НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА И ВЫЯВЛЕНИЮ ЛЕГИОНЕЛЛ В ВОДНЫХ СИСТЕМАХ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, доктор наук Карпова Татьяна Игоревна

• Карпова Татьяна Игоревна
• доктор наук
• 2016

Оглавление диссертации доктор наук Карпова Татьяна Игоревна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности таксономии и биологии легионелл

1.1.1 Общая характеристика возбудителя

1.1.2 Особенности таксономии легионелл

1.1.3 Особенности биологии легионелл

1.2. Лабораторная диагностика легионеллёза

1.2.1 Выделение и идентификация культуры легионелл из клинического материала

1.2.2 Серологическая диагностика легионеллеза

1.2.3 Определение антигена легионелл в моче больных

1.2.4 Выявление легионелл в клиническом материале методом прямой иммунофлюоресценции

1.3 Экология легионелл в потенциально опасных водных системах

1.3.1 Легионеллы в воде и почве

1.3.2 Легионеллы и простейшие

1.3.3 Легионеллы и биопленки

1.3.4 Выделение легионеллы из окружающей среды

1.3.5 Методы контроля и мониторинга легионелл в потенциально опасных водных системах

1.4 Заключение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

2.1 Штаммы легионелл, клинический материал (бронхоаль-

веолярный лаваж, моча)

Методы

2.2. Лабораторная диагностика легионеллёза

2.2.1 Определение антигена в моче

2.2.2 Микробиологическое исследование БАЛ

2.2.3 Применение ПЦР-РВ для диагностики легионеллезной инфекции у гематологических больных

2.3. Выявление легионелл в потенциально опасных водных объектах окружающей среды

2.3.1 Бактериологическое исследование воды и биопленок

2.3.2. Характеристика выделенных штаммов

2.3.2.1 Идентификация легионелл

2.3.2.2 Типирование легионелл с помощью панели моноклональ-ных антител

2.3.2.3 Секвенирование ДНК легионелл

2.4. Получение бактериальных биопленок

2.4.1. Получение моновидовых биопленок

2.4.2 Получение биопленок других микроорганизмов

2.4.3. Изучение природных биопленок

2.4.3.1 Высев из биопленок на легионеллы и другие микроорганизмы

2.4.3.2 Электронно-микроскопическая характеристика биопленок

2.5 Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Диагностика легионеллеза у больных тяжелыми пневмониями

3.1.1 Разработка алгоритма диагностики легионеллёза при вне-больничных пневмониях

3.1.2 Разработка алгоритма диагностики легионеллёза при лёгочных осложнениях у иммунокомпрометированных па-

циентов

3.2. Разработка алгоритма выявления легионелл в окружающей среде

3.3. Применение разработанного алгоритма при расследовании эпидемических вспышек легионеллёза

3.3.1. Применение разработанного алгоритма при расследовании вспышки внебольничного легионеллеза в Верхней Пышме

3.3.2. Применение разработанного алгоритма при анализе случаев пневмоний в ФГБУ «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации

3.4. Изучение особенностей формирования модельных и природных биопленок легионелл

3.4.1. Особенности формирования модельных биопленок в экспериментальных условиях

3.4.2. Изучение особенностей формирования биопленок в открытых (градирни промышленных предприятий) и закрытых (системы горячего водоснабжения общественных зданий) водных системах

3.5. Сравнительное изучение особенностей колонизации ле-гионеллами 2-х типов потенциально опасных водных систем в регионах России

3.5.1. Особенности колонизации градирен промышленных предприятий

3.5.2. Особенности колонизации легионеллами систем водоснабжения общественных зданий

3.5.3. Серологическое разнообразие выделенных штаммов Legionella pneumophila, циркулирующих в градирнях и сис-

темах водоснабжения в Российской Федера-

ции

3.6. Создание национальной коллекции легионелл

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПЦР-РВ Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

КОЕ Колониеобразующая единица

GICL Gamaleya Institute Collection of Legionellosis

SBT Sequence-Based Typing

Sg Серогруппа

ЛПО Лечебно-профилактическая организация

БАЛ Бронхоальвеолярный лаваж

БУДРАГ Буферный угольно-дрожжевой агар

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Легионеллез - сапронозная бактериальная острая инфекционная болезнь с аспи-рационным механизмом передачи возбудителя. Различают две клинические формы заболевания: болезнь легионеров и лихорадку Понтиак. Болезнь легионеров -тяжелая острая пневмония, для которой описаны спорадические случаи и вспышки, в том числе и внутрибольничные. Несмотря на проводимое этиотропное лечение смертность может достигать 10 -12%, а при внутрибольничных вспышках -30-40%. Легионеллез характеризуется весьма специфическими эпидемиологическими особенностями, существенно отличающимися от таковых для всех остальных респираторных инфекций, которые до настоящего времени находятся в состоянии изучения, что во многом определяется качеством лабораторной диагностики этой инфекции (Luck P.C., Helbig J.H., Schuppler M. 2002; Fields B.S., Benson R.F., Besser R.E. 2002). Статистические данные о числе случаев легионеллеза в России не отражают истинного распространения ни болезни легионеров, ни тем более лихорадки Понтиак. Наличие возбудителя легионеллеза в водных объектах окружающей среды, где он часто находится в симбиозе с амебами, водорослями и другими представителям водного планктона, объясняет зависимость вероятности возникновения случаев заболевания от таких факторов, как уровень контаминации воды легионеллами; эффективность образования аэрозолей, содержащих ле-гионеллы, и скорость его распространения по воздуху; а также индивидуальная восприимчивость человека и вирулентность штаммов (Jakubovski W. et al. 1983; Breiman R.E. 1993).

Легионеллез представляет существенную угрозу общественному здоровью, описаны крупные эпидемические вспышки и спорадические случаи в различных странах мира с высоким процентом летальных исходов (5-20%). Характер вспышек также значительно отличается от вспышек других респираторных инфекций,

что демонстрируют следующие примеры: вспышка в Германии, Ульм(2010), источник возбудителя - градирня в центре города; Варштейн (2013), источник -пруды очистки воды на пивоваренном заводе; в Коста-Бланка (2012), вспышка в отеле продолжалась в течение полугода, источник - СПА-бассейн; в Шотландии, Эдинбург (2012), предполагаемый источник - градирни; в Нью-Йорке (2015) источник - система охлаждения воздуха в гостинице и др. Для попадания возбудителя в организм человека необходим инфицированный мелкодисперсный аэрозоль. Поэтому случаи заболевания связаны с контаминацией легионеллами потенциально опасных водных систем, прежде всего систем горячего водоснабжения и водных систем охлаждения общественных зданий и промышленных предприятий, с водой которых возбудитель попадает в организм человека (И.С.Тартаковский 2001; Cooper A. et al 2004).

На территории Российской Федерации первые случаи легионеллеза (болезни легионеров) были выявлены и описаны ещё в 1979 г. (С.В.Прозоровский, И.С.Тартаковский с соавт. 1980) на основе использования главным образом серологических методов диагностик (НИФ, РПГА), при этом многие методы носили ретроспективный характер, что не позволяло в кратчайшие сроки назначать этио-тропную терапию.

До начала настоящих исследований лабораторная диагностика легионеллезной инфекции и выявление возбудителя в объектах окружающей среды в Российской Федерации соответствовали в целом уровню 80-х годов прошлого века и не учитывали тех изменений, которые произошли в понимании проблемы легионеллеза за последние десятилетия. Основным методом считался метод непрямой иммунофлюоресценции при исследовании одиночной сыворотки (В.И.Покровский, С.В.Прозоровский с соавт. 1995), что позволяло установить предполагаемый диагноз. Диагностическое нарастание титров антител носило запоздалый ретроспективный характер, что не позволяло скорректировать схему антибиотикотерапии тяжелой пневмонии легионеллезной этиологии. В XXI веке к

бактериологическому выделению легионелл («золотой стандарт») был добавлен метод определения антигена легионелл в моче и метод ПЦР (Н.Д.Темежникова, И.С.Тартаковский 2007). За рубежом ПЦР, несмотря на широкое распространение данного метода для диагностики инфекционных заболеваний, до настоящего времени не включена в стандарты лабораторной диагностики легионеллеза, и используется в качестве базового метода в ограниченном числе лабораторий (Hu J. et al.2002; Uldum S.A., Molbak K. 2002).

В последние годы принципиально важным для предупреждения случаев легионеллеза стало понимание того, что для его профилактики не применимы подходы, традиционно используемые для предупреждения других респираторных инфекций, а основное направление профилактики легионеллёза было направлено на снижение концентрации легионелл (с помощью термических или химических способов) в водных объектах, из которых водный аэрозоль мог поступить в организм человека (Н.Д.Темежникова, И.С.Тартаковский 2007). Для этого необходимо проводить регулярно микробиологический мониторинг потенциально опасных для человека водных объектов, генерирующих аэрозоль (градирни, централизованные системы кондиционирования с водным охлаждением, джакузи и др.); систем горячего водоснабжения, если температура воды не превышает 55О С; оборудования и инструментария, представляющего опасность возникновения нозокомиального легионеллёза (Г.Г.Онищенко, Ю.В.Демина, И.С.Тартаковский 2009).

В Российской Федерации в 21 веке до начала настоящих исследований лабораторная диагностика легионеллеза и выявление легионелл в потенциально опасных водных системах не соответствовали современному уровню в связи с отсутствием соответствующей методической базы, а сведения о распространении легионелл на территории Российской Федерации и их роли в этиологии внеболь-ничных и внутрибольничных пневмоний были недостаточными.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА И ВЫЯВЛЕНИЮ ЛЕГИОНЕЛЛ В ВОДНЫХ СИСТЕМАХ»

Цель работы:

Обосновать и разработать новые подходы к лабораторной диагностике легио-неллеза, обеспечивающие эффективную диагностику внебольничных и внутри-больничных пневмоний и количественный мониторинг легионелл в потенциально опасных водных системах.

Для достижения данной цели поставлены следующие задачи:

1. Разработать эффективные алгоритмы лабораторной диагностики легионел-леза на основе дифференцированного методического подхода к диагностике вне-больничных и внутрибольничных пневмоний легионеллезной этиологии.

2. Разработать алгоритм количественного мониторинга легионелл в потенциально опасных водных системах с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с последующим бактериологическим подтверждением.

3. Оценить эффективность разработанных алгоритмов при расследовании эпидемической вспышки внебольничного легионеллеза и выявлении случаев легио-неллеза, связанных с пребыванием в лечебно-профилактических организациях (ЛПО).

4. Изучить особенности формирования природных биопленок легионелл в открытых и закрытых потенциально опасных водных системах.

5. Провести анализ уровня и частоты колонизации легионеллами потенциально опасных водных систем различного типа на территории Российской Федерации.

6. Охарактеризовать серологическое разнообразие штаммов Legionella pneumophila, циркулирующих в градирнях и системах водоснабжения в Российской Федерации, для выявления локализации штаммов наиболее значимых в эпидемиологическом отношении серогрупп легионелл.

7.Создать национальную отечественную коллекцию штаммов легионелл, выделенных из окружающей среды и клинического материала и охарактеризовать их с помощью панели моноклональных антител и секвенирования.

Научная новизна работы

• Впервые был предложен и использован дифференцированный подход для диагностики внебольничных пневмоний (сочетание иммунохроматографического метода выявления антигена легионелл в моче и бактериологических методов) и легочных осложнений у иммунокомпрометированных пациентов (внутриболь-ничных пневмоний) легионеллезной этиологии (ПЦР-РВ с последующим применением бактериологических методов).

• При разработке алгоритма выявления легионелл в окружающей среде, основанном на предварительном скрининге образцов воды в потенциально опасных водных системах на наличие ДНК легионелл с помощью ПЦР-РВ с последующим бактериологическим подтверждением, предложено рассматривать ПЦР-РВ и бактериологическое исследование воды не как альтернативные подходы, а как единый комплекс методов.

• Разработанные алгоритмы диагностики легионелеза и выявления легионелл в объектах окружающей среды были впервые применены нами в полном объеме при расследовании крупной эпидемической вспышки легионеллеза в Верхней Пышме и изучении роли легионелл в этиологии легочных осложнений у иммуно-компрометированных больных в ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России (ГНЦ).

• Впервые была получена коллекция прижизненно выделенных клинических штаммов Ь.рпвиторИНа от пациентов (ГНЦ).

• Применение иммунохроматографического метода для определения легио-неллезного антигена в моче было эффективно при диагностике внебольничных пневмоний, тогда как для расшифровки внутрибольничных пневмоний исключи-

тельно важное значение имело применение ПЦР-РВ для исследования жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ).

• Впервые в России был успешно применен современный алгоритм молеку-лярно-генетического типирования при выявлении нескольких (более двух) случаев легионеллеза. От четырех пациентов была выделена культура L.pneumophila серогруппы 1. Мультилокусное секвенирование и типирование с помощью панели моноклональных антител показало, что речь идет о трех разных штаммах легио-нелл. Показано отсутствие связи между случаями легионеллеза, вызванными штаммами L.pneumophila серогруппы 1 и контаминированной легионеллами воды, циркулирующей в системе водоснабжения ЛПО. Для шести случаев легионеллез-ной инфекции, вызванных штаммом L.pneumophila серогруппы 3, результаты были диаметрально противоположными. Мультилокусное секвенирование показало, что все эти случаи вызваны одним штаммом Hem2 (St87), циркулирующим в системе водоснабжения ЛПО. Таким образом, доказано, что система горячего водоснабжения центра является источником распространения L.pneumophila серогруппы 3, а выявленные случаи легионеллезной инфекции с полным основанием относятся к случаям инфекции, связанной с оказанием медицинской помощи.

• Доказано, что в настоящее время визуальное выявление и взятие образцов биопленок для количественного определения в них легионелл является обязательным элементом любого профилактического обследования потенциально опасных водных объектов и расследования возможной эпидемической ситуации на объекте.

• Создана национальная отечественная коллекция легионелл, насчитывающая 354 штамма, выделенных из окружающей среды (339) и клинического материала (15) и охарактеризованных с помощью панели моноклональных антител и секвенирования. Коллекция насчитывает 354 штамма, принадлежащих к 13 се-рогруппам L.pneumophila и 15 штаммов 11 видов Legionella spp.

Теоретическая значимость работы для микробиологии состоит в изучении колонизации легионеллами потенциально опасных водных систем различного типа, особенностей формирования природных биопленок в различных системах, серологическом разнообразии штаммов легионелл, циркулирующих в этих системах, анализе роли мультилокусного секвенирования для характеристики опасности для пациентов штамма легионелл, циркулирующего в водной системе.

Практическая значимость работы:

Проведенные исследования позволили разработать и внедрить современные методы лабораторной диагностики легионеллеза и профилактического мониторинга легионелл в потенциально опасных водных системах в практику отечественного здравоохранения. Методы диагностики легионеллеза хорошо стандартизованы и доступны в настоящее время широкому кругу микробиологических лабораторий России. Широкое использование стандартов лабораторной диагностики легионеллеза практическим здравоохранением является необходимым условием своевременного выявления и эффективной антибиотикотерапии случаев ле-гионеллезной инфекции в нашей стране. Это нашло отражение в следующих документах национального уровня:

1. Санитарные правила:

Профилактика легионеллеза (Санитарные правила 3.1.2.2626-10), 2010, с.24

2. Методические указания:

• Определение бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды. (Методические указания 4.22.17.07 Роспотребнадзора), 2007

• Эпидемиологический надзор за легионеллезной инфекцией (Методические указания МУ 3.1.2.2412-08), 2008, с.35

3. Методические рекомендации:

• Выявление и количественное определение легионелл в водных образцах методом полимеразной цепной реакции с использованием тест-систем производства «Синтол» (Методические рекомендации МР 02.039-09), 2009, с.31

• Выявление антигена бактерий Legionella pneumophila серогруппы 1 в клиническом материале иммунохроматографическим методом (Методические рекомендации N01/14633-8-34), 2010

• Практические рекомендации по диагностике и лечению легионеллезной инфекции, вызываемой Legionella pneumophila серогруппы 1. Пособие для врачей, 2009, с.24 (МАКМАХ и Российское респираторное общество)

Методология и методы исследования.

Разработан комплекс методов лабораторной диагностики легионеллеза и выявления легионелл в потенциально опасных водных системах на основе следующих алгоритмов: разработан и внедрен в практику алгоритм диагностики легионелеза при внебольничных пневмониях и при легочных осложнениях у иммунокомпро-метированных больных на основе бактериологического и ПЦР-исследования БАЛ пациента и иммунохроматографического анализа мочи; разработан и внедрен в практику алгоритм количественного выявления легионелл в природных образцах воды и биопленках с помощью бактериологического метода и ПЦР-РВ.

Выделенные штаммы легионелл изучались с помощью серологических, биохимических и молекулярно-генетических методов. При выполнении работы были использованы современные микробиологические, молекулярно-биологические и статистические методы.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Современные подходы к лабораторной диагностике легионеллеза нуждаются в усовершенствовании и должны строиться на дифференцированном подходе:

-к диагностике внебольничных тяжелых пневмоний;

-легочных осложнений у пациентов со сниженным иммунитетом (как правило, внутрибольничных пневмоний) легионеллезной этиологии;

и разработке специальных алгоритмов микробиологических исследований для каждой группы.

• Впервые был предложен и использован дифференцированный подход для диагностики внебольничных пневмоний, заключающийся в сочетанном использовании иммунохроматографического метода определения антигена легионелл в моче и бактериологических методов, тода как для этиологической диагностики легочных осложнений у иммунокомпрометированных пациентов (внутриболь-ничных пневмоний) необходимо применять ПЦР-РВ с последующим бактериологическим подтверждением.

• С учетом достаточно высокой частоты колонизации легионеллами основных типов потенциально опасных водных систем в России (градирни, горячее водоснабжение, джакузи массового пользования) оперативное применение представленного в данной работе методического подхода должно стать обязательным элементом эпидемиологического расследования при выявлении нескольких (более 2-х) случаев легионеллеза, связанных с пребыванием на одном объекте.

• Впервые создана национальная коллекция легионелл, насчитывающая 354 штамма, выделенных из окружающей среды (339) и клинического материала (15) и охарактеризованных с помощью панели моноклональных антител и секвениро-вания. Коллекция насчитывает 354 штамма, принадлежащих к 13 серогруппам L.pneumophila и 15 штаммов 11 видов Legionella spp.

Апробация работы.

Основные результаты работы были доложены на научных конгрессах, съездах, конференциях: 21ая Европейская рабочая группа по легионеллёзу, Лиссабон,

2006; 22ая Европейская рабочая группа по легионеллёзу, Стокгольм, 2007; IX съезд ВНПОЭМП, 2007; V Международная конференция по генодиагностике, ноябрь 2007г; 18ый международный конгресс Европейского респираторного общества, Берлин, 2008; IX межгосударственная конференция стран участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями на территории государств участников содружества независимых государств», 2008; 23я Европейская рабочая группа по легионеллезу, Мадрид, 2008; конференция «Теоретические и практические аспекты современной эпидемиологии» посвященной 75-летию Б.Л.Черкасского, 2009; Х-ом съезде ВНПОЭМП ,Москва 2012. VII международная конференция по легионеллёзу, Париж, 2009; 25ая Европейская рабочая группа по легионеллезу, Копенгаген, 2010; 26ая Европейская рабочая группа по легионеллезу, Вена, 2011, 27ая Европейская рабочая группа по легионеллезу, Дрезден, 2012; VI ежегодный конгресс всероссийского общества инфекционистов, Москва, 24-26марта 2014; 29ая Европейская рабочая группа по легионеллезу, Барселона, 2014; VII научно-практическая междисциплинарная конференция «Основные направления диагностики и лечения заболеваний микробной этиологии», Ставрополь, 2016.

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 1 монография, 25 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 26 тезисов конференций, из них 11 международных. Результаты внедрены в форме: Стандарта специализированной медицинской помощи при пневмонии тяжелой степени тяжести с осложнениями. (Приложение к приказу Минздрава России от 29.01.2013 №741н.), 2 методических указаний, 3 методических рекомендаций, санитарных правил.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, включающих обзор литературы, собственные исследования и их результаты, обсуждения, выводов, списка литературы.

Работа изложена на 200 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 таблицами, и 36 рисунками.

Указатель литературы состоит из 35 отечественных и 123 зарубежных источников.

Личный вклад.

Автором разработан комплекс методов лабораторной диагностики легионелле-за и выявления легионелл в водных системах на основе следующих алгоритмов: разработан и внедрен в практику алгоритм диагностики легионеллеза при вне-больничных пневмониях и при легочных осложнениях у больных с иммунодефи-цитами на основе бактериологического и ПЦР-исследования БАЛ пациента и им-мунохроматографического анализа мочи; разработан и внедрен в практику алгоритм количественного выявления легионелл в природных образцах воды и биопленках с помощью предварительного скрининга с использованием ПЦР-РВ с дальнешим подтверждением количества жизнеспособных клеток легионелл бактериологическим методом.

Выбор и отработка методик исследования, обработка и оценка полученных результатов исследования, оформление диссертации и автореферата выполнены автором самостоятельно.

Исследования по изучению биопленок легионелл с помощью электронной микроскопии проводились совместно с лабораторией анатомии микроорганизмов

«ФНИЦЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» под руководством заведующей лабораторией, д.м.н. Диденко Л.В.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Особенности таксономии и биологии легионелл 1.1.1 Общая характеристика возбудителя.

Возбудитель представляет собой мелкую грамотрицательную кислотоустойчивую палочку длиной 2-3 мкм и диаметром 0,5-0,7 мкм. В ряде случаев можно наблюдать и более длинные нити до 20 мкм, а иногда и до 50 мкм. Полиморфизм и интенсивное нитеобразование характерны для культур легионелл, выделенных из секционного материала или от павших лабораторных животных. После нескольких пассажей на искусственных питательных средах вариабельность формы и размеров клеток легионелл, как правило, исчезает. Легионеллы не образуют спор, размножение происходит путем бинарного деления; они подвижны благодаря наличию одного или нескольких жгутиков, прикрепленных, как правило, к одному из полюсов клетки.

Помимо жгутиков, у многих легионелл на внешней поверхности клеточной стенки формируются пили (фимбрии), равномерно распределенные по всей поверхности клетки. Как правило, фимбрии лучше всего заметны у бактерий в период логарифмической фазы роста на питательных средах. Структура клеточной стенки, включая более электронно-плотный внешний слой и менее плотную ци-топлазматическую мембрану (внутренний слой), в целом, типична для грамотри-цательных бактерий.

Легионеллы значительно отличаются от других грамотрицательных бактерий по содержанию липидных компонентов. Клеточная стенка легионелл характеризуются значительным содержанием фосфолипидов, а среди жирных кислот до 90% составляют соединения с разветвленными боковыми цепями. Среди грамот-рицательных бактерий только Thermus aquaticus и термофильная Flavobacterium содержат значительное количество жирных кислот с разветвленными цепями.

Другим важным отличительным признаком всех видов легионелл является наличие убихинонов (кофермент Q) с боковыми цепями, представленными 9-14 изопреновыми радикалами [1]. Соотношение различных типов жирных кислот и убихинонов является достаточно важным таксономическим признаком, позволяющим идентифицировать различные виды легионелл с помощью газово-жидкостной хроматографии [2]. Данный методический подход активно использовался для таксономически надежной идентификации культур легионелл в 80-е годы прошлого века, пока не был вытеснен бурно развивавшейся техникой молеку-лярно-генетического типирования.

Возбудитель легионеллеза отличается своеобразными требованиями к условиям культивирования. Это факультативный внутриклеточный паразит, требующий для своего культивирования обогащенных питательных сред со специфическими ростовыми добавками и узкого диапазона рН и температуры. В отличие от многих патогенных микроорганизмов, утилизирующих углеводы, легионеллы в качестве источника энергии и питательных веществ используют аминокислоты, а не сахара. Ь-цистеин является обязательным компонентом всех питательных сред для выращивания легионелл. Помимо цистеина показана необходимость для роста легионелл и других аминокислот - аргинина, лейцина, метионина, треонина, серина, валина и изолейцина, а также ионов железа, источником которых в питательных средах является растворимый пирофосфат железа.

Большинство видов легионелл характеризуются сходными культуральными и биохимическими свойствами. Бета-лактамаза продуцируется всеми известными к настоящему времени видами, за исключением L.micdadei, Ь. feeleii и Ь.тасвасЬвгпи. Гидролиз гиппурата характерен для представителей всех серог-рупп вида Ь.рпвыторИНа, за исключением сероваров 4 и 15, а также для Ь. feeleii [3,4]. Практически все штаммы легионелл, за редким исключением, разжижают желатин.

В 80-ые годы прошлого века биохимические и культуральные тесты широко использовались для идентификации видов легионелл. Совокупность тестов включала определение каталазной и оксидазной активности, разжижение желатина, определение тирозиназной активности (образование коричневого пигмента в процессе культивирования), гидролиз гиппурата № и крахмала, анализ флюоресцирующего свечения колоний при ультрафиолетовом освещении, а также цвета колоний на средах с красителями (бромкрезоловым красным и бромтимоловым синим). Но большое число тестов далеко не всегда соответствовало специфичности полученных результатов [21]. В настоящее время биохимические и культу-ральные тесты могут быть использованы для паспортизации штаммов легионелл, но не для быстрой идентификации выделенных культур.

По устойчивости к действию химических и физических факторов легионеллы не отличаются от большинства неспоровых форм бактерий. Возбудитель не обладает кислотоустойчивостью и не окрашивается по Цилю-Нильсену. В лабораторных условиях клетки Ь.рпеиторЫ1а в суспензии (106-107 КОЕ/мл) погибают в течение минуты при действии 1% формалина, 70% этилового спирта, 0,002% фенола. 3% раствор хлорамина вызывал гибель возбудителя в течение 10 мин. при концентрации суспензии легионелл 109К0Е/мл. При хранении культур легионелл в полужидком агаре с добавлением глицерина при -70оС они сохраняли жизнеспособность более 10 лет. Показана также способность легионелл к длительному сохранению в дистиллированной и водопроводной воде - в течение нескольких недель или месяцев при комнатной температуре [5]. Хотя возбудитель высокочувствителен к действию различных химических и физических агентов, требователен к температуре и рН среды культивирования, в водной среде и при низких температурах он может сохраняться достаточно долго. Таким образом, диапазон физико-химических и биологических условий существования легионелл достаточно широк.

Первый штамм легионелл, выделенный от больного во время "филадельфийской" вспышки в 1976 г., был принят за типовой штамм L.pneumophila в разрабатываемой классификации легионелл как нового бактериального рода. Ситуация с таксономией легионелл принципиально отличается по сравнению с большинством других недавно открытых возбудителей. Если возбудитель ВИЧ инфекции относится к хорошо известной группе ретровирусов, возбудитель болезни Лайма -всего лишь новый вид известного рода боррелий, а Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae выделен в самостоятельный вид после детального изучения семейства Chlamydiaceae, то легионеллы образуют самостоятельный род и семейство микроорганизмов. В названии нового бактериального агента увековечены первые жертвы инфекции - участники конгресса организации "Американский леги-он"("Атепсап Legion") и обозначена пневмотропность возбудителя - Legionella pneumophila. Род Legionella образует генетически родственную таксономическую структуру, а семейство Legionellaceae состоит только из одного рода и принадлежит к у подтипу протеобактерий. Общепринятая классификация семейства Legionellaceae основана на работах D.J. Brenner et al., использовавших для определения вида легионелл гибридизацию ДНК [6, 7]. Штаммы легионелл относили к одному виду, если уровень гибридизации ДНК между ними при оптимальных условиях превышал 70%. Гомология у штаммов L. pneumophila составляет 82-99%. Гомология ДНК между отдельными видами легионелл колеблется от 40 до 70%. Для идентификации легионелл до уровня вида используются рестрикционный анализ, ДНК амплификация и секвенирование, анализ жирнокислотного состава клеточной стенки, серологические методы. Биохимические тесты имеют крайне ограниченное значение. В настоящее время известно более 40 видов легионелл, для 22 из которых доказана их роль в инфекционной патологии человека (таблица 1). Более 90% случаев болезни ассоциированы с видом L. pneumophila. Среди других видов легионелл чаще всего заболевание вызывают, как правило, при нарушениях клеточного иммунитета и/или на коморбидном фоне, виды L. micdadei, L. longbeuchae,L. dumoffii и L. bozemanii.

Из-за сложного антигенного состава легионелл определение вида с помощью серологических методов исследования весьма затруднительно. В сочетании с другими фенотипическими характеристиками идентификация до вида возможна лишь в референтных лабораториях. В то же время идентификация рода Legionella и основного патогенного вида L. pneumophila возможна в обычных микробиологических лабораториях. Серотипирование легионелл основано на взаимодействии с гипериммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела к липополисаха-риду (ЛПС) или О-антигену. Вид L. pneumophila включает 15 серогрупп, 8 видов легионелл - по 2 серогруппы, остальные виды - по одной. С L. pneumophila серогрупп 1, 3 и 6 связывают большую часть случаев легионеллеза. Причем около 80% случаев болезни связаны с серогруппой 1, а 5-10% - с серогруппами 4 и 6 [8].

1.1.2 Особенности таксономии легионелл

Современные представления о таксономии легионелл в целом были сформулированы D.J.Brenner с соавт. в промежутке между первым и вторым международными симпозиумами, посвященными болезни легионеров, и проходившими в CDC, Атланта, США, соответственно в 1978 и 1983 гг. Возбудитель вспышки в Филадельфии в 1976 г. был выделен в новый вид L.pneumophila на основании анализа размера генома порядка 2,5х109 типичного для многих бактерий и вдвое превосходящего геном риккетсий; содержании пар нуклеотидных оснований гуа-нин+цитозин (39%) и отрицательных результатов гибридизации ДНК с более 50 видами микроорганизмов с близкими фенотипическими характеристиками и аналогичным содержанием гуанина и цитозина [6]. Эти результаты позволили обосновать выделение нового семейства в таксономии бактерий - семейства Legionellaceae, рода Legionella и первоначально единственного вида L.pneumophila. В основу дальнейшей классификации легионелл был положен новый в то время метод гибридизации ДНК. В 1983 г. род Legionella насчитывал уже 10 видов, а вид L.pneumophila - 8 серогрупп [7].

В дальнейшем стало очевидным, что представителей рода Legionella легко идентифицировать фенотипически на основании их способности к росту на среде BCYEa и неспособности к росту на аналогичной среде без L-цистеина и растворимого пирофосфата железа. Однако, более надежное подтверждение родовой и видовой принадлежности с помощью биохимических методов или анализа состава и количества жирных кислот с разветвленными цепями (высокое содержание этих кислот типично для легионелл - 75-90%) невозможно из-за недостаточно высокой чувствительности данных методов. Метод гибридизации ДНК на этом фоне был наиболее предпочтителен. Степень гибридизации ДНК между различными штаммами L. pneumophila превосходила 70%. Уровень гибридизации между штаммами других видов легионелл был еще выше и составлял 90-100%. Степень гибридизации между штаммами различных видов легионелл всегда составляла менее 70%. Дальнейшая идентификация принадлежности штаммов легионелл к видам и серогруппам осуществлялась серологически с помощью гипериммунных кроличьих сывороток [8].

Метод гибридизации ДНК в сочетании с серотипированием позволил в итоге определить существование в природе не менее 50 видов и более 70 серогрупп легионелл (таблица 1), большая часть которых не имеет значения в инфекционной патологии человека. Помимо вида L.pneumophila не более 5-6 видов можно рассматривать в качестве оппортунистических возбудителей пневмоний, а вид L. longbeachae эндемичен для Австралии.

Таблица 1. Основные виды и серогруппы семейства Legionellaceae, их значение в инфекционной патологии человека.

№ Вид Серогруппа Значение в инфекционной патологии человека

1 L. pneumophila 1 Главный возбудитель легионеллезной пневмонии

2 L. pneumophila 2-15 вторая по значимости группа легионелл в этиологии внебольничных и, особенно, нозокоми-альных пневмоний

3 L. longbeachae 1 и 2 возбудитель внебольничных и внутрибольнич-ных пневмоний (эндемичен для Австралии)

4 L. bozemanii 1 и 2 типичный возбудитель оппортунстической инфекции

5 L. dumoffii 1 - « « -

6 L. micdadei 1 - « « -

7 L. feeleii 1 и 2 - « « -

8 L. gormanii 1 - « « -

9 L. anisa 1 - « « -

10 L. jordanis 1 редкий возбудитель оппортунистической инфекции

11 L. wadsworthii 1 - « « -

12 L. hackeliae 1 и 2 - « « -

13 L. maceachernii 1 - « « -

14 L.

birminghamensis 1 - « « -

15 L. cincinnatiensis 1 - « « -

16 L. sainthelensi 1 и 2 - « « -

17 L. tucsonensis 1 - « « -

18 L. lansingensis 1 - « « -

19 L. erythra 1 и 2 - « « -

20 L. parisiensis 1 - « « -

21 L. oakridgensis 1 - « « -

22 L. spiritensis 1 не играет роли в инфекционной патологии человека

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Карпова Татьяна Игоревна, 2016 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Moss C.W., Further studies of the cellular fatty acid composition of Legionnaires' Disease bacteria / C.W. Moss, S.B. Dees // J.clin.microbiol.-1979.- 9:648-649.

2. Wait R., Confirmation of the identity of Legionellae by whole cell fatty-acid and isoprenoid quinine profiles. / R. Wait, T.Harrison, A.Taylor // In: A laboratory manual for Legionella John Wiley&Sons Ltd. -1988 - P. 69-102.

3. Hebert G. A., Hippurate hydrolysis by Legionela pneumophila / G.A. Hebert // J.clin.microbiol. - 1981 - 13(1) - P. 240-242.

4. Luck P.C., Isolation of Legionella pneumophila strain serologically distinguishable from all known serogroups / P.C. Luck, J.H. Helbig, W. Ehret // Zentalbl. Bacteriol.-1995- 282(1)- P.35-39.

5. Skaliy P., Survival of the Legionnaires Disease' bacterium in water/ P. Skaliy, H.V. McEachern // Ann.Int.Med.- 1979(90) - P. 662-663.

6. Brenner D.A., Classification of Legionnaires' Disease bacterium: Legionella pneumophila, genus novum, species nova, of the family Legionellaceae, familia nova / D.A. Brenner, A. Steigerwalt, Mc J. Dade // Ann.Intern.Med.-1979 (90) - P. 656-658.

7. Brenner D.J. Classification of Legionellae / D.J. Brenner // In:"Legionella" Proc. Of the 2nd. Intern.Symp.-1983 - P.55-60.

8. Balows A., The genus Legionella in "Procaryotes" / A. Balows, D. Brenner // vol.1 Berlin E A.-1981 - P.1091-1102.

9. Adeleke A., Legionella-like amebal pathogens - phylogenetic status and possible role in respiratory disease/ A. Adeleke, J. Pruckler, R. Benson // Emerg. Infect. Dis.-1996- 2(3) - P. 225-230.

10. Ludwig W., A phylogenetic analysis of Legionella / W. Ludwig, E. Stackerbrandt // Arch.microbiol. - 1983 - 135 - P. 45-50.

11. Benson R., Classification of the genus Legionella / R. Benson, B. Fields // Semin. Resp. Infect.-1998-13-P.90-99.

12. Swanson M., Legionella pneumophila pathogenesis: a fateful jorney from amoebae to macrophages / M. Swanson, B. Hammer // Ann. Rev. Microbiol. - 2000 - 54 -P.567-613.

13. Vickers R., Clinical laboratory differentiation of Legionellaceae family members with pigment production and fluorescence on media supplemented with aromatic substrates / R. Vickers, V.L. Yu // J. clin. microbiol. - 1984 - 19(5) - P.583-587.

14. Lawson J.H., Legionnaires disease - the Benidorm episode / J.H. Lawson // Scot. Med. J. - 1978 - 23 - P.121-124.

15. Horwitz M.A., Formation of a novel phagosome by the Legionnaires Disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes / M.A. Horwitz // J. exp. med. -1983 - 158 - P. 1319-1331.

16. Horwitz M.A., Phagocytosis of the Legionnaires Disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil / M.A. Horwitz // Cell - 1984 - 36 - P.27-33.

17. Rowbotham T.J., Current views on the relationships between amoebae, legionella and man./ T.J. Rowbotham // Isr. J. Med. Sci. - 1986 - 22 - P.678-689.

18. Cazalet C., Evidence in the Legionella pneumophila genome for exploitation of host cell function and high genome plasticity / C. Cazalet, C. Rusniok, H. Bruggerman // Nat. Genet. - 2004 - 36 (11) - Р.1165-1173.

19. Chien M., The genomic sequence of the accidental pathogen Legionella pneumophila / M. Chien, I. Morozova, S. Shi // Science. - 2004 - 305(5692) - Р.1966-1968.

20. Seshadry R., Complete genome sequence of the Q-fever pathogen Coxiella burnetii / R. Seshadry, I.T. Paulsen, J.A. Eisen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 2003 -100(9) - Р.5455-5460.

21. Прозоровский С.В., Болезнь легионеров (Легионеллез) / С.В. Прозоровский, В.И. Покровский, И.С.Тартаковский // Москва. Медицина. - 1984.

22. Jones G., "Legionnaires" the disease, the bacterium and methodology. / G. Jones, G.A. Hebert // CDC, Atlanta - 1978.

23. Dournon E., Isolation of Legionellae from Clinical Speciemens / E. Dournon T. Harrison, A.G. Taylor // In: A Laboratory manual for Legionella. John Wiley&Sons Ltd. - 1988 - Р.13-30.

24. WHO Recommended Surveillance Standarts - 2nd ed.- 1999

25. Dennis P.L., Isolation of Legionellae from environmental speciemens / P.L. Dennis, T. Harrison, A.G. Taylor // In: A Laboratory manual for Legionella. John Wiley&Sons Ltd. - 1988 - Р. 31-44.

26. Edelstein P.H., Legionella pneumonias. In: "Respiratory infections: diagnosis and management"/ P.H. Edelstein, R.D. Meyer J. Pennington // Raven Press, New York -1994 - Р.57-71.

27. Тартаковский И.С., Методические особенности диагностики легионеллез-ной пневмонии в лечебно-профилактических учреждениях / И.С. Тартаковский, Г.М. Галстян, Т.И. Карпова // 2012 - 14(2) - Р.100-107.

28. Edelstein P.H., Legionnaires Disease / P.H. Edelstein, R.D. Meyer // A review. Chest. - 1984 - 85(1) - Р.114-120.

29. Taylor T.H., Legionella bozemanii cavitary pneumonia poorly responsive to erythromycin: case report and review / T.H. Taylor, M. Albrecht // Clin. Infect. Dis. -1995 - 20(2) - Р.329-334.

30. Morill W.E., Increased recovery of Legionella micdadei and Legionella bozemanii on buffered charcoal yeast extract agar supplemented with albumin / W.E. Morill, J.M. Barbaree, B.S. Fields // J. clin. microbiol. - 1990 - 28 (3) - Р.616-618.

31. Lee T.C., Growth of 28 Legionella species on selective culture media: a comparative study / T.C. Lee, R.M. Vickers, V.L. Yu // J. clin. microbiol. - 1993 - 31(10) Р.2764-2768.

32. Wilkinson H., Indirect immunofluorescence test for serodiagnosis of Legionnaires Disease: evidence for serogroup diversity of Legionnaires' Disease bacterial antigens and for multiple specificity of human antibodies / H. Wilkinson, B. Fikes, D. Cruce // J. clin. microbiol. - 1979 - 9 - Р.379-383.

33. Farshy C.E., Detection of antibodies to legionnaires disease organism by microagglutination and micro-enzymelinked immunosorbent assay tests / C.E. Farshy, G.C. Klein, J.C. Feeley // J. clin. Microbiol. - 1978 - 7 - Р.327-331.

34. Harrison T.G., The diagnosis of Legionnaires' Disease by estimation of antybody levels. / T. Harrison, A.G. Taylor // In: A Laboratory manual for Legionella John Wiley&Sons Ltd. - 1988 - Р.113-133.

35. Wilkinson H.W., Formalin-killed vercus heat-killed Legionella pneumophila serogroup antigen in the indirect immunofluorescence assay for legionellosis / H.W. Wilkinson, B.J. Brake // J. clin. Microbiol. - 1982 - 16 P.979-981.

36. Fallon R.J., Polyvalent heat-killed antigen for the diagnosis of infection with Legionella pneumophila / R.J. Fallon, W.H. Abraham // J. clin. Pathol. - 1982 - 35 -P.434-438.

37. Wilkinson H.W., Measure of immunoglobulin G-, M-and A-specific titers against Legionella pneumophila and inhibition of titers against nonspecific, gram negative bacterial antigens in the indirect immunofluorescence test for legionellosis / H.W. Wilkinson, C.E. Farshy, B. Fikes B. // J. Clin. Microbiol. - 1979 - 10 - P.685-689.

38. Bangsborg J.M., Performance of four different indirect enzyme-linked immunosorbent assays (ELIZAs) to detect specific JgG, JgA and JgM in Legionnaires' Disease / J.M. Bangsborg, G. Shand, K. Hansen, H. Wright // APMIS - 1994 - 102 -P.501-508.

39. Harrison T.G., The serological diagnosis of Legionnaires' Disease / T.G. Harrison // PhD. Thesis, University of London - 1984.

40. Luck P.C., Epidemiology and laboratory diagnosis of Legionella infection / P.C. Luck, J.H. Helbig, M. Schuppler // J. lab. Medicine - 2002-26(2/3)-P.174-182.

41. Harrison T.G., Evaluation of sensitivity of two serological tests for diagnosing pneumonia caused by Legionella pneumophila serogroup 1 / T.G. Harrison, E. Dournon, A.G. Taylor // J. Clin. Pathol. - 1987 - 40 - P.77-82.

42. Fields B.S., Legionella and Legionnaires Disease: 25 years of investigation/ B.S. Fields, R.F. Benson, R.E. Besser // Clin. Microb.Rev., 2002 - 15(3) P.506-526.

43. Васильева В.И., Иммуноструктура населения некоторых районов СССР к Legionella pneumophila / В.И. Васильева, С.В. Прозоровский, Е.В. Русакова// Журн. Микробиол. - 1986 - 7-Р.75-79.

44. Berdal B., Detection of Legionella pneumophila antigen in urine by enzyme-linked immunospecific assay/ В. Berdal, C.E. Farshy, J.C. Feeley // J. Clin. Microbiol. -1979- 9 - Р.575-578.

45. Tilton R.C. , Legionnaires Disease antigen detected by enzyme-linked immunosorbent assay/ R.C. Tilton // Ann. Intern. Med. - 1979- 90 - Р.697-698.

46. Kohler R., Rapid immunoassay diagnosis of Legionnaires' Disease: detection and partial characterization of urinary antigen / R.Kohler, S.E. Zimmerman, E. Wilson // Ann. Intern. Med. - 1981 - 94 - Р. 601-605.

47. Bernander S., Legionella urinary antigen in early disease / S. Bernander, B. Gastrin, S. Logfren, A.M. Olinder-Nielsen // Scand. J. Infect. Dis. - 1994 - 26 - Р.777-778.

48. Dominguez J., Evaluation of a rapid immunochromatographic assay for detection the detection of Legionella antigen in urine samples / J. Dominguez, N. Gali, L. Matas // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 1999 - 18 - Р.896-898.

49. Harrison T., A multicenter evaluation of the Biotest Legionella urinary antigen EIA / T. Harrison, S. Uldum, F. Fehrenbuch // Clin.Microbiol.Infect. - 1998 - 4(7) -Р.359-365.

50. Helbig J., Detection of Legionella pneumophila antigen in urine samples by the BinaxNOW immunochromatographic assay and comparison with both Binax Legionella Urinary Enzyme Immunoassay(EIA) and Biotest Legionella Urin antigen EIA / J. Helbig, S. Uldum, P.C. Luck // J. Med. Microbiol. - 2001 - 50(6) - Р.509-516.

51. Andreo F., Impact of rapid urine antigen tests to determine the etiology of community-acquired pneumonia in adults / F. Andreo, J. Dominguez, J. Ruiz // Respir. Med. - 2006- 100(5) - P. 884-891.

52. Cherry W.B., Detection in Clinical Specimens by direct immunofluorescence / W.B. Cherry, R.M. McKinney // In: "Legionnaires" the disease, the bacterium and methodology, ed G.Jones&G.Hebert, Atlanta, CD - 1988 - P.129-146.

53. Edelstein P.H., Evaluation of the Merifluor Legionella immunofluorescent reagent for identifying and detection 21 Legionella species / P.H. Edelstein, M.A. Edelstein // J. Clin. Microbiol. - 1989 - 27 - P.2455-2458.

54. Gosting L.H., Identification of a species-specific antigen in Legionella pneumophila by a monoclonal antibodies / L.H. Gosting, C. Cabrian, J. Sturge, L. Goldstein // J. Clin. Microbiol - 1984 - 20 - P.1031-1035.

55. Fliermans C.B., Ecological distribution of Legionella pneumophila / C.B. Fliermans, W.B. Cherry, L.N. Orrison // Appl. Environ. microb. - 1981 - 41 - P.9-16.

56. Fliermans C.B., Philosophical ecology: Legionella in Historical perspective / C.B. Fliermans // In: Legionella, Proc. Of the 2nd Intern. Symp., Atlanta - 1983 - P. 285-289.

57. Fliermans C.B. , Autecology of Legionella pneumophila / C.B. Fliermans // Zbl. Bact. Hyg. I Abt. Orig. - A255 - 1983 - P.58-63.

58. Sheehan K.B., Legionella species diversity in an acidic biofilm community in Yellowstone National park / K.B. Sheehan, J. Henson, M. Ferris // Appl. Environ. Microbiol. - 2005 - 71(1) - P.507-511.

59. Tyndall R., Thermally altered habitats as a source of known and new Legionella species / R. Tyndall, S.W. Christensen, J. Solomon // In: Legionella, Proc.of the 2nd Intern.Symp., Atlanta - 1983 - P.311-313.

60. Ballard A.L., Detection of Legionella pneumophila using a real-time PCR hybridization assay. / A.L. Ballard, N. Fry, L. Chan // J. clin. microbiol. - 2000 - 38 -Р.4215-4218.

61. Ortiz-Roque C.M., Abundance and distribution of Legionellaceae in Puerto Rican waters / C.M. Ortiz-Roque, T.C. Hazen // Applied and Environmental Microbiology -1987 - 53 - Р.2231-2236.

62. Legionnaires Disease associated with potting soil - California, Oregon, and Washington, May-Yune 2000 - Morb.Mortal.Wkly - Rep.49 - Р.777-778.

63. Colbourne J.S., Legionella and public water supplies / J.S. Colbourne // Water Science and Technology -1988 - 20(11-12) - Р.5-10.

64. Colbourne J.S., The Ecology and Survival of Legionella Pneumophila / J. S. Colbourne, P. J. Dennis // Water and Environment Journal - 1989 - 3 -Р.345-350.

65. Соколенко А.В., Некультивируемые формы бактерий: распространение в природе, индукторы некультивируемого состояния и реверсии / А.В. Соколенко// Биол.науки - 2006 - 2 - Р.11-15.

66. Dykhuizen D.E., Santa Rosalia revisited: Why are there so many species of bacteria? / D.E. Dykhuizen // Antonie van Leenwenhoek - 1998 - 73 - Р.25-33.

67. Романова Ю.М., Генетический контроль индукции некультивируемого состояния у патогенных бактерий / Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // ЖМЭИ -1996 - 3 - С.16-18.

68. Stout J. E., Ecology of Legionella pneumophila within water distribution systems / J. E. Stout, V. L. Yu, M. G. Best // Appl Environ Microbiol - 1985 - 49 - P.221-228.

69. Steinert M., Resuscitation of viable but nonculturable Legionella pneumophila Philadelphia JR32 by Acanthamoeba castellanii / M. Steinert, L. Emödy, R. Amann, J. Hacker // Appl Environ Microbiol - 1997 - 63 - P.2047-2053.

70. James B., Poly-3-Hydroxybutyrate in Legionella pneumophila, an Energy Source for Survival in Low-Nutrient Environments / B. James, W.S. Mauchline, P.J. Dennis // Appl Environ Microbiol - 1999 - 65(2) - P.822-827.

71. Dennis P., A note on the temperature tolerance of Legionella. J. / P. Dennis, D. Green, B.P. Jones // Appl. Bacteriol - 1984 - 56 - P.349-350.

72. Yee R.B., Multiplication of Legionella pneumophila in unsterilized tap water / R.B. Yee, R.M. Wadowsky // Appl. Environm Microbiol - 1982 - 43 - P.1330-1334.

73. Pritchard D.G., Failure to detect antibodies to Legionella pneumophila serogroup 1 in bovine and porcine sera from outbreaks of severe respiratory disease / D.G. Pritchard, A.D. Macrae, A. Laverick // Vet.Rec - 1980 - 106 - P.367.

74. Boldur L., Isolation of Legionella pneumophila from calves and the prevalenc of antibodies in cattle, sheep, horses, antelopes, buffaloes and rabbits / L. Boldur, A. Cohen, R. Tamarin-Landau, D. Sompolinsky // Vet.microbiol - 1987 - 13 - P.313-320.

75. Rowbotham T.J., Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae / T.J. Rowbotham // J.clin.Pathol - 1980 - 33 - P. 1179-1183.

76. Drozanski W., Fatal bacterial infection in soil amoebae. / W. Drozanski // Acta.microbiol., Pol. - 1956 - 5(3-4) - P.315-317.

77. Hookey J.V., Phylogeny of legionellaceae based on small-subunit ribosomal DNA sequences and proposal of Legionella lytica comb.nov. for Legionella-like amoebal pathogens / J.V. Hookey, N. Saunders, N.K. Fry et.al // Int.J.Syst.Bacteriol -1996 - 46 - P.526-531.

78. Steinert M., Interaction of Legionella pneumophila with Dictyostelium discoideum / M. Steinert, S. Hagele, C. Skrivan et.al // In:Legionella ed.R.Marre., ASM press, Washington - 2002- P.161-164.

79. Пушкарева В.И., Анализ механизмов межпопуляционного взаимодействия иерсиний с инфузориями на клеточном и субклеточном уровне / В.И. Пушкарева, Н.Д. Константинова, В.Ю. Литвин и др. // Журн.микробиол. - 1990 - 1- C.39-45.

80. Rowbotham T.J., Legionella and amoebae / T.J. Rowbotham // In: Legionella, Proc.of the 2nd Intern.Symp., Atlanta -1983- P.325-327.

81. Stout J. E., Ecology of Legionella pneumophila within water distribution systems / J. E. Stout, V. L. Yu, M. G. Best // Appl Environ Microbiol - 1985 - 49 - P.221-228.

82 Colbourne J.S., Water fittings as sources of Legionella pneumophila in a hospital plumbing system / J.S. Colbourne, D. Pratt, D. Smith et.al. // Lancet - 1984 - 1 - P.210-213.

83. Schofield M.G., Colonization of components of a model hot water systems by Legionella pneumophila / M.G. Schofield, R. Locci // J.appl.bacteriol - 1985 - 58 -P.151-162.

84. Colbourne J.S., Rubbers, waters and Legionella / J.S. Colbourne, J. Ashworth // Lancet - 1986 - 2(8506) - P.583.

85.States S.J., Effects of metals on Legionella pneumophila growth in drinking water plumbing systems / S.J. States, L.F. Conley, M. Ceraso et.al. // Appl.Environm.Microbiol -1985 - 50(5) - P. 1149-1154.

86. Rogers J., Immunogold and fluorescein immunolabelling of Legioinella pneumophila within an aquatic biofilm visualized by using episcopic differential interference contrast microscopy / J. Rogers, C.W. Keevil // Appl.Environ.Microbiol - 1992 - 58 - P.2326-2330.

87. Rogers J., Influence of plumbing material on biofilm formation and growth of Legionella pneumophila in a potable water systems / J. Rogers, A.B. Dowsett, P.J. Dennis et.al.// Appl.Environ.Microbiol - 1994 - 6 - P.1842-1851.

88. Fields B., The social life of Legionellaeae / B. Fields // In:Legionella ed. Marre R. ASM Press - 2002 - P.135-142.

89. Voronina O.L., The microbial composition of biofilms maintaining Legionella pneumophila in cooling towers and autonomous water systems. / O.L. Voronina, M.S. Kunda, V.V. Bitkina et.al. // Abst.of 26th EWGLI meeting, Vienna - 2011 - P.59.

90. Rogers J., A paint incorporation silver to control mixed biofilms containing Legionella pneumophila / J. Rogers, A.B. Dowsett, C.W. Keevil // J.Ind.Microbiol - 1995

- 15(4) - P.377-383.

91.Van der Kooij D., Biofilm formation and multiplication of Legionella in a model warm water system with pipes of cooper, stainless, steel and cross -linked polyethylene / D. Van der Kooij, H. Veenendaal, W.J. Sheffer // Water Res. - 2005 - 39 - P.2789-2798.

92.Loret J., Comparison of desinfectants for biofilm, protozoa, and Legionella control / J. Loret, S. Robert, V. Thomas et.al. // J.water health - 2005 - 3(4) - P.423-433.

93.Thomas V., Amoebae in domestic water systems: resistance to disinfection treatments and implication on Legionella persistence / V. Thomas, T. Bouchez, V. Nicolas et.al. // J.Appl.Microbiol - 2004 - 97(5) - P.950-963.

94._Feeley J., Primary isolation medium for Legionnaires Disease Bacterium / J. Feeley, G. Gorman, R.E. Weaver // J.clin.microbiol - 1978 - 8 - P.320-325.

95.Feeley J.C., Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila / J.C. Feeley, R. Gibson, G.W. Gorman// J. clin. Microbiol. - 1979 - 10, 4

- P.437-441.

96. Edelstein P.H., Improved semiselective medium for isolation of Legionella pneumophila from contaminated clinical and environmental specimens / P.H. Edelstein // J. clin. Microbiol. - 1981 - 14(3)- Р.298-303.

97. Saunders N.A., The application of nucleic acid probes and monoclonal antibodies to the investigation of Legionella infections / N.A. Saunders, T.G. Harrison // In: A Laboratory manual of for Legionella ,ed. T.Harrison&A.G.Taylor,John Wiley&Sons Ltd -1988 - Р.137-154.

98. Wilson D., Detection of Legionella pneumophila by real-time PCR for the mip gene / D. Wilson, B. Yen-Lieberman, U. Reisci // J. clin. Microbial - 2003 - 41(7) -Р.3327-3330.

99. Wellinghausen N., Detection of Legionella in hospital water samples by quantative real-time lightcycler PCR / N. Wellinghausen, C. Frost, R. Marre // Appl. And Environm. Microbiol. - 2001 - 67(9) - Р.3985-3993.

100. Wilson D.A., Detection of Legionella pneumophila by real-time PCR for the mip gene / D.A. Wilson, B. Yen-Liberman, U. Reischl // J. clin. microb. - 2003 - 41(7) - Р.3327-3330.

101.Garrelly L., Advantages of a standardization procedure for Real-Time PCR detection and quantification of Legionella (AFNOR T90471 standard) / L. Garrelly // In.: Abstract book of 1st BIO-RAD international Legionella conference - 2007 - Р.8-9.

102. Литвин В.Ю., Эпидемиологические аспекты экологии бактерий / В.Ю. Литвин, А.Л. Гинцбург, В.И. Пушкарева, Ю.М. Романова, Б.В. Боев // Москва -1988.

103. Marra A., Identification of Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages / A. Marra, S. Blander, M.A. Horwitz, H.A. Shuman // Proc.Natl.Acad.Sci.USA - 1992 - 89 - P.9607-9611.

104.Isberg R.R., The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells / R.R. Isberg, T. O'Connor, M. Heidtman // Nature Reviews -2009 - 7(1) - P.13-24.

105. Soderberg M.A., The type 11 protein secretion system of Legionella pneumophila promotes growth at low temperatures / M.A. Soderberg, O. Rossier, N.P. Cianciotto // J.Bacteriol - 2004 - 186 - P.3712-3720.

106. Сперанская Е.В., Изучение распространенности редких и трудно-культивируемых возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания / Е.В. Сперанская, В.Н. Мазепа, Е.И. Ефимов, Н.Ф. Бруснигина // ЖМЭИ - 2012 - 5

- С.3-7

107. Шкарин В. В., Оценка эпидемиологической ситуации по лигионеллезу в Нижегородской области / В. В. Шкарин, О. А. Чубукова, О. В. Ковалишена, А. С. Благонравова // Медицинский альманах - 3(22) - 8 - 2012.

108. Тартаковский И. С., Моногр. Профилактика, диагностика и лечение легио-неллеза / И. С. Тартаковский, О.А. Груздева, Г.М. Галстян, Т.И. Карпова // Москва

- 2013

109. Legionella and prevention of Legionellosis. Ed. by J.Bartram., WHO, 2007.

110. Бызова Н.А., Разработка экспресс-теста для выявления микроальбуминурии / Н.А. Бызова, С.П. Ярков, В.Н. Злобин и др. // Физиология и патология иммунной системы - 2005 - 8 - C.41-5.

111. Ярков С.П., Разработка технических средств иммунохроматографического анализа для выявления возбудителя легионеллеза / С.П. Ярков, С.И. Третьяков, Л.А. Башарова, И.С. Тартаковский, Т.И. Карпова, Ю.Е. Дронина // Матер. IX Межгос. науч.-практ. конф. Волгоград - 2008 - С.160.

112. Методические рекомендации №01/14633-8-34 «Выявление антигена бактерий рода Legionella pneumophila серогруппы 1в клиническом материале иммуно-хроматографическим методом». Роспотребнадзор. 2010.

113. Соколов А.Н., Респираторные проявления внелегочных заболеваний. Гематологические заболевания / А.Н. Соколов, Г.М. Галстян, В.Г. Савченко // В кн.: Респираторная медицина. Под ред А.Г. Чучалина. М. 2007 г., ГЭОТАР-Медиа, Т. 2: 605-19.

114. Яцышина С.Б., Разработка и применение ПЦР с гибридизационно-флуоресцентнй детекцией для обнаружения Legionella pneumophila / С.Б. Яцышина, С.А. Портенко, Т.С. Астахова и др. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии - 2008 - 2 - C.29-37.

115. Садретдинова О.В., Контаминация Legionella pneumophila систем горячего водоснабжения зданий общественного назначения, в том числе лечебно-профилактических учреждений / О.В. Садретдинова, О.А. Груздева, Т.И. Карпова с соавт. // Клин.микробиол.антимикроб.химиотер. - 2011 - 2 - C.163-167.

116. Helbig J., Pan-European study on culture-proven Legionnaires' disease: distribution of Legionella pneumophila serogroups and monoclonal subgroups / J. Helbig, S. Bernander, M. Castellani Pastoris, et al // Eur J Clin Microbol Infect Dis 2002 - 21 -P.710-716.

117. Helbig J., Antigenic lipopolysaharide components of Legionella pneumophila recognized by monoclonal antibodies: possibilities and limitations for division of the species into serogroups / J. Helbig, J. Kurtz, M. Castellanii Pastoris et.al // J.clin.microbiol. - 1997 - 35(11) - P.2841-2845.

118. European Working Group for Legionella Infections Sequence-Based Typing (SBT) protocol for epidemiological typing of Legionella pneumophila Version 3.0, October 2007.

119. Fry N.K., Identification of Legionella spp. By 19 European reference laboratories: result of the European Working Group for Legionella Infections External Ouality Assessmant Scheme using DNA sequencing of the macrophage infectivity potentiator gene and dedicated online tools / N.K. Fry, B. Afshur, W. Bellamy et al. // Clin Microbiol Infect. - 2007 - 13(11) - P.1119-11124.

120. Воронина О.Л., Молекулярно-генетическое типирование штаммов Legionella pneumophila и Legionella spp., выделенных на территории Российской Федерации / О.Л. Воронина, М.С. Кунда, В.Г. Лунин, Т.И. Карпова, И.С. Тартаков-ский // Клин.микробиология и антимикробная химиотерапия - 2008 - 10 - 2 -C.154-163.

121. Карпова Т.И., Природные биопленки легионелл и их роль в эпидемиологии инфекции: методы изучения и моделирования / Т.И. Карпова, Ю.Е. Дронина, И.С. Тартаковский, Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Журн. микробиол. №2 - 2008 -C.13-16.

122. Тартаковский И.С., Методические особенности диагностики легионеллез-ной пневмонии в лечебно-профилактических учреждениях / И.С. Тартаковский, Р.Р. Адгамов, С.А. Ермолаева и соавт. // Часть 2. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. - 2013 - 15(3) - C.166-17.

123. Карпова Т.И., Формирование биопленок Legionella spp. в эксперименте / Т.И. Карпова, Ю.Е. Дронина, Н.В. Алексеева, Ю.М. Романова, И.С. Тартаковский // Журн. микробиол. №1 - 2008 - C.3-7.

124. Диденко Л.В., Морфологические особенности биопленок в потенциально опасных водных системах / Л.В. Диденко, О.В. Садретдинова, Н.В. Шевлягина, Г.А. Автандилов, И.В. Новокшонова, Т.И. Карпова, О.А. Груздева, И.С. Тартаковский // Эпидемиология и инфекционные болезни - 2012 -1 - C.15-20.

125. Ito S., Formaldehyde/glutraraldehyde fizatives containing trinitro compounds / S. Ito, M.J. Karnovsky // J.Cell.Biol. - 1968 - 39 - P.168a-169a.

126. Newman G.R., The preservation of ultrastructure and antigenicity / G.R. Newman, B. Jasani, E.D. Williams // J.microscopy. - 1982 -127 - P.RP5-RP6.

127. Reynolds E.S., The use of lead citrate at high ph an electron-opaque stain in electron microscopy / E.S. Reynolds // J.Cell. Biol. - 1963 - 17(1) - P.208-21

128. СП 1.3.1318-03. Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами. 2003.

129. Методические рекомендации «Выявление и количественное и определение легионелл в водных образцах внешней среды методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием тест-систем производства ЗАО Синтол.» МР 02.039-09 Роспотребнадзора. (Аляпкина Ю.С., Новокшонова И.В., Тартаковский И.С. с соавт.)

130. Guidelines for preventing health-care associated pneumonia 2003: recommendation of CDC and the Health care Infection Control Practices Advisory Committee. MMWR Recomm. Rep. - 2004 - 26 - 53(RR-3) - P.1-36.

131. Прозоровский С.В., Выявление болезни легионеров на территории СССР / С.В. Прозоровский, В.И. Васильева, И.С. Тартаковский // Журн.микробиол. - 1980 - 7 - C.105-107.

132. Покровский В.И., Этиологическая диагностики и этиотропная терапия острых пневмоний / В.И. Покровский, С.В. Прозоровский, В.В. Малеев, И.С. Тартаковский // Медицина - Москва - 1995.

133.Темежникова Н.Д., Легионеллезная инфекция / Н.Д. Темежникова, И. С. Тартаковский // Медицина - Москва - 2007- С.260.

134. Бобылева З.Д., Клинико-лабораторная характеристика легионеллезной пневмонии (по материалам эпидемической вспышки легионеллеза в Свердловской области) / З.Д. Бобылева, И.В. Лещенко // Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. - 2010 - 12(2) - C.117-126.

135. Бобылева З.Д., Легионеллезная пневмония: Диагностика, клиническая картина, лечение, отдаленные результаты (по материалам эпидемической вспышки легионеллеза в Свердловской области) / З.Д. Бобылева // Автореф. дисс. докт. мед. наук - Москва - 2010 - С.43.

136. Тартаковский И.С., Выделение первых штаммов Legionella pneumophila в СССР / И.С. Тартаковский, С.В. Прозоровский, В.Л. Попов // Журн.микробиол. -1983- 11 - C.41-46.

137. Stout J.E., Hospital-acquired Legionnaires Disease: new developments / J.E. Stout, V.L. Yu // Curr Opin Infect Dis. - 2003 - 16(4) - P.337-338.

138. Тартаковский И. С., Стандарты лабораторной диагностики легионеллеза и их применение во время эпидемической вспышки пневмоний в г. Верхняя Пышма / И.С. Тартаковский, А.Л. Гинцбург, Г.Ф. Лазикова и соавт. // Журн.микробиол. -2008 - 2 - C.16-19.

139. Дронина Ю.Е., Серологическая характеристика штаммов Legionella pneumophila, выделенных из потенциально опасных водных систем в Российской Федерации в 2007-2011годах / Ю.Е. Дронина, И.С. Тартаковский, О.В. Садретди-нова, Т.И. Карпова, И.В. Новокшонова, О.А. Груздева, Н.В. Каражас, Т.Н. Рыбал-кина // Ж.микробиол. - 2012 - 2 - C.23-28.

140. Lueck C., A large community outbreak of Legionnaires Disease during winter time in Germany / C. Lueck, G. Harter, A. Essig et.al. // Abst.of 25th EWGLI meeting, Copenhagen, Denmark - 2010 - P.22.

141. Pelaz C., Utility of SBT and nested-PCR SBT in the Legionnaires Disease outbreak in Madrid, Spain / C. Pelaz, B. Baladron, C. Elola et.al. // Abst.of 26th EWGLI meeting. Vienna, Austria - 2011- P.21.

142. McCormick, Public Health response to an outbreak of Legionnaires Disease in Edinburgh / McCormick, S. Thorn, D. Milne et.al. // United Kingdom - June 2012 -Eurosurveillance - 17 (28) - P.20216.

143. Яцышина С.Б., Астахова Т.С., Романенко В.В. и др., Применение молеку-лярно-генетических методов при расследовании вспышки болезни легионеров в г. Верхняя Пышма / С.Б. Яцышина, Т.С. Астахова, В.В. Романенко и др. // Журн.микробиол. - 2008 - 2 - C.23-28.

144. Gilmour M.W., Bernard K., Tracz D.M. et.al., Molecular typing of a Legionella pneumophila outbreak in Ontario, Canada / M.W. Gilmour, K. Bernard, D.M. Tracz et.al. // J.med.microbiol - 2007 - 56(3) - P.336-341.

145. Vanaclocha H., Guiral S., Morera V.et.al., Preliminary report: Outbreak of legionnaires Disease in a hotel in Calp, Spain / H. Vanaclocha, S. Guiral, V. Morera et.al. // Eurosurveiilance - 2012 - 17(8) - P. 51-54.

146. Oren I., Zuckerman T., Avivi I. et.al., Nosocomial outbreak of Legionella pneumophila serogroup 3 pneumonia in a new bone marrow transplant unit: evaluation, treatment and control / I. Oren , T. Zuckerman, I. Avivi et.al. // Bone Marrow Transplant - 2002 - 30(3) -P. 175-79.

147. Struelens M.J., Brisse J., From molecular to genomic epidemiology: transforming surveillance and control of infectious diseases / M.J. Struelens, J. Brisse // Eurosurveillance - 2013 - (1) - P.2-5.

148. Савинова Т.А., Филимонова О.Ю., Грудинина С. А.,Сидоренко С.В., Генетическое разнообразие пенициллиноустойчивых Streptococcus pneumonia / Т.А.

Савинова, О.Ю. Филимонова, С.А. Грудинина, С.В. Сидоренко // Журн.инфектологии - 2011 - (4)- C.66-71.

149. Эйдельштейн М. В. , Склеенова Е. Ю. , Шевченко О. В. и соавт., Распространенность и молекулярная эпидемиология грамотрицательных бактерий, продуцирующих металло-бета-лактамазы в России, Беларуси и Казахстане / М.В. Эйдельштейн, Е.Ю. Склеенова, О.В. Шевченко и соавт // Клин микробиол антимикроб химиотер - 2012 - 14(2) - C.132-152.

150. Harrison T. G., Afshar B., Doshi N., Fry N. K., Lee J. V., Distribution of Legionella pneumophila serogroups, monoclonal antibody subgroups and DNA sequence types in recent clinical and environmental isolates from England and Wales (20002008) / T. G. Harrison, B. Afshar, N. Doshi, N. K. Fry, J. V. Lee // Eur J Clin Microbiol Infect Dis - 2009.

151. Ragul S., Garsia-Nunez M., Pedro-Botet M.L. et al. Legionella pneumophila in cooling towers: fluctuations in counts, determination of genetic variability by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), and persistence of PFGE patterns. Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73 (16): 5382-5384

152. Luck P.C., Helbig J.H. Typing of Legionella strains isolated from patients and environmental sources in Germany, 1990 to2000.In:Marre et.al. ed. Legionella, ASM Press, Washington, 2002:267-270.

153. Садретдинова О.В., Груздева О.А., Карпова Т.И. с соавт., Контаминация Legionella pneumophila систем горячего водоснабжения зданий общественного назначения, в том числе лечебно-профилактических учреждений. Клин.микробиол.антимикроб.химиотер. 2011, 2:163-167.

154. ISO 11731-2:2004 ISO Standard: Water quality - detection and enumeration of Legionella.

155. HSE, Legionnaires disease - a guide for employers.2004, London.

156. СП 3.1.2.2626-10 «Профилактика легионеллеза» 2010г.

157. Hu J. , Direct detection of Legionellae in respiratory tract specimens by using fluorescence in situ hybridization / J. Hu, R. Marre// Legionella, Washington DC, ASM Press -2002 - P.221-224

158. Uldum S.A., PCR is routine method for diagnosis of Legionnaires disease / S.A. Uldum, K. Molbak // Legionella, Washington DC, ASM Press -2002 - P.213-215