Характеристика новых линий репортерных мышей для изучения экспрессии фактора некроза опухолей in vivo и in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Кучмий, Анна Александровна

• Кучмий, Анна Александровна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кучмий, Анна Александровна

Оглавление

Введение

Обзор литературы

Методы флуоресцентной визуализации

Разнообразие методов флуоресцентной визуализации для исследований in vivo

Флуоресцентные белки в качестве молекулярных меток

Методы направленного флуоресцентного мечения клеточных и молекулярных

мишеней

«Репортерные» линии экспериментальных животных для биологических исследований

Репортерные линии мышей с флуоресцентной меткой для изучения биологии TNF

Общие сведения о Факторе Некроза Опухолей: структура белка, регуляция биосинтеза

цитокина, рецепторы TNF

Мышиные модели для изучения функций TNF in vivo

Биологические функции TNF и актуальные вопросы биологии TNF

Преимущества «репортерных» линий мышей с флуоресцентным белком в качестве

метки для изучения биологии TNF

Материалы и методы

Результаты и их обсуждение

1. Получение и отбор линии трансгенных TNF-репортерных мышей

2. Экспрессия репортерных белков и TNF в миелоидных клетках репортерных мышей in vitro

3. Особенности экспрессии TNF и репортерных белков в культурах костномозговых макрофагов in vitro

4. TNF, экспрессируемый с трансгенной вставки в Kat-TNF мышах, является биологически неактивным

5. Экспрессия флуоресцентных белков и TNF в лимфоцитах репортерных мышей

6. Базальная экспрессия eGFP коррелирует с активностью промотора и уровнем транскрипции гена TNF

7. « Гомеостатическая» экспрессия репортерных для TNF белков

8. Использование TNF-репортерных мышей для гистологического анализа клеток, экспрессирующих TNF

9. Характеристика репортерных Kat-TNF мышей in vivo

Заключение

Выводы

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика новых линий репортерных мышей для изучения экспрессии фактора некроза опухолей in vivo и in vitro»

Введение

Визуализация отдельных молекул и клеточных популяций широко используются в изучении биологических процессов на молекулярном уровне. Особую роль для изучения биологических процессов играют флуоресцентные методы визуализации. Флуоресцентные белки, будучи экспрессированными под контролем регуляторных элементов белка-мишени в составе репортерной конструкции, делают возможным оптическое наблюдение за экспрессией белка-мишени in vivo и in vitro. Технически использование именно флуоресцентных меток, в отличие от изотопных или люминесцентных меток, позволяет использовать комбинированно большое количество методов флуоресцентного анализа, имеющих высокое разрешение (на уровне клетки и субклеточном уровне), например, микроскопию совместно с цитофлуориметрией и клеточной сортировкой.

Благодаря внедрению репортерной конструкции в организм лабораторных мышей был создан ряд так называемых «репортерных» линий - когда экспрессия определенной молекулы (транскрипционный фактор, белок адгезии, хемокин, цитокин и пр.) сопровождается экспрессией флуоресцентного белка in vivo. В результате подробного анализа репортерных линий животных современными флуоресцентными методами стало возможным проследить происхождение, дифференцировку, пролиферацию, выживание и локализацию клеток, экспрессирующих изучаемый белок, и показать механизм участия этих клеток при развитии патологий.

Благодаря появлению новых технических решений, визуализация биологических объектов претерпела качественный переход от получения отдельных статических изображений к наблюдению за динамикой клеточных событий в организмах живых репортерных животных в реальном времени in vivo. Важнейшее и уникальное свойство визуализации in vivo - это возможность неинвазивно (или микроинвазивно) в условиях,

приближенных к физиологическим, получать изображение и наблюдать динамику клеток внутри органов и тканей, анализировать процессы их миграции и, самое главное, отслеживать межклеточные контакты. Этот подход активно развивается и успешно применяется для фармакологических и медико-биологических исследований моделей человеческих заболеваний на экспериментальных животных.

Использование репортерных линий лабораторных животных является популярным подходом для изучения биологии цитокинов in vivo. Цитокины представляют собой биологически активные пептидные продукты секреции клеток, которые обеспечивают формирование иммунной системы и согласованность функционирования ее компонентов в нормальных условиях и при патологических воздействиях. Как правило, один цитокин производит ся разными клеточными популяциями и может оказывать разнообразные биологические эффекты. Главным преимуществом использования «репортерных» линий при изучении цитокинов является возможность идентификации и очистки живых клеток-продуцентов цитокина, а также наблюдение за ними in vivo, что было недоступно ранее.

Значительный интерес представляет собой создание репортерных линий мышей для изучения биологии фактора некроза опухолей (Tumor Necrosis Factor, TNF), поскольку остается нерешенным ряд вопросов об экспрессии TNF в норме и при развитии патологий. TNF является важным провоспалительным цитокином, который играет ключевую роль в защите от внутриклеточных патогенов и в гомеостазе микроструктуры вторичных лимфоидных органов. С другой стороны, TNF представляет собой медиатор хронических воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Создание репортерных линий мышей с флуоресцентной меткой для маркирования клеток, экспрессирующих фактор некроза опухолей, позволит

идентифицировать клеточне источники TNF и проводить исследования по физиологии TNF недоступными прежде методами в норме и при патологиях. Обзор литературы.

Методы флуоресцентной визуализации.

Методы оптической визуализации позволяют наблюдать за распределением биомолекул и молекулярными событиями при помощи меток, испускающих фотоны оптического диапазона (Massoud and Gambhir 2003). По принципу получения оптических фотонов эти методы подразделяются на биолюминесцентный и флуоресцентный.

При флуоресцентной визуализации внешний свет определенной длины волны возбуждает флуоресцентные молекулы-мишени, способные в ответ испускать фотоны с большей длиной волны (и, соответственно, меньшей энергией), последние, в свою очередь, регистрируются детектором (Luker and Luker 2008). Возможна детекция флуоресценции как от эндогенных молекул (коллаген, гемоглобин, НАДФ) (Monici 2005), так и от искусственно внедренных в организм или клетку флуоресцентных белков и флуорофоров. Заметное преимущество флуоресцентных методов визуализации перед другими методами оптического наблюдения в том, что одновременно могут регистрироваться множество проб с различными спектральными характеристиками. Явление флуоресценции от искусственно введенных меток (для молекул-мишеней) широко используется для исследований in vitro и ex vivo в молекулярной и клеточной биологии с использованием большого разнообразия методик: флуоресцентной микроскопии, аналитической проточной цитофлуориметрии, сортировки флуоресцентных клеток, конфокальной микроскопии на срезах и пр. Совершенствование методов флуоресцентной визуализации происходит в трех основных направлениях (Кучмий et al. 2012), развернутое описание которых представлено в следующих главах:

1. Во-первых, технологическое совершенствование инструментальных методов флуоресцентного анализа. Новые приборы позволяют с большим разрешением различать одновременно несколько флуоресцентных меток в толще тканей в реальном времени.

2. Во-вторых, получение новых флуоресцентных меток с улучшенными характеристиками, то есть расширение спектра цветов и совершенствование биофизических параметров флуорохромов: яркость, фотостабильность, pH стабильность и пр.

3. В-третьих, разработка новых молекулярно-биологических подходов для введения флуоресцентных меток в организм. Наиболее перспективный подход - это внедрение генетической последовательности метки в геном организма под контролем специфических для молекулы-мишени регуляторных элементов, что позволяет визуализировать определенные субпопуляции клеток in vivo.

Разнообразие методов флуоресцентной визуализации для исследований in vivo

Технологически новым шагом в области флуоресцентной визуализации была адаптация флуоресцентных методов анализа для исследований in vivo и наблюдением биологических процессов в реальном времени внутри живого организма Разные методы флуоресцентной визуализации in vivo имеют различное разрешение, чувствительность и максимальную глубину детекции. Для анализа на организменном уровне с пространственным разрешением 1-3 мм была разработана флуоресцентная томография (Graves et al. 2003). Сочетание флуоресцентной визуализации in vivo с оптоакустическими методами, а также с методами KT и МРТ позволило существенно улучшить разрешение и глубину наблюдения (Davis et al. 2008). В частности мультиспектральная оптоакустическая томография (МСОТ), основана на регистрации акустических волн, возникающих в результате поглощения сверхкоротких импульсов

света (1-100 не) молекулами флуорофоров. Спектр поглощения молекул-мишеней для детекции методом МСОТ должен находиться в отличной от фонового поглощения (гемоглобин, меланин, липиды, вода) области, т.е. должен находится в красной и дальне-красной области спектра и иметь другую форму. Для количественного анализа пробы глубоко в тканях (>100 мкм) в МСОТ применяют сложные алгоритмы, учитывающие проводимость тканей для света. Таким образом, мультиспектральная оптоакустическая томография делает возможным изучение образцов до 1 см в размере (диаметр) с пространственным разрешением ЮОмкм (Ntziachristos and Razansky 2010). В настоящий момент опубликовано много примеров применения МСОТ для визуализации у рыб, мелких млекопитающих и даже в применении к человеку.

Микроскопия in vivo в настоящий момент обладает, пожалуй, наилучшими техническими характеристиками, и позволяет прижизненное наблюдение молекул-мишеней на клеточном уровне и субклеточном уровне (<200 мкм) (Denk et al. 1990;Niesner and Hauser 2011).

Принципы многофотонной флуоресцентной микроскопии in vivo.

Микроскопия in vivo или «интравитальная» микроскопия - представляет собой разновидность флуоресцентной микроскопии, в которой осуществляется детекция метки в живых экспериментальных животных в реальном времени (Niesner and Hauser 2011;Weigert et al. 2010). Важно отметить, что микроскопия in vivo требует хирургических операций под действием анестезии, что накладывает некоторые ограничения, связанные с наркозом, гипоксией, гипотермией или послеоперационным восстановлением (Germain et al. 2006). Наиболее широко распространенным подходом для микроскопии in vivo высокого разрешения является многофотонная оптическая микроскопия.

Многофотонная оптическая микроскопия (МФМ) основана на том, что молекула флуорофора может быть возбуждена одновременной (или почти одновременной в диапазоне атто- и фемто- 10"18 - 10"15 с ) абсорбцией двух (или даже трех) фотонов которые имеют половину (или треть) той энергии, которая необходима для возбуждения и перехода на более высокий энергетический уровень (Denk et al. 1990). Таким образом, для мультифотонного возбуждения используются дальнекрасные и инфракрасные длины волн, обладающие лучшей способностью проникать в ткани, чем ультрафиолетовый или видимый свет. Действительно, если конфокальная микроскопия может давать изображение на глубине 50-60 мкм, то для мультифотонной микроскопии этот диапазон может быть увеличен до 300 мкм - 1мм (особенно для тканей с низким рассеянием, например, для мозга). Вероятность возникновения многофотонных переходов достаточно низка, поэтому необходима большая концентрация света, как во времени, так и в пространстве. Это достигается путем использования лазеров, которые излучают дальне- и инфракрасный свет очень короткими импульсами (100 фс), с большой частотой (80-100 МГц) и с использованием многочисленных апертурных линз для фокусировки света в точке возбуждения. Абсорбция и эмиссия при многофотонном возбуждении возникает в малом объеме (1фл) снижая, таким образом, фототоксичность и фототушение остальных объемов, и ограничивая эмиссию вне фокуса. Кроме того, для всех охарактеризованных флуорофоров спектр мультифотонной абсорбции намного шире, чем при однофотонном возбуждении, что делает возможным визуализацию нескольких флуорофоров при одной длине волны возбуждения (Weigert et al. 2010),

Часто мультифотонная микроскопия сопряжена с генерацией второй гармоники (ГВГ). ГВГ— это нелинейный оптический процесс, во время которого фотоны, в результате взаимодействия с молекулами определенной структуры, эффективно

комбинируются в новые фотоны с удвоенной энергией (с большей в два раза частотой и половинной длины волны). Так, вторая гармоника в тканях появляется при взаимодействии света с коллагеном, микротрубочками, миозином и липидными тельцами. Таким образом, при мультифотонном возбуждении тканей одновременно с эмиссией молекул мишеней может быть зарегистрирована вторая гармоника от капсулы органа с высоким содержанием коллагена. Определение положения капсулы органа помогает отслеживать глубину исследования в толще органа (Weigert et al. 2010;Кучмий et al. 2012).

Существуют сравнительно новые подходы с использованием оптоволоконных эндоскопов в сочетании с двухфотонной микроскопией, которые позволяют осуществлять анализ в труднодоступных областях организма, как например, визуализация в желудочнокишечном тракте (Polglase et al 2005).

Флуоресцентные белки в качестве молекулярных меток.

Революцию в визуализации клеток произвело открытие, клонирование и экспрессия

зеленого флуоресцентного протеина (GFP) из медузы Aequorea victoria (Chalfie et al. 1994). GFP принимает нативную конформацию и образует флуорофор без добавления дополнительных кофакторов (кроме 02) внутри клеток разных организмов, что делает этот белок практически универсальным внутриклеточным маркёром. GFP представляет собой лишь один пример целого семейства гомологичных флуоресцентных белков (ФБ), полученных из морских кишечнополостных. Флуоресцентные белки, будучи экспрессированными под контролем регуляторных элементов белка-мишени в составе генетической репортерной конструкции, делают возможным оптическое наблюдения за экспрессией белка-мишени in vivo и in vitro.

Основными ограничениями в случае прижизненной флуоресцентной визуализации являются поглощение света гемоглобином и меланином, и рассеяние света тканями

организма, что снижает количественную оценку в глубине тканей (Contag et al. 1995). Мутагенез ФБ в лабораторных условиях позволил преодолеть эти ограничения, а именно были развиты стратегии визуализации белков с эмиссией в наиболее «прозрачном», с точки зрения прохождения света через ткани, диапазоне 650нм-900 нм. В настоящий момент существует большое разнообразие флуоресцентных белков, обладающих разнообразными характеристиками (спектром эмиссии, яркостью, стабильностью, показателями фотоконверсии), которые находят приложения для визуализации in vivo (Chudakov et al. 2010).

Флуоресцентные белки с особыми свойствами позволяют наблюдать за молекулярными событиями внутри клетки в реальном времени. Так, были разработаны фотоактивируемые белки, которые переключаются с темного на яркое свечение при воздействии возбуждающего света (Lukyanov et al. 2005). Фотопереключение может быть как обратимым, так и необратимым, и оно важно для наблюдения за диффузией белков, их транспортировкой и их временем жизни. Путем слияния доменов эндогенных белков, способных связывать молекулу-мишень, с флуоресцентными белками были получены конформационные флуоресцентные сенсоры. Связывание белковых доменов в составе подобных сенсоров с молекулой-мишенью приводит к изменению конформации ассоциированного с доменами флуоресцентного белка, в результате, меняются его спектральные характеристики (Chudakov et al. 2010). Конформационные сенсоры в перспективе могут быть использованы для исследований in vivo.

Кроме того, были разработаны флуоресцентные подходы для изучения межмолекулярных взаимодействий белков, которые используются для наблюдения молекулярных каскадов передачи сигнала. К этим подходам относятся: межмолекулярный перенос резонансной энергии Фёрстера (FRET), коррелятивная

флуоресцентная спектроскопия и воссоединение частей флуоресцентных молекул. В основе FRET лежит явление, при котором эмиссия донорного хромофора в коротковолновой части спектра эффективно возбуждает акцепторный хромофор с более длинноволновой эмиссией, если молекулы достаточно сближены для передачи энергии (Rusanov et al. 2010). Например, успешное применение FRET для интравитальной микроскопии позволило визуализировать апоптотические раковые клетки в процессе цитотоксичеекой активности CD8+ Т-клеток в опухоли (Breart et al. 2008).

Методы направленного флуоресцентного мечения клеточных и молекулярных мишеней.

Прямое окрашивание флуоресцентными красителями. В ранних исследованиях поведения лимфоцитов и дендритных клеток in situ было использовано мечение клеток in vitro красителями CFSE (5(6)-карбоксифлуоресцеин диацетат N-сукцинимидиловый эфир), SNARF-1 (семинафтолродафлуор), или CMTMR (хлорметил-бензойламинотетраметилродамин). Перечисленные флюорофоры способны свободно проникать через мембрану и связываться с компонентами цитоплазмы. Этот технически простой подход позволяет метить популяции клеток, очищенных по определенным критериям, разными цветами. После введения меченых клеток в организм становится возможным наблюдать за их перераспределением in vivo в норме и при патологиях (Bajenoff and Germain 2007).

Однако существует ряд недостатков этого подхода по сравнению с эндогенной флуоресцентной меткой, что и ограничивает его применение. Во-первых, клетки, для того, чтобы быть помечены, изымаются из естественного окружения. Для лимфоцитов только 10-15% трансплантируемых обратно в организм клеток обнаруживаются в составе вторичных лимфоидных органов, что вызывает законный вопрос о репрезентативности этой выборки для всей исходной популяции. Во-вторых, по мере

деления клеток (и цитокинеза) внутриклеточная концентрация красителей снижается, и интенсивность окрашивания падает, что делает невозможным наблюдение за мечеными лимфоцитами спустя некоторое время после антигенной стимуляции. В-третьих, этот подход не позволяет специфически метить белки-мишени в любых ситуациях, но только в очищенных (с помощью других методов) клеточных популяциях.

Флуоресцентное иммуноокрашивание - представляет собой мечение белков при помощи антител, конъюгированных с флуоресцентной меткой: небольшими органическими молекулами, флуоресцентными белками и квантовыми точками. Недостатками иммуноокрашивания ex vivo является необходимость фиксации (фактически умерщвлении) клеток при изучении внутриклеточных молекул, в том числе и цитокинов. Фиксация может также негативно повлиять на свойства флуорофора. Для использования иммуноокрашивания in vivo существуют следующие ограничения: 1) возможно изучение только поверхностных детерминант, причем интенсивность сигнала сильно зависит от количества/плотности мишени; 2) многие антитела могут либо нейтрализовать, либо наоборот активировать функции изучаемых молекул, а также вызывать процесс антитело-зависимой клеточной цитотоксичности и фагоцитоз; 3) мультивалентность антител может приводить к олигомеризации мишени и нарушению её функции (Bajenoff and Germain 2007;Giepmans et al. 2006). Генетическая флуоресцентная метка. Эндогенная экспрессия репортерных белков может быть достигнута за счет трансфекции (или вирусной трансдукции) клеток репортерными конструкциями in vitro и последующим переносом модифицированных клеток в организм. Как правило, осуществляется лентивирусная или ретровирусная трансдукция репортерными векторами гемопоэтической стволовой клетки. Такие клетки могут быть перенесены в летально облученных реципиентов для создания так

называемых «химерных» животных и дальнейшего наблюдения за экспрессией молекулы-мишени in vivo (Larochelle and Dunbar 2004).

Экспрессия генетически закодированных флуоресцентных белков под контролем специфических регуляторных элементов в геноме экспериментальных животных представляет собой оптимальный инструмент для точного мечения молекул in vivo. Этот подход лишен необходимости нежелательных манипуляций с клетками in vitro и других перечисленных выше недостатков использования специфических антител для иммуноокрашивания in vivo. Использование эндогенной репортерной метки с целью изучения экспрессии молекул-мишеней в линиях «репортерных» мышей фактически произвело революцию в биологии.

«Репортерные» линии экспериментальных животных для биологических исследований.

Генетически-модифицированные линии «репортерных» животных, в которых

флуоресцентная метка находится под контролем регуляторных элементов определенного гена, являются общепризнанным инструментом для современных биологических исследований (Groxford and Buch 2011). Существует четыре основных подхода для получения «репортерных» линий мышей: обычный трансгенез, сайт-специфическая рекомбинация, трансгенез с использованием искусственных бактериальных хромосом (ВАС) и система Сге-активируемой экспрессии флуресцентных белков в локусе ROSА26 (рис.1 А, Б, В, Г) (Croxford and Buch 2011;Germain et al. 2006;Niesner and Häuser 2011).

Трансгенез представляет собой результат случайной интеграции в геном трансгенной репортерной конструкции после инъекций ее в пронуклеус (рис.1 А). Для того чтобы трансгенная репортерная конструкция правильно отражала синтез белка-мишени, необходимо включать в ее состав все регуляторные элементы гена, кодирующего этот белок, что не всегда возможно из-за существования интронных

или удаленных энхансерных регуляторных элементов конкретных генов. Для сохранения эндогенных механизмов регуляции обычно используют сайт-специфическую рекомбинацию - генетический «нок-ин» (рис. 1 Б). В последнее десятилетие широко используется альтернативный подход, сочетающий преимущества трансгенеза и генетического нок-ина - трансгенез искусственными бактериальными хромосомами (ВАС).

А.

вектора для трансгенеза^

(¡ГР

случайное встраивание в геном

: обычно внедряется

; несколько копий ▼

I <¡N>-.11') ' -

I

Б.

вектор для нок-ин

4 Т

1 I

—

гомологическая рекомбинация

I

Сге/Ир-

опосредованная рекомбинация

С)1 I»

В.

()] р

кап

Г.

с

1 - 2 - 3 - 4 ■

43*

.-VI-

МЮ-кассета является стоп-сигналом для синтеза €г УРР

с\1(К)

1

рекомбинация конструкции с ВАС

С

с I 1> К пи

1-2-3

С \1(К)

í

^случайное встраивание ВАС

| с дополнительными генами в геном

*--

Сге-рекомбиназа под контролем промотора лизозима М

|Тканеспецифическое Сге-опосредованное вырезание стоп-кассеты в клетках миелоидного ряда

I

(.1 Р

Кап

Рис.1 Стратегии внедрения последовательности флуоресцентной метки в геном.

А. Обычный трансгенез: в генетической конструкции последовательность гена репортера (ОБР-зеленый флуоресцентный белок) помещена под контроль регуляторных элементов гена исследуемого белка, затем конструкция вводится в

пронуклеус и происходит её случайное встраивание в геном, часто в нескольких копиях.

Б. Метод генетического нок-ина: последовательность репортерного гена (GFP) встраивается в генетический локус гена путем гомологической рекомбинации. Маркеры селекции (необходимые для отбора стволовых клеток с удачной рекомбинацией), такие как неомицин (NEO), удаляются с помощью сайт-специфической Сге-опосредованной рекомбинации. Сге-рекомбиназа вырезает фрагмент, обрамленный 1охР сайтами (указаны овалами).

В. Векторы для трансгенеза получаются путем модификации искусственных бактериальных хромосом, содержащих весь локус изучаемого гена. После инъекции в пронуклеус происходит случайное встраивание ВАС в геном. Серые квадраты -маркеры селекции хлорамфеникол (CM(R)), канамицин Kan.

Г. Сге-опосредованная активация синтеза репортерного белка под контролем специфического промотора. Были созданы линии мышей, в которых репортерный белок (eYFP желтый флуоресцентный белок с улучшенными спектральными свойствами) вместе со стоп-сигналом (NEO) был гомологично встроен в активный локус генома ROSA26. Экспрессия репортерного гена возможна только после Сге-опосредованного удаления стоп-сигнала. Сге-рекомбиназа под контролем промотора гена лизозима приводит к экспрессии eYFP только в клетках миелоидного ряда. SA -аденовирусный акцептор сплайсинга для терминации транскрипции.

Поскольку ВАС-конструкция содержит крупные фрагменты генома (150-350 т.п.н.), включающие удаленные энхансеры, то регуляция экспрессии флуоресцентных маркеров с большой вероятностью останется правильной, как в случае генетического «нок-ина». Получение ВАС-конструкции и ее микроинъекции занимают время, сравнимое с получением обычных трансгенных мышей, в то время как подход генетического «нок-ина» связан с применением технологии эмбриональных стволовых клеток и требует существенно больше времени. Основным недостатком трансгенеза искусственными бактериальными хромосомами является неизбежное внедрение дополнительных генов, расположенных в составе ВАС-конструкции, что может приводить к повышению дозы этих генов в организме трансгенного животного и к изменению нормальной физиологии (рис. 1 В).

В настоящий момент доступны многочисленные линии мышей, в которых Сге-рекомбиназа экспрессирована под контролем специфических промоторов. Эти линии часто используются для Сге-зависимой «активации» флуоресцентной метки в определенных клеточных популяциях (рис. 1 Г). Для этого мыши с Сге-

рекомбиназой под контролем промотора молекулы-мишени скрещивают с другими мышами ROSA26-FP, в которых транскрипция флуоресцентного белка находится под контролем убиквитарного промотора ROSA, но эта транскрипция заблокирована генетическим стоп-сигналом. Стоп-сигнал в ROSA26-FP мышах окаймлен loxP сайтами узнавания Сге-рекомбиназой. Таким образом, после скрещивания таких двух линий мышей в результате гомологической рекомбинации стоп-сигнал удаляется, но только в тех клетках, которые экспрессируют Сге-рекомбиназу, и именно эти клетки оказываются помечены флуоресцентным белком. Слудет учесть, что если промотор, который контролирует экспрессию Сге-рекомбиназы, был активен в клетках на ранних стадиях дифференцировки, то все «потомство» этих клеток будет помечено флуоресцентным белком, даже когда промотор уже не активен. В результате, система Cre-зависимой активации флуоресцентной метки может не давать правильной информации о транскрипции гена цитокина в реальном времени. Использование мышей с индуцируемой экспрессией Сге-рекомбиназы может позволить преодолеть это ограничение (Кучмий.еГ al. 2012). На сегодняшний день доступен целый ряд линии мышей ROSA26-FP, в которых происходит Сге-зависимая экспрессия разных по цвету флуоресцентных белков: CFP, YFP, eGFP, tdRFP (Niesner and Hauser 2011).

А.

Б.

а

нарушение регуляции

нефизиологический паттерн экспрессии

мутации: генетические инсерции и др.

увеличение дозы генов

дополнительный фенотип

изменение стабильности полицистронной мРНК

б

\

пострансля-

ционные модификации белка-мишени

созревание флуорофора ФБ

В

Л

контроль секреции ФБ

ошибочная оценка биологической значимости данных репортера

фотоконверсии ФБ

Рис.2 Недостатки современных методов, связанных с использованием репортерных мышей. А. На уровне транскрипции ДНК. а - в процессе трансгенеза в геном интегрируются сравнительно короткие участки гена-мишени, таким образом, регуляция экспрессии может быть нарушена в связи с отсутствием некоторых регуляторных элементов. Место хромосомной интеграции также способно влиять на экспрессию гена-мишени, б - при сайт-специфическом мутагенезе (нок-ин) после внедрения последовательности флуоресцентного белка могут возникать мутации в гене-мишени, в - при трансгенезе ВАС-конструкциями увеличивается доза генов, находящиеся в составе ВАС конструкции. Дополнительные гены могут приводить к собственному фенотипу. Б. На уровне трансляции мРНК и пост-трансляционном уровне, а - мРНК несет стабилизирующие и дестабилизирующие элементы в нетранслируемых областях. Если эти области используются для внедрения IRES или 2А пептида, стабильность мРНК слитного с флуорофором гена-мишени может изменяться, что может привести к изменению экспрессии. Некоторые белки-мишени должны быть модифицированы и/или депонирована в виде везикул, что может быть причиной разной кинетики синтеза белка-мишени и флуоресцентной метки, б и в -свойства флуоресцентных белков, такие как, время созревания флуорофора, фотоконверсия, и также случайное введение секреторных последовательностей в структуру репотерных белков, могут негативно влиять на способность детектировать белок-мишень.

Некоторые ограничения, связанные с использованием «репортерных» линий мышей для изучения биомолекул, приведены на рис. 2 (Croxford et al. 2009). Одним из основных недостатков генетического введения флуорофора в состав молекулы-мишени может быть нарушение ее функции в составе слитного белка. Для раздельного синтеза белка-мишени и флуоресцентной метки, закодированных единой мРНК, между ними физически встраиваются генетические последовательности IRES (участок внутренней посадки рибосомы) или 2А пептида.

IRES (впервые была обнаружена в пикорновирусах) - последовательность нуклеотидов в вирусных мРНК, обеспечивающая инициацию трансляции с внутреннего участка мРНК, без сканирования 5'-нетранслируемой области, как это имеет место в большинстве клеточных мРНК. Если поместить последовательность IRES между двумя репортерными генами, то второй (3'-концевой) цистрон будет экспрессироваться отдельно (т. н. метод бицистронных конструкций). Тем не менее, существует ряд ограничений метода бицистронных конструкций, а именно, IRES может обладать собственной промоторной активностью, иметь дополнительные сайты сплайсинга или иметь сниженную эффективность инициации транскрипции, по сравнению с 5'-нетранслируемый участком, которые приводят к диспропорции синтеза маркерных белков по сравнению с белком-мишенью и к нарушению функции репортеров (Mosser et al. 1997).

Последовательность 2А пептида пикорновирусов, когда закодирована между последовательностью молекулы-мишени и последовательностью метки, позволяет раздельную трансляцию белков, закодированных в одной рамке считывания. В последовательности 2А пептида закодированы 22 аминокислоты. В настоящий момент считается признанным механизм так называемого «рибосомального пропуска», когда рибосома в результате стерических взаимодействий в

пептидильном центре делает пропуск между 19-тым остатком Gly на С-конце и 20-ым остатком Pro на N-конце. Главным ограничением применения 2А-пептида является физическое добавление 19-ти аминокислот на С-конец исследуемого белка, что может повлиять на его функцию (Donnelly et al. 2001).

Разнообразие существующих в настоящий момент «репортерных» линий мышей отражено в таблице 1. В частности, были созданы линии в которых флуоресцентно помечены клетки, экспрессирующие цитокины (IL-2, IL-4, IFNy, IFNß, TNF), транскрипционные факторы (Blimp 1, FoxP3, NFkB, Roryt), хемокины (CXCL12, CCL17), молекулы адгезии, рецепторы хемокинов (GX3CR1, CD11с), а также другие молекулы, например лизоцим (Faust et al. 2000).

Основным преимуществом «репортерных» линий для изучения биологии цитокинов, как уже было сказано ранее, является возможность идентификации и получения живых клеток, экспрессирующих изучаемый цитокин, но только при условии, что репортер точно отражает правильную продукцию мРНК цитокина и самого белка. Методики для анализа экспрессии цитокинов, которые применялись прежде, имеют ряд существенных недостатков, которые можно избежать при использовании репортерных мышей. Например, твердофазный иммуноферментный анализ не позволяет анализировать индивидуально клетки-продуценты цитокина. Когда экспрессия цитокина определяется методами иммуноокрашивания и проточной цитофлуориметрии, зачастую требуется дополнительная стимуляция клеток in vitro и фиксация клеток для внутриклеточного окрашивания антителами, что создает условия, отличные от физиологических. «Секреционный тест» и модификация иммуноферментного анализа ELISPOT позволяют определить индивидуальных продуцентов цитокина, но только ex vivo (Croxford and Buch 2011).

Мишень Репортерный белок Тип Название Ссылка

IL-2 LacZ Tr IL-2_LacZ (Brombacher et al. 1994)

IL-2 GFP Tr IL-2-GFP-CD2.27 (Saparov et al. 1999)

IL-4 GFP НИ IL-4/GFP (Hu-Li et al. 2001)

IL-4 IRES-GFP НИ C.129-il4w/J (Mohrs et al. 2005)

IL-4 YFP Tr IL-4 YFP (Kumar et al. 2005)

IL-4 hCD2 НИ KN-2 (Mohrs et al. 2001)

IL-7 hCD25 ВАС IL-7.hCD25 (Repass et al. 2009)

IL-7 Cre ВАС IL-7.Cre (Repass et al. 2009)

IL-7 GFP,Cre,DTR, Luc ВАС IL-7GCDL (Shalapour et al. 2010)

IL-10 IRES-GFP НИ B6.129S6- l\\Otm,Fhli (Kamanaka et al. 2006)

IL-10 Thy 1.1 Тг lOBiT (Maynard et al. 2007)

IL-10 eGFP ВАС Tiger (Kamanaka et al. 2006)

IL-10 eYFP НИ IL-HfVM' (Calado et al. 2006)

IL-12J3 IRES-eYFP НИ B6.129-1112tmlLky /} (Reinhardt et al. 2006)

IL-17F Cre ВАС IL-17F-Cre (Croxford et al. 2009)

IL-17F Thy 1.1 Тг IL-17F"lyl 1 (Lee et al. 2009)

IL-17F RFP НИ IL-17F-RFP (Yang et al. 2008)

IFN-pl IRES-eYFP НИ B6.129-ifhbl ,m,Lky /J (Scheu etal. 2008)

IFN-y eYFP Тг YETI (Stetson et al. 2003)

TNF LucZ Тг Tnfa-luc (Kravchenko et al. 2008)

TNF Katushka Тг TNF-2A-Kat (Кучмий A.A. et al. 2011)

TGFpl GFP НИ TGF(3 null (Li et al. 2007)

IL-13 eGFP НИ И13-eGFP (Neill etal. 2010)

FoxP3 GFP ВАС FoxP3 -GFP-hCre (Zhou et al. 2008)

FoxP3 GFP НИ Foxp3gtp (Fontenot et al. 2005)

Blimp-1 YFP ВАС Blimp-1Y№ (Rutishauser et al. 2009)

GATA3 LacZ НИ GATA-3+/nlslacZ (Hendriks a/. 1999)

RORyt GFP НИ Rorc(yt)+/^ (Eberl et al 2004)

Таблица 1. Примеры опубликованных линий «репортерных» экспериментальных животных. НИ - генетический нок-ин, ВАС - трансгенез ВАС-конструкциями, Тг-конвенционный трансгенез. eGFP - зеленый флуоресцентный белок с улучшенными свойствами, eYFP - желтый флуоресцентный белок с улучшенными свойствами, LacZ, Luc - люцифераза, Ил - интерлейкины, FoxP3, G AT A3, Blimp-1, RORyt - название транскрипционных факторов, ФНО - фактор некроза опухолей, ИФН - интефероны, TOPß - трансфорирующий фактор роста ß, h - человеческий, CD -кластеры дифференцировки.

Таким образом, только при помощи репортерных мышей оказывается возможным идентифицировать клетки, экспрессирующие цитокин in situ. Использование «репортерных» мышей дало возможность проследить происхождение, дифференцировку, пролиферацию, выживание и миграцию клеток, экспрессирующих разные цитокины, а также проанализировать паттерн экспрессии исследуемого цитокина и межклеточные взаимодействия его продуцентов in vivo (Кучмий et al. 2012).

Репортерные линии мышей с флуоресцентной меткой для изучения биологии TNF

Значительный интерес, с точки зрения создания репортерных мышиных моделей с флуоресцентной меткой, представляет собой цитокин Фактор Некроза Опухолей (TNF), поскольку существует ряд нерешенных вопросов о функциях этого цитокина и о роли клеток, экспрессирущих этот цитокин, в норме и при патологиях, которые потенциально могут быть изучены с использованием линий репортерных мышей.

Фактор некроза опухолей является плейотропным провоспалительным и иммунорегуляторным цитокином, который играет важную роль в защите организма от внутриклеточных патогенов и в организации структуры вторичных лимфоидных органов. Нарушение регуляции и избыточная продукция TNF приводит к развитию ряда аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит, псориаз, а в острых случаях может приводить к симптомам септического шока. Фармакологическая блокировка TNF используется в клинике при лечении некоторых аутоиммунных заболеваний (Tracey et al. 2008).

Исследования нашей лаборатории показали, что некоторые биологические функции TNF зависят от вида клеток-продуцентов и их локализации (Grivennikov et al. 2005;Kruglov et al. 2011;Tumanov et al. 2010). Вместе с тем, роль индивидуальных клеточных источников TNF в патогенезе аутоиммунных заболеваний по-прежнему до конца не понята. Более того, на настоящий момент далеко не все подтипы клеток, экспрессирующих TNF, хорошо охарактеризованы, и не исключено, что существуют дополнительные типы клеток - как иммунных, так и стромальных - продуцирующих TNF в специальных условиях. Новые репортерные системы позволят изучить роль клеток-продуцентов TNF в норме и при развитии модельных заболеваний с использованием наиболее современных методов на сегодняшниц день .

Во-первых, использование именно флуоресцентных меток позволит расширить арсенал методов анализа ex vivo и in vitro: использовать микроскопию, проточную цитофлуориметрию, клеточную сортировку, лизерную микродиссекцию и пр. Перечисленные методы обладают большой точностью и высоким разрешением, позволяют проводить анализ на уровне отдельных клеток. Высокоочищенные субпопуляции жизнеспособных TNF-экспрессирующих клеток могут быть использованы для последующего транскриптомного анализа.

Во-вторых, TNF-репортерные линии мышей открывают возможность использования методов прижизненной микроскопии, что впервые позволит проанализировать паттерн экспрессии TNF и межклеточные взаимодействия TNF-продуцентов в реальном времени in vivo (Bajenoff and Germain 2007;Niesner and Hauser 2011;Кучмий et al. 2012)

Для получения достоверной модели TNF-репортерных линий мышей важно учитывать особенности регуляции и биосинтеза TNF, которым посвящена следующая глава.

Общие сведения о Факторе Некроза Опухолей: структура белка, регуляция биосинтеза цитокина, рецепторы TNF.

Структура TNF. Впервые существование "фактора некроза опухолей" было показано

в лаборатории Л.Олда (Carswell et al. 1975). Оказалось, что в ответ на инъекции компонентов клеточной стенки Грам" бактерий макрофагами выделяется эндогенный фактор, который вызывает геморрагический некроз подкожных трансплантатов саркомы. Вслед за очисткой и определением аминокислотной последовательности TNF человека (Aggarwal et al. 1985), было осуществлено молекулярное клонирование TNF человека в лаборатории Д. Гёддела (Gray et al. 1984;Pennica et al. 1984), и TNF мыши и человека в лаборатории В. Фййерса (Fransen et al. 1985;Marmenout et al. 1985).

TNF представляет собой трансмембранный белок II типа, то есть С-конец полипептидной цепи этого цитокина ориентирован в просвет эндоплазматического ретикулума (впоследствии во внеклеточное пространство) и N-конец находится в цитоплазме. Мономерная мембраносвязанная форма TNF (26kDa) имеет топологию «сэндвича» из антипараллельных ß-слоев (Eck et al. 1988). Пространственная укладка молекул TNF осуществляется на поверхности мембраны, затем мономеры цитокина спонтанно объединяются в биологически активные тримеры (Kriegler et al. 1988). Участки связывания с рецепторами у тримеров TNF расположены в «желобках» между мономерами (Eck and Sprang 1989), поэтому только тримерная форма TNF способна связываться с рецепторами, что приводит к кластеризации последних и эффективной передаче сигнала (Tartaglia and Goeddel 1992). В процессе дальнейшего созревания от трансмембранной формы цитокина (tmTNF) протеолитически отрезается растворимая форма TNF, также в биологически активной тримерной форме. Протеолитическую конверсию в положении между А1а76 и Val77 в человеческом TNF (Thr79 и Lys80 в

мышином TNF) осуществляет мембраносвязанная матриксная металлопротеиназа -TNF-конвертирующий фермент (TACE или ADAM 17) (Black et al. 1997).

Регуляция биосинтеза TNF.

TNF экспрессируется в ответ на разнообразные стимулы, связанные с воспалением, инфекционным процессом и клеточным стрессом (Falvo-eí al. 2010;Шебзухов Ю.В. и Купраш Д.В. 2011). Впервые TNF был обнаружен как продукт секреции макрофагов (Beutler et al. 1985), но сейчас известно большое число разных типов клеток, которые способны производить TNF: aßT-клетки (Steffen et al. 1988), у8Т-клетки (Lundqvist et al. 1994), В-клетки (Sung et al. 1988), NK-клетки (натуральные киллерные клетки) (Dalbeth and Callan 2002), тучные клетки (Gordon and Galli 1990), дендритные клетки (Caux et al. 1994), нейтрофилы, синовиальные фибробласты (Mclnnes et al. 2000) и др. Недавно было показано, что IgA" плазматические клетки из собственной пластинки (lamina propria) кишечника способны производить TNF и индуцированную NO-синтазу (iNOS) в неинфицированных мышах (Fritz et al 2011). Экспрессия этого цитокина может быть обнаружена и в специализированных типах клеток, которые появляются в ходе воспалительных реакций, как например TNF/iNOS-экспрессирующие дендритные клетки (Serbina et al. 2003). Не исключено, что существуют другие популяции клеток, способные производить TNF (при определенных условиях), которые еще предстоит идентифицировать.

Для обеспечения своих биологических функций TNF производится строго

определенными клетками организма, причем его количество, время синтеза и кинетика

высвобождения должны четко регулироваться. Регуляция биосинтеза TNF в клетках

происходит на нескольких уровнях: транскрипционном (инициация транскрипции и

элонгация), пост-транскрипционном (сплайсинг мРНК и поддержание стабильности

мРНК), на уровне трансляции, а также на уровне секреции - в ходе протеолитического

26

отщепления TNF металопротеиназой TACE и при связывании/блокаде TNF растворимыми рецепторами (рис.3). TNF путем взаимодействия со своими рецепторами способен регулировать собственную экспрессию и осуществлять позитивную или негативную обратную связь, в зависимости от цитокинового и клеточного контекста.

BCR/TCR

синтез TNF различными типами клеток зависит от природы стимула

регуляция секреции TNF

Рис. 3 Схема регуляции биосинтеза TNF. TNF экспрессируется в ответ на активацию паттерн распознающих Toll-подобных рецепторов (Toll Like Receptors, TLRs); рецепторов некоторых цитокинов (IL-1, IL-18, TNF); при активации Т- или 13-клеточных рецепторов (TCR; BCR). Далее включается сложный многоэтапный сигнальный каскад: 1) ряд адаитерных молекул. Адаптеры TLRs: MyD88 - myeloid differentiation primary response protein 88 ; TIRAP - TIR domain-containing adapter; TRIF -

TIR domain-containing adapter inducing interferon-P; TRAM - TRIF-related adapter molecule. Адаптеры рецепторов TNF: TRADD -TNF' receptor associated protein with death domain, RIP - receptor interacting protein, TRAF - TNF-receptor associated factor; 2) включается первый уровень МАРЗ киназ (mitogen-activated protein kinase kinase, MAP3Ks): TAK1 - TGFp-activated kinase 1, TPL - tumor progression locus 2, MEKK1, mitogen-activated protein kinase /extracellular signal-related kinase kinase; 3) включается следующий уровень MAP2 киназ - MKKs и комплекса, ингибирующего IkB киназу (IKK), 1кВа - ингибитор NFkB 4) дистальный уровень эффекторных киназ: ERK-extracellular signal-regulated kinase, JNK -c-Jun-N-terminal kinases, p38 mitogen kinase, MK2 - mitogen activated protein kinase МАРК/МАРК activated protein ; 5) уровень транскрипционных факторов: NFkB - nuclear factor kB, включает p50, p65, c-Rel субъединиц, AP-1- activating protein-1, NFAT - nuclear factor of activated T-cells; полимераза II - PolII, СВР/рЗОО - транскрипционный ко-активатор.

При передаче сигнала с В-клеточного рецептора (BCR) и Т-клеточного рецептора (TCR) используются аналогичные сигнальные пути. К активации фосфолипазы Су (PLCy) и фосфатидил-инозитол бифосфатного пути (PIP2) приводят киназы ВТК и ITK, ассоциированные с BCR и TCR соответственно. Затем включаются вторичные посредники передачи сигнала инозитол-три фосфат (IP3), диацилглицерол (DAG) , протеин-киназа С (РКС) и ионы Са2+. В результате происходит активация кальмодулина (Cam) и кальцинейрина (calcineurin) с последующей транспортировкой NFATp в ядро. VAV/Rac путь o r BCR и TCR рецепторов приводит к активации JNK и р38. Через РКС возможна активация транскрипционных факторов NFkB. Обозначение дополнительных адаптерных молекул передачи сигнала с В-клеточного рецептора: Btk

- Bruton's tyrosine kinase , ITK - IL2-inducible T-cell kinase, SLP65 - B-cell linker protein. Регуляция на уровне трансляции, обозначения: ARE - AU-богатые участки в

З'нетранслируемой области гена TNF, HuR, AUF-1, TIA-1 , ТТР- тристетрапролин -белки участвующие в утилизации мРНК TNF по механизму, зависящему от ARE, РАВР

- поли-А связывающие белки, elF - эукариотический фактор инициирующий трансляцию.

Регуляция секреции, обозначения: матриксная металлопротеиназа ADAM 17, TNFRs

- рецепторы TNF, iRhom2 - некаталитическая ромбоидная протеаза, регулирующая экспрессию ADAM 17.

Регуляторные элементы локуса TNF/LT.

Ген TNF находится в составе компактного локуса, включающего два других члена

суперсемейства TNF - лимфотоксин a (LTa) и лимфотоксин р (LTfi), на 6 хромосоме у

человека и на 17 хромосоме у мыши (Muller et al 1987;Spies et al. 1986). Существенная

для экспрессии предпромоторная область TNF охватывает область до 1200 пар

оснований (п.о.), находящуюся в 5'-области от начала транскрипции (рис. 4).

Выравнивание in silico последовательностей разных видов показало наличие

дистального и проксимального консервативных участков в предпромоторной области

TNF. Проксимальная промоторная область TNF картирована в пределах 200 п.о. выше

28

старта транскрипции. В этой области были выявлены последовательность ТАТА-бокса и мотивы связывания для ряда важных транскрипционных факторов: NFAT, Egr, SP1, Ets/Elk, АР-1. Сайт CRE (cAMF response element) для транскрипционного фактора АР-1 (c-Jun/ATF) совместно с расположенным рядом сайтом связывания NFAT составляют мощный регуляторный элемент, достаточный для транскрипции гена TNF в большинстве систем экспрессии (рис.4) (Kuprash et al. 1999;Шебзухов Ю.В. и Купраш Д.В. 2011). Известно, что транскрипционные факторы семейства NFkB (р50, р65 (Rel-А), р52, RelB, c-Rel) играют важную роль в регуляции транскрипции TNF (Kuprash et al. 1995;Shakhov et al. 1990). Распределение сайтов связывания NFkB в предпромоторной области представлено на рис.4, их функциональность будет обсуждена в следующей главе. Еще один регуляторный элемент гена TNF - энхансер TNF - находится в третьем интроне гена (Barthel and Goldfeld 2003).

Метилирование остатков цитидина в CpG-динуклеотидных повторах промоторов

разных генов представляет собой универсальный механизм эпигенетической репрессии

их транскрипции. Как правило, степень метилирования CpG-повторов в геномной ДНК

коррелирует с признаками конденсированной формы хроматина - устойчивостью к

ДНКазе I и супрессирующими модификациями гистонов. Присутствие

неметилированных «CpG-островков» в 5'-промоторных областях генов приводят,

напротив, к дестабилизации связывания нуклеосомы с ДНК и к разрешению

транскрипции генов без дополнительных модификаций нуклеосом комплексом

SWI/SNF (Ramirez-Carrozzi et al. 2006). Оказалось, что предпромоторная область гена

TNF метилирована неравномерно: в проксимальной области промотора не наблюдается

метилирования CpG-динуклеотидов, когда как в дистальной области промотора

обнаруживаются преимущественно метилированные CpG-повторы (Sullivan et al. 2007).

В первичных клетках иммунной системы (в отличие от клеточных линий)

29

метилирование промотора гена TNF является стабильным и эволюционно консервативным. Тем не менее, статус метилирования промоторной области гена TNF, скорее всего, не является лимитирующим эпигенетическим механизмом регуляции транскрипцию гена TNF в клетках иммуной системы (Shebzukhov et al. 2012).

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Кучмий, Анна Александровна

Выводы

1. Получены и охарактеризованы две новых линии TNF-репортерных мышей, с красным белком Katushka и двойные репортерные мыши с красным и зеленым флуоресцентными белками Kat*eGFP-TNF.

2. Анализ миелоидных клеток обеих линий репортерных мышей показал достоверное маркирование TNF-экспрессирующих клеток флуоресцентными белками после активации ЛПС, с нормальной транскрипционной регуляцией мРНК Kat-TNF в культурах костномозговых макрофагов.

3. По экспрессии флуоресцентных белков были определены фракции TNF-экспрессирующих лимфоцитов из обеих линии репортерных мышей. Детекция флуоресцентных белков только в части трансгенных лимфоцитов связана с разной кинетикой экспрессии флуоресцентных белков и цитокина.

4. TNF, кодируемый трансгенной вставкой Kat-TNF, является биологически с неактивным, что связано присоединением 2А-пептида на С-конец белка, который важен для взаимодействия с рецептором цитокина. Поэтому Kat-TNF мыши продуцируют нормальные уровни биологически активного TNF.

5. Интенсивность базальной флуоресценции eGFP в иммуноцитах из неиммунизованных, наивных eGFP-TNF мышей отражает активность промотора гена TNF в разных клеточных субпопуляциях на разных стадиях развития и дифференцировки.

6. Т -клетки из Пейеровых бляшек с активированным фенотипом в наивных, неиммунизованных мышах конститутивно производят TNF. Модель Kat*eGFP-TNF пригодна для гистологического анализа TNF-экспрессирующих клеток в наивных неиммунизованных мышах.

7. TNF-экспрессирующие клетки с большой точностью детектируются по экспрессии флуоресцентного белка Katushka в in vivo моделях при помощи проточной цитофлуориметрии и двухфотонной микроскопии.

Заключение.

В ходе этой работы была получена и охарактеризована новая уникальная линия генетически модифицированных мышей Kat-TNF, в геном которых методом трансгенеза была интегрирована репортерная конструкция, программирующая параллельную экспрессию TNF и красного флуоресцентного белка Katushka. В состав конструкции для получения линии мышей Kat-TNF включены все известные регуляторные элементы гена TNF, в том числе последовательность самого гена TNF с энхансерным элементом в 3-м нитроне и З'-нетранслируемой областью, что обеспечивает сохранение правильной регуляции трансгена.

Одновременно и независимо коллегами из Университета им. Йохана Гутенберга в Майнце, была получена другая трансгенная TNF-репортерная линия мышей eGFP-TNF, в которой экспрессия TNF сопряжена с экспрессией зеленого флуоресцентного белка с улучшенными спектральными характеристиками. Особенностью конструкции для получения eGFP-TNF репортерных мышей является то, что экспрессия eGFP регулируется только промоторной областью TNF и в ней отсутствуют важные регуляторные элементы - AU-богатые участки, расположенные в З'-нетранслируемой области гена TNF.

В результате скрещивания Kat-TNF и eGFP-TNF была получена еще одна линия двойных репортерных мышей Kat*eGFP-TNF, которая представляет собой пример комплементации двух трансгенов и позволяет анализировать экспрессию «патогенного» и «физиологического» TNF одновременно.

Две созданные модели представляют собой первый пример использования флуоресцентного белка для мечения TNF-экспрессирующих клеток. Использование флуоресцентной метки является перспективным подходом для выявления экспрессии TNF на уровне одной клетки, позволяющим осуществлять всесторонний анализ с использованием флуоресцентных методов. В нашей работе по характеристике Kat-TNF и Kat*eGFP-TNF мышей было убедительно показано, что экспрессия флуоресцентных белков соответствует экспрессии TNF.

Так, в линии Kat-TNF мышей методами проточной цитофлуориметрии с высокой точностью можно определить фенотип TNF-экспрессирующих клеточных субпопуляций in vitro и в условиях моделей системной ЛПС-токсичности и Конканавалин A-индуцированной гепатотоксичности in vivo. Кроме того, линия Kat-TNF репортерных мышей была положительно охарактеризована для in vivo микроскопии нервной системы при развитии экспериментального энцефаломиелита. Наконец, при помощи Kat-TNF линии мышей была выявлена конститутивная экспрессия TNF Т-клетками кишечника с активированным фенотипом.

Таким образом, применение Kat-TNF мышей в других моделях TNF-зависимых заболеваний (коллаген-индуцированный артрит, колит, индуцированный CD4 CD45RB Т -клетками, модели канцерогенеза) позволит точнее установить фенотип TNF-экспрессирующих клеток, проследить за их миграцией и межклеточными взаимодействиями in vivo, и определить механизм участия этих клеток в патогенезе заболеваний. При помощи проточной цитофлуориметрии можно будет выделить высокоочищенные субпопуляции жизнеспособных TNF-экспрессирующих клеток для последующего транскриптомного анализа. Таким образом, впервые становится возможным с большой точностью и разрешением определять клетки, экспрессирующие TNF в ответ на различные стимулы in vitro и in vivo.

При анализе двойных репортерных мышей была обнаружена базальная экспрессия eGFP в иммуноцитах из наивных, неиммунизованных мышей, указывающая на корректное функционирование промотора гена TNF в составе eGFP-TNF конструкции, при нарушенной регуляции AU-богатыми участками. Результатом исключения регуляторных AU-богатых элементов в конструкции для получения eGFP-TNF репортерной модели стало то, что клетки, в которых транскрипция TNF в норме незначительна (или клетки просто «подготовлены» к транскрипции), экспрессируют детектируемые уровни зеленого, репортерного для TNF белка. Kat*eGFP-TNF мыши представляют собой первый пример флуоресцентной репортерной системы с высокой чувствительностью к активности промотора гена TNF in vivo. Подобная модель представляет собой интерес для поиска новых источников TNF в наивных неиммунизованных мышах - такие клетки могут оказаться важными для развития патологии. С другой стороны, транскрипция гена TNF не всегда означает продукция цитокина этими клетками. Характеристика синтеза TNF eGFP+ клетками является важной задачей на будущее.

В результате, полученные модели (каждая из которых имеет свои особенности) являются не имеющим аналогов инструментом для изучения регуляции биосинтеза TNF и роли TNF-экспрессирующих клеток в норме и при патологиях с использованием современных методов флуоресцентного анализа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кучмий, Анна Александровна, 2012 год

Список литературы

1. Кучмий А.А., Круглов А.А., Галимов А.Р., et al. (2011) Новая линия трансгенных репортерных мышей для изучения экспрессии фактора некроза опухолей. Российский Иммунологический Журнал 5, с. 205-214.

2. Кучмий,А.А., Ефимов,Г.А., и Недоспасов,С.А. (2012) Методы молекулярной визуализации in vivo. Биохимия (Моек) в печати.

3. Шебзухов Ю.В. и Купраш Д.В. (2011) Регуляция транскрипции генов локуса TNF/LT в клетках иммунной системы. Молекулярная биология 45, 56-67.

4. Ярилин А.А. (2010) Иммунология. ГЭОТАР-Медиа, Москва, с. 302-310;345-358

5. Aggarwal,B.B., Kohr,W.J., Hass,P.E., et al. (1985) Human tumor necrosis factor. Production, purification, and characterization. J.Biol.Chem. 260, 2345-2354.

6. Alexopoulou,L., Kranidioti,K., Xanthoulea,S., et al. (2006) Transmembrane TNF protects mutant mice against intracellular bacterial infections, chronic inflammation and autoimmunity. Eur. J. Immunol. 36, 2768-2780.

7. Allen,C.D., Okada,T., Tang,H.L., & Cyster,J.G. (2007) Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531.

8. Andrews,S.F. & Rawlings,D.J. (2009) Transitional В cells exhibit а В cell receptor-specific nuclear defect in gene transcription. J.Immunol. 182, 2868-2878.

9. Ato,M., Stager,S., Engwerda,C.R., & Kaye,P.M. (2002) Defective CCR7 expression on dendritic cells contributes to the development of visceral leishmaniasis. Nat. Immunol. 3, 1185-1191.

10. Baer,M., Dillner,A., Schwartz,R.C., Sedon,C., Nedospasov,S., & Johnson,P.F. (1998) Tumor necrosis factor alpha transcription in macrophages is attenuated by an autocrine factor that preferentially induces NF-kappaB p50. Mol Cell Biol. 18, 5678-5689.

11. Bajenoff,M. & Germain,R.N. (2007) Seeing is believing: a focus on the contribution of microscopic imaging to our understanding of immune system function. Eur. J. Immunol. 37 Suppll, S18-S33.

12. Barthel,R. & Goldfeld, A.E. (2003) T cell-specific expression of the human TNF-alpha gene involves a functional and highly conserved chromatin signature in intron 3. J. Immunol. 171,3612-3619.

13. Benoit,S., Toksoy,A., Brocker,E.B., Gillitzer,R., & Goebeler,M. (2004) Treatment of recalcitrant pustular psoriasis with infliximab: effective reduction of chemokine expression. Br.J.Dermatol. 150, 1009-1012.

14. Beutler,B., Greenwald,D., Hulmes,J.D., et al. (1985) Identity of tumour necrosis factor and the macrophage-secreted factor cachectin. Nature. 316, 552-554.

15. Bialecki,E., Paget,C., Fontaine,J., Capron,M., Trottein,F., & Faveeuw,C. (2009) Role of marginal zone B lymphocytes in invariant NKT cell activation. J.Immunol. 182, 61056113.

16. Black,R. A., Rauch,C.T., Kozlosky,C. J., et al. (1997) A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from cells. Nature. 385, 729-733.

17. Bonder,C.S., Ajuebor,M.N., Zbytnuik,L.D., Kubes,P., & Swain,M.G. (2004) Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J.Immunol. 172,45-53.

18. Breart,B., Lemaitre,F., Celli,S., & Bousso,P. (2008) Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice. J. Clin. Invest. 118, 1390-1397.

19. Brombacher,F., Schafer,T., Weissenstein,U., et al. (1994) IL-2 promoter-driven lacZ expression as a monitoring tool for IL-2 expression in primary T cells of transgenic mice. Int.Immunol. 6,189-197.

20. Calado,D.P., Paixao,T., Holmberg,D., & Haury,M. (2006) Stochastic monoallelic expression of IL-10 in T cells. J.Immunol. 177, 5358-5364.

21. Caput,D., Beutler,B., Hartog,K., Thayer,R., Brown-Shimer,S., & Cerami,A. (1986) Identification of a common nucleotide sequence in the 3'-untranslated region of mRNA molecules specifying inflammatory mediators. Proc.Natl.AcadSci.U.S.A. 83,1670-1674.

22. Carswell,E.A., 01d,L.J., Kassel,R.L., Green,S., Fiore,N., & Williamson,B. (1975) An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 72, 3666-3670.

23. Caux,C., Massacrier,C., Vanbervliet,B., et al. (1994) Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J.Exp.Med. 180, 1263-1272.

24. Chalfie,M., Tu,Y., Euskirchen,G., Ward,W.W., & Prasher,D.C. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805.

25. Chatzidakis,I. & Mamalaki,C. (2010) T cells as sources and targets of TNF: implications for immunity and autoimmunity. Curr.Dir.Autoimmun. 11, 105-118.

26. Cherwinski,H.M., Schumacher,J.H., Brown,K.D., & Mosmann,T.R. (1987) Two types of mouse helper T cell clone. III. Further differences in lymphokine synthesis between Thl and Th2 clones revealed by RNA hybridization, functionally monospecific bioassays, and monoclonal antibodies. J.Exp.Med. 166,1229-1244.

27. Chiang,E.Y., Kolumam,G.A., Yu,X„ et al. (2009) Targeted depletion of lymphotoxin-alpha-expressing TH1 and TH17 cells inhibits autoimmune disease. Nat.Med. 15, 766-773.

28. Chudakov,D.M., Matz,M.V., Lukyanov,S., & Lukyanov,K.A. (2010) Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90, 1103-1163.

29. Clausen,B.E., Burkhardt,C., Reith,W., Renkawitz,R., & Forster,I. (1999) Conditional gene targeting in macrophages and granulocytes using LysMcre mice. Transgenic Res. 8, 265-277.

30. Contag,C.H., Contag,P.R., Mullins,J.I., Spilman,S.D., Stevenson,D.K., & Benaron,D.A. (1995) Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603.

31. Corazza,N., Eichenberger,S., Eugster,H.P., & Mueller,C. (1999) Nonlymphocyte-derived tumor necrosis factor is required for induction of colitis in recombination activating gene (RAG)2(-/-) mice upon transfer of CD4(+)CD45RB(hi) T cells. J.Exp.Med. 190, 14791492.

32. Croxford,A.L. & Buch,T. (2011) Cytokine reporter mice in immunological research: perspectives and lessons learned. Immunology. 132, 1-8.

33. Croxford,A.L., Kurschus,F.C., & Waisman,A. (2009) Cutting edge: an IL-17F-CreEYFP reporter mouse allows fate mapping of Thl7 cells. J.Immunol. 182, 1237-1241.

34. Dalbeth,N. & Callan,M.F. (2002) A subset of natural killer cells is greatly expanded within inflamed)oirAs. Arthritis Rheum. 46, 1763-1772.

35. Davis,S.C., Pogue,B.W., Springett,R., et al. (2008) Magnetic resonance-coupled fluorescence tomography scanner for molecular imaging of tissue. Rev.Sci.Instrum. 79, 064302.

36. Denk,W., Strickler,J.H., & Webb,W.W. (1990) Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76.

37. Dieguez-Hurtado,R., Martin,J., Martinez-Corral,I., et al. (2011) A Cre-reporter transgenic mouse expressing the far-red fluorescent protein Katushka. Genesis. 49, 36-45.

38. Doi,K., Leelahavanichkul,A., Yuen,P.S., & Star,R.A. (2009) Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury. J. Clin.Invest. 119, 2868-2878.

39. Donnelly,M.L., Luke,G., Mehrotra,A., el al. (2001) Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. J. Gen. Virol 82, 1013-1025.

40. Eberl,G., Marmon,S., Sunshine,M.J., Rennert,P.D., Choi,Y., & Littman,D.R. (2004) An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nat. Immunol. 5, 64-73.

41. Eck,M.J., Beutler,B., Kuo,G., Merryweather,J.P., & Sprang,S.R. (1988) Crystallization of trimeric recombinant human tumor necrosis factor (cachectin). J.Biol.Chem. 263,12816-12819.

42. Eck,M.J. & Sprang,S.R. (1989) The structure of tumor necrosis factor-alpha at 2.6 A resolution. Implications for receptor binding. J.Biol.Chem. 264, 17595-17605.

43. Elliott,M.J., Maini,R.N., Feldmann,M., et al. (1993) Treatment of rheumatoid arthritis with chimeric monoclonal antibodies to tumor necrosis factor alpha. Arthritis Rheum. 36, 1681-1690.

44. Espevik,T. & Nissen-Meyer,J. (1986) A highly sensitive cell line, WEHI164 clone 13, for measuring cytotoxic factor/tumor necrosis factor from human monocytes.

J. Immunol. Met hods. 95, 99-105.

45. Fagarasan,S., Kawamoto,S., Kanagawa,0., & Suzuki,K. (2010) Adaptive immune regulation in the gut: T cell-dependent and T cell-independent IgA synthesis. Annu.Rev.Immunol. 28, 243-273.

46. Falvo,J.V., Tsytsykova,A.V., & Goldfeld,A.E. (2010) Transcriptional control of the TNF gene. Curr.Dir.Autoimmun. 11,27-60.

47. Falvo,J.V., Uglialoro,A.M., Brinkman,B.M„ et ah (2000) Stimulus-specific assembly of enhancer complexes on the tumor necrosis factor alpha gene promoter. Mol Cell Biol 20, 2239-2247.

48. Faust,N., Varas,F., Kelly,L.M., Heck,S., & Graf,T. (2000) Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726.

49. Flynn,J.L., Goldstein,M.M., Chan,J„ et al. (1995) Tumor necrosis factor-alpha is required in the protective immune response against Mycobacterium tuberculosis in mice. Immunity. 2, 561-572.

50. Fontenot,J.D., Rasmussen,J.P., Williams,L.M., Dooley,J.L., Farr,A.G., & Rudensky,A.Y. (2005) Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor foxp3. Immunity. 22, 329-341.

51. Foster,B., Prussin,C., Liu,F , Whitmire,J.K., & Whitton,J.L. (2007) Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr.Protoc. Immunol. Chapter 6, Unit 6.24.

52. Fransen,L., Muller,R., Marmenout,A.; et al. (1985) Molecular cloning of mouse tumour necrosis factor cDNA and its eukaryotic expression. Nucleic Acids Res. 13, 44174429.

53. Fritz,J.H., Rojas,O.L., Simard,N., et al. (2011) Acquisition of a multifunctional IgA+ plasma cell phenotype in the gut. Nature. 481, 199-203.

54. Gaestel,M. (2006) MAPKAP kinases - MKs - two's company, three's a crowd. Nat.Rev.Mol Cell Biol. 7, 120-130.

55. Galanos,C., Freudenberg,M.A., & Reutter,W. (1979) Galactosamine-induced sensitization to the lethal effects of endotoxin. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 76, 5939-5943.

56. Germain,R.N., Miller,M.J., Dustin,M.L., & Nussenzweig,M.C. (2006) Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat.Rev.Immunol. 6, 497-507.

57. Giepmans,B.N., Adams,S.R., Ellisman,M.H., & Tsien,R.Y. (2006) The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224.

58. Giroir,B.P., Brown,T., & Beutler,B. (1992) Constitutive synthesis of tumor necrosis factor in the thymus. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 89, 4864-4868.

59. Glosli,H., Veiby,O.P., Fjerdingstad,H., et al. (1999) Effects of hTNFalpha expression in T cells on haematopoiesis in transgenic mice. Eur.J.Haematol. 63, 50-60.

60. Godfrey,D.I., Kennedy,J., Suda,T., & Zlotnik,A. (1993) A developmental pathway involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression. J.Immunol. 150, 4244-4252.

61. Gordon, J.R. & Galli,S. J. (1990) Mast cells as a source of both preformed and immunologically inducible TNF-alpha/cachectin. Nature. 346, 274-276.

62. Graves,E.E., Ripoll,J., Weissleder,R., & Ntziachristos,V. (2003) A submillimeter resolution fluorescence molecular imaging system for small animal imaging. MedPhys. 30, 901-911.

63. Gray,P.W., Aggarwal,B.B., Benton,C.V., et al. (1984) Cloning and expression of cDNA for human lymphotoxin, a lymphokine with tumour necrosis activity. Nature. 312, 721-724.

64. Green,E.A., Wong,F.S., Eshima,K., Mora,C., & Flavell,R.A. (2000) Neonatal tumor necrosis factor alpha promotes diabetes in nonobese diabetic mice by CD154-independent antigen presentation to CD8(+) T cells. J.Exp.Med. 191, 225-238.

65. Grivennikov,S.I., Kuprash,D.V., Liu,Z.G., & Nedospasov,S.A. (2006) Intracellular signals and events activated by cytokines of the tumor necrosis factor superfamily: From simple paradigms to complex mechanisms. Int.Rev.Cytol. 252, 129-161.

66. Grivennikov,S.I., Tumanov,A.V., Liepinsh,D.J., et al. (2005) Distinct and nonredundant in vivo functions of TNF produced by t cells and macrophages/neutrophils: protective and deleterious effects. Immunity. 22, 93-104,

67. Gu,H., Marth,J.D., Orban,P.C., Mossmann,H., & Rajewsky,K. (1994) Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science. 265, 103-106.

68. Guicciardi,M.E. & Gores,G.J. (2009) Life and death by death receptors. FASEB J. 23, 1625-1637.

69. Gururajan,M., Jacob,J., & Pulendran,B. (2007) Toll-like receptor expression and responsiveness of distinct murine splenic and mucosal B-cell subsets. PLoS One. 2, e863.

70. Hargreaves,D.C., Horng,T., & Medzhitov,R. (2009) Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138, 129-145.

71. Hashiguchi,M., Hachimura,S., Ametani,A., et al. (2011) Naive CD4+ T cells of Peyer's patches produce more IL-6 than those of spleen in response to antigenic stimulation. Immunol.Lett. 141,109-115.

72. Hendriks,R.W., Nawijn,M.C., Engel,J.D., van,D.H., Grosveld,F., & Karis,A. (1999) Expression of the transcription factor GATA-3 is required for the development of the earliest

T cell progenitors and correlates with stages of cellular proliferation in the thymus. Eur. J.Immunol. 29, 1912-1918.

73. Hobeika,E., Thiemann,S., Storch,Bv et al. (2006) Testing gene function early in the B cell lineage in mbl-cre mice. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 103, 13789-13794.

74. Horiuchi,T., Mitoma,H., Harashima,S., Tsukamoto,H., & Shimoda,T. (2010) Transmembrane TNF-alpha: structure, function and interaction with anti-TNF agents. Rheumatology (Oxford). 49, 1215-1228.

75. Hu-Li,J., Pannetier,G., Guo,L„ et al. (2001) Regulation of expression of IL-4 alleles: analysis using a chimeric GFP/IL-4 gene. Immunity. 14, 1-11.

76. Jump,R.L. & Levine.A.D. (2002) Murine Peyer's patches favor development of an IL-10-secreting, regulatory T cell population. J.Immunol. 168, 6113-6119.

IT. Kamanaka,M., Kim,S.T., Wan,Y.Y„ et al. (2006) Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25,941-952.

78. Keffer,J., Probert,L., Cazlaris,Hv et al. (1991) Transgenic mice expressing human tumour necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. EMBO J. 10, 4025-4031.

79. Kontoyiannis,D., Boulougouris,G., Manoloukos,M., et al. (2002) Genetic dissection of the cellular pathways and signaling mechanisms in modeled tumor necrosis factor-induced Crohn's-like inflammatory bowel disease. J.Exp.Med. 196, 1563-1574.

80. Kontoyiannis,D., Pasparakis,M., Pizarro,T.T., Cominelli,F., & Kollias,G. (1999) Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies. Immunity. 10, 387-398.

81. Korner,H., Cook,M., Riminton,D.S., et al. (1997a) Distinct roles for lymphotoxin-alpha and tumor necrosis factor in organogenesis and spatial organization of lymphoid tissue. Eur. J.Immunol. 27, 2600-2609.

82. Korner,H., Riminton,D.S., Strickland,D.H., Lemckert,F.A., Pollard,J.D., & Sedgwick, J.D. (1997b) Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. J.Exp.Med. 186, 1585-1590.

83. Kracht,M. & Saklatvala,J. (2002) Transcriptional and post-transcriptional control of gene expression in inflammation. Cytokine. 20, 91-106.

84. Kravchenko, V. V., Kaufmann,G.F., Mathison,J.C„ et al. (2008) Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321, 259-263.

85. Kriegler,M., Perez,C., DeFay,K., Albert,I., & Lu,S.D. (1988) A novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein: ramifications for the complex physiology of TNF. Cell. 53, 45-53.

86. Kroenke,M.A., Carlson,T.J., Andjelkovic,A.V., & Segal,B.M. (2008) IL-12- and IL-23-modulated T cells induce distinct types of EAE based on histology, CNS chemokine profile, and response to cytokine inhibition. J.Exp.Med. 205, 1535-1541.

87. Kruglov,A.A., Kuchmiy,A., Grivennikov,S.I., Tumanov,A.V., Kuprash,D.V., & Nedospasov,S.A. (2008) Physiological functions of tumor necrosis factor and the consequences of its pathologic overexpression or blockade: mouse models. Cytokine Growth Factor Rev. 19,231-244.

88. Kruglov,A.A., Lampropoulou,V., Fillatreau,S., & Nedospasov,S.A. (2011) Pathogenic and protective functions of TNF in neuroinflammation are defined by its expression in T lymphocytes and myeloid cells. J.Immunol. 187, 5660-5670.

89. Kumar,S., Skeen,MJ., Adiri,Y„ et al. (2005) A cytokine promoter/yellow fluorescent protein reporter transgene serves as an early activation marker of lymphocyte subsets. Cell Immunol 237, 131-140.

90. Kunder,C.A., St John,A.L., Li,G., et al. (2009) Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J.Exp.Med. 206, 2455-2467.

91. Kuprash,D.V., Tumanov,A.V., Liepinsh,D.J„ et al. (2005) - Novel tumor necrosis factor-knockout mice that lack Peyer's patches. Eur. J. Immunol, 35, 1592-1600

92. KuprashJD.V., Udalova,I.A., Turetskaya,R.L., Kwiatkowski,D., Rice,N.R., & Nedospasov,S.A. (1999) Similarities and differences between human and murine TNF promoters in their response to lipopolysaccharide. J.Immunol. 162, 4045-4052.

93. Kuprash,D.V., Udalova,I.A., Turetskaya,R.L., Rice,N.R., & Nedospasov,S.A. (1995) Conserved kappa B element located downstream of the tumor necrosis factor alpha gene: distinct NF-kappa B binding pattern and enhancer activity in LPS activated murine macrophages. Oncogene. 11, 97-106.

94. Lanzavecchia,A. & Sallusto,F. (2000) Dynamics of T lymphocyte responses: intermediates, effectors, and memory cells. Science. 290, 92-97.

95. Larochelle,A. & Dunbar,C,E. (2004) Genetic manipulation of hematopoietic stem cells. Semin.Hematol. 41, 257-271.

96. Lee,P.P., Fitzpatrick,D.R., Beard,C., et al. (2001) A critical role for Dnmtl and DNA methylation in T cell development, function, and survival. Immunity. 15, 763-774.

97. Lee,Y.K., Turner,H., Maynard,C.L., et al. (2009) Late developmental plasticity in the T helper 17 lineage. Immunity. 30, 92-107.

98. Leist,M., Gantner,F., Künstle,G., et al. (1996) The 55-kD tumor necrosis factor receptor and CD95 independently signal murine hepatocyte apoptosis and subsequent liver failurq. Mol Med. 2, 109-124.

99. Li,M.O., Wan,Y.Y., & Flavell,R.A. (2007) T cell-produced transforming growth factor-betal controls T cell tolerance and regulates Thl- and Thl7-cell differentiation. Immunity. 26, 579-591.

100. Liepinsh,D.J., Kruglov,A.A., Galimov,A.R., et al. (2009) Accelerated thymic atrophy as a result of elevated homeostatic expression of the genes encoded by the TNF/lymphotoxin cytokine locus. Eur. J.Immunol. 39, 2906-2915.

101. Liu,J., Marino,M.W., Wong,G„ et al. (1998) TNF is a potent anti-inflammatory cytokine in autoimmune-mediated demyelination. Nat.Med. 4, 78-83.

102. Loder,F., Mutschier,B., Ray,R.J., et al. (1999) B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals. J.Exp.Med. 190, 75-89.

103. Luker,G.D. & Luker,K.E. (2008) Optical imaging: current applications and future directions. J.Nucl.Med. 49,1 -4.

104. Lukyanov,K.A., Chudakov,D.M., Lukyanov,S., & Verkhusha,V.V. (2005) Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat.Rev.Mol Cell Biol. 6, 885-891.

105. Lund,F.E. (2008) Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Curr.Opin.Immunol. 20, 332-338.

106. Lund,F.E. & Randall,T.D. (2010) Effector and regulatory B cells: modulators of CD4(+) T cell immunity. Nat.Rev.Immunol. 10, 236-247.

107. Lundqvist,C., Baranov,V„ Teglund,S., Hammarstrom,S., & Hammarstrom,M.L. (1994) Cytokine profile and ultrastructure of intraepithelial gamma delta T cells in chronically inflamed human gingiva suggest a Cytotoxic effector function. J. Immunol 153, 2302-2312.

108. Lundqvist,C., Melgar,S., Yeung,M.M., Hammarstrom,S., & Hammarstrom,M.L. (1996) Intraepithelial lymphocytes in human gut have lytic potential and a cytokine profile that suggest T helper 1 and cytotoxic functions. J.Immunol. 157, 1926-1934.

109. Maeda,S., Chang,L., Li,Z.W., Luo,J.L., Leffert,H., & Karin,M. (2003) IKKbeta is required for prevention of apoptosis mediated by cell-bound but not by circulating TNFalpha. Immunity. 19, 725-737.

110. Marino,M.W., Dunn,A., Grail,D., et al. (1997) Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 94, 8093-8098.

111. Marmenout,A., Fransen,L., TavernierJ., et al. (1985) Molecular cloning and expression of human tumor necrosis factor and comparison with mouse tumor necrosis factor. Eur. J. Biochem. 152, 515-522.

112. Massoud,T.F. & Gambhir,S.S. (2003) Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580.

113. Maynard,C.L., Harrington,L.E., Janowski,K.M„ et al. (2007) Regulatory T cells expressing interleukin 10 develop from Foxp3+ and Foxp3- precursor cells in the absence of interleukin 10. Nat. Immunol. 8, 931-941.

114. McInnes,I.B., Leung,B.P., & Liew,F.Y. (2000) Cell-cell interactions in synovitis. Interactions between T lymphocytes and synovial cells. Arthritis Res. 2, 374-378.

115. McInnes,I.B. & Schett,G. (2007) Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Nat.Rev.Immunol. 7, 429-442.

116. Medvedev,A.E., Espevik,T., Ranges,G., & Sundan,A. (1996) Distinct roles of the two tumor necrosis factor (TNF) receptors in modulating TNF and lymphotoxin alpha effects. J.Biol.Chem. 271, 9778-9784.

117. Medzhitov,R. & Horng,T. (2009) Transcriptional control of the inflammatory response. Nat.Rev.Immunol. 9, 692-703.

118. Möhrs,K., Wakil, A.E., Killeen,N., Locksley,R.M., & Möhrs,M. (2005) A two-step process for cytokine production revealed by IL-4 dual-reporter mice. Immunity. 23, 419-429.

119. Möhrs,M., Shinkai,K., Möhrs,K., & Locksley,R.M. (2001) Analysis of type 2 immunity in vivo with a bicistronic IL-4 reporter. Immunity. 15, 303-311.

120. Monici,M. (2005) Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnol.Annu.Rev. 11, 227-256.

121. Monteleone,G., Holloway,J., Salvati,V.M., et al. (2003) Activated STAT4 and a functional role for IL-12 in human Peyer's patches. J.Immunol. 170, 300-307.

122. Mora,J.R., Bono,M.R., Manjunath,N„ et al. (2003) Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells. Nature. 424, 88-93.

123. Mosser,D.D., Caron,A.W., Bourget,L., Jolicoeur,P., & Massie,B. (1997) Use of a dicistronic expression cassette encoding the green fluorescent protein for the screening and selection of cells expressing inducible gene products. Biotechniques. 22, 150-161.

124. Mowat,A.M., Millington,O.R., & Chirdo,F.G. (2004) Anatomical and cellular basis of immunity and tolerance in the intestine. J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr. 39 Suppl 3, 723-724.

125. Mowat,A.M. & Viney,J.L. (1997) The anatomical basis of intestinal immunity. Immunol.Rev. 156,145-166.

126. Muhlen,K.A., Schumann,J., Wittke,F., et al. (2004) NK cells, but not NKT cells, are involved in Pseudomonas aeruginosa exotoxin A-induced hepatotoxicity in mice. J.Immunol. 172,3034-3041.

127. Muller,U., Jongeneel,C.V., Nedospasov,S.A., Lindahl,K.F., & Steinmetz,M. (1987) Tumour necrosis factor and lymphotoxin genes map close to H-2D in the mouse major histocompatibility complex. Nature. 325, 265-267.

128. Neill,D.R., Wong,S.H., Bellosi,A., et al. (2010) Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370.

129. Neumann,B., Luz,A., Pfeffer,K., & Holzmann,B. (1996) Defective Peyer's patch organogenesis in mice lacking the 55-kD receptor for tumor necrosis factor. J.Exp.Med. 184, 259-264.

130. Neurath,M.F., Fuss,I., Pasparakis,M., et al. (1997) Predominant pathogenic role of tumor necrosis factor in experimental colitis in mice. Eur. J.Immunol. 27, 1743-1750.

131. Niesner,R.A. & Hauser,A.E. (2011) Recent advances in dynamic intravital multiphoton microscopy. Cytometry A. 79,789-798.

132. Notley,C.A., Inglis,J.J., Alzabin,S., McCann,F.E., McNamee,K.E., & Williams,R.O. (2008) Blockade of tumor necrosis factor in collagen-induced arthritis reveals a novel immunoregulatory pathway for Thl and Thl7 cells. J.Exp.Med. 205, 2491-2497.

133. Ntziachristos,V. & Razansky,D. (2010) Molecular imaging by means of multispectral optoacoustic tomography (MSOT). Chem.Rev. 110, 2783-2794.

134. Pasparakis,M., Alexopoulou,!., Episkopou,V., & Kollias,G. (1996) Immune and inflammatory responses in TNF alpha-deficient mice: a critical requirement for TNF alpha in the formation of primary B cell follicles, follicular dendritic cell networks and germinal centers, and in the maturation of the humoral immune response. J.Exp.Med. 184,1397-1411.

135. Pennica,D., Nedwin,G.E., Hay flick, J. S., et al. (1984) Human tumour necrosis factor: precursor structure, expression and homology to lymphotoxin. Nature. 312, 724-729.

136. Pfeffer,K., Matsuyama,T., Kundig,T.M„ et al. (1993) Mice deficient for the 55 kd tumor necrosis factor receptor are resistant to endotoxic shock, yet succumb to L. monocytogenes infection. Cell. 73, 457-467.

137. Piecyk,M., Wax,S., Bcck,A.R,. el al. (2000) TIA-1 is a translational silencer that selectively regulates the expression of TNF-alpha. EMBO J. 19,4154-4163.

138. Pistoia,V. & Corcione,A. (1995) Relationships between B cell cytokine production in secondary lymphoid follicles and apoptosis of germinal center B lymphocytes. Stem Cells. 13, 487-500.

139. Polglase,A.L., McLaren, W.J., Skinner,S.A., Kiesslich,R., Neurath,M.F., & Delaney,P.M. (2005) A fluorescence confocal endomicroscope for in vivo microscopy of the upper- and the lower-GI tract. Gastrointest.Endosc. 62, 686-695.

140. Probert,L., Akassoglou,K., Pasparakis,M., Kontogeorgos,G., & Kollias,G. (1995) Spontaneous inflammatory demyelinating disease in transgenic mice showing central nervous system-specific expression of tumor necrosis factor alpha. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 92, 11294-11298.

141. Probert,L., Keffer,J., Corbella,P., et al. (1993) Wasting, ischemia, and lymphoid abnormalities in mice expressing T cell-targeted human tumor necrosis factor transgenes. J.Immunol. 151, 1894-1906.

142. Ramirez-Carrozzi,V.R., Nazarian,A.A., Li,C.C., et al. (2006) Selective and antagonistic functions of SWI/SNF and Mi-2beta nucleosome remodeling complexes during an inflammatory response. Genes Dev. 20, 282-296.

143. Rao,P., Hayden,M.S., Long,M., et al. (2010) IkappaBbeta acts to inhibit and activate gene expression during the inflammatory response. Nature. 466, 1115-1119.

144. Reinhardt,R.L., Hong,S„ Kang,S.J., Wang,Z.E„ & Locksley,R.M. (2006) Visualization of IL-12/23p40 in vivo reveals immunostimulatory dendritic cell migrants that promote Thl differentiation. J. Immunol. 177, 1618-1627.

145. Rennert,P.D., Browning,J.L., Mebius,R., Mackay,F., & Hochman,P.S. (1996) Surface lymphotoxin alpha/beta complex is required for the development of peripheral lymphoid organs. J.Exp.Med. 184, 1999-2006.

146. Repass,J.F., Laurent,M.N., Carter,C., et al. (2009) IL7-hCD25 and IL7-Cre BAC transgenic mouse lines: new tools for analysis of IL-7 expressing cells. Genesis. 47, 281-287.

147. Rickert,R.C., Roes,J., & Rajewsky,K. (1997) B lymphocyte-specific, Cre-mediated mutagenesis in mice. Nucleic Acids Res. 25, 1317-1318.

148. Rothe,J., Lesslauer,W., Lotscher,H„ et al. (1993) Mice lacking the tumour necrosis factor receptor 1 are resistant to TNF-mediated toxicity but highly susceptible to infection by Listeria monocytogenes. Nature. 364, 798-802.

149. Rusanov,A.L., Ivashina,T.V., Vinokurov,L.M„ et al. (2010) Lifetime imaging of FRET between red fluorescent proteins. J.Biophotonics. 3, 774-783.

150. Rutishauser,R.L., Martins,G.A., Kalachikov,S„ et al. (2009) Transcriptional repressor Blimp-1 promotes CD8(+) T cell terminal differentiation and represses the acquisition of central memory T cell properties. Immunity. 31, 296-308.

151. Ruuls,S.R., Hoek,R.M , Ngo,V.N., et al. (2001) Membrane-bound TNF supports secondary lymphoid organ structure but is subservient to secreted TNF in driving autoimmune inflammation. Immunity. 15, 533-543.

152. Saparov,A., Wagner,F.H., Zheng,R„ et al. (1999) Interleukin-2 expression by a subpopulation of primary T cells is linked to enhanced memory/effector function. Immunity. 11,271-280.

153. Sato, A. & Iwasaki,A. (2005) Peyer's patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cell Mol Life Sci. 62, 1333-1338.

154. Saxne,T., Palladino,M.A., Jr., Heinegard,D., Talal,N., & Wollheim,F.A. (1988) Detection of tumor necrosis factor alpha but not tumor necrosis factor beta in rheumatoid arthritis synovial fluid and serum. Arthritis Rheum. 31, 1041-1045.

155. Scheu,S., Dresing,P., & Lbcksley,R.M. (2008) Visualization of IFNbeta production by plasmacytoid versus conventional dendritic cells under specific stimulation conditions in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 105,20416-20421.

156. Schumann,J., Wolf,D., Pahl,A., et al. (2000) Importance of Kupffer cells for T-cell-dependent liver injury in mice. Am.J.Pathol. 157, 1671-1683.

157. Sean,R.D., Korner,H., Strickland,D.H., Lemckert,F.A., Pollard,J.D., & Sedgwick,J.D. (1998) Challenging cytokine redundancy: inflammatory cell movement and clinical course of experimental autoimmune encephalomyelitis are normal in lymphotoxin-deficient, but not tumor necrosis factor-deficient, mice. J.Exp.Med. 187, 1517-1528.

158. Seder,R.A., Darrah,P.A., & Roederer,M. (2008) T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat.Rev.Immunol. 8, 247-258.

159. Sedgwick,J.D., Riminton,D.S., Cyster,J.G., & Korner,H. (2000) Tumor necrosis factor: a master-regulator of leukocyte movement. Immunol. Today. 21,110-113.

160. Serbina,N.V., Salazar-Mather,T.P., Biron,C.A., Kuziel,W.A., & Pamer,E.G. (2003) TNF/iNOS-producing dendritic cells mediate innate immune defense against bacterial infection. Immunity. 19, 59-70.

161. Shakhov,A.N., Collart,M.A., Vassalli,P., Nedospasov,S.A., & Jongeneel,C.V. (1990) Kappa B-type enhancers are involved in lipopolysaccharide-mediated transcriptional activation of the tumor necrosis factor alpha gene in primary macrophages. J.Exp.Med. 171, 35-47.

162. Shalapour,S., Deiser,K., Sercan,0„ et al. (2010) Commensal microflora and interferon-gamma promote steady-state interleukin-7 production in vivo. Eur. J.Immunol. 40, 2391-2400.

163. Shcherbo,D., Merzlyak,E.M., ChepurnykhJ.V., et al. (2007) Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat.Methods. 4, 741-746.

164. Shebzukhov,Iu.V., Horn,K., Brazhnik,I.K., Kuchmiy,A.A., Kuprash,D.V., & Nedospasov,S.A. (2012) Dynamic changes in chromatin conformation at the TNF promoter in T helper lymphocyte subsets. Manuscript in preparation.

165. Siggers,T., Chang,A.B., Teixeira,A., et al. (2011) Principles of dimer-specific gene regulation revealed by a comprehensive characterization of NF-kappaB family DNA binding. Nature immunology 13, 95-102.

166. Singh,A., Wuthrich,M., Klein,B., & Suresh,M. (2007) Indirect regulation of CD4 T-cell responses by tumor necrosis factor receptors in an acute viral infection. J. Virol. 81, 65026512.

167. Skinner,S.J., Deleault,K.M., Fecteau,R., & Brooks,S.A. (2008) Extracellular signalregulated kinase regulation of tumor necrosis factor-alpha mRNA nucleocytoplasmic transport requires TAP-NxTl binding and the AU-rich element. J.Biol.Chem. 283, 31913199.

168. Smallie,T., Ricchetti,G., Horwood,N J., Feldmann,M., Clark,A.R., & Williams,L.M. (2010) IL-10 inhibits transcription elongation of the human TNF gene in primary macrophages. J.Exp.Med. 207, 2081-2088.

169. Spies,T., Morton,C.C., Nedospasov,S.A., Fiers,W., Pious,D., & Strominger,J.L. (1986) Genes for the tumor necrosis factors alpha and beta are linked to the human major histocompatibility complex. Proc.Natl.AcadSci.U.S.A. 83, 8699-8702.

170. Stamou,P. & Kontoyiannis,D.L. (2010) Posttranscriptional regulation of TNF mRNA: a paradigm of signal-dependent mRNA utilization and its relevance to pathology. Curr.Dir.Autoimmun. 11,61-79.

171. Steffen,M., Ottmann,O.G., & Moore,M.A. (1988) Simultaneous production of tumor necrosis factor-alpha and lymphotoxin by normal T cells after induction with IL-2 and anti-Tl>. J.Immunol. 140, 2621-2624.

172. Stetson,D.B., Mohrs,M., Reinhardt,R.L., el al. (2003) Constitutive cytokine mRNAs mark natural killer (NK) and NK T cells poised for rapid effector function. J.Exp.Med. 198, 1069-1076.

173. Su,T.T., Guo,B., Wei,B., Braun,J., & Rawlings,D J. (2004) Signaling in transitional type 2 B cells is critical for peripheral B-cell development. Immunol.Rev. 197, 161-178.

174. Sullivan,K.E., Reddy,A.B., Dietzmann,K., et al (2007) Epigenetic regulation of tumor necrosis factor alpha. Mol Cell Biol. 27, 5147-5160.

175. Sung,S.S., Jung,L.K., Walters,J.A., Chen,W., Wang,C.Y., & Fu,S.M. (1988) Production of tumor necrosis factor/cachectin by human B cell lines and tonsillar B cells. J.Exp.Med. 168, 1539-1551.

176. Tak,P.P. & Bresnihan,B. (2000) The pathogenesis and prevention of joint damage in rheumatoid arthritis: advances from synovial biopsy and tissue analysis. Arthritis Rheum. 43, 2619-2633.

177. Tak,P.P., Smeets,T.J., Daha,M.R., el al. (1997) Analysis of the synovial cell infiltrate in early rheumatoid synovial tissue in relation to local disease activity. Arthritis Rheum. 40, 217-225.

178. Tang,W., Lu,Y., Tian,Q. Y., et al. (2011) The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice. Science. 332, 478-484.

179. Tartaglia,L.A. & GoeddeLD.V. (1992) Tumor necrosis factor receptor signaling. A dominant negative mutation suppresses the activation of the 55-kDa tumor necrosis factor receptor. J.Biol.Chem. 267, 4304-4307.

180. Tezuka,H., Abe,Y., Iwata,M., et al. (2007) Regulation of IgA production by naturally occurring TNF/iNOS-producing dendritic cells. Nature. 448, 929-933.

181. Togbe,D., Grivennikov,S.I., Noulin,N„ et al. (2007) T cell-derived TNF down-regulates acute airway response to endotoxin. Eur. J.Immunol. 37, 768-779.

182. Tracey,D., Klareskog,L., Sasso,E.H., Salfeld,J.G., & Tak,P.P. (2008) Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action: a comprehensive review. Pharmacol.Ther. 117, 244279.

183. Tracey,K.J., Fong,Y., Hesse,D.G., et al. (1987) Anti-cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteraemia. Nature. 330, 662-664.

184. Tsai,E.Y., Jain,J., Pesavento,P.A., Rao,A., & Goldfeld,A.E. (1996a) Tumor necrosis factor alpha gene regulation in activated T cells involves ATF-2/Jun and NFATp. Mol Cell Biol. 16, 459-467.

185. Tsai,E.Y., Yie,J., Thanos,D., & Goldfeld,A.E. (1996b) Cell-type-specific regulation of the human tumor necrosis factor alpha gene in B cells and T cells by NFATp and ATF-2/JUN. Mol Cell Biol. 16, 5232-5244.

186. Tsuji,M., Suzuki,K., Kitamura,H., et al. (2008) Requirement for lymphoid tissue-inducer cells in isolated follicle formation and T cell-independent immunoglobulin A generation in the gut. Immunity. 29, 261-271.

187. Tsytsykova, A. V. & Goldfeld,A.E. (2000) Nuclear factor of activated T cells transcription factor NFATp controls superantigen-induced lethal shock. J.Exp.Med. 192, 581586.

188. Tumanov,A.V., Grivennikov,S.I., Kruglov,A.A., et al. (2010) Cellular source and molecular form of TNF specify its distinct functions in organization of secondary lymphoid organs. Blood. 116, 3456-3464

189. Tumanov,A.V., Kuprash,D. V., Mach,J.A., Nedospasov,S.A., & Chervonsky,A. V. (2004) Lymphotoxin and TNF produced by B cells are dispensable for maintenance of the follicle-associated epithelium but are required for development of lymphoid follicles in the Peyer's patches. J.Immunol. 173, 86-91.

190. Udalova,!A., Richardson,A., Ackerman,H., Wordsworth,P., & Kwiatkowski,D.

(2011) Association of accelerated erosive rheumatoid arthritis with a polymorphism that alters NF-kappaB binding to the TNF promoter region. Rheumatology (Oxford) 41, 830-831.

191. Vandenabeele,P., Declercq,W., Beyaert,R., & Fiers,W. (1995) Two tumour necrosis factor receptors: structure and function. Trends Cell Biol. 5, 392-399.

192. Vassalli,P. (1992) The pathophysiology of tumor necrosis factors. Annu. Rev. Immunol. 10,411-452.

193. Weigert,R., Sramkova,M., Parente,L., Amornphimoltham,P., & Masedunskas,A. (2010) Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem.Cell Biol. 133,481-491.

194. Yang,X.O., Nurieva,R., Martinez,G.J., et al. (2008) Molecular antagonism and plasticity of regulatory and inflammatory T cell programs. Immunity. 29, 44-56.

195. Zhou,X., Jeker,L.T., Fife,B.T„ et al. (2008) Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity. J.Exp.Med. 205, 1983-1991.

Благодарности.

Я хочу поблагодарить своего научного руководителя Сергея Артуровича Недоспасова за постановку научной задачи, за всестороннюю помощь и поддержку в организации экспериментов, анализе и обсуждении результатов, за внимательное отношение к научному процессу на протяжении всей моей работы. Также я хотела бы выразить признательность Юрию Шебзухову, Дмитрию Купрашу и Андрею Круглову за существенную помощь в экспериментальной работе, обсуждение экспериментов и полученных данных, помощь в оформлении данных.

Я также хотела бы отметить других важных участников этой работы и выразить им свою искреннюю благодарность:

Дмитрию Чудакову и Сергею Анатольевичу Лукьянову за предоставление генетических конструкций, кодирующих флуоресцентные белки

• Рональду Науману за помощь в получении тансгенных моделей

Итамару Горену и Ари Вайсману за эффективную коллаборацию и предоставление еОРР-ТМР репортерных мышей

Артуру Галимову за помощь в дизайне и клонировании генетической конструкции.

Людмиле Николаевне Друцкой за техническую и организационную помощь в выполнении работы.

Рафаелу Шаэновичу Казаряну за организационную помощь. Марине Сергеевне Друцкой за обсуждение экспериментальных данных.

• Евгению Шилову за помощь в оформлении диссертации.

• Григорию Ефимову, Павлу Белоусову, Ильгизу Муфазалову, Дмитрию Пеиькову, Катарине Хорн, Зое Хлопчатниковой за создание благоприятной и плодотворной рабочей обстановки. Также хочется сказать спасибо всем бывшим и нынешним сотрудникам лаборатории Сергея Артуровича Недоспасова Института молекулярной биологии РАН за помощь и всесторонние научные взаимодействия.