Закономерности функционирования АТР-зависимой Lon-протеиназы E. coli и ее мутантных форм тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Мельников, Эдвард Эдуардович

• Мельников, Эдвард Эдуардович
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Мельников, Эдвард Эдуардович

Список сокращений

Введение

Структура и функция АТР-зависимых протеиназ Е. coli обзор литературы)

1. Сериновая Ьоп-протеиназа

1.1. Эндогенные субстраты Ьоп-протеиназы

1.2. Ферментативная активность Ьоп-протеиназы in vitro

1.3. Структура пептидгидролазного центра Ьоп-протеиназы

2. Металлозависимая FtsH-протеиназа

3. С1р-протеиназы

3.1. АТР-азные компоненты С1р(А/Х)Р-протеиназ

3.2. Пептидгидролазный компонент сериновых С1р(А/Х)Р-протеиназ

3.3. Треониновая HslUV (ClpYQ)-npoTenHa3a

4. Структурная гомология регуляторных компонентов

АТР-зависимых протеиназ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Закономерности функционирования АТР-зависимой Lon-протеиназы E. coli и ее мутантных форм»

Функционирование иротеолитических ферментов внутри клетки направлено на поддержание гомеостаза. Условно можно выделить две основные функции протеиназ, имеющие существенное значение для жизнеспособности организмов: регуляторную и деструктивную.

В первом случае протеолитические ферменты осуществляют процессинг белков и контроль содержания в клетке регуляторных белков.

Во втором случае протеолиз позволяет устранять нефункциональные "балластные" белки, образующиеся, например, при случайной ошибочной экспрессии генов, в результате временного пребывания организма под влиянием общих факторов стресса (биохимическое голодание, экстремальные значения температуры, повреждающее излучение, химическое воздействие и т.п.), или чужеродные белки. Деструктивный протеолиз носит "защитный" характер и направлен на обеспечение организма аминокислотным и пептидным материалом.

Установлено, что ключевую роль при внутриклеточном протеолизе играют энергозависимые ферменты, сопрягающие протеолитическую активность с гидролизом АТР. Эти протеиназы отличаются достаточно сложной структурной организацией, выраженной субстратной селективностью и выполняют, по-видимому, комплексную функцию (проявляют свойства и деструктивных протеиназ и регуляторных).

Lon-протеиназа Е. coli - первый обнаруженный представитель АТР-зависимых протеиназ. Можно указать на следующие структурно-функциональные особенности этого фермента, отличающие его от классических протеиназ: (1) зависимость протеолиза от гидролиза АТР; (2) высокая селективность по отношению к белкам-мишеням; (3) процессивный характер деградации белков при отсутствии специфичности по отношению к расщепляемой пептидной связи; (4) наличие четвертичной структуры (гомоолигомер); (5) локализация АТР-азиого и пептидгидролазного центра в пределах одной полипептадной цепи.

В настоящее время установлено, что ферменты, сопрягающие протеолитическую активность с АТР-азной (в том числе и Lon-протеиназы) широко представлены в клетках самых разнообразных организмов. В Е. coli обнаружено уже несколько АТР-зависимых иротеолитических ферментов.

Несмотря на относительные успехи в изучении функции этих ферментов на клеточном уровне методами биохимической генетики, основные молекулярноэнзимологические проблемы, общие для АТР-зависимых протеиназ, во многом не решены и представляют собой весьма актуальную научную задачу. Важное значение имеют вопросы, связанные с выяснением принципов узнавания этими ферментами своих субстратов (проблема селективности) и принципов сопряжения гидролиза АТР и протеолиза (проблема сопряжения).

В представляемой работе эти проблемы рассматриваются при исследовании функционирования in vitro Lon-протеиназы Е. coli.

Структура и функция АТР-зависимых протеиназ Е. coli (обзор литературы)

Внутриклеточный протеолиз играет важную роль в поддержании определенного уровня белка, необходимого живой клетае [1]. Можно выделить следующие группы белков, подвергающиеся внутриклеточной деградации:

1) нефункциональные (аномальные) белки (неправильно свернутые и мутантные белки, белки, синтезированные с аномальными аминокислотами, укороченные белки); такие белки являются нестабильными и подвергаются быстрой деградации как у прокариот, так и у эукариот [1,2];

2) короткоживущие белки, необходимые клетке в течение ограниченного периода времени или при специфических метаболических условиях (примерами таких белков служат белки, выполняющие свои функции в условиях стресса [3]);

3) белки, "лишенные партнеров", стабильные в составе олигомерных комплексов отдельные субъединицы таких белков, образующиеся в результате недостаточного или избыточного биосинтеза, подвергаются быстрой деградации и считаются "условными субстратами" [4].

В цитозоле, ядре и митохондриях эукариотических клеток и в цитоплазме бактериальных клеток внутриклеточная деградация осуществляется главным образом мультимерными АТР-зависимыми протеиназами. Протеолитическая активность этих ферментов сопряжена с гидролизом АТР. Это свойство АТР-зависимых протеиназ выделяет их в особую группу протеолитических ферментов. Среди ферментов из прокариот наиболее исследованы Lon- и С1р-протеиназы Е. coli [5]. У эукариот значительная часть внутриклеточного протеолиза осуществляется 26S протеасомными комплексами [6].

В представляемом обзоре обобщены сведения о структурной организации и основных свойствах энергозависимых ферментов внутриклеточной деградации белков, функционирующих в Escherichia coli.

В клетках Е. coli обнаружено несколько растворимых АТР-зависимых протеиназ [7-12]: Lon, ClpAP, ClpXP (сериновые протеиназы) и HslUV (или ClpYQ, каталитически активный остаток пептидгидролазного центра - треонин). Обнаружена также мембрано-связанная Zn-зависимая металлопротеиназа - FtsH (или Hfl В) [13].

В Lon- и FtsH-протеиназах протеолитический и АТР-азный центры локализованы в одной полипептидной цепи, и эти ферменты функционируют как гомоолигомеры (иногда их относят к внутриклеточным белкам типа AAA

ATPase Accosiated with a variety of cellular Activities).

ClpAP, ClpXP и HslUV (ClpYQ) относятся к типу протеиназ, связанных с шаперонами (Chaperon Linked Proteases), и представляют собой гетроолигомеры, состоящие из протеолитических (ClpP и HslV) и регуляторных (ClpA, ClpX и HslU) субъединиц. Регуляторные субъединицы (АТР-азы) обладают шапероноподобными свойствами.

In vivo АТР-зависимые протеиназы проявляют высокую селективность по отношению к своим белковым мишеням: Lon-протеиназа участвует в деградации белков SulA [14], RscA [15], N-белка фага X [16]; субстратами протеиназы ClpAP in vivo являются MazE [17] и некоторые гибридные белки, полученные на основе ß-галактозидазы [18]; ClpXP проявляет избирательность по отношению к О-белку фага X [10, 19], а также к ряду других белков [20-22]; одним из установленных субстратов FtsH является фактор с32 [13, 23].

Наряду с протеолизом, рассматриваемые протеиназы (по результатам исследования как in vivo, так и in vitro) могут осуществлять АТР-зависимое изменение конформации белков (белковое ремоделирование), функционируя, таким образом, подобно молекулярным шаперонам [24].

1. Сериновая Lon-протеиназа

Ьоп(Ьа)-протеиназа из E.coli - исторически первая энергозависимая протеиназа [25-27], выделенная из экстрактов E.coli как фермент, требующий наличия АТР для деградации казеина [26]. Протеиназа La впоследствии была идентифицирована в работах [26, 27] как продукт гена Ion и получила название Lon-протеиназы.

Клонирование гена Ion и определение его структуры было осуществлено одновременно в лаборатории химии протеолитических ферментов Института б.иоорганичеек0Н,химви.■.■РАН-[28.]. и вл1абаратории,-проф^ АХ^. Goldberg^ США. .

29]. ." . . 7 ^ . "V :

Регуляторная последовательность гена Ion содержит--418-п.н. Структурная часть этого гена кодирует белок, состоящий из 784 аминокислотных остатков [28]. Анализ первичной структуры Lon-протеиназы с учетом данных о ее ферментативной активности позволил выдвинуть предположение о том, что субъединица Lon-протеиназы имеет функционально-доменную организацию [30] и состоит из центрального АТР-азного домена (A-домен), содержащего так называемые мотивы Уолкера А и В, ответственные за продуктивную для гидролиза АТР координацию трифосфата нуклеотида и иона Mg2+ в АТР-азном центре [31]; С-концевого - протеолитического домена (Р-домен), включающего каталитически активный остаток серина 679 [32] (рис.1); N-концевой часта (N-домен), вариабельной в подсемействе Ьоп-протеиназ.

1 107 566 784

Мотив А Мотив В

Рис. 1. Схема строения Lon-протеиназы Escherichia coli. Показаны границы предполагаемых доменов, локализация мотивов А и В Уолкера и фрагмента, включающего каталитический остаток серина.

По первичной структуре Ьоп-протеиназа не обнаруживает гомологии с другими известными протеиназами (в том числе и сериновыми). Молекула фермента представляет собой гомоолигомер, образованный субъединицами с молекулярной массой 87,4 кДа. Методом гель-фильтрации в препаратах Lon-протеиназы были обнаружены тетра- и октамерные формы [33]. Физиологически активная форма Ьоп-протеиназы, вероятно, представляет собой тетрамер [34, 35]. Существуют наблюдения, свидетельствующие в пользу кооперативного функционирования активных центров фермента [33, 34].

Интересное и малоизученное свойство фермента - его способность связываться с ДНК [36]. Следует отметить, что впервые Ьоп-протеиназа была выделена именно как ДНК-связывающий белок [37], что, в свою очередь, позволило предположить ее участие в регуляции экспрессии генов. В работе [36] показано, что одноцепочечпая ДНК активирует протеолитическую и белок-активируемую АТР-азную активность фермента; мРНК и тРНК не обладают таким действием [33]. В работе [38] установлено, что Ьоп-протеиназа специфически связывается с TG-богатыми участками нуклеотидной последовательности ДНК. Физиологическая роль связывания ДНК к настоящему времени не определена.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Мельников, Эдвард Эдуардович

выводы

1. Изучены кинетические аспекты функционирования Ьоп-протеиназы. Выявлена регуляторная роль свободных ионов Mg2+ - активатора протеолитической и пептидгидролазной активности фермента и ингибитора базовой АТР-азной активности (для физиологических концентраций АТР и магния). Показано, что активация гидролиза АТР при связывании белкового субстрата сопровождается устранением ингибирующего действия ионов Mg2+.

2. Получены и охарактеризованы формы Ьоп-протеиназы E.coli с мутациями в АТР-азном домене: K362Q, Т363А, D387N, D423N, Y493F. Установлено ключевое значение остатков К362 и Т363 из мотива А Уолкера АТР-азного центра не только для катализа гидролиза АТР, но и для сопряжения гидролиза АТР и протеолиза. Показано, что остаток D387 не является каталитически активным, как было постулировано в литературе. Продемонстрировано формальное участие в системе передачи сигнала остатков D423 из мотива В Уолкера и Y493.

3. Выявлено отсутствие прямой корреляции между АТР-азной и пептидгидролазной активностями при функционировании как нативного фермента, так и его мутантных форм.

4. Подтверждено существование в Ьоп-иротеиназе дополнительного центра связывания белкового субстрата, локализованного вне протеолитического домена фермента.

5. Показано, что мутации в АТР-азном центре Ьоп-протеиназы понижают стабильность четвертичной структуры фермента. Высказано предположение о локализации АТР-азных центров в области контакта субъединиц.

6. Обнаружено, что ADP-Mg- (ингибитор нативной Ьоп-протеиназы) активирует пептидгидролазный центр в субъединице фермента, содержащего мутацию K362Q. Постулировано существование в нативном ферменте двух путей передачи сигнала ог АТР-азных центров к протеолитическим виутрисубъединичного и межсубъединичного.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Мельников, Эдвард Эдуардович, 1999 год

1. Goldberg A.L. Degradation of abnormal proteins in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1972, v.69, pp.422-426.

2. Goldberg A.L., John ASC. Intracellular protein degradation in mammalian and bacterial cells // Ann. Rev. Biochem., 1976, v.45, pp.747-803.

3. Gottesman S., Maurizi M.R. Regulation by proteolysis: energy-dependent proteases and their targets // Microbiol.Rev., 1992, pp. 592-621.

4. Gottesman S. Proteases and their targets in Escherichia coli II Ann. Rev. Genet., 1996, v. 30, pp. 465-506.

5. Maurizi M.R. Degradation in vitro of bacteriophage lambda N protein by Lon protease from Escherichia coli II J. Biol. Chem., 1987, v. 262, pp. 2696-2703.

6. Koster A.J., Walz J., Lupas A., Baumeister W. Structural features of the archaebacterial and eukariotic proteasome // Mol. Biol. Rep., 1995, v. 21, pp. 120.

7. Goldberg A.E. The mechanism and functions of ATP-dependent proteases in bacterial and animal cells // Eur. J. Biochem., 1992 , v. 203, pp. 9-23.

8. Gottesman S., Maurizi M.R. Regulation by proteolysis: Energy-dependent proteases and their targets // Microbiol. Rev., 1992 ,v. 56, pp. 592-621.

9. Maurizi M.R. Proteases and protein degradation in Escherichia coli II Experientia, 1992, v. 48, pp. 178-201.

10. Wojtkowiak D., Georgopoulos C., Zylicz, M. ClpX, a new specificity component of the ATP-dependent Escherichia coli Clp protease, is potentionally involved in X DNA replication // J. Biol. Chem., 1993, v.268, pp. 22609-22617.

11. Kessel M., Wu W.-F., Gottesman S., Kocsis E., Steven A., Maurizi M.R. Six-fold rotational symmetry of ClpQ, the E.coli homolog of the 20S proteasome, and its ATP-dependent activator, ClpY // FEBS Lett., 1996, v. 398, pp. 274-278.

12. Mizusawa S., Gottesman S. Protein degradation in Escherichia coli : the lon gene controls the stability of the SulA protein // Proc. Natl. Acad. Sei. USA,1983,v. 80, pp. 358-362.

13. Torres-Cabassa A.S., Gottesman S. Capsule synthesis in Escherichia coli K-12 is regulated by priteolysis // J. Bacteriol., 1987, v. 169, pp. 987-989.

14. Gottesman S., Gottesman M.E., Shaw J. E., Pearson M.L. Protein degradation in E. coli: the lon mutation and bacteriophage lambda N and ell protein stability // Cell, 1981, v. 24, pp. 225-233.17