Выявление и характеристика легионелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Новокшонова, Ирина Владимировна

• Новокшонова, Ирина Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Новокшонова, Ирина Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Легионеллезная инфекция и её возбудитель

1.1.1. Характеристика легионеллезной инфекции

1.1.2. Биология и таксономия легионелл

1.1.3. Методы выявления и идентификации легионелл в клиническом материале и объектах окружающей среды

1.1.3.1.-1.1.3.2. Методы выделения и идентификации легионелл из объектов окружающей среды

1.1.3.3. Методы исследования клинических образцов на наличие легионелл

1.2. Особенности экологии легионелл, значение в распространении легионеллеза

1.2.1. Взаимодействие легионелл с простейшими и другими микроорганизмами

1.2.2. Биопленки легионелл

1.2.3. Особенности колонизации потенциально опасных водных систем

1.2.4. Методы профилактики легионеллеза, используемые в потенциально опасных водных системах различного типа

_Тос215476315ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ МЕТОДЫ

2.1. Штаммы легионелл

2.2. Методы культивирования легионелл

2.3. Бактериологическое выделение легионелл из воды и биоплёнок

2.4. Определеление легионелл методом ГТЦР-РВ в воде и биопленках

2.5.Типирование легионелл с помощью панели моноклональных АТ

2.6. Изучение биопленок легионелл методами электронной микроскопии

2.7. Определение чувствительности легионелл к действию дезинфицирующих препаратов

2.8. Статистические методы обработки результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка порядка обследования градирен

3.2. Предварительная оценка уровня контаминации легионеллами градирен промышленных предприятий

3.3. Сравнительная характеристика уровня контаминации градирен легионеллами в Московском и Уральском регионах

3.4. Оценка уровня контаминации градирен с помощью ПЦР в реальном времени

3.5. Изучение серологического разнообразия штаммов легионелл, циркулирующих в воде градирен промышленных предприятий

3.6. Анализ морфологических особенностей формирования природных биопленок легионелл в ассоциации с другими микроорганизмами в водных системах охлаждения промышленных предприятий

3.7. Анализ эффективности ряда биоцидов на легионеллы в условиях эксперимента и градирни промышленного предприятия

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выявление и характеристика легионелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий»

ВВЕДЕНИЕ

Хотя легионеллезная инфекция известна уже более 30 лет, достаточно хорошо разработаны методы её диагностики и лечения, возбудитель, по-прежнему, представляет существенную угрозу общественному здоровью.

Эпидемические вспышки и спорадические случаи легионеллеза выявляют повсеместно.Среди наиболее заметных эпидемических вспышек легионеллеза в 21 веке, например в Испании 2002 г. (470 случаев/9 летальных), во Франции в 2004 г. (86/16), в Норвегиии в 2005 г. (55/10), в Германиии в 2010 г. (64/5), в Шотландиии в 2012 г. (90/3). Эпидемическая вспышка легионеллеза в Российской Федерации - г. Верхняя Пышма в 2007 г., во время которой заболели более 100 человек, при этом зарегистрировано 5 летальных исходов (7).

Первые достоверные случаи заболевания в России зарегистрировали в 1980 году. В нашей стране исследования неизвестного ранее возбудителя и вызываемой им инфекции возглавил академик РАМН C.B. Прозоровский. Под его руководством были изучены основные биологические свойства штаммов легионелл, выделенных из разных источников, разработаны эффективные лабораторные методы диагностики болезни легионеров, изучены

эпидемиологические особенности легионеллезов в России (C.B. Прозоровский C.B., 1979; В.И. Васильева с соавт.,1986; В.И.Покровский с соавт.,1995; И.С. Тартаковский, 2001).

Вода пресных водоемов является основной средой обитания легионелл. Но наличия природных хозяев - свободноживущих в воде и почве амеб и простейших, в которых легионеллы паразитируют при благоприятных температурных условиях (выше 25 °С) недостаточно для достижения возбудителем высоких концентраций, представляющих угрозу человеку. Если бы концентрация легионелл в природных пресноводных водоемах представляла опасность для человека и заболевание было бы контагиозным, то легионеллез давно занял бы место среди наиболее распространенных инфекций человека. К

счастью, этого не происходит поскольку размножиться до опасной для человека концентрации возбудитель может только в определенных типах искусственных водных систем.

Наиболее часто эпидемические вспышки легионеллеза связаны с контаминацией легионеллами водных систем охлаждения (градирен) (5,15). Водные системы охлаждения являются обязательным элементом как централизованных систем кондиционирования воздуха так и производственных циклов промышленных предприятий. Для обозначения данных систем в мировой литературе используется термин - «cooling tower» (охладительная башня, градирня). Системы данного типа, а не «пресловутые бытовые кондиционеры» или приточно-вытяжная вентиляция являются реальными источниками распространения легионелл, при определенных обстоятельствах способных вызвать эпидемические вспышки и спорадические случаи болезни легионеров.

В водном контуре систем охлаждения циркулирует несколько десятков тысяч литров воды при температуре 30-35 °С. В процессе циркуляции в зависимости от конструкции системы 0,1-2 % воды распространяется из охладительной башни в виде водного аэрозоля с размером капель 1-100 мкм. Капли диаметром менее 5 мкм могут легко попадать в альвеолы легких человека, где вирулентные штаммы легионелл проникают в альвеолярные макрофаги и начинают размножаться. В зависимости от высоты башни и метеорологических условий аэрозоль может распространяться на значительное расстояние и вызывать инфекцию у людей. По данным Европейской рабочей группы по легионеллезу (EWGLI) с 2002 по 2007 годы в европейских странах зарегистрированы 44 эпидемические вспышки, связанные с контаминацией градирен (15, 97).

В Российской Федерации до настоящего времени отсутствовала необходимая методическая база и исследования по анализу уровня контаминации легионеллами водных систем охлаждения не проводились.

Сложность количественной оценки легионелл в сочетании с высокой устойчивостью к дезпрепаратам создают существенные трудности в оценке уровня контаминации и потенциальной опасности водных систем охлаждения. Мониторинг легионелл в водных системах охлаждения промышленных предприятий и определение частоты и количественного уровня их контаминации легионеллами, является одним из наиболее перспективных подходов. Выбор в качестве объекта исследования водных систем охлаждения промышленных предприятий важен с учетом особенностей эксплуатации данных потенциально опасных водных систем в России. Для централизованных систем кондиционирования с водным охлаждением в России характерна сезонная эксплуатация (отключены в зимний период), в отличие от США и Европейских стран, где данные системы эксплуатируют круглогодично. В то же время водные системы охлаждения промышленных предприятий в России, как и за рубежом, эксплуатируют круглогодично, что создает благоприятные условия для накопления в высоких концентрациях легионелл. По этой причине именно данный объект представлял наибольший интерес для изучения в качестве экологической ниши.

Цель и задачи исследования

Цель работы: изучить особенности колонизации легионеллами водных систем охлаждения промышленных предприятий, определить частоту и количественный уровень их контаминации легионеллами.

Задачи исследования:

1. Разработать методику количественного мониторинга легионелл в водных системах охлаждения промышленных предприятий на основе бактериологического метода и ПЦР в реальном времени.

2. Установить частоту и уровень контаминации легионеллами водных систем охлаждения промышленных предприятий.

3. Охарактеризовать серологическое разнообразие легионелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий с помощью международной панели моноклональных антител.

4. Изучить особенности природных биопленок легионелл в ассоциации с другими микроорганизмами в водных системах охлаждения промышленных предприятий.

5. Изучить активность биоцидов, применяемых в водных системах охлаждения промышленных предприятий, на биопленки легионелл.

6. Внедрить современные принципы и методы мониторинга легионелл в водных системах охлаждения промышленных предприятий в систему государственного санитарно-гигиенического нормирования.

Научная новизна работы:

- Впервые установлена частота и уровень контаминации легионеллами водных системах охлаждения промышленных предприятий в Российской Федерации.

- Впервые охарактеризовано серологическое разнообразие штаммов легионелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий. Показано, что в водных системах данного типа преобладают штаммы Legionella pneumophila серогруппы 1 - наиболее значимые в этиологии эпидемических вспышек внебольничных легионеллезных пневмоний.

Показано, что присутствие природных биопленок, содержащих легионеллы на поверхности градирни, является маркером эпидемически значимого уровня контаминации воды градирни легионеллами.

- Впервые изучены морфологические особенности природных биопленок легионелл в ассоциации с другими микроорганизмами в водных системах охлаждения промышленных предприятий.

- Изучена активность ряда биоцидов, применяемых в водных системах охлаждения промышленных предприятий, на моновидовые биопленки легионелл и в градирнях промышленных предприятий.

Практическая значимость работы:

• Разработан порядок обследования, позволяющий выявлять контаминированные легионеллами участки и зоны потенциально опасных водных объектов в водных системах охлаждения промышленных предприятий на основе скрининга с помощью ПЦР-РВ, с последующим бактериологическим подтверждением.

• Разработанный порядок обследования водных систем охлаждения промышленных предприятий включен в комплекс профилактических мероприятий за соблюдением требований санитарного законодательства, направленный на предупреждение контаминации легионеллами до эпидемически значимых концентраций потенциально опасных водных объектов - Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.2.2626 - 2010 «Профилактика легионеллеза».

Материалы диссертации доложены на X съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, апрель 2012), на Пленуме Научного совета по экологии и гигиене окружающей среды РАМН (Москва, 2009), на международной конференции «Legionella 2009» (Париж, 2009), 25 и 26. конференциях Европейской рабочей группы по легионеллезу (Копенгаген, 2010; Вена, 2011).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Новокшонова, Ирина Владимировна

ВЫВОДЫ

1. На основе разработанной методики с использованием видоспецифической ПЦР в реальном времени и бактериологического метода впервые охарактеризованы частота и уровень колонизации легионеллами градирен промышленных предприятий Московского и Уральского регионов Российской Федерации. Показано, что частота колонизации градирен составляла от 73 % до 80 % от общего числа обследованных градирен (43 градирни). Уровень колонизации градирен колебался в диапазоне от 1,0x102 до 3,6x10Э КОЕ на литр воды.

2. Анализ серологического разнообразия легионелл, циркулирующих в водных системах охлаждения промышленных предприятий показал, что в водных системах данного типа преобладают штаммы Legionella pneumophila серогруппы 1 (40 %) - наиболее значимые в этиологии эпидемических вспышек внебольничных легионеллезных пневмоний Выделение изолятов 2х и более различных серогрупп L.pneumophila в 56 % исследованных образцов воды градирен свидетельствует о выраженном серологическом разнообразии легионелл в потенциально опасных водных системах данного типа.

3. Показано, что присутствие природных биопленок, содержащих легионеллы, на поверхности градирни является маркером эпидемически значимого уровня контаминации воды градирни легионеллами.

4. Анализ морфологических особенностей природных ассоциативных биопленок легионелл с другими микроорганизмами в водных системах охлаждения промышленных предприятий с помощью электронно-микроскопических методов исследования (сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии) показал, что природные биопленки градирен представляют собой сообщества легионелл, грибов и водорослей, причем диатомовые водоросли являются основным каркасным элементом природной биопленки. С помощью рентгеновского микроструктурного анализа показано наличие в биопленках включений различных металлов, в том числе, титана и железа, что указывает на взаимосвязь формирования природных биопленок с процессами коррозии градирни.

5. Анализ действия на легионеллы хлор и бром содержащих биоцидов №1со 81аЬгех ЭТ40 и Реггос1с1 8580 на модели моновидовых биопленок в концентрации 30 мг/л при времени контакта от 24 до 72 часов соответственно, показал их высокую эффективность. Применение препарата Реггос1с1 8580 на работающей градирне, контаминированной легионеллами, позволило полностью элиминировать легионелл из потенциально опасной водной системы в течение 7 дней.

По теме диссертации опубликовано 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК. На основании полученных результатов в практику здравоохранения внедрены СП 3.1.2.2626-10 «Профилактика легионеллеза» и МР 02.039-09 «Выявление и количественное определение легионелл в водных образцах внешней среды методом полимеразной цепной реакции в реальном времени».

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Новокшонова, Ирина Владимировна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гинцбург A.JL, Шандала М.Г., Тартаковский И.С., Пантелеева Л.Г., Карпова Т.И., Демина Ю.В., Новокшонова И.В., Дронина Ю.Е. Опыт применения в градирнях промышленного предприятия дезинфицирующих средств для профилактики легионеллеза. Дезинфекционное дело, 2010, 1:50-53.

2. Дронина Ю.Е., Карпова Т.И., Садретдинова О.В., Диденко Л.В, Тартаковский И.С. Особенности формирования биопленок легионелл в искусственных и природных водных системах. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2012, 4:76-80.

3. MP 011/14633-8-34 «Выявление антигена бактерий Legionella pneumophila серогруппы 1 в клиническом материале иммунохроматографическим методом», - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008, с. 7.

4. MP 02.039 - 09 «Выявление и количественное определение легионелл в водных образцах внешней среды методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием тесте-систем производства ЗАО «Синтол» - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009.

5. МУ 3.1.2.2412 - 08 «Эпидемический надзор за легионеллезной инфекцией» М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008.

6. МУК 4.2.2217 - 0 7 «Выявление бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды», - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007, с. 27.

7. Онищенко Г.Г., Покровский В.И., Тартаковский И.С. и др. Современные взгляды на эпидемиологию легионеллеза: алгоритм действия при эпидемических вспышках и профилактическом мониторинге. Журн. Микробиол., 2008 ,2:5 -9.

8. Покровский В.И., Прозоровский С.В., Малеев В.В.,Тартаковский И.С. Этиологическая диагностики и этиотропная терапия острых пневмоний. Медицина, Москва, 1995.

9. Прозоровский С.В., Васильева В.И., Тартаковский И.С. Выявление болезни легионеров на территории СССР. Журн. микробиол., 1980,7:105107.

10. Прозоровский С.В., Покровский В.И., Тартаковский И.С. Выявление случаев легионеллеза среди больных острыми пневмониями. Сов. мед., 1982, 3:96-98.

11. Прозоровский С.В., Покровский В.И., Тартаковский И.С. Болезнь легионеров. Москва «Медицина», 1984, с. 67-80.

12. Тартаковский И.С., Прозоровский С.В., Попов В.Л. Выделение первых штаммов Legionella pneumophila в СССР. Журн. микробиол., 1983, 11: 41 -45.

13. Тартаковский И.С., Болезнь легионеров: итоги 25-летнего изучения инфекции, проблемы и перспективы исследования. Вестник РАМН., 2001,11:11-14.

14. Тартаковский И.С. Мониторинг и контроль потенциально опасных водных объектов как основной путь профилактики легионеллеза. Вода: химия и экология. 2009, 2:28-35.

15. Темежникова Н.Д., Тартаковский И.С. Легионеллёзная инфекция. Москва «Медицина», 2007, с. 287.

16. Abraham W.R. Controlling biofilms of gram-positive pathogenic bacteria. Curr Med Chem. 2006; 13( 13): 1509-24.

17. Adeleke A.A., Fields B.S., Benson R.F., Daneshvar M.I., Pruckler J.M., Ratcliff R.M., Harrison T.G., Weyant R.S., Birtles R.J., Raoult D., Halablab M.A. Legionella drozanskii sp. nov., Legionella rowbothamii sp. nov. and Legionella fallonii sp. nov.: three unusual new Legionella species. Int J Syst Evol Microbiol. 2001 May;51(Pt 3):1151-60.

18. Atlas R.M. Legionella: from environmental habitats to disease pathology, detection and control. Environ Microbiol. 1999 Aug; l(4):283-93.

19. Barbeau J., Gauthier C., Payment P. Biofilms, infectious agents, and dental unit waterlines: a review. Can J Microbiol. 1998 Nov; 44(11):1019-28.

20. Benson R.F., Fields B.S. Classification of the genus Legionella. Semin Respir Infect. 1998 Jun; 13(2):90-9.

21. Berry D., Xi C., Raskin L. Microbial ecology of drinking water distribution systems. Curr Opin Biotechnol. 2006 Jun; 17(3):297-302.

22. Blanc D.S., Carrara P., Zanetti G., Francioli P. Water disinfection with ozone, copper and silver ions, and temperature increase to control Legionella: seven years of experience in a university teaching hospital. J Hosp Infect. 2005 May; 60(l):69-72.

23. Borella P., Guerrieri E., Marchesi I., Bondi M., Messi P. Water ecology of Legionella and protozoan: environmental and public health perspectives. Biotechnol Annu Rev. 2005; 11:355-80.

24. Brenner D.J., Steigerwalt A.G., McDade J.E. Classification of the Legionnaires' disease bacterium: Legionella pneumophila, genus novum, species nova, of the family Legionellaceae, familia nova. Ann Intern Med. 1979 Apr; 90(4):656-8.

25. Cazalet C., Rusniok C., Bruggemann H., Zidane N., Magnier A., Ma L., Tichit M., Jarraud S., Bouchier C., Vandenesch F., Kunst F., Etienne J., Glaser P., Buchrieser C. Evidence in the Legionella pneumophila genome for exploitation of host cell functions and high genome plasticity. Nat Genet. 2004 Nov; 36(11):1165-73.

26. Chen Y.S., Liu Y.C., Lee S.S., Tsai H.C., Wann S.R., Kao C.H., Chang C.L., Huang W.K., Huang T.S., Chao H.L., Li C.H., Ke C.M., Lin Y.S. Abbreviated duration of superheat-and-flush and disinfection of taps for Legionella disinfection: lessons learned from failure. Am J Infect Control. 2005 Dec; 33(10):606-10.

27. Chien M., Morozova I., Shi S., Sheng H., Chen J., Gomez S.M., Asamani G., Hill K., Nuara J., Feder M., Rineer J., Greenberg J.J., Steshenko V., Park S.H., Zhao B., Teplitskaya E., Edwards J.R., Pampou S., Georghiou A., Chou I.C., Iannuccilli W., Ulz M.E., Kim D.H., Geringer-Sameth A., Goldsberry C., Morozov P., Fischer S.G., Segal G., Qu X., Rzhetsky A., Zhang P., Cayanis E., De Jong P.J., Ju J., Kalachikov S., Shuman H.A., Russo J.J. The genomic sequence of the accidental pathogen Legionella pneumophila. Science. 2004 Sep 24; 305(5692):1966-8.

28. Colbourne J.S., Dennis P.J. Distribution and persistence of Legionella in water systems. Microbiological Sciences. 1985, 2:40-43.

29. Cooper A, Barnes HR, Myers ER. Assessing risk of Legionella. ASHRAE Journal.2004, 46(4):22-26.

30. Costa J., Tiago I., da Costa M.S., Verissimo A. Presence and persistence of Legionella spp. in groundwater. Appl Environ Microbiol. 2005 Feb; 71(2):663-71.

31. Cuhna B.A. Clinical features of Legionnaires Disease. Seminars in Respiratory Infection. 1998, 13(2): 116-127.

32. Den Boer J.W., Yzerman E.P. Diagnosis of Legionella infection in Legionnaires' disease. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2004 Dec; 23(12):871-8.

33. Donlan R.M., Forster T., Murga R., Brown E., Lucas C., Carpenter J., Fields B. Legionella pneumophila associated with the protozoan Hartmannella vermiformis in a model multi-species biofilm has reduced susceptibility to disinfectants. Biofouling. 2005; 21(1): 1-7.

34. Drozanski W. Fatal bacterial infection in soil amoebae. Acta Microbiol Pol. 1956; 5(3-4):315-7.

35. Edelstein P.H. Improved semiselective medium for isolation of Legionella pneumophila from contaminated clinical and environmental specimens. J Clin Microbiol. 1981 Sep; 14(3):298-303.

36. Edelstein P.H., Snitzer J.B., Bridge J.A. Enhancement of recovery of Legionella pneumophila from contaminated respiratory tract specimens by heat. J Clin Microbiol. 1982 Dec; 16(6): 1061-5.

37. Edelstein P.H., Meyer R.D. Legionella pneumonias. 1994. In: Pennington JE .Respiratory infections, diagnosis and management, New York, Raven Press Ltd.

38. Enright M.C., Spratt B.G. Multilocus sequence typing. Trends Microbiol. 1999 Dec; 7(12):482-7.

39. European Guidelines for control and prevention of travel associated legionellosis.2002.

40. Exner M., Kramer A., Lajoie L., Gebel J., Engelhart S., Hartemann P. Prevention and control of health care-associated waterborne infections in health care facilities. Am J Infect Control. 2005 Jun; 33(5 Suppl l):S26-40.

41. Feeley J.C., Gibson R.J., Gorman G.W., Langford N.C., Rasheed J.K., Mackel D.C., Baine W.B. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. J Clin Microbiol. 1979 Oct; 10(4):437-41.

42. Fields B.S. The molecular ecology of legionellae. Trends in Microbiology. 1996, 4:286-290.

43. Fields B.S., Benson R.F., Besser R.E. Legionella and Legionnaires' disease: 25 years of investigation. Clin Microbiol Rev. 2002 Jul; 15(3):506-26.

44. Feeley J.C., Gorman G.W., Weaver R.E. Primary isolation media for Legionnaires diasease bacterium. Clin Microbiol. 1978 Oct; vol.8:320-325.

45. Fliermans C.B. Philosophical Ecology: Legionella in Historical Perspective. State of the Art Lecture. In Proceedings of the 2nd international symposium Legionella, Atlanta, USA, 1983; 285-289.

46. Fox K.F., Brown A. Application of numerical systematics to the phenotypic differentiation of legionellae. J Clin Microbiol. 1989 Sep; 27(9):1952-5.

47. Fry N.K., Warwick S., Saunders N.A., Embley T.M. The use of 16S ribosomal RNA analyses to investigate the phylogeny of the family Legionellaceae. J Gen Microbiol. 1991 May; 137(5): 1215-22.

48. Fry N.K., Bangsborg J.M., Bernander S., Etienne J., Forsblom B., Gaia V., Hasenberger P., Lindsay D., Papoutsi A., Pelaz C., Struelens M., Uldum S.A., Visca P., Harrison T.G. Assessment of intercentre reproducibility and epidemiological concordance of Legionella pneumophila serogroup 1 genotyping

by amplified fragment length polymorphism analysis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2000 Oct; 19(10):773-80.

49. Fry N.K., Bangsborg J.M., Bergmans A., Bernander S., Etienne J., Franzin L., Gaia V., Hasenberger P., Baladron Jimenez B., Jonas D., Lindsay D., Mentula S., Papoutsi A., Straelens M., Uldum S.A., Visca P., Wannet W., Harrison T.G. Designation of the European Working Group on Legionella Infection (EWGLI) amplified fragment length polymorphism types of Legionella pneumophila serogroup 1 and results of intercentre proficiency testing Using a standard protocol. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2002 Oct; 21(10):722-8.

50. Fry N.K., Afshar B., Visca P., Jonas D., Duncan J., Nebuloso E., Underwood A., Harrison T.G. Assessment of fluorescent amplified fragment length polymorphism analysis for epidemiological genotyping of Legionella pneumophila serogroup 1. Clin Microbiol Infect. 2005 Sep; 11(9):704-12.

51. Gaia V., Fry N.K., Harrison T.G., Peduzzi R. Sequence-based typing of Legionella pneumophila serogroup 1 offers the potential for true portability in legionellosis outbreak investigation. J Clin Microbiol. 2003 Jul; 41(7):2932-9.

52. Gaia V., Fry N.K., Afshar B., Luck P.C., Meugnier H., Etienne J., Peduzzi R., Harrison T.G. Consensus sequence-based scheme for epidemiological typing of clinical and environmental isolates of Legionella pneumophila. J Clin Microbiol. 2005 May; 43(5):2047-52.

53. Garrity G.M., Brown A., Vickers R.M. Tatlockia and Fluoribacter: two new genera og organisms resembling Legionella pneumophila. Int J Syst Bacteriol. 1980; 30:609-14.

54. Geary DF.New guidelines on Legionella. ASHRAE Journal.2000, 42(9):44-49.

55. George J.R., Pine L., Reeves M.W., Harrell W.K. Amino acid requirements of Legionella pneumophila. J Clin Microbiol. 1980 Mar; 11(3):286-91.

56. Gilbart J. Detecction of Legionella spp. in Water Samples by Electron-Captur Gas Chromatography. In Proceedings of the 2nd international symposium Legionella, Atlanta, USA, 1983; 296-298.

57. Gimenez D.F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 1964 May; 39:135-40.

58. Gomez-Lus P., Fields B.S., Benson R.F., Martin W.T., O'Connor S.P., Black C.M. Comparison of arbitrarily primed polymerase chain reaction, ribotyping, and monoclonal antibody analysis for subtyping Legionella pneumophila serogroup 1. J Clin Microbiol. 1993 Jul; 31 (7): 1940-2.

59. Gorelik O., Lazarovich Z., Boldur I., Almoznino-Sarafian D., Alon I., Modai D., Cohen N. Legionella in two splenectomized patients. Coincidence or causal relationship? Infection. 2004 Jun; 32(3): 179-81.

60. Harrison T.G., Uldum S., Alexieu-Daniel S.et.al., A multicenter evaluation of the Biotest legionella urinary antigen EIA.Clinical microb. and Infection, 1998, 4(7):359-365.

61. Health and Safety Commission and Executive. Legionnaire's disease. The control of legionella bacteria in water systems. Approved code of practice and guidance. 2000.

62. Hebert G.A. Hippurate hydrolysis by Legionella pneumophila. J Clin Microbiol. 1981 Jan; 13(l):240-2.

63. Helbig J.H., Kurtz J.B., Castellanii Pastoris M.C., Pelaz C., Luck P.C. Antigenic lipopolysaccharide components of Legionella pneumophila recognized by monoclonal antibodies: possibilities and limitations for division of the species into serogroups. J Clin Microbiol. 1997, 35(11):2841-5.

64. Helbig J.H., Uldum S.A., Luck P.C., Harrison T.G. Detection of Legionella pneumophila antigen in urine samples by the BinaxNOW immunochromatographic assay and comparison with both Binax Legionella Urinary Enzyme Immunoassay (EIA) and Biotest Legionella Urin Antigen EIA. J Med Microbiol. 2001 Jun; 50(6):509-16.

65. Huerta M., Castel H., Grotto I., Shpilberg O., Alkan M., Harman-Boehm I. Clinical and epidemiologic investigation of two Legionella-Rickettsia co-infections. Isr Med Assoc J. 2003 Aug; 5(8):560-3.

66. ISO standard: Water quality-detection and enumeration of Legionella. 1998.

67. Ito S., Karnovsky M.J. Formaldehyde/glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds, J. Cell Biol. 1968, 39:168a-9a.

68. Janssen P., Coopman R., Huys G., Swings J., Bleeker M., Vos P., Zabeau M., Kersters K. Evaluation of the DNA fingerprinting method AFLP as an new tool in bacterial taxonomy. Microbiology. 1996 Jul; 142 ( Pt 7):1881-93.

69. Jimenez-Lucho V., Shulman M., Johnson J. Bordetella bronchiseptica in an AIDS patient cross-reacts with Legionella antisera. J Clin Microbiol. 1994 Dec; 32(12):3095-6.

70. Joly J.R., McKinney R.M., Tobin J.O., Bibb W.F., Watkins I.D., Ramsay D. Development of a standardized subgrouping scheme for Legionella pneumophila serogroup 1 using monoclonal antibodies. J Clin Microbiol. 1986 Apr; 23(4):768-71.

71. Jonas D., Meyer H.G., Matthes P., Hartung D., Jahn B., Daschner F.D., Jansen B. Comparative evaluation of three different genotyping methods for investigation of nosocomial outbreaks of Legionnaires' disease in hospitals. J. Clin Microbiol. 2000 Jun; 38(6):2284-91.

72. Joseph C. European surveillance of travel-associated Legionnaires disease.Eurosurveillance, 2004, 9(2), 15-18.

73. Katz S.M., Hammel J.M. The effect of drying, heat, and pH on the survival of Legionella pneumophila. Ann Clin Lab Sci. 1987 May-Jun; 17(3): 150-6.

74. Koide M., Saito A. Diagnosis of Legionella pneumophila infection by polymerase chain reaction. Clin.Infect.Dis., 1995, 21:199-201.

75. Kool J.L., Buchholz U., Peterson C., Brown E.W., Benson R.F., Pruckler J.M., Fields B.S., Sturgeon J., Lehnkering E., Cordova R., Mascola L.M., Butler J.C. Strengths and limitations of molecular subtyping in a community outbreak of Legionnaires' disease. Epidemiol Infect. 2000 Dec; 125(3):599-608.

76. Legionella and the prevention of Legionellosis.WH0.2006.

77. Lindsay D.S., Abraham W.H., Findlay W., Christie P., Johnston F., Edwards G.F. Laboratory diagnosis of legionnaires' disease due to Legionella pneumophila serogroup 1: comparison of phenotypic and genotypic methods. J. Med Microbiol. 2004 Mar; 53(Pt 3): 183-7.

78. Liu Z., Lin Y.E., Stout J.E., Hwang C.C., Vidic R.D., Yu V.L. Effect of flow regimes on the presence of Legionella within the biofilm of a model plumbing system. J. Appl Microbiol. 2006 Aug; 101(2):437-42.

79. Lo Presti F., Riffard S., Vandenesch F., Reyrolle M., Ronco E., Ichai P., Etienne J. The first clinical isolate of Legionella parisiensis, from a liver transplant patient with pneumonia. J. Clin Microbiol. 1997 Jul; 35(7): 1706-9.

80. Loret J.F., Robert S., Thomas V., Cooper A.J., McCoy W.F., Levi Y. Comparison of disinfectants for biofilm, protozoa and Legionella control. J. Water Health. 2005 Dec; 3(4):423-33.

81. Luck P.C., Helbig J.H., Drasar V., Bornstein N., Fallon R.J., Castellani-Pastoris M. Genomic heterogenicity amongst phenotypically similar Legionella micdadei strains. FEMS Microbiol. Lett. 1995 Feb 1; 126(1):49-54.61.

82. Mampel J., Spirig T., Weber S.S., Haagensen J.A., Molin S., Hilbi H. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl Environ Microbiol. 2006 Apr; 72(4):2885-95.

83. Management of spa pools: controlling the risk of infection.2006.London.Health Protection Agency.

84. McDade J.E., Shepard C.C., Fraser D.W., Tsai T.R., Redus M.A., Dowdle W.R. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. N Engl J Med. 1977 Dec 1; 297(22): 1197-203.

85. McKinney R. M. et al. Antigenic and genetic variation in Legionella pneumophila serogroup 6.J. Clin. Microbiol. 1989, 27 (4): 738-742.

86. Medzhitov R., Janeway C.A., Jr. Decoding the patterns of self and nonself by the innate immune system. Science. 2002 Apr 12; 296(5566):298-300.

87. Mermel L.A., Josephson S.L., Giorgio C.H., Dempsey J., Parenteau S. Association of Legionnaires' disease with construction: contamination of potable water? Infect Control Hosp Epidemiol. 1995 Feb; 16(2):76-81.

88. Molofsky A.B., Swanson M.S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 2004 Jul; 53(l):29-40.

89. Muder R.R., Yu V.L. Infection due to Legionella species other than L. pneumophila. Clin Infect Dis. 2002 Oct 15; 35(8):990-8.

90. Murdoch D.R. Diagnosis of Legionella infection. Clin Infect Dis. 2003 Jan 1; 36(l):64-9.

91. Murga R., Forster T.S., Brown E., Pruckler J.M., Fields B.S., Donlan R.M. Role of biofilms in the survival of Legionella pneumophila in a model potable-water system. Microbiology. 2001 Nov; 147(Pt 11):3121-6.

92. Neuman G.R., Jasani B., Williams E.D., The reservation of ultras tructure and antigenicity. J.Microscopy. 1982,127:RP5-6.

93. Neumeister B. Intracellular multiplication of Legionella species and the influence of amoebae on their intracellular growth in human monocytes: mono mac 6 cells and Acanthamoeba castellanii as suitable in vitro models. Methods Mol Biol. 2004; 268:141-51.72.

94. Pasculle A.W., Feeley J.C., Gibscon R.J. Pittsburgh pneumonia agent direct isolasion from human lung tissue. J. Infect. Dis. 1980, 141:727-732.

95. Paszco-Kolva C., Yamamoto H., Shahamat M., and Colwell R.R. Polymerase Chain Reaction, Gene Probe, and Direct Fluorescent Antibody Staining of Legionella pneumophila Serogroup 1 in Drinking Water and Environmental Samples. Legionella, Current Status and Emerging Perspectives; Washington, 1993,181-183.

96. Piao Z., Sze C.C., Barysheva O., Iida K., Yoshida S. Temperature-regulated formation of mycelial mat-like biofilms by Legionella pneumophila. Appl Environ Microbiol. 2006 Feb; 72(2): 1613-22.

97. Pine L., George J.R., Reeves M.W., Harreil W.K. Development of a chemically defined liquid medium for growth of Legionella pneumophila. J. Clin Microbiol. 1979 May; 9(5):615-26.

98. Pourcel C., Vidgop Y., Ramisse F., Vergnaud G., Tram C. Characterization of a tandem repeat polymorphism in Legionella pneumophila and its use for genotyping. J Clin Microbiol. 2003 May; 41(5): 1819-26.

99. Pruckler J.M., Mermel L.A., Benson R.F., Giorgio C., Cassiday P.K., Breiman R.F., Whitney C.G., Fields B.S. Comparison of Legionella pneumophila isolates by arbitrarily primed PCR and pulsed-field gel electrophoresis: analysis from seven epidemic investigations. J Clin Microbiol. 1995 Nov; 33(11): 2872-5.

100. Ricketts K.D., Joseph C., Lee J., Wewalka G. Survey onlegistation regarding wet cooling systems European countries. Eurosurveiilance, 2008,13: 373-377.

101. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high ph as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell. Biol., 1963,17(1):201-212.

102. Riffard S., Lo Presti F., Vandenesch F., Forey F., Reyrolle M., Etienne J. Comparative analysis of infrequent-restriction-site PCR and pulsed-field gel electrophoresis for epidemiological typing of Legionella pneumophila serogroup 1 strains. J Clin Microbiol. 1998 Jan; 36(1): 161-7.

103. Rogers J., Keevil C.W. Immunogold and fluorescein immunolabelling of Legionella pneumophila within an aquatic biofilm visualized by using episcopic differential interference contrast microscopy. Appl Environ Microbiol. 1992 Jul; 58(7):2326-30.

104. Rogers J., Dowsett A.B., Dennis P.J., Lee J.V., Keevil C.W. Influence of plumbing material on biofilm formation and growth of Legionella pneumophila in a potable water systems. Appl Environ Microbiol. 1994; 6:1842-51.

105. Rogers J., Dowsett A.B., Keevil C.W. A paint incorporating silver to control mixed biofilms containing Legionella pneumophila. J. Ind Microbiol. 1995 Oct; 15(4):377-83.

106. Rowbotham T.J. Pontiac fever explained? Lancet. 1980 Nov 1; 2(8201):969.

107. Scaturro M., Losardo M., De Ponte G., Ricci M.L. Comparison of three molecular methods used for subtyping of Legionella pneumophila strains isolated during an epidemic of Legionellosis in Rome. J Clin Microbiol. 2005 Oct; 43(10):5348-50.

108. Schwartz T., Hoffmann S., Obst U. Formation of natural biofilms during chlorine dioxide and u.v. disinfection in a public drinking water distribution system. J Appl Microbiol. 2003;95(3):591-601.

109. Shadrach W.S., Rydzewski K., Laube U., Holland G., Ozel M., Kiderlen A.F., Flieger A. Balamuthia mandrillaris, free-living ameba and opportunistic agent of encephalitis, is a potential host for Legionella pneumophila bacteria. Appl Environ Microbiol. 2005 May; 71(5):2244-9.

110. Steele T.W. Legionnaires' disease in South Australia, 1979-1988. Med J Aust. 1989 Sep 18; 151(6):322, 5-6, 8.

111. Steinmetz I., Rheinheimer C., Hubner I., Bitter-Suermann D. Genus-specific epitope on the 60-kilodalton Legionella heat shock protein recognized by a monoclonal antibody. J Clin Microbiol. 1991 Feb; 29(2):346-54.

112. Stout JE, Yu V.L. Legionellosis. New England Journal of Medicine. 1997.337:682-687.

113. Storey M.V., Langmark J., Ashbolt N.J., Stenstrom T.A. The fate of legionellae within distribution pipe biofilms: measurement of their persistence, inactivation and detachment. Water Sci Technol. 2004; 49(11-12):269-75.

114. Surman S.B., Morton L., Keevil C. Growth of Legionella pneumophila in aquatic biofilms is not dependent on intracellular multiplication. In: Keevil CW et.al. Biofilm in the aquatic environment.Cambridge, 1999.160-170.

115. Thomas V., Bouchez T., Nicolas V., Robert S., Loret J.F., Levi Y. Amoebae in domestic water systems: resistance to disinfection treatments and implication in Legionella persistence. J Appl Microbiol. 2004; 97(5):950-63.

116. Valsangiacomo C., Baggi F., Gaia V., Balmelli T., Peduzzi R., Piffaretti J.C. Use of amplified fragment length polymorphism in molecular typing of Legionella pneumophila and application to epidemiological studies. J Clin Microbiol. 1995 Jul; 33(7): 1716-9.

117. van Belkum A., Struelens M., de Visser A., Verbrugh H., Tibayrenc M. Role of genomic typing in taxonomy, evolutionary genetics, and microbial epidemiology. Clin Microbiol Rev. 2001 Jul; 14(3):547-60.

118. van der Kooij D., Veenendaal H.R., Scheffer W.J. Biofilm formation and multiplication of Legionella in a model warm water system with pipes of copper, stainless steel and cross-linked polyethylene. Water Res. 2005 Aug; 39(13):2789-98.

119. Walker J.T., Bradshaw D.J., Bennett A.M., Fulford M.R., Martin M.V., Marsh P.D. Microbial biofilm formation and contamination of dental-unit water systems in general dental practice. Appl Environ Microbiol. 2000 Aug; 66(8):3363-7.

120. Wellinghausen N., Frost C., Marre R. Detection of Legionella in hospital water samples by quantative real-time lightcycler PCR. Appl. And Environm. Microbiol., 2001, 67(9):3985-3993.

121. WHO Recommended Surveillance Standarts. 1999.

122. William T. Martin, James M. Barbaree, and James C. Feeley. Detecction and Quantitation of Legionella pneumophila by Immune Autoradiography. In Proceedings of the 2nd international symposium Legionella; Atlanta, USA, 1983; 299-300.

123. Wilson D.A., Yen-Liberman B., Reischl U. et.al. Detection of Legionella pneumophila by real-time PCR for the mip gene. J.clin.microb., 2003., 41(7):3327-3330.

124. Uzel A., Ucar F., Hames-Kocabas E.E. Prevalence of Legionella pneumophila serogroup 1 in water distribution systems in Izmir province of Turkey. Apmis. 2005 Oct; 113(10):664-9.