Выделение, иммобилизация и практическое использование липолитического комплекса Rhizopus oryzae 1403 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Янышева, Наталья Васильевна

• Янышева, Наталья Васильевна
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Янышева, Наталья Васильевна

ВВЕДЕНИЕ

• ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Синтез липолитических ферментов микроорганизмами.

1.2. Характеристика свойств микробных липаз

1.2.1. Выделение и очистка препаратов липаз.

1.2.2. Физико-химические свойства и особенности строения нативных липаз.

1.2.3. Специфичность действия микробных липаз.

1.3. Иммобилизация липолитических ферментов.

• 1.3.1. Физико-химические свойства иммобилизованных липаз.

1.4. Практическое использование липолититческих ферментов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение, иммобилизация и практическое использование липолитического комплекса Rhizopus oryzae 1403»

Актуальность темы. Липолитические ферменты всегда вызывали интерес ученых в связи со своими уникальными свойствами. Это действие на поверхности раздела фаз, разнообразие субстратной специфичности, способность катализировать как гидролиз триглицеридов, так и обратные реакции в микроводных условиях.

Ферментативный гидролиз жиров имеет несомненные преимущества по сравнению с химическим расщеплением. Помимо физиологического значения он используется человеком для получения глицерина и жирных кислот, удаления жировых примесей. С помощью позиционно-специфичных липаз можно осуществить избирательный гидролиз, который позволяет получать моно- и диглицериды, а также изменять функциональные свойства природных жиров, что важно для некоторых технологий. Исследования в области ферментативного катализа, реакций этерификации открыли новые возможности использования липаз.

Таким образом, липолитические ферменты представляют ценность для многих отраслей промышленности (олеохимической, текстильной, кожевенной, пищевой), для медицины и как биохимические реагенты.

Однако, внедрение липаз в производство сдерживалось в связи с их высокой стоимостью. Возможность иммобилизации ферментов в большей части решило эту проблему. Поэтому в последнее десятилетие исследования липаз развернулись в большем масштабе.

Несмотря на множество работ, посвященных липазам, трудно назвать такие, в которых они охарактеризованы достаточно полно с точек зрения свойств и структуры белка, строения активного центра, каталитического действия, специфичности, кинетических и термодинамических характеристик. Поэтому проблема глубокого изучения свойств нативных и иммобилизованных препаратов липолитических ферментов и разработка научно-обоснованных подходов к их применению является актуальной в теоретическом и практическом отношении.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований кафедры микробиологии и биохимии ВГТА, соответствующих плану госбюджетной НИР на 2001-2005 гг. (№ гос. регистрации 01930004491) по проблеме «Изыскание оптимальных условий биосинтеза микроорганизмами биологически активных веществ и изучение их физико-химических свойств». Данная проблема включена в координационный план РАН по программе «Микробиологический синтез и научные основы микробиологического получения практически ценных веществ».

Цели и задачи исследования. Цель работы - получение препаратов липазы Rhizopus oryzae 1403, иммобилизация фермента, исследование физико-химических свойств нативной и иммобилизованной липазы, изучение некоторых аспектов практического использования липазы в хлебопечении. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

S разработка технологии получения ферментных препаратов липазы с различной степенью очистки; S установление фракционного состава липолитического комплекса продуцента; S исследование некоторых свойств изоферментов липазы; S изучение каталитических свойств Липазы I: идентификация функциональных групп активного центра; определение кинетических характеристик гидролиза три-глицеридов; изучение специфичности действия.

S иммобилизация липазы химическим и физическим способами; •S исследование физико-химических и кинетических характеристик реакции гидролиза трибутирина иммобилизованными липазами; S проведение непрерывного гидролиза растительного масла в реакторе с иммобилизованными липазами; S изучение роли гидролизованного масла в технологии хлебопечения (влияние на жизнедеятельность дрожжей, клейковину пшеничного теста и пшеничный крахмал).

Научная новизна. Установлено, что липолитический комплекс гриба Rhizopus oryzae 1403 состоит из двух изоформ.

На основе анализа кинетических параметров гидролиза трибутирина Липазой I при различных значениях рН, а также в присутствии специфических ингибиторов, установлено, что в акте катализа принимает участие гистидин и она относится к сериновым ферментам. В поддержании активной конформации фермента определенную роль играют SH-группы.

Выявлено, что Липаза I обладает 1,3-позиционной специфичностью; селективно гидролизует связи, образованные жирными кислотами со средней длиной цепи и содержащими не более двух двойных связей.

Исследованы некоторые свойства и установлены кинетические параметры гидролиза трибутирина липазой, иммобилизованной различными способами.

Практическая значимость работы. Разработаны технологические стадии производства препаратов липазы различной степени чистоты, предложена схема получения изоферментов липазы. Осуществлена иммобилизация ацетоноса-жденного препарата липазы на гидрофобном сорбенте и анионите АВ-17-2П. Показана возможность непрерывного гидролиза растительного масла в установке с иммобилизованной липазой. Доказана целесообразность использования гидролизованного растительного масла в хлебопечении на основании того, что оно интенсифицирует процесс потребления углеводов дрожжевыми клетками, улучшает свойства клейковины и пшеничного крахмала.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на Международных научных конференциях: «Пищевые продукты XXI века» (Москва, 2001); «От фундаментальной науки к передовым технологиям» (Москва, Тверь 2001); «Биотехнология на рубеже третьего тысячелетия» (Саранск, 2001); 6-ой Международной научной конференции памяти В.М. Горбатова «Биотехнологические процессы переработки сельскохозяйственного сырья» (Москва, 2002); 2-ой Всероссийской научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2002); 7-ой Пущин-ской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003); Международном форуме «Аналитики и аналитика» (Воронеж, 2003); Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, 2004); ежегодных научных конференциях Воронежской государственной технологической академии 1999-2002 г.г. и др.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 5 статьях, 1 патенте и 6 тезисах докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, основных выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 203 страницах машинописного текста, содержит 52 рисунка и 14 таблиц. Список литературы включает 281 наименование, в том числе 165 на иностранных языках.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Янышева, Наталья Васильевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения препаратов липазы микромицета Rhizopus oryzae 1403 на основе ультрафильтрации, осаждения органическими растворителями, вакуум-сублимационной сушки. Активность препаратов составила 2424 и 2746-3647 ед/г соответственно.

2. Методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии установлено наличие двух изоформ фермента, обозначенных как Липаза I и Липаза II. Удельная активность Липазы I составила 880,2; Липазы II — 683,2 ед/мг белка. Изо-ферменты отличались pi: 1-3,0, Н-4,2; рН-оптимумом - 6,5 и 6,0 соответственно. Оптимальная температура действия для обеих изоформ - (35±1) °С. Молекулярная масса была одинаковой - (44±2) кДа.

3. Значения рК ионизации Липазы I - 5,2 и 6,9 позволяют предположить участие в её каталитическом действии остатков гистидина и карбоксильной группы.

4. Наличие гистидина в активном центре Липазы I доказано значениями рК и теплоты ионизации (29,1 кДж -моль'1), инактивацией фотоокислением и снижением Vl7m при ингибировании диэтилпирокарбонатом. Фермент относится к сериновым гидролазам, так как ингибируется фенилметилсульфонилфторидом.

5. Липаза I проявляет селективность к жирным кислотам со средней длиной цепи (С12-С18), содержащим не более 2 двойных связей и обладает специфичностью к 1 и 3 положению в триглицеридах.

6. Установлены оптимальные условия иммобилизации ацетоносажденной липазы с помощью адсорбции на стиросорбе и связывания с анионитом АВ-17-2П. Эффективность иммобилизации составила 67,5 и 23,0 % соответственно; время полужизни препаратов при непрерывной работе лабораторного реактора 18 и 96 ч соответственно.

7. Обоснован положительный эффект влияния масла, подвергнутого ферментативному гидролизу липазой Rhizopus oryzae 1403, в хлебопечении по увеличению интенсивности потребления глюкозы дрожжевыми клетками, улучшению свойств клейковины теста и суспензий пшеничного крахмала.

6.4. Заключение

Таким образом, данными исследованиями обоснован положительный эффект использования масла, подвергнутого ферментативному гидролизу иммобилизованной липазой Rhizopus oryzae 1403 в производстве хлебобулочных изделий. Улучшаются физические свойства теста, интенсифицируется брожение и замедляется черствение готовых изделий. Это подтверждено производственными испытаниями в заводских условиях.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Янышева, Наталья Васильевна, 2005 год

1. Алмаши А. Бысторое замораживание пищевых продуктов / Пер. с англ. А. Алмаши, Л. Эрдели, Т. Шарой. - М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1981. -408 с.

2. Аре Р. Ю. Очистка, физико-химические и каталитические свойства микробных липаз. Обзор. / Р. Ю. Аре, Б. Я. Лусиня, М. Г. Плата и др. // Известия АН Латвийской ССР. 1979. -№ 6. - С. 92-106

3. Ауэрман Л. Я. Технология хлебопекарного производства. 8-е изд. пере-раб. и допол. -М.: Легая и пищевая пром-сть, 1984. -416 с.

4. Байчив И. Изучение возможности применения липолитически активныхштаммов дрожжей для улучшения органолептических качеств ветчины / И. Байчев, М. Радева, Е. Митева и др. // Мясопромышленность. 1980. — Т. 13-№ 4. - С. 16-18

5. Башкатова Н. А. Липазы некоторых грамотрицательных бактерий // Ав-тореф. . к. б. н. М.: МГУ, 1980. - 23 с.

6. Беззубов Л. П. Химия жиров. Учебник для техникумов пищевой промети. 3-е изд.перераб. и доп. М.: Пищевая пром-сть, 1975. - 279 с.

7. Березин И. В. Введение в прикладную энзимологию. Иммобилизованныеферменты / И. В. Березин, К. Мартинек / Учебн. пособие для студ. хим. и биол. фак-в ун-в. М.: МГУ, 1982. - 383 с.

8. Березин И. В. Иммобилизованные ферменты. Биотехнология / И. В. Березин, Н. В. Клячко, А. В. Левашов и др. М.: Высшая школа, 1987. - 159 с.

9. Берри Д. Биология дрожжей / Пер. с англ. В. Г. Горбулева, под ред. Н. М. Мейселя.-М.: Мир, 1985.-95 с.

10. Брокерхоф К. Липолитические ферменты / К. Брокерхоф, Р. Дженсен, пер. с англ. Т. П. Левчук и др., под ред. Браунштейна А. Е. и др. —1. М.: Мир, 1978.-396 с.

11. Буник В. И. О функциональной роли гистидиновых остатков а-кетоглутаратдегидрогеназы / В. И. Буник, В. С. Гомазкова // Биохимия. 1987. - Т. 52. - С. 1235-1247

12. Варфоломеев С. Д. Биокинетика: Практический курс / С. Д. Варфоломеев, К. Г. Гуревич. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.

13. Васильченко С. А. Липолитическая активность гриба Blakeslea trispora / С. А. Васильченко, Л. В. Баталкина, С. В. Васильченко и др. // Вопр. химии и хим. технол. Харьков. - 1989. - № 91. - С. 49-52

14. Вершинина О. Л. Пищевые добавки липидной природы и перспективы их применения в хлебопекарной промышленности / О. Л. Вершинина, Н. Н. Корнен, С. А. Ильинова // Изв. вузов. Пищевая технол. — 2001. -№ 1. С. 25-28

15. Вода в пищевых продуктах. / Под ред. Р. Б. Дакуорта, пер. с англ. Р. Н. Евтеевой, Г. Е. Русанова, под ред. А. С. Гинзбурга, Г. Е. Русанова. М.: Пищевая пром-сть, 1980. - 376 с.

16. Волошина Т. Ю. Разработка способа получения растворимой и иммобилизованной липазы Rhizopus oryzae 14 и её характеристика: Дисс. .к. т. н. М.: МГАПП, 1995. - 194 с.

17. Вудворд Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. М.: Мир, 1988.-215 с.

18. Гааль Э. Электорофорез в разделении биологических макромолекул. / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи: Пер. с англ. Е. Б. Мейзеля и др., под ред. В. И. Розенгарта. М.: Мир, 1982. - 446 с.

19. Горячева А. Ф. Пути улучшения качества хлеба и сохранение его свежести / А. Ф. Горячева, Р. В. Кузьминскаий. М.: ЦНИИТЭИпищепром,1984.-28 с.

20. Горячева А. Ф. Жиры в хлебопечении / А. Ф. Горячева, В. С. Семенов, И. П. Изосимова. М.: ЦНИИТЭИпищепром, 1985. - 35 с.

21. Грачев Ю. П. Математические методы планирования экспериментов. — М.: Пищевая пром-сть, 1979. 199 с.

22. Грачева И. М. Технология ферментных препаратов / И. М. Грачева, А. Ю. Кривова / Учебник для студ. вузов. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Элевар, 2000.-512 с.

23. Григорьева Т. А. Изучение процесса ультрафильтрации растворов грибной липазы / Т. А. Григорьева, А. М. Рожанская и др. // Прикл. биохимия и микробиол.- 1977.-Т. 13.-Вып. 5.-С. 779-781

24. Давранов К. Д. Выделение и характеристика внеклеточных липаз микро-мицета Penicillium sp. / К. Д. Давранов, К. А. Тумялова, Б. Розмухамедова, М. Шамилева // Прикл. биохимия и микробиол. 1994. - Т. 30. - № 2. -С. 234-237

25. Давранов К. Д. Липаза гриба Rh. microsporus / К. Д. Давранов, М. 3. Заки-ров, М. И. Ризаева // Химия природ, соед. 1976. - № 5. - С. 636-639

26. Давранов К. Д. Липаза Oospora lactis / К. Д. Давранов, 3. Р. Ахмедова, М. И. Ризаева и др. // Прикл. биохимия и микробиол. 1984. - Т. 20. — №2.-С. 166-174

27. Давранов К. Д. Некоторые свойства внеклеточной липазы Rhizopus microsporus УзЛТ-3 / К. Д. Давранов, И. Т. Куйлибаев, Б. X. Розмухамедова, А. А. Махсумханов // Прикл. биохимия и микробиол. — 1995. — Т. 31. № 4. - С. 405-411

28. Давранов К. Д. Препаративное выделение, очистка, кристаллизация и некоторые свойства липазы из Oospora lactis / К. Д. Давранов, М. Я. Табак, А. С. Саггаров//Биохимия. 1989.-Т. 54.-№ 11.-С. 1866-1872

29. Давранов К. Д. Микробные липазы в биотехнологии. Обзор // Прикл. биохимия и микробиол. 1994. - Т. 30. - №. 4-5. - С. 527-534

30. Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970. - 320 с.

31. Диеров Ж. X. Липазы микромицетов: Дисс. . д. б. и. ПУЩИНО: И-т биохимии и физиологии микроорганизмов, 1994. - 400 с.

32. Диеров Ж. X. Очистка и свойства внутриклеточных липаз гриба Rhizopus microsporus / Ж. X. Диеров, А. Б. Циоменко, К. Д. Давранов, и. С. Кулаев // Биотехнология. 1993. - № 7. - С. 26-30

33. Диксон М. Ферменты. / М. Диксон, Э. Уэбб / Пер. с 3-го англ. изд. Л. Д. Гинодмана и М. И. Левянт, под ред. акад. А. И. Опарина. М.: Мир, 1982. - Т. 1.-389 с.

34. Дубцова Г. Н. Липид-белковые комплексы пшеницы, их формирование и роль в технологических процессах. Дисс. . к. т. н. Москва: МТИПП, 1999.-650 с.

35. Дужак А. Б. Выделение и свойства препаратов внеклеточных липаз природного (В-10) и мутантного (М-1) штаммов / А. Б. Дужак, 3. Н. Панфилов, Е. А. Васюнина // Прикл. биохимия и микробиол. 2000. -Т. 36.-№4.-С. 402-411

36. Жеребцов Н. А. Очистка и свойства липазы Rhizopus japonicus 1403 / Н. А. Жеребцов, С. А. Шеламова, Э. А. Шишкова и др. // Ферменты микроорганизмов. Сборник статей, ч. 1. М.: ВНИИСЭНТИ, 1989. 235 с.

37. Зубченко А. В. Пути эффективного использования сахаросодержащих и жировых продуктов в хлебопекарной промышленности / А. В. Зубченко, Т. В. Санина. М.: ЦНИИТЭИхлебопродуктов, 1990. - 36 с.

38. Иммобилизованные ферменты: современное состояние и перспективы. Т. 1,2./ Под ред. И. В. Березина, В. К. Антонова, К. Мартинека. М.: Издательство МГУ, 1976. — 296 с.

39. Казаков Е. Д. О теоретических основах образования клейковины // Изв. вузов. Пищевая технол. 1992. - № 1. - С. 5-7

40. Казаков Е. Д. Клейковина, ее формирование, состав. В 2-х ч. Ч. 1. / Элеваторная промышленность. Обзорная информация. — М.: ЦНИИТЭИ, 1992. -60 с.

41. Калунянц К. А. Микробные ферментные препараты: Технология и оборудование / К. А. Калунянц, JI. И. Голгер. М.: Пищевая пром-сть, 1979. -304 с.

42. Кейтс М. Техника липидологии: Выделение, анализ и идентификация ли-пидов / Пер с анг. В. А. Вавера. М.: Мир, 1975. - 324 с.

43. Келети Т. Основы ферментативной кинетики / Пер. с англ. JI. Ю. Бровко и др. Под ред. Б. И. Курганова. М.: Мир, 1990. - 350 с.

44. Кёстнер А. И. Иммобилизованные ферменты // Успехи химии. — 1974. -Т. XLIII. Вып. 8. - С. 1480-1511

45. Кислухина О. В. Применение ферментов в масло-жировой промышленности / О. В. Кислухина, В. Д. Надыпта, Н. М. Минасян // Изв. вузов. Пищевая технол. 1993. - № 1-2.-С. 14-19

46. Клесов А. А. Ферментативный катализ: Уч. пособие для хим. спец. унтов. В 2-х ч. Ч. 1 / А. А. Клесов, И. В. Березин. М.: Изд-во МГУ, 1980. -Т. 1.-264 с.

47. Ковалева С. В. Фотоокисление и модификация диэтилпирокарбонатом «биосинтетической» L-треининдегидротазы из пивных дрожжей Sassharomyces carlsbergensis / С. В. Ковалева, А. И. Дорожко, 3. С. Каган // Биоихимия. 1984. - Т. 49. - № 8. - С. 1253-1262

48. Коваленко Г. А. Иммобилизация ферментов на углеродминеральных носителях. Некоторые закономерности адсорбционной иммобилизации ферментов. / Г. А. Коваленко, М. П. Ванина // Биотехнология. 1997. -№ 4. - С. 3-12

49. Ковальская JI. П. Технология пищевых продуктов / JI. П. Ковальская, И. С. Шуб, Г. М. Мелькина. М.: Колос, 1999. - 752 с.

50. Козьмина Н. П. Биохимия хлебопечения. 2-е изд., перераб. и доп. -М.: Пищевая пр-сть, 1978. 277 с.

51. Кочетов Г. А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высш. школа, 1980.-272 с.

52. Кретович В. JI. Введение в энзимологию. 3-е изд. доп., перераб., испр. — М.: Наука, 1986.-336 с.

53. Кузнецова JI. С. Лабораторный практикум по технологии кондитерского производства. М.: Пищевая пром-сть, 1980. - 184 с.

54. Лосева Л. П. Роль остатков гистидина в конститутивной НАД(Р)-глутаматдегидрогеназе Chorella pirenoidosa II Л. П. Лосева, М. В. Бен-диашвили, В. Р. Шптилов и др. // Биоихимия. 1986. - Т. 51. - С. 840-849

55. Луговой В. И. Криоповреждения ферментов и ферментных систем. Актуальные проблемы криобиологии / Под. ред. Н. С. Пушкаря, А. М. Белоуса.- Киев.: Наукова думка, 1981. 607 с.

56. Лукьянов А. Б. Физическая и коллоидная химия. М.: Химия, 1980. - 224 с.

57. Лурье И. С. Технохимический контроль сырья в кондитерском производстве. Справочник. М.: Агропромиздат, 1987. - 271 с.

58. Маджидов К. X. Повышение качества и расширение ассортимента кондитерских изделий с использованием эффективных добавок / К. X. Маджидов, М. Г. Басиев, М. И. Мурдахиева // Изв. вузов. Пищевая технол. — 1984.-Вып. 1-2.-С. 22-26

59. Марданян С. С. Взаимодействие аденозиндезаминазы с ингибиторами, модификация диэтилпирокарбонатом / С. С. Марданян, С. Г. Шароян, А. А. Антонян и др. // Биохимия. 2002. - Т. 67. - № 7. - С. 930-938

60. Мартинек К. Иммобилизованные ферменты. М.: Наука, 1984. - 324 с.

61. Манойлов Ю. С. Исследование ИК-спектров гемопротеидов и их составных частей / Ю. С. Манойлов, Ю. П. Комов, С. Е. Манойлов // Биофизика.- 1965 Т. 10. - №5. - С. 782-788.

62. Мартьянов В. А. Получение высокоактивных препаратов нейтральной протеазы Bacillus subtilis / В. А. Мартьянов, А. Ф. Зябрев и др. // Ферменты микроорганизмов. Сборник статей, ч. 1. М.: ВНИИСЭТИИ, 1989. -225 с.

63. Матвеева И. В. Пищевые добавки и хлебопекарные улучшители в производстве мучных изделий. / И. В. Матвеева, И. Г. Белявская. М.: МГУПП, 1998.-104 с.

64. Микробные ферменты и биотехнология. /Под ред. Фогарти и др., пер. с англ. И. М. Грачева. М.: Агропромиздат, 1986. - 318 с.

65. Мусил Я. А. Современная биохимия в схемах / Я. А. Мусил, О. Н. Нова-кова, К. В. Кунц. М.: Мир, 1984. - 264 с.

66. Неклюдов А. Д. Биохимическая переработка жиров и масел в новые ли-пидные продкты с улучшенными биологическими и физико-химическими свойствами. (Обзор) / А. Д. Неклюдов, А. Н. Иванкин // Прикл. биохимия и микробиол. 2002. - Т. 38.-№ 5.-С. 469^81

67. Неклюдов А. Д. Свойства препарата иммобилизованной липазы Rhizopus oiyzae 14-14 / А. Д. Неклюдов, Б. Д. Шведов, В. В. Цибанов // Прикл. биохимия и микробиол. 1981. - Т. 17. - Вып. 4. - С. 510-515

68. Николаенко С. В. Повышение эффективности сублимационной сушки ферментных препаратов. Автореф. дисс. . к. т. н. — Воронеж: ВТИ, 2000. -24 с.

69. Орос Г. Ю. Механизм сорбции т-РНК неионогенным сорбентом / Г. Ю. Орос В. Ф. Селеменев, В. Ю. Хохлов и др. // Физическая химия. — 1988.- Т. 72.-№5.-С. 926-932

70. Петрова Jl. JI. Применение рН-статного метода для изучения ферментив-ного действия липазы Penicillium sp. / Jl. Jl. Петрова, Г. А. Казани на, А. А. Селезнева // Прикл. биохим. и микроб. -1977. -Т. 13. -№ 5. С. 758

71. Поландова Р. Д. Применение пищевых добавок в хлебопечении // Хлебопечение России. 1996. - № 1. - С. 25-3076