Высококонтрастные генетически кодируемые сенсоры на основе зеленого флуоресцентного белка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Суслова, Екатерина Андреевна

• Суслова, Екатерина Андреевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Суслова, Екатерина Андреевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I.I. Зеленый флуоресцентный белок GFP и его свойства

1.П. Генетически кодируемые сенсоры на основе GFP

1.П.1. Са2+ чувствительные сенсоры

1.И. 1.1. Са2+ сенсоры на основе акворина

1.П.1.2. Са2+FRET-сенсоры

1.П.1.З. Са2+ сенсоры на основе cpFP

I.II.2. Сенсоры киназной активности

1.П.2.1. FRET-сенсоры киназной активности

1.П.2.2. Сенсоры киназной активности на основе cpFP

1.П.З. FRET-сенсоры каспазной активности

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Высококонтрастные генетически кодируемые сенсоры на основе зеленого флуоресцентного белка»

Клонирование гена зеленого флуоресцентного белка GFP (Green Fluorescent protein) медузы Aequorea victoria в 1992 году [Prasher et al., 1992] открыло широкие перспективы для фундаментальных и прикладных исследований в области молекулярной и клеточной биологии. Сегодня GFP и другие GFP-подобные флуоресцентные белки (FP, fluorescent proteins) применяются в качестве репортеров генной экспрессии и для прижизненной визуализации объектов (белков, органелл, клеток и органов). Одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений применил FP является создание на их основе флуоресцентных генетически кодируемых сенсоров (ГКС). Такие внутриклеточные индикаторы позволяют визуализировать взаимодействия и активности интересующих исследователя белков, а также изменения концентрации определенных молекул. Существующие на сегодняшний день ПСС находят свое применение в различных молекулярно-биологических исследованиях и могут быть использованы в фармакологических скринигах новых лекарственных препаратов.

По сравнению с химически синтезированными флуоресцентными красителями ГКС имеют ряд преимуществ. Они экспрессируются самой клеткой и не требуют внешнего добавления или инъекции; использование сигналов внутриклеточной локализации позволяет направить ГКС в различные органеллы живой клетки; также могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие ГКС в определенных тканях в определенный период времени. Потенциально, с использованием соответствующих белковых доменов может быть разработан ГКС практически для любого аналита или ферментативной активности.

Достаточно широкое распространение получило создание ПСС на основе эффекта FRET (Forster resonance energy transfer) - безызлучательного переноса энергии возбужденного состояния флуорофора одного FP (донорного) на другой (акцепторный). Альтернативный подход основан на использовании так называемых «пермутированных» вариантов флуоресцентных белков - cpFP (circularly permuted Fluorescent Protein), в которых на уровне гена нативные N- и С- концы белка соединены друг с другом, а новые концы образованы в другой части белка. Однако, несмотря на значительный потенциал ГКС в качестве инструментов для изучения различных процессов в живых клетках, разработанные ранее ГКС обладают рядом недостатков, затрудняющих их практическое применение. Одной из основных проблем является низкий контраст флуоресцентного ответа ГКС (т.е. степень выраженности изменений его флуоресценции в ответ на детектируемый аналит). Для FRET-индикаторов выраженный в долях или % контраст отражает изменение отношения флуоресценции акцептора к донору после «срабатывания» сенсора. Аналогичным образом проводят оценку контраста так называемых «ратиометрических» индикаторов, характеризующихся аналит-зависимым изменением соотношения пиков возбуждения флуоресценции. Применительно к cpFP-еодержащим сенсорам с одним пиком возбуждения и эмиссии флуоресценции контраст соответствует степени изменения интенсивности эмиссии флуоресценции после взаимодействия с аналитом.

Помимо невысокого контраста подавляющее большинство описанных ранее ГКС обладает также недостаточной яркостью флуоресценции, что делает их малопригодными для высокопроизводительных скринингов и ограничивает чувствительность во внутриклеточных экспериментах.

Целью данной работы стала разработка высококонтрастных ГКС на основе гомологов зеленого флуоресцентного белка GFP.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Суслова, Екатерина Андреевна

выводы

1. Установлены ключевые позиции аминокислотных остатков, отвечающих за изменение флуоресцентных свойств генетически кодируемых сенсоров на основе пермутированных (cpFP 147-146) флуоресцентных белков.

2. Впервые на основе пермутированного варианта флуоресцентного белка разработаны генетически кодируемые сенсоры с более чем 10-кратным контрастом -Са2+ сенсоры Casel2 и Casel6, характеризующиеся 12- и 16-кратным возрастанием яркости флуоресценции, соответственно.

3. Продемонстрирована высокая эффективность Casel2 в живых клетках. Показано, что по совокупности характеристик (улучшенная рН-стабильность, высокая яркость, быстрое созревание при 37°С и высокий контраст) Casel2 превосходит все опубликованные ранее Са2+ чувствительные генетически кодируемые сенсоры и не уступает также химически синтезированным Са2+ индикаторам. Получены версии Case 12, локализованные на мембране эукариотических клеток и в матриксе митохондрий и продемонстрирована их эффективность в живых клетках.

4. Показано, что полученный при создании Casel2 оптимизированный вариант пермутированного флуоресцентного белка может быть использован для создания высококонтрастных генетически кодируемых сенсоров различной специфичности. В частности, впервые на основе пермутированного варианта флуоресцентного белка разработан индикатор активности протеинкиназы А - сенсор RePKA2, характеризующийся выраженными изменениями спектральных свойств в ответ на специфичное фосфорилирование (контраст in vitro 2.2 раза).

5. Разработана высококонтрастная FRET-пара PS-CFP/phiYFP, характеризующаяся при разделении донора и акцептора более чем 7-кратным падением яркости флуоресценции акцептора при практически неизменной яркости донора. Это значение является максимальным для существующих на сегодняшний день FRET-nap изменением яркости флуоресценции акцептора.

6. Разработаны эффективные FRET-пары mTagBFP/mTagGFP и mTagGFP/mTagRFP, на основе которых получены высококонтрастные FRET-сенсоры внутриклеточной активности каспазы-З - CaspeR-B/G и CaspeR-G/R. Высокие яркость флуоресценции, фотостабильность, рН-стабильность и контраст данных индикаторов, а также мономерность входящих в их состав флуоресцентных белков позволяют использовать их в качестве надежных и удобных репортеров апоптоза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе предложена модель расположения доменов в Са2+ сенсорах, созданных на основе пермутированных вариантов флуоресцентных белков. На основании предложенной модели установлены ключевые аминокислотные позиции, определяющие спектральные свойства и контраст индикаторов данного типа. Путем оптимизации а.о. по этим положениям получены высококонтрастные Са2+ сенсоры с максимальным среди всех существующих ГКС контрастом, превышающим 10 раз.

Полученные в ходе работы данные по подбору аминокислотного окружения хромофора для пермутированных вариантов флуоресцентных белков в составе сенсоров могут быть использованы для дальнейшей разработки высококонтрастных ГКС.

Разработанный в настоящей работе Са2+ сенсор Case 12 по своим характеристикам превосходит все опубликованные ранее ГКС и не уступает также химически синтезированным флуоресцентным индикаторам Са2+. В отличие от последних, он может быть избирательно направлен в любой компартмент клетки, а также использован для исследований в трансгенных организмах. Показана высокая эффективность цитозольной, митохондриальной и мембрано-локализованной версий Casel2 в качестве детектора Са2+ в различных типах эукариотических клеток. Улучшенные характеристики Case 12 делают его преспективным инструментом для мониторинга внутриклеточной концентрации Са2+, а также высокопроизводительных скринингов. В настоящее время ведутся работы по созданию трансгенных мышей, несущих ген Case 12,

Во второй части работы мы применили подход, основанный на присоединении детекторных доменов к пермутированному варианту флуоресцентного белка, для создания сенсора киназной активности. Так, с использованием специфичных киназа-чувствительных доменов и оптимизированного пермутированного флуоресцентного «ядра», полученного при разработке Casel2, был получен сенсор активности протеинкиназы А - RePKA2. RePKA2 стал первым протеинкиназа А-чувствительным индикатором на основе одного (пермутированного) флуоресцентного белка. В настоящее время проводится подбор условий для оптимального функционирования этого индикатора в живых клетках.

В работе также получены новые донорно-акцепторные пары, характеризующиеся высокой эффективностью FRET: PS-CFP/phiYFP, mTagBFP/mTagGFP и mTagGFP/mTagRFP. FRET-пара PS-CFP/phiYFP нашла свое применение при создании высококонтрастного FRET-индикатора активности каталитических аутоантител в лаборатории биокатализа ИБХ РАН. На основе двух других FRET-nap разработаны высококонтрастные сенсоры активности каспазы-3 -CaspeR-B/G и CaspeR-G/R. Показано, что оба индикатора могут быть использованы в качестве надежных и удобных репортеров апоптоза.

Высокие контраст, яркость флуоресценции, фотостабильность, достаточная рН-стабильность и быстрое созревание при 37°С разработанных в данной работе генетически кодируемых сенсоров обеспечивают их эффективное функционирование в живых клетках. Улучшенные характеристики полученных нами индикаторов позволяют надеяться, что они найдут широкое применение как инструменты для изучения внутриклеточных путей передачи сигнала, а также для высокопроизводительных скринингов новых лекарственных препаратов.

В заключение автор выражает искреннюю благодарность коллективу сотрудников лаборатории молекулярных технологий для биологии и медицины ИБХ РАН и компании «Евроген» за создание дружеской рабочей атмосферы, в особенности Всеволоду Белоусову, Дмитрию Староверову, Юрию Янушевичу, Екатерине Мерзляк, Татьяне Чепурных, Константину Лукьянову, а также заведующему лабораторией Сергею Лукьянову.

Особенную признательность хочется выразить научному руководителю Дмитрию Чудакову за обучение, внимательное и чуткое руководство, помощь в обсуждении результатов и всестороннюю поддержку в работе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Суслова, Екатерина Андреевна, 2008 год

1. Ai H.W., Shaner N.C., Cheng Z., Tsien R.Y. and Campbell R.E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins. (2007) Biochemistry, 46, 5904-5910.

2. Ando R., Hama H., Yamamoto-Hino M., Mizuno H. and Miyawaki A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. (2002) PNAS, 99, 12651-12656.

3. Araki Т., Harashi M., Watanabe N., Kanuka H., Yoshino J., Miura M. and Satura T. Down-regulation of Mcl-1 by inhi bition of the PI3-K/Akt pathway is required for cell shrinkage-dependent cell death, (2002) Biochem Biophys Res Commun, 290(4), 12751281.

4. Augustine G.J., Charlton M.P. and Smith S.J. Calcium action in synaptic transmitter release. (1987) Annu Rev Neurosci, 10, 633-693.

5. Augustine G.J. How does calcium trigger neurotransmitter release? (2001) Curr Opin Neurobiol, 11(3), 320-326.

6. Baird G.S., Zacharias D.A. and Tsien R.Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. (1999) PNAS, 96, 11241-11246.

7. Baubet V., Le Mouellic H., Campbell A.K., Lucas-Meunier E., Fossier P. and Brulet P. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. (2000) PNAS, 97(13), 7260-7265.

8. Belousov V.V., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Staroverov D.B., Shakhbazov K.S., Terskikh A.V. and Lukyanov S. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. (2006) Nat Meth, 3, 281-286.

9. Berridge M.J. Neuronal calcium signaling. (1998) Neuron, 21, 13-26.

10. Bokman S.H. and Ward W.W. Renaturation of Aequorea gree-fluorescent protein. (1981) Biochem Biophys Res Commun, 101(4), 1372-1380.

11. Campbell R.E., Tour О., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A. and Tsien R.Y. A monomeric red fluorescent protein. (2002) PNAS, 99(12), 7877-7882.

12. Chiang J.J. and Truong K. Using co-cultures expressing fluorescence resonanse based protein biosensors to simultaneously image caspase-3 and Ca2+ signaling. (2005) Biotechnol Lett, 27(16), 1219-1227.

13. Chudakov D.M., Belousov V.V., Zaraisky A.G., Novoselov V.V., Staroverov D.B., Zorov D.B., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. (2003) Nat Biotechnol, 21, 191-194.

14. Chudakov D.M., Chepurnykh T.V., Belousov V.V., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Fast and precise protein tracking using repeated reversible photoactivation. (2006) Traffic, 7, 1304-1310.

15. Chudakov D.M., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. (2005) Trends Biotechnol, 23, 605-613.

16. Chudakov D.M., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Souslova E.A., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. (2004) Nat Biotechnol, 22, 1435-1439.

17. Clapham D.E. Calcium signaling. (1995) Cell, 80(2), 259-268.

18. Cody C.W., Prasher D.C., Westler W.M., Prendergast F.G., Ward, W.W. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein. (1993) Biochemistry, 32(5), 1212-1218.

19. Cormack B.P., Valdivia R.H., Falkow S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). (1996) Gene, 173(1), 33-38.

20. Cubitt А.В., Woollenweber L.A., Heim R. Understanding structure-function relationships in the Aequorea victoria green fluorescent protein. (1995) Methods Cell Biol., 58, 19-30.

21. Darzynkiewicz Z., Bedner E., Smolewski P., Lee B.W. and Johnson G.L. Detection of caspase activation in situ by fluorochrome-labeled inhibitors of caspases (FLICA). (2002) Methods Mol Biol, 203, 289-299.

22. Davenport D. and Nicol J.A.C. Luminescence in Hydromedusae. (1955) Proc R Sol London Ser В, 144, 399-411.

23. Delagrave S., Hawtin R.E., Silva C.M., Yang M.M., Youvan D.C. Red-shifted excitation mutants of the green fluorescent protein. (1995) Biotechnology, 13(2), 151154.

24. Ellis R.E., Yuan J.Y., Horvitz H.R: Mechanisms and functions of cell death. (1991) Annu Rev Cell Biol, 7, 663-698.

25. Ericson M.G., Moon D.L. and Yue D.T. DsRed as a potential FRET partner with CFP and GFP. (2003)BiophysJ, 85, 599-611.

26. Evans J.H. and Sanderson M.J. Intracellular calcium oscillations induced by ATP in airway epithelial cells. (1999) Am J Physiol Lung cell Mol Physiol, 277, 30-41.

27. Galperin E., Verkhusha V.V. and Sorkin A. Three-chromophore FRET microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. (2004) Nat Methods, 1, 209-217.

28. Goedhart J., Vermeer J.E., Adjobo-Hermans M.J., van Weeren L. and Gadella T.W. Sensitive detection of p65 homodimers using red-shifted and fluorescent protein-based FRET couples. (2007) PLoS ONE, 2(10), 1011.

29. Gonzales D., Sawyer A. and Ward W.W. Spectral perturbations of mutants of recombinant Aequorea victoria green-fluorescent protein (GFP). (1997) Photochem Protobiol, 65, 218.

30. Green D. Apoptotic pathways. The roads to run. (1998) Cell, 94, 695.

31. Green H.M. and Alberola-Ila J. Development of ERK Activity Sensor, an in vitro, FRET-based sensor of Extracellular Regulated Kinase activity. (2005) BMC Che. Biol, 5, 1.

32. Griesbeck O., Baird G.S., Campbell R.E., Zacharias D.A. and Tsien, R.Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. (2001) J Biol Chem, 276, 29188-29194.

33. Gu Y., Di W.L., Kelsell D.P. and Zicha D. Quantitative fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurement with acceptor photobleaching and spectral unmixing. (2004) JMicrosc, 2\5, 162-173.

34. He L., Wu X., Meylan F., Olson D.P, Simone J., Hewgill D., Siegel R. and Lipsky P.E. Monitoring Caspase Activity in Living Cells Using Fluorescent Proteins and Flow Cytometry. (2004)AJP, 164(6), 1901-1913.

35. Heim N. and Griesbeck O. Genetically encoded indicators of cellular calcium dynamics based on troponin С and green fluorescent protein. (2004) J Biol Chem, 279, 14280-14286.

36. Heim R., Cubitt A.B. and Tsien R.Y. Improved green fluorescence. (1995) Nature, 373(6516), 663-664.

37. Heim R., Prasher D.C. and Tsien R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. (1994) PNAS, 91(26), 12501-12504.

38. Heinemann U. and Hahn M. Circular permutation of polypeptide chains: implications for protein folding and stability. (1995) Progr Biophys Mol Biol. 64, 121-143.

39. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K. and Pease L.R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. (1989) Gene, 77, 51-59.

40. Jares-Erijman E.A. and Jovin T.M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. (2006) Curr Opin Chem Biol. 10, 409-416.

41. Jarvis S.E and Zamponi G.W. Interactions between presynaptic Ca2+ channels, cytoplasmic messengers and proteins of the synaptic vesicle release complex. (2001) Trends Pharmacol Sci, 22(10), 519-525.

42. Jayaraman S., Haggie P., Wachter R.M., Remington S.J. and Verkman A.S. Mechanism and cellular applications of a green fluorescent protein-based halide sensor. (2000) J Biol Chem, 275(9), 6047-6050.

43. Johnson F.H., Shimomura et al. Quantitum efficiency of Cypridina luminescence, with a note of that of Aequorea. (1962) J Cell Comp Physiol, 60, 85-104.

44. Karasawa S,, Araki Т., Nagai Т., Mizuno H. and Miyawaki A. Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer. (2004) Biochem J, 381(1), 307-312.

45. Katoch В., Sebastian S., Sahdev S., Padh H., Hasnain S.E. and Begum R. Programmed cell death and its clinical implications. (2002) Indian J Exp Biol, 40(5), 513-524.

46. Kawai Y., Sato M. and Umezawa Y. Single color fluorescent indicators of protein phosphorylation for multicolor imaging of intracellular signal flow dynamics. (2004) Analyt Chem, 76, 6144-6149.

47. Keizer J. and De Young G.W. Two roles of Ca2+ in agonist stimulated Ca2+ oscillations. (1992) Biophys J, 61(3), 649-660.

48. Kiedrowski L. and Costa E. Glutamate-induced destabilization of intracellular calcium concentration homeostasis in cultured cerebellar granule cells: role of mitochondria in calcium buffering. (1995) Mol Pharmacol, 47(1), 140-147.

49. Komoriya A., Packard B.Z., Brown M.J., Wu M.L. and Henkart P.A. Assessment of caspase activities in intact apoptotic thymocytes using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. (2000)JExpMed, 191(11), 1819-1828.

50. Kunkel M.T., Ni Q., Tsien R.Y., Zhang J. and Newton A.C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. (2005) J Biol Chem, 280, 5581-5587.

51. Kurokawa K., Mochizuki N., Ohba Y., Mizuno H., Miyawaki A. and Matsuda M. A pair of fluorescent resonance energy transfer-based probes for tyrosine phosphorylation of the Crkll adaptor protein in vivo. (2001) J Biol Chem, 276, 3130531310.

52. Lee T. and Luo L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. (1999) Neuron, 22, 451-461.

53. Lippincott-Schwartz J., Altan-Bonnet N. and Patterson G.H. Photobleaching and photoactivation: following protein dynamics in living cells. (2003) Nat Cell Biol, Suppl:S7-14.

54. Llinas R., Sugimori M. and Silver R.B. Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal. (1992)Science\ 256(5057), 677-679.

55. Llinas R., Sugimori M. and Silver R.B. The concept of calcium concentration microdomains in synaptic transmission. (1995) Neuropharmacology, 34(11), 14431451.

56. Llopis J., McCaffery J.M., Miyawaki A., Farquhar M.J. and Tsien R.G. Measurement of cytosolic, mitohondrial, and Goldgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. (1998) PNASi, 95, 6803-6808.

57. Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Lukyanov S. and Verkhusha V.V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. (2005) Nat RevMol Cell Biol, 6, 885-891.

58. Mahajan N.P., Harrison-Shostak D.C., Michaux J. and Herman B. Novel mutant green fluorescent protein protease substrates reveal the activation of specific caspases during apoptosis. (1999) Chemistry & Biology, 6(6), 401-409.

59. Mank M„ Reiff D.F., Heim N., Friedrich M.W., Borst A. and Griesbeck O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. (2006) Biophys J, 90, 1790-1796.

60. Martin S.J. and Green D.R. Protease activation during apoptosis. Death by a thousand cuts? (1995) Cell, 82, 349-352.

61. Matsuyama S. and Reed J.C. Mitochondria-dependent apoptosis and cellular pH regulation. (2000) Cell Death Differ, 7(12), 1155-1165.

62. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L. and Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. (1999) Nat Biotechnol, 17, 969-973.

63. Mena, M.A., Treynor, T.P., Mayo, S.L. and Daugherty, P.S. Blue fluorescent proteins with enhanced brightness and photostability from structurally targeted library. (2006) Nat Biotechnol, 24, 1569-1571.

64. Miyawaki A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. (2003) Dev Cell, 4, 295-305.

65. Miyawaki A., Griesbeck O., Heim R. and Tsien R.Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. (1999) PNAS, 96, 2135-2140.

66. Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J.M., Adams J.A., Ikura M. and Tsien R.Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. (1997) Nature, 388, 882-887.

67. Mizuno H., Sawano A., Eli P., Наша H. and Miyawaki A. Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer. (2001) Biochemistry, 40, 2502-2510.

68. Morise H., Shimomura O., Johnson F.H., Winant J. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea. (1974) Biochemistry, 13(12), 2656-2662.

69. Nagai T. and Miyawaki A. A high-throughput method for development of FRET-based indicators for proteolysis. (2004b) Biochem Biophys Research Comtnun, 319, 72-77.

70. Nagai Т., Ibata K., Park E.S., Kubota M., Mikoshiba K. and Miyawaki A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. (2002) Nat Biotechnol, 20, 87-90,

71. Nagai Т., Sawano A., Park E.S. and Miyawaki A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. (2001) PNAS, 98, 3197-3202.

72. Nagai Т., Yamada S., Tominaga Т., IchikawaM. and Miyawaki A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. (2004a) PNAS, 101, 10554-10559.

73. Nagai Y., Miyazaki M., Aoki R., Zama Т., Inouye S., Hirose K., lino M. and Hagiwara M. A fluorescent indicator for visualizing cAMP-induced phosphorylation in vivo. (2000)Nat Biotechnol, 18(3), 313-316.

74. Nagata Т., Kishi H., Liu Q.L., Matsuda Т., Imanaka Т., Tsukada K., Kang D. and Muraguchi A. The regulation of DNAse activities in subcellular compartments of activated thymocytes. (2002) Immunology, 105, 399-406.

75. Nakai J., Ohkura M. and Imoto K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. (2001) Nat Biotechnol, 19, 137-141.

76. Ng Т., Squire A., Hansra G., Bornancin F., Prevostel C., Hanby A., Harris W., Barnes D., Schmidt S., Mellor H., Bastiaens P. I. and Parker P.J. Imaging protein kinase Calpha activation in cells. (1999) Science, 283, 2085-2089.

77. Nguyen A.W. and Daugherty P.S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. (2005) Nat Biotechnol, 23(3), 355-360.

78. Nicholson D.W: ICE/CED3-like proteases as therapeutic targets for the control of inappropriate apoptosis. (1996) Nat Biotechnol, 14(3), 297-301.

79. Niwa H., Inouye S., Hirano Т., Matsuno Т., Kojima S., Kubota M., Ohashi M. and Tsuji F.I. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. (1996) PNAS, 93, 13617-13622.

80. Ohashi Т., Galiacy S.D., Briscoe G. and Erickson H.P. An experimental study of GFP-based FRET, with application to intrinsically unstructured proteins. (2007) Protein Sci, 16,1429-1438.

81. Ohkura M., Matsuzaki M., Kasai H., Imoto K. and Nakai J. Genetically encoded bright Ca2+ probe applicable for dynamic Ca2+ imaging of dendritic spines. (2005) Analyt Chem, 77, 5861-5869.

82. Ormo M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y. and Remington S.J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. (1996) Science, 273(5280), 1392-1395.

83. Patterson G., Day R.N. and Piston D. Fluorescent protein spectra. (2001) J Cell Sci, 114, 837-838.

84. Patterson G.H. and Lippincott-Schwartz J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. (2002) Science, 13, 1873-1877.

85. Patterson G.H., Piston D.W. and Barisas B.G. Forster distances between green fluorescent protein pairs. (2000) Anal Biochem, 284(2), 438-440.

86. Periasamy A. and Day R.N. Visualizing protein interactions in living cells using digitized GFP imaging and FRET microscopy. (1999) Methods Cell Biol, 58, 293-314.

87. Pologruto T.A., Yasuda R. and Svoboda K. Monitoring neural activity and Ca2+. with genetically encoded Ca2+ indicators. (2004) JNenrosci, 24(43), 9572-9579.

88. Porumb Т., Yau P., Harvey T.S. and Ikura M. A calmodulin-target peptide hybrid molecule with unique calcium-binding properties. (1994) Protein Eng, 7, 109-115.

89. Pozzan Т., Rizzuto R., Volpe P. and Meldolesi J. Molecular and cellular physiology of intracellular calcium stores. (1994) Physiol Rev, 74(3), 595-636.

90. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G. and Cormier M.J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. (1992) Gene, 111(2), 229-33.

91. Rizzuto R., Brini M., Pizzo P., Murgia M. and Pozzan T. Chimeric green fluorescent protein as atool for visualizing subcellular organelles in living cells. (1995) Curr Biol, 5,635-642.

92. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

93. Sasaki K., Sato M. and Umezawa Y. Fluorescent indicators for Akt/protein kinase В and dynamics of Akt activity visualized in living cells. (2003) J Biol Chem, 278,30945-30951.

94. Schultz C., Schleifenbaum A., Goedhart J., Gadella T.W.Jr. Multiparameter imaging for the analysis of intracellular signaling. (2005) Chembiochem, 6(8), 13231330.

95. Shaner N.C., Steinbach P.A. and Tsien R.Y. A guide to choosing fluorescent proteins. (2005) Nat Methods, 2, 905-909.

96. Shimomura O. Structure of the chromophore of Aequorea green fluorescent protein. (1979) FEBS Lett, 104, 220-222.

97. Shimomura O., Johnson F. H. and Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. (1962) Cell Comp Physiol, 59, 223-239.

98. Shimomura O. and Johnson F.H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. (1978) PNAS, 75(6), 2611-2615.

99. Skene J.H.P. and Virag I. Posttranslational membrane attachment and dynamic fatty acylation of a neuronal growth cone protein, GAP-43. (1989) J Cell Biol, 108, 613-625.

100. Souslova E.A. and D.M. Chudakov. Photoswitchable cyan fluorescent protein as a FRET donor. (2006) MicrRes and Techn, 69, 207-209.

101. Takemoto K., Nagai Т., Miyawaki A. and Miura M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. (2003) J Cell Biology, 160(2), 235-243.

102. Tawa P., Tarn J., Cassady R., Nicholson D.W. and Xanthoudakis. Quantitative analysis of fluorescent caspase substrate cleavage in intact cells and identification of novel inhibitors of apoptosis. (2001) Cell death and Differentiation, 8, 30-37.

103. Terskikh A., Fradkov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A. V., Zhao X., Lukyanov S., Matz M., Kim S., Weissman I. and Siebert P. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. (2000) Science, 290(5496), 1478-1479.

104. Thornberry N.A: The caspase family of cysteine proteases. (1997b) Br Med Bull, 53, 478-490.

105. Ting A.Y., Kain K.H., Klemke R.L. and Tsien R.Y. Genetically encoded fluorescent reporters of protein tyrosine kinase activities in living cells. (2001) PNAS, 98, 15003-15008.

106. Tyas L., Brophy V.A., Pope A., Rivett A.J. and Tavare M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonanse energy transfer. (2000) EMBO Reports, 1(3), 266-270.

107. Van Munster E.B. and Gadella T.W. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). (2005) Adv Biochem Eng Biotechnol, 95, 143-175.

108. Verkhusha V.V., Chudakov D.M., Gurskaya N.G., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. (2004) Chem Biol, 11, 845-854.

109. Violin J.D., Zhang J., Tsien R.Y. and Newton A.C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C. (2003) J Cell Biol, 161, 899-909.

110. Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A. and Tsien R.Y. Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation. (2004) PNAS, 101, 1674516749.

111. Ward W.W. and Bockman S.H. Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein : Physical separation and characterisation of the renatured protein. (1982) Biochemistry, 21, 4535-4540.

112. Ward W.W. and Cormier M.J. An energy transfer protein in coelenterate bioluminescence. Characterization of the Renilla green-fluorescent protein. (1979) Biol Chem, 254(3), 781-788.

113. Wilson. T. and Hastings J.W. Bioluminescence. (1998) Annu Rev Cell Dev Biol, 14, 197-230.

114. Wu X., Simone J., Hewgill D., Siegel R., Lipsky P.E. and He L. Measurement of two caspase activities simultaneously in living cells by a novel dual FRET fluorescent indicator probe. (2006) Cytometry Part A69A, 477-486.

115. Xu X., Gerard A.L., Huang B.C., Anderson D.C., Payan D.G. and Luo Y. Detection of programmed cell death using fluorescence energy transfer. (1998) Nucleic Acids Res, 26(8), 2034-2045.

116. Yan D., Guo L. and Wang Y. Requirement of dendritic Akt degradation by the ubiquitin-proteasome system for neuronal polarity. (2006) J Cell Biol, 174, 415-424.

117. Yang F., Moss L.G. and Phillips G.N.Jr. The molecular structure of green fluorescent protein. (1996) Nat Biotechnol, 14(10), 1246-1251.

118. Yasuda R., Nimchinsky E.A., Scheuss V., Pologruto T.A., Oertner T.G., Sabatini B.L. and Svoboda K. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. (2004) Sci STKE., 219,15.

119. Zaccolo M., de Giorgi F., Cho C.Y., Feng L„ Knapp Т., Negulescu P.A., Taylor S.S., Tsien R.Y. and Pozzan T. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. (2000) Nat Cell Biol, 2, 25-29.

120. Zhang J., Ma Y., Taylor S.S. and Tsien R.Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. (2001) PNAS, 98, 14997-15002.