Влияние инактивации патогенов в концентратах тромбоцитов на функцию тромбоцитов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.21, кандидат наук Накастоев, Ислам Мухарбекович

• Накастоев, Ислам Мухарбекович
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Накастоев, Ислам Мухарбекович

Введение..........................................................................................4

Глава 1. Обзор литературы................................................................12

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Получение концентратов тромбоцитов...........................................35

2.2 Проведение инактивации патогенов..............................................36

2.3. Характеристика реципиентов......................................................39

2.4. Методы исследования................................................................41

2.4.1. Получение и хранение образцов концентрата тромбоцитов...............41

2.4.2. Определение тромбоцитарных параметров...................................41

2.4.3.Определение количества фосфатидилсерин-положительных

и Р-селектин-положительных тромбоцитов.........................................46

2.4.4. Исследование агрегации тромбоцитов.........................................49

2.4.5. Подсчет количества тромбоцитов у реципиента.............................52

2.4.6. Оценка геморрагического синдрома............................................53

2.4.7. Статистическая обработка результатов...........................................55

Глава 3. Обсуждение собственных результатов.

3.1. Данные полученные на гематологическом анализаторе

«БУЗМЕХ ХЕ-2100».............................................................................56

3.2. Определение экспозиции фосфатидилсерина и Р-селектина................61

3.3. Исследование агрегации тромбоцитов с различными агонистами.........67

3.3. Клиническая эффективность трансфузии концентратов

тромбоцитов подвергнутых инактивации патогенов...............................68

Глава 4. Заключение.......................................................................74

Глава 5. Выводы...........................................................................79

Список литературы........................................................................81

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ АА - апластическая анемия АПТ - абсолютный прирост тромбоцитов БТБ - базовый тромбоцитарный буфер KT - концентрат тромбоцитов МДС - миелодиспластический синдром ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз ОМЛ - острый миелобластный лейкоз ОММЛ - острый миеломонобластный лейкоз ПИ - патогенинактивация

ПИ KT - патогенинактивированный концентрат тромбоцитов

СПТ - скорректированный прирост тромбоцитов

УФ - ультрафиолет

Фл - фемтолитр

ФС - фосфатидилсерин

CRP - collagen related peptide

IPF - фракция незрелых тромбоцитов

М - среднее значение

РЕ - фикоэритрин

P-LCR- крупные тромбоциты, объем которых >12фл

PLT - тромбоциты (platelets)

PUVA - псорален + ультрафиолет А

SD - стандартное отклонение

UVA - ультрафиолет A (UltraViolet А)

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования Проблема инфекционной безопасности реципиентов при трансфузиях компонентов крови стала актуальной одновременно с развитием службы крови, увеличением количества переливаний и совершенствованием методов детекции трансмиссивных инфекций [1-6 ].

Точных популяционных данных по количеству трансфузий концентратов тромбоцитов до настоящего времени нет, поскольку отсутствует единый международный регистр. Тем не менее, учитывая отчеты региональных служб крови и косвенные данные, можно сделать вывод о существенном увеличении потребности в количестве и качестве концентратов тромбоцитов [2].

По данным регистра ЕВМТ (European Group for Blood and Marrow Transplantation) количество ежегодно выполняемых трансплантаций в Европейских странах с 1990 года по 2010 увеличилось с 4200 до 30 000, при этом аллогенные трансплантации составили 41% из которых 53% от неродственного донора [3]. Подобный рост трансплантационной активности сопровождается также увеличением потребности в тромбоцитосодержащих компонентах крови. Так, в Великобритании количество трансфузий тромбоцитов возросло с 4,0 на 1000 населения в 2005 году до 4,5 на 1000 населения в 2010 году и ожидаемый прирост потребности в переливаниях тромбоцитов составляет до 5% в год [4]. В абсолютном выражении в 2010 году это составило 274 000 доз тромбоцитов. В США, Финляндии, Ирландии потребность в трансфузиях концентратов тромбоцитов еще выше - порядка 6 доз на 1000 населения.

По данным Cobain T.J. и соавт., проанализировавших эпидемиологические данные по трансфузиям компонентов крови в США, Великобритании, Австралии и Дании, количество используемых доз

концентратов тромбоцитов в этих странах колеблется от 2 до 6 на 1000 населения [5].

В России имеются проблемы с регистрацией количества трансфузий компонентов крови, так как помимо медицинских организаций системы Министерства здравоохранения имеются службы крови в таких ведомствах, как, Министерство обороны, Министерство по чрезвычайным ситуациям, Министерство внутренних дел, учреждения Академии медицинских наук и т.д. [6] По данным Е. Б. Жибурта заготовка тромбоцитов в России в 10-20 раз ниже, чем в странах Западной Европы [2] и не превышает 0,2-0,6 единиц концентрата тромбоцитов на 1000 населения.

Таким образом, во всем мире наблюдается динамический рост применения концентрата тромбоцитов. Россия же в настоящее время существенно отстает в количестве заготавливаемых тромбоцитосодержащих сред от стран Европы и США. В будущем по мере внедрения в широкую практику высокотехнологичных методов лечения, в том числе трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и протоколов высокодозной химиотерапии, потребность в концентрате тромбоцитов будет существенно увеличиваться.

Высокая потребность в концентратах тромбоцитов диктует повышение требований к их качеству и безопасности. В настоящее время используются три основные технологии заготовки концентрата тромбоцитов:

1. Метод афереза

2. Тромбоциты восстановленные из обогащенной плазмы

3. Тромбоциты восстановленные из лейкотромбоцитарного слоя

Поскольку аферезные тромбоциты получают от одного донора, их

преимущества очевидны - меньше вероятность передачи трансмиссивных инфекций, сенсибилизации к антигенам системы НЬА и др. [7] Тем не менее, тромбоциты, полученные из одной дозы цельной крови, продолжают

использоваться в практике вследствие простоты и дешевизны методики. Однако в этом случае для обеспечения достаточного прироста уровня тромбоцитов реципиенту переливают концентраты тромбоцитов, полученные от 4 до 7, в некоторых случаях до 10 доноров.

Доказано, что тромбоциты из лейкотромбоцитарного слоя имеют преимущества при хранении в сравнении с тромбоцитами, полученными из обогащенной плазмы: снижение выхода Р-селектина, более высокое количество неповрежденных тромбоцитов, лучший ответ в гипотоническом растворе [8]. Тромбоциты из лейкотромбоцитарного слоя более устойчивы при хранении и на 15 день после забора их характеристики превосходят показатели тромбоцитов из обедненной плазмы на 7 день хранения [9].

По данным группы BEST ( Biomedical Excellence lor Safer Transfusion) Collaborative в странах Западной и Северной Европы доля аферезных тромбоцитов составляет от 2% в Финляндии до 88% во Франции [10]. В остальных случаях чаще всего используются тромбоциты из лейкотромбоцитарного слоя - от 98% в Финляндии до 12% во Франции. Тромбоциты из обогащенной плазмы применяются только в трех странах -Португалии (56%), Испании (35%) и Италии (10%о).

Таким образом, тромбоциты, восстановленные из лейкотромбоцитарного слоя, сейчас находят широкое применение вследствие простоты получения и удобства хранения, но при этом они имеют существенный недостаток - количество доноров. Остается актуальной проблема аллоиммунизации к HLA антигенам, образования антитробоцитарных антител и резистентности к трансфузиям, особенно в группе пациентов с депрессиями кроветворения и онкогематологическими заболеваниями.

Аллоиммунизация к HLA антигенам при трансфузиях тромбоцитов была признана серьезным осложнением еще пять десятилетий назад. Частота

выявления аллоантител и вероятность развития резистентности к трансфузиям тромбоцитов пропорциональна количеству доноров [11]. Трансфузионные фебрильные реакции являются одним из следствий сенсибилизации к HLA антигенам. Фебрильные реакции при трансфузиях от нескольких доноров наблюдаются статистически значимо чаще, чем при трансфузии от одного донора (8,4% vs 21,4%; р<0,001)[12].

Учитывая рост частоты трансфузий тромбоцитов, риск заражения реципиента при переливании компонентов крови, особенно при наличии большого числа доноров, является весьма существенным и не может не приниматься во внимание. В среднем риск вирусного заражения при увеличении количества доноров от 1 до 8 возрастает от 3,6 до 36 на 1000 пациентов [13]. В США несмотря на систему строгой селекции доноров тромбоцитов и скрининга гемотрансмиссивных инфекций, внедренные в 1980х годах после серии случаев заражения ВИЧ, летом и весной 2002 года была зарегистрирована трансфузионно-обусловленная эпидемия лихорадки Западного Нила [14]. В настоящее время не разработаны методы скрининга для 68 различных инфекционных агентов, которые могут передаваться при переливании компонентов крови [15]. Среди них важнейшее эпидемиологическое значение имеют такие патогенны, как прионы, вызывающие болезнь Creutzfeldt-Jakob, вирус лихорадки Денге и Babesia sp. В России также не теряет актуальности и проблема заражения парентеральными вирусными гепатитами [16].

Инициальный риск бактериальной контаминации существенно ниже -0,9 на 1000 трансфузий [13], но при этом роль данного вида заражения компонентов крови имеет не менее важное и с течением времени возрастающее практическое значение. Бактериальное обсеменение концентратов тромбоцитов происходит, как правило, в момент донации. В дальнейшем, при хранении в течение 5 дней в температурном диапазоне 20-

24° С, количество микроорганизмов может многократно увеличиваться [17]. В США риск развития бактериемии/сепсиса, связанного с трансфузией аферезных тромбоцитов от одного донора в 2010 году составлял 1/60000 трансфузий [18]. Вероятность контаминации тромбоцитов, полученных из цельной крови от нескольких доноров статистически значимо, в 5,6 раза выше в сравнении с аферезными тромбоцитами [19]. Объяснение этому факту очень простое - чем выше частота венепункций, тем больше вероятность контаминации компонентов крови микроорганизмами, находящимися на коже [20]. При получении аферезного концентрата тромбоцитов проводится лишь одна венепункция, при получении тромбоцитов из цельной крови - от 4 до 6-7 венепункций. Селекция доноров, обработка места венепункции 70% спиртом в сочетании с 2% раствором хлоргекседина, микробиологическое тестирование образцов крови снижают риск бактериальной контаминации на 50% [21]. Тем не менее, риск тяжелых осложнений, связанных с бактериальным обсеменением

тромбоконцентратов, в том числе с летальным исходом, сохраняется. По данным Ес1ег е1 а1. на 1004000 протестированных концентратов тромбоцитов приходилось 20 септических реакций от 17 донаций, при этом в трех случаях со смертельным исходом [22]. Схожие данные по частоте бактериальной контаминации и развитию тяжелых септических реакций приводят и другие авторы [23, 24].

Таким образом, организационные мероприятия, формирование пула кадровых доноров, проведение строгой селекции допоров, качественное микробиологическое тестирование компонентов крови, обеспечение принципа «один донор - один реципиент» являются недостаточными для обеспечения инфекционной безопасности трансфузий [25,26]. Рост количества трансфузий тромбоцитов, расширение спектра тяжелых гемотрансмиссивных инфекций, учащение тяжелых осложнений, связанных с

бактериальной контаминацией концентратов тромбоцитов диктует необходимость внедрения методов патогенинактивации.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние инактивации патогенов в концентратах тромбоцитов на функцию тромбоцитов»

Цель работы:

изучить влияние фотодинамического метода инактивации патогенов в концентрате тромбоцитов с использованием амотосалена на функцию тромбоцитов

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ количественных и морфометрических характеристик тромбоцитов в концентрате в зависимости от инактивации патогенов

2. Определить степень экспрессии маркеров активации тромбоцитов до и после инактивации патогенов

3. Исследовать влияние инактивации патогенов на агрегацию тромбоцитов после активации АДФ, ристомицином и коллагеном

4. Оценить влияние инактивации патогенов на клиническую эффективность переливаний концентратов тромбоцитов

Научная новизна работы

Получены новые данные о влиянии ПИ в КТ с применением амотосалена на функциональный статус тромбоцитов.

Впервые проведено исследование агрегации тромбоцитов с тремя индукторами для оценки влияния ПИ в КТ на функцию тромбоцитов.

Научно-практическая ценность работы

Данные, полученные в результате исследования, могут быть использованы в клинике при планировании заместительной терапии и службой крови для адекватного обеспечения клинических отделений концентратами тромбоцитов.

Положения, выносимые на защиту

1. Проведение ПИ методом INTERCEPT приводит к уменьшению количества тромбоцитов в концентрате.

2. ПИ существенно снижает уровень спонтанной активации тромбоцитов (в том числе экспозиции ФС, Р-селектина и чувствительности АДФ-рецепторов), происходящей во время хранения концентратов.

3. Гемостатический эффект трансфузии ПИ КТ у реципиентов сопоставим с трансфузиями КТ, не подвергнутых инактивации.

4. После трансфузии КТ подвергнутых ПИ посттрансфузионный прирост статистически значимо ниже по сравнению с переливанием необработанных КТ.

5. Использование ПИ не приводит к сокращению межтрансфузионного интервала и увеличению количества трансфузий КТ.

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 в зарубежных изданиях и 2 статьи в журналах рецензируемых ВАК.

и

Материалы работы доложены на симпозиумах и конференциях: Всероссийская научно практическая конференция: «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины», 6-7 октября, 2010г., Киров.

23rd Regional Congress of the International Society of Blood Transfusion, 2-5 июня, 2013 г., Амстердам, Голландия.

VII Международный симпозиум, посвященный памяти Раисы Максимовны Горбачевой: «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей и взрослых», 19-21 сентября, 2013 г., Астана, Республика Казахстан.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Переливание донорских тромбоцитов является неотъемлемой и важной частью терапии больных острыми лейкозами и другими гематологическими заболеваниями сопровождающимися тромбоцитопенией. До начала широкого применения трансфузий донорских тромбоцитов у пациентов с острыми лейкозами, кровотечение было наиболее частой причиной смерти превосходившей инфекционные осложнения [27]. Доступность трансфузионных сред позволяет проводить профилактические переливания тромбоцитов, прогнозируя развитие глубокой тромбоцитопении при проведении высокодозной химиотерапии. Переливание компонентов крови, в том числе и тромбоцитов, имеет свои риски и осложнения. К отрицательным последствиям переливания тромбоцитов относят:

1. Негемолитические фебрильные реакции, возникающие вследствие реакции антител реципиента с антигенами на мембранах переливаемых лимфоцитов, грапулоцитов или самих тромбоцитов.

2. Аллосенсибилизация вследствие многократных трансфузий с развитием рефрактерное™ к трансфузиям тромбоцитов.

3. Реакция «трансплантат против хозяина» развивающаяся у больных с иммунодепрессией.

4. Риск бактериального и вирусного инфицирования.

В связи с ростом количества трансфузий все более актуальной становится проблемы бактериального и вирусного инфицирования. Тщательный отбор доноров, следование принципу «один донор - один реципиент», микробиологическое тестирование концентратов тромбоцитов

снижают риск инфицирования, но не могут гарантировать полной бактериальной и вирусной безопасности.

С целью направленного снижения риска бактериального и вирусного инфицирования реципиента, а так же риска возникновения реакций обусловленных воздействием остаточных лейкоцитов донора, службой крови применяются методы патогенинактивации концентратов тромбоцитов.

Методы патогенинактивации концентратов тромбоцитов

Идеальный метод патогенинактивации концентрата тромбоцитов должен обеспечивать деконтаминацию всех инфекционных агентов -бактерий, грибов, вирусов, прионов. При этом он не должен оказывать влияния на количество и функциональную активность тромбоцитов. В настоящее время подобный универсальный метод патогенинактивации не разработан. Каждый из используемых сегодня имеет свои достоинства и недостатки. Условно все существующие методы патогенинактивации компонентов крови, применяемые в практике службы крови, могут быть разделены на три группы:

1. Нанофильтрация;

2. Методы с использованием сольвент-детергентов;

3. Фото динамические методы.

Использование нанофильтров для обработки концентратов тромбоцитов неприемлемо в связи с тем, что размеры тромбоцитов превышают 1 мкм, то есть более чем в 1000 раз больше размеров наночастиц [28]. Обработка сольвент-детергентами применяется только для патогенинактивации плазмы и белков, поскольку данные агенты (например, три-Ы-бутилфосфат в комбинации с твином-80) разрушают все биологические объекты, имеющие липидную мембрану [29,30]. Сольвент-детергенты эффективно воздействуют

на вирусы с липидной оболочкой, такие как HIV, HBV, HCV, но не влияет на безоболочечные вирусы, как например парвовирус В19. [31]

Фотодинамические методы являются более перспективными и некоторые из них приемлемы для обработки концентратов тромбоцитов. Принципиальный подход, используемый во всех фотодинамических методах патогенинактивации, является единым: компонент крови обрабатывается веществом, которое при облучении светом с определенной длиной волны способно вызывать повреждение нуклеиновых кислот или клеточных мембран. В зависимости от спектра излучения и используемого деконтаминационного агента фотодинамические методы патогенинактивации компонентов крови в свою очередь можно разделить на следующие группы:

1. Методы с использованием ультрафиолетового облучения [32] или его комбинация:

a. С псораленами [25];

b. С рибофлавином (витамин В2) [33]

2. Методы, использующие облучение в видимой части спектра с добавлением:

a. Метиленового синего [34,35];

b. Мероцианина 540 [36];

c. Гематопорфиринов [37];

d. Фталоцианинов [37];

e. Рибофлавина [38]

Ультрафиолетовое излучение в В и С-диапазопах может использоваться для инактивации бактерий (Clostridium perfringens, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, К. pneumoniae, Propionibacterium acnes, Pseudomonas aeruginosa, S. Epidermidis) безоболочечных вирусов, и приводить к дополнительной лейкодеплеции. [39,40]

Однако, высокая интенсивность ультрафиолетового облучения тромбоцитов может оказывать влияние на их функциональную активность. Van Marwijlc и соавторы [41] наблюдали после облучения тромбоцитов ультрафиолетовым светом в В-диапазоне активацию агрегации тромбоцитов. Другая группа исследователей обнаружила уменьшение прироста уровня тромбоцитов после воздействия ультрафиолетового облучения в В-диапазоне [42]. Очевидно, что агрегация тромбоцитов in vitro и уменьшение прироста после трансфузии in vivo взаимосвязаны.

При исследовании эффективности и клинической безопасности системы патогенинактивации THERAFLEX, основанной на облучении концентрата тромбоцитов ультрафиолетовым светом в С-диапазоне с длиной волны 254 нм было установлено, что после процедуры наблюдается агрегация тромбоцитов in vitro [43]. Данный эффект опосредован прямой активацией мембранного интегрина allb(33 (GP Ilb/lIIa) под влиянием ультрафиолетового облучения без изменения активности систем внутриклеточной трансдукции сигналов.

Псоралены являются наиболее перспективными компонентами для патогенинактивации компонентов крови, в особенности тромбоцитов. Они способны связываться с нуклеиновыми кислотами и под влиянием ультрафиолетового излучения оказывают действие, аналогичное алкилирующим соединениям, эффективно ингибируя все основные функции ДНК и РНК - репликацию, транскрипцию, трансляцию и репарацию. [44]

Исследования показали, что этот метод инактивации позволяет эффективно нейтрализовать большинство известных болезнетворных микроорганизмов, включая оболочечные и безоболочечные вирусы, бактерии, простейшие (таблица 1-3), теоретически может оказывать влияние на грибы [45,46]. В отношении прионов, учитывая отсутствие у этих патогенов нуклеиновых кислот, псоралены не эффективны.

Таблица 1. Инактивация вирусов

Снижение Log

Оболочечныс HIV-1, cell-free >6.2

HIV-1, cell-associated >6.1

HBV > 5.5

HCV >4.5

HTLV-I, cell associated 4.7

HTLV-II, cell associated 5.1

CMV, cell-associated > 5.9

WNV > 6.0

SARS (Corona Virus) >6.2

Vaccinia > 5.2

Chikungunya > 6.4

H5N1 >5.9

Безобол очечные Bluetongue Virus 6.1 - 6.4

Calicivirus 1.7-2.4

SV 15 0.7-2.3

B19 4->5.5

Human Adenovirus 5 > 5.7

Таблица 2. Инактивация бактерий

Грамположительные (Аэробные и анаэробные) Снижение Log rpaivioTpHna i ejibiibie Снижение Log

Staphylococcus epidermidis >6.6 Escherichia coli > 6.4

Staphylococcus aureus 6.6 Serratia marcescens >6.7

Streptococcus pyogenes >6.8 Klebsiella pneumoniae >5.6

Listeria monocytogenes >6.3 Pseudomonas aeruginosa 4.5

Corynebacterium minutissimum >6.3 Salmonella choleraesuis >6.2

Bacillus cereus (vegetative) > 6.0 Yersinia enterocolitica > 5.9

Lactobacillus sp > 6.9 Enterobacter cloacae 5.9

Bifidobacterium adolescentis >6.5 Spirochetes

Propionibacterium acnes >6.7 Treponema pallidum 6.8 - 7.0

Clostridium perfringens >7.0 Borrelia burgdorferi >6.8

Таблица 3. Инактивация простейших

Снижение Log

Trypanosoma cruzi > 5.3

Plasmodium falciparum >6.0

Leishmania mexicana > 5.0

Leishmania major >4.3

Babesia microti >5.3

Существует определенный риск того, что псоралены, влияя на все виды нуклеиновых кислот, в том числе цитоплазматические РНК, могут опосредованно ухудшать функциональную активность тромбоцитов, особенно при длительных (до 5 суток) сроках хранения концентрата тромбоцитов [47J.

Рибофлавин, так же как и псоралены, интеркалирует между азотистыми основаниями нуклеиновых кислот и при ультрафиолетовом облучении с длиной волны 265-370 нм вызывает окисление гуанина, делая невозможной репликацию. [48] Данный метод близок по механизму действия, антимикробному спектру и возможным побочным эффектам к современным методам, основанным на использовании синтетических псораленов, конкурирует с ними. [49] Если при воздействии ультрафиолетовых лучей повреждение ДНК является обратимым, то при добавлении рибофлавина оно становится необратимым за счет модификации гуанина [50]. Janetzko и соавт. показали, что повреждающее действие рибофлавин+ультрафиолет более избирательно в отношении ядерной ДНК в сравнении с митохондриальиой [51].

Рибофлавин инактивирует 104-105 внутриклеточных и внеклеточных HIV, вирусов лихорадки Западного Нила, свиной Parvovirus, вирус везикулярного стоматита, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Klebsiella pneumonia. [52-57]

Результаты лабораторных исследований влияния обработаных рибофлавином тромбоцитов в сочетании с воздействием ультрафиолета свидетельстовали о том, что их количество, морфология, функциональные свойства значимо не отличались от аналогичных показателей контрольной группы [55, 58, 59]. В настоящее время имеется коммерческая система MIRASOL, основанная на рибофлавине (Caridian ВСТ Biotechnologies, Lakewood, СО, USA).

В рандомизированном контролируемом исследовании MIRACLE была оценена эффективность и безопасность концентратов тромбоцитов после патогенинактивации рибофлавином в сочетании с УФО с использованием системы MIRASOL [60]. В исследовании были проанализированы результаты трансфузий 678 лечебных доз концентрата тромбоцитов у 110 пациентов (56 после обработки рибофлавином, 54 - контрольная группа). Между группами не было выявлено статистически значимых различий в среднем количестве дней между трансфузиями концентрата тромбоцитов, средним числом трансфузий концентрата тромбоцитов и количеством их доз. Однако, по первичной конечной точке между основной и контрольной группами были выявлены статистически значимые различия (р<0,0001). В данном исследовании первичной конечной точкой являлось среднее скорректированное повышение уровня тромбоцитов через 1 час после трансфузии. В основной группе показатель составил 11725±1140, в контрольной 16939±1149, то есть прирост тромбоцитов после патогенинактивации с использованием рибофлавина через 1 час после трансфузии был статистически значимо ниже в сравнении с результатами трансфузии тромбоцитов, не подвергавшихся специальной обработке. Авторы данного исследования не делают выводы о том, насколько этот факт влияет на частоту геморрагических осложнений, по можно предположить, что для достижения «безопасного» уровня кровяных пластинок (10-20x109/л) необходимо увеличить частоту траисфузий рибофлавин-обработанных концентратов тромбоцитов.

Метиленовый синий под влиянием длинноволнового видимого света (600 нм и более) приводит к инактивации большинства вирусов и бактерий в результате генерации свободных радикалов, в основном синглетного кислорода [35, 61]. В то же время метиленовый синий практически не оказывает влияния на внутриклеточные патогены, что существенно снижает

его возможность использования для обработки концентратов тромбоцитов и в современных системах для патогенинактивации кровяных пластинок данный агент не используется [62].

В настоящее время другие деконтаминационные агенты, активируемые видимым светом не нашли широкого клинического применения для патогенинактивации тромбоцитов. Гемопорфирины используются в основном для обработки эритроцитсодержащих сред, воздействуют только на вирусы [63]. Мероцианин 540 значительно нарушает функцию тромбоцитов. Алюминиевые фталоцианиновые тетрасульфонаты не эффективны при бактериальной контаминации и их влияние на функцию тромбоцитов остается неясным. Рибофлавин, являющийся эффективным при использовании ультрафиолетового облучения использовался так же в комбинации с облучением видимым светом, но противовирусная эффективность подобного сочетания была ниже и требовала дополнительного уменьшения уровня альбумина. [64]

В основе всех методов патогенинактивации лежит фотодинамический эффект - нарушение биологических функций или структур клетки действием света при наличии кислорода и поглощенных красителей [65]. В обобщенном и несколько упрощенном виде различия между двумя группами фотодинамической патогенинактивации компонентов крови связаны с различиями в длине волны излучения. При воздействии более коротковолнового ультрафиолетового излучения первичные события в первую очередь вызывают повреждение нуклеиновых кислот, более длинноволновое видимое излучение в сочетании с фотосенсибилизаторами вызывает образование активных форм кислорода и повреждение липидов биологических мембран и в меньшей степени белков. Данное обобщение позволяет сделать вывод о том, что методы, использующие ультрафиолетовое излучение, имеют более избирательное действие, могут

влиять на вирусы, бактерии и ядросодержащие клетки крови, а также эндомитохондриальные нуклеиновые кислоты и, в меньшей степени, влияют на целостность клеточных мембран. В свою очередь методы, использующие видимый свет могут инактивировать оболочечные вирусы и вызывать цитолиз, как бактерий, так и клеток крови и тромбоцитов.

Таким образом, из всех методов патогенинактивации концентратов тромбоцитов в настоящее время наиболее приемлемым с учетом спектра патогенов в практике службы крови являются фотодинамические с использованием ультрафиолетового облучения и фотосенсибилизаторов. Данные методы потенциально могут приводить к изменению морфологии, ухудшению функции и уменьшению количества кровяных пластинок, как за счет нарушения процессов трансляции, так и за счет прямого повреждающего действия на биологические макромолекулы.

Влияние патогенинактивации с использованием амотосалена на морфофункцнональные характеристики тромбоцитов

Псоралепы (фурокумарины) - соединения растительного происхождения, фотохимически активные и в комбинации с длинноволновым ультрафиолетовым излучением (320-400 нм) используются при лечении псориаза, витилиго, кожных Т-клеточных лимфом, кожных проявлений реакции трансплантат против хозяина при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (РНУА-терапия) [66, 67]

Псоралепы гидрофобны, хорошо проникают через клеточные мембраны. Молекулы псораленов способны встраиваться (интеркалировать) между двумя парами оснований ДНК благодаря структурной схожести с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот. Интеркаляция не ведет к серьезным последствиям для молекулы ДНК и является обратимым процессом. В 1965 году итальянские исследователи Л.Мюсайо, Дж.

Родигъеро и др. обнаружили, что при ультрафиолетовом облучении в А диапазоне (длина волны более 320 нм) молекула псоралена переходит в электронно-возбужденное состояние и ковалентно присоединяется к тимидину [65]. Образованная связь очень прочна и не разрушается при нагревании до 100°С, воздействии щелочей и кислот.

Способность псораленов к взаимодействию с молекулами ДНК при воздействии ультрафиолетовому облучению высокоспецифична. Данный механизм является не единственным молекулярным механизмом реализации биологических фотодинамических эффектов псораленов. Однако еще 20 лет назад JI. Киттлер обнаружил, что псоралены образовывают циклобутановые аддукты не только с ДНК, но и с ненасыщенными липидами биологических мембран [цит. по 68]

Первым псораленом, который был использован для патогенинактивации плазмы, был 8-метоксипсорален [66]. В связи с неблагоприятным влиянием на выживаемость тромбоцитов в настоящее время данный тип псораленов не применяется [69].

Амотосален является новым классом аминопсораленов. В настоящее время он является основным представителем данного класса веществ, применяемых для патогенинактивации, т.к. лишен основных недостатков своих предшественников. [70]

Эффективность Амотосалена является достаточно высокой в

1 6

исследованиях in vitro. Амотосален ииактивирует 10-10 оболочечных и безоболочечных вирусов, в том числе Parvovirus, грамположительных и грамотрицательных бактерий и простейших [71, 72].

Способность Амотосалена нарушать структуру нуклеиновых кислот приводит не только к инактивации ДНК или РНК-содержащих микроорганизмов, но и к подавлению репликации нуклеиновых кислот в клетках крови. Практически важным фактом является способность

фотодинамических методов вызывать подавление пролиферативной активности лимфоцитов, что позволяет предотвращать трансфузионную реакцию трансплантант против хозяина и отказаться от дополнительного рентгеновского или у-облучения [73-78].

Как известно, тромбоциты представляют собой фрагменты цитоплазмы и цитолеммы мегакариоцитов, лишенные ядра, а, следовательно, и ДНК и содержащие только транспортные, митохондриальные и матричные РНК. Если не принимать во внимание некоторый незначительный цитолитический эффект, связанный преимущественно с ультрафиолетовым облучением, рибофлавин и амотосален вызывают достаточно специфическое ингибирование основных функций нуклеиновых кислот [32, 49, 65]

Однако эффекты амотосалена могут реализовываться через влияние на цитоплазматические или митохондриальные нуклеиновые кислоты и ненасыщенные жирные кислоты билипидного слоя плазмолеммы. Функции тромбоцитов многообразны, они включают не только участие в гемостазе, поддержании структуры сосудистого эндотелия, но выполняют защитную, антигенпрезентирующую [79] и транспортную функции. Предсказать и оценить изменение функциональных свойств тромбоцитов во всем их многообразии после воздействия амотосалена невозможно. Однако, трансфузии концентрата тромбоцитов проводятся в основном для достижения одной единственной цели - купирования или профилактики тромбоцитопенических кровотечений. В данном контексте конечной точкой исследования будет являются достижение клинической гемостатической эффективности трансфузии концентрата тромбоцитов, а суррогатными точками - морфологические или функциональные характеристики тромбоцитов in vitro, наиболее тесно коррелирующие с их гемостатическими свойствами.

В настоящее время доступна коммерческая система INTERCEPT, основанная на амотосалене ("Cerus Corporation", США). Наличие стандартизированных протоколов патогенинактивации с использованием данной системы позволяет проводить многоцеитровые рандомизированные исследования и оценивать эффективность, токсичность и безопасность технологии снижения патогенности.

Технология INTERCEPT для патогенинактивации тромбоцитов и плазмы базируется на трех важных элементах: обработке компонентов крови амотосаленом (150 мкмоль/л, конечная концентрация), облучение ультрафиолетовым светом в А-диапазоне

(3 J/cm ) и удаление остатков фотосенсибилизатора с использованием абсорбционной системы. Данная система не использует ультрафиолетовые лучи В и С диапазонов, поскольку известно, что коротковолновое УФО приводит к генерации активных форм кислорода, повреждающих белковые молекулы и, возможно, тромбоциты [80].

В таблице 4 приведены некоторые наиболее важные исследования эффективности и безопасности тромбоцитов, обработанных с использованием системы INTERCEPT. Обращает внимание, что исследований, в которых проводилась бы одновременно оценка клинической эффективности трансфузий и «суррогатных» маркеров функционального состояния тромбоцитов, пет. Это может считаться существенным недостатком, поскольку закономерности, выявляемые в клинических и лабораторных исследованиях, рассматриваются раздельно.

Таблица 4. Исследования эффективности трансфузий концентратов тромбоцитов, инактивированных с использованием системы INTERCEPT

№ п/ п Авторы, год Тип исследования, кол-во пациенюв, п Первичные конечные точки и «Суррогатные» маркеры Вторичные точки Выводы

1 Vamvakas Е.С. (2012 г.) [81] Мета-анализ 5 рандомизированных контролируемых исследований (п-923) Частота кровотечений (градация по классификации ВОЗ) Прирост числа тромбоцитов через 1 и 24 часа после трансфузии (СЪ); скорректированный Ск; количество дней до следующей трансфузии; частота рефрактерности к трансфузиям тромбоцитов; Патогенинактивац ия с использованием системы Мегсергможет увеличивать риск всех и клинически значимых (но не тяжелых) кровотечений

2 Огородникова МД. и соавт. (2011 г.) [82] Открытое не рандомизированное исследование (п=16) Р-селектин (СЭ62Р); АппехтУ (РБ); Не оценивались Тромбоцитаферез статистически значимо увеличивает экспрессию СБ62Р и АппехтУ. Последующая фотохимическая обработка и у- облучение тромбоцитов не влияют на экспрессию данных маркеров.

3 КегкМв и соавт. (НОУОЫ 82) (2010 г.) [83] Проспективное, рандомизированное, открытое (п=179) Прирост уровня тромбоцитов через 1 час Прирост уровня тромбоцитов через 24 часа; кровотечения; интервал между трансфузиями тромбоцитов Эффективность тромбоцитов, подвергнутых патогенинактивац ии ниже не обработанных (32% геморрагических эпизода в сравнении с 15%; р=0,034)

4 МсСиИоицЬ 1 и соавт. (8Р1ШТ) (2004 г.) [47] Проспективное, рандомизированное, открытое (п-645) Частота кровотечений (градация по классификации ВОЗ) Прирост числа тромбоцитов через 1 и 24 часа после трансфузии (СЛэ); скорректированный Об; количество дней до следующей трансфузии; частота рефрактерности к трансфузиям тромбоцитов; Частота кровотечений 2 градации по ВОЗ были эквивалентны для патогенинактивир ованных и не обработанных тромбоцитов, но потребность в грансфузиях тромбоцитов была выше в первой группе.

5 БсЫепке Р. (2011 г.) [84] Обсервационное, открытое исследование (п=51) Частота острых трансфузионных реакций Частота кровотечений, прирост числа тромбоцитов через 1 и 24 часа; побочные реакции Патогенинактивир ованные тромбоциты безопасны и эффективны

6 Рюкег 8. М. (2009 г.) [85] Открытое не рандомизированное сравнительное исследование (27 доз аферезного концентрата тромбоцитов) Количество тромбоцитов, газы крови, метаболизм (лактат, глюкоза), функция тромбоцитов ¡пукго (ответ на гипотонический шок, агрегация), клеточные интегрины (ДС- 1 сигнал, АппехтУ, С062Р) Пе оценивались Патогенинактивир ованные тромбоциты не отличались в течение 7 дней хранения от контроля по всем учитываемым параметрам

В 11 клинических трайлах, включивших более 1000 пациентов, была продемонстрирована безопасность системы Intercept и эффективность трансфузии тромбоцитов, подвергнутых патогенинактивации [86]. Изучалось использование тромбоцитов как с целыо профилактики геморрагических осложнений, так и в качестве терапии при острых кровотечениях. Результаты данных исследований позволили начать использование тромбоцитов, обработанных фотодинамическим методом с использованием амотосалена в рутинной клинической практике во многих европейских странах. В ретроспективном одноцептровом исследовании, включившем данные о 13 ООО трансфузиях обработанных псораленом концентратов тромбоцитов, не выявлено увеличения потребности в трансфузиях в сравнении с использованием тромбоцитов, не подвергнутых патогенинактивации. [87]

Важным вопросом, который возникает при использовании систем патогенинактивации, является их безопасность. Потенциальный канцерогенный эффект был исключен в исследованиях па животных [88]. Иммунологическая безопасность псораленов требовала более тщательного подтверждения. Под влиянием псораленов происходит модификация белков и нуклеиновых кислот с образованием неоантигенов, что также может иметь определенные последствия. В частности, модификация поверхностных гликопротеидов тромбоцитов может приводить к развитию иммунной тромбоцитопении.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Накастоев, Ислам Мухарбекович, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Improving blood safety worldwide //Lancet. 2007.-Vol.370.-Suppl. 9585.-P. 361.

2. Жибурт E. Концетрат тромбоцитов в России и за рубежом //Медицинская газета. 2007.-№46.-С. 46.

3. Passweg J.R., Baldomero Н., Gratwohl A., Bregni М. et al. The EBMT activity survey: 1990-2010 // Bone Marrow Transplant. 2012.- Vol. 47.-Suppl.7.-P.906-923.

4. Massey Ed. Use of platelets in hospitals: factors that are driving up demand, 2012.- P. 8.

5. Cobain T.J., Vamvakas E.C., Wells A., Titlestad K. A survey of the demographics of blood use //Transfus Med. 2007.-Vol.17.-Suppl. 1.-P. 1-15.

6. Воробьев А.И. Трансфузиология вчера, сегодня, завтра Доклад на симпозиуме «Безопасность переливания компонентов крови» 07-08 декабря 2006 г. Москва

7. Ness P.M., Campbell-Lee S.A. Single donor versus pooled random donor platelet concentrates // Curr Opin Hematol. 2001.-Vol. 8.-Suppl.6.-P. 392396.

8. Bertolini F., Rebulla Т., Porretti L., Murphy S. Platelet quality after 15-day storage of platelet concentrate prepared from buffy coats and stored in a glucose-free crystalloid medium // Transfusion 1992.-Vol. 32.-P. 9-16.

9. Murphy S. The efficacy of synthetic media in the storage of human platelets for transfusion//Transfus Med Rev. 1999.-Vol. 13.-P. 153-163.

10.Murphy S. Platelets from pooled buffy coats: an update //Transfusion. 2005,- Vol. 45.- Issue 4.- P. 634-639.

11.Pavenski K, Freedman J, Semple JW. HLA alloimmunization against platelet transfusions: pathophysiology, significance, prevention and management. Tissue Antigens. 2012 Apr;79(4):237-45.

12.Chambers L.A., Kruskall M.S., Pacini D.G., Donovan L.M. Febrile reactions añer platelet transfusion: the effect of single versus multiple donors // Transfusion. 1990.-Vol. 30.-N3.-P. 219-221.

13.McCullough J. Transfusion Medicine, 3rd Edition, 2012.

14.Vamvakas E.C. Relative safety of pooled whole-blood-derived versus single-donor (apheresis) platelets in the United States: a systematic review of disparate risks. // Transfusion. 2009.-Vol. 49.-P. 2743-2758.

15.Stramer S.L., Hollinger F.B., Katz L.M., et al. Emerging infectious disease agents and their potential threat to transfusion safety // Transfusion.2009.-Vol. 49.-Suppl. 2.-P. 1S-236S.

16.Гармаева Т.Ц., Куликов C.M., Карякип A.B., Терентьева JT.А. и соавт. Мониторироваиие факторов риска и индикаторов инфицированное™ вирусами гепатитов В и С гематологических больных // Гематология и трансфузиология. 2006.-№ 1.-С .23-27.

17.Corash L. Inactivation of Viruses, Bacteria, Protozoa and Leucocytes in Platelet and Red Cell Concentrates // Vox Sang. 2000,- Vol. 78.-Suppl. 2.-P. 205-210.

18.Vamvakas E.C., Blajchman M.A. Blood still kills: six strategies to further reduce allogeneic blood transfusion-related mortality // Transfus. Med. Rev. 2010.-Vol. 24.-P. 77-124.

19.Spahn D.R., Vamvakas E.C. Is best transfusion practice alone best clinical practice? // Blood Transfus. 2013.-Vol.l 1.-N2.-P. 172-174.

20.Kleinman S., Dumont L.J., Tomasulo P. et al. The impact of discontinuation of 7-day storage of apheresis platelets (PASSPORT) on recipient safety: an illustration of the need for proper risk assessments //Transfusion. 2009.-Vol. 49.-P. 903-912.

21.Eder A.F., Kennedy J.M., Dy B.A., Notari E.P. et al. Bacterial screening of apheresis platelets and the residual risk of septic transfusion reactions: the American Red Cross experience (2004-2006) // Transfusion. 2007.-Vol. 47.-N7.-P. 1134-1142.

22.Ramírez-Arcos S., Kou Y., Mastronardi C., Perkins H., Goldman M. Bacterial screening of outdated buffy coat platelet pools using a culture system and a rapid immunoassay // Transfusion. 2011.- Vol. 51.-N12.-P. 2566-2572.

23.de Korte D., Curvers J., de Kort W.L., Hoekstra T. et al. Effects of skin disinfection method, deviation bag, and bacterial screening on clinical safety of platelet transfusions in the Netherlands // Transfusion. 2006.-Vol. 46.-N.3.-P. 476-485.

24.Alter H.J. Pathogen reduction: a precautionary principle paradigm // Transfus Med Rev. 2008,-Vol. 22.-P. 97-102.

25.Klein H.G., Anderson D., Bernardi M.J., Cable R. et al. Pathogen inactivation: making decisions about new technologies. Report of a consensus conference // Transfusion. 2007.-Vol. 47.-P. 2338-2347.

26.Жибурт Е.Б. Бенчмаркинг заготовки и переливания крови. Руководство для врачей/ Издание Российской академии естественных наук.- М., 2009,- 364 с.

27.ISO ISO/TS 27687:2008 Nanotechnologies - Terminology and definitions for nano objects - nanoparticle, nanofibre and nanoplate. Available at http://www.iso.org/iso/iso catalogue.htm

28.http://www.chem.unep.ch/irptc/sids/OECDSIDS/126-73-8.pdf

29.3убкова H.B. Сольвент-детергентный метод инактивации вирусов в технологии производства иммуноглобулинов // Гематология и трансфузиология.2010.- №2.-С. 39-45.

30.McCullough J. Pathogen Inactivation A New Paradigm for Preventing Transfusion-Transmitted Infections // Am J Clin Pathol. 2007.-Vol. 128.-P. 945-955.

31.Prodouz K.N, Fratantoni J.C, Boone E.J, Booner R.F. Use of lazer-UV for inactivation of virus in blood products // Blood. 1987.-Vol. 70.-P. 589-592.

32.Kumar V.K., Lockerbi O., Keil S.D. et al. Riboflavin and UVlight based pathogen reduction: extent and consequence of DNA damage at the molecular level // Photochem Photobiol. 2004.-Vol. 80.-P. 15-21.

33.Muller-Breitkreutz K., Mohr H. Hepatitis C and human immunodeficiency virus RNA degradation by methylene blue/light treatment of human plasma. //J Med Virol. 1998.-Vol. 56.-P. 239-245.

34.Wagner S.J. Virus inactivation in blood components by photoactive phenothiazine dyes // Transfus Med Rev. 2002.-Vol. 16.-P. 61-66.

35.Dodd R.Y, Moroff G, Wagner S. Inactivation of viruses in platelet suspensions that retain their in vitro characteristics: comparison of psoralen-ultraviolet A and merocyanine 540-visible light methods // Transf. 1991.-Vol.31.-P. 483-490.

36.Matthews J.L, Newman J.T, Sogandares-Bernal F. et al. Photodynamic therapy of viral contaminants with potential for blood banking applications. //Transf. 1988.-Vol. 28.-P. 81-83.

37.Rywkin S., Ben-Hur E., Malik Z. et al. New phtalocyanines for photodynamic virus inaktivation in red cell concentrates // Photochim. Photobiol. 1994.-Vol.60.-P. 165-170.

38.Pamphilon D.H, Corbin S.A, Saunders J, Tandy N.P. Aplikations of ultraviolet light in preparetion of platelet concentrates // Transf. 1989.-Vol. , 29.-P. 379-383.

39.Seltsam A., Muller Th. UVC Irradiation for Pathogen Reduction of Platelet Concentrates and Plasma // Transfus Med Elemother. 2011.-Vol. 38.-P. 4354.

40.van Marwijk K.M, Akkerman J.W., van Asbeck S. et al. UVB radiation exposes fibrinogen binding sites on platelets by activating protein kinase C via reactive oxygen species // Br J Haematol. 1993.-Vol. 83.-P. 253-258.

41.Grijzenhout M.A., Aarts-Riemens M.I., Akkerman J.W., Nieuwenhuis H.K., et al. Ultraviolet-B irradiation of platelets induces a dose-dependent increase in the expression of platelet activation markers with storage // Br J Haematol. 1993.-Vol. 83.-P. 627-632.

42.Verhaar R., Dekkers D., Cuyper Iris M. De et al. UV-C irradiation disrupts platelet surface disulfide bonds and activates the platelet integrin alfallb betta3//Blood. 2008,-Vol. 112.-N.13.-P. 4935-4939.

43.Corash L. Virus inactivation in cellular components // Vox Sang. 1996.-Vol. 70.-Suppl. 3.-P. 9-16.

44.Pineda A., McCullough J., Benjamin R.J., Cable R. et al. Pathogen inactivation of platelets with a photochemical treatment with amotosalen HC1 and ultraviolet light: process used in the SPRINT trial // Transfusion. 2006.-Vol. 46.-N.4.-P. 562-571.

45.Murphy S., Snyder E., Cable R., Slichter S.J. et al. Platelet dose consistency and its effect on the number of platelet transfusions for support of thrombocytopenia: an analysis of the SPRINT trial of platelets photochemically treated with amotosalen HC1 and ultraviolet A light. // Transfusion. 2006.-Vol. 46.-N1.-P. 24-33.

46.McCullough J., Vesole D.H., Benjamin R.J., Slichter S.J. et al. Therapeutic efficacy and safety of platelets treated with a photochemical process for pathogen inactivation: the SPRINT Trial // Blood. 2004,-Vol. 104.-N5.-P. 1534-1541.

47.ITardwick C.C., Herivel T.R., Hernandez S.C. et al. Separation, identification and quantification of riboflavin and its photoproducts in blood products using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection: a method to support pathogen reduction technology // Photochem Photobiol. 2004.-Vol. 80.-P. 609-615.

48.Goodrich R.P., Platz M.S. The design and development of selective, photoactivated drugs for sterilization of blood products // Drugs Future. 1997.-Vol. 22.P. 159-171.

49.Kumar V., Lockerbie O., Keil S.D., Ruane P.FI. et al. Riboflavin and UV-light based pathogen reduction: extent and consequence of DNA damage at the molecular level // Photochem Photobiol. 2004.-Vol. 80.-P. 15-21.

50.Janetzko K., Hinz K., Marschner S., Kleter H., Bugert P. Monitoring of the Mirasol Pathogen Reduction Procedure for Platelet Concentrates by PCR and bioanalyzer // Transfus Med Hemother. 2007.-Vol.34.-Suppl l.-P. S60.

51.Ruane P.FI., Edrich R., Gampp D. et al. Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light//Transfusion. 2004.-Vol.44.-P. 877-885.

52.Li J., de Korte D., Woolum M.D. et al. Pathogen reduction of buffy coat platelet concentrates using riboflavin and light: comparisons with pathogen-reduction technology-treated apheresis platelet products // Vox Sang. 2004.-Vol. 87.-P. 82-90.

53.Goodrich R.P. The use of riboflavin for the inactivation of pathogens in blood products // Vox Sang. 2000.-Vol. 78.-P. 211-215.

54.Goodrich R.P., Li J., Edrich R. et al. The Mirasol PRT system for pathogen reduction of platelets and plasma: an overview of current status and future trends // Transfus Apheresis Sci. 2006.-Vol. 35,-P. 5-17.

55.Goodrich R.P., Edrich R.A., Goodrich L.L. et al. The antiviral and antibacterial properties of riboflavin and light: applications to blood safety and transfusion medicine. In: Silva E, Edwards AM, eds. Flavins: Photochemistry and Photobiology Cambridge, England: Royal Society of Chemistry; 2006. Comprehensive Series in Photochemistry and Photobiology; Vol 6.

56.Cardo L.J., Rentas F.J., Ketchum L. et al. Pathogen inactivation of Leishmania donovani infantum in plasma and platelet concentrates using riboflavin and light // Vox Sang. 2006.-Vol. 90.-P. 85-91.

57.Goodrich L., Ghielli M., Hansen E. et al. Riboflavin and UV light inactivate enveloped and non-enveloped viruses in platelet concentrates under conditions which maintain cell quality [abstract] // Vox Sang. 2002.-Vol. 83.-P. 111. Abstract 333.

58.Goodrich R.P., Janssen M., Ghielli M. et al. Correlation of in vitro parameters and in vivo recovery and survival values for PRT treated platelets in normal human donors // Transfusion. 2003.-Vol. 43.-P. 79A.

59.Cazenave J.P., Folia G., Bardiaux L. A randomized controlled clinical trial evaluating the performance and safety of platelets treated with MIRASOL pathogen reduction technology // Transfusion. 2010.-Vol. 50.-P. 2362-2375.

60. Wagner S.J, Robinette D, Storry J. Differential sensitivities of viruses in red cell suspensions to methylene blue photosensitization. // Transf. 1994.-Vol. 34.-P. 521-526.

61.Wagner S.J., Abe H., Benade L. Differential sensitivity to methylene blue (MB) photosensitization//Photochem.Photobiol. 1993.-Vol. 57,-Suppl. 67S

62.North J., Neyndorff H., King D., Levy J.G. Viral inaktivation in blood and red cell concentrates with benzoporphyrin derivate // Blood Cells. 1992.-Vol. 18.-P. 129-140.

63.Raymond P., Goodrich Ph D. The use of riboflavin for the inactivation of pathogens in blood products // Vox Sang. 2000.-Vol. 78.-Suppl.2.-P. 211215.

64.Ярмоиенко С.П., Вайнсон A.A. Радиобиология человека и животных.-М.: Высшая школа, 2004.-549 с.

65.Потапенко А.Я. Псоралены и медицина - 4000 летний опыт фотохимиотерапии // Соросовский образовательный журнал. 2000.-№11.- Т6.-С 22-29.

66.Llanob J., Raber J., Eriksson L. Theoretical study of phototoxic reactions of psoralens Journal of Photochemistry and Photobiology A // Chemistry. 2003.-Vol. 154.-P. 235-243.

67.Caffieri S., Zabreska Z., Dall'Acqua F., in: A. Shima, M. Ichahasci,Y. Fujiwara, H. Takebe (Eds.), Frontiers in Photobiology, Excerpta Medica, Amsterdam, 1995.

68.Goodrich R.P., Yerram N.R, Tay G.B, et al. Selective inactivation of viruses in the presence of human platelets: UV sensitization of psoralen derivatives //Proc.Natl.Acad.Sci USA. 1994.-Vol.91.-N12.-P. 5552-5556.

69.Kerkhoffs J.PL, Wim L. J., Van Putten К. Clinical effectiveness of leucoreduced, pooled donor platelet concentrates, stored in plasma or additive solution with and without pathogen reduction // British Journal of Haematology doi: 10.1111/j. 1365-2141.2010.08227.

70.Dupuis K., Alfonsol A. Helinx technology used in the INTERCEPT blood system, inactivates high titers of emerging insect-borne pathogens in platelets and red cells // Blood Banking Transfusion Med. 2003.-Vol. 1.-Suppl. l.-P. S292.

71.Sawyer L., Hanson D., Castro G. et al. Inactivation of parvovirus B19 in human platelet concentrates by treatment with amotosalen and ultraviolet A illumination // Transfusion. 2007,-Vol. 47.-P. 1062-1070.

72.Conlani M., Lin J.-S., Flament J. et al. INTERCEPT platelets treated with Helinx technology to inactivate T-cells prevented transfusion-associated graft vs host disease (TAGVHD): results of 3 clinical trials // Blood Banking Transfusion Med. 2003,-Vol. l.-Suppl. l.-P. S292.

73.Fast L.D., DiLeone G., Li J. et al. Functional inactivation of white blood cells by Mirasol treatment // Transfusion. 2006.-Vol. 46.-P. 642-648.

74.Grass J.A., Wafa T., Reames A. et al. Prevention of transfusionassociated graft-versus-host disease by photochemical treatment // Blood. 1999.-Vol. 93.-P. 3140-3147.

75.Fiebig E., Hirschkorn D.F., Maino V.C. et al. Assessment of donor T-cell function in cellular blood components by the CD69 induction assay: effects of storage, gamma radiation, and photochemical treatment // Transfusion. 2000.-Vol. 40.-P. 761-770.

76.Corash L., Lin L. Novel processes for inactivation of leukocytes to prevent transfusion-associated graft-versus-host disease // Bone Marrow Transplant. 2004.-Vol. 33.-P. 1-7.

77.Marschner S., Fast L.D., Baldwin W.M. Ill, Slichter S.J., Goodrich R.P. White blood cell inactivation after treatment with riboflavin and ultraviolet light// Transfusion 2010.-Vol. 50.-P. 2489-2498.

78.Yvonne B. Immune responses: Platelets drive shuttle buggy // Nature Reviews Immunology.2011 .-Vol. 11 .-P. 804-805.

79.Terpstra F.G., van't Wout A.B., Schuitemaker H., van Engelenburg F.A. et al. Potential and limitation of UVC irradiation for the inactivation of pathogens in platelet concentrates // Transfusion. 2008.-Vol. 48.-P. 304-313.

80.Vamvakas E.C. Meta-analysis of the studies of bleeding complications of platelets pathogen-reduced with the Intercept system // Vox Sang. 2012.-Vol. 102.-N4.-P. 302-316.

81.Огородникова М.Д., Заботина Т.Н., Борунова А.А. и соавт. Влияние фотохимической обработки у-облучения на экспрессию маркеровактивации и апоптоза тромбоцитов // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2011. 10, №1, с. 15-20.

82.Kerkhoffs J.-L. Н., Van Putten, W. L. J., Novotny, V. M. J., Те Boekhorst et al. Clinical effectiveness of leucoreduced, pooled donor platelet concentrates, stored in plasma or additive solution with and without pathogen reduction // British Journal of Haematology.-Vol. 150.-Issue. 2.- P. 209-217.

83.Schlenke P., Hagenah W., Irsch J., Sundin D. et al. Safety and clinical efficacy of platelet components prepared with pathogen inactivation in routine use for thrombocytopenic patients // Ann Hematol. 2011.-Vol. 90.-Vol. 12.-P.1457-65.

84.Picker S.M., Speer R., Gathof B.S. Functional characteristics of buffy-coat PLTs photochemically treated with amotosalen-HCI for pathogen inactivation // Transfusion. 2004.-Vol. 44.-P. 320-329.

85.Lozano M., Knutson F., Tardivel R., Cid J. et al. A multi-center study of therapeutic efficacy and safety of platelet components prepared with pathogen inactivation (INTERCEPT) stored for 6 or 7 days prior to transfusion // Vox Sang. 2010.-Vol. 99.-P. 13.

86.Cazenave J.P., Isola H., Waller C., Mendel I. et al. Use of additive solutions and pathogen inactivation treatment of platelet components in a regional blood center: impact on patient outcomes and component utilization during a 3-year period // Transfusion 2010;doi: 10.1111/j.1537-2995. 2010.02873.x.

87.Tice R.R., Gatehouse D., Kirkland D., Speit G. The pathogen reduction treatment of platelets with S-59 HC1 (amotosalen) plus ultraviolet A light: genotoxicity profile and hazard assessment // Mutat Res. 2007.-Vol. 630.-P. 50-68.

88.Lozano M., Galan A., Mazzara R., Corash L., Escolar G. Leucocyte-reduced buffy coat derived platelet concentrates photochemically treated with amotosalen-HCI and ultraviolet A light stored up to 7 days: assessment of

hemostatic function under flow conditions // Transfusion. 2006.-Vol. 47.-P. 666-671.

89.Lin C., Bardossy L., Drerup J. et al. Demonstration of in vivo hemostatic efficacy of human PCT platelets using a thrombocytopenic rabbit bleeding time model // Vox Sang. 2000,-Vol. 78.-Suppl. l.-P. 98.

90.Pyke A.D., Blajchman M.A. The pathogen inactivation of platelets: studies of the possible mechanisms of the platelet dysfunction seen following photochemical treatment [abstract] //Blood. 2006.-Vol. 108.-P. 175a.

91.1kehata LI., Ono T. The mechanisms of UV mutagenesis // J Radiat Res. 2011.-Vol. 52.-N2.-P. 115-125.

92.Snyder E., Raife T., Lin L. et al. Recovery and life span of lllindium-radiolabeled platelets treated with pathogen inactivation with amotosalen HCI (S-59) and ultraviolet A light // Transfusion. 2004,-Vol. 44.-P. 17321740.

93.Slichter S.J., Raife T.J., Davis K. et al. Platelets photochemically treated with amotosalen HCI and ultraviolet A light correct prolonged bleeding times in patients with thrombocytopenia // Transfusion. 2006.-Vol. 46.-P. 731-740.

94.Janetzko K., Klinger M., Mayaudon V. et al. Storage characteristics of split double-dose platelet concentrates derived from apheresis and treated with amotosalen hydrochloride and UVA light for pathogen inactivation // Transfus Med Hemother. 2002,-Vol. 29.-P. 193-198.

95.Picker S.M., Speer R., Gathof B.S. Functional characteristics of buffy-coat PLTs photochemically treated with amotosalen-LICI for pathogen inactivation // Transfusion. 2004.-Vol. 44.-P. 320-329.

96.Picker S. M., Oustianskaia L., Schneider V. & Gathof B. S. Functional characteristics of apheresis-derived platelets treated with ultraviolet light combined with either amotosalen-HCl (S-59) or riboflavin (vitamin B2) for pathogen-reduction // Vox Sanguinis. 2009.-Vol. 97.-P. 26-33.

97.Kamath S., Blann A.D., Lip G.Y. Platelet activation: assessment and quantification//Eur Heart J. 2001.-Vol. 22.-N17.-P. 1561-1571.

98.Simone M., Yuan Y., Josefsson E.S. et al. Two distinct pathways regulate platelet phosphatidylserine exposure and procoagulant function // Blood. 2009.-Vol. 114.-N3.-P. 663-666.

99.Lin L., Colan M.G., Tessman J., Cimino G., Porter S. Amotosalen interactions with platelet and plasma components: absence of neoantigen formation after photochemical treatment // Transfusion. 2005.-Vol. 45.-N.10.-P. 1610-1620.

100. Slichter Sh.J., Davis K., Enright EI. Factors affecting posttransfusion platelet increments, platelet refractoriness, and platelet transfusion intervals in thrombocytopenic patients // Blood. 2005,- Vol. 105.- N. 10.-P. 785-788.

101. Погорелов B.M., Бескоровайнова В.Ю., Лазаренко М.И., Гемджян Э.Г., Уртаев Б.М., Шиканова З.Г., Точенов Л.В., Козинец Г.И. Незрелые тромбоциты в периферической крови допоров до и после тромбоцитафереза // Вестник Службы крови России. 2011.-№2.-С. 2933.

102. Jung PL, Jeon Н., Kim H-J., Kim S-H. Immature Platelet Fraction: Establishment of a Reference Interval and Diagnostic Measure for Thrombocytopenia// Korean J. 2010,-Vol. 30.-P. 451-459.

103. Born G.V.R. Quantitative investigation into the aggregation of blood platelets// J. Physiol. (Lond). 1962.-P. 67P-68P.

104. O'Brien J.R. Platelet aggregation. Part II. Some results of a new study. // J. Clin. Pathol. 1962.-Vol. 15.-P. 452-455.

105. Latimer P., Born G.V.R., Michal F. Application of light-scattering theory to optical effects associated with morphology of blood platelets. // Arch. Biochem. Biophys. 1977.-Vol. 180.-P. 151-159.

106. Heddle N.M., Cook R.J., Tinmouth A., Kouroukis С. T. et al. A randomized controlled trial comparing standard- and low-dose strategies for transfusion of platelets (SToP) to patients with thrombocytopenia // Blood. 2009.-Vol. 12.-N7.-P. 1564-1573.

107. Miller А.В., Hoogstraten В., Staquet M., Winkler A. Reporting results of cancer treatment // Cancer. 1981 .-Vol. 47.-P. 207-214.

108. ГОСТ Р 53470-2009. Национальный стандарт Российской Федерации. Кровь донорская и ее компоненты. Руководство по применению компонентов донорской крови. 2011 г.

109. Karpatkin S. Heterogeneity of human platelets. VI. Correlation of platelet function with platelet volume / S. Karpatkin // Blood. 1978. Vol. 51. P. 307-316.

110. Пантелеев M.A., Васильев С.А., Аталуханов Ф.И., Воробьев А.И. (ред.). Практическая коагулология. М: практическая медицина; 2011. 32-35.

111. Heemskerk J. W., Bevers E. M., Lindhout T. Platelet activation and blood coagulation//Tromb Haemost. 2002,-Vol. 88.-N2.-P. 186-193.

112. Sims P. J., Wiedmer Т., Esmon С. T. et al. Assembly of the platelet prothrombinase complex is linked to vesiculation of the platelet plasma membrane. Studies in Scott syndrome: an isolated defect in platelet procoagulant activity // J Biol Chem. 1989.-Vol. 264.-N. 29.-P. 1704917057.

113. Ivotova Y. N., Ataullakhanov F. I., Panteleev M. A. Formation of coated platelets is regulated by the dense granule secretion of adenosine 5'diphosphat acting via the P2Y12nreceptor // J Thromb Haemost. 2008.-Vol. 6.-N9.-P. 1603-1605.

114. Wang H.L, Avila G. Platelet Rich Plasma: Myth or Reality? // Eur J Dent. 2007.-Vol. 1.-N4.-P. 192-194.