Выявление геномов возбудителей аденоматоза и висна-маеди овец с помощью полимеразной цепной реакции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Бурдинский, Владимир Геннадьевич

• Бурдинский, Владимир Геннадьевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бурдинский, Владимир Геннадьевич

Оглавление.

Список сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1.Актуальность избранной темы работы.

1.2. Цель и задачи исследований.

1.3. Научная новизна работы.

1.4. Практическая значимость.

1.5. Публикации результатов исследований.

1.6. Апробация материалов исследований.

1.7. Личный вклад соискателя.

1.8. Основные положения, выносимые на защиту.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Структура и организация генома вирусов аденоматоза легких овец и висна-маеди.

2.2. Филогенетический анализ возбудителей аденоматоза легких и висна-маеди овец.

2.3. Характеристика аденоматоза легких овец.

2.3.1. Распространение аденоматоза легких овец.

2.3.2. Классические методы диагностики аденоматоза легких овец.

2.3.3. Молекулярная диагностика аденоматоза лёгких овец.

2.4. Характеристика висна-маеди овец.

2.4.1. Распространение висна-маеди овец.:.

2.4.2. Классические методы диагностики висна-маэди овец.

2.4.3. Молекулярная диагностика висна-маеди.

2.5.Создание диагностических тест-систем на основе использования ПЦР

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выявление геномов возбудителей аденоматоза и висна-маеди овец с помощью полимеразной цепной реакции»

1.1 .Актуальность избранной темы работы

Медленные инфекции животных - традиционно сложившееся наименование группы инфекционных болезней, которые представляют собой серьёзную проблему в связи с их скрытым течением, неизбежным летальным исходом, а так же отсутствием средств лечения и профилактики [29, 150]. В основном - это болезни, поражающие только один орган или систему тканей и один вид животных или родственные виды, принадлежащие к одному систематическому рангу (семейство, отряд) [4]. К группе медленных инфекций животных относятся болезни, вызываемые такими возбудителями как прионы - губкообразная энцефалопатия КРС, скрепи, а также вирусные инфекции - алеутская болезнь норок, инфекционная анемия лошадей, артрит-энцефалит коз и другие заболевания, среди которых аденоматоз лёгких и висна-маеди овец по степени распространённости и уровню экономического ущерба занимают одно из главных мест [4].

Для медленных инфекций характерно отсутствие сезонности и периодичности эпизоотий, географической приуроченности. В то же время чётко прослеживается энзоотичность болезней [4].

Аденоматоз легких овец (АЛО) или легочная аденокарцинома, энзоотический прогрессирующий аденоматоз - контагиозная трансмиссивная метастазирующая опухоль легких овец, реже коз, возникающая в терминальных бронхиолах из пневмоцитов типа II (типа В) и клеток Клара и неизбежно ведущая к гибели животного [5]. Морфологически заболевание схоже с бронхоальвеолярной карциномой человека [184, 153].

Возбудитель АЛО по современной классификации Международного комитета по таксономии вирусов (МКТВ) относится к роду Betaretrovirus подсемейству Orthoretrovirinae семейства Retroviridae [116].

В настоящее время АЛО диагностируют на основании комплекса эпизоотологических и клинических данных, результатов патологоанатомического вскрытия животного. Из лабораторных методов исследования применяется гистологическое исследование пораженных тканей легких овец. Прижизненная серологическая диагностика не разработана вследствие того, что данный возбудитель не вызывает образования специфических антител в организме поражённых животных [139].

Таким образом, единственный метод лабораторной диагностики АЛО является длительным и трудоемким, не позволяющим проводить прижизненную диагностику болезни. В связи с вышеизложенным возникает необходимость в разработке тест-систем, позволяющих обнаруживать геном данного вируса, как при жизни животного, так и посмертно, но в более короткие сроки, по сравнению с гистологическим методом.

В последние годы для обнаружения вирусного генома АЛО широко применяют метод полимеразной цепной реакции и секвенирование генома, которые открывают новые возможности для усовершенствования диагностики АЛО [122, 123, 120, 205, 195].

Висна-маеди (ВМ) - термин, принятый для обозначения двух симптомокомплексов, связанных с патологией центральной нервной системы и легких овец. Термин имеет исландское происхождение, висна переводится как «изнурение», «истощение», маеди — как «одышка». Маеди — медленно прогрессирующая вирусная интерстициальная пневмония овец; висна — безлихорадочная вирусная медленная инфекция овец, которая характеризуется развитием менингита и энцефаломиелита, проявляющихся атаксией и параличами [5].

Висна и маеди впервые описаны в Исландии как две самостоятельные болезни [144]. Однако в опытах на животных было показано, что одни и те же штаммы могут вызывать патологию, характерную и для висны, и для маеди. Так, после интрацеребральной или интрапульмональной инокуляции штаммов вируса маеди наблюдали типичную клинику висны. С другой стороны, параллельно с развитием клиники висны поражения, типичные для маеди, развивались после интрацеребрального введения вируса висны [104].

По современной классификации МКТВ возбудитель ВМ относится к роду Ьеп1:тги5 подсемейству ОгЙюгейчтппае семейства Б1е1;гоутс1ае [116].

В Российской Федерации для установления этиологического объекта болезни на настоящий момент разработан метод РДП для диагностики ВМ, отличающийся низкой чувствительностью, что не позволяет диагностировать данное заболевание на ранних стадиях [26, 139]. За рубежом для диагностики широко применяется метод ИФА, дающий быстрые результаты при относительно невысоких затратах [139]. Недостатком ИФА является то, что не все животные дают достаточный для выявления антительный ответ на данный патоген, либо дают позднее накопление антител в сыворотке крови, вследствие чего эти животные остаются скрытыми носителями вируса ВМ [139, 42].

Приоритетность разработки новых эффективных диагностических препаратов против латентных инфекций животных обусловлена тем, что при возросших торгово-экономических связях растет вероятность заноса в страну их возбудителей племенными животными.

Избирательная амплификация отдельных участков вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции и их секвенирование с последующим филогенетическим анализом, дополняя серологические методы, открывают новые возможности для прижизненного выявления возбудителей инфекционных заболеваний, а также путей их заноса в хозяйства и проведение соответствующих мероприятий для предотвращения их дальнейшего распространения.

В связи с вышеизложенным, разработка методов выявления геномов вирусов ВМ и АЛО имеет важное эпизоотологическое и диагностическое значение для ветеринарии и является актуальной.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Бурдинский, Владимир Геннадьевич

6. ВЫВОДЫ

1. На основе анализа банка нуклеотидных последовательностей подобраны уникальные праймеры комплементарные ЬТЯ-участку генома возбудителя аденоматоза легких овец. Отработаны оптимальные условия постановки ПЦР, позволяющие выявлять наличие генома возбудителя аденоматоза легких овец в пробах крови подозреваемых в заболевании животных.

2. В результате проведенного анализа банка нуклеотидных последовательностей подобраны уникальные праймеры комплементарные §а§-гену вируса висна-маеди. Отработаны оптимальные условия постановки ПЦР, позволяющие выявлять наличие генома вируса висна-маеди в пробах клинического и патологического материала с аналитической чувствительностью 100-1000 копий генома в 1 мл пробы.

3. На основе исследований проб крови овец методом ПЦР установлена циркуляция возбудителя аденоматоза легких овец в овцеводческих хозяйствах на территории Удмуртии и Ярославской области. Доля положительно реагировавших образцов от числа исследованных составила 2,4 % в хозяйствах Удмуртии и 23 % - Ярославской области.

4. Установлено, что циркулирующий возбудитель аденоматоза легких в овцеводческих хозяйствах Удмуртии генетически относится к Европейской и Северо-Американской группе изолятов.

5. Показано, что штамм М-88 вируса висна-маеди, хранящийся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ (инв.№572), имеет 97% степень гомологии с Европейскими штаммами, имея нуклеотидные отличая, неповторяющиеся ни у одного из проанализированных штаммов.

6. Получено 4 плазмидных клона, несущих встройку фрагмента генома вируса висна-маеди размером 500 п.о. Полученная плазмида специфична и может быть использована в качестве положительного контроля при постановке ПЦР.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для практического использования предлагается тест-система для выявления РНК вируса аденоматоза легких овец с помощью полимеразной цепной реакции, которая может быть включена в схему лабораторной диагностики данного заболевания.

2. Для практического использования предлагается тест-система для выявления РНК вируса висна-маеди с помощью полимеразной цепной реакции, которая может быть применена для лабораторной диагностики заболевания.

3. Составлены методические указания выявлению генома вируса аденоматоза методом полимеразной цепной реакции, одобренные ученым советом и утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ 17.07.2006г.

4. Составлены методические указания по выявлению генома вируса висна-маеди методом полимеразной цепной реакции, одобренные ученым советом и утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ 17.07.2006 г.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бурдинский, Владимир Геннадьевич, 2009 год

1. Агибалова, дис. канд. вет. наук: 06.00.03 / Агибалова Александра. — Покров, 1991.- 168 с.

2. Аксенов, М.Ю. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции / М.Ю. Аксенов, A.JL Гинцбург // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1993 — №4. - С.3-7.

3. Алиев, Д.И. Патоморфология аденоматоза легких мелкого рогатого скота в Азербайджанской ССР: автореф. дис.канд. вет. наук: 00.00.00 / Алиев. Покров, 0000. -000 с.

4. Архипов, Н.И. Медленные инфекции животных / Н.И. Архипов, И.А.Бакулов, Л.И.Соковых. -М.: Агропромиздат, 1987. 191с.

5. Вирусные болезни животных / В.Н . Сюрин и др.. -М. : ВНИТИБП, 1998.-928 с.

6. Выявление ДНК вируса болезни Ауески гибридизацией с биотипированными зондами / А. Г. Глотов и др. // Ветеринария. 2001. - №2. - С.21-24.

7. Голицина, J1.H. Оценка разработанного «nested»- варианта полимеразной цепной реакции при выявлении энтеровирусов у больных / Л.Н. Голицина и др. // Вопросы вирусологии. 2002.- №5. -С. 41^43.

8. Гусева, Е. В. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике инфекционных заболеваний животных / Е. В. Гусева, Т. А. Сатина. Владимир, 1995. —44 с.

9. ДеМартини, Дж. К. Онкогенез ретровирусов на модели рака легких овец / Дж. К. ДеМартини // Российский ветеринарный журнал сельскохозяйственные животные. -2005. -№4. С.9-11.

10. История изучения медленных инфекций овец в нашей стране / интервью с Ю.Д.Караваевым // Российский ветеринарный журнал сельскохозяйственные животные. -2005. -№1. -С. 12-13.

11. Кадымов, P.A. Инфекционные болезни овец / P.A. Кадымов, A.A. Кунаков, В.А. Седов; Под ред. P.A. Кадымов. М.: Агропромиздат, 1987. - 303 с.

12. Коромыслов, Г.Ф. Опыт оздоровления неблагополучного по висна-маеди овцеводческого хозяйства / Г.Ф. Коромыслов, Б.Ф. Шуляк // Бюллетень ВИЭВ. — М.:ВИЭВ, 1996. -Вып. 77. -С.25-26.

13. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование/ пер. с англ. Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук М.: Мир, 1984. - 480 с.

14. Меркулов, Г.А. Курс патологогистологической техники / Г.А.Меркулов. -Л.:Медгиз, 1961. -340с.

15. Митрофанов, П.М. Патолого-анатомическая диагностика малоизвестных инфекционных болезней сельскохозяйственных животных / П.М. Митрофанов. — Саранск: Изд-во Мордов. Ун-та, 1997. 108с.

16. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / С. Херрингтон, Дж. Макги; пер. с англ. A.A. Лушниковой, Л.И. Новиковой, П.А. Сломинского. М.: Мир, 1999.-558 с.

17. Мюллис, К. Необычайная история о том, как родилась полимеразная цепная реакция / К. Мюллис // В мире науки .- 1990. №6 - С.26-34.

18. Наумкина, М. Разработка методов молекулярной гибридизации и ПЦР для идентификации вируса бешенства: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.06. / Наумкина Марина Алексеевна. Покров, 1999. - 24 с.

19. Обнаружение вируса болезни Ауески методом «гнездовой» полимеразной цепной реакции / А. Г. Аминев и др. // Молекулярная биология. 1997. - Т.31, №3. -С.564—567.20.