Пространственная структура транскрипционного регулятора HlyIIR B. Cereus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Ковалевский, Олег Владимирович

• Ковалевский, Олег Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ковалевский, Олег Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bacillus cereus - микроорганизм, условно-патогенный для человека

1.1. Гемолизины Bacillus cereus

1.1.1. Гемолизины, имеющие ферментативный механизм действия

1.1.2. порообразующие гемолизины

1.2. Регуляция экспрессии генов токсинов в. cereus

1.2.1. Глобальный регулятор PlcR

1.2.2. Плейотропный регулятор Fur

1.2.3. HlyIIR - специфичный регулятор гена гемолизина II

1.3. Семейство транскрипционных регуляторов TetR

1.3.1. TetR - регулятор гена устойчивости к тетрациклину

1.3.2. QacR - регулятор, контролирующий процесс множественной лекарственной устойчивости

1.3.3. Другие белки TetR семейства с известной пространственной структурой

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы

2.1.1. Штаммы бактерий и плазмидные векторы

2.1.2. Среды и основные буферы ^

2.1.3. Материалы и реактивы.

2.2. Методы исследования 57 2.2.1. Получение компетентных клеток е. coli

2.2.2. Трансформация компетентных клеток

2.2.3. Проведение реакций модификации ДНК

2.2.4. Выделение плазмидной ДНК

2.2.5. Приготовление олигонуклеотидов

2.2.6. Амплификация ДНК с помощью ПЦР

2.2.7. Сайт-направленнь'ш мутагенез

2.2.8. Электрофорез в полиакриламидном геле и агарозе

2.2.9. Очистка белка НьуНК

2.2.9.1. Очистка НьуШ1 с гистидиновым тэгом по обычной методике

2.2.9.2. Очистка НьуШ1 с гистидиновым тэгом по модифицированной методике

2.2.9.3. Очистка НьуШ1 и его мутантных вариантов с отщепляемым тэгом

2.2.10. Продукция селено-метионинового производного белка НьуПЯ.

2.2.11. Проверка связывания НьуГШ. и его мутантов с ДНК

2.2.12. Аналитическая гель-фильтрация

2.2.13. Аналитическое ультрацентрифугирование

2.2.14. Химическая сшивка глутаровым альдегидом

2.2.15. Определение /?-галактозидазной активности

2.2.16. Приготовление комплексов НьуПЯ с ДНК для кристаллизации

2.2.17. Кристаллизация белка НьуПЯ, его мутантов и комплексов с ДНК

2.2.18. Сбор дифракционных данных, определение и уточнение структур

2.2.19. Виртуальный скрининг библиотеки лигандов

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение олигомерной формы НьуПЯ в растворе

2. Определение олигомерной формы НьуНК при взаимодействии с оператором

3. Кристаллизация и рентгеноструктурный анализ белка НьуПЯ

4. Анализ пространственной структуры белка НьуНЯ

5. Кристаллизация комплекса НьуИЯ и операторной ДНК

6. Улучшение кристаллизационных свойств НьуИЯ с помощью направленного мутагенеза

7. Мутанты НьуИЯ с заменой области а.к. 170-185 на удлиненный линкер

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пространственная структура транскрипционного регулятора HlyIIR B. Cereus»

Актуальность работы. Одной из основных задач современной молекулярной биологии является всестороннее изучение процесса экспрессии генетической информации. Современные данные свидетельствуют о том, что экспрессия подавляющего большинства генов регулируется на многих уровнях, тончайшая настройка всех клеточных систем в соответствии с потребностями клетки обеспечивается функционированием сложных многокомпонентных регуляторных сетей. Новое направление молекулярно-генетических исследований - геномика, пытается одновременно рассматривать все гены организма в качестве единой динамической системы, компоненты которой, формируя генные сети, взаимодействуют друг с другом в пространстве и времени. Программой-максимумом функциональной геномики можно считать установление функциональных взаимоотношений между всеми взаимодействующими генами организма, познание фундаментальных отношений между генотипом и фенотипом (Патрушев, 2004). В случае прокариотических организмов основная часть регуляторных воздействий, определяющих экспрессию генетической информации, приходится на уровень транскрипции, поэтому всестороннее, в том числе структурно-функциональное, изучение белковых транскрипционных регуляторов является приоритетной фундаментальной задачей молекулярной биологии прокариот.

Следует отметить, что данная фундаментальная задача так же имеет огромную практическую ценность в случае изучения регуляции синтеза факторов патогепности микроорганизмов, ведь патогенные свойства бактерий определяются не только наличием в их геномах структурных генов токсинов, но и в значительной мере особым контролем экспрессии этих генов. Понимание логики, лежащей в основе ответа микроорганизма на изменение условий среды, проявляющейся, например, в виде скоординированного запуска синтеза токсинов, позволит более эффективно бороться с патогенными бактериями и проводить терапию вызванных ими заболеваний.

В настоящее время активно изучаются генетические системы, контролирующие синтез бактериальных факторов патогенности. Для ряда патогенных микроорганизмов выявлены гены, белковые продукты которых, выступая в роли позитивных или негативных плейотропных регуляторов, контролируют экспрессию целых комплексов из десятков генов, определяющих патогенные свойства бактерий. Наряду с этим обнаружена и более специфическая регуляция, когда белок-регулятор контролирует экспрессию одного или малого числа генов вирулентности, определяя тем самым тонкие особенности патогенного процесса. Эти исследования заслуживают самого серьезного внимания, поскольку их результаты представляют не только фундаментальный научный интерес, но и важны в практическом плане, для повышения эффективности и разработки новых схем терапии инфекционных заболеваний.

Bacillus cereus - широко распространенный грам-положительный, спорообразующий, условно-патогенный для человека микроорганизм. Некоторые штаммы В.cereus могут вызывать пищевые отравления, пост-травматические инфекции, а также другие заболевания. Патогенные свойства B.cereus определяются синтезом многочисленных белковых токсинов, различающихся по механизму действия на ферментативные (например, сфингомиелиназа и др.) и порообразующие (гемолизин BL, гемолизин II и др.). В настоящее время в научной литературе охарактеризованпо всего три регулятора, контролирующих экспрессию токсинов B.cereus. Большинство токсинов, экспрессирующихся в начале стационарной фазы роста (фосфолипаза С, цереолизин, негемолитический энтеротоксин Nhe и другие), находятся под контролем позитивного регулятора PlcR (Slamti and Lereclus, 2002). Данный регулятор инициирует синтез токсинов по механизму "quorum sensing". Недавние исследования показали, что мутантный штамм B.cereus с инактивированным геном транскрипционного регулятора Fur проявляет аттенуированный фенотип. Регулятор Fur контролирует экспрессию генов, вовлеченных в метаболизм и транспорт железа, но его сайт связывания так же обнаружен в промоторной области гена гемолизина II (Harvie et al., 2005). И, наконец, недавно был описан специфичный транскрипционный регулятор цитотоксина гемолизина II, названый HlyllR (Budarina et al., 2004).

Ген hlylIR , кодирующий белок длиной 201 а.к., в геноме B.cereus находится сразу за геном гемолизина II (hlyll), оба гена являются независимыми транскрипционными единицами. Проведенные ранее эксперименты в гетерологичных системах in vivo показали, что присутствие hlylIR снижает уровень экспрессии гена гемолизина II (Budarina et al., 2004). Добавление белка HlylIR значительно ингибировало транскрипцию с промотора гемолизина II in vitro. Было показано, что HlylIR является специфичным ДНК-связывающим белком, связывающим область длиной 44 п.н. в районе промотора гена hlyll. При этом на промоторно-операторном сегменте гена hlyll HlylIR образует тройной комплекс с РНК-полимеразой и снижает уровень транскрипции гена гемолизина II путем ингибирования изомеризации закрытого промоторного комплекса в открытый (Budarina et al., 2004).

Следует отметить важность работ по выяснению деталей функционирования транскрипционных регуляторов, контролирующих синтез токсинов B.cereus, ведь они закладывают основы нашего понимания логики принятия решений патогенными микроорганизмами, а значит, в перспективе, позволят более эффективно проводить терапию вызванных ими заболеваний.

Цели и задачи исследования:

Целью настоящей работы являлось детальное изучение структуры транскрипционного регулятора HlylIR B.cereus. Для достижения указанной цели последовательно ставились следующие задачи:

• определение олигомерной формы HlylIR в растворе и в бактериальной клетке, как в свободном состоянии, так и при взаимодействии с оператором;

• получение кристаллов HlylIR и экспериментальное определение его пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа;

• анализ структуры HlylIR и выявление структурно и функционально важных областей с помощью направленного мутагенеза, экспериментальное определение структур мутантов;

• кристаллизация комплекса HlylIR с операторной ДНК.

Данная работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Научная новизна работы. Впервые определена пространственная структура транскрипционного регулятора, участвующего в контроле синтеза токсинов B.cereus^ установлено, что белок HlylIR в растворе и при взаимодействии с ДНК, in vitro и in vivo существует в виде димера. Впервые получены данные, указывающие на возможное участие стероидных производных в регуляции экспрессии гена гемолизина II, и показана способность мутантного варианта белка TetR-семейства к образованию альтернативного димера.

Координаты атомов транскрипционного регулятора HlylIR и его мутантов, определенные методом рентгеноструктурного анализа, занесены в Protein Data Bank (коды PDB 2FX0, 2JJ7 и 2JK3).

Практическое значение работы. Определение структуры HlylIR создает основу для понимания молекулярной логики регуляции экспрессии гена гемолизина II B.cereus, а точная идентификация низкомолекулярного лиганда, взаимодействующего с HlylIR, может оказаться важной для терапии инфекций и пищевых отравлений, вызванных данным микроорганизмом. Выявление неожиданной способности мутанта HlylIR образовывать альтернативный димер представляет интерес с фундаментальной точки зрения, для углубления нашего понимания деталей белок-белковых взаимодействий и образования четвертичной структуры белка.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Ковалевский, Олег Владимирович

выводы

1. Белок HlylIR в растворе и в бактериальной клетке существует в виде гомодимера. Два димера HlylIR взаимодействуют с операторным участком гена гемолизина II независимо.

2. Получены кристаллы HlylIR и методом рентгеноструктурного анализа определена его пространственная структура с разрешением 2,4 Â. Установлено, что HlylIR имеет пространственную укладку, характерную для TetR семейства репрессоров.

3. В структуре HlylIR обнаружен гидрофобный лиганд-связывающий карман объемом 550 Ä3. Компьютерный анализ библиотеки лигандов показал, что HlylIR потенциально способен связывать молекулы массой —400-500 Да, возможно являющиеся стероидными производными.

4. Получены обладающие улучшенными кристаллизационными свойствами мутантные формы HlylIR с заменами в неупорядоченной области с 170 по 185 аминокислотный остаток. Пространственные структуры двух мутантных белков определены методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 2,1 Â и 2,2 Â. Выявлена способность одного из этих белков к образованию альтернативного димера.

5. Установлена роль сегмента HlylIR с 161 по 169 аминокислотный остаток в поддержании нативной структуры белка.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ковалевский, Олег Владимирович, 2008 год

1. Agaisse, Н., Gominet, М., Okstad, О. A., Kolsto, А. В., Lereclus, D. (1999) PlcR is а pleiotropic regulator of extracellular virulence factor gene expression in Bacillus thuringiensis. Mol Microbiol, 32,1043-53.

2. Agata, N., Ohta, M., Mori, M., Isobe, M. (1995) A novel dodecadepsipeptide, cereulide, is an emetic toxin of Bacillus cereus. FEMS Microbiol Lett, 129, 17-20.

3. Andreeva, Z. I., Nesterenko, V. F., Yurkov, I. S., Budarina, Z. I., Sineva, E. V., Solonin, A. S. (2006) Purification and cytotoxic properties of Bacillus cereus hemolysin II. Protein Expr Pur if, 47, 186-93.

4. Baida, G., Budarina, Z. I., Kuzmin, N. P., Solonin, A. S. (1999) Complete nucleotide sequence and molecular characterization of hemolysin II gene from Bacillus cereus. FEMS Microbiol Lett, 180, 7-14.

5. Baida, G. E., Kuzmin, N. P. (1995) Cloning and primary structure of a new hemolysin gene from Bacillus cereus. Biochim Biophys Acta, 1264, 151-4.

6. Baida, G. E., Kuzmin, N. P. (1996) Mechanism of action of hemolysin III from Bacillus cereus. Biochim Biophys Acta, 1284, 122-4.

7. Baulard, A. R., Betts, J. C., Engohang-Ndong, J., Quan, S., McAdam, R. A., Brennan, P. J., Locht, C., Besra, G. S. (2000) Activation of the pro-drug ethionamide is regulated in mycobacteria. J Biol Chem, 275, 28326-31.

8. Beecher, D. J., MacMillan, J. D. (1990) A novel bicomponent hemolysin from Bacillus cereus. Lnfect Immun, 58, 2220-7.

9. Beecher, D. J., Macniillan, J. D. (1991) Characterization of the components of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect Lmmun, 59, 1778-84.

10. Beecher, D. J., Schoeni, J. L., Wong, A. C. (1995) Enterotoxic activity of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect Immun, 63, 4423-8.

11. Beecher, D. J., Wong, A. C. (1994) Improved purification and characterization of hemolysin BL, a hemolytic dermonecrotic vascular permeability factor from Bacillus cereus. Infect Immun, 62, 980-6.

12. Beecher, D. J., Wong, A. C. (1997) Tripartite hemolysin BL from Bacillus cereus. Hemolytic analysis of component interactions and a model for its characteristic paradoxical zone phenomenon. J Biol Chem, 272, 233-9.

13. Bernheimer, A. W., Grushoff, P. (1967) Cereolysin: production, purification and partial characterization. J Gen Microbiol, 46, 143-50.

14. Bernheimer, A. W., Grushoff, P. (1967) Extracellular hemolysins of aerobic sporogenic bacilli. J Bacteriol, 93, 1541-3.

15. Bhakdi, S., Bayley, H., Valeva, A., Walev, I., Walker, B., Kchoe, M., Palmer, M. (1996) Staphylococcal alpha-toxin, streptolysin-O, and Escherichia coli hemolysin: prototypes of pore-forming bacterial cytolysins. Arch Microbiol, 165, 73-9.

16. Bowman, M. N., Ottolenghi, A. C., Mengel, C. E. (1971) Effects of phospholipase C on human erythrocytes. J. Membr. Biol., 4, 156-164.

17. Bragg, P. D., Hou, C. (1986) Chemical crosslinking of alpha subunits in the F1 adenosine triphosphatase of Escherichia coli. Arch Biochem Biophys, 244, 361-72.

18. Budarina, Z. I., Sinev, M. A., Mayorov, S. G., Tomashevski, A. Y., Shmelev, I. V., Kuzmin, N. P. (1994) Hemolysin II is more characteristic of Bacillus thuringiensis than Bacillus cereus. Arch Microbiol, 161, 252-7.

19. Callegan, M. C., Kane, S. T., Cochran, D. C., Gilmore, M. S., Gominet, M., Lereclus, D. (2003) Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infect Immun, 71,3116-24.

20. Carlson, C. R., Caugant, D. A., Kolsto, A. B. (1994) Genotypic Diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Strains. Appl Environ Microbiol, 60, 1719-1725.

21. Carlson, C. R., Johansen, T., Kolsto, A. B. (1996) The chromosome map of Bacillus thuringiensis subsp. canadensis HD224 is highly similar to that of the Bacillus cereus type strain ATCC 14579. FEMSMicrobiol Lett, 141, 163-7.

22. CCP4. (1994) The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 50, 760-3.

23. Coolbaugh, J. C., Williams, R. P. (1978) Production and characterization of two hemolysins of Bacillus cereus. Can J Microbiol, 24, 1289-95.

24. Coy, M., Neilands, J. B. (1991) Structural dynamics and functional domains of the fur protein. Biochemistry, 30, 8201-10.

25. De Silva, R. S., Kovacikova, G., Lin, W., Taylor, R. K., Skorupski, K., Kull, F. J. (2007) Crystal structure of the Vibrio cholerae quorum-sensing regulatory protein IiapR. J Bacteriol, 189,5683-91.

26. Di Lallo, G., Ghelardini, P., Paolozzi, L. (1999) Two-hybrid assay: construction of an Escherichia coli system to quantify homodimerization ability in vivo. Microbiology, 145 ( Pt 6), 1485-90.

27. Drobniewski, F. A. (1993) Bacillus cereus and related species. Clin Microbiol Rev, 6, 324-38.

28. Emsley, P., Cowtan, K. (2004) Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 60, 2126-32.

29. Fagerlund, A., Ween, O., Lund, T., Hardy, S. P., Granum, P. E. (2004) Genetic and functional analysis of the cytK family of genes in Bacillus cereus. Microbiology, 150, 2689-97.

30. Fedhila, S., Daou, N., Lereclus, D., Nielsen-LeRoux, C. (2006) Identification of Bacillus cereus internalin and other candidate virulence genes specifically induced during oral infection in insects. Mol Microbiol, 62, 339-55.

31. Fiser, A., Do, R. K., Sali, A. (2000) Modeling of loops in protein structures. Protein Sci, 9, 1753-73.

32. Fossum, K. (1963) Separation of Hemolysin and Egg Yolk Turbidity Factor in Cell-Free Extracts of Bacillus Cereus. Acta Pathol Microbiol Scand, 59, 400-6.

33. Frenois, F., Engohang-Ndong, J., Locht, C„ Baulard, A. R., Villeret, V. (2004) Structure of EthR in a ligand bound conformation reveals therapeutic perspectives against tuberculosis. Mol Cell, 16,301-7.

34. Gominet, M., Slamti, L., Gilois, N., Rose, M., Lereclus, D. (2001) Oligopeptide permease is required for expression of the Bacillus thuringiensis plcR regulon and for virulence. Mol Microbiol, 40, 963-75.

35. Granum, P.' E. 2002. Bacillus cereus and food poisoning. Applications and systematics of Bacillus and relatives. 37-46.

36. Granum, P. E., Lund, T. (1997) Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol Lett, 157,223-8.

37. Grkovic, S., Brown, M. H., Roberts, N. J., Paulsen, I. T., Skurray, R. A. (1998) QacR is a repressor protein that regulates expression of the Staphylococcus aureus multidrug efflux pump QacA. J Biol Chem, 273, 18665-73.

38. Grkovic, S., Brown, M. H., Schumacher, M. A., Brennan, R. G., Skurray, R. A. (2001) The staphylococcal QacR multidrug regulator binds a correctly spaced operator as a pair of dimers. JBacteriol, 183, 7102-9.

39. Grkovic, S., Hardie, K. M., Brown, M. I I., Skurray, R. A. (2003) Interactions of the QacR multidrug-binding protein with structurally diverse ligands: implications for the evolution of the binding pocket. Biochemistry, 42, 15226-36.

40. Gu, R., Li, M., Su, C. C., Long, F., Routh, M. D., Yang, F., McDermott, G., Yu, E. W. (2008) Conformational change of the AcrR regulator reveals a possible mechanism of induction. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 64, 584-8.

41. Gu, R., Su, C. C., Shi, F., Li, M., McDermott, G., Zhang, Q., Yu, E. W. (2007) Crystal structure of the transcriptional regulator CmeR from Campylobacter jejuni. J Mol Biol, 372, 58393.

42. Hantke, K. (2001) Iron and metal regulation in bacteria. Curr Opin Microbiol, 4, 172-7.

43. Harvie, D. R., Vilchez, S., Steggles, J. R., Ellar, D. J. (2005) Bacillus cereus Fur regulates iron metabolism and is required for full virulence. Microbiology, 151, 569-77.

44. Hayward, S., Lee, R. A. (2002) Improvements in the analysis of domain motions in proteins from conformational change: DynDom version 1.50. JMol Graph Model, 21, 181-3.

45. Hillen, W., Berens, C. (1994) Mechanisms underlying expression of TnlO encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol, 48, 345-69.

46. Hinrichs, W., Kisker, C., Duvel, M., Muller, A., Tovar, K., Hillen, W., Saenger, W. (1994) Structure of the Tet repressor-tetracycline complex and regulation of antibiotic resistance. Science, 264, 418-20.

47. Hirata, T., Saito, A., Nishino, K., Tamura, N., Yamaguchi, A. (2004) Effects of effluxitransporter genes on susceptibility of Escherichia coli to tigecycline (GAR-936). Antimicrob Agents Chemother, 48, 2179-84.

48. Holm, L., Sander, C. (1998) Touring protein fold space with Dali/FSSP. Nucleic Acids Res, 26,316-9.

49. Hsueh, Y. H., Somers, E. B., Lereclus, D., Ghelardi, E., Wong, A. C. (2007) Biosurfactant production and surface translocation are regulated by PlcR in Bacillus cereus ATCC 14579 under low-nutrient conditions. Appl Environ Microbiol, 73, 7225-31.

50. Hsueh, Y. H., Somers, E. B., Lereclus, D., Wong, A. C. (2006) Biofilm formation by Bacillus cercus is influenced by PlcR, a pleiotropic regulator. Appl Environ Microbiol, 72, 508992.

51. Hu, J. C., O'Shea, E. K., Kim, P. S., Sauer, R. T. (1990) Sequence requirements for coiled-coils: analysis with lambda repressor-GCN4 leucine zipper fusions. Science, 250, 1400-3.

52. Ikezawa, H., Mori, M., Ohyabu, T., Taguchi, R. (1978) Studies on sphingomyelinase of Bacillus cereus. I. Purification and properties. Biochim Biophys Acta, 528, 247-56.

53. Ikezawa, H., Mori, M., Taguchi, R. (1980) Studies on sphingomyelinase of Bacillus cereus: hydrolytic and hemolytic actions on erythrocyte membranes. Arch Biochem Biophys, 199, 572-8.

54. Jacob, F., Monod, J. (1964) Biochemical and Genetic Mechanisms of Regulation in the Bacterial Cell. Bull Soc Chim Biol (Paris), 46, 1499-532.

55. Jobling, M. G., Holmes, R. K. (1997) Characterization of hapR, a positive regulator of the Vibrio cholerae HA/protease gene hap, and its identification as a functional homologue of the Vibrio harveyi luxR gene. Mol Microbiol, 26, 1023-34.

56. Johnson, C. E., Bonventre, P. F. (1967) Lethal toxin of Bacillus cereus. I. Relationships and nature of toxin, hemolysin, and phospholipase. J Bacteriol, 94, 306-16.

57. Kaneko, M., Yamaguchi, A., Sawai, T. (1985) Energetics of tetracycline efflux system encoded by TnlO in Escherichia coli. FEBSLett, 193, 194-8.

58. Kisker, C., Hinrichs, W., Tovar, K., Hillen, W., Saenger, W. (1995) The complex formed between Tet repressor and tetracycline-Mg2+ reveals mechanism of antibiotic resistance. J Mol Biol, 247, 260-80.

59. Kotiranta, A., Lounatmaa, K., Haapasalo, M. (2000) Epidemiology and pathogenesis of Bacillus cereus infections. Microbes Infect, 2, 189-98.

60. Kovacikova, G., Skorupski, K. (2002) Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol Microbiol, 46, 1135-47.

61. Kramer, J. M., Gilbert, R. J. (1989) Bacillus cereus and other Bacillus species, in Foodborne Bacterial Pathogens, 21-70.

62. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-5.

63. Laskowski, R. A. (1995) SURFNET: a program for visualizing molecular surfaces, cavities, and intermolecular interactions. JMol Graph, 13, 323-30, 307-8.

64. Laskowski, R. A., MacArthur, M. W„ Moss, D. S., Thornton, J. M. (1993) PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst, 26, 283-291.

65. Lereclus, D., Agaisse, H., Grandvalet, C., Salamitou, S., Gominet, M. (2000) Regulation of toxin and virulence gene transcription in Bacillus thuringiensis. Int J Med Microbiol, 290, 295-9.

66. Levy, S. B., McMurry, L. M., Barbosa, T. M., Burdett, V., Courvalin, P., Hillen, W., Roberts, M. C., Rood, J. I., Taylor, D. E. (1999) Nomenclature for new tetracycline resistance determinants. Antimicrob Agents Chemother, 43, 1523-4.

67. Lewin, B. (2004). Genes VIII. pp. 1056 Pearson Education.

68. Li, M., Gu, R, Su, C. C„ Routh, M. D., Harris, K. C., Jewell, E. S., McDermott, G., Yu, E. W. (2007) Crystal structure of the transcriptional regulator AcrR from Escherichia coli. J Mol Biol, 374, 591-603.

69. Lin, J., Akiba, M., Sahin, O., Zhang, Q. (2005) CmeR functions as a transcriptional repressor for the multidrug efflux pump CmeABC in Campylobacter jejuni. Antimicrob Agents Chemother, 49, 1067-75.

70. Lin, J., Cagliero, C., Guo, B., Barton, Y. W., Maurel, M. C., Payot, S., Zhang, Q. (2005) Bile salts modulate expression of the CmeABC multidrug efflux pump in Campylobacter jejuni. J Bacteriol, 187, 7417-24.

71. Lund, T., De Buyser, M. L., Granum, P. E. (2000) A new cytotoxin from Bacillus cereus that may cause necrotic enteritis. Mol Microbiol, 38, 254-61.

72. Lund, T., Granum, P. E. (1999) The 105-kDa protein component of Bacillus cereus non-haemolytic enterotoxin (Nhe) is a metalloprotease with gelatinolytic and collagenolytic activity. FEMS Microbiol Lett, 178, 355-61.

73. Ma, D., Alberti, M., Lynch, C., Nikaido, H., Hearst, J. E. (1996) The local repressor AcrR plays a modulating role in the regulation of acrAB genes of Escherichia coli by global stress signals. Mol Microbiol, 19, 101-12.

74. Manickam, N., Knorr, A., Muldrew, K. L. (2008) Neonatal Meningoencephalitis Caused by Bacillus Cereus. Pediatr Infect Dis J.

75. McMurry, L. M., Oethinger, M., Levy, S. B. (1998) Overexpression of marA, soxS, or acrAB produces resistance to triclosan in laboratory and clinical strains of Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett, 166, 305-9.

76. Miles, G., Bayley, II., Cheley, S. (2002) Properties of Bacillus cereus hemolysin II: a heptameric transmembrane pore. Protein Sci, 11, 1813-24.

77. Miller, M. B., Skorupski, K., Lenz, D. H., Taylor, R. K., Bassler, B. L. (2002) Parallel quorum sensing systems converge to regulate virulence in Vibrio cholerae. Cell, 110, 303-14.

78. Morris, G. M., Goodsell, D. S., Halliday, R. S., Huey, R., Hart, W. E., Belcw, R. K., Olson, A. J. (1998) Automated Docking Using a Lamarckian Genetic Algorithm and and Empirical Binding Free Energy Function. J. Computational Chemistry, 19, 1639-1662.

79. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. (1997) Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 53, 240-55.

80. Natsume, R., Ohnishi, Y., Senda, T., Horinouchi, S. (2004) Crystal structure of a gamma-butyrolactone autoregulator receptor protein in Streptomyces coelicolor A3(2). JMol Biol, 336, 409-19.

81. Neilands, J. B. (1993) Siderophores. Arch Biochem Biophys, 302, 1-3.

82. Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. (1996) AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. JBacteriol, 178, 306-8.

83. Onaka, H., Nakagawa, T., Horinouchi, S. (1998) Involvement of two A-factor receptor homologues in Streptomyces coelicolor A3(2) in the regulation of secondary metabolism and morphogenesis. Mol Microbiol, 28, 743-53.

84. Orth, P., Schnappinger, D., Hillen, W., Saenger, W., Hinrichs, W. (2000) Structural basis of gene regulation by the tetracycline inducible Tet repressor-operator system. Nat Struct Biol, 7, 215-9.

85. Otto, B. R., Sparrius, M., Wors, D. J., de Graaf, F. K., MacLaren, D. M. (1994) Utilization of haem from the haptoglobin-haemoglobin complex by Bacteroides fragilis. Microb Pathog, 17, 137-47.

86. Otwinowski, Z., Minor, W. (1997). Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. In: Methods in Enzymology, Vol. 276: Macromolecular Crystallography, part A, pp. 307-326 Academic Press, New York.

87. Painter, J., Merritt, E. A. (2006) Optimal description of a protein structure in terms of multiple groups undergoing TLS motion. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 62, 439-50.

88. Perrakis, A., Morris, R., Lamzin, V. S. (1999) Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nat Struct Biol, 6, 458-63.

89. Rajkovic, A., Uyttendaele, M., Ombregt, S. A., Jaaskelainen, E., Salkinoja-Salonen, M., Debevere, J. (2006) Influence of type of food on the kinetics and overall production of Bacillus cereus emetic toxin. J Food Prot, 69, 847-52.

90. Ramos, J. L., Martinez-Bueno, M., Molina-Henares, A. J., Teran, W., Watanabe, K., Zhang, X., Gallegos, M. T., Brennan, R., Tobes, R. (2005) The TetR family of transcriptional repressors. Microbiol Mol Biol Rev, 69, 326-56.

91. Ratledge, C., Dover, L. G. (2000) Iron metabolism in pathogenic bacteria. Annu Rev Microbiol, 54, 881-941.

92. Reyes, J. E., Bastias, J. M., Gutierrez, M. R., Rodriguez Mde, L. (2007) Prevalence of Bacillus cereus in dried milk products used by Chilean School Feeding Program. Food Microbiol, 24, 1-6.

93. Salah-Bey, K., Thompson, C. J. (1995) Unusual regulatory mechanism for a Streptomyces multidrug resistance gene, ptr, involving three homologous protein-binding sites overlapping the promoter region. Mol Microbiol, 17, 1109-19.

94. Sambrook, J., Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., pp. 2100 CSHL Press, New York.

95. Schumachcr, M. A., Miller, M. C., Grkovic, S., Brown, M. H., Skurray, R. A., Brennan, R. G. (2001) Structural mechanisms of QacR induction and multidrug recognition. Science, 294, 2158-63.

96. Schumacher, M. A., Miller, M. C., Grkovic, S., Brown, M. H., Skurray, R. A., Brennan, R. G. (2002) Structural basis for cooperative DNA binding by two dimers of the multidrug-binding protein QacR. Embo J, 21, 1210-8.

97. Silva, A. J., Pham, K., Benitez, J. A. (2003) Haemagglutinin/protease expression and mucin gel penetration in El Tor biotype Vibrio cholerae. Microbiology, 149, 1883-91.

98. Sinev, M. A., Budarina Zh, I., Gavrilenko, I. V., Tomashevskii, A., Kuz'min, N. P. (1993) Evidence of the existence of hemolysin II from Bacillus cereus: cloning the genetic determinant of hemolysin II., Mol Biol (Mosk), 27, 1218-29.

99. Slamti, L., Lereclus, D. (2002) A cell-cell signaling peptide activates the PlcR virulence regulon in bacteria of the Bacillus cereus group. Embo J, 21, 4550-9.

100. Smith, A., Hooper, N. I., Shipulina, N., Morgan, W. T. (1996) Heme binding by a bacterial repressor protein, the gene product of the ferric uptake regulation (fur) gene of Escherichia coli. J Protein Chem, 15, 575-83.

101. Stojiljkovic, I., Hantke, K. (1995) Functional domains of the Escherichia coli ferric uptake regulator protein (Fur). Mol Gen Genet, 247, 199-205.

102. Suhre, K., Sanejouand, Y. H. (2004) EINemo: a normal mode web server for protein movement analysis and the generation of templates for molecular replacement. Nucleic Acids Res, 32, W610-4.

103. Takahashi, M., Altschmied, L., Hillen, W. (1986) Kinetic and equilibrium characterization of the Tet repressor-tetracycline complex by fluorescence measurements. Evidence for divalent metal ion requirement and energy transfer. JMol Biol, 187, 341-8.

104. Tauch, A., Puhler, A., Kalinowski, J., Thierbach, G. (2000) TetZ, a new tetracycline resistance determinant discovered in gram-positive bacteria, shows high homology to gramnegative regulated efflux systems. Plasmid, 44, 285-91.

105. Terwilliger, T. C. (2000) Maximum-likelihood density modification. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 56, 965-72.

106. Terwilliger, T. C., Berendzen, J. (1999) Automated MAD and MIR structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 55, 849-61.

107. Titball, R. W. (1993) Bacterial phospholipases C. Microbiol Rev, 57, 347-66.

108. Tomita, M., Taguchi, I. R., Ikezava, H. (1991) Sphingomyelinase of Bacillus cereus as a bacterial hemolysin. J. Toxicol.-Toxin Rev., 10, 169-207.

109. Turnbull, P. 1986. Bacillus cereus toxins. Pharmacology of Bacterial Toxins.

110. Vagin, A., Teplyakov, A. (2000) An approach to multi-copy search in molecular replacement. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 56, 1622-4.

111. Vilas-Boas, G. T., Peruca, A. P., Arantes, O. M. (2007) Biology and taxonomy of Bacillus cereus, Bacillus anthracis, and Bacillus thuringiensis. Can J Microbiol, 53, 673-87.

112. Wadsworth, R. I., White, M. F. (2001) Identification and properties of the crenarchaeal single-stranded DNA binding protein from Sulfolobus solfataricus. Nucleic Acids Res, 29, 91420.

113. Winn, M. D., Isupov, M. N., Murshudov, G. N. (2001) Use of TLS parameters to model anisotropic displacements in macromolecular refinement. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 57, 122-33.

114. Zhao, J., Aoki, T. (1992) Nucleotide sequence analysis of the class G tetracycline resistance determinant from Vibrio anguillarum. Microbiol Immunol, 36, 1051-60.

115. Zhu, J., Miller, M. В., Vance, R. E., Dziejman, M., Bassler, B. L., Mekalanos, J. J. (2002) Quorum-sensing regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc Natl Acad SciUS A, 99, 3129-34.

116. Досон, P., Эллиот, Д., Эллиот, У. (1991) Справочник биохимика. Наука, Москва.

117. Козырев, Д. П., Васинова, Н. А. (2004) Роль железорегулируемых генов в патогенности бактерий. Цитология, 46, 465-73.

118. Мазин, А. В., Кузнеделов, К. Д., Краев, А. С., Холодилов, Н. Г. (1990) Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Наука, Новосибирск.

119. Миллер, Д. (1976) Эксперименты в молекулярной генетике. Наука, Москва.

120. Остерман, Л. А. (1985) Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Наука, Москва.

121. Патрушев, Л. И. (2004) Искусственные генетические системы, (редактор А. И. Мирошников). Наука, М.