Симбиоз Burkholderia cenocepacia с почвенными простейшими в разных экологических условиях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Каминская, Анастасия Александровна

• Каминская, Анастасия Александровна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Каминская, Анастасия Александровна

Введение.

Обзор литературы

Глава 1. Симбиоз с простейшими кяк стратегия существования патогенных бактерии в почвах и водоемах

1.1. Общие сведения об экологии свободноживущих простейших и патогенных бактерий.

1.2. Ультраструктурные закономерности внутриклеточного паразитизма бактерий в простейших.

1.3. Некоторые молекулярно-генетические механизмы паразитизма патогенных бактерий в простейших.

1.4. Покоящиеся (некультивируемые) формы патогенных бактерий.

Глава 2. Роль бактсрнальпо-протозоГшых ассоциаций в формировании бноплсиок.

Глава 3. Материалы и методы исследований

3.1. Культивирование и идентификация Burkholderia cenocepacia.

3.2. Культивирование инфузорий.

3.3. Совместное культивирование Burkholderia cenocepacia и Tetrahymena pyriformis.

3.4. Количественный учет Burkholderia cenocepacia и Tetrahymena pyriformis

3.5. Подготовка проб и постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР).

3.6. Постановка протистоцидного теста для оценки гетерогенности популяции Burkholderia cenocepacia по признаку цитопатогенности.

3.7. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия для ультраструктурного анализа бактериалыю-протозойной ассоциации.

3.8. Статистическая обработка результатов.

Результаты исследований

Глава 4. Вегетативные и покоящиеся формы в популяции Burkholderia cenocepacia в процессе взаимодействия с простейшими

4.1. Моделирование бактериалыю-протозойной ассоциации в искусственных и естественной средах.

4.2. Влияние абиотических (температура и рН) и биотических (простейшие) факторов на переход буркхолдерий в покоящееся (некультивируемое) состояние.

4.3. Адаптивная изменчивость популяции B.cenocepacia и условия длительной резервации покоящихся форм.

Глава 5. Роль ассоциации простейших Tetrahymena pyriphormis и бактерий Burkholderia cenocepacia в формировании биоплеиок

5.1. Свойства исходного штамма В. cenocepacia 370 и его изогенных

5.2. Технология получения биопленок в ассоциации Burkholderia cenocepacia и Tetrahymena pyriformis.

5.3. Качественная оценка сформировавшихся биопленок.

5.4. Количественная оценка планктонных популяций бактерий и инфузорий.

Глава 6. Ультраструктурный анализ ассоциации Tetrahymena pyriformis и Burkholderia cenocepacia в биоплепке с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Симбиоз Burkholderia cenocepacia с почвенными простейшими в разных экологических условиях»

В общей эпидемиологии и концепции природной очаговости инфекционных болезней до недавнего времени господствовали традиционные представления о циркуляции возбудителей как практически единственной форме их существования - в виде непрерывных эпидемических и эпизоотических процессов. В последние десятилетия, по мере накопления сведений о закономерных перерывах в циркуляции патогенных микроорганизмов в природе и обществе, формировались представления о межэпизоотических и межэпидемических периодах - как сезонных, так и многолетних. В условиях, затрудняющих или исключающих циркуляцию возбудителей, она сменяется стадией резервации - устойчивым их сохранением, в том числе в окружающей среде - почвах и водоемах (Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., 1997; Литвин В.Ю., 1986; 1991; Литвин В.Ю. и др., 1998; Пушкарева В.И., 1997).

В настоящее время хорошо известна способность многих патогенных бактерий существовать и размножаться в объектах внешней среды - почвах, водоемах и др. (Литвин В.Ю. и др., 1998). Относительно недавно установлено (Литвин В.Ю. и др., 2000; Collwell R.R. et.al., 1985; 1996; Oliver J.D., 1993 ), что неблагоприятные для существования и размножения условия среды неспорообразующие бактерии способны переживать, переходя в покоящееся, некультивируемое состояние (НС). Оно определено как состояние бактериальных клеток, проявляющих метаболическую активность, но не способных к непрерывному клеточному делению, необходимому для роста на жидких или плотных средах. При смене условий существования клетки могут быть рекультивированы, т.е. могут вновь приобрести способность к размножению и росту на обычных средах. Феномен перехода в НС в последнее время привлекает пристальное внимание исследователей, поскольку образование некультивируемых форм (НФ), по-видимому, может обеспечивать сохранение патогенных бактерий в межэпидемические и межэпизоотические периоды. Способность к переходу в НС к настоящему времени выявлена для многих (более 30 видов) патогенных бактерий ( в основном грамотрицательных), в том числе и для псевдомонад 4 видов.

Известно, что основным местообитанием псевдомонад и буркхолдерий в природе является ризосфера растений (маис, пасленовые, лилейные), где они существенно влияют на другие виды за счет продукции антифунгальных, бактерицидных и антипротозойных веществ. Указывается на симбиотические связи этих возбудителей со свободноживущими почвенными простейшими, которые могут служить резервуарпыми хозяевами для возбудителей сапронозных инфекций, в том числе и для Burkholderia cepacia (cenocepacia) (Пушкарева В.И., 1994).

Оставалось неизвестным, способны ли Burkholderia cenocepacia переходить в покоящееся состояние и каковы абиотические и биотические факторы, участвующие в этом процессе.

Биопленки как «фиксированная» форма существования микроорганизмов в окружающей среде известна давно (Сукачев В.Н., 1947). Патогенные бактерии, основной средой обитания которых являются почвы и водоемы (холерные вибрионы, легионеллы, листерии, кампилобактеры, клебсиеллы, сальмонеллы, псевдомонады) прикрепляются к «неживым» субстратам - почвенным частицам или существуют в различных ассоциациях: с водорослями, ризосферой растений, простейшими, ракообразными и другими организмами. Изучение экологических закономерностей формирования биопленок дает возможность выявить роль абиотических и биотических факторов в реализации данной стратегии существования микроорганизмов в природе.

Псевдомонады и экологически близкий им род Burkholderia являются возбудителями болезней человека, животных и растений (синегнойная инфекция, сап, мелиоидоз, гниль лука и др.). B.cenocepacia вызывает внутриболышчные инфекции прежде всего у лиц, страдающих кистозным фиброзом (муковисцидозом) и хроническим гранулематозом, у иммунокомпрометированных больных, а также у пациентов, при лечении которых использовали катетеры и имплантаты (искусственные клапаны сердца, линзы, челюстно-лицевые протезы и др.). Установлено, что бактерии способны колонизировать поверхности различных материалов, образуя биопленки (Donlan R.M., Costerton J.W., 2002; Gauthier Y. et. al., 1989; Girardeau J.P., 1982). Доказана способность буркхолдерий формировать биопленки на пораженных органах и тканях (Шагинян И.А., Данилина Г.А., 2007).

Выявлены тесные биоценотические связи В. cepacia (cenocepacia) с почвенными и водными простейшими (амебами, инфузориями) - основными природными хозяевами и резервуарами многих потенциально патогенных бактерий (Пушкарева В.И., 1994; 2006; Пушкарева В.И. и др., 1992; 2005; Landers P. et. al., 2000; Marolda C.L. et. al., 1999), однако их участие в формировании биопленок неизвестно.

Цель данной работы - оценка возможности и условий перехода Burkholderia cenocepacia в некультивируемое (покоящееся) состояние, а также способности к формированию биопленок в сообществе с простейшими.

Задачи:

1. Оценить структуру и численность популяции B.cenocepacia в разных экологических условиях при параллельном использовании бактериологического метода и тест-системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2. Определить возможность перехода B.cenocepacia в покоящееся состояние при воздействии ряда абиотических и биотических факторов.

3. Изучить фенотипическую изменчивость основных свойств буркхолдерий в разных экологических условиях.

4. Разработать методические подходы для получения и количественной оценки биопленок, формируемых бактериально-протозойным сообществом в искусственных и естественных средах.

5. На ультраструктурном уровне с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (KJICM) продемонстрировать динамику взаимодействий буркхолдерий с фагоцитирующими простейшими и исход внутриклеточных событий в планктонных и биопленочных сообществах.

Научная новизна:

- Впервые описан переход B.cenocepacia в покоящееся (некультивируемое) состояние при взаимодействии с почвенными простейшими T.pyriformis и в их отсутствие. Установлены динамика и сроки этого процесса при температурах, соответствующих холодному сезону в почвах умеренных широт.

- Выявлены не известные ранее изменения культурально-морфологических свойств, биохимической активности и пигментообразования вегетативных клеток буркхолдерий в разных экологических условиях.

- Впервые разработана оригинальная технология получения биопленок, сформированных бактериально-протозойной ассоциацией на модели (B.cenocepacia + T.pyriformis) и выявлена ведущая роль инфузорий в их образовании.

- Впервые с помощью KJICM детально охарактеризована в динамике ультраструктура планктонных и биопленочных (неподвижных) клеток бактерий и простейших. Установлен паразито-хозяинный тип симбиотических отношений при обеих формах существования.

Практическая значимость работы

Важная роль простейших в активной жизнедеятельности B.cenocepacia и их длительной резервации в объектах окружающей среды определяют целесообразность микробиологического анализа бактериалыю-протозойных ассоциаций при мониторинге как природных водоемов, так и объектов окружающей среды стационаров. Такой анализ должен включать, наряду с традиционными методами, применение тест-систем на основе ПЦР для выявления некультивируемых (покоящихся) форм буркхолдерий.

Оригинальный метод, представленный в диссертации, оформлен в виде Методических рекомендаций: «Технология получения бактериально-протозойных биопленок» (2007г), утвержденных на совете по внедрению научных достижений в практику в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Технология получения бактериально-протозойных биопленок для ультраструктурного изучения методом KJICM может найти применение в научно-исследовательских учреждениях, занимающихся проблемами симбиологии, экологии бактерий и простейших в природных экосистемах.

Материалы диссертации представлены на VI международном конгрессе Экватек - 2004 «Вода: экология и технология» (Москва, 2004), на 1-й и 2-й Всероссийских научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005; Рязань, 2007), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007).

Материалы диссертации используются при чтении лекций студентам кафедры инфектологии ГОУ ВПО ММА им. Сеченова.

По результатам исследований опубликованы 6 работ.

Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Каминская, Анастасия Александровна

Выводы

1. Впервые установлено образование покоящихся (некультивируемых) форм у Burkholderia cenocepacia. Бактериальные клетки буркхолдерий в почвенной вытяжке переходили в покоящееся (некультивируемое) состояние при низкой температуре (4°С) уже через 9 суток. В ассоциации с простейшими образование покоящихся форм замедлялось до 2 месяцев.

В температурном режиме 25°С Burkholderia cenocepacia в некультивируемое состояние не переходили - как в ассоциации с инфузориями Tetrahymena pyriformis, так и без них, в «бедной» и «богатых» средах.

2. В длительных экспериментах (4 месяца) при смене «летнего» температурного режима на «зимний» выявлена изменчивость ряда важных свойств Burkholderia cenocepacia: замедление роста на плотных средах до 4-7 суток; S-R диссоциация; снижение скорости ряда биохимических реакций; уменьшение оксидазной активности и пигментоообразования. Выявлена связь цитопатогенности в популяции Burkholderia cenocepacia с пигментообразованием: в протистоцидном тесте цитопатогенность буркхолдерий снижалась с уменьшением числа пигментообразующих клонов.

3. Впервые в естественной среде получены биопленки, сформированные бактериями Burkholderia cenocepacia, а также их ассоциацией с почвенными инфузориями. Установлена стимулирующая роль простейших в накоплении пленочной биомассы.

4. Установлено, что в ассоциации с простейшими мутантные штаммы буркхолдерий резко повышали способность к формированию биопленок, в том числе штамм Bcb-.

5. Впервые методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии исследована ультраструктура бактериалыю-протозойных сообществ (планктонных и биопленочных) в динамике. Продемонстрирована частичная утилизация планктонных буркхолдерий в пищеварительных вакуолях инфузорий. Устойчивые к перевариванию бактериальные клетки сохранялись неизмененными, размножались, вызывали гибель простейших и накапливались в окружающей среде.

6. Симбиотические отношения в бактериально-протозойных биопленках складывались по типу «паразит - хозяин». Как и в планктонных ассоциациях, благодаря незавершенности фагоцитоза поддерживались существование и численность бактериальной популяции в биопленках. Цитопатогенное действие буркхолдерий возрастало по мере созревания биопленок. В биопленочной ассоциации формировались особые «микроколонии» буркхолдерий на месте их выхода из разрушенных фагосом.

Заключение

Оценка состава и численности B.cenocepacia в разных экологических условиях, с параллельным использованием бактериологического метода и ПЦР, приводит к следующим заключениям. В стерильной воде, как при 4°С, так и при 25°С буркхолдерии не переходили в некультивируемое состояние на протяжении срока наблюдений (4 месяца). Однако в ассоциации с инфузориями при низкой температуре буркхолдерии не выявлялись через 2 месяца ни бактериологически, ни при ПЦР-анализе. Очевидно, это свидетельствует о выедании бактерий простейшими.

Длительное совместное существование буркхолдерий с инфузориями при оптимальной температуре (25°С) свидетельствует об установлении симбиотических отношений по типу «паразит - хозяин», аналогичных установленным ранее для разных бактерий - иерсиний, листерий, эризипелотриксов, а также псевдомонад 5 видов (Пушкарева В.И., 1994; Литвин В.Ю. и др., 1998).

Весьма отчетливо проявлялось влияние температуры среды на состояние и численность бактериальной популяции. Так, в почвенной вытяжке при 25°С популяция бактерий длительно существовала как совместно с инфузориями, так и в их отсутствие. Напротив, низкая температура (4°С) индуцировала в тех же условиях переход буркхолдерий в покоящееся (некультивируемое) состояние, причем без простейших этот процесс протекал гораздо быстрее: уже на 9 - е сутки рост прекращался при положительных результатах ПЦР-анализа. Инфузории поддерживали существование буркхолдерий в вегетативном состоянии до 2 месяцев, а через 3 и 4 месяца ПЦР-анализ продолжал регистрировать покоящиеся бактериальные клетки, сохранявшиеся в среде, а, возможно, и внутри образовавшихся цист инфузорий.

В поверхностных горизонтах почв и водоемов умеренных широт столь низкие температуры характерны для зимних сезонов и можно полагать, что буркхолдерии способны переживать их, переходя в покоящееся состояние параллельно с формированием цист и иных зимующих форм простейших. О резервуарной роли почвенных амеб рода Acanthamoeba свидетельствуют существование и размножение в них В. cepacia (cenocepacia) (Landers P. et. al., 2000; Marolda C.L.et. al., 1999). Ранее это было доказано при детальном ультраструктурном анализе внутриклеточного паразитизма Pseudomonas (Burkholderia) cepacia (cenocepacia) в инфузориях Tetrahymena pyriformis (Пушкарева В.И. и др., 1992).

В ходе длительных экспериментов популяция В. cenocepacia продемонстрировала высокую экологическую пластичность в различных температурных условиях: это и S - R диссоциация, и снижение ферментативной активности при низкой температуре, и замедление роста, и, наконец, образование покоящихся бактериальных клеток. Особо следует отметить изменчивость пигментообразования, которое снижалось (вплоть до отсутствия) по мере перехода популяции буркхолдерий в покоящееся (некультивируемое) состояние. Важной представляется связь пигментообразования с цитопатогенностыо, высокий уровень которой отмечен именно у пигментообразующих клонов буркхолдерий.

Известно, что псевдомонады и буркхолдерии синтезируют пигменты, которые обеспечивают выживаемость видов в среде обитания, представляющие собой полициклические соединения, несущие функцию витаминов, сидерофоров. По мнению Rhame F.S. (1980) пигменты, в частности пиоцианин, обладают антипротозойными свойствами и защищают бактериальные популяции от выедания хищными простейшими в процессе фагоцитоза.

Целенаправленное исследование взаимодействия пигментообразующих штаммов псевдомонад с почвенными амебами - Tetramitus, Naegleria, Hartmanella выявило цитотоксическое воздействие на клетки простейших (Groscop J. A., Brent М.М., 1964).

Подводя итоги экспериментов, отметим, что в почве (воде) как первичной естественной среде обитания В. cenocepacia численность, структура и свойства бактериальной популяции способны контролироваться температурой и симбиотическими связями с простейшими. Сохранение буркхолдерий при крайне неблагоприятных условиях может обеспечиваться их переходом в покоящееся (некультивируемое) состояние, что впервые продемонстрировано в данных опытах. Диапазон экологической толерантности В. cenocepacia есть следствие адаптивной изменчивости бактериальной популяции - преобладания тех или иных клонов в ее структуре.

Экологическая «многоликость» В. cenocepacia - как почвенных бактерий, фитопатогенов (бактериальная гниль лука) и, вместе с тем, возбудителей ряда болезней человека (вероятно, сапронозной природы) вполне очевидна, однако ничего неожиданного и уникального в этом нет. Pseudomonas (Burkholderia) cepacia (cenocepacia) были описаны более полувека назад именно как фитопатогены, а их патогенность для человека и клиническая значимость - в 80-х г.г. прошлого века (Беляков В.Д. и др., 1990; Шагинян И.А., Чернуха М.Ю., 2003). Уже тогда при сравнении изолятов ризосферного и клинического происхождения по 120 признакам были показаны их сходство (по ферментативной активности, спектру углеродного питания и др.) и различия адаптивного характера: более высокая антибактериальная активность у первых и преобладание гемолитических свойств у вторых (Смирнов В.В., Киприанова Е.А., 1990).

Полипатогенность псевдомонад объясняли сходством ряда признаков, важных для возбудителя, у теплокровных животных и растений, а с другой стороны - универсальностью факторов патогенности бактерий (Беляков В.Д. и др., 1990; Смирнов В.В., Киприанова Е.А.,1990). Широкая полипатогенность В. cenocepacia (от растений до человека) не является чем-то исключительным, вполне укладываясь в рамки эпидемиологически новой проблемы - «патогенные бактерии, общие для человека и растений» (Литвин В.Ю. и др., 1996; 1998). Растущее эпидемиологическое значение этих буркхолдерий, занимающих разнообразные экологические ниши в природе, на наш взгляд, определяют актуальность исследований в следующих направлениях:

- условия образования покоящихся бактериальных клеток и их реверсии в вегетативное состояние;

- возможность и формы устойчивого сохранения буркхолдерий в цистах простейших и других гидробионтах;

- резервуарная роль растений и пути их колонизации;

- вирулентность и клональная структура бактериальной популяции в разных условиях существования.

Вторая часть работы посвящена анализу существования бактериалыю-протозойного сообщества при формировании биопленок в различных экологических условиях. Наше внимание было сфокусировано на абиотических (состав культуральных сред, температура) и биотических (простейшие) факторах среды, контролирующих процесс формирования биопленок в модельных водных экосистемах. Качественный анализ образцов позволил визуально оценить, при каких условиях происходит наибольшее накопление пленочной биомассы. B.cenocepacia 370 исходного штамма и его мутанты с разной способностью формировать биопленки, в оптимальных температурных условиях (при 28°С) и богатых средах (LB-бульоне и его смеси с почвенной вытяжкой) через 2 суток на поверхности и стенках лунок образовывали тонкие пленки. В почвенной вытяжке они были едва заметны. Мутант с резко сниженной способностью к формированию биопленки, ни в одной среде не проявлял этого признака.

Картина кардинально менялась, когда к бактериальным популяциям подселяли инфузорий. Уже через 2 суток, как в искусственной среде, так и в почвенной вытяжке, наблюдали интенсивное накопление биопленок. Даже мутант(ВсЬ -), сам по себе не формировавший биопленки, проявлял это свойство. Максимальная биомасса накапливалась через 3-4 суток инкубации. Характерно, что такие сроки накопления биопленок отмечены для легионелл, псевдомонад и вибрионов (Costerton J.W. et.al., 1987; Costerton J.W. et.al., 1995; Matz С. et. al. 2004; 2005).

При количественной оценке наибольшее накопление биопленки выявлено при взаимодействии мутанта Bcb ++ с инфузориями в LB-бульоне; буркхолдерии остальных штаммов в сообществе с простейшими также обладали выраженной способностью к формированию биопленки. В почвенной вытяжке все они проявляли это свойство, хотя биопленок было значительно меньше.

Интересно отметить двоякую роль простейших при взаимодействии с буркхолдериями в процессе формирования биопленок. С одной стороны, они выполняют функцию хищников, утилизирующих часть планктонной субпопуляции бактерий, что соответствует результатам, полученным для синегнойной палочки и холерных вибрионов в сообществе с морскими жгутиконосцами (Flagellatae) - другими хищными простейшими (Matz С. et. al. 2004; 2005). С другой стороны, в ходе этого процесса селектируются устойчивые к перевариванию бактериальные клетки, размножение которых переводит межпопуляционные взаимодействия в русло «паразито-хозяинных», как это детально расшифровано у ряда патогенных бактерий, включая и B.cepacia (cenocepacia) (Пушкарева В.И. и др., 1992). Сформировавшиеся биопленки способствуют распространению и устойчивому существованию возбудителей в природных экосистемах (Matz С. et. al., 2005).

Сами инфузории (по-видимому, их планктонная субпопуляция) стимулировали процесс формирования биопленок во всех вариантах опытов, причем продукция биомассы нарастала линейно в течение 3-4 суток. Утилизации простейшими самих биопленок (данные не приводятся) не происходит.

Учитывая полученные результаты, можно предположить, что простейшие заметно способствуют существованию бактериальной популяции в составе биопленок. Своеобразие данной экологической ниши патогенных бактерий позволяет считать формирование биопленок с участием простейших, а возможно, и других сочленов биоценоза, одним из механизмов устойчивого существования возбудителей сапронозов в почвах и водоемах.

Ультраструктурное исследование ассоциации T.pyriformis и B.cenocepacia в биопленке методом KJTCM выявило следующее.

В ранних биопленках (через 7 часов) популяция простейших представляла собой морфологически неизмененные, активно фагоцитирующие особи, заполненные различным количеством фагосом (от 4 до 25). В некоторых инфузориях наблюдали формирование гигантских пищеварительных вакуолей за счет слияния нескольких мелких фагосом. Подобные структуры характерны для псевдомонад и буркхолдерий, взаимодействующих с простейшими, что было показано в нашей лаборатории ранее с применением трансмиссионной электронной микроскопии (Пушкарева В.И., 1992). Помимо локализации внутри клеток-хозяев (эндосимбиоз) на кортексе инфузорий адгезировались большие скопления буркхолдерий (экзосимбиоз). Большое количество пищеварительных вакуолей в ранние сроки взаимодействия ассоциации свидетельствует об установлении отношений между популяциями буркхолдерий и простейших по типу «хищник-жертва». В более поздние сроки (18 часов) вышедшие из фагосом, активно делящиеся бактерии, очевидно, устойчивые к перевариванию, вызывали значительные морфологические изменения (лизис эндоплазмы, нарушение внутренних структур) у большинства инфузорий, погруженных в биопленочный матрикс. Аналогичный сценарий имел место при ультраструктурном анализе взаимодействия псевдомонад (буркхолдерий) и простейших методом трансмиссионной электронной микроскопии. Бактерии, резистентные к фагоцитозу, выходили неповрежденными в эндоплазму, размножались и разрушали клетку-хозяина.

По мере накопления биомассы и «созревания» пленок цитопатогенное воздействие буркхолдерий возрастало и через 36 часов можно было видеть лишь отдельные фрагменты клеток инфузорий. С уверенностью можно утверждать, что в процессе взаимодействия T.pyriformis с B.cenocepacia симбиотические отношения по типу «хищник-жертва», имеющие место в первые часы взаимодействия, в более поздние сроки изменяются на отношения по типу «паразит-хозяин» с фатальным исходом для популяции простейших. Устойчивая к фагоцитозу часть буркхолдерий после выхода из фагосом активно размножалась и накапливалась в окружающей среде. Пассируясь естественным образом через интактные клетки инфузорий, вероятно, они способны повышать вирулентность популяции.

Следует отметить, что уже на ранних стадиях формирования биопленок в присутствии инфузорий возникали скопления буркхолдерий в виде «микроколоний», по форме аналогичных фагосомам, заполненным бактериями и выпавшим во внеклеточное пространство. В поздние сроки (36 часов), когда биопленки достигали высшей зрелости, количество таких микроколоний возрастало на 40 - 50 % в отдельных препаратах. Очевидно они «остались» на месте разрушенных фагосом в тех же границах, повторяя их форму.

Совокупность представленных в диссертации экспериментальных исследований вносит новый вклад в оригинальное направление медицинской микробиологии и экологической эпидемиологии - изучение общих закономерностей, факторов и механизмов существования патогенных бактерий в биоценозах почв и водоемов. Это направление исследований, традиционное в работе лаборатории экологии возбудителей инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН на протяжении 20 лет, обозначено (Литвин В.Ю. и др., 2004) как «Биоценотические основы природной очаговости сапронозов».

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Каминская, Анастасия Александровна, 2007 год

1. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы. М.: Медицина, 1990, 135 с.

2. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий, М., Медицина, 2005, 242 с.

3. Гершун В.И. Экология листерий и пути их циркуляции в природном очаге. В сб: Экология возбудителей сапронозов. М., 1988, С. 80.

4. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. Некультивируемые формы бактерий и их роль в сохранении возбудителей сапронозов во внешней среде. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 1997,3: 116 121.

5. Диденко Л.В., Константинова Н.Д., Романова Ю.М. и др. Новый метод концентрирования бактериальных суспензий для трансмиссионного электронно-микроскопического анализа. Молекул, генетика, 1996,4: 35 -39.

6. Диденко Л.В., Константинова Н.Д., Романова Ю.М. и др. Ультраструктурная организация клеток Sallmonella typhimurium при длительном голодании и переходе в некультивируемое состояние, Молекул, генетика, 2000, 3: 21 26.

7. Догель В.А. Зоология беспозвоночных. М.: Высшая школа, 1981, 605с.

8. Ермолаева С.А., Романова Ю.М., Тартаковский И.С. Вклад системной регуляции экспрессии генов патогенности в вирулентность факультативных внутриклеточных паразитов. Вестник РАМН, 2005, 1: 44-48.

9. Емельяненко Е.Н. Некультивируемые формы иерсиний и листерий в почве и при взаимодействии с растениями. Дисс.канд.биол.наук, М., 1998, 123с.

10. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург A.JI. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития. Генетика. 2004,40(11): 1 12.

11. Каминская А.А. Паразитизм в простейших Burkholderia cepacia в зависимости от факторов окружающей среды. Мат-лы научно-практ.конф. молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Суздаль, 2005, С. 66 68

12. Кормилицина М.И., Барановский П.М., Ананова Е.В. Ассоциации франциселл с инфузориями в эксперименте. В сб: Патогенные бактерии в сообществах. М., 1994, С. 65 70.

13. Куликовский А.В., Павлова И.Б., Айвазян М.А., Дроздова Т.Д. Поведение микробной популяции во внешней среде. Вестник с.-х. науки. 1990,12: 101-104.

14. Литвин В.Ю. Общие закономерности и механизмы существования патогенных микроорганизмов в почвенных и водных экосистемах. В сб: Экология возбудителей сапронозов. М., 1988, С. 20 34.

15. Литвин В.Ю. Природная очаговость сапронозов новое в концепции Е.Н.Павловского. Мат-лы XII Всес. конф. по прир. очаговости болезней. М., 1989, С. 98 -99.

16. Литвин В.Ю. Потенциальная патогенность и случайный паразитизм микроорганизмов. В сб: Потенциально патогенные бактерии в природе. Москва, 1991,С. 9-30.

17. Литвин В.Ю. Холера как природноочаговая сапронозная инфекция. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол, 1995, 6: 24-27.

18. Литвин В.Ю. Механизмы устойчивого сохранения возбудителя чумы в окружающей среде (новые факты и гипотезы). Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 1997,4: 26 31.

19. Литвин В.Ю. Сапронозные аспекты энзоотии чумы. Успехи соврем, биологии, 2003, 123(6): 543 547.

20. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И., Романова Ю.М., Боев Б.В. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М.: Фармарус принт, 1998,256 с.

21. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И., Романова Ю.М. Обратимый переход патогенных бактерий в покоящееся (некультивируемое) состояние: экологические и генетические механизмы. Вестник РАМН, 2000,1: 7-13.

22. Литвин В.Ю., Емельяненко Е.Н., Пушкарева В.И. Патогенные бактерии, общие для человека и растений: проблема и факты. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.,. 1996, 2: 101-104.

23. Литвин В.Ю., Пушкарева В.И Емельяненко Е.Н. Биоценотические основы природной очаговости сапронозов. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004,4: 102-108.

24. Меркуров А.Э., Тартаковский И.С., Пушкарева В.И., Литвин В.Ю., Константинова Н.Д., Попов В.Л. Инфузории как хозяева легионелл в природе. Мат-лы XII Всес. конф. по прир. очаговости болезней. М., 1989, С. 101 -102.

25. Мидоуз П. Прикрепление водных ьактерий к твердым поверхностям. IX Междун. конгресс по микробиологии. М., 1966, С. 361.

26. Никулынин С.В., Онацкая Т.Г., Луконина Л.М., Бондаренко А.И. Изучение ассоциаций почвенных амеб с бактериями возбудителями чумы и псевдотуберкулеза в эксперименте. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.,. 1992, 9-10:2-4.

27. Олсуфьев Н.Г., Петров В.Г., Шлыгина К.Н. Об обнаружении возбудителей эризипелоида и листериоза в воде ручьев. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 1959, 3: 89 94.

28. Павловский Е.Н. Природноочаговые болезни человека. М.: Медгиз, 1960, 326 с.

29. Погорелов В.И., Пинигин А.Ф., Марамович А.С., Пушкарева В.И., Литвин В.Ю. Изучение взаимодействия холерных вибрионов синфузориями Tetrahymena pyriformis. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 1995,2: 22-27.

30. Пушкарева В.И. Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах (экспериментально-экологическое исследование). Дисс. докт. биол. наук, Москва, 1994, 210с.

31. Пушкарева В.И. Методы экспериментального изучения хозяев и путей циркуляции возбудителей инфекций в почвенных и водных сообществах. В сб: Патогенные бактерии в сообществах (механизмы и формы существования). М., 1994, С. 35-42.

32. Пушкарева В.И. Паразитизм в простейших как стратегия существования патогенных бактерий в почвах и водоемах. Успехи соврем, биологии. 2006, 126 (4): 323 333

33. Пушкарева В.И., Величко В.В., Каминская А.А., Литвин В.Ю. Burkholderia cepacia в разных экологических условиях: численность и изменчивость бактериальной популяции. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 2005, 3: 39 44.

34. Пушкарева В.И., Емельяненко Е.Н., Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Кулеш Е.В., Белякова Г.А. Патогенные листерии в почве и в ассоциации с водорослями: обратимый переход в некультивируемое состояние. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 1997, 3:3 -6.

35. Пушкарева В.И., Константинова Н.Д., Литвин В.Ю., Попов В.Л. Псевдомонады как паразиты простейших. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 1992, 2:4-10.

36. Пушкарева В.И., Литвин В.Ю., Тартаковский И.С. Популяционная динамика Yersinia pseudotuberculosis в ассоциации с инфузориями

37. Tetrahymena pyriformis. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1989, 1:17-20.

38. Романова Ю.М. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий на модели Salmonella typhimurium: феномен и генетический контроль. Дисс. докт. биол.наук,-М., 1997, 161 с.

39. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наук, думка, 1990,264 с.

40. Соколенко А.В. Морфология, ультраструктура, метаболизм некультивируемых форм холерных вибрионов. Автореф. дис. канд. биол. наук.- Саратов, 2000, 18 с.

41. Сукачев В.Н. Основы теории биогеоценологии. М. АН СССР, 1947, 283 с.

42. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. М.: Медицина для всех, 2002,200 с.

43. Томов А., Цветкова Е., Курдова Р. Взаимодействие на амеби с легиолни и туларемийни бактерии. VII конгресс по заразни и паразитни болезни, Вилиноград. 1992, С. 17.

44. Троицкая В.В., Четина Е.В., Аляпкина Ю.С., Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л. Некультивируемые формы Yersinia pseudotuberculosis в почвах природного очага псевдотуберкулеза. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 1996, 5: 13-15.

45. Филипченко А.А. Экологическая концепция паразитизма и самостоятельность паразитологии как научной дисциплины. Уч. зап. МГУ. 1937, Вып. 13 (4): 4-7.

46. Хаусман К. Протозоология. М.: Мир, 1988,334 с.

47. Четина Е.В., Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф. и др. О возможном механизме эндемичности современной холеры (роль некультивируемых форм Vibrio cholerae 01). Мол. генетика, миробиол., вирусол., 1993, 6: 1822.

48. Шагинян И.А., Чернуха М.Ю. Бактерии комплекса Burkholderia cepacia: особенности диагностики организации генома и метаболизма. Мол. генетика, вирусол., микробиол. 2003, 2: 39 41.

49. Abd Н., Johansson Т., Golovlid J., Sandstrom G., Forsman M. Survival and growth of Francisella tularensis in Acanthamoeba castellanii. Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69(1): 600 606.

50. Alexander M. Why microbial predators and parasites do not eliminate their prey and hosts. Ann. Rev. Microbiol. 1981,(35): 113 133.

51. Anand C.M., Skinner A.R., Malic A., Kurts J.B. Interaction of L.pneumophila and a free living amoeba (Acanthamoeba palestensis). J. Hyg. 1983,91 (2): 167-178.

52. Byrd J.J., Hu H-S., Colwell R.R. Viable but nonculturable bacteria in drinking water, Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57: 875-878

53. Boyd A., Chakrabarty A.M. Pseudomonas aeruginosa biofilms: role of the alginate exopolysaccharide. J. Ind. Microbiol. 1995, 15: 162-168.

54. Burkholder W.H. Sour skin, a bacterial rot of onion bulbs. Phytopathology 1950,40:115-117.

55. Cianciotto N.P., Eisenstein B.J., Mody C.N., Toews G.B., Engleberg N.C. A Legionella pneumophila gene encoding a species-specific surface protein potentiates initiation of intracellular infection. Infect. Immun. 1989, 57: 1255 -1262.

56. Colwell R.R. An indirect fluorescent antibody staining procedure for detection of Vibrio cholerae serovar 01 cells in aquatic environmental samples. J. Microbiol. Methods. 1984,2: 221-331.

57. Colwell R.R., Brayton P.R., Grimes D.J e.a. Viable but nonculturable Vibrio cholerae and related pathogens in the environment: implication for the release of genetically engineered microorganism. Bio/Technology. 1985, 3: 817-820.

58. Colwell R.R., Bryton P.R., Herington D. et al. Vieable but nonculturable V.cholerae revert to culturable state in the human intestine, World J.Microbiol, and Biotechnol. 1996,12: 28-31.

59. Colwell R.R., Kaper J., Joseph S.W. Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, and other vibrios: occurrence and distribution in Chesapeake Bay. Sciens. 1977,198:394-396.

60. Costerton J.W., Cheng K.-J, Geesy G.G., Ladd T.I., Nickel J.G., Dasgupta M. and Marrie T.J. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu. Rev. Microbiol. 1987, 41:435-464

61. Costerton J.W., Geesy G.G. Cheng K.-J. How bacteria stick. Sci Am. 1978, 238: 86-95.

62. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., Lappin-Scott H.M. et. al., Microbiol, biofilms. Ibid. 1995,49: 711-745.

63. Daley R.J., Hobbie J.E. Direct counts of aquatic bacteria by modified epi-fluorescent technique. Limnol. Oceanogr. 1975,20: 875-882.

64. Davey, M.E., and O'Tool, G.A. Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics. Microbiology and Molecular Biolodgy Reviews 2000, 4: 847-867.

65. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin. Microbiol. Rev. 2002,15: 167-193.

66. Eren J., Pramer D. Application of immunofluorescent staining to studies of the ecology of soil microorganisms. Soil Sci. 1966,101: 39-45.

67. Fields B.S., Fields S.R., Chin Loy J.N., White E.N. Attachment and entry of Legionella pneumophila in Hartmannella vermiformis. J. Infect. Dis. 1993, 167: 1146- 1150.

68. Fliermans C.B., Schneider C., Schmidt E.L. Direct measurement of bacterial stratification in Minnesota lakes. Arch. Hydrobiol. 1975, 76: 248-255.

69. Forst, S.A., and Roberts, D.L. Signal transduction by the EnvZ-OmpR phosphotransfer system in bacteria. Res Microbiol 1994, 145(5-6): 363-73.

70. Fransisco D.E., Mah R.A., Rabin A.C. Acridine orange epi-fluorescent technique for counting bacteria in natiral waters. J. Trans. Am. Microsc. Soc. 1973, 92:416-421.

71. Gauthier Y., Isoard P. et. al. L'adhesion des bacteries sur les surfaces. Ind. alimetagr. 1989, 106(1-2): 31.

72. Girardeau J.P.Adherence bacterienne. "6 eme Reun. Microbial. INRA. Murat-le-Quaire. Versailles. 1982. P. 9.

73. Groscop J.A., Morgan M.B. The effects of selected strains of pigmented microorganisms on small free-living amoebae. Canadian J. of Microbiol. 1964, 10: 579-584.

74. Hales L.M., Shuman H.A. The Legionella pneumophila rpoS gene is required for growth within Acanthamoeba castellanii. J. Bacterid. 1999, 181: 4879 4889.

75. Hill I., Gray T. Application of fluorescent antibody technique to an ecological study of bacteria in soil. J. Bacteriol. 1967,93: 1888-1896.

76. Hobbie J.E., Daley R.J., Jasper S. Use of nucleopore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy. Appl. Environm. Microbiol. 1977, 33 (5): 1225-1228.

77. Hall J., Voelz H. Bacterial endosymbionts of Acanthamoeba sp. J. Parazitol. 1985,71:89-95.

78. Holler C, Witthuhn D, Janzen-Blunck B. Effect of low temperatures on growth, structure, and metabolism of Campylobacter coli SP10. Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64(2): 581-587.

79. Islam M. S., Rahim Z., Alam M.J. e.a. Association of Vibrio cholerae 01 with the cyanobacterium, Anabaena sp., elucidated by polymerase chain reaction and transmission electron microscopy. Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.1999, 93 (1): 36-40.

80. Jadin J.B Free-living pathogenic amoebae. Acta leprol. 1975, 59:57.

81. Jones J.G., Simon B.M. An investigation of errors in direct counts of aquatic bacteria by epi-fluorescence microscopy, with reference to a new method for dyeing membrane filters. J. Appl. Bacteriol. 1975,39: 1-13.

82. Keevil C.W. Rapid detection of biofilms and adherent pathogens using scanning confocal laser microscopy and episcopic differential interference contrast microscopy.Water Sci. Thechnol. 2003, V. 47 (5). P. 105-116.

83. Kilvington S., Price S. Survival of Legionella pneumophila within cyst of acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure J. Appl. Bacteriol. 1990, 68 (5): 519-525.

84. Kondo K, Takade A, Amako K. Morphology of the viable but nonculturable Vibrio cholerae as determined by the freeze fixation technique. FEMS Microbiol. Lett. 1994,123 (1-2): 179-184.

85. Kogure K., Simidu U., Taga N. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria, Can.J.Microbiol., 1979,25: 415 420.

86. Kogure K., Simidu U., Taga N. Effect of Sceletonema costatum (Grev.) Cleve on the growth of marine bacteria. J. Exp. Mar. Biol. And Ecol. 1979, 36: 201-215.

87. Lamothe J., Thyssen S., Valvano M.A. Burkholderia cepacia complex isolates survive intracellularly without replication within acidic vacuoles of Acanthamoeba polyphaga. Cellular Microbiol. 2004, 6 (12): 1127- 1138.

88. Landers P., Kerr K.G., Rowbotham T.J. e.a. Survival and growth of Burkholderia cepacia within the Free-Living Amoeba Acanthamoeba polyphaga. Eur. J. Clin.Microbiol.Jnfeck.Dis. 2000,19 :121-123.

89. Lieo M.M., Tafi M.C., Canepari P. Nonculturable Enterococcus faecalis cells are metabolically active and capable of resuming active growth. Syst. Appl. Microbiol. 1998,21(3): 333-339.

90. Linder K, Oliver J.D. Membrane fatty acid and virulence changes in the viable but nonculturable state of Vibrio vulnificus. Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55(11): 2837-2842.

91. Ly T.M.C., Muller H.E. Ingested Listeria monocytogenes survive and multiply in protozoa. J. Med. Microbiol. 1990, 33: 51 54.

92. Marolda, С., Hauroder, В., John, M., Michel, R., and Valvano, M. Intracellular survival and saprophytis growth of isolates from the Burkholderia cepacia complex in free-living amoebae. Microbiology 1999,145: 1509-1517.

93. Matz C., Bergfeld Т., Rice S.A. and Staffan Kjelleberg. Microcolonies, quorum sensing and cytotoxicity determine the survival of Pseudomonas aeroginosa biofilms exposed to protozoan grazing. Environment. Microbiol. 2004, 6(3): 218-226.

94. Mats, С., 1., McDougald, D., Moreno., A. M., Yung, P. Y., Yildiz, F. H., andKjelleberg, S. Biofilm formation and phenotypic variation enhance predation-driven persistence of Vibrio cholerae. PNAS 2005,46:16819-16824.

95. Matz C.and Kjelleberg S. Off the hook how bacteria survive protozoan grazing. Trends in Micribiolology. 2006, 13 (7): 302-307.

96. McKay A.M. Nonviable bacterial pathogens, 3ett. Appl., Microbiol., 1992, 14: 129-135.

97. Oliver J.D. Formation of viable but nonculturable cells. Starvation in bacteria (ed. S.Kjellenberg). Plenum Press, New York, 1993, p.239.

98. Olsson-Axelsson D., Waldenstrom J., Broman T. et. al. Protozoan Acanthamoeba polyphaga as a potential reservoir for Campylobacter jejune. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71: 987-992.

99. Pedersen K. Factors regulating microbial biofilm development in system slowly flowing seawater. Eppl. Environ. Microbiol. 1982, 44: 1196-1204.

100. Rhame F.S. The Ecology and Epidemiology of Pseudomonas aeruginosa. (Ed) L.D. Sabath, 1980, Bern, 31-50.

101. Rollins D.M., Colwell R.R. Viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural environment. Appl. Environ. Microbiol. 1986, 52(3): 531-538.

102. Roszak D.B., Grimes D.J.,Colwell R.R. Viable but nonrecoverable stage of Salmonella enteritidis in aquatic systems. Can.J.Microbiol., 1984, 30: 334-338.

103. Rowbotham T.J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. Jornal of Clinical Pathology 1980. 33:1179- 1183.

104. Rowbotham T.J. Current views on the relationships between amoebae, legionellae and man. Israel J. Med. Sci. 1986,22: 678 689.

105. Segal G., Shuman H.A. The Legionella pneumophila utilized the same genes to multiply within Acanthamoeba castellanii and human macrophages. Infect, and Immun. 1999, 67(5): 2117 2124.

106. Shapiro J.A. Bacteria as multicellular organism. Sci.Am.1988,256:82-89.

107. Shapiro J.A. Thinking about bacterial populations as multicellular organism. Annu.Rev.Microbiol. 1998, 52: 81-104.

108. Signoretto C., Lleo M.M., Tafi M.C., Canepari P., 2000, Cell wall chemical composition of Enterococcus Faecalis in the viable but nonculturable state. Appl. Environ. Microbiol., May; 66 (5): 1953 1959.

109. Stepanovic S., Cirkovic I., Ranin L. et. al. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.Lett Appl Microbiol. 2004, 38: 428 432

110. Stoodley P., Sauer K., Davies D.S., Costerton J.W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu.Rev.Microbiol. 2002, 56: 187-209.

111. Taylor S.S., Ahonen L.J., Frans A.A. de Leij FA, Dale JW1.fection of Acanthamoeba castellanii with Mycobacterium bovis and M. bovis BCG and survival of M. bovis within the amoebae. Appl. Environ. Microbiol. 2003, P. 4316-4319.

112. Thom S., Warhurst D., Drasar B.S. Association of Vibrio cholerae with fresh water amoebae. J. Med. Microbiol. 1992, 36: 303 306.

113. Tezcan-Merdol D., Ljungstrom M., Winiecka-Krusnell J., Linder E., Engstrand L., Rhen M. Uptake and replication of Salmonella enterica in Acanthamoeba rhysodes. Appl. Environ. Microbiol. 2004, 70(6): 3706.

114. Wang W., Shor L.M., Le Boeuf E.J. Wikswo JP, Kosson DS. Mobility of protozoa through narrow channels. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71(8): 4628 -4637.

115. Watnick P., Kolter R. Steps in the development of Vibrio cholerae El Tor Biofilm. Mol. Microbiol. 1999, 34(3): 586 -595.

116. Zimmerman R., Itturiaga R., Becker-Birck J. Simultaneous determination of the total number of aquatic bacteria and the number there of involved in respiration. Appl. Environm. Microbiol. 1978, 36 (12): 926-935.