Выделение и характеристика гемолизина II Bacillus cereus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Ковалевская, Жанна Ивановна

• Ковалевская, Жанна Ивановна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ковалевская, Жанна Ивановна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гемолизины как группа бактериальных токсинов 9 1.1.1.Общие сведения о бактериальных токсинах

1.1.2. Место гемолизинов в классификации токсинов

1.1.3. Гемолизины как факторы патогенности и вирулентности

1.1.4. Эволюционная и адаптационная роль гемолизинов

1.2. Типы бактериальных гемолизинов

1.2.1. Фосфолипазы - цитолизины с ферментативной активностью

1.2.2. Порообразующие гемолизины

1.3. Механизмы действия бактериальных гемолизинов

1.4. Механизмы секреции бактериальных токсинов

1.5. В. cereus как объект для изучения гемолизинов

1.6. Спектр гемолизинов, продуцируемых Bacillus cereus

1.6.1. Сфингомиелиназа и цереолизин АВ

1.6.2. Цереолизин (гемолизин I)

1.6.3. Гемолизин BL

1.6.4. Гемолизин III

1.6.5. Гемолизин IV (токсин CytK)

1.6.6. Цереолизинподобный гемолизин

1.6.7. Гемолизин II

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 51 ПЛ. Материалы

II. 1.1. Штаммы бактерий, плазмидные векторы

II. 1.2. Среды и основные буферы

II. 1.3. Материалы и реактивы

II.2. Методы исследования

11.2.1. Выделение плазмидной ДНК

11.2.2. Препаративное выделение фрагмента ДНК

11.2.3. Проведение реакций рестрикции и лигирования ДНК

11.2.4. ПЦР-амплификация ДНК

11.2.5. Получение компетентных клеток

11.2.6. Трансформация

11.2.7. Анализ рекомбинантных клонов

П.2.8. Отбор рекомбинантных клонов по гемолитическому фенотипу

11.2.9. Плазмидные конструкции

11.2.10. Анализ первичной последовательности ДНК

11.2.11. Тестирование гемолитической активности

11.2.12. Получение бесклеточных экстрактов

11.2.13. Электрофорез в полиакриламидном геле

11.2.14. Определение количества белка

11.2.15. Приготовление сорбентов

11.2.16. Экспрессия и очистка до гомогенного состояния внеклеточного гемолизина II

11.2.17. Очистка внутриклеточного гемолизина II

11.2.18. Экспрессия и очистка рекомбипантпого белка HlyII-His

11.2.19. Перенос белков с геля на мембрану - вестерн трансблоттинг

11.2.20. Исследование Hlyll на бислойных липидпых мембранах

11.2.21. Электронная микроскопия олигомеров Hlyll связанных с липосомами

11.2.22. Определение диаметра пор с помощью осмопротектантов

11.2.23. Моделирование структуры поры гемолизина II

11.2.24. Влияние Hlyll па разные типы клеток

11.2.25. Влияние Hlyll на макроорганизмы

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 70 III. 1 .Экспрессия гемолизина II в клетках Е. coli

111.2. Очистка внеклеточного гемолизина II

111.3. Очистка внутриклеточного гемолизина II

111.4. Продукция зрелого Hlyll при помощи секреционного аппарата Е. coli

111.5. Клонирование генетической детерминанты гемолизина II

111.5.1. Получение рекомбинантных клонов и их фенотипический анализ

111.5.2. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков

111.6. Цитолитическое действие очищенного гемолизина II

111.7. Моделирование структуры поры гемолизина II

111.8. Размеры пор сформированных гемолизином II

111.9. Свойства каналов сформированных гемолизином II 105 ШЛО. Влияние температуры на формирование пор гемолизином II

III. 10.1. Первый шаг, взаимодействие Hlyll с мембранами, не зависит от температуры

III. 10.2. Структура Hlyll пор, сформированных при 4°С и 37°С, различается

II 1.11. Патогенное действие гемолизином II на макроорганизмы

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение и характеристика гемолизина II Bacillus cereus»

Актуальность работы. Одним из основных фундаментальных направлений современных микробиологии и медицины является изучение патогенности микроорганизмов. В настоящее время известно, что патогенные бактерии вырабатывают широкий спектр веществ, как непосредственно повреждающих или убивающих клетки макро- и микроорганизмов, так и способствующих проникновению бактерий в организм хозяина, вследствие преодоления его защитных систем. Эти вещества играют главную роль в развитии заболеваний, вызываемых бактериями (McDonel et al., 1986).

Среди многообразия таких веществ можно выделить цитолитические токсины, которые играют немаловажную роль в патогенезе. Характерными примерами, подтверждающими этот тезис, являются такие цитолизины, как фосфолипаза С Clostridium perfringens - основной фактор, ответственный за развитие газовой гангрены (Stevens et al., 1988), тиол-активируемый токсин Listeria monocytogenes, нарушение продукции которого приводит к потере вирулентности (Cossart et al., 1989), альфа-токсин Staphylococcus aureus, ответственный за целый ряд клинических эффектов при стафилококковых инфекциях и являющийся Р-складчатым каналообразующим цитолизином (Freer, 1988; Дерябин, 2000).

Интерес к исследованиям цитолитических токсинов не ограничивается лишь медицинской сферой. Изучение этих белков стимулируется и тем, что цитолизины стали ценными инструментами при исследовании клеточной физиологии и функционирования клеточных мембран (Ahnert-Hilger and Weller, 1998; Hucho, 1995), а также являются превосходными модельными объектами для выяснения связи между структурой и функцией белка (Bayley, 1994; Gouaux, 1998). Р-Складчатые каналобразующие цитолизины нашли своё применение и в биотехнологии, в создании клетко-подобных биореакторов, что позволяет значительно увеличить экспрессию белков (Noireaux, 2004), а также в конструкции нанопор (Howorka, 2001; Merzlyak, 2005), биосенсоров (Braha, 2000; Gu, 2001). Цитолизины являются хорошей моделью в изучении белок-мембранного взаимодействия (Menestrina et al., 2001). К Р-складчатым каналообразующим токсинам относят ряд цитолизинов Staphylococcus aureus (а-токсин, лейкоцидины, у-гемолизин), Р-токсин Clostridium perfringens (Gouaux, 1998) и CytK токсин В. cereus (Lund et al., 2000).

Изучение цитолитических токсинов и их генетических детерминант, включающее в себя клонирование, идентификацию, молекулярный анализ, гетерологичную экспрессию генов цитолизинов, выяснение путей регуляции их экспрессии, а также - изучение механизмов действия этих токсинов представляется одним из наиболее перспективных направлений в исследовании молекулярных основ патогенности и вирулентности микроорганизмов.

Особый интерес вызывает цереусная группа микроорганизмов рода Bacillus, в которую входят: В. anthracis, известный как опасный патоген, вызывающий сибирскую язву; В. thuringiensis - являющийся патогенным для насекомых; В. cereus, который относится к условно-патогенным для теплокровных. Эти микроорганизмы продуцируют ряд цитолитических белков, рассматриваемых в качестве потенциальных факторов вирулентности. В. cereus, занимая по патогенному статусу промежуточное положение среди представителей данной группы бактерий и продуцируя широкий спектр цитолизинов, может служить прекрасной моделью для изучения этих токсинов.

Одной из причин, которая побуждает к активному изучению токсинов, вырабатываемых В. cereus (и его ближайшим родственником В. thuringiensis), является огромная значимость этих микроорганизмов для человека. В настоящее время для производства инсектицидных препаратов широко используется В. thuringiensis, приводя к широкомасштабному внесению этого микроорганизма в окружающую среду. Другой важной проблемой является бактериологическое загрязнение производимых промышленностью продуктов питания, лекарственных и косметических препаратов. При этом В. cereus - один из основных бактериальных загрязнителей. В связи с вышеизложенным встает задача определения степени безопасности таких микроорганизмов для окружающей среды, животных и человека. В рамках данной задачи изучение отдельных токсинов, продуцируемых этими бактериями, является необходимым звеном.

В. cereus, синтезирует ряд токсинов, которые способствуют развитию инфекции, и может вызывать диаррейный и эметический синдромы, а также заболевания глаз, нервной системы, маститы и другие болезни. Ряд внеклеточных токсинов В. cereus, обладают гемолитической активностью и рассматриваются в качестве потенциальных факторов иатогснности (Turnbull, 1986; Drobniewski, 1993). На настоящий момент в разной степени описаны цереолизин, сфингомиелиназа, цереолизин АВ, гемолизин BL, цереолизин-нодобный гемолизин, гемолизины II и III и CytK. Спектр и свойства гемолитических белков, продуцируемых данным микроорганизмом, изучены далеко не полно. Это обусловлено сложностью получения индивидуальных препаратов данных белков из исходного микроорганизма. Один из цитолитических порообразующих токсинов В. cereus - гемолизин II (Hlyll) представляет особый интерес, так как он является гомологом такого опасного токсина, как альфа-токсин Staphylococcus aureus. Более того, он характерен для цсреусной группы бацилл, так как его ген был обнаружен в клетках В. thuringiensis, В. weihenstephanensis и В. anthracis. В геноме В. anthracis обнаружен ген, структура которого повторяет структуру гена hlyll В. cereus, но содержит мутацию приводящую к сбивке рамки считывания. К настоящему времени ряд гемолизинов В. cereus получены в очищенном состоянии и активно изучаются в самых разнообразных аспектах. В тоже время гемолизин II, будучи обнаружен уже давно, до сих пор практически не изучен, поскольку не удавалось получить высокоочищенный препарат белка. Есть основание считать, что гемолизин играет немаловажную роль в патогенезе и поэтому требуется его всестороннее изучение. Данное обстоятельство определяет актуальность разработки метода очистки, получения гомогенного препарата белка и исследование его свойств.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось проведение структурно-функционального анализа гемолизина II Bacillus cereus. Для достижения указанной цели ставились следующие задачи:

1. Подобрать оптимальные условия для максимальной экспрессии гена гемолизина II Bacillus cereus в Е. coli.

2. Разработать метод очистки препарата Hlyll.

3. Определить роль сигнальной пептидазы в процессинге Hlyll.

4. Изучить механизм действия гемолизина II с использованием искусственных и клеточных мембран.

5. Изучить свойства пор, формируемых гемолизином II в естественных и искусственных мембранах, механизм и условия порообразования.

6. Изучить цитолитическое действие и влияние на макроорганизмы гемолизина И. Данная работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН.

Научная новизна работы. Впервые получен высокоочищенный препарат гемолизина II В. cereus, исследованы его свойства и определен механизм действия.

Практическое значение работы. Результаты работы могут быть использованы в медицине, биотехнологии, сельском хозяйстве. Получение чистого препарата гемолизина II и изучение его структурно-функциональных особенностей даёт возможность для дальнейших исследований - выяснения участия его в патогенезе, поиска подходов для нейтрализации действия токсина. Гемолизин II может играть важную роль при развитии заболеваний вызываемых В. cereus. Также знание о Hlyll позволит использовать этот объект при исследовании клеточной физиологии и функционирования мембран клеток. Можно применить этот продукт в создании клетко-подобных биореакторов, что позволяет значительно увеличить экспрессию белков, а также в конструкции нанопор. Развитие наиобиологии не возможно без понимания механизмов сборки канала и его функционирования. Полученные результаты можно применять в конструирование мембранных пор с определёнными свойствами (с разной проводимостью, селективностью и т.д.). Такие поры могут быть употреблены как компоненты фильтров, биосенсоров и других наноустройств. Тот факт, что гемолизин Н-подобный токсин обнаружен у В. thuringiensis, широко применяемого как биологический инсектицид, заставляет усилить внимание к тщательному анализу используемых штаммов на предмет их безопасности для человека и животных, а также заостряет вопрос о правомочности использования данного микроорганизма в качестве инсектицидного препарата.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Ковалевская, Жанна Ивановна

выводы

1. Впервые получен очищенный препарат внеклеточного гемолизина II В. cereus.

2. Гемолизии II является секреторным белком и синтезируется в форме предшественника, имеющего сигнальный пептид из 31 аминокислотного остатка, который в ходе процессинга отщепляется сигнальной пептидазой с образованием зрелого белка.

3. Зрелый гемолизин II образует анион-селективные и потенциал-зависимые каналы с функциональным диаметром пор 12-16 А и с внешним диаметром 80-100 А. Возможно формирование гекса-, гепта- и октамерных комплексов Hlyll.

4. Полное связывание Hlyll с мембраной в виде мономера происходит в течение первой минуты lag периода и не зависит от температуры. В дальнейшем, процесс формирование поры осуществляется в плоскости мембраны и является зависимым от температуры.

5. Гемолизин II обладает цитолитическим патогенным действием.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ковалевская, Жанна Ивановна, 2007 год

1. Abdel-Hameed A. and Landen R. (1994) Studies on Bacillus thuringiensis strains isolated from Swedish soils: insect toxicity and production of Bacillus ceretts-diarrhoeal-type enterotoxin. World J. Microbiol. Biotechnol., V. 10, P. 406-409.

2. Agaisse H., Gominet M., Okstad O.A., Kolsto A-B., Lereclus D. (1999) PlcR is a pleiotropic regulator of extracellular virulence factor gene expression in Bacillus thuringiensis. Mol. Microbiol., V. 32, P. 1043-1053.

3. Ahnert-Hilger G. and Weller U. (1998) Alpha-toxin and streptolysin О as tools in cellbiological research. P. 103-110. Cell Biology: A Laboratory Handbook, V. 4, Acad. Press, New York.

4. Aksimentiev A. and Schulten K. (2005) Imaging alpha-hemolysin with molecular dynamics: ionic conductance, osmotic permeability, and the electrostatic potential map. Biophys J, V. 88, P. 3745-3761.

5. Alouf J.E. (2000) Cholesterol-binding cytolytic protein toxins. Int. J. Med. Microbiol., V. 290, P. 351-356 Int. J. Med. Microbiol., V. 290, P. 295-299.

6. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res., V. 25, P. 3389-3402.

7. Arbuthnott J.P., Freer J.H. and Bernheimer A.W. (1967) Physical states of staphylococcal a-toxin. J. Bacteriol., V. 94, P. 1170-1177.

8. Ash C, Collins MD. (1992), Comparative analysis of 23S ribosomal RNA gene sequences of Bacillus anthracis and emetic Bacillus cereus determined by PCR-direct sequencing. FEMS Microbiol Lett.;73(l-2), 75-80.

9. Ash C, Farrow JA, Dorsh M, Stackebrandt E, Collins MD. (1991) Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and related species on the basis of reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. Int. JSyst. Bacteriol. 41,343-346.

10. Awad M.M., Ellemor D.M., Boyd R.L., Emmins J.J., Rood J. (2001) Synergistic effects of alpha-toxin and perfringolysin О in Clostridium perfringens-medlated gas gangrene. Infect. Immun., V. 69, P. 7904-7910.

11. Baida G.E. and Kuzmin N.P. (1995) Cloning and primary structure of a new hemolysin gene from Bacillus cereus. Biochim Biophys. Acta, V. 1264, P. 151-154.

12. Baida G.E. and Kuzmin N.P. (1996) Mechanism of action of hemolysin III from Bacillus cereus. Biochim Biophys. Acta, V. 1284, P. 122-124.

13. Baida G.E., Sidorov I.A. and Kuzmin N.P. (1997) Hemolysin III from Bacillus cereus. P. 48. Abstracts of the First International Workshop on The Molecular Biology of B. cereus, B. anlhracis andB. thuringiensis, May 23-25, Oslo.

14. Baida G., Budarina Z.I., Kuzmin N.P., Solonin A.S. (1999) Complete nucleotide sequence and molecular characterization of hemolysin II gene from Bacillus cereus. FEMS Microbiol. Lett., V. 180, P. 7-14.

15. Bainbridge G., Gokce I., and Lakey J. H. (1998) Voltage gating is a fundamental feature of porin and toxin beta-barrel membrane channels. FEBS Lett, V. 431, P. 305-308.

16. Barth H., Aktories K., Popoff M. and Stiles B. (2004) Binary bacterial toxins: biochemistry, biology and applications of common Clostridium and Bacillus proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews, V.68, N.3, P. 373-402.

17. Bayley H. (1994) Triggers and switches in a self-assembling pore-forming protein. J. Cell. Biochem., V. 56, P. 177-182.

18. Beecher D.J. and Macmillan J.D. (1990) A novel bicomponent hemolysin from Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 58, P. 2220-2227.

19. Beecher D.J. and Macmillan J.D. (1991) Characterization of the components of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 59, P. 1778-1784.

20. Beecher D.J. and Wong A.C. (2000) Cooperative, synergistic and antagonistic haemolytic interactions between haemolysin BL, phosphatidylcholine phospholipase С and sphingomyelinase from Bacillus cereus. Microbiology, V. 146, P. 3033-3039.

21. Beecher D.J. and Wong A.C. (2000a) Tripartite haemolysin BL: isolation and characterization of two distinct homologous sets of components from a single Bacillus cereus isolate. Microbiology, V. 146, P. 1371-1380.

22. Beecher D.J. and Wong A.C.L. (1994) Improved purification and characterization of hemolysin BL, a hemolytic dermonecrotic vascular permeability factor from Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 62, P. 980-986.

23. Beecher D.J. and Wong A.C.L. (1994a) Identification of hemolysin BL-producing Bacillus cereus isolates by a discontinuous hemolytic pattern in blood agar. Appl. Environ. Microbiol., V. 60, P. 1646-1651.

24. Beecher D.J. and Wong A.C.L. (1997) Tripartite hemolysin BL from Bacillus cereus: hemolytic analysis of component interactions and a model for its characteristic paradoxical zone phenomenon. J. Biol Chem., V. 272, P. 233-239.

25. Beecher D.J., Pulido J.S., Barney N.P., Wong A.C.L. (1995) Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infect. Immun., V. 63, P. 632-639.

26. Beecher D.J., Schoeni J.L. and Wong A.C.L. (1995a) Enterotoxic activity of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 63, P. 4423-4428.

27. Benz R., Schmid A., Wagner W., Goebel W. (1989) Pore formation by Escherichia coli hemolysin: evidence for an association-dissociation equilibrium of the pore-forming aggregates. Infect. Immun., V. 57, P. 887-895.

28. Bernadac A., Bolla J.M., Lazdunski C., Inouye M., Pages J.M. (1987) Precise localization of an overproduced periplasmic protein in Escherichia coli: use of double immunogold labelling. Biol.Cell, V. 161, P.141-147.

29. Bernheimer A.W. (1976) Mechanisms in bacterial toxinology, Wiley, New York.

30. Bernheimer A.W. (1988) Assay of hemolytic toxins. Meth. Enzymol., V. 165, P. 213-217.

31. Bernheimer A.W. and Grushoff P. (1967) Cereolysin: production, purification and partial characterization. J.Gen. Microbiol., V. 46, P. 143-150.

32. Bernheimer A.W. and Grushoff P. (1967a) Extracellular hemolysins of aerobic sporogenic Bacilli. J. Bacteriol., V. 93, P. 1541-1543.

33. Bhakdi S., Bayley H., Valeva A., Walev I., WalkerB., Weller U., Kehoe M., Palmer M„ (1996) Staphylococcal alpha-toxin, streptolysin-O, and Escherichia coli hemolysin: prototypes of pore-forming bacterial cytolysins. Arch. Microbiol., V. 165, P. 73-79.

34. Bhakdi S., Mackhan N., Nicaud J.-M., Holland I.B. (1986) Escherichia coli hemolysin may damage target cell membranes by generating transmembrane pores. Infect. Immun., V. 52, P. 6369.

35. Bhakdi S., Tranum-Jensen J. and Sziegoleit A. (1985) Mechanism of membrane damage by streptolysin-O. Infect. Immun., V. 47, P. 52-60.

36. Bhakdi S., Tranum-Jensen J. (1991) Alpha-toxin of Staphylococcus aureus. Microbiological Reviews, V. 55, N.4, P. 733-751.

37. Bhakdi S., Walev I., Palmer M., Valeva A. (2000) Staphylococcal a-toxin. P. 509-527. Bacterial protein toxins, Aktories K. and Just I. (eds.), Springer, Berlin.

38. Binet R., Letoffe S., Ghigo J.M., Delepelaire P., Wandersman C. (1997) Protein secretion by gram-negative bacterial ABC exporters. Folia Microbiol., V. 42, P. 179-183.

39. Boehm D.F., Welch R.A. and Snyder I.S. (1990) Domains of Escherichia coli hemolysin (HlyA) involved in binding of calcium and erythrocyte membranes. Infect. Immun., V. 58, P. 1959-1964.

40. Bonneau R., Tsai J., Ruczinski I., Chivian D., Rohl C., Strauss С. E. and Baker D. (2001) Rosetta in CASP4: progress in ab initio protein structure prediction. Proteins, Suppl 5, P. 119126.

41. Bortoli-German I., Brun E., Py В., Chippaux M., Barras F. (1994) Periplasmic disulphide bond formation is essential for cellulase secretion by the plant pathogen Erwinia chrysantemi. Mol. Microbiol., V. 11, P. 545-553.

42. Bowman M.N., Ottolenghi A.C. and Mengel C.E. (1971) Effects of phospholipase С on human erythrocytes. J. Membr. Biol., V. 4, P. 156-164.

43. Bradford M.M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein.Utilizing the Principle of Proteine. J. Anal. Biochem., V. 72., P. 248-254.

44. Braha O., Gu L., Zhou L., Lu X., Cheley S., and Bayley H. (2000) Simultaneous stochastic sensing of divalent metal ions. Nature biotechnology, V. 17.

45. Brillard J. and Lereclus D. (2004) Comparison of cytotoxin cytK promoters from Bacillus cereus strain ATCC 14579 and from a B. cereus food-poisoning strain. Microbiology, V. 150, P. 2699-2705.

46. Brinton G.S., Topping T.M., Hyndiuk R.A., Aaberg T.M., Reeser F.H., Abrams G.W. (1984) Posttraumatic endophthalmitis. Arch. Ophthalmol., V. 102, P. 547-550.

47. Budarina Z. I., Sinev M. A., Mayorov S. G., Tomashevski A. Y., Shmelev I. V. and Kuzmin N.P. (1994) Hemolysin II is more characteristic of Bacillus thuringiensis than Bacillus cereus. Arch.Microbiol., V. 161, P. 252-257.

48. Burnette W.N. (1981) Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from SDS-PAAG to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem., V. 12, P. 195-203.

49. Carlson C.R., Caugant D.A. Kolsto A.-B. (1994) Genotypic diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains. Appl. Environ. Microbiol., V. 60, P. 1719-1725.

50. Carlson C.R., Johansen Т. and Kolsto A.-B. (1996) The chromosome map of Bacillus thuringiensis subsp. canadensis HD224 is highly similar to that of the Bacillus cereus type strain ATCC 14579. FEMSMicrobiol. Lett., V. 141, P. 163-167.1.^

51. Cassidy P. and Harshman S. (1976) Studies on the binding of staphylococcal I-labeled a-toxin to rabbit erythrocytes. Biochemistry, V. 15, P. 2348-2355.

52. Cheng L.W., Anderson D.M., Schneewind 0. (1997) Two independent type III secretion mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica. Mol. Microbiol., V. 24, P. 757-765.

53. Claus D. and Berkeley R.C.W. (1996) Genus Bacillus. P. 1105-1139. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Sneath P.H.A., Mair N.A., Sharpe M.E. Holt J.G. (eds.), Williams and Wilkins, Baltimore, MD.

54. Clinkenbeard K.D. and Thiessen A.E. (1991) Mechanism of action of Moraxella bovis hemolysin. Infect. Immun., V. 59, P. 1148-1152.

55. Coolbaugh J.C. and Williams R.P. (1978) Production and characterization of two hemolysins of Bacillus cereus. Can. J. Microbiol., V. 24, P. 1289-1295.

56. Cortajarena A.L., Goni F.M., Ostolaza H. (2003) A receptor-binding region in Escherichia coli alpha-hemolysin. J. Biol. Chem. V. 278, P. 19159-19163.

57. Cortajarena A. L., Goni F. M. and Ostolaza H. (2002) His-859 Is an Essential Residue for the Activity and pH Dependence of Escherichia coli RTX Toxin a -Hemolysin. J. Biological Chemistry, V. 277, N. 26, P. 23223-23229.

58. Cortajarena A. L., Goni F. M. and Ostolaza H. (2001) Glycophorin as a Receptor for Escherichia coli a -Hemolysin in Erythrocytes. J. Biological Chemistry, V. 276, N. 16, P. 12513-12519.

59. Cossart P. and Lecuit M. (1998) Interactions of Listeria monocytogenes with mammalian cells during entry and actin-based movement: bacterial factors, cellular ligands and signaling. EMBOJ., V. 17, P. 3797- 3806.

60. Cossart P. and Mengaud J. (1989) Listeria monocytogenes: a model system for the molecular study of intracellular parasitism. Mol. Biol. Med., V. 6, P. 463-474.

61. Cossart P., Vincente M.F., Mengaud J., Baquero F., Perez-Diaz J.C., Berche P. (1989) Listeriolysin О is essential for virulence of Listeria monocytogenes: direct evidence obtained by gene complementation. Infect. Immun., V. 57, P. 3629-3636.

62. Cowell J.L., Grushoff-Kosyk P.S., Bernheimer A.W. (1976) Purification of cereolysin and the electrophoretic separation of the active (reduced) and inactive (oxidized) forms of the purified toxin. Infect. Immun., V. 14, P. 144-154.

63. Crowell K.M. and Lutz F. (1989) Pseudomonas aeruginosa cytotoxin: the influence of sphingomyelin on binding and cation permeability increase in mammalian erythrocytes. Toxicon, V. 27, P. 531-540.

64. Czajkowsky D. M., Sheng S.T., Shao Z.F. (1998) Staphylococcal alpha-hemolysin can form hexamers in phospholipid bilayers. JMol Biol, V.276, P. 325-330.

65. Czajkowsky D. M., Iwamoto H., Cover T. L. and Shao Z. (1999) The vacuolating toxin from Helicobacter pylori forms hexameric pores in lipid bilayers at low pH. Biochemistry, V. 96, P. 2001-2006.

66. Damgaard P.H. (1995) Diarrhoeal enterotoxin production by strains Bacillus thuringiensis isolated from commercial Bacillus thuringiensis-based insecticides. FEMS Immun. Med. Microbiol., V. 12, P. 245-250.

67. Date T. (1983) Demonstration by a novel genetic technique that leader peptidase is an essential enzyme of Escherichia coli. J Bacteriol, V. 154, P. 76-83.

68. Diep D. В., Nelson K. L., Lawrence T. S., Sellman B. R., Tweten R. K. and Buckley J. T. (1999) Expression and properties of an aerolysin- Clostridium septicum alpha toxin hybrid protein. Molecular Microbiology, V. 31, N. 3, P. 785-794.

69. Dijl J.M., de Jong A., Vehmaanpera J., Venema G., Bron S. (1992) Signal peptidase I of Bacillus subtilis: patterns of conserved amino acids in prokaryotic and eukaryotic type I signal peptidases. EMBO J., V. 11, P. 2819-2828.

70. Drobniewski F.A. (1993) Bacillus cereus and related species. Clin. Microbiol. Rev. V. 6, P. 324-338.

71. Edman P. (1956) On the mechanism of the phenyl isothiocyanate degradation of peptides. Acta Chem. Scand., V. 10, P. 761-768.

72. Edgar R.C. (2004) MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res, V. 32, P. 1792-1797.

73. Eisenberg D., Luthy R. and Bowie J. U. (1997) VERIFY3D: assessment of protein models with three-dimensional profiles. Methods Enzymol, V. 277, P. 396-404.

74. Elek S.D. and Levy E. (1954) The nature of discrepancies between haemolysins in culture filtrates and plate haemolysin patterns of staphylococci. J. Pathol. Bacteriol., V. 68, P. 31-40.

75. Fagerlund A., Ween 0., Lund Т., Hardy S.P., Granum P.E. (2004) Genetic and functional analysis of the cytK family of genes in Bacillus cereus. Microbiology, V. 150, P. 2689-2697.

76. Felmlee T. and Welch R.A. (1988) Alterations of amino acid repeats in the Escherichia coli hemolysin affect cytolytic activity and secretion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., V. 85, P. 52695273.

77. Ferreras M., Hoper F., Dalla Serra M., Colin D.A., Prevost G. and Menestrina G. (1998) The interaction of Staphylococcus aureus bi-component у -hemolysins and leucocidins with cells and lipid membranes. Biochim. Biophys., V. 1414, P. 108-126.

78. Filloux A., Michel G., Bally M. (1998) GSP-dependent protein secretion in gram-negative bacteria: the Xcp system of Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol. Rev., V. 22, P. 177198.

79. Fossum K. (1963) Separation of hemolysin and egg yolk turbidity factor in cell-free extracts of Bacillus cereus. Acta Path. Microbiol Scand., V. 59, P. 400-406.

80. Fossum K. (1964) The heat sensitivity of Bacillus cereus hemolysin. Acta Path. Microbiol. Scan., V. 60, P. 523-527.

81. Freer J.H. (1988) Toxins as virulence factors of gram-positive pathogenic bacteria of veterinary importance. P. 264-288. Virulence mechanisms of bacterial pathogens, Roth J.A. (ed.), American Society for Microbiology, Washington, D.C.

82. Freer J.H., Arbuthnott J.P. and Bernheimer A.W. (1968) Interaction of staphylococcal a-toxin with artifical and natural membranes. J. Bacteriol., V. 95, P. 1153-1168.

83. Gaviria Rivera A.M., Granum P.E., Priest F.G. (2000) Common occurrence of enterotoxin genes and enterotoxicity in Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiol. Lett., V. 190, P. 151-155.

84. Geoffroy C. and Alouf J.E. (1983) Selective purification by thiol-disulfide interchange chromatography of alveolysin, a sulphydryl-activted toxin of Bacillus alvei. J. Biol. Chem., V. 258, P. 9968-9972.

85. Gouaux E. (1998) a-Hemolysin from Staphylococcus aureus: An archetype of p-barrel, channel-forming toxins. J. Struct. Biol., V. 121, P. 110-122.

86. Gouaux E., Hobaugh M.R. and Song L. (1997) a-Hemolysin, y-hemolysin and leukocidin from Staphylococcus aureus: distant in sequence but similar in structure. Protein Sci, V.6, P. 2631-2635.

87. Gouaux E., Braha 0., Hobaugh M., Song L., Cheley S., Shustak C. and Bayley H. (1994) Subunit stoichiometry of staphylococcal a-hemolysin in crystals and on membranes: A heptameric transmembrane pore. Biochemistry, V 91, P. 12828-12831.

88. Granum P.E. (1997) Bacillus cereus. P. 327-336. Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers, Doyle M.P., Beuchat L.R., Montville T.J. (eds.), ASM Press, Washington, DC.

89. Granum P.E. and Lund T. (1997) Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Lett., V. 157, P. 223-228.

90. Gu L. Q., Dalla S. M., Vincent J. В., Vigh G., Cheley S., Braha O., and Bayley H. (2000) Reversal of charge selectivity in transmembrane protein pores by using noncovalent molecular adapters. Proc Natl Acad Sci, V. 97, P. 3959-3964.

91. Gu L., Cheley S., Bayley H. (2001) Capture of a Single Molecule in a Nanocavity. Science, V. 291, P. 636-640.

92. Hacker J., Hughes C., Hof. H., Goebel W. (1983) Cloned hemolysin genes from Escherichia coli that cause urinary tract infection determine different levels of toxicity in mice. Infect. Immun., V. 42, P. 57-63.

93. Hangombe M.B., Kohda Т., Mukamoto M., Kozaki S. (2005) Relationship between Clostridium septicum alpha-toxin activity and binding to erythrocyte membranes. J. Vet. Med. Sci., V. 67, P. 69-74.

94. Hansen B.M. and Hendriksen N.B. (2001). Detection of enterotoxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains by PCR analysis. Appl. Environ. Microbiol., V. 67, P. 185-189.

95. Hardy S.P., Lund Т., Granum P.E. (2001) CytK toxin of Bacillus cereus forms pores in planar lipid bilayers and is cytotoxic to intestinal epithelia. FEMS Microbiol. Lett., V. 197, P.47-51.

96. Harvie D.R., Vilchez S., Steggles J.R., Ellar D.J.(2005) Bacillus cereus Fur regulates iron metabolism and is required for full virulence. Microbiology, V. 151, P. 569-577.

97. Heinrichs J.H., Beecher D.J., Macmillan J.D., Zilinskas B.A. (1993) Molecular cloning and characterization of the hblA gene encoding the В component of hemolysin BL from Bacillus cereus. J. Bacterid, V. 175, P. 6760-6765.

98. Henderson I.R., Navarro-Garcia F., Nataro J.P. (1998) The great escape: structure and function of the autotransporter proteins. Trends Microbiol., V. 6, P. 370-378.

99. Hendriksen N.B., Hansen B.M. and Johansen J.E. (2006) Occurrence and pathogenic potential of Bacillus cereus group bacteria in a sandy loam. Antonie Van Leeuwenhoek, V. 89, P. 239-249.

100. Hertle R. (2000) Serratia type pore forming toxins. Curr. Protein Pept. Sci., V. 1, P. 75-89.

101. Hertle R. (2002) Serratia marcescens hemolysin (ShlA) binds artificial membranes and forms pores in a receptor-independent manner. J. Membr. Biol. V. 189, P. 1-14.

102. Heuck A.P., Tweten R.K., Johnson A.E. (2003) Assembly and topography of the prepore complex in cholesterol-dependent cytolysins. J. Biol. Chem., V. 27.

103. Hildebrand A., Pohl M. and Bhakdi S. (1991) Staphylococcus aureus a-toxin. Dual mechanism of binding to target cells. J. Biol. Chem., V. 266,17195-17200.

104. Hille B. (1984) Ionic Channels of Excitable Membranes. Sunderland, MA: Sinauer Associate Publishers.

105. Honda Т., Shiba A., Seo S., Yamamoto J., Matsuyama J., and Miwatani T. (1991) Identity of hemolysins produced by Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus. FEMS Microbiol. Lett., V. 79, P. 205-210.

106. Hotze E.M., Heuck A.P., Czajkowsky D.M., Shao Z., Johnson A.E., Tweten R.K. (2002) Monomer-monomer interactions drive the prepore to pore conversion of a P-barrel -forming cholesterol-dependent cytolysin. J. Biol. Chem., V. 277, P. 11597-11605.

107. Howorka S., Cheley S., and Bayley H. (2001) Sequence-specific detection of individual DNA strands using engineered nanopores. Nature biotechnology, V. 19.

108. Hucho F. (1995) Toxins as tools in neurochemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., V. 34, P. 39-50.

109. Hueck C. J. (1998) Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiol. Mol. Biol. Rev., V. 62, P. 379-433.

110. Ikezava H., Mori M. and Taguchi R. (1980) Studies on sphingomyelinase of Bacillus cereus-. Hydrolytic and hemolytic actions on erythrocyte membranes. Arch. Biochem. Biophys., V. 199, P. 572-577.

111. Ikezawa H., Matsushita M., Tomita M., Taguchi R. (1986) Effects of metal ions on sphingomyelinase activity of Bacillus cereus. Arch. Biochem. Biophys., V. 249, P. 588-595.

112. Jayasinghe L. and Bayley H. (2005) The leukocidin pore: Evidence for an octamer with four LukF subunits and four LukS subunits alternating around a central axis. Protein Science, V. 14, P. 2550-2561.

113. Johnson C.E. and Bonventre P.F. (1967) Lethal toxin of Bacillus cereus. I.Relationships and nature of toxin, hemolysin, and phospholipase. J. Bacteriol., V. 94, P. 306-316.

114. Jung Y., Bayley H. and Movileanu L. (2006) Temperature-responsive protein pores. J. Am. Chem. Soc., V. 128, P. 15332-15340.

115. Kaneko J. and Kamio Y. (2004) Bacterial two-component and hetero-heptameric pore-forming cytolytic toxins: structures, pore-forming mechanism, and organization of the genes. Biosci. Biotechnol. Biochem., V. 68, N. 5, P. 981-1003.

116. Kajava A.V., Zolov S.N., Pyatkov K.I., Kalinin A.E. and Nesmeyanova M.A. (2002) Processing of Escherichia coli Alkaline Phosphatase. J. Biological Chemistry, V. 277, N. 52, P. 50396-50402.

117. Kawate T. and Gouaux E. (2003) Arresting and releasing Staphylococcal a-hemolysin at intermediate stages of pore formation by engineered disulfide bonds. Protein Science, V.12, P. 997-1006.

118. Kehoe M.A., Miller L., Walker J.A., Boulnois G.J. (1987) Nucleotide sequence of the streptolysin О (SLO) gene: structural homologies between SLO and other membrane-damaging, thiol-activated toxins. Infect. Immun., V. 55, P. 3228-3232.

119. Kennedy С. L., Krejany E. 0., Young L. F., O'Connor J. R., Awad M. M., Boyd R. L., Emmins J. J., Lyras D. and Rood J. I. (2005) The a -toxin of Clostridium septicum is essential for virulence. Molecular Microbiology, V. 57, N. 5, P. 1357-1366.

120. Knapp S., Hacker J., Jarchau Т., Goebel W. (1986) Large, unstable inserts in the chromosome affect virulence properties of uropathogenic Escherichia coli 06 strain 536. J. Bacteriol., V. 168, P. 22-30.

121. Koster M., Bitter W., Tommassen J. (2000) Protein secretion mechanisms in Gram-negative bacteria. Int. J. Med. Microbiol., V. 290, P. 325-331.

122. Kovalevskiy О. V., Lebedev A. A., Surin A. K., Solonin A. S. and Antson A. A. (2007) Crystal Structure of Bacillus cereus HlyllR, a Transcriptional Regulator of the Gene for Pore-forming Toxin Hemolysin II. J. Mol. Biol., V. 365, P. 825-834.

123. Kramer J.M., Turnbull P.C.B., Jorgensen K., Parry J., Gilbert R.J. (1978) Separation of exponential growth exotoxins of Bacillus cereus and their preliminary characterization. J. Appl. Bacl. V. 45, P. 19-23.

124. Krug E.L. and Kent C. (1984) Phospholipase С from Clostridium perfringens: preparation and characterisation of homogenous enzyme. Arch. Biochem. Biophys., V. 231, P. 400-410.

125. Lacy D.B. and Stevens R.C. (1998) Unraveling the structure and modes of action of bacterial toxins. Curr. Op. Struct. Biol., V. 8, P. 778-784.

126. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, V. 227, P. 680-685.

127. Lowe C.R., Hans M., Spibey N. and Drabble W.T. (1980) The Purification of Inosine 5'-Monophosphate Dehydrogenase from E. coli by Affinity Chromatography on Immobilized Procion Dyes. Analytical biochemistry, V. 104, N. 1, P. 23-28.

128. Ludwig A., Schmid A., Benz R. and Goebel W. (1991) Mutations affecting pore formation of hemolysin from Escherichia coli. Mol. Gen. Genet., V. 226, P. 198-208.

129. Lund Т., De Buyser M.-L., Granum P.E. (2000) A new cytotoxin from Bacillus cereus that may cause necrotic enteritis. Molecular Microbiology, V. 38, P. 254-261.

130. McDonel J.L. (1986) Toxins of Clostridium perfringens types А, В, C, D and E. P. 477-517. Pharmacology of Bacterial Toxins, Dorner F. and Drews J. (eds.), Pergamon Press, Oxford.

131. McDonel J.L., Dorner F. and Drews J. (1986) The role of toxins in bacterial pathogenesis. P. 1-4. Pharmacology of Bacterial Toxins, Dorner F. and Drews J. (eds.), Pergamon Press, Oxford.

132. McMahon J.W. and Rigler F.H. (1965) Feeding rate of Daphnia magna Straus in different foods labeled with radioactive phosphorus. Limnol. Oceanogr., V. 10, P. 105-113.

133. Menestrina G. (1986) Ionic channels formed by Staphylococcus aureus alpha-toxin: voltage-dependent inhibition by divalent and trivalent cations. JMembr.Biol, V. 90, P. 177-190.

134. Menestrina G. (1988) Escherichia coli hemolysin permeabilizes small unilamellar vesicles loaded with calcein by a single-hit mechanism. FEBSLett., V. 232, P. 217-220.

135. Menestrina G., Dalla Serra M., Prevost G. (2001) Mode of action of P-barrel pore-forming toxins of the staphylococcal a-hemolysin family. Toxicon, V. 39, P. 1661-1672.

136. Merzlyak P. G., Yuldasheva L. N., Rodrigues C. G., Carneiro С. M., Krasilnikov О. V., and Bezrukov S. M. (1999) Polymeric nonelectrolytes to probe pore geometry: application to the alpha-toxin transmembrane channel. Biophys J, V. 77, P. 3023-3033.

137. Merzlyak P. G., Capistrano M. F., Valeva A., Kasianowicz J. J. and Krasilnikov О. V. (2005) Conductance and ion selectivity of a mesoscopic protein nanopore probed with cysteine scanning mutagenesis. Biophys. J.

138. Mezes P.S.F. and Lampen J.O. (1985) Secretion of proteins by Bacilli. P. 151-183. The molecular biology of the Bacilli, Dubnau D.A. (ed.), Acad. Press, New York

139. Miles G., Bayley H., Cheley S. (2002) Properties of Bacillus cereus hemolysin II: a heptameric transmembrane pore. Protein Sci., V. 11, P. 1813-1824.

140. Miles G., Movileanu L., Bayley H. (2002) Subunit composition of a bicomponent toxin: Staphylococcal leukocidin forms an octameric transmembrane pore. Protein Sci., V. 11, P. 894902.

141. Mitsui К., Mitsui N. and Hase J. (1973) Clostridium perfringens exotoxins. I. Purification and properties of the a-toxin. Jpn. J. Exp. Med., V. 43, P. 65-80.

142. Mollby R. (1978) Bacterial phospholipases. P. 367-424. Bacterial toxins and cell membranes, Jeljaszewicz J. and Wadstrom T. (eds.), Academic Press Ltd., London.

143. Morgan P.J., Hyman S.C., Rowe A.J., Mitchell T.J., Andrew P.W., Saibil H.R. (1995) Subunit organization and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Lett., V. 371, P. 77-80.

144. Mueller P. and Rudin D.O. (1963) Induced excitability in reconstituted cell membrane structure. J Theor Biol, V. 4, P. 268-280.

145. Naumann M., Reuter R., Metz P. and Kopperschlager G. (1989) Affinity chromatography of bovine heart lactate dehydrogenase using dye ligands linked directly or spacer-mediated to bead cellulose. J Chromatogr., V. 466, P. 319-329.

146. Nesmeyanova M. A. (1982) Membrane function in biosynthesis of secreted proteins in Escherichia coli. Doctor of Sciences Thesis, Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino.

147. Nguyen V. Т., Kamio Y. and Higuchi H. (2003) Single-molecule imaging of cooperative assembly of y-hemolysin on erythrocyte membranes. EMBOJ., V. 22, N. 19, P. 4968-4979.

148. Nguyen V. T. and Kamio Y. (2004) Cooperative assembly of p-barrel pore-forming toxins. J.Biochem., V. 136, P. 563-567.

149. Noireaux V. and Libchaber A. (2004) A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. PNAS, V. 101, N. 51, P. 17669-17674.

150. Olson R. and Gouaux E. (2005) Crystal Structure of the Vibrio cholerae Cytolysin (VCC) Pro-toxin and its Assembly into a Heptameric Transmembrane Pore. J. Mol. Biol., V. 350, P. 997-1016.

151. Pages J.M., Anba J., Lazdunski C. (1987) J. Bacterid., V.169, P. 1386-1390.

152. Palmer K.L., Goldman W.E. and Munson Jr.R.S. (1996) An isogenidc haemolysin-deficient mutant of Haemophilus ducreyi lacks the ability to produce cytopathic effects on human foreskin fibroblasts. Mol. Microbiol., V. 21, P. 13-19.

153. Panbangred W., Kondo Т., Negoro S., Shinmyo A., Okada H. (1983) Mol. Gen. Genet., V. 192, P. 335-341.

154. Parker D.A. and Goepfert J.M. (1978) Enhancement of synthesis of Bacillus cereus enterotoxin using a sac-culture technique. J. Fd. Protect., V. 41, P. 116-117.

155. Parker M.W., van der Goot F.G. and Buckley J.T. (1996) Aerolysin the ins and outs of a model channel-forming toxin. Mol. Microbiol., V. 19, P. 205-212.

156. Paton J.C., Berry A.M., Lock R.A., Hansman D., Maiming P.A. (1986) Cloning and expression in Escherichia coli of the Streptococcus pneumoniae gene encoding pneumolysin. Infect. Immun., V. 54, P. 50-55.

157. Pendleton I.R., Bemheimer A.W. and Grushoff P. (1973) Purification and partial characterization of hemolysins from Bacillus thuringiensis. J. Invert. Path., V. 21., P. 131-135.

158. Pflugfelder S.C. and Flynn H.W. (1992) Infectious endophthalmitis. Infect. Dis. Clin. N. Am.y. 6, P. 859-873.

159. Poole K. and Braun V. (1988) Iron regulation of Serratia marcescens hemolysin gene expression. Infect. Immun., V. 56, P. 2967-2971.

160. Portnoy D.A., Jacks P.S. and Hinrichs D.J. (1988) Role of hemolysin for the intracellular growth of Listeria monocytogenes. J. Exp. Med., V. 167, P. 1459-1471.

161. Promdonkoy B. and Ellar D. J. (2003) Investigation of the pore-forming mechanism of a cytolytic delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis. Biochem J, V. 374, P. 255-259.

162. Pugh G.W. and Hughes D.E. (1968) Experimental bovine infectious keratoconjunctivitis caused by sunlamp irradiation and Moraxella bovis infections: correlation with hemolytic ability and pathogenecity. Am. J. Vet. Res., V. 29, P. 835-839.

163. Reers M., Smiley S. Т., Mottola-Hartshorn C., Chen A., Lin M. and Chen L. B. (1995) Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods Enzymol, V. 260, P. 406417.

164. Ryan P.A., Macmillan J.D. and Zilinskas B.A. (1997) Molecular cloning and characterization of the genes encoding the LI and L2 components of hemolysin BL from Bacillus cereus. J. Bacteriol., V. 179, P. 2551-2556.

165. Sabirov R. Z. and Okada Y. (2004) Wide nanoscopic pore of maxi-anion channel suits its function as an ATP-conductive pathway. Biophys J, V. 87, P. 1672-1685.

166. Sali A. and Blundell T. L. (1993) Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. J Mol Biol, V. 234, P. 779-815.

167. Sambrook, J., Fritsch, E. and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York.

168. Sato N., Kurotaki H., Watanabe Т., Mikami Т., Matsumoto T. (1998) Use of hemoglobin as an iron source by Bacillus cereus. Biol. Pharm. Bull., V. 21, P. 311-314.

169. Scherrer R., Gerhardt P. (1971) Molecular sieving by the Bacillus megaterium cell wall and protoplast. J. Bacteriol., V. 107, N. 3, P. 718-735.

170. Scherrer R., Cabrera В. T. and Gerhardt P. (1971) Macromolecular sieving by the dormant spore of Bacillus cereus. J Bacteriol, V. 108, P. 868-873.

171. Schlebel E. and Braun V. (1989) Integration of the Serratia marcescens haemolysin into human erythrocyte membranes. Mol. Microbiol., V. 3, P.445-453.

172. Schnepf E., Crickmore N., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., Feitenson J., Zeigler D.R., Dean D.H. (1998) Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal protein. Microbiol. Mol. Biol. Rev., V. 62, P. 775-806.

173. Schoeni J.L. and Wong A.C. (2005) Bacillus cereus food poisoning and its toxins. J. Food Prot.,W.68, P. 636-648.

174. Schuerch D. W., Wilson-Kubalek E. M. and Tweten R. K. (2005) Molecular basis of listeriolysin О рН dependence. PNAS, V. 102, N. 35, P. 12537-12542.

175. Scott D.E. and Silhavy T.J. (1982) Molecular components of the signal sequence that function in the initiation of protein export. J. Cell Biol., V. 95, P. 689-696.

176. Sekiya K., Satoh R., Danbara H., Futaesaku Y. (1993) A ring-shaped structure with a crown formed by streptolysin О on the erythrocyte membrane. J. Bacteriol., V. 157, P. 5953-5961.

177. Shannon J.G., Ross C.L., Koehler T.M., Rest R.F. (2003) Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin. Infect. Immun., V. 71, P. 3183-3189.

178. Shewen P.E. and Wilkie B.N. (1982) Cytotoxin of Pasteurella haemolytica acting on bovine leukocytes. Infect. Immun., V. 35, P. 91-94.

179. Shimada Y., Maruya M., Iwashita S., Ohno-Iwashita Y. (2002) The C-terminal domain of perfringolysin О is an essential cholesterol-binding unit targeting to cholesterol-rich microdomains. Eur. J. Biochem., V. 269, P. 6195-6203.

180. Shinagawa K., lchikawa K., Matsusaka N., Sugii S. (1991) Purification and some properties of a Bacillus cereus mouse lethal toxin. J. Vet. Med. Sci., V. 53, P. 469-474.

181. Simonen M. and Palva I. (1993) Protein secretion in Bacillus species. Microbiol. Rev., V. 57, P. 109-137.

182. Smith NR, Gordon RE, and Clark FE. (1952) In Aerobic Spore-forming Bacteria, 56-67. Washington, DC: US Department of Agriculture.

183. Song L., Hobaugh M.R., Shustak C., Cheley S., Bayley H., Gouaux J.E. (1996) Structure of staphylococcal a-hemolysin, a heptameric transmembrane pore. Science, V. 274, P. 1859-1866.

184. Souckova A. and Soucek A. (1972) Inhibition of the hemolytic action of a and (5 lysins of Staphylococcus pyogenes by Corynebacterium hemolyticum, C. ovis and C. ulcerans. Toxicon, V. 10, P. 501-509.

185. Steinthorsdottir V., Halldorsson H., Andresson O.S. (2000) Clostridium perfringens beta-toxin forms multimeric transmembrane pores in human endothelian cells. Microb. Pathog., V. 28, P. 45-50.

186. Stevens D.L., Troyer B.E., Merrick D.T., Mitten J.E., Olson R.D. (1988) Lethal effects and cardiovascular effects of purified a and 0 toxins. J. Infect. Dis., V. 157, P. 272-279.

187. Stoebner J.A. and Payne S.M. (1988) Iron-regulated hemolysin production and utilization of heme and hemoglobin by Vibrio cholerae. Infect. Immun., V. 56, P. 2891-2895.

188. Sugahara Т., Takahashi Т., Yamaya S., Ohsaka A. (1977) Vascular permeability increase by a-toxin (phospholipase C) of Clostridium perfringens. Toxicon, V. 15, P. 81-87.

189. Sugavara N., Tomita T. and Kamio Y. (1997) Assembly of Staphylococcus aureus y-hemolysin into pore-forming ring-shaped complex on the surfase of human erythrocytes. FEBS Lett., V. 410, P. 333-337.

190. Takahashi Т., Sugahara T. and Ohsaka A. (1981) Phospholipase С from Clostridium perfringens. Methods Enzymoi, V. 71., P. 710-725.

191. Thompson N.E., Ketterhagen M.J., Bergdoll M.S., Schantz EJ. (1984) Isolation and some properties of an enterotoxin produced by Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 43, P. 887-894.

192. Tilley S. J., Orlova E. V., Gilbert R. J.C., Andrew P. W. and Saibil H. R. (2005) Structural Basis of Pore Formation by the Bacterial Toxin Pneumolysin. Cell, V. 121, P. 247-256.

193. Titball R.W. (1993) Bacterial phospholipases C. Microbiol. Rev., V. 57, P. 347-366.

194. Tomita M., Taguchi I.R., Ikezava H. (1991) Sphingomyelinase of Bacillus cereus as a bacterial hemolysin. J. Toxicol.-Toxin Rev., V. 10, P. 169-207.

195. Tomita Т. and Kamio Y. (1997) Molecular biology of the pore-forming cytolysins from Staphylococcus aureus, a- and y-hemolysins and leukocidin. Biosci. Biotech. Biochem., V. 61, P. 565-572.

196. Trees D.L. and Morse S.A. (1995) Chancroid and Haemophilus ducreyi: an update. Clin. Microbiol. Rev., V. 8, P. 357-375.

197. Turnbull P.C. and Kramer J.M. (1991) Bacillus. P. 296-303. Manual of clinical microbiology, 5th ed., Balows A., Hausler W.J., Herrmann K.L., Isenberg H.D., Shadomy H.J. (eds.), American Society for Microbiology, Washington, D.C.

198. Turnbull P.C., Kramer J.M., Jorgensen K., Gilbert R.J., Melling J. (1979) Properties and production characteristics of vomiting, diarrheal, and necrotizing toxins of Bacillus cereus. Amer. J. Clin. Nutr., V. 32, P. 219-228.

199. Turnbull P.C.B. (1986) Bacillus cereus toxins. P. 397-448. Pharmacology of Bacterial Toxins, Dorner F. and Drews J., (eds.), Pergamon Press, Oxford.

200. Tweten R.K. (1988) Nucleotide sequence of the gene for perfringolysin О (theta-toxin) from Clostridium perfringens: significant homology with the genes for streptolysin О and pneumolysin. Infect. Immun., V. 56, P. 3235-3240.

201. Valeva A., Weisser A., Walker В., Kehoe M., Bayley H., Bhakdi S., Palmer M. (1996) Molecular architecture of a toxin pore: A 15-residue sequence lines the transmembrane channel of staphylococcal a-toxin. EMBO J., V. 15, P. 1857-1864.

202. Viero G., Cunaccia R., Prevost G., Werner S., Monteil H., Keller D., Joubert O., Menestrina G., Dala Serra M. (2006) Homologous versus heterologous interactions in the bicomponent staphylococcal gamma-haemolysin pore. Biochem J., V. 394, P. 217-225.

203. Waite M. (1987) The phospholipases. Handbook of lipid reseach, V. 5, Hanahan D.J. (ed.), Plenum Press, New York, London.

204. Wallner B. and Elofsson A. (2005) All are not equal: a benchmark of different homology modeling programs. Protein Sci, V. 14, P. 1315-1327.

205. Welch R.A. (1991) Pore-forming cytolysins of Gram-negative bacteria. Mol. Microbiol., V. 5, P.521-528.

206. Yamane K., Bunai K., Kakeshita H. (2004) Protein traffic for secretion and related machinery of Bacillus subtilis. Biosci. Biotechnol. Biochem., V. 68, P. 2007-2023.

207. Ye Y. and Godzik A. (2003) Flexible structure alignment by chaining aligned fragment pairs allowing twists. Bioinformatics, V. 19, Suppl 2, P. 246-255.

208. Yeh C.J., Hsi B.L. and Faulk W.P. (1981) Propidium iodide as a nuclear marker in immunofluorescence. II. Use with cellular identification and viability studies. J Immunol Methods, V. 43, P. 269-275.

209. Yuan Z., Hansen B.M., Andrup L., Eilenberg J. (2002) Detection of enterotoxin genes in mosquito-larvicidal Bacillus species. Curr. Microbiol., V. 45, P. 221-225.

210. Бицаев A.P. и Езепчук Ю.В. (1987) Молекулярная природа патогенного действия, вызываемого Bacillus cereus. Мол. Генет. Микробиол. Вирусол., N 7, С. 18-23.

211. Гловер Д. (1988) Клонирование ДНК. Методы. Мир, Москва, 538 с. (перевод с английского).

212. Дарбре А. (1989) Практическая химия белка. Мир, Москва, 623 с. (пер. с англ.).

213. Дерябин Д. Г. (2000) Стафилококки: Экология и патогенностъ. Екатеринбург: УрО РАН, 240 с.

214. Добош Д. (1980) Электрохимические константы. Мир, Москва, 365с.

215. Зайцев Е.Н., Зайцева Е.М., Бакланова И.В., Горелов В.Н., Кузьмин Н.П., Крюков В.М., Ланцов В.А. (1986) Клонирование и секвенирование гена reck из штамма Pseudomonas aeruginosa. Генетика, Т. 22, С. 2721-2727.

216. Мазин А.В., Кузнеделов К.Д., Краев А.С., Холодилов Н.Г. и др.(1990) Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Наука, Новосибирск, 248 с.

217. Маниатис Т., Фриш Э., Сэмбрук Д. (1984) Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Мир, Москва, 480с.

218. Маурер Г. (1971) Диск-электрофорез. Мир, Москва, 248с.

219. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. (1991) Методы иммунохгшического анализа в биологии развития. Наука, Москва, 288 с.

220. Михалева Н.И., Золов С.Н., Сузина Н.Е., Мелкозернов А.Н., Несмеянова М.А. (1995) Проницаемость внешней мембраны Escherichia coli для ионов этидия и периплазменной щелочной фосфатазы при ее повышенном синтезе. Биохимия, Т. 60, С. 1161-1170.

221. Михалева Н.И., Калинин А.Е., Молотковский Ю.Г., Несмеянова М.А. (1997) Взаимодействие предшественника щелочной фосфотазы Е. coli с искусственными фосфолипидными мембранами. Биохимия, Т.62., Вып.2, С. 217-224.

222. Остерман JI.A. (1985) Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Наука, Москва, 536 с.

223. Синев М.А., Бударина Ж.И. (1993) Доказательство существования гемолизина II B.cereus. Клонирование генетической детерминанты гемолизина II. Молекулярная биология, Т. 27, Вып. 6, С.1218-1229.

224. Скоупс Р. (1985) Методы очистки белков. Мир, Москва (перевод с английского).

225. Сомов Г.П., Варвашевич Т.Н., Тимченко Н.Ф. (1991) Психрофилъностъ патогенных бактерий. Новосибирск: Наука, 204 с.

226. Строганов Н.С., Колосова JI.B. (1971) Ведение лабораторной культуры и определение плодовитости дафний в ряде поколений. Сборник Методики биологич. исслед. по водн. коксикол, Москва: Наука, С.210.

227. Шадрин A.M., Шапырина Е.В., Сиунов А.В., Солонин А.С. (2007) Пороформирующие токсины Bacillus cereus гемолизин II и цитотоксин К: полиморфизм и распределение генов среди представителей цереусной группы. Микробиология, Т. 76, №4, С. 1-9.

228. Юдина Т.Г. и Бурцева Л.И. (1997) Действие 5-эндотоксинов четырех подвидов Bacillus thuringiensis на различных прокариот. Микробиология, Т. 66, С. 25-31.1. Благодарности

229. Автор очень благодарна своему соруководителю Терновскому Вадиму Игоревичу за советы, идеи, за помощь в подготовке к защите.

230. Автор очень благодарна своим оппонентам Харакозу Дмитрию Петровичу и Азизбекяну Рудольфу Рубеновичу. Также благодарна ученому секретарю Диссертационного совета Заиграевой Галине Григорьевне.