygen than at 20 percent. Transfusion 2000;40(12):1482-8.

48. Josefsen D, Myklebust JH, Lynch DH, Stokke T, Blomhoff HK, Smeland EB. Fas ligand promotes cell survival of immature human bone marrow CD34+CD38- hematopoietic progenitor cells by suppressing apoptosis. Exp Hematol 1999; 27: 1451-1459.

49. Kasai M, Masauzi N. The characteristics of umbilical cord blood (UCB) and UCB transplantation. Semin Thromb Hemost 1998;24(5):491-5.

50. Kerr JF, Wyllie, AH and Currie, AR (1972). "Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics." Br J Cancer26(4): 239-57.

51. Knudtzon S. In vitro growth of granulocytic colonies from circulating cells in human cord blood. Blood 1974;43(3):357-61.

52. Lamana M, Albella B, Rodriguez F, Regidor C, Bueren JA. Conclusions of a national multicenter intercomparative study of in vitro cultures of human hematopoietic progenitors. Bone Marrow Transplant 1999;23(4):373-80.

53. Laroche V, McKenna DH, Moroff G et al. Cell loss and recovery in umbilical cord blood processing: a comparison of postthaw and postwash samples. Transfusion. 2005 Dec;45(12):1909-16.

54. Laver J, Duncan E, Abboud M, Gasparetto C, Sahdev I, Warren D, et al.: High levels ofgranulocyte and granulocyte-macrophage colony-stimulating factors in cord blood of normal full-term neonates. J Pediatr 1990, 116: 627-631.

55. Leary AG, Ogawa M. Blast cell colony assay for umbilical cord blood and adult bone marrow progenitors. Blood 1987;69(3):953-6.

56. Li F, Ambrosini G, Chu EY, et al. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin. Nature 1998; 396: 580-584.

57. Li F, Flanary PL, Altieri DC, Dohlman HG. Cell division regulation by BIR1, a member of the inhibitor of apoptosis family in yeast. J Biol Chem 2000; 275: 6707-6711.

58. Li F: Role of survivin and its splice variants in tumorigenesis. Br J Cancer. 2005 Jan 31;92(2):212-6.

59. Li K, Li CK, Fok TF, Liu J, Yuen PM. Neonatal blood: a source of haematopoietic stem cells for transplantation? The Lancet 1998;351(9103):647-8.

60. Liao C, Liu* B, Huang Y. Establishment of cord blood stem cell bank and its clinical application. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2001 Aug;22(8):411-4.

61. Lim F, Beckhoven J, Brand A, Kluin-Nelemans J, Hermans J, Willemze R, Kanhai H, Falkenburg J. The number of nucleated cells reflects the hematopoietic content of umbilical cord blood for transplantation. Bone Marrow Transplant 112; 1999;24(9):965-70.

62. Linette GP, Li Y, Roth K, Korsmeyer SJ. Cross talk between cell death and cell cycle progression: BCL-2 regulates NFAT mediated activation. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 9545-9552.

63. Lizard G, Fournel S, Genestier L, Dgedin N, Chaput C, Flacher M, Mutin M, Panaye G, Revillard J-P: Kinetics of plasma membrane and mitochondrial alterations in cells undergoing apoptosis. Cytometry 21:275-283,1995.

64. Lockshin, RA and Williams, CM (1964). "Programmed cell death. II. Endocrine potentiation of the brea down of the intersegmental muscles of silkmoths." J Insect Physiol 10: 643-649.

65. Lockshin, RA and Zakeri, Z (2001). "Programmed cell death and apoptosis: origins of thetheory." Nat Rev Mol Cell Biol2(7):545-50.

66. Lumley MA, Burton A, Billingham LJ, McDonald DF, Czarnecka HM, Milligan DW. Quality assurance of CFU-GM assays: inter-laboratory variation despite standard reagents.

67. Eur J Haematol 1999;62(l):32-7.

68. Lyons AB, Samuel K, Sanderson A, Maddy AH: Simultaneous analysis of immunophenotype and apoptosis of murine thymocytes by single laser flow cytometry. Cytometry 13:809-821, 1992.

69. Ma DD, Varga DE, Biggs JC. Donor marrow progenitors (CFU-Mix, BFU-E and CFU-GM) and haemopoietic engraftment following HLA matched sibling bone marrow transplantation. Leuk Res 1987;11(2): 141-7.

70. Ma Y, Zou P, Xiao J, Huang SA: Expression of survivin in cord- blood CD34(+) stem/progenitor cells and its significance. Zhonghua Xue Ye; Xue Za Zhi. 2003 May;24(5):23 8-40.

71. Ma Y, Zou P: Functional expression of CD95/Fas antigen and Bcl-2 on cord blood hematopoietic progenitor cells. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci: 2002;22(l):24-7.

72. Maianski NA, Roos D, Kuijpers TW. Bid truncation, bid/bax targeting to the mitochondria, and caspase activation associated with neutrophil apoptosis are inhibited by granulocytecolony-stimulating factor. J Immunol. 2004 Jun 1;172(11):7024-30.

73. Majno G, Joris I: Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol 146:3-16, 1995.

74. Majno G, Joris I: Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol 146:3-16,1995.

75. MangXiao, Douglas C. Dooley: Assessment of Cell Viability and Apoptosis in Human Umbilical Cord Blood Following Storage. Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research. Feb 2003, Vol. 12, No. 1:115-122

76. Mayani H, Alvarado-Moreno JA, Flores-Guzman P: Biology of human hematopoietic stem and progenitor cells present in circulation. Arch Med Res 2003;34(6):476-88.

77. Haneline LS, Marshall KP, Clapp DW. The highest concentration of primitive hematopoietic progenitor cells in cord blood is found in extremely premature infants. Pediatr Res 1996;39(5):820-5.

78. Mayani H, Lansdorp PM. Biology of human umbilical cord blood-derived hematopoietic stem/progenitor cells. Stem Cells 1998;16:153-65.

79. Mazel S, Burtrum D, Petrie HT. Regulation of cell division cycle progression by bcl-2 expression: A potential mechanism for inhibition of programmed cell death. J Exp Med 1996; 183:2219-2226.

80. McConkey DJ, Nicotera P, Hartzell P, Bellomo G, Wyllie AH, Orrenius S: Glucocorticoids acticvate a suicide process in thymocytes through an elevation of cytosolic Ca21 concentration. Arch Biochem Biophys 269:365-370, 1989.

81. Migliaccio G, Baiocchi M, Hamel N, Eddleman K, Migliaccio AR. Circulating progenitor cells in human ontogenesis: response to growth factors and replating potential. J Hematother 1996;5(2): 161-70.

82. Miller LK. An exegesis of IAPs: Salvation and surprises from BIR motifs. Trends Cell Biol 1999;9:323-328.

83. Nagafuji K, Takenaka K, Niho Y: Fas antigen expression on human hematopoietic progenitor cells. Nippon Rinsho. 1996 Jul;54(7):1790-6.

84. Nakahata T, Ogawa M. Hemopoietic colony-forming cells in umbilical cord blood with extensive capability to generate mono- and multipotential hemopoietic progenitors. Journal of Clinical Investigation 1982;70:1324-8.

85. Niho Y, AsanoY. Fas/Fas ligand and hematopoietic progenitor cells. Curr Opin Hematol 1998; 5:163-165.

86. O'Reilly LA, Huang DC, Strasser A. The cell death inhibitor Bcl-2 and its homologues influence control of cell cycle entry. Embo J1996; 15: 6979-6990

87. Park JR, Bernstein ID, Hockenbery DM. Primitive human hematopoietic precursors express Bcl-x but not Bcl-2. Blood 1995; 86: 868-876.

88. Peters R, Leyvraz S, Perey L. Apoptotic regulation in primitive hematopoietic precursors. Blood 1998; 92: 2041-2052.

89. Phillips RL, Ernst RE, Brunk B, et al. The genetic program of hematopoietic stem cells. Science 2000; 288: 1635-1640.

90. Piacentini M, Fesus I, Farrace MG, Ghibelli L, Piredda L, Meline G: The expression of "tissue" transglutaminase in two human cancer cell lines is related to with the programmed cell death (apoptosis). Eur J Cell Biol 54:246-254, 1995.

91. Prasad KV, Ao Z, Yoon Y, et al. CD27, a member of the tumor necrosis factor receptor family, induces apoptosis and binds to Siva, a proapoptotic protein. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:6346-6351.

92. Rathmell JC, Thompson CB. The central effectors of cell death in the immune system. Annu Rev Immunol 1999; 17: 781-828.

93. Reed JC, Bischoff JR. BIR inging chromosomes through cell division—and survivin' the experience. Cell 2000; 102: 545-548.

94. Rodriguez L, Garcia J, Querol S. Predictive utility of the attached segment in the quality control of a cord blood graft. Biol Blood Marrow Transplant. 2005 Apr;l 1(4):247-51.

95. Rubinstein P., Rubinstein P., Carrier C., Scaradavou A., et al. Outcomes among 562 recipients of placental-blood transplants from unre-lated donors. N Engl J Med 1998; 339(22): 1565-77.

96. Sanz C, Benito A, Inohara N, Ekhterae D, Nunez G, Fernandez-Luna JL. Specific and rapid induction of the proapoptotic protein Hrk after growth factor withdrawal in hematopoietic progenitor cells. Blood 2000; 95: 2742-2747.

97. Saxonhouse MA, Rimsza LM, Christensen RD, Hutson AD, Stegner J, Koenig JM, Sola MC. Effects of anoxia on megakaryocyte progenitors derived from cord blood CD34pos cells. Eur J Haematol. 2003 Nov;71(5):359-65.

98. Scaffidi C, Fulda S, Srinivasan A, et al. Two CD95 (APO-l/Fas) signaling pathways. EMBO J1998; 17:1675-1687.

99. Schmid I, Krall WJ, Uttenbogaart, Braun J, Giorgi JV: Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry 13:204-208,1992.

100. Shimizu S, Eguchi Y, Kamiike W et al. Induction of apoptosis as well as necrosis by hypoxia and predominant prevention of apoptosis by Bcl-2 and Bcl-XL. Cancer Res 1996;56:2161-2166.

101. Siegel RM, Frederiksen JK, Zacharias DA, et al. Fas preassociation required for apoptosis signaling and dominant inhibition by pathogenic mutations. Science 2000; 288: 2354-2357.

102. Smith S, Broxmeyer HE. The influence of oxygen tension on the long-term growth in vitro of haematopoietic progenitor cells from human cord blood. Br J Haematol 1986;63(l):29-34.

103. Spitzer G, Verma DS, Fisher R, Zander A, Vellekoop L, Litam J, McCredie KB, Dicke KA. The myeloid progenitor cell—its value in predicting hematopoietic recovery after autologous bone marrow transplantation. Blood 1980;55(2):317-23.

104. Stennicke H.R., Salvesen G.S. Biochemical characteristics of caspases-3, -6, -7, and -8. // J. Biol. Chem., 1997, Vol. 272, P. 25719-15723.

105. Strasser A. Apoptosis: Death of a T-cell. //Nature, 1995, Vol.373, N.6513, P. 385-386.

106. Sun B, Bai CX, Feng K, Li L, Zhao P, Pei XT. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of CD34(+) hematopoietic stem/progenitor cells and their response to cytokines. Sheng Li Xue Bao. 2000 Apr;52(2):143-6.

107. Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, et al. Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature 1999; 397: 441-446.

108. Takenaka K, Nagafuji K, Harada M, et al. In vitro expansion of hematopoietic progenitor cells induces functional expression of Fas antigen (CD95). Blood 1996; 88: 2871-2877.124. Thomas E.D., 2000

109. Traycoff CM, Abboud MR, Laver J, Brandt JE, Hoffman R, Law P, Ishizawa L, Srour EF. Evaluation of the in vitro behavior of phenotypically defined populations of umbilical cord blood hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol 1994;22(2):215-22.

110. Tsujimoto Y, Shimizu S, Eguchi Y, KamiikeW, Matsuda H. Bcl-2 and Bcl-xL block apoptosis as well as necrosis: possible involvement of common mediators in apoptotic and necrotic signal transduction pathways. Leukemia 1997;11 (Suppl. 3):380-382.

111. Ura H, Hirata K, Katsuramaki T. Mechanisms of cell death in hypoxic stress. Nippon Geka Gakkai Zasshi 1999;100:656-662 (in Japanese).

112. Uren AG, Beilharz T, O'Connell MJ, et al. Role for yeast inhibitor of apoptosis (IAP)-like proteins in cell division. Proc Natl Acad Sei USA 1999; 96: 10170-10175.

113. Valtieri M, Gabbianelli M, Pelosi E, Bassano E, Petti S, Russo G, Testa U, Peschle C. Erythropoietin alone induces erythroid burst formation by human embryonic but not adult BFU-E in unicellular serum-free culture. Blood 1989;74(l):460-70.

114. Vaux DL: Toward an understanding of the molecular mechanisms of physiological celldeath. Proc Natl Acad Sei U S A 90:786-789, 1993.

115. Verhagen AM, Ekert PG, Pakusch M, et al. Identification of DIABLO, a Mammalian Protein that Promotes Apoptosis by Binding to and Antagonizing IAP Proteins. Cell 2000; 102: 43

116. Walczak H, Krammer PH. The CD95 (APO-l/Fas) and the TRAIL (APO-2L) apoptosis systems. Exp Cell Res 2000; 256: 58-66.

117. Wiesmann A, Phillips RL, Mojica M, et al. Expression of CD27 on murine hematopoieticstem and progenitor cells. Immunity 2000; 12: 193-199.

118. Wilimas JA, Wall JE, Fairclough DL, Dancy R, Griffin C, Karanth S, et al.: A longitudinal study of granulocyte colony-stimulating factor levels and neutrophil counts in newborn infants. J Pediatr Hematol Oncol 1995,17: 176-179.

119. Wyllie AH, Arends MJ, Morris RG, Walker SW, Evan G: The apoptosis endonuclease and its regulation. Seminars Immunol 4:389-398, 1992.

120. Wyllie AH: Apoptosis and the regulation of cell numbers in normal and neoplastic tissues: An overview. Cancer Metast Rev 11:95-103,1992.

121. Xiao J, Zou P, Huang SA, Hu ZB, Liu LB, You Y: Role of apoptosis in cryoinjury of cord blood hematopoietic stem/progenitor cells and its mechanism. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2004 Feb;12(l):90-4.

122. Xiao M, Dooley DC. Assessment of cell viability and apoptosis in human umbilical cord blood following storage. J Hematother Stem Cell Res. 2003 Feb;12(l):l 15-22.

123. Zamai L, Falcieri E, Marhefka G, Vitale M: Supravital exposure to propidium iodide identifies apoptotic cells in the absence of nucleosomal DNA fragmentation. Cytometry 23:303-311,1996.