Возможности современных технологий клеточного анализа в оценке тромбоцитов и детекции бластных клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.10, кандидат наук Мининкова Анна Игоревна

• Мининкова Анна Игоревна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Мининкова Анна Игоревна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Возможности гематологических анализаторов в оценке различных параметров тромбоцитов

1.2. Современные технологии клеточного анализа в выявлении бластных клеток

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы исследования

2.2 Методы исследования

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Аналитические возможности современных гематологических анализаторов в количественной оценке тромбоцитов

3.1.1 Мониторинг изменения параметров тромбоцитов в течение суток

3.1.2 Анализ результатов подсчета общего количества тромбоцитов тремя методами (PLT-O, PLT-I, ImmPLT) в пределах референтного интервала

3.1.3 Анализ результатов подсчета общего количества тромбоцитов тремя методами (PLT-O, PLT-I, ImmPLT) при тромбоцитопении

3.2 Аналитические возможности современных технологий в детекции бластных клеток

3.2.1 Сравнительный анализ результатов детекции бластных клеток микроскопическим методом и с помощью гематологического анализатора ADVIA 2120/ 2120i

3.2.2 Сравнительный анализ результатов детекции бластных клеток микроскопическим методом и на проточном цитометре с применением технологии CytoDiff

3.3 Мониторинг элиминации бластных клеток и оценка количества ретикулярных тромбоцитов у пациентов ОМЛ

3.3.1 Мониторинг элиминации бластных клеток

3.3.2 Мониторинг общего числа тромбоцитов и количества ретикулярных

тромбоцитов у пациентов с острыми миелоидными лейкозами в восстановительный период

ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДИ- доверительный интервал ИО - истинноотрицательные результаты тестов ИП- истинноположительные результаты тестов КДЛ- клинико-диагностическая лаборатория К2-ЭДТА- К2-этилендиаминотетрауксусная кислота КЭ - коэффициент элиминации бластных клеток ЛП - ложноположительные результаты тестов ЛО - ложноотрицательные результаты тестов Моно - моноциты Нф - нейтрофилы ОЛ - острый лейкоз

ОМБлЛ -острый миелобластный лейкоз ОМЛ - острый миелоидный лейкоз ОММЛ - острый миеломонобластный лейкоз РНК - рибонуклеиновая кислота РТ - ретикулярные (незрелые) тромбоциты MPV - средний объем тромбоцитов PDW - ширина распределения тромбоцитов Bias - среднее разностей

ImmPLT - общее количество тромбоцитов, измеренное иммунологическим методом IRM - международный референсный метод измерения общего количества тромбоцитов

LUC (large unstained cells) - большие неокрашенные клетки PCT - тромбокрит

PLT-I - общее количество тромбоцитов, измеренное импедансным методом PLT-F - общее количество тромбоцитов, измеренное флюоресцентным методом PLT-O - общее количество тромбоцитов, измеренное оптическим методом SD- стандартное отклонение Xn - ни Т-, ни В-бласты (миелобласты)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Развитие новых технологий сопровождается внедрением в практическое здравоохранение высокотехнологичных гематологических анализаторов с широким спектром новых параметров, характеризующие различные клеточные популяции, что требует анализа их клинической значимости. Наиболее актуальным вопросом для мониторинга эффективности терапии онкогематологических заболеваний, протекающих с угнетением гемопоэза и бластозом периферической крови, является контроль восстановления общего количества тромбоцитов и оценка элиминации бластных клеток.

Данные об использовании тромбоцитарных параметров для оценки восстановления тромбоцитопоэза малочисленны и противоречивы [Meintker L., 2017, Dusse L.M. et al., 2015]. Сохраняются вопросы по точности определения тромбоцитарных параметров и по влиянию преаналитических факторов на получение достоверных результатов, что особенно важно при принятии клинического решения о необходимости трансфузии тромбоконцентрата с учетом современных тенденций к централизации лабораторных исследований [Кишкун А.А., 2015, Вавилова Т.В., 2018].

Одной из проблем современной лабораторной диагностики остается выявление бластных клеток. Основополагающим методом диагностики онкогематологического заболевания остается морфологическое исследование препаратов крови и костного мозга с целью выявления бластов [CLSI, H20-A2, 2007; Луговская С.А., Почтарь М.Е., 2016]. Однако проведение химиотерапии сопровождается лейкопенией и низким числом бластных клеток в препаратах. Контроль за элиминацией бластов морфологическим методом становиться невозможен [Kim A.H., Lee W. et al, 2014]. Высокочувствительным методом детекции бластных клеток является проточная цитометрия, позволяющая не только выявлять бласты, но и определять их иммунофенотип. Однако данный метод

дорогостоящий и требует специальной квалификации персонала. Определение абсолютного числа лейкоцитов и подсчет лейкоцитарной формулы являются составной частью одного из самых распространенных исследований в клинико-диагностической лаборатории - общего анализа крови. В связи с тем, что общий анализ крови часто выполняется без визуальной оценки препарата, необходимо оценить технологические возможности гематологических анализаторов в детекции бластных клеток и сигнализации об их появлении. В последние годы появился новый подход к расширенному анализу клеточных популяций периферической крови методом проточной цитометрии - технология Cytodiff (Beckman Coulter, Miami, FL, USA). Применение набора моноклональных антител позволяет не только определять основные субпопуляции лейкоцитов, но и выявлять 4 типа бластных клеток (Xt (Т-бласты), Xb (В-бласты), Xn (миелобласты), Xm (монобласты)) [Kahng J. et al, 2015]. Оценка и определение диагностической ценности новых технологических возможностей анализаторов в детекции бластных клеток позволит в будущем сократить количество пункций костного мозга, проводя мониторинг элиминации бластных клеток на фоне химиотерапии по результатам исследований периферической крови.

Степень разработанности темы исследования

Определение количества тромбоцитов - неотъемлемая часть общего анализа крови. Общий анализ крови - комплексное исследование периферической венозной крови человека, включающее определение количества лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, измерение концентрации гемоглобина в крови, а также расчет ряда индексов. Одним из направлений реформирования лабораторной службы является централизация лабораторных, в том числе и гематологических, исследований. Данные об особенностях условий транспортировки пробирок (способах и времени), направляющихся на общий анализ крови в централизованные лаборатории крайне малочисленные и скудные. Так, в ГОСТ Р 53079.4- 2008 приведены данные только по концентрации гемоглобина и количеству эритроцитов, в методических рекомендациях по централизации клинико-диагностических лабораторий [Кишкун

А.А., Годков М.А., 2013] упоминаются условия транспортировки пробирок, однако не говорится о факторе времени. Рядом авторов было установлено, что стабильность количества тромбоцитов изменяется в зависимости от метода их определения [Daves M. et al, 2015г; Mannuss S., Kohlschein P. et al, 2016]. Также остается открытым вопрос, зависит ли точность определения тромбоцитов от метода, используемого на современных высокотехнологичных гематологических анализаторах. В 2001 г. Международный комитет по стандартизации в гематологии (ICSH) и Международное общество Лабораторной гематологии (ISLH) рекомендовали считать референсным методом подсчета числа тромбоцитов проточную цитометрию с использованием моноклональных антител к рецепторным маркерам СD41 и CD61 [Harrison P, Ault KA, Chapman S et al, 2001]. На сегодняшний момент существует три автоматизированных метода определения числа тромбоцитов (импедансный, оптический, иммунологический). Иммунологический метод наиболее близок к референсному, поскольку в его технологии используются моноклональные антитела к антигену CD61 поверхности тромбоцитов [Briggs, 2007, Grimaldi E, Del Vecchio L et al, 2009 Kim SY, 2010]. Однако основная часть гематологических приборов, которыми оснащены лаборатории, работают по принципам импедансного и/или оптического анализа без использования иммунологического метода. По данным литературы нет точных подтверждений, доказывающих преимущества оптического или импедансного способа подсчета тромбоцитов. Одни авторы говорят о том, что нет разницы между двумя методами [Kim S.Y. с соавт, 2010]. Другие свидетельствуют о том, что в случае тромбоцитопении результаты оптического метода определения количества тромбоцитов лучше коррелируют с методом проточной цитометрии [Tantanate C., Khowawisetsut L., Pattanapanyasat K., 2017, Hummel K., Sachse M., Hoffmann J.J.M.L., van Dun L.P.J.M., 2018].

Одним из новых тромбоцитарных параметров является определение числа ретикулярных (незрелых) тромбоцитов (РТ). Существенный вклад в изучении проблемы агрегации РТ внес Thompson C.B. с группой авторов в 80-е гг XX века. По литературным данным РТ являются функционально активными. До настоящего

времени их количество рассматривается в первую очередь как один из маркеров тромботических осложнений сердечно-сосудистых заболеваний [Hannawi B. et al 2018; Nagareddy P.R. et al.,2018, Murphy S.J.X. et al, 2018]. Данные об использование РТ для оценки восстановления тромбоцитопоэза малочисленные и противоречивые [Meintker L., 2017, Dusse L.M. et al., 2015].

Современные гематологические анализаторы имеют систему флагирования при обнаружении бластных клеток в периферической крови. В специальной литературе упоминается только использование «флагов» в детекции бластных клеток, но не затрагиваются вопросы мониторинга элиминации бластных клеток при ряде заболеваний, их выявления в зависимости от видовой принадлежности [Depoorter M., Goletti S., Latinne D., Defour J., 2015; Rabizadeh E., Pickholtz I. et al, 2015]. В то же время метод проточной цитометрии позволяет быстро и надежно определить линейную принадлежность бластов с помощью моноклональных антител к различным антигенам дифференцировки миелоидной и лимфоидной направленности. Технология Cytodiff™ предназначена для дифференциального подсчета лейкоцитов. Данный метод является многообещающим [Kim A.H., Lee W. et al, 2014; Vazquez R., Roussel M. et al, 2018]. Однако статьи, посвященные работе с технологией Cytodiff™, малочисленны и в них не затрагивается вопрос мониторинга бластных клеток в ходе химиотерапии у гематологических больных.

Цель исследования оценить возможности новых технологических подходов клеточного анализа тромбоцитов и бластных клеток, используемых в гематологических анализаторах и проточных цитометрах.

Задачи исследования

1. Изучить стабильность тромбоцитарных параметров и точность подсчета числа тромбоцитов гематологическими анализаторами с использованием различных технологий у практически здоровых людей и при тромбоцитопении.

2. Изучить особенности выявления бластных клеток гематологическим анализатором, использующим оптический метод и цитохимическую реакцию, а также проточным цитометром с применением технологии Cytodiff™

3. Определить значимость параметров гематологического анализатора и метода проточной цитометрии с использованием технологии Cytodiff™ для оценки элиминации бластных клеток пациентов с острыми миелоидными лейкозами на фоне химиотерапии

4. Исследовать возможности применения параметра относительного числа незрелых (ретикулярных) тромбоцитов как маркера восстановления тромбоцитопоэза у пациентов с острыми миелоидными лейкозоми на фоне химиотерапии.

Научная новизна работы

Данные настоящего исследования во многом сопоставимы с ранее проведенными исследованиями других авторов [Daves M. et al, 2015г; Mannuss S., Kohlschein P. et al, 2016; Meintker L., 2017, Dusse L.M. et al., 2015 Kahng J. и соавт, 2015), но в отличие от указанных работ научной новизной обладают результаты комплексного и динамического исследования тромбоцитарных параметров и числа бластных клеток при остром миелоидном лейкозе, протекающего с угнетением гемопоэза и бластозом периферической крови.

Доказана высокая информативность метода детекции бластных клеток с применением технологии CytodiffTM при первичной диагностике и мониторинге терапии у пациентов с острым миелоидным лейкозом. Чувствительность метода Cytodiff™ к детекции бластных клеток на основе параметра %Xn составляет 85%, специфичность 100%. Это позволяет использовать его для мониторинга терапии острых миелобластных лейкозов (rs=0,798 с морфологическим методом). Однако при остром миеломонобластном лейкозе оценку элиминации бластных клеток рекомендуется проводить по совокупности значений %Xn и %моноцитов (rs=0,606 с морфологическим методом).

Предложен новый критерий оценки эффективности химиотерапии на ранних сроках лечения пациентов с острым миелоидным лейкозом по

коэффициенту элиминации (КЭ) бластов. Достоверное снижение этого показателя более чем в два раза на 4-6 день (КЭ 0,5) проведения индукционного курса химиотерапии выявило высокую корреляцию с достижением полной ремиссии острого миелоидного лейкоза, устанавливаемой на основании Национальных клинических рекомендаций

Предложен и обоснован способ оценки восстановления мегакариоцитопоэза на основе показателя относительного числа ретикулярных тромбоцитов у пациентов с острым миелоидным лейкозом, что позволит снизить частоту переливания тромбоконцентрата при тромбоцитопении, нередко возникающей у таких больных. Результаты исследования установили, что увеличение числа ретикулярных тромбоцитов наблюдается на 7-10 дней раньше увеличения общего количества тромбоцитов (р<0,01) после проведения консолидирующего курса химиотерапии острого миелоидного лейкоза.

Теоретическая и практическая значимость работы Доказанная точность определения количества тромбоцитов оптическим методом при тромбоцитопениях позволит в практической деятельности врачам клинических специальностей сократить количество уточняющих повторных исследований, уменьшить число необоснованных трансфузий. Уточнены временные и температурные факторы, влияющие на стабильность общего количества тромбоцитов, измеренных различными методами, и ряда тромбоцитарных параметров. Применение параметра ретикулярных тромбоцитов может иметь диагностическую значимость для оценки тромбоцитопоэза и его восстановления после химиотерапии.

Выявление бластных клеток и мониторинг их элиминации с помощью современных технологий клеточного анализа позволит оценить эффективность проводимой терапии.

Оценка новых технологий в детекции бластных клеток даст возможность сократить количество пункций костного мозга, мониторируя элиминацию бластных клеток на фоне химиотерапии по результатам исследований периферической, не прибегая к трудоемкому микроскопическому исследованию.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Количество тромбоцитов и тромбоцитарные параметры остаются стабильными в течение суток при комнатной темпратуре +20°С-+22°С. Точность анализа числа тромбоцитов гематологическими анализаторами у практически здоровых людей не зависит от используемой технологии. При тромбоцитопении предпочтительным является использование оптического метода определения количества тромбоцитов.

2. Метод детекции бластных клеток с применением технологии CytodiffTM на проточном цитометре обладает высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с параметром гематологического анализатора оптического типа с применением цитохимической реакцией

3. Параметр %LUC (large unstained cells, крупные неокрашенные клетки) гематологического анализатора оптического типа с применением цитохимической реакцией позволяет мониторировать элиминацию бластов только у пациентов с числом МПО-позитивных бластных клеток менее 30%. Методика детекции бластных клеток с помощью технологии Cytodiff может быть рекомендована для мониторинга выявления бластных клеток в практике, независимо от количества МПО - позитивных бластных клеток.

4. Параметр относительного числа незрелых (ретикулярных) тромбоцитов является маркером восстановления тромбоцитопоэза у пациентов с острыми миелоидными лейкозоми на фоне химиотерапии.

Личный вклад автора Автором самостоятельно проведен анализ современной отечественной и зарубежной литературы по теме диссертационной работы, сформулирована проблема, требующая разрешения, обоснована степень ее разработанности, в связи с чем поставлена следующая цель - оценить возможности новых технологических подходов клеточного анализа тромбоцитов и бластных клеток, используемых в гематологических анализаторах и проточных цитометрах. Для достижения цели автором лично поставлены необходимые задачи. Определен методологический подход, выполнен сбор и анализ клинических и лабораторных данных, проведены

лабораторные исследования, посвященные сравнению методов определения тромбоцитов и выявления бластных клеток, оценены и интерпретированы полученные результаты. Соискателем лично сформирована база данных и проведена статистическая обработка, сформулированы положения, выносимые на защиту, выводы и практические рекомендации, подготовлены публикации по теме выполненной работы.

Степень достоверности результатов

Достоверность результатов основана на рациональном дизайне проведенного исследования, использовании современной лабораторной техники, адекватных группах клинических наблюдений, сформированных с целью оценки диагностической и прогностической ценности исследуемых показателей. При изучении стабильности тромбоцитарных параметров и точности подсчета числа тромбоцитов гематологическими анализаторами с использованием различных технологий у практически здоровых людей и при тромбоцитопении проанализировано в общей сложности 117 образцов венозной крови практически здоровых людей, обследованных в отделении переливания крови ГБУЗ ГКБ им С.П.Боткина ДЗМ, 96 проб от 34 пациентов, госпитализированных с различными гематологическими заболеваниями. При суточном мониторинге тромбоцитарных параметров пробы исследовались в четырех различных аналитических сериях для исключения случайной ошибки. С целью оценки возможности новых технологических подходов клеточного анализа тромбоцитов и бластных клеток, используемых в гематологических анализаторах и проточных цитометрах проведено исследование периферической крови 58 пациентов с первично выявленным острым миелоидным лейкозом в динамике. Всего проанализировано 311 проб.

Для обеспечения доказательности полученных результатов были применены современные инструменты статистического анализа. Статистический анализ результатов исследования проводился на программе GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., США). Для каждого массива данных проведена оценка нормальности распределения с использованием критериев Колмагорова-Смирнова и Шапиро-

Уилки. При нормальном распределении показателей они представлены в виде среднего значения, стандартного отклонения и 95% доверительного интервала и для анализа значимости различий используются параметрические методы. Для сравнения двух групп непрерывных данных с парными выборками применялся парный ^критерий, с независимыми выборками - критерий Стьюдента. В группах непрерывных данных при числе сравниваемых групп 3 и более: с парными выборками - статистический критерий АКОУЛ повторных измерений, с независимыми выборками - дисперсионный анализ АЫОУА. Для выявления взаимосвязи между двумя приблизительно нормально распределенными непрерывными переменными, использовался коэффициент корреляции Пирсона (г). Корреляцию считали сильной при г>0,7; умеренной - при г = 0,5-0,7; слабой- при г<0,5. В случае если распределение результатов не являлось нормальным, то данные представлены в виде медианы, 10% и 90% процентиля и для анализа значимости различий использовались непараметрические методы. Для сравнения двух групп непрерывных данных с парными выборками применялся критерий знаков Уилкоксона; с независимыми выборками - критерий Манна-Уитни. В группах непрерывных данных при числе сравниваемых групп 3 и более: с парными выборками - статистический критерий «однофакторный дисперсионный анализ Фридмана», с независимыми выборками - критерий Краскела-Уоллиса. Для выявления взаимосвязи между двумя непрерывными переменными, не распределенными по нормальному закону, использовался коэффициент ранговой корреляции Спирмена (р). Различия между группами считали статистически значимыми при р<0,05. При сравнении методов измерения количества тромбоцитов и выявления бластных клеток использовались регрессионный анализ с расчетом уравнения линейной регрессии, построение и анализ графиков «остатков» диаграммы рассеивания и метод Бланда-Алтмана.

Внедрение результатов исследования Предложения по применению оптического метода определения количества тромбоцитов при тромбоцитопениях, показателя ретикулярных тромбоцитов в качестве раннего маркера восстановления тромбопоэза, использованию

коэффициента элиминации бластных клеток для мониторинга и оценки эффективности лечения острого миелоидного лейкоза внедрены в клиническую практику ГБУЗ ГКБ им С.П.Боткина ДЗМ (акт внедрения от 20.05.2019).

Полученные результаты включены в учебные планы программ подготовки ординаторов, циклов профессиональной переподготовки и повышения квалификации врачей по направлению «Клиническая лабораторная диагностика» на кафедре клинической лабораторной диагностики ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России (акт внедрения от 29.10.2018).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Возможности современных технологий клеточного анализа в оценке тромбоцитов и детекции бластных клеток»

Апробация работы

Проведение диссертационного исследования одобрено Комитетом по этике научных исследований, протокол №8 от 25 сентября 2018 года.

Апробация диссертационной работы проведена на расширенном заседании кафедры клинической лабораторной диагностики ФГБОУ ДПО РМАНПО 17 июня 2019 г. (Протокол № 03/19). Материалы диссертации доложены и обсуждены на VII научно-практической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» 14 мая 2014 г Москва; на IX межрегиональной научно-практической конференции «Современная лабораторная медицина: эффективность, доступность, качество» 24-25 мая 2016 г Москва, на IV Российском конгрессе лабораторной медицины 3-5 октября 2018г Москва.

По теме диссертации автором опубликовано 11 научных работ, из них в научных рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ - 10 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 таблицами и 36 рисунками. Работа состоит из введения, пяти глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Библиографический указатель включает 121 источник, из которых 16 отечественных и 105 зарубежных авторов.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Возможности гематологических анализаторов в оценке различных

параметров тромбоцитов

Среди параметров общего анализа крови тромбоциты одни из важных клеточных элементов и в тоже время сложных для анализа. Принятие клинического решения о необходимости трансфузии тромбоконцентрата требует достоверных данных о количестве тромбоцитов в периферической крови. С одной стороны, переливание тромбоцитарной массы ассоциируются с высоким риском вирусных инфекций, бактериальной контаминации, аллоиммунизации, увеличивают затраты на лечение пациента, однако, с другой стороны, в случае отказа от переливания увеличивается риск кровотечения. Порог принятия решения о трансфузии тромбоконцентрата различается в разных странах. В Российской Федерации приказом №363 Министерства здравоохранения от 25 ноября 2002 г клинически значимым уровнем тромбоцитов для трансфузии принята концентрация ниже 50х109/л при наличии спонтанных кровотечений [13]. При тромбоцитопении неиммунного генеза снижение тромбоцитов до 20 х109/л и более служит прямым показанием для переливания тромбомассы даже в отсутствии гемморрагических проявлений. Оптимальным режимом переливания тромбоконцентрата является такой, при котором количество тромбоцитов в периферической крови поддерживается на уровне выше 40 х109/л. В странах Европейского союза трансфузионный тромбоцитарный порог, при котором проводятся профилактические переливания тромбоцитов у стабильных пациентов, 10 х109/л [41]. При уровне тромбоцитов ниже 20 х109/л трансфузии проводятся только в случае наличия факторов риска, таких как спленомегалия, недостаток факторов свертывания, быстрое падение числа тромбоцитов в крови, тяжелые кровотечения. Немецкая медицинская ассоциация приводит еще более низкий порог для переливания тромбомассы- 5 х109/л у пациентов с хронической тромбоцитопенией при отсутствии гемморрагических проявлений [111]. В задачи клинико-диагностической лаборатории входит обеспечение достоверного подсчета числа

тромбоцитов через 1 ч и через 24 ч после окончания трансфузии, необходимого для качественного мониторинга эффективности трансфузий тромбоцитов. В настоящее время существует большое разнообразие способов количественного определения тромбоцитов, которые можно разделить на три группы:

1. Прямой метод с использованием камеры Горяева и микроскопа (ручная фазово-контрастная микроскопия);

2. Методы подсчета тромбоцитов в окрашенном мазке крови на 1000 эритроцитов по Фонио и его модификации;

3. Автоматизированные методы (импедансный, оптический, флюоресцентный и иммунологический методы).

Используемые технологии отличаются воспроизводимостью и точностью. Важно определить, какой метод исследования числа тромбоцитов является наиболее точным в условиях тромбоцитопении для оценки их количества. При ложноувеличенном количестве тромбоцитов есть риск отказа от переливания тромбоконцентрата, что может привести к увеличению риска возникновения кровотечений. По данным Joan Cid с соавт при использовании неточных методов измерения количества тромбоцитов процент невыполненных трансфузий в случае, если установленный порог для тромбоцитов 5х109/л составляет 22% и если установленный порог для тромбоцитов 10х109/л - 15%, соответственно [33]. Этот вывод подтверждается и в работах других авторов [89, 106].

В советское время, 70-80-х гг XX века, было принято два унифицированных метода подсчета количества тромбоцитов (Приказ министерства здравоохранения СССР №290 от 11 апреля 1972 г.) [12]:

1. Подсчет тромбоцитов в 1 мкл крови с использованием камеры Горяева (фазово-контрастная микроскопия);

2. Подсчет в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов (метод Фонио)

Международным комитетом по стандартизации в гематологии (The International Council for Standardization in Haematology, ICSH) с 1988г референсным методом для подсчета числа тромбоцитов была признана фазово-контрастная

микроскопия в гемоцитометре [98]. Этот метод был введен в лабораторную практику группой ученых под руководством Brecher G. в 1953 [23]. Однако все выше перечисленные методы являются трудоемкими, субъективными, плохо воспроизводимыми. Высокие коэффициенты вариации (от 10% до 25%) ограничивают их применение в клинической практике [53]. Стоит отдельно подчеркнуть, что точность этих методов ещё более снижается при исследовании количества тромбоцитов в условиях тромбоцитопении. Ошибки при подсчете в мазках крови могут быть обусловлены плохим качеством мазка и неравномерным распределением тромбоцитов, неточным определением количества эритроцитов крови. При наличии агрегатов тромбоцитов, гипертромбоцитоза подсчет клеток неточен. К занижению результатов исследования могут привести образование сгустка, поглощающего часть клеток, недостаточное перемешивание содержимого пробирки перед заполнением камеры, подсчет тромбоцитов сразу после заполнения камеры, не выжидая 5 мин для оседания тромбоцитов. Также к ошибкам измерения приводят неправильная подготовка камеры, недостаточное притирание покровных стекол, неравномерное заполнение камеры, образование пузырьков воздуха, подсчет меньшего, чем требуется по методике, количества квадратов, плохо вымытые камера, пробирки, пипетка, капилляр для взятия крови; недостаточно просушенные пробирки и пипетки.

Дополнительное микроскопическое исследование мазков крови может помочь при проверке наличия агрегатов тромбоцитов, тромбоцитарно-лейкоцитарного саттелизма, присутствия шизоцитов, микроциты, фрагментов лейкоцитов, которые могут попасть в область подсчета тромбоцитов. Исследуя мазок крови, следует обратить внимание на аномальные формы тромбоцитов такие, как наличие микроформ тромбоцитов при синдроме Вискотта-Олдрича, агранулярных тромбоцитов при синдроме «серых тромбоцитов», присутствие макроформ тромбоцитов при хронических миелопролиферативных заболеваниях, синдроме Бернарда Сулье.

Параллельно с ручными методами подсчета тромбоцитов с середины ХХ века стали развиваться автоматизированные технологии измерения их числа, целью

которых было увеличить показатели воспроизводимости, точности и уменьшить коэффициенты вариации, снизить трудоемкость выполнения этого анализа. Так, в середине прошлого века появились первые гематологические анализаторы, основанные на апертуро-импедансном (метод Культера или кондуктометрический) методе измерения. Технология автоматического подсчета клеток была разработана в 1947 г Wallace H. и Joseph R.Coulter, запатентована в 1949 г. В 1954 г вышел счетчик клеток крови Coulter Counter Model A, получивший широкое применение в клинической гематологии. Приборы значительно облегчили труд врачей клинической лабораторной диагностики. Основу данной технологии составило знание о том, что живая клетка, взвешенная в растворе, не проводит электрический ток, что приводит к скачку электрического сопротивления постоянного тока, возникающие при прохождении клетками отверстия малого диаметра - апертуры (рисунок 1.1.1).

Рисунок 1.1.1 Принцип импедансного метода измерения количества клеток.

При прохождении измерительного канала клетки крови генерируют электрические импульсы разной амплитуды, пропорциональной их размерам. Импульсы, соответствующие частицам, размером от 1,8 до 25-30 фл, относятся к тромбоцитам. Число импульсов низкой амплитуды соответствует количеству тромбоцитов. Так как в распределение клеток имеет значение только один фактор -их размер, без учета внутреннего содержимого, то в счет к тромбоцитам могут попадать любые объекты объемом менее 30 фл (микроциты, фрагменты эритроцитов и лейкоцитов, криоглобулины). Макроформы тромбоцитов, объемом

более 30 фл, попадают в счет к эритроцитам. Если в один и тот же момент через апертуру проходят несколько клеток, то прибором они регистрируются, как одна крупная частица, что приводит к ошибке подсчета клеток. Первые кондуктометрические анализаторы могли использовать для исследования только богатую тромбоцитами плазму, что сопровождалось значительной ошибкой. В автоматизированный общий анализ крови методика импедансного подсчета тромбоцитов была добавлена лишь в конце 70-х гг ХХ века после изобретения метода гидродинамического фокусирования, который позволил отделить тромбоциты и микроцитарные эритроциты [54]. Принцип технологии гидродинамического фокусирования состоит в следующем: струя клеточной суспензии окружается обтекающей жидкостью (струей - оболочкой). За счет разности давления между ними клетки попадают в центральный ламинарный поток, выстраиваясь друг за другом, струя в струе. Клетки одна за другой пропускаются через отверстие малого диаметра, что обеспечивает анализ только одного объекта (клетки) в текущий момент времени. Приказом №290 министерства здравоохранения СССР от 11 апреля 1972 г было законодательно унифицировано только определение количества эритроцитов и лейкоцитов в автоматических счетчиках [12].

В дальнейшем, импедансный метод усовершенствовался. Компания Becman Coulter запатентовала технологию уносящего потока (sweep-flow), которая позволила избежать рециркуляции клеток в апертуре. Сразу после измерения на клетку воздействует уносящий поток жидкости, который не позволяет ей вернуться в измерительную ячейку. Для увеличения точности подсчета тромбоцитов методом импедансометрии в некоторых анализаторах применяется тройной подсчет клеток одновременно в трех апертурах. В случае тромбоцитопении увеличивается время подсчета тромбоцитов в измерительной ячейке. Также используется дополнительный математический обсчет - экстраполирование кривой графика соотношения абсолютного числа тромбоцитов и их среднего объема с целью снижения интерференции макро- и микроцитов периферической крови.

Внедрение оптических технологий в работу гематологических анализаторов открыло новую страницу в развитии медицинской техники. В 1964 г русские ученые Н.Г. Басов и А.М.Прохоров вместе с американским ученым Ч.Х.Таунсом стали лауреатами Нобелевской премии за исследование и создание лазера. Лазерная технология стала широко применяться в медицине, в том числе легла в основу нового метода измерения количества клеток в гематологических анализаторах. С появлением гематологических приборов нового поколения качество определения количества тромбоцитов резко возросло. Первый проточный цитофлюориметр сконструировал в 1968г Вольфганг Гёде в Германии. Уже год спустя оптический счетчик крови был выпущен на рынок немецкой компанией Partec. Изначально термина «проточная цитометрия» не существовало. Новая технология носила название импульсной цитометрии. Лишь в 1978г на конференции Американского инженерно-технического фонда было предложено название проточной цитометрии, которое и стало использоваться в дальнейшем. Проточная цитометрия - метод оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в них процессов. Принцип метода проточной цитометрии основан на регистрации светорассеивания от каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии. Современные гематологические анализаторы с оптическим методом измерения также используют технологию гидродинамического фокусирования. Клеточная суспензия пропускается через проточную кювету, одна за другой клетки пересекаются монохроматическим лучом полупроводникового лазера с определенной длиной волны. Длина волны различается у разных производителей (488 нм, 633 нм, 670 нм). Контакт с клеткой вызывает рассеивание луча под разными углами. При анализе полученных сигналов измеряются прямое (малоугловое) светорассеяние (forward scatter - FSC) и боковое светорассеяние (side scatter - SSC). Детектор прямого светорассеивания располагается по ходу лазерного луча за проточной ячейкой и регистрирует излучение лазера, которое рассеивается под малым углом (от 0° до 7° в зависимости от производителя гематологического анализатора). Интенсивность рассеянного под малым углом света пропорциональна размеру клетки. Чем крупнее

клетка, тем интенсивнее она рассеивает свет. При регистрации бокового светорассеивания детектор излучения располагается сбоку от хода лазерного луча. Он улавливает многократно преломляющиеся и рассеивающиеся лучи лазера, проходящие сквозь клетку. На интенсивность бокового светорассеивания влияют: наличие ядра, его соотношение с цитоплазмой, присутствие гранул, других внутриклеточных включений. Датчики бокового светорассеивания располагаются под углом от 5° до 90° относительно падения луча лазера, в зависимости от производителя гематологического прибора (рисунок 1.1.2).

Рисунок 1.1.2 Схема рассеивания лазерного луча при пропускании клеточной суспензии через проточную ячейку.

Все клетки крови имеют уникальное распределение по интенсивности прямого и бокового светорассеиванию. Таким образом, оптические технологии позволили добавить в алгоритм распределения клеток дополнительный фактор учета внутреннего содержимого клетки, что вместе с характеристикой ее размера, дает возможность определить вид клетки крови (лейкоцит, эритроцит, тромбоцит).

Для увеличения точности измерения внутреннего содержимого клеток производители современных высокотехнологичных приборов используют несколько датчиков регистрации прямого и бокового светорассеивания. На приборах фирмы Abbott применяется патентованная технология MAPSS (Multi-Angle Polarized Scatter Separation) -многоугловое разделение поляризационного пучка. Светорассеивание от клетки улавливается четырьмя детекторами: два

детектора прямого светорассеивания (под углами 0° и 7°), два - бокового светорассеивания поляризованного и деполяризованного света под углом 90°. Это позволяет отдельно оценивать лобулярность (строение ядра), гранулярность клеток. Гематологические анализаторы производителя Becman Coulter также используют технологии регистрации светорассеяния под несколькими углами, что обеспечивает более четкое разграничение популяций клеток. Датчики прямого светорассеивания располагаются под углами 0-0,5°, 5,1° относительно падения луча лазера, а бокового светорассеивания - 9-19° и 20-43°.

Кроме вышеописанных оптических технологий, некоторые производители гематологических анализаторов стали применять разновидность оптического -флюоресцентный метод для проверки результата измерения прямого и бокового светорассеивания. Используются специальные флюоресцентные красители, которые окрашивают определенные компоненты клетки. При взаимодействии света лазера с окрашенными клетками, краситель флюоресцирует с большой длиной волны, чем свет лазера. В гематологических анализаторах применяются различные флюорохромные красители нуклеиновых кислот - дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и/или рибонуклеиновой кислоты (РНК) (ауромин О, полиметин, оксазин, CD4K530). Интенсивность флюоресцентного излучения напрямую зависит от количества нуклеиновых кислот в клетке. Увеличение нуклеиновых кислот в клетке сопровождается усилением сигнала флюоресценции. При подсчете тромбоцитов флюоресцентным методом (PLT-F) используется построение скатерограммы относительно прямого светорассеивания и бокового флюоресцентного сигнала от нуклеиновых кислот (рисунок 1.1.3).

Флюоресцентный сигнал

Рисунок 1.1.3 Скатерограмма тромбоцитов, измеренных флюоресцентным методом (РЬТ-Б). Обозначения: ЯБС -эритроциты, "ВС -лейкоциты, 1РБ-фракция незрелых тромбоцитов.

Это дает возможность отделить популяцию тромбоцитов, включающую зрелые и молодые клетки, от нормо- и макроцитов, которые характеризуются низкой интенсивностью флюоресценции и крупными размерами. Кроме того, флюоресцентный сигнал в совокупности с данными светорассеивания позволяет проверить число ядросодержащих клеток, измеренных основным оптическим методом, помогает дифференцировать различные лейкоциты (нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, моноциты, лимфоциты), оценить количество ретикулоцитов, незрелых тромбоцитов.

Разновидностью флюоресцентных методов является иммунологический метод (1шшРЬТ) определение абсолютного числа тромбоцитов. 1шшРЬТ основан на применение моноклональных антител к специфическим тромбоцитарным антигенам (CD61), меченные флюоресцентным зондом. Флюоресцентный краситель (флюоресцеинизотиоцианат) связывается с моноклональными антителами CD61. В состоянии возбуждения при 488 нм центр флюоресценции приходится на пик длины волны 530 нм, испускаемой красителем. Сигнал флюоресценции улавливается фотоумножительной трубкой. При определении абсолютного числа тромбоцитов иммунологическим методом прибор анализирует прямое, боковое светорассеивание клеток под углами 7° и 90° относительно луча

лазера, а также флюоресцентный сигнал от моноклональных антител CD61, связанных со специфичным антигеном (белок gpШa комплекса gpПb/Шa) на поверхности тромбоцита (рисунок 1.1.4).

CD61 Иммунотромбоциты

IAS (7°)

Рисунок 1.1.4 Скатерограмма тромбоцитов, измеренных иммунологическим методом на гематологическом анализаторе Cell-Dyn Sapphire фирмы Abbott. По оси Х расположены данные бокового светорассеивания клеток под углом 7° относительно луча лазера. По оси Y - данные флюоресцентного сигнала от моноклональных антител CD61.

Данная технология реализована на гематологическом анализаторе Cell-Dyn 4000 (Sapphire, Abbott). Иммунологический метод позволяет с высокой точностью производить подсчет тромбоцитов, независимо от наличия фрагментов эритроцитов и лейкоцитов в периферической крови.

В гематологических приборах, где одновременно присутствует апертурно -импедансный и классический оптический методы измерения, количество тромбоцитов измеряется, как правило, двумя методами. Результаты выдаются с двух каналов, что дает возможность сравнить их между собой. При их различии анализатор выдает флаг, сигнализирующий о нарушении измерения. В ряде геманализаторов одновременно используется кондуктометрический, оптический и флюоресцентный методы определения абсолютного число тромбоцитов. Врач клинической лабораторной диагностики получает возможность провести анализ трех технологий исследования количества тромбоцитов на одном приборе.

В 2001 г. Международный комитет по стандартизации в гематологии (ICSH) и Международное сообщество Лабораторной гематологии (ISLH) рекомендовали считать референсным методом подсчета тромбоцитов проточную цитофлюориметрию с использованием моноклональных антител к рецепторным маркерам CD41 и CD61 (international reference method (IRM)) [51; 96]. Предлагается подсчитывать 50000 событий с минимальным порогом по тромбоцитарному гейту в 1000 событий. Далее определять соотношение эритроцитов к тромбоцитам и высчитывать точное количество тромбоцитов, зная концентрацию эритроцитов, измеренное на гематологическом анализаторе. Иммунологический метод имеет самый лучший коэффициент корреляции с IRM [26, 46, 68]. По данным Kim S.Y. с соавторами коэффициент корреляции между ImmPLT и IRM составляет 0,976 [68].

Однако, основная часть гематологических приборов, которыми оснащены лаборатории, работают по принципам импедансного и/или оптического анализа без использования иммунологического метода. Остается неясными следующие важные моменты: зависит ли точность определения числа тромбоцитов от метода, используемого на современных высокотехнологичных гематологических анализаторах, а также влияет ли длительное нахождение проб венозной крови (в течение суток) при комнатной температуре +20°С-+22°С на стабильность общего количества тромбоцитов, измеренные различными методами, и на ряд тромбоцитарных параметров (средний объем тромбоцитов, тромбокрит, параметр анизоцитоза тромбоцитов, количество ретикулярных тромбоцитов).

В доступной нам литературе мы не нашли подтверждений, доказывающих преимущества оптического (PLT-O) или импедансного (PLT-I) способа подсчета тромбоцитов. Одни авторы не находят разницы между двумя методиками [26, 68, 115]. С результатами измерения, как в оптическом, так и в импедансном каналах, интерферируют клетки и/или их частицы, сопоставимые с размером тромбоцита (фрагментами эритроцитов, лейкоцитов). Kim SY с соавт установили, что коэффициенты корреляции между PLI-O и IRM, PLT-I и IRM равняются соответственно 0,970 и 0,969, что не доказывает преимущество какого-то из методов [68]. Результаты, полученные как оптическим, так и импедансным

методами измерения, завышают значения тромбоцитов, измеренных ImmPLT и IRM [33,37, 84]. К этому может приводить ряд причин: наличие фрагментов эритроцитов (шизоциты при микроангиопатиях, в случае тяжелой микроцитарной железодефицитной анемии, при микросфероцитозах), присутствие фрагментов лейкоцитов у больных с острым лейкозом, с лимфомами, у пациентов, находящихся на химиотерапии, бактериемия у септических пациентов, инфицирование грибами рода Candida и трофозоитами Plasmodium falciparum при малярии [115]. Все вышеперечисленные объекты имеют размеры, сопоставимые с размерами тромбоцитов, и могут попадать в их зону детекции. Также ложное увеличение количества тромбоцитов вызывает присутствие липидов у пациентов, сдающих кровь не натощак, у больных с гиперхиломикронемией [120]. Наличие криоглобулинов при системных иммунопатологических воспалительных заболеваниях в крови также приводит к ложному завышению числа тромбоцитов [120].

C другой стороны, в ряде научных публикаций показано, что в случае тромбоцитопении результаты оптического метода определения количества тромбоцитов лучше коррелируют с методом проточной цитофлюориметрии, чем импедансный метод [25, 53, 59]. Коэффициенты вариации для образцов с количеством тромбоцитов от 5 х 109/л до 10 х10 /л составляют от 15% до 43% в зависимости от метода. При измерении образцов с количеством тромбоцитов 36 х109/л - 65 х109/л точность методов увеличивается, коэффициент вариации колеблется от 5% до 11%. В обоих случаях, импедансные технологии характеризуются более высокими коэффициентами вариации, чем оптические. [37]. При наличии микроцитов и тромбоцитопении (<100х109/л) в исследуемой крови, показатель количества тромбоцитов, измеренный оптическим методом ниже, чем при использовании импедансного метода [22, 93]. По данным Boulassel MR с соавторами, при уровне тромбоцитопении в образцах менее 50х109/л оптический метод измерения показывает хорошую корреляцию с иммунологическим (r=0.91, p<0.0001), в отличие от импедансной технологии (r=0.73, p<0.001) [21]. Эти результаты согласуются с работами под руководством Joan Cid и M.Schoorl [33,

105]. При измерении уровня тромбоцитов ниже 50х109/л, установлен коэффициент корреляции между PLI-O и ImmPLT 0,95 ф<0,001), тогда как между PLT-I и ImmPLT коэффициент корреляции составил 0,40 ф<0,001) [33]. PLT-F показал наибольшую корреляцию с IRM (г=0,988) [105]. По данным С.Tantanate с соавторами при подсчете тромбоцитов в условиях тромбоцитопении (менее 100х109/л) корреляция между PLT-I и IRM была наименьшей по сравнению с PLT-O и PLT-F технологиями [109]. При этом чувствительность всех трех методов оказалось сопоставима (0,99-1,00), а специфичность PLT-I низкой - 0,38 по сравнению с 0,63 - у PLT-O и 0,83 - у PLT-F. При количестве тромбоцитов более 100х109/л все три метода сопоставимы и коррелируют с референсным.

Также опубликованы работы результаты, которых свидетельствуют в пользу импедансного метода подсчета тромбоцитов у пациентов в восстановительный период после химиотерапии [106]. Возможно, это связано с присутствием в крови апоптотических фрагментов лейкоцитов у пациентов [115].

Таким образом, нет точного ответа на вопрос, импедансный или оптический методы использовать для определения числа тромбоцитов при тромбоцитопении у пациента при невозможности применения дорогостоящих иммунологического метода с использованием моноклональных антител CD61 и/или референсного метода проточной цитофлюорометрии.

Большое значение в работе приборов имеет стабильность измерения количества тромбоцитов в периферической крови, как важный фактор стандартизации исследования. С внедрением в работу лабораторий автоматических анализаторов появилась тенденция в мировых масштабах к централизации лабораторных исследований и создание централизованных клинико-диагностических лабораторий [3, 5, 10, 11]. В условиях большой протяженности нашей страны и, зачастую, тяжелой климатической ситуации, лаборатория должна обеспечит проведение высококачественного, клинически информативного исследования. Сведения по особенностям условий транспортировки пробирок (способах и времени доставки) с целью гематологического исследования в централизованные лаборатории малочисленны. В ГОСТ Р 53079.4-2008 приведены

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мининкова Анна Игоревна, 2020 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Балаховский И. С. Статистический контроль качества клинических лабораторных анализов (лекция) // Клиническая лабораторная диагностика. -2009. - N10. - С. 30-37

2. Бурячковская Л. И. Гетерогенность тромбоцитов человека и животных. Связь морфологических особенностей с функциональным состоянием: автореферат диссертации доктора биологических наук: 03.00.25 / Бурячковская Людмила Ивановна - Москва, 2007 .- 44 с.

3. Вавилова Т.В. Телемедицина, централизация без «коллективизации» и симбиоз медиков с биологами // Справочник заведующего КДЛ. - 2018. -№11. - С.3-11

4. ГОСТ Р 53079.4 - 2008 Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа. 69 с.

5. Кишкун А.А. Централизация клинических лабораторных исследований. М.: ГЕОТАР-Медиа, 2015. - 368 с.

6. Кишкун А.А., Годков М.А. Централизация клинических лабораторных исследований. Методические рекомендации. М.:2013. -35 с.

7. Луговская С.А., Почтарь М.Е. «Гематологический атлас», 4-ое изд., доп., Тверь: Триада - Тверь, 2016. - 434 с.

8. Мазуров А.В. Оборот тромбоцитов и атеротромбоз // Атеротромбоз.- 2017.- №2. - C.131-141

9. Мазуров А.В., Хаспекова С.Г., Васильев С.А. Диагностика тромбоцитопений // Терапевтический архив.- 2018. - №07.- C.4-13

10.Меньшиков В.В. Оптимизация расходов на здравоохранение, централизация лабораторных исследований и доступность лабораторной информации // Клиническая лабораторная диагностика. -2014. - №4. - С. 56-59

11.Методические рекомендации. Централизация клинико-диагностических исследований / Под ред. Меньшикова В.В.- М.: 1979

12. Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследования Приказ №290 Министерства здравоохранения СССР от 11 апреля 1972 г

13.Об утверждении инструкции по применению компонентов крови. Приказ №363 Министерства здравоохранения РФ от 25 ноября 2002 г

14.Об утверждении Порядка медицинского обследования донора крови и ее компонентов. Приказ Минздрава РФ от 14.09.2001 N 364 (ред. от 06.06.2008)

15.Попов А.М. Вержбицкая Т.Ю.Фечина Л.Г. Шестопалов А.В. Плясунова С.А. Острые лейкозы: различия иммунофенотипа бластных клеток и их неопухолевых аналогов в костном мозге. // Клиническая онкогематология. -2016.- №9(3).- С. 302-313

16. Савченко В.Г., Паровичникова Е.Н., Афанасьев Б.В., Грицаев С.В., Семочкин С.В., Бондаренко С.Н. и др., Национальные клинические рекомендации по диагностике и лечению острых миелоидных лейкозов взрослых // Гематология и трансфузиология. - 2014. -№59(1 ). - С.1-32

17.Abe Y, Wada H, Sakakura M, Nishioka J, Tomatsu H, Hamaguchi Y, Oguni S, Shiku H, Nobori T.Usefulness of fully automated measurement of reticulated platelets using whole blood. // Clin Appl Thromb Hemost.- 2005.- 11(3).- С.263-70.

18.Anetsberger A, Blobner M, Haller B, Schmid S, Umgelter K, Hager T, Langgartner C, Kochs EF, Laugwitz KL, Jungwirth B1, Bernlochner I. Immature platelets as a novel biomarker for adverse cardiovascular events in patients after non-cardiac surgery. // Thromb Haemost.- 2017. - 117(10). - P.1887-1895.

19.Ault KA. Flow cytometric measurement of platelet function and reticulated platelets. // Ann N Y Acad Sci.- 1993. - 677. - P. 293-308.

20.Boos CJ, Balakrishnan B, Lip GY. The effects of coronary artery disease severity on time-dependent changes in platelet activation indices in stored whole blood. // Thromb Thrombolysis. - 2008. - 25(2). - P. 135-40.

21.Boulassel MR, AL-Farsi R, Al-Hashmi S, Al-Kindi S Comparative analysis of four methods for enumeration of platelet counts in thrombocytopenic patients // JAHJ.-2015. - Volume : 6. - Issue : 3. - P. 119-124.

22.Boulassel MR, Al-Farsi R, Al-Hashmi S, Al-Riyami H, Khan H, Al-Kindi S Accuracy of Platelet Counting by Optical and Impedance Methods in Patients with Thrombocytopaenia and Microcytosis Sultan Qaboos // Univ Med J. - 2015.-15(4).-P.463-468

23.Brecher G, Schneiderman M, Cronkite EP. The reproducibility and constancy of the platelet count. // Am J Clin Pathol.-1953.- 23.- P.15-26

24.Briggs C, Culp N, Davis B, d'Onofrio G, Zini G, Machin SJ; International Council for Standardization of Haematology ICSH guidelines for the evaluation of blood cell analysers including those used for differential leucocyte and reticulocyte counting. // Int J Lab Hematol. - 2014.- 36(6).- P. 613-627

25.Briggs C, Harrison P, Grant D, Staves J, MacHin SJ. New quantitative parameters on a recently introduced automated blood cell counter--the XE 2100. // Clin Lab Haematol.- 2000.- 22(6). - P. 345-350

26.Briggs C, Harrison P, Machin SJ. Continuing developments with the automated platelet count. // Int J Lab Hematol. - 2007. - 29(2).- P. 77-91

27.Briggs C, Kunka S, Hart D, Oguni S, Machin SJ. Assessment of an immature platelet fraction IPF in peripheral thrombocytopenia. // Br J Haematol. - 2004. -126(1). -P.93-99

28.Briggs C, Longair I, Kumar P, Singh D, Machin SJ. Performance evaluation of the Sysmex haematology XN modular system.// J Clin Pathol.- 2012. - 65. - P.1024-1030;

29.Bruegel M, Nagel D, Funk M, Fuhrmann P, Zander J, Teupser D. Comparison of five automated hematology analyzers in a university hospital setting: Abbott Cell-Dyn Sapphire, Beckman Coulter DxH 800, Siemens Advia 2120i, Sysmex XE-5000, and Sysmex XN-2000. // Clin Chem Lab Med.- 2015.- 53(7).- P. 1057-1071

30.Brummitt DR, Barker HF. The determination of a reference range for new platelet parameters produced by the Bayer ADVIA120 full blood count analyser.// Clin Lab Haematol.- 2000.- 22(2).- P.103-107

31.Butkiewicz AM, Kemona H, Dymicka-Piekarska V, Matowicka-Karna J, Radziwon P, Lipska А Platelet count, mean platelet volume and thrombocytopoietic indices in healthy women and men. // Thromb Res.- 2006. - 118(2). - P.199-204

32.Carty DJ, Gear AR. Fractionation of platelets according to size: functional and biochemical characteristics. // Am J Hematol.- 1986.- 21(1).- P.1-14.

33.Cid J, Nascimento JD, Vicent A, Aguinaco R, Escoda L, Ugarriza A, Llorente A. Evaluation of low platelet counts by optical, impedance, and CD61-immunoplatelet methods: estimation of possible inappropriate platelet transfusion. // Transfusion. -2010.- 50(4).- P.795-800.

34.CLSI. H20-A2 Reference Leukocyte (WBC) Differential Count (Proportional) and Evaluation of Instrumental Methods, Clinical Laboratory and Standards Institute, Wayne, Pa, USA, 2007

35.Cybulska A, Meintker L, Ringwald J, Krause SW Measurements of immature platelets with haematology analysers are of limited value to separate immune thrombocytopenia from bone marrow failure. // Br J Haematol.- 2017.- 177(4).-P.612-619

36.Daves M, Zagler EM, Cemin R, Gnech F, Joos A, Platzgummer S, Lippi G. Sample stability for complete blood cell count using the Sysmex XN haematological analyser. // Blood Transfus.- 2015.- 13(4).- P. 576-82

37.De la Salle BJ, McTaggart PN, Briggs C, Harrison P, Doré CJ, Longair I, Machin SJ, Hyde K.The accuracy of platelet counting in thrombocytopenic blood samples distributed by the UK National External Quality Assessment Scheme for General Haematology. // Am J Clin Pathol.- 2012.- 137(1).- P. 65-74.

38.Depoorter M., Goletti S., Latinne D., Defour J., 2015 Optimal flagging combinations for best performance of five blood cell analyzers. // Int J Lab Hematol.- 2015.-37(1).-P.63-70

39.Desirable Biological Variation Database specifications [Электронный ресурс-Режим доступа: https://www.westgard.com/biodatabase1.htm

40.Dusse LM, Freitas LG. Clinical applicability of reticulated platelets. // Clin Chim Acta.- 2015.- 439.- P. 143-147

41.Estcourt LJ, Birchall J, Allard S, Bassey SJ, Hersey P, Kerr JP, Mumford AD, Stanworth SJ, Tinegate H; British Committee for Standards in Haematology. Guidelines for the use of platelet transfusions. // Br J Haematol.- 2017.- 176(3).-P.365-394

42.Freynhofer MK, Iliev L, Bruno V, Rohla M, Egger F, Weiss TW, Hubl W, Willheim M, Wojta J, Huber K Platelet turnover predicts outcome after coronary intervention. // Thromb Haemost.- 2017.- 117(5).- P.923-933

43.Fuentes-Arderiu X, Garcia-Panyella M, Dot-Bach D. Between- examiner reproducibility in manual differential leukocyte counting. // Accred Qual Assur.-2007.- 12.- P. 643-645

44.Giles H, Smith RE, Martin JF. Platelet glycoprotein IIb-IIIa and size are increased in acute myocardial infarction. // Eur J Clin Invest.- 1994.- 24(01).- P.69- 72

45.Gong X, Wang X, Xu Z, Zhu T, Zhang Q, Zhang J, Wang X, Li C Over-expression of cyclooxygenase-2 in increased reticulated platelets leads to aspirin resistance after elective off-pump coronary artery bypass surgery. // Thromb Res.- 2017.- 160.-P.114-118

46.Grimaldi E, Del Vecchio L, Scopacasa F, Lo Pardo C, Capone F, Pariante S, Scalia G, De Caterina M Evaluation of the platelet counting by Abbott CELL-DYN SAPPHIRE haematology analyser compared with flow cytometry. // Int J Lab Hematol.- 2009.- 31(2).- P.151-60.

47.Grove EL, Hvas AM, Kristensen SD. Immature platelets in patients with acute coronary syndromes. // Thromb Haemost.- 2009.- 101(01).- P.151 - 156

48.Gruber SC, Freynhofer MK, Willheim M, Weiss TW, Egger F, Hubl W, Huber K Twenty-four-hour time dependency of clopidogrel effects in patients with acute coronary syndromes: The CiCAD-Study. // Platelets.- 2019.-30(4).- P.506-512.

49.Guthikonda S, Lev EI, Patel R, DeLao T, Bergeron AL, Dong JF, Kleiman NS. Reticulated platelets and uninhibited COX-1 and COX-2 decrease the antiplatelet effects of aspirin. // J Thromb Haemost.- 2007.- 5(3).- P.490-496

50.Hannawi B, Hannawi Y, Kleiman NS. Reticulated Platelets: Changing Focus from Basics to Outcomes. // Thromb Haemost.- 2018.- 118(9).- P.1517-1527

51.Harrison P, Ault KA, Chapman S, Charie L, Davis B, Fujimoto K, Houwen B, Kunicka J, Lacombe F, Machin S, Raynor R, van Hove L, van Assendelft OW, International Society of Laboratory Hematology Task Force for the Reference Platelet Count. An interlaboratory study of a candidate reference method for platelet counting. // Am J Clin Pathol.- 2001.-115.- P.448-59

52.Harrison P, Goodall AH. "Message in the platelet"--more than just vestigial mRNA! // Platelets.- 2008.-19(6).- P.395-404

53.Harrison P, Horton A, Grant D, Briggs C, MacHin S Immunoplatelet counting: a proposed new reference procedure. // Br J Haematol.- 2000.- 108(2).- P.228-35

54.Haynes J.L. High-resolution particle analysis-Its application to platelet counting and suggestions for further application in blood cell analysis. In: Automation in Haematology: What to measure and why? // (eds D.W. Ross, G. Brecher & M.N. Wintrobe), 1981.- 97-109 pp. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg and New York.

55.Hickerson DH, Bode AP. Flow cytometry of platelets for clini-cal analysis. // Hematol Oncol Clin North Am.- 2002.- 16(2).- P.421-54.

56.Hoffmann JJ. Reticulated platelets: analytical aspects and clinical utility. // Clin Chem Lab Med.- 2014.- 52(8).- P.1107-1117

57.Hoffmann JJ, van den Broek NM, Curvers J. Reference intervals of reticulated platelets and other platelet parameters and their associations. // Arch Pathol Lab Med.- 2013.-137.- P.1635-1640

58.Hotton J1, Broothaers J, Swaelens C, Cantinieaux B. Performance and abnormal cell flagging comparisons of three automated blood cell counters: Cell-Dyn Sapphire, DxH-800, and XN-2000. // Am J Clin Pathol.- 2013.- 140(6).- P. 845-852

59.Hummel K, Sachse M, Hoffmann JJML, van Dun LPJM. Comparative evaluation of platelet counts in two hematology analyzers and potential effects on prophylactic platelet transfusion decisions. // Transfusion.- 2018.- 58(10).- P.2301-2308

60.Ingram M, Coopersmith A. Reticulated platelets following acute blood loss. // Br J Haematol.- 1969.- 17(3).- P.225-229

61.Jakubowski JA, Thompson CB, Vaillancourt R, Valeri CR, Deykin D. Arachidonic acid metabolism by platelets of differing size. // Br J Haematol.- 1983.- 53(03).-P.503-511

62.Jo Y, Kim SH, Koh K, Park J, Shim YB, Lim J, Kim Y, Park YJ, Han K.Reliable, accurate determination of the leukocyte differential of leukopenic samples by using Hematoflow method. // Korean J Lab Med.- 2011.- 31(3).- P.131-137

63.Jung H, Jeon HK, Kim HJ, Kim SH. Immature platelet fraction:establishment of a reference interval and diagnostic measure for thrombocytopenia. // Korean J Lab Med.- 2010.- 30.- P.451-459

64.Kahng J, Kim Y, Kim M, Oh EJ, Park YJ, Han K Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. // Ann Lab Med.- 2015.-35(1).- P. 28-34

65.Kang SH, Kim HK, Ham CK, Lee DS, Cho HI Comparison of four hematology analyzers, CELL-DYN Sapphire, ADVIA 120, Coulter LH 750, and Sysmex XE-2100, in terms of clinical usefulness. // Int J Lab Hematol.- 2008.- 30(6).- P.480-486

66.Kickler TS, Oguni S, Borowitz MJ. A clinical evaluation of high fluorescent platelet fraction percentage in thrombocytopenia. // Am J Clin Pathol.- 2006.-125.- P.282-287

67.Kim AH, Lee W, Kim M, Kim Y, Han K White blood cell differential counts in severely leukopenic samples: a comparative analysis of different solutions available in modern laboratory hematology. // Blood Res.- 2014.- 49(2).- P.120-126

68.Kim SY, Kim JE, Kim HK, Han KS, Toh CH Accuracy of platelet counting by automated hematologic analyzers in acute leukemia and disseminated intravascular coagulation: potential effects of platelet activation. // American Journal Clinical Pathology.- 2010.-134(4).- P.634-647

69.Kiran Kumar RM, Siqueiros-Garcia A, Vaduganathan M, Dong J, Kleiman NS, r Guthikonda S Platelet activation patterns in platelet size sub-populations:differential responses to aspirin in vitro.// J Thromb Thrombolysis.-2010.- 30.- P.251-262

70.Ko YJ, Kim H, Hur M, Choi SG, Moon HW, Yun YM, et al. Establishment of reference interval for immature platelet fraction. // Int J Lab Hematol.- 2013.-35.-P.528-33.

71.Kutter D. Prevalence of mieloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. // J Mol Med.- 1998.- 79.- P. 669-675

72.Lador A, Leshem-Lev D, Spectre G, Abelow A, Kornowski R, Lev E Characterization of surface antigens of reticulated immature platelets. // J Thromb Thrombolysis.- 2017.-44(3).- P.291-297.

73.Lakkis N, Dokainish H, Abuzahra M, et al. Reticulated platelets inacute coronary syndrome: a marker of platelet activity. // J Am Coll Cardiol. 2004.- 44(10).- P.2091-2093

74.Lancé MD, van Oerie R, Henskens YM, Marcus MA. Do we need time adjusted mean platelet volume measurements? // Lab Hematol.- 2010.- 16(3).- P.28-31

75.Lippi G, Salvagno GL, Solero GP, Franchini M, Guidi GC Stability of blood cell counts, hematologic parameters and reticulocytes indexes on the Advia A120 hematologic analyzer. // J Lab Clin Med.- 2005.-146(6).- P.333-340

76.Macaulay IC, Carr P, Gusnanto A, Ouwehand WH, Fitzgerald D, Watkins NA Platelet genomics and proteomics in human health and disease. // J Clin Invest.-2005.- 115(12).- P.3370-3377

77.Macey M, Azam U, McCarthy D, Webb L, Chapman ES, Okrongly D, Zelmanovic D, Newland A. Evaluation of the anticoagulants EDTA and citrate, theophylline, adenosine, and dipyridamole (CTAD) for assessing platelet activation on the ADVIA 120 hematology system. // Clinical Chem.- 2002.- 48(6 Pt 1).- P.891-899

78.Mannuß S, Kohlschein P, Dreißiger K, Schuff-Werner P. Measurement of Platelet Counts and Volume Using Magnesium Sulfate as an Anticoagulant: Comparison of Impedance and Light-Scatter Technology. // Am J Clin Pathol.- 2016.- 146(5). P.538-545

79.McDonnell A, Bride KL, Lim D3, Paessler M, Witmer CM, Lambert MP Utility of the immature platelet fraction in pediatric immune thrombocytopenia: Differentiating

from bone marrow failure and predicting bleeding risk. // Pediatr Blood Cancer.-2018.- 65(2)

80.Meintker L, Fritsch JD, Ringwald J, Krause SW. Immature platelets do not reliably predict platelet recovery in patients with intensive chemotherapy or stem cell transplantation. // Vox Sang.- 2017.- 112(2).- P.132-139

81.Meintker L, Haimerl M, Ringwald J, Krause SW. Measurement of immature platelets with Abbott CD-Sapphire and Sysmex XE-5000 in haematology and oncology patients. // Clin Chem Lab Med.- 2013.-51.- P.2125-2132

82.Meintker L, Ringwald J,Fritsch JD Krause SW Immature platelets do not reliably predict platelet recovery in patients with intensive chemotherapy or stem cell transplantation. // Vox Sang.- 2017.- 112(2).- P.132-139

83.Michur H, Maslanka K, Szczepinski A, Marianska B.Reticulated platelets as a marker of platelet recovery after allogeneic stem cell transplantation. // Int J Lab Hematol.-2008.-30(6).- P.519-525

84.MlinariC A, Juros GF, Rogic D Massive RBC fragmentation masks severe thrombocytopenia in both impedance and optical platelet count measurements - a case report of a neonate on ECMO support // Signa Vitae.- 2016. - 12(1).- P. 128-130

85. Monteagudo JM, Guedán M.J., Muñoz ML, Campos J.A., Martínez I. R, Vilella C.T Measurement of reticulated platelets by simple flow cytometry: An indirect thrombocytopoietic marker. // European Journal of Internal Medicine.- 2006.- 17.- P. 541-544

86.Murphy SJX, Lim ST, Kinsella JA, Murphy D, Enright HM, McCabe DJH; HEIST study group.Increased platelet count and reticulated platelets in recently symptomatic versus asymptomatic carotid artery stenosis and in cerebral microembolic signalnegative patient subgroups: results from the HaEmostasis In carotid STenosis (HEIST) study. // J Neurol.- 2018.- 265(5).- P.1037-1049

87.Nagareddy PR, Noothi SK, Flynn MC, Murphy AJ It's reticulated: the liver at the heart of atherosclerosis. // J Endocrinol.- 2018.- 238(1).- P.1-11

88.Nakamura T, Uchiyama S, Yamazaki M, Okubo K, Takakuwa Y, Iwata M. Flow cytometric analysis of reticulated platelets in patients with ischemic stroke. // Thromb Res.- 2002.-106(4-5).- P.171-177

89.Nishiyama M, Hayashi S, Futsukaichi Y, Suehisa E, Kurata Y. Usefulness of immunoplatelet measurement using the flow cytometric method for accurate platelet counting in hematological patients with severe thrombocytopenia. // Rinsho Byori.-2004.- 52. P.103-108

90.Nomura T, Kubota Y, Kitanaka A, Kurokouchi K, Inage T, Saigo K, et al. Immature platelet fraction measurement in patients with chronic liver disease: a convenient marker for evaluating cirrhotic change. // Int J Lab Hematol.- 2010.-32.- P. 299-306

91.0'Malley CJ, Rasko JE, Basser RL, McGrath KM, Cebon J, Grigg AP, Hopkins W, Cohen B, O'Byrne J, Green MD, Fox RM, Berndt MC, Begley CG Administration of pegylated recombinant human megakaryocyte growth and development factor to humans stimulates the production of functional platelets that show no evidence of in vivo activation. // Blood.- 1996.- 88(9). P3288-3298

92.Park D, Chang J, Kahng J, Park H, Jo I, Kim Y, Han K Development of a Novel Flow Cytometry-Based System for White Blood Cell Differential Counts: 10-color LeukoDiff. // Ann Lab Med.- 2019.- 39(2).- P.141-149

93. Pan LL, Chen CM, Huang WT, Sun CK, Enhanced Accuracy of Optical Platelet Counts in Microcytic Anemia. // Laboratory Medicine.- 45(1).- P. 32-36

94. Pierre RV Peripheral blood film review. The demise of the eyecount leukocyte differential. // Clin Lab Med.- 2002.-22(1).- P.279-297

95.Pinter E, Laszlo K, Schuszler I, Konderak J The stability of quantitative blood count parameters using the ADVIA2120i hematology analyzer. // Practical Laboratory Medicine.- 2016.- 4.- P.16-21

96.Platelet Counting by the RBC/Platelet Ratio Method. A Reference Method International Council for Standardization in Hematology Expert Panel on Cytometry and International Society of Laboratory Hematology Task Force on Platelet Counting» // American Journal Clinical Pathology.- 2001.- 115.- P.460-464

97.Rabizadeh E., Pickholtz I, Barak M, Isakov E, Zimra Y, Froom P. Acute leukemia detection rate by automated blood count parameters and peripheral smear review. // Int J Lab Hematol.- 2015.- 37(1).- P.44-49

98.Recommendations of the International Council for Standardization in Haematology for Ethylenediaminetetraacetic Acid Anticoagulation of Blood for Blood Cell Counting and Sizing. International Council for Standardization in Haematology: Expert Panel on Cytometry. // Am J Clin Pathol.- 1993.- 100(4).- P.371-372

99.Recommended methods for the visual determination of white cell and platelet counts. WHO Document LAB/88.3 // Biochim Clin.- 1988.-12.- P.1385-1391

100. Richards EM, Baglin TP. Quantitation of reticulated platelets: methodology and clinical application. // Br J Haematol.- 1995.- 91(2).- P.445-451

101. Robinson MS1, MacKie IJ, Machin SJ, Harrison P. Two colour analysis of reticulated platelets. // Clin Lab Haematol.- 2000.- 22(4).- P. 211-213

102. Roussel M1, Davis BH, Fest T, Wood BL; International Council for Standardization in Hematology (ICSH).Toward a reference method for leukocyte differential counts in blood: comparison of three flow cytometric candidate methods. // Cytometry A.- 2012.- 81(11).- P.973-982

103. Ruisi MM, Psaila B, Ward MJ, Villarica G, Bussel JB. Stability of measurement of the immature platelet fraction. // Am J Hematol.- 2010.- 85.- P.622-624.

104. Salvagno GL, Montagnana M, Degan M, Marradi PL, Ricetti MM, Riolfi P, Poli G, Minuz P, Santonastaso CL, Guidi GC Evaluation of platelet turnover by flow cytometry. // Platelets.- 2006.-17(3).- P.170-177

105. Schoorl M, Schoorl M, Oomes J, van Pelt J New fluorescent method (PLT-F) on Sysmex XN2000 hematology analyzer achieved higher accuracy in low platelet counting. // Am J Clin Pathol.- 2013.- 140(4).- P.495-499

106. Segal H., Briggs C., Kunka S., Casbard A., Harrison P., Machin S.J. & Murphy M. Accuracy of platelet counting haematology analysers in severe thrombocytopenia and potential impact on platelet transfusion. // British Journal of Haematology.- 2005.128.- P. 520-525.

107. Shelat SG, Canfield W., Shibutani.S. Differences in detecting blasts between ADVIA 2120 and Beckman-Coulter LH750 hematology analyzers. // Int J Lab Hematol.- 2010.- 32(1 Pt 2).- P.113-116

108. Stohlawetz P, Schulenburg A, Stiegler G, Panzer S, H^ker P, Kalhs P, et al. The proportion of reticulated platelets is higher in bone marrow than in peripheral blood in haematological patients. // Eur J Haematol.- 1999.- 63.- P.239-244

109. Tantanate C, Khowawisetsut L, Pattanapanyasat K.Performance Evaluation of Automated Impedance and Optical Fluorescence Platelet Counts Compared With International Reference Method in Patients With Thalassemia. // Arch Pathol Lab Med.- 2017.- 141(6).- P.830-836

110. Tendulkar A , Puneet J, Sumeet G, Manisha T, Ravindra K, Bala G Stability of Selected Hematological Parameters in Stored Blood Samples. // J Cell Sci Ther.-2015.- 6.- P.5

111. The Board of the German Medical Association on the Recommendation of the Scientific Advisory Board. Platelet concentrates. Cross-sectional guidelines for therapy with blood components and plasma derivatives. // Transfusion Medicine and Hemotherapy.- 2009.- 36.- P. 372- 382.

112. Thompson CB, Eaton KA, Princiotta SM, Rushin CA, Valeri CR. Size dependent platelet subpopulations: relationship of platelet vol-ume to ultrastructure, enzymatic activity, and function. // Br J Haematol.- 1982.- 50(3).- P.509-519

113. Thompson CB, Jakubowski JA, Quinn PG, Deykin D, Valeri CR. Platelet size and age determine platelet function independently. // Blood.- 1984.- 63(6).- P.1372-1375

114. Thompson CB, Love DG, Quinn PG, Valeri CR, Karpatkin S. Heterogeneity of human platelets. I. Metabolic and kinetic evidence suggestive of young and old platelets. // J Clin Invest.- 1969.- 48(06).- P.1083-1087

115. Van der Meer W., Mackenzie M.A., Dinnissen J.W. & Keijzer M.H. Pseudoplatelets: a retrospective study of their incidence and interference with platelet counting. // Journal of Clinical Pathology.-2003.- 56.- P. 772-774

116. Vazquez R, Roussel M, Badaoui B, Freynet N, Tarfi S, Solary E, Selimoglu-Buet D, Wagner-Ballon O; Groupe Francophone des Myelodysplasies (GFM).High

sensitivity of the Hematoflow™ solution for chronic myelomonocytic leukemia screening. // Cytometry B Clin Cytom.- 2018.- 94(5).- P. 658-661

117. Wang C, Smith BR, Ault KA, Rinder HM Reticulated platelets predict platelet count recovery following chemotherapy. // Transfusion.- 2002.- 42(3).- P.368-74

118. Wood B, Jevremovic D, Bene MC, Yan M, Jacobs P, Litwin V. ICSH/ICCS Working Group. Validation of cell-based fluorescence assays: practice guidelines from the ICSH and ICCS - part V - assay performance criteria. // Cytometry B Clin Cytom.- 2013.- 84(5).- P.315-323

119. Wu DW, Li YM, Wang F How Long can we Store Blood Samples: A Systematic Review and Meta-Analysis. // EBioMedicine.- 2017.- 24.- P.277-285

120. Zandecki M., Genevieve F., Gerard G, Godon A Spurious counts and spurious results on hematology analysers: a review. Part I:platelets. // IJLH.- 2007.- 29 (1).- P. 4-20

121. Zini G. International Council for Standardization in Haematology (ICSH).Stability of complete blood count parameters with storage: toward defined specifications for different diagnostic applications. // Int J Lab Hematol. - 2014.- 36(2). - P. 111-113