Влияние полиморфизмов в генах CCKAR, HMGA1, CTSD, DMD, IGF2 и MC4R на показатели мясной и откормочной продуктивности свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.07, кандидат наук Карпушкина Татьяна Вячеславовна

• Карпушкина Татьяна Вячеславовна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Карпушкина Татьяна Вячеславовна

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Эволюция методов оценки племенной ценности свиней

2.2. Локусы количественных признаков (ОТЬ) свиней

2.3. Откормочные и мясные качества свиней

2.3.1. QTL откормочных и мясных качеств свиней

2.3.2. Гены-кандидаты откормочной и мясной продуктивности свиней

2.4. Характеристика изучаемых ДНК-маркеров откормочной и мясной продуктивности свиней

2.4.1. Ген рецептора холецистокинина А, CCKAR

2.4.2. Ген белка высокомобильной группы А1, НМОЛ1

2.4.3. Ген катепсина Б, СТББ

2.4.4. Ген дистрофина, БМБ

2.5. Анализ методов определения полиморфизма ДНК

2.6. Заключение по обзору литературы

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Объекты и материалы исследований

3.2. Методика исследований

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Разработка тест-систем определения полиморфизмов в генах ССКЛЯ, НМОЛ1, СТ5Б и БМБ и проведение их исследовательских испытаний

4.1.1. Теоретическое моделирование тест-систем

4.1.2. Разработка лабораторного регламента производства тест-систем

4.1.3. Изготовление экспериментальных образцов и проведение исследовательских испытаний тест-систем

4.2. Популяционно-генетическая характеристика хряков пород крупная белая, ландрас и дюрок по ДНК-маркерам

4.2.1. Распределение частот генотипов и аллелей гена ССКЛЯ

4.2.2. Распределение частот генотипов и аллелей гена НМОЛ1

4.2.3. Распределение частот генотипов и аллелей гена СТБО

4.2.4. Распределение частот генотипов и аллелей гена ОМО

4.2.5. Характеристика распространения комплексных генотипов у свиней различных пород

4.3. Изучение продуктивных качеств свиней с различными генотипами по изучаемым генам

4.3.1. Характеристика мясных и откормочных качеств потомков хряков

4.3.2. Изучение продуктивных качеств свиней с различными генотипами по гену ССКЛЯ

4.3.3. Изучение продуктивных качеств свиней с различными генотипами по гену НМОЛ1

4.3.4. Изучение продуктивных качеств свиней с различными генотипами по гену СТБО

4.3.5. Изучение продуктивных качеств свиней с различными генотипами по гену ОМО

4.3.6. Изучение продуктивных качеств свиней с различными генотипами по комплексу генов

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

215

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние полиморфизмов в генах CCKAR, HMGA1, CTSD, DMD, IGF2 и MC4R на показатели мясной и откормочной продуктивности свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Разработка высоко конкурентных технологий на основе современных научных достижений, позволяющих обеспечить производство собственного (отечественного) племенного поголовья (материала) свиней, имеет особую актуальность для снижения зависимости от импорта племенного материала и обеспечения продовольственной безопасности РФ [Указ Президента РФ № 350 от 21 июля 2016 г]. Решение данной проблемы требует разработки приемов, позволяющих максимизировать эффективность селекционно-племенной работы путем получения и интенсивного использования племенных животных, характеризующихся высокими значениями племенной ценности (EBV = Estimated Breeding Value). EBV - является количественной характеристикой наследуемых признаков, дающей прогноз изменчивости продуктивности потомков в популяции при тех же условиях. Генетическое превосходство обусловлено точностью оценки племенной ценности (генотипа), интенсивностью отбора и аддитивной генетической изменчивостью признака [Кузнецов В.М., 1995]. Создание и применение на практике методов, гарантирующих получение высокоточных значений EBV для племенных животных, в том числе еще не имеющих потомства, служит дополнительным потенциалом для обеспечения прогресса в селекции и, соответственно, для повышения эффективности производства продукции животноводства. При этом для повышения точности EBV и обеспечения генетического прогресса в отношении желаемых характеристик особую значимость приобретает разработка методов оценки генотипов племенного поголовья с учетом включения в оценку генов-кандидатов [Глазко Т.Т. и др., 2008; Гладырь Е.А. и др., 2009; Рудь А.И. и др. 2013; Tang Z. et al., 2019].

Показатели мясной и откормочной продуктивности являются важнейшими признаками в селекции свиней, так как их улучшение непосредственно связано с повышением экономической эффективности производства свинины [Чернуха И.М. и др., 2012; Fontanesi L. et al., 2014; Ding R. et al., 2018; Шейко И.П. и др., 2016]. Секвенирование генома свиней [Groenen M.A.M. et al., 2012; Rubin C.J. et al., 2012;

Choi J.W. et al., 2015], развитие высокопроизводительных методов анализа полиморфизмов [Jenkins S., Gibson N., 2002] и разработка коммерческих ДНК-чипов для одновременного определения десятков тысяч и даже сотен тысяч полиморфизмов в геноме свиней [Groenen M.A.M. et al., 2009; Ramos A.M. et al., 2009; Porcine SNP60 v2 Genotyping BeadChip, 2019] позволили идентифицировать целый ряд генов-кандидатов локусов количественных признаков (QTL -quantitative trait loci) свиней, включая показатели мясной и откормочной продуктивности [Onteru S. K. et al., 2013; Do D.N. et al., 2014; Hu Z.-L. et al., 2016; Meng Q. et al., 2017; Tang Z. et al., 2019]. Многочисленные исследования генов-кандидатов выявили достоверное влияние ряда локализованных в них полиморфизмов на показатели мясной и откормочной продуктивности в различных породах и популяциях свиней [Kunhareang S., 2013; Fontanesi L. et al., 2014; Guo Y. et al., 2017; Мельникова E.E. и др., 2019], что дает основу для разработки программ маркерной селекции.

В качестве потенциальных генов-кандидатов QTL откормочной и мясной продуктивности для включения в программы маркерной селекции свиней интерес представляют гены рецептора холецистокинина А (CCKAR), белка высокомобильной группы А1 в (HMGA1), катепсина D (CTSD) и дистрофина (DMD). CCKAR влияет на ожирение и физиологический контроль потребления кормов за счет обострения чувства голода и напрямую связан с затратами корма и среднесуточными приростами [Clutter A.C. et. al., 1998; Houston R.D. et. al., 2006; Johnson R., 2010]. Главная физиологическая функция HMGA1 связана с эмбриональным развитием, в том числе с развитием жировой ткани [Fan B., 2009; Лядський I.K., 2010]. CTSD играет важную роль в формировании качественных показателей мяса, состава туши и связан со скороспелостью и эффективностью использования корма у свиней [Russo V. et al., 2008]. DMD является важной составляющей структуры мышечной ткани [Le Rumeur E. et al., 2010]. В этой связи, для обоснования целесообразности интеграции в программы селекционно-племенной работы в качестве ДНК-маркеров актуальным является разработка молекулярно-генетических тест-систем определения полиморфизмов в генах

CCKAR, HMGA1, CTSD и DMD, характеризующихся высокой аналитической специфичностью и воспроизводимостью результатов, а также оценка влияния аллельных вариантов вышеназванных генов и их сочетаний с другими потенциальными ДНК-маркерами (ген инсулиноподобного фактора роста 2, IGF2, ген рецептора меланокортина 4, MC4R) на хозяйственно-полезные признаки в российских популяциях свиней.

Степень разработанности темы исследования.

Исследования, направленные на поиск генетических маркеров, связанных с экономически-значимыми признаками свиней, проводятся во многих странах с развитым свиноводством. В настоящее время в работу ведущих племенных предприятий Российской Федерации внедряется обязательное тестирование племенного поголовья по ряду ДНК-маркеров. Поиск генетических маркеров и разработка тест-систем, позволяющих идентифицировать носителей генетических дефектов, а также выявлять желательные генетические сочетания у племенных животных и использовать полученную информацию в селекционно-племенной работе имеет важное значение как в нашей стране, так и за рубежом [Rothschild M.F. et al., 2000; Nonneman D.J. et al., 2012; Зиновьева H.A. и др., 2011]. Исследованиям в данной области посвящено значительное количество работ отечественных и зарубежных ученых [Глазко T.T. и др., 2008; Fontanesi L. et al., 2010; Лядский И.К. и др., 2011]. Таким образом, идентификация ДНК-маркеров хозяйственно-ценных признаков, разработка молекулярно-генетических тест-систем их анализа, оценка действия аллельных вариантов ДНК-маркеров на проявление хозяйственно полезных признаков свиней как основы для интеграции маркерной селекции в племенную работу характеризуется научной и практической значимостью.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение влияния полиморфизмов в генах CCKAR, HMGA1, CTSD, DMD, IGF2 и MC4R на показатели мясной и откормочной

продуктивности свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок, разводимых в России.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Выполнить теоретическое и практическое моделирование тест-систем определения полиморфизмов в генах CCKAR, HMGA1, CTSD и DMD.

2. Разработать лабораторные регламенты производства и провести исследовательские испытания тест-систем определения полиморфизмов в генах CCKAR, HMGA1, CTSD и DMD.

3. Исследовать распределение частот аллелей и генотипов по CCKAR, HMGA1, CTSD и DMD у хряков пород крупная белая, ландрас и дюрок.

4. Изучить влияние генотипов по CCKAR, HMGA1, CTSD и DMD на уровень племенной ценности (EBV), собственной продуктивности и продуктивности потомства по показателям мясных и откормочных качеств у хряков пород крупная белая, ландрас и дюрок.

5. Выполнить анализ влияния комплексных генотипов по CCKAR, HMGA1, CTSD, IGF2 и MC4R на признаки мясной и откормочной продуктивности хряков пород крупная белая, ландрас и дюрок.

Научная новизна исследования. Впервые дана характеристика аллелофонда хряков пород крупная белая, ландрас и дюрок, разводимых в России, по ДНК-маркерам CCKAR, HMGA1, CTSD и DMD. Изучено влияние генотипов по CCKAR, HMGA1, CTSD и DMD на показатели откормочной и мясной продуктивности, включая скороспелость, толщину шпика и глубину мышцы, процент выхода постного мяса у свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок, разводимых в России. Впервые определено влияние комплексных генотипов по ДНК-маркерам CCKAR, HMGA1, CTSD, IGF2 и MC4R на изучаемые хозяйственно-полезные признаки. Созданы научные основы для интеграции изучаемых ДНК-маркеров в программы селекционно-племенной работы в свиноводстве.

Теоретическая и практическая значимость работы. Выполнен аналитический обзор первоисточников по теме диссертационной работы, по результатам которого осуществлен выбор генов-кандидатов откормочной и мясной продуктивности свиней. Разработаны принципы конструирования тест-систем определения полиморфизма генов CCKЛR, HMGЛ1, CTSО и ОMО - потенциальных ДНК-маркеров откормочных и мясных качеств. Разработаны лабораторные регламенты и проведены исследовательские испытания тест-систем для определения полиморфизмов в генах CCKЛR, HMGЛ1, CTSО и ОМО. Установлено влияние различных генотипов ДНК-маркеров на племенную ценность, собственную продуктивность и продуктивность потомства у хряков по признакам мясной и откормочной продуктивности. Полученные данные могут быть использованы при разработке селекционных программ, направленных на улучшение хозяйственно-полезных качеств свиней.

Методология и методы исследования.

Методологической основой для проводимой работы явились опыт предыдущих исследований и научные положения ученых в области молекулярной генетики, разведения, селекции и биотехнологии сельскохозяйственных животных. При выполнении диссертационной работы использовались общепринятые молекулярно-генетические и биотехнологические методы исследований, лабораторная часть исследований была выполнена с использованием современного оборудования Центра коллективного пользования научным оборудованием «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ФГБНУ ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста. Полученные экспериментальные данные были обработаны статистическими методами анализа.

Положения, выносимые на защиту

• молекулярно-генетические тест-системы определения полиморфизмов в генах CCKЛR, HMGЛ1, CTSО и ОМО и лабораторные регламенты производства тест-систем;

• популяционно-генетическая характеристика свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок по генам ССКЛК, HMGЛ1, СТБВ и ВМВ;

• различия в уровне показателей мясной и откормочной продуктивности свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок с различными генотипами по изучаемым генам;

• связи комплексных генотипов свиней по генам ССКЛК, HMGЛ1, СТБВ, ЮЕ2 и МС4К с уровнем развития мясных и откормочных качеств свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов подтверждена включением контрольных точек в технологические схемы производства тест-систем, использованных для исследований, проведением испытаний разработанных тест-систем, включением в каждую партию положительных и отрицательных контрольных образцов при выполнении молекулярно-генетических исследований, учетом в моделях на основании дисперсионного анализа факторов, оказывающих достоверное влияние на изучаемые фенотипические признаки, биометрической обработкой данных результатов исследований с оценкой степени достоверности выявленных различий.

Результаты работы доложены и получили положительные оценки на следующих научных конференциях:

• международном биотехнологическом форуме «РосБиоТех» (г. Москва, 2014-2018 гг.),

• VIII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2015 г.),

• II Международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (г. Минск, Республика Беларусь, 2015

г.),

• 10-ой Всероссийской конференции-школы с международным участием «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных, БиоТехЖ-2015» (п. Дубровицы Московской обл., 2015 г.),

• XXIII Международной научно-практической конференции «Современные проблемы и научное обеспечение инновационного развития свиноводства» (п. Лесные поляны Московской обл., 2016 г.),

• ежегодной научной конференции Американского общества наук о животных (ЛSЛS-ЛОSЛ) (Балтимор, США, 2017 г.),

• международной научной конференции по животноводству, посвященной 180-летию основателя масло- и сыроделия в России Н. В. Верещагина (г. Тверь, 2019 г.),

• XXV научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» (п. Быково Московской обл., 2019 г.).

Публикации результатов исследований

По материалам диссертационной работы опубликовано 6 работ, в том числе 5 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 - в сборнике трудов конференций.

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 227 страницах компьютерного текста с приложениями. Диссертация включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, куда входят разделы: материал и методы исследований, результаты исследований, их обсуждение и заключение, включающее выводы, практические предложения, перспективы дальнейшей разработки темы, список литературы и 3 приложения. Собственные исследования иллюстрированы 29 таблицами, 14 рисунками. Список литературы включает 145 источников, в том числе 113 на иностранном языке.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Эволюция методов оценки племенной ценности свиней

Точная оценка племенной ценности (EBV, estimated breeding value) является необходимым условием для совершенствования генетического потенциала животных [Кузнецов В.М., 1995]. На каждом этапе воспроизводства и в дальнейшей племенной работе участвует только часть разводимой популяции. Ожидается, что поголовье, отобранное для воспроизводства, будет иметь генетическое превосходство, что обеспечит повышение у потомков уровня развития селекционных признаков по сравнению с родительской популяцией. Поэтому одной из основных задач селекции является как можно более ранняя объективная оценка и отбор лучших животных [Зиновьевой H.A. и др., 2011]. Методы оценки племенной ценности сельскохозяйственных животных за последние 75 лет значительно менялись [Сермягин A.A. и др., 2017]. Внедрение новых методов, прежде всего, проходило в скотоводстве, и уже в дальнейшем они были адаптированы и внедрены в селекционные программы в свиноводстве. Изначально оценка животных базировалась на сравнении показателей продуктивности между родителями и их потомством (30-е года XX века). Затем, в 50-60-х гг. появился метод сравнения со сверстниками (Contemporary Comparison, CC) [Everett R.W. et al., 1994]. Позже появились смешанные модели с использованием рандомизированных и фиксированных факторов с учетом информации из родословных отцов (BLUP Sire Model), или по всей имеющейся информации (BLUP Animal Model) [Weller J.I., 2009]. Сегодня все чаще применяют в работе нелинейные методы с использованием байесовского подхода и элементами метода Монте-Карло по схеме Марковских цепей [Сермягин A.A. и др., 2017]. Стратегия в селекции, построенная на основе EBV, является высокоэффективной, но прогресс в развитии признаков несколько лимитирован ограниченным полом проявлением воспроизводительных качеств, относительно

длинным генерационным интервалом, потребностью в сохранении продуктивного долголетия. Определенные трудности связаны с получением и обработкой информации о некоторых признаках, таких как потребление корма или устойчивость к заболеваниям, а также о послеубойных характеристиках (убойный выход, качество мяса) [Кузнецов В.М., 2003].

Мощное развитие для ускорения селекционного прогресса в последнее время получают молекулярно-генетические методы: от идентификации единичных генов, отвечающих за физиологические процессы, до картирования локусов количественных признаков (QTL - quantitative trait loci) - участков генома, отвечающих за наследование признаков [Geldermann H., 1975; Сазанов А.А. и др., 2004], и однонуклеотидных полиморфизмов (SNP - single nucleotide polymorphism) - точечных мутаций, маркирующих комплекс продуктивных качеств. В свиноводстве ДНК-технологии стали применять с конца XX века (90-е годы). Первым коммерчески доступным тестом стал анализ Hal-1843, позволяющий выявлять мутантный аллель, ассоциированный с развитием под воздействием стресса злокачественной гипертермии и, как следствие, с ухудшением качества мяса [Brenig B. et al., 1990; Brenig B., Brem G., 1992; Forster M. et al., 1992]. Проведение ДНК-диагностики сделало возможным выявление животных -скрытых носителей мутантного аллеля и проведение маркерной селекции против нежелательной мутации. Первым QTL-маркером, включенным в селекционные программы свиней, стал ген эстрогенового рецептора (ESR, estrogen receptor) [Rothschild M.F. et al., 1996], который контролирует около 12% стандартного отклонения по многоплодию. Тем не менее, необходимо принимать во внимание, что большинство QTL оказывают лишь незначительное влияние на хозяйственно-полезные признаки, а вероятность определения их действия на признаки весьма зависима от размера выборки [Hayes B. et al., 2001]. Тем не менее, использование генной и маркерной селекции в свиноводстве продолжает оставаться актуальным.

2.2. Локусы количественных признаков (QTL) свиней

В «догеномную» эру основным методом идентификации QTL было создание так называемых F2 кроссированных популяций (известных также под названиями F2 интеркроссов, прародительских модельных популяций, F2 ресурсных популяций) с использованием контрастных пород в качестве родоначальников. Под контрастными породами понимают породы, существенно отличающиеся друг от друга по одному или нескольким картируемым фенотипическим признакам. В поколении F2 кроссов происходит расщепление по таким контрастным признакам, что позволяет получить большой размах изменчивости изучаемых признаков. Для картирования соответствующих QTL были использованы сотни микросателлитных маркеров, распределенных по всему геному. Широкое распространение для картирования как воспроизводительных, так мясных и откормочных качеств у свиней получило использование в качестве родоначальников Европейских (скороспелых, постных, относительно малоплодных) и китайских (позднеспелых, жирных, многоплодных) пород свиней [Andersson L. et al., 1994; Walling G.A. et al., 2000; Bidanel J.P. et al., 2001; Rohrer G.A., 2000; Sato S. et al., 2003]. Вместе с тем разрешение традиционного картирования QTL относительно невысокое вследствие большого расстояния между маркерами и недостаточного количества рекомбинационных событий у F2 кроссов.

Разработка ДНК-чипов Illumina Porcine SNP60 Beadchip сделала возможным проведение ассоциативных исследований между высокоплотными SNP и фенотипическими признаками посредством проведения полногеномных ассоциативных исследований (GWAS - genome-wide association studies) [Ramos A.M. et al., 2009]. По сравнению с традиционным методом картирования QTL метод GWAS позволяет идентифицировать SNP, которые достоверно ассоциированы с признаком. Однако для идентификации SNP, которые слабо ассоциированы с изучаемым признаком, требуется относительно большой размер популяции. Увеличение статистической мощности GWAS и уменьшение количества ложноположительных результатов может быть достигнуто посредством мета-

анализа - сочетания информации множественных независимых исследований [Evangelou E., Ioannidis J.P., 2013]. Детекционная мощность GWAS для QTL с плейотропным эффектом на множество признаков может быть повышена посредством анализа таких множественных признаков [Knott S.A., Haley C.S., 2000; Korol A.B. et al., 2001; Bolormaa S. et al. 2014].

В настоящее время в геноме свиней идентифицировано большое количество QTL и GWAS-ассоциаций, которые обобщены в базе данных Pig QTLdb [Hu Z.-L. et al., 2005, 2007, 2010, 2013, 2016], в которой содержится информация о 29045 QTL / ассоциациях, обобщенных на основании анализа 657 публикаций. Такие QTL / ассоциации представлены 678 различными признаками

[https://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/index]. Количество

идентифицированных QTL / ассоциаций представлено на рисунке 1 [Hu Z.-L. et al., 2016].

2011

2012

2013

2014

2015

Рисунок 1 - Динамика количества идентифицированных ОГЬ / ассоциаций в

геноме свиней [Ш Z.-L. et al., 2016]

Как показано на рисунке 1, с 2011 по 2014 гг. наблюдался заметный поступательный рост числа идентифицированных ОГЬ, после чего отмечалось снижение активности в данном направлении исследований. Ассоциативные исследования, напротив, характеризовались незначительным ростом числа

выявленных ассоциаций в период с 2011 по 2014 гг., в то время как в 2015 году число выявленных ассоциаций по сравнению с предыдущим годом возросло более чем в 5 раз. Это связано, прежде всего, с разработкой и активным использованием в исследованиях коммерческого ДНК-чипа средней плотности, позволяющего получать информацию об изменчивости более 60 тыс. SNP, равномерно распределенных по геному свиней. В настоящее время отмечается дальнейший рост числа исследований геномных ассоциаций практически со всеми хозяйственно-полезными признаками свиней.

2.3. Откормочные и мясные качества свиней

Откормочные и мясные качества являются важнейшими селекционными признаками, так как напрямую связаны с экономической эффективностью промышленного производства свинины [Fontanesi L. et al., 2014]. Откормочные качества как правило выражаются такими показателями как среднесуточный прирост (ADG) и скороспелость - возраст достижения живой массы 100 кг (AGE100). Для селекции по мясным качествам используются показатели как прижизненной (ультразвуковой), так и послеубойной оценки толщины шпика (BF - back fat), глубины мышцы (MD - muscle deeps) или площади мышечного глазка (LMA - loin muscle area). Для послеубойной оценки мясных качеств используются также показатели выхода туши, содержания постного мяса в туше (LEAN) и другие. Разработка эффективных селекционных программ требует понимания генетических детерминант, контролирующих признаки откормочной и мясной продуктивности [Wang K. et al., 2015].

Признаки откормочных и мясных качеств характеризуются, как правило, средней степенью наследуемости (табл. 1).

Как показано в таблице 1, коэффициент наследуемости среднесуточного прироста в зависимости от периода оценки составил 0,28-0,34. Мясные качества

характеризовались относительно более высокой наследуемостью: к2 составил от 0,42 до 0,55.

Таблица 1 - Коэффициенты наследуемости (к2), корреляция между генетическими и средовыми эффектами (в2) и фенотипическая варианса (о2р) для показателей

откормочных и мясных качеств у свиней крупной белой породы [Dube B. et al., 2013].

Показатель h2 e2 G2p

BF 0,45±0,04 0,58±0,03 3,82±0,06

ADG1 0,28±0,03 0,68±0,02 5764,00±83,65

ADG2 0,34±0,05 0,55±0,02 1218,00±19,41

LEAN 0,44±0,08 0,53±0,05 1,94±0,06

AREA 0,55±0,08 0,45±0,08 20,87±1,07

CFAT 0,42±0,08 0,58±0,08 16,58±0,82

Примечание - BF - толщина шпика, A выращивании; ADG2 - среднесуточный прг мяса в туше; AREA - площадь мышечного гл vDG1 - среднесуточный прирост на контрольном ¡рост за весь период; LEAN - процент постного [азка; CFAT - толщина шпика в туше.

Показатели мясных и откормочных качеств находятся в тесной взаимосвязи,

при этом зачастую желательные с точки зрения селекции признаки находятся в обратной зависимости. Так, например, более высокие среднесуточные приросты ассоциированы с более высокими значениями показателя конверсии корма (табл. 2). В этой связи, в программах селекционно-племенной работы при установлении целевых показателей отбора по мясным и откормочным качествам необходимо учитывать корреляции между признаками.

Таблица 2 - Генотипическая (над диагональю) и фенотипическая (под диагональю)

корреляция для признаков интенсивности роста на контрольном выращивании у свиней крупной белой породы [Dube B. et al., 2013]

Показатель BF ADG1 ADG2 FCR

BF * -0,26±0,04 -0,14±0,08 0,36±0,05

ADG1 -0,07±0,01 * 0,60±0,03 -0,99±0,01

ADG2 -0,04±0,01 0,68±0,01 * -0,961±0,03

FCR 0,01±0,01 -0,99±0,01 -0,72±0,01 *

Примечание - Б¥ - толщина шпика, Л001 - среднесуточный прирост на контрольном выращивании; ЛБ02 - среднесуточный прирост за весь период; ¥СЯ - конверсия корма.

Маркерная селекция может стать эффективным инструментом повышения откормочных и мясных качеств свиней.

2.3.1. QTL откормочных и мясных качеств свиней

В соответствии с pigQTLdb [Hu Z.-L. et al., 2016] с признаками роста свиней ассоциированы 1315 QTL, включая 563 QTL для ADG и 18 QTL для возраста достижения различной массы. Данные QTL предполагают, что признаки роста контролируются многими локусами [Fontanesi L. et al., 2014], однако идентификация каузальных генов или SNP затруднена вследствие низкой разрешающей способности или сложной архитектуры большинства QTL [Andersson L., 2009; Sanchez M.P. et al., 2014].

Был проведен целый ряд GWAS с целью поиска ассоциаций с признаками роста. В исследовании, проведенном на хряках породы дюрок, было идентифицировано 14 генов-кандидатов [Wang K. et al., 2015]. В другом GWAS исследовании было идентифицировано 127 значимых SNP и 102 предположительных SNP, ассоциированных с ADG в итальянской популяции свиней крупной белой породы [Fontanesi L. et al., 2014]. Ряд SNP, ассоциированных с показателями конверсии корма и ADG, были идентифицированы на нескольких хромосомах свиней SSC3, SSC5, SSC6, SSC7, SSC13, SSC14 и SSC15 в двух сильно дивергентных линиях чистопородных йоркширов [Onteru S.K. et al., 2013]. Посредством GWAS анализа признаков ADG, AGE100 и других в чистопородной популяции свиней породы йоркшир, содержащей около 600 индивидуумов, Meng Q. с соавторами [2017] с использованием Porcine GGP HD BeadChip (GeneSeek-Neogen, США) идентифицировали новые гены-кандидаты, вовлеченные в регуляцию роста свиней. Было детектировано 6 значимых и 12 предположительных SNP и идентифицировано 9 генов-кандидатов в непосредственной близости от них (SOGA1, RSPO2, MAP2K6, PLCB1, ARHGAP24, CPEB4, GLI2, NYAP2 и ZFPM2). Анализ онтологии генов и литературных данных показал, что гены-кандидаты вовлечены в процессы развития костей, мышц, жировой ткани и легких. Анализ

путей обмена веществ показал, что PLCB1 и MAP2K6 принимают участие в сигнальном пути гонадотропина и позволил предположить, что эти два гена оказывают влияние на рост при наступлении полового созревания.

2.3.2. Гены-кандидаты откормочной и мясной продуктивности свиней

Востребованность в получении скороспелых свиней с более высоким содержанием постного мяса и пониженным отложением жира инициировала поиск ДНК-маркеров, влияющих на данные показатели [Andersson L. et al., 1994]. Выявлен целый ряд ДНК-маркеров с валидированным эффектом на показатели откормочной и мясной продуктивности свиней. Одним из первых открытых ДНК-маркеров, получившим широкое распространение в селекционно-племенной работе, стал ген инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF2 - insulin-like growth factor 2), который вместе с инсулином, гормонами щитовидной железы, половыми стероидами и гормоном роста играет ключевую роль в регуляции роста. Ген IGF2, локализованный на дистальном конце SSC2 [Van Laere A.S., 2005], был предложен в качестве гена-кандидата из-за своего хромосомного местоположения, патернальной экспрессии, влияния на миогенез и участия в широком спектре метаболических и дифференцирующих процессов [Nezer С. et al., 1999; Van Laere A.S. et al., 2003]. Установлено влияние полиморфизма G3072A в гене IGF2 на скорость роста, наращивание мышечной массы и отложение жира у свиней [Van Laere A.S. et al., 2003]. В последующем действие этой мутации подтверждено в многочисленных исследованиях, проведенных на различных популяциях свиней как зарубежной [Heuven H.C.M. et al., 2005; Estellé J. et al., 2005; Chang K.C., 2007; Oczkowicz M. et al., 2009], так и отечественной селекции [Лобан Н.А. и др., 2009; Костюнина О.В. и др., 2011, 2015].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Карпушкина Татьяна Вячеславовна, 2019 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Амерханов, Х.А. Анализ национальных регистрационных сертификатов и введение в систему генетической оценки свиней США. Методические рекомендации / Х.А. Амерханов, H.A. Зиновьева // Москва: Минсельхоз России, 2008. - 73 с.

2. Амерханов, Х.А. Анализ национальных регистрационных сертификатов и введение в систему оценки племенной ценности свиней Канады. Методические рекомендации / Х.А. Амерханов, H.A. Зиновьева // Москва: Минсельхоз России, 2008. - 53 с.

3. Большая медицинская энциклопедия / гл. ред. Б. В. Петровский. - 3-е изд. - М.: Советская энциклопедия, 1974 - 1989. - Т. 1 - 30., [Электронный ресурс]. -Режим доступа: h77p://6M3.opr/index.php/%D0%9A%D0%90%D0%A2%D0%95%D0%9F%D0%A1 %D0%98%D0%9D%D0%AB.

4. Гетманцева, Л.В. Полиморфизм SNP RS80867243, RS81379421 и RS81236069 у свиней материнских пород / Л.В. Гетманцева, М.А. Колосова, С.Ю. Бакоев, М.С. Форнара, Н.В. Бардуков, Т.В. Карпушкина // Аграрная наука Евро-Северо-Востока. 2018. - № 4 (65). - С. 98-102.

5. Гладырь, Е.А. Изучение генома свиней (Sus Scrofa) с использованием ДНК-маркеров / Е.А. Гладырь, Л.К. Эрнст, О.В. Костюнина // Сельскохозяйственная биология. - 2009. - № 2. - С. 16 - 26.

6. Глазко, Т.Т. ДНК-технологии для повышения мясной продуктивности / Т.Т. Глазко, А.Б. Комаров, Е.В. Борзаковская // Известия ТСХА. - 2008. - №2 1. - С. 75 - 80.

7. Зиновьева, H.A. Современные генетические методы в селекции свиней / H.A. Зиновьева, A.B. Доцев, A.B. Шахин, В.Н. Маурчева, Ю.И. Чинаров // Дубровицы: Изд-во ГНУ ВИЖ Россельхозакадемия, 2011. - 72 с.

8. Инструкция по бонитировке свиней / Минсельхоз СССР. - 02.06.1975.

9. Карпушкина, Т.В., Продуктивные качества свиней крупной белой породы в зависимости от генотипа по IGF2 и CTSD / Т.В. Карпушкина, О.В. Костюнина, Е.И. Сизарева, H.A. Зиновьева // Достижения науки и техники АПК. - 2016. - Т. 30. - № 6. - С. 82-85.

10. Костюнина, О.В. Влияние маркерного генотипа по ESR и IGF2 на племенную ценность хряков крупной белой породы / О.В. Костюнина, H.A. Свеженцева, H.A. Зиновьева, A.B. Доцев, A.B. Шахина, Е.И. Сизарева, Е.А. Гладырь // Сельскохозяйственная биология. - 2011. - № 6. - С. 54 - 59.

11. Костюнина, О.В. Ассоциация гена IGF2 с продуктивными качествами свиней (Sus scrofa) крупной белой породы с учетом половой дифференциации / О.В. Костюнина, С.С. Крамаренко, H.A. Свеженцева, Е.И. Сизарева, H.A. Зиновьева // Сельскохозяйственная биология. - 2015. - Т. 50. - № 6. - С. 736 - 745. - DOI: 10.15389MGrobiology.2015.6.736rus.

12. Костюнина, О.В. Влияние генотипа хряков крупной белой породы по ДНК-маркерам на воспроизводительные качества дочерей / О.В. Костюнина, Т.В. Карпушкина, H.A. Свеженцева, H.A. Зиновьева, Е.И. Сизарева // В сборнике: Биотехнология: состояние и перспективы развития материалы VIII Московского Международного Конгресса. - ЗАО «Экспо-биохим-технологии». - РХТУ им. Д.И. Менделеева. - 2015. - С. 463-465.

13. Костюнина, О.В. Новый стресс-синдром у свиней, обусловленный мутацией в гене DMD / О.В. Костюнина, Т.В. Карпушкина, М.С. Форнара, H.A. Зиновьева // Свиноводство. - 2015. - № 8. - С. 14-15.

14. Костюнина, О.В. Молекулярные методы в диагностике генетических дефектов свиней / О.В. Костюнина, Т.В. Карпушкина, В.Р. Харзинова, М.С. Форнара, H.A. Зиновьева // В сборнике: Современные проблемы и научное обеспечение инновационного развития свиноводства XXIII Международная научно-практическая конференция. 2016. - С. 50-54.

15. Костюнина, О.В. Продуктивность свиней породы ландрас в зависимости от генотипа по DMD / О.В. Костюнина, Т.В. Карпушкина, А.И. Рудь, М.С. Форнара,

H.A. Зиновьева // Достижения науки и техники АПК. - 2016. - Т. 30. - № 12. - С. 86-89.

16. Генетическая устойчивость свиней к стрессам и колибактериозам / О.В. Костюнина, М.С. Форнара, Н.В. Бардуков, Т.В. Карпушкина, H.A. Зиновьева // Достижения науки и техники АПК. - 2018. - Т. 32. - № 6. - С. 53-55.

17. Кузнецов, В.М. Генетическая оценка молочного скота методом BLUP / В.М. Кузнецов // Зоотехния. 1995. - № 11. - С. 8 - 15.

18. Кузнецов, В.М. Методы племенной оценки животных с введением в теорию BLUP / В.М. Кузнецов // Киров: Зональный НИИСХ Северо-Востока, 2003. - 358 с.

19. Лядський, I.K. Оцшка пол1морф1зму гешв MC4R та HMGA1, що вщповщають за формування м'ясних i вщгод1вельних ознак у свиней велико!' бшо! породивюник / I.K. Лядський // Полтавсько! державно! аграрно! академп. - 2010. -№ 3. - С.184-187.

20. Лядский, И.К. Связь Asp298Asn полиморфизма гена mc4r с толщиной спинного сала у свиней крупной белой породы / И.К. Лядский, A.A. Гетя, К.Ф. Почерняев // Цитология и генетика. — 2011. — Т. 45, № 2. — С. 52-56.

21. Лядский, И. К. Связь полиморфизма генов CTSL, MC4R и HMGA1 с продуктивными качествами свиней крупной белой породы Украины / И. К. Лядский, К. Ф. Почерняев, В. Н. Балацкий, В. П. Рыбалко // Зоотехния, 2014. - № 6. - С. 4 - 5.

22. Лобан, H.A. Полиморфизм гена IGF2 у свиней мясных пород в Республике Беларусь и его влияние на откормочные и мясные качества / H.A. Лобан, О.В. Костюнина, О.Я. Василюк, А.Д. Банникова, А.С.Чернов, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // С.-х.биология. Сер. Биология животных. - 2009.-№ 2. - С. 27-30.

23. Мельникова, Е.Е., Изучение влияния генотипов по IGF2, CCKAR и MC4R на фенотипы и племенную ценность свиней по хозяйственно-полезным признакам / Е.Е. Мельникова, Н.В. Бардуков, М.С. Форнара, О.В. Костюнина, A.A.

Серьмягин, A.M. Зайцев, H.A. Зиновьева // Сельскохозяйственная биология. 2018. - № 4. - С. 423 - 734. - DOI: 10.15389/Agrobiology.2018.4.723rus.

24. Рудь, А.И. Опыт ирландских свиноводов / А. Рудь, П. Ларионова, Н. Глазкова, В. Попов, Д. Садовой // Животноводство России. - 2013. - № 1. - С. 25 -26.

25. Сазанов, A.A. Позиционное клонирование локусов количественных признаков у домашней курицы / А. А. Сазанов, В. А. Царёва, А. Ф. Смирнов, Б. Вардецка, М. Корчак, К. Ящак, M. Н. Романов // Тезисы докладов итогового семинара по физике и астрономии по результатам конкурса грантов 2003 года для молодых учёных Санкт-Петербурга. Санкт-Петербург. Физико-технический институт им. А. Ф. Иоффе. 2004, С. 42.

26. Сермягин, A.A. Валидация геномного прогноза племенной ценности быков-производителей по признакам молочной продуктивности дочерей на примере популяции черно-пестрого и голштинского скота / A.A. Сермягин, A.A. Белоус, А.Ф. Контэ, A.A. Филипченко, А.Н. Ермилов, И.Н Янчуков, КВ. Племяшов, Г. Брем, H.A. Зиновьева // Сельскохозяйственная биология. 2017. - Т. 52. - № 6. - С. 1148 - 1156. - DOI: 10.15389MGrobiology.2017.6.1148rus.

27. Указ Президента РФ «О мерах по реализации государственной научно-технической политики в интересах развития сельского хозяйства». - № 350 от 21 июля 2016 г.

28. Харзинова, В.Р. Популяционно-генетическая характеристика свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок с использованием микросателлитов / В.Р. Харзинова, Т.В. Карпушкина, Т.Е. Денискова, О.В. Костюнина, H.A. Зиновьева // Зоотехния. - 2018. - № 4. - С. 2-7.

29. Харзинова, В.Р. Генетическая характеристика свиней белорусской селекции с использованием днк-маркеров / В.Р. Харзинова, H.A. Лобан, Т.В. Карпушкина, О.В. Костюнина, Е.В. Пищелко, E.H. Лобан, H.A. Зиновьева // Свиноводство. - 2018. - № 8. - С. 63-66.

30. Чернуха, И.М. Оценка мясной продуктивности свиней отечественной и канадской селекции при использовании терминальных хряков / И.М. Чернуха, И.В.

Сусь, Т.М. Миттельштейн, С.В. Лисикова, С.А. Грикшас, Н.С. Губанова // Все о мясе. - 2012. - № 3. - С. 42 - 44.

31. Шейко И.П. Повышение продуктивных, откормочных и мясных качеств свиней материнских пород с использованием селекционных индексов / И.П. Шейко, Н.А. Лобан, Р.И. Шейко // Доклады Национальной академии наук Беларуси. 2016. - Т. 60. - № 2 - С. 123-128.

32. Andersson, L. Genetic mapping of quantitative trait loci for growth and fatness in pigs / L. Andersson, C.S. Haley, H. Ellegren, S.A. Knott, M. Johansson, K. Andersson, L. Andersson-Eklund, I. Edfors-Lilja, M. Fredholm, I. Hansson // Science. - 1994. - V. 263(5154). - P. 1771-1774.

33. Andersson, L. Genome-wide association analysis in domestic animals: a powerful approach for genetic dissection of trait loci / L. Andersson // Genetica. - 2009. - V. 136(2). - P. 341 - 349. - DOI 10.1007/s10709-008-9312-4.

34. Asin, K.E. Differential effects of CCK-JMV-180 on food intake in rats and mice / K.E. Asin, L. Bednarz // Pharmacology Biochemistry and Behavior. - 1992. - V. 42. - P. 291-295.

35. Authier, F. Endosomal proteolysis of internalized insulin at the C-terminal region of the B chain by cathepsin D / F. Authier, M. Metioui, S. Fabrega, M. Kouach, G. Briand // The Journal of Biological Chemistry. - 2002. - V. 277 (11). - P. 9437 -9446. - D0I:10.1074/jbc.M110188200. - PMID 11779865.

36. Baechle, D Cathepsin D is present in human eccrine sweat and involved in the postsecretory processing of the antimicrobial peptide DCD-1L / D. Baechle, T. Flad, A. Cansier, H. Steffen, B. Schittek, J. Tolson, T. Herrmann, H. Dihazi, A. Beck, G.A. Mueller, M. Mueller, S. Stevanovic, C. Garbe, C.A. Mueller, H. Kalbacher // The Journal of Biological Chemistry. - 2006. V. 281 (9). - P. 5406 - 5415. -D0I:10.1074/jbc.M504670200. - PMID 16354654.

37. Bankowska, A Biological and diagnostic role of cathepsin D / A. Bankowska, M. Gacko, E. Chyczewska, A. Worowska // Roczniki Akademii Medycznej W Bialymstoku. - 1997. - 42 Suppl 1. - P. 79-85. - PMID 9337526.

38. Barnoy, S. Regulation of calpain and calpastatin in differentiating myoblasts: mRNA levels, protein synthesis and stability / S. Barnoy, L. Supino-Rosinn, N.S. Kosower // Biochem. J. - 2000. - V. 351. - P. 413 - 420.

39. Benes, P Cathepsin D - many functions of one aspartic protease / P, Benes, V, Vetvicka, M, Fusek // Critical Reviews in Oncology/Hematology. - 2008. - V. 68 (1).

- P. 12 - 28. D0I:10.1016/j.critrevonc.2008.02.008. - PMC 2635020. - PMID 18396408.

40. Bidanel, J.P. Detection of quantitative trait loci for growth and fatness in pigs / J.P. Bidanel, D. Milan, N. Iannuccelli, Y. Amigues, M.Y. Boscher, F. Bourgeois, F. Bourgeois, J.C. Caritez, J. Gruand, P. Le Roy, H. Lagant, R. Quintanilla, C. Renard, J. Gellin, L. Ollivier, C. Chevalet // Genet Sel Evol. - 2001. - V. 33. - P. 289-309. - DOI: 10.1186/1297-9686-33-3-289

41. Biziene, R. Effects of single nucleotide polymorphism markers on the carcass and fattening traits in different pig populations / R. Biziene, Morkuniene K., Miseikiene R., Peciulaitiene N., Makstutiene N., Slyzius E. // Journal of Animal and Feed Sciences. - 2018. - V. 27. - P. 255-262. - DOI: 10.22358/jafs/95020/2018. .

42. Blicharski, T. Relationship between polymorphism at loci colipase and leptin and most important fattening and slaughter traits in pigs with special reference to intramuscular fat - a review (in Polish) / T. Blicharski, J. Kuryl, M. Pierzchala. // Pr. Mater. Zootech. Zesz. Spec. - 2004. - V. 15. - P. 41-46.

43. Bolormaa, S. A multi-trait, meta-analysis for detecting pleiotropic polymorphisms for stature, fatness and reproduction in beef cattle [Электронный ресурс] / S. Bolormaa, J.E. Pryce, A. Reverter, Y. Zhang, W. Barendse, K. Kemper, B. Tier, K. Savin, B.J. Hayes, M.E. Goddard // PLoS Genet. - 2014. - V. 10(3). - Режим доступа: hTTps://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004198.

44. Brenig, B. The porcine PHIcDNA linked to the halothane gene defects a IlindHI and Ilsal RFLP in normal and malignant hyperthermia susceptible pigs / B. Brenig, S. Jurs, G. Brem // Nucl. Acids Res. - 1990. - V. 18. - P. 388.

45. Brenig, B. Genomic organisation and analysis of the 5 end of the porcine ryanodine receptor gene (RYRI) / B. Brenig, G. Brem // FEBS Letters. - 1992. - V. 298.

- P. 277 - 279.

46. Brunsch, C. Analysis of associations of PIT1 genotypes with growth, meat quality and carcass composition traits in pigs / C. Brunsch, I. Sternstein, P. Reinecke, J. Bieniek // J. Appl. Genet. - 2002. - V. 43(1). - P. 85-91.

47. Chang, K.C. Key signalling factors and pathways in the molecular determination of skeletal muscle phenotype / K.C. Chang // Animal. - 2007. - V. 1(5). -P. 681-698. - DOI: 10.1017/S1751731107702070.

48. Chen, P. Melanocortin 4 Receptor-Mediated Hyperphagia and Activation of Neuropeptide Y Expression in the Dorsomedial Hypothalamus during Lactation / P. Chen, S.M. Williams, K.L. Grove, M. Susan // Journal of Neuroscience. - 2004. - V. 24 (22). - P. 5091. - 5100. - DOI: https://doi.org/10.1523/JNEUR0SCI.0588-04.2004.

49. Choi, J.-W. Whole-genome resequencing analyses of five pig breeds, including Korean wild and native, and three European origin breeds [Электронный ресурс] / J.-W. Choi, W.-H. Chung, K.-T. Lee, E.-S. Cho, S.-W. Lee, B.-H. Choi, S.-H. Lee, W. Lim, D. Lim, Y.-G. Lee, J.-K. Hong, D.-W. Kim, H.-J. Jeon, J. Kim, N. Kim, T.-H. Kim // DNA Research. - 2015. - V. 22(4). - P. 259 - 267. - Режим доступа: h7Tps:// doi .org/10.1093/ dnares/dsv011.

50. Clutter, A.C Rapid communication: the cholecystokinin type-A receptor (CCKAR) gene maps to porcine chromosome 8 / A.C. CluTTer, S. Sasaki, D. Pomp // J Anim Sci. - 1998. - V. 76. - P. 1983-1984.

51. Crawley, J.N. Centrally administered cholecystokinin suppresses feeding through a peripheral-type receptor mechanism / J.N. Crawley, S.M. Fiske, C. Durieux, M. Derrien, B.P. Roques. // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1991. - V. 257. - P. 1076-1080.

52. De Oliveira Peixoto, J. Associations of leptin gene polymorphisms with production traits in pigs [Электронный ресурс] / J. De Oliveira Peixoto, S.E. Facioni Guimaraes, P. Savio Lopes, M.A. Menck Soares, A. Vieira Pires, M.V. Gualberto Barbosa, R. De Almeida Torres, M. De Almeida e Silva // J. Anim. Breed. Genet. - 2006. - V. 123. - P. 378-383. - Режим доступа: https://doi.org/10.1111/ j.1439-0388.2006.00611.x.

53. Ding, R. Genetic architecture of feeding behavior and feed efficiency in a Duroc pig population [Электронный ресурс] / R. Ding, M. Yang, X. Wang, J. Quan, Z.

Zhuang, S. Zhou, S. Li, Z. Xu, E. Zheng, G. Cail, D. Liu, W. Huang, J. Yang, Z. Wu1 // Front. Genet. - 2018. - Режим доступа: https://doi.org/10.3389/fgene.2018.00220.

54. Do, D.N. Genome-wide association and pathway analysis of feed efficiency in pigs reveal candidate genes and pathways for residual feed intake / D.N.Do, A.B. Strathe, T. Ostersen, S.D. Pant, H.N. Kadarmideen // Front. Genet. - 2014. V. 5:307. -DOI: 10.3389/fgene.2014.00307.

55. Dube, B. Genetic relationship between growth and carcass traits in Large White pigs / B. Dube, S.D. Mulugeta, K. Dzama // South African Journal of Animal Science. - 2013. - V. 43. - № 4. - P. 482-492.

56. Estellé, J. Effect of the porcine IGF2-intron3-G3072A substitution in an outbred Large White population and in an IberianxLandrace cross / J. Estellé, A. Mercadé, J.L. Noguera, M. Pérez-Enciso, C. Óvilo, A. Sánchez, J.M. Folch // Journal of animal science. - 2005. - V. 83(12). - P. 2723 - 2728. - DOI: 10.2527/2005.83122723x.

57. Evangelou, E Meta-analysis methods for genome-wide association studies and beyond / E. Evangelou, J.P. Ioannidis. // Nat Rev Genet. - 2013. - V. 14. - P. 379 -389. - DOI: 10.1038/nrg3472.

58. Everett, R.W. A test-day model for monitoring management and genetics in dairy cattle / R.W. Everett, F. Schmitz, L.H. Wadell // J. Dairy Sci. - 1994. - V. 77. -Suppl.1. - P. 267.

59. Fan, H. The different HMGA1 expression of total population of glioblastoma cell line U251 and glioma stem cells isolated from U251 / H. Fan, H. Guo, I.Y. Zhang, B. Liu, L. Luan, S. Xu, X. Hou, W. Liu, R. Zhang, X.Wang, Q. Pang // Brain Res. - 2011.

- V. 1384. - P. 9-14.

60. Fontanesi, L. The insulin-like growth factor 2 (IGF2) gene intron3-g.3072G>A polymorphism is not the only Sus scrofa chromosome 2p mutation affecting meat production and carcass traits in pigs: Evidence from the effects of a cathepsin D (CTSD) gene polymorphism / L. Fontanesi, C. Speroni, L. Buttazzoni, E. Scotti, S. Dall'Olio, L. Nanni Costa, R. Davoli, V. Russ Fontanesi // J Anim Sci. - 2010. - V. 88.

- P. 2235-2245. DOI: 10.2527/jas.2009-2560.

61. Fontanesi, L. A genomewide association study for average daily gain in Italian Large White pigs / L. Fontanesi, G. Schiavo, G. Galimberti, D.G. Calo, V. Russo // J. Anim. Sci. - 2014. -V. 92. - P. 1385 - 1394. - DOI: 10.2527/jas.2013-7059.

62. Forster, M. Der MHS-Gentest fur die sichere Stresresistenzzuchtung beim Schwein / M. Forster, B. Brening, G. Brem et al. // Schweine-Zucht und Schweine-Mast. - 1992. - Bd. 40. - S. 4 - 6.93.

63. Franco, M. Association of PIT1, GH and GHRH polymorphisms with performance and carcass traits in Landrace pigs / M. Franco, C. Robson, R.C. Antunes, H.D. Silva, L.R. Goulart. // J Appl. Genet. - 2005. - V. 46(2). - P. 195-200.

64. Fujii, J. Identification of a mutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia / J. Fujii, K. Otsu , F. Zorzato, S. de Leon, V.K. Khanna, J.E. Weiler, P.J. O'Brien, D.H. MacLennan // Science. - 1991. - № 253. - P. 448-451.

65. Geldermann, H. Investigations on inheritance of quantitative characters in animals by gene markers I. Methods / H. Geldermann // Theor. Appl. Genet. - 1975. - V. 46. - №. 7. - P. 319-330. - DOI: 10.1007/5F00281673.

66. Georgescu, S.E. Comparative study of leptin and leptin receptor gene expression in different swine breeds / S.E. Georgescu, M.A. Manea, S. Dinescu, M. Costache // Genet. Mol. Res. - 2014. - V. 13. - P. 7140-7148.

67. Gerbens, F. Characterization, chromosomal localization, and genetic variation of the porcine heart fatty acid-binding protein gene / F. Gerbens, G. Rettenberger, J.A. Lenstra, J.H. Veerkamp, M.F. Te Pas // Mamm. Genome. - 1997. - V. 8. - P. 328 - 332.

68. Getmantseva, L. Effect of polymorphisms in intron 1 of the swine POU1F1 gene on growth and reproductive traits / L. Getmantseva, A. Kolosov, M. Leonova, A. Usatov, F. Bakoev, A. Klimenko, S. Bakoev // Turk J Vet Anim Sci. - 2017. - V. 41. -P. 643 - 647. - DOI: 10.3906/vet-1702-77.

69. Goll, D. E., The calpain system and skeletal muscle growth / D.E. Goll, V.F. Thompson, R.G. Taylor, A. Ouali // Can. J. Anim. Sci. - 1998. - V. 78. - P. 503 - 512.

70. Cheung, G.W.C. Intestinal Cholecystokinin Controls Glucose Production through a Neuronal Network / G.W.C. Cheung, A.Kokorovic, C.K.L. Lam, M. Chari,

T.K.T. Lam // Cell Metabolism. - 2009. - V. 10. - P. 99 - 109. - DOI: 10.1016/j.cmet.2009.07.005.

71. Groenen, M.A.M. Analyses of pig genomes provide insight into porcine demography and evolution / M.A.M. Groenen1, A.L. Archibald, H. Uenishi, C.K. Tuggle, Y. Takeuchi, Max F. Rothschild, C. Rogel-Gaillard, C. Park, D. Milan, H-J. Megens,S. Li, D.M. Larkin, H. Kim, L.A.F. Frantz, M. Caccamo, H. Ahn, B.L. Aken, A. Anselmo, C. Anthon, L. Auvil, B. Badaoui, C. W. Beattie, C. Bendixen, D. Berman, F. Blecha, J. Blomberg, L. Bolund, M. Bosse, S. Botti, Z. Bujie, M. Bystrom, B. Capitanu, D. Carvalho-Silva, P. Chardon, C. Chen, R. Cheng, S.-H. Choi, W. Chow, R.C. Clark, C. Clee, R.P.M.A. Crooijmans, H.D. Dawson, P. Dehais, F. De Sapio, B. Dibbits, N. Drou, Z.-Q. Du, K. Eversole, J. o Fadista, S. Fairley, T. Faraut, G.J. Faulkner, K.E. Fowler, M. Fredholm, E. Fritz, J.G. R. Gilbert, E. Giuffra, J. Gorodkin, D.K. Griffin, J.L. Harrow, A. Hayward, K. Howe, Z.-L. Hu, S.J. Humphray, T. Hunt, H. Hornshej, J.-T. Jeon, P. Jern, M. Jones, J. Jurka, H. Kanamori, R. Kapetanovic, J. Kim, J.-H. Kim, K.-W. Kim, T.-H. Kim, G. Larson, K. Lee, K.-T. Lee, R. Leggett, H.A. Lewin, Y. Li, W. Liu, J.E. Loveland, Y. Lu, J.K. Lunney, J. Ma,O. Madsen, K. Mann, L. Matthews, S. McLaren, T. Morozumi, M.P. Murtaugh, J. Narayan, D.T. Nguyen, P. Ni, S.-J. Oh, S. Onteru, F. Panitz, E.-W. Park, H.-S. Park, G. Pascal, Y. Paudel, M. Perez-Enciso, R. Ramirez-Gonzalez, J.M. Reecy, S. Rodriguez-Zas, G.A. Rohrer, L. Rund, Y. Sang, K. Schachtschneider, J.G. Schraiber, J. Schwartz, L. Scobie, C. Scott, S. Searle, B. Servin, B.R. Southey, G. Sperber, P. Stadler, J.V. Sweedler, H. Tafer, B. Thomsen, R. Wali, J. Wang, J. Wang, S. White, X. Xu, M. Yerle, G. Zhang, J. Zhang, J. Zhang, S. Zhao, J. Rogers, C. Churcher, L.B. Schook // Nature. - 2012. - V. 491. - P. 393 - 398. - DOI: 10.1038/nature11622.

72. Groenen, M.A.M. Design of the illumina porcine 50k+ snp iselect™ beadchip and characterization of the porcine hapmap population / M.A.M. Groenen, R.P.M.A. Crooijmans, A.M. Ramos, A.J. Amaral, H. Kerstens, C. Bendixen, J. Hedegaard, G. Rohrer, T. Smith, C. Van Tassel, J.F. Taylor, M.F. Rothschild, Z. Hu, D. Nonneman, J. Beever, A. Archibald, A. Law, D. Milan, M. Hansenand, L. Schook // Swine Genome sequencing W493 in The International Plant & Animal Genome XVII Conference. - San

Diego, California. - Town & Country Convention Center., USA. - 2009. - January 1014.

73. Guo, Y. Genome-wide detection of genetic markers associated with growth and fatness in four pig populations using four approaches / Y. Guo, Y. Huang, L. Hou, J. Ma, C. Chen, H. Ai, L. Huang, J. Ren // Genet Sel Evol. 2017. - V. 49. - P. 21. doi: 10.1186/s12711-017-0295-4.

74. Hakala, J.K. Lysosomal Enzymes Are Released From Cultured Human Macrophages, Hydrolyze LDL In Vitro, and Are Present Extracellularly in Human Atherosclerotic Lesions / J.K. Hakala, R. Oksjoki, P. Laine, H. Du, G. A. Grabowski, P.T. Kovanen, M.O. Pentikäinen // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology.

- 2003. - V. 23. - № 8. - P. 1430 - 1436. - DOI: 10.1161/01 .ATV.0000077207.49221.06. - PMID 12750117.

75. Hayes, B. The distribution of the effects of genes affecting quantitative traits in livestock / B. Hayes, M.E. Goddard // Genet. Sel. Evol. - 2001. - V. 33. - P. 209 - 229. DOI: 10.1186/1297-9686-33-3-209.

76. Heid, C.A. Real-time quantitative PCR / C.A. Heid // Genome Res. - 1996.

- V. 6. - P. 986 - 994.

77. Heuven, H.C.M. Efficiency of population structures for mapping of Mendelian and imprinted quantitative trait loci (QTL) in outbred pigs using variance component methods / H.C.M. Heuven, H. Bovenhuis, L.L.G. Janss, J.A.M. Van Arendonk. // Genet. Sel. Evol. - 2005. - V. 37. - P. 35 - 655. - DOI: 10.1051/gse:2005019.

78. Higuchi, R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions / R. Higuchi // Biotechnology. - 1993. - V. 11. - P. 1026 - 1030.

79. Hollinger, K. The physiological response of protease inhibition in dystrophic muscle / K. Hollinger, J.T. Selsby // Acta Physiol (Oxf). - 2013. - V. 208(3). - P. 234 -244.

80. Houston, R.D A Polymorphism in the 5'-Untranslated region of the porcine cholecystokinin type a receptor gene affects feed intake and growth / R.D. Houston, C.S. Haley, A.L. Archibald, N.D. Cameron, G.S. Plastow, and K.A. Rance // Genetics. - 2006.

- V. 10. - P. 1556 - 1562.

81. Hu, Z.-L. A QTL Resource and Comparison Tool for Pigs: PigQTLDB / Z.-L. Hu, S. Dracheva, W. Jang, D. Maglott, J. Bastiaansen, M.F. Rothschild, J.M. Reecy // Mammalian Genome. - 2005. - V. 16. - № 10. - P. 792 - 800.

82. Hu, Z.-L. Animal QTLdb: Beyond a Repository - A Public Platform for QTL Comparisons and Integration with Diverse Types of Structural Genomic Information Hu Z.-L., Reecy J.M. / Mammalian Genome. 2007. - 18(1). - P. 1 - 4.

83. Hu, Z.-L. QTLdb: A comprehensive database tool building bridges between genotypes and phenotypes / Z.-L. Hu, C.A. Park, E.R. Fritz, J.M. Reecy // Invited Lecture with full paper published electronically on The 9th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. - Leipzig, Germany. - 2010. - P. 1 - 6.

84. Hu, Z.-L. Animal QTLdb: an improved database tool for livestock animal QTL/association data dissemination in the post-genome era / Z.-L. Hu, C.A. Park, X.-L. Wu, J.M. Reecy // Nucleic Acids Research. - 2013. - 41(Database issue). - D871-879. -DOI: 10.1093/nar/gks 1150.

85. Hu, Z.-L. Developmental progress and current status of the Animal QTLdb / Z.-L. Hu, C.A. Park, J.M. Reecy // Nucleic Acids Res. - 2016. - V. 44. - P. D827 - D833. - DOI: 10.1093/nar/gkv1233.

86. Jenkins, S., High-throughput SNP genotyping / S. Jenkins, N. Gibson // Comparative and Functional Genomics. - 2002. - V. 3(1). - P. 57-66. -DOI:10.1002/cfg.130.

87. Johnson, R. Effect of DNA Markers in Nebraska Selection Lines / R. Johnson // Nebraska Swine Report. - 2010. - 44 - 50.

88. Karpushkina, T.V. The association DMD gene with productive traits of landrace pigs breed / T.V. Karpushkina, M.S. Fornara, O.V. Kostyunina, V.R. Kharzinova, N.A. Zinoveva // Journal of Animal Science. - 2017. - T. 95. - № 4. - C. 348.

89. Kim, G.W Association of genotype of POU1F1 intron 1 with carcass characteristics in crossbred pigs / G.W. Kim, J.Y. Yoo, H.Y. Kim. // J. Anim. Sci. Technol. - 2014. - V. 56. - P. 25.

90. Kim, K.S. Rapid communication: Linkage and physical mapping of the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene // K.S. Kim, N.J. Larsen, M.F. Rothschild // Journal of Animal Science. - 2000. - V. 78(3). - P. 791 - 792.

91. Kim, K.S. Multitrait least squares for quantitative trait loci detection / K.S. Kim; J.J. Lee, H.Y. Shin, B.H. Choi, C.K. Lee, J.J. Kim, B.W. Cho, T.-H. Kim, S.A. Knott, C.S. Haley // Genetics. - 2000. - V. 156. - P. 899 - 911.

92. Kim, K.S. Investigation of obesity candidate genes on porcine fat deposition quantitative trait loci regions / K.S. Kim, H. Thomsen, J. Bastiaansen, N.T. Nguyen, J.C. Dekkers, G.S. Plastow, M.F. Rothschild // Obesity Research. 2004. V. 12. P. 1981-1994.

93. Kim, K.S. Association of melanocortin 4 receptor (MC4R) and high mobility group AT-hook 1 (HMGA1) polymorphisms with pig growth and fat deposition traits / K.S. Kim, J.J. Lee, H.Y. Shin, B.H. Choi , C.K. Lee , J.J. Kim, B.W. Cho, T.-H. Kim // Animal Genetics. 2006. V.37(4). P. 419-421. doi:10.1111/j.1365-2052.2006.01482.x

94. Knorr, C. Associations of GH gene variants with performance traits in F2 generations of European wild boar, Pietrain and Meishan pigs / C. Knorr, G.Moser, E. Müller, H. Geldermann // Anim. Genet. - 1997. - V. 28. - P. 124 - 128.

95. Korol, A.B. Enhanced efficiency of quantitative trait loci mapping analysis based on multivariate complexes of quantitative traits / A.B. Korol, Y.I. Ronin, A.M. Itskovich, J. Peng, E. Nevo // Genetics. - 2001. - V. 157. - P. 1789 - 1803.

96. Kunhareang, S. Genes that affect meat production, fat deposition and carcass weight in pigs / S. Kunhareang // A thesis submitted in fulfilment of the requirements for the Degree of Doctor of Philosophy at Lincoln University. - 2013. - P.128.

97. Kulig, H. Effect of leptin gene polymorphism on growth and carcass traits in pigs / H.Kulig, W. Grzesiak, I. Szatkowska // Arch. Anim. Breed. - 2001. - V. 44. - P. 291 - 296.

98. Kunej, T. Frequency distribution of a Cys430Ser polymorphism in peroxisome proliferatoractivated receptor-gamma coactivator-1 (PPARGC1) gene sequence in Chinese and Western pig breeds / T. Kunej, X.L. Wu., T.M. Berlic, J.J. Michal, Z. Jiang, P. Dovc // J. Anim. Breed. Genet. - 1997. - V. 122. - P. 7 - 11.

99. Kury, J. Preliminary observations on the effect of calpastatin gene (CAST) polymorphism on carcass traits in pigs. / J. Kury, W. Kapelaski, M. Pierzchaa, S. Grajewska, M. Bocian // Animal Science Papers and Reports. - 2003. - V. 21(2). - P. 87 - 95.

100. Lee, A.Y. Conformational switching in an aspartic proteinase / A.Y. Lee, S.V. Gulnik, J.W. Erickson // Nature Structural Biology. - 1998. - V. 5(10). - P. 866 -71. - DOI: 10.1038/2306. - PMID 9783744.

101. Livak, KJ. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay / K.J. Livak // Genet Anal. - 1999. - V. 14(5-6). - P. 143 - 149.

102. Le Rumeur, E. Dystrophin: more than just the sum of its parts / E. Le Rumeur, S.J. Winder, J.F. Hubert // Biochim Biophys Acta. - 2010. - V. 1804(9). - P. 1713 - 22. - DOI: 10.1016/j.bbapap.2010.05.001.

103. Meidtner, K. Association of the melanocortin 4 receptor with feed intake and daily gain in F2 MangalitsaxPietrain pigs / K. Meidtner, A.K. Wermter, A. Hinney, H. Remschmidt, J. Hebebrand, R. Fries // Animal Genetics. - 2006. - V. 37. - P. 245 - 247.

104. Mellgren, R.L., The protein inhibitor of calcium-dependent proteases: Purification from bovine heart and possible mechanisms of regulation / R.L. Mellgren, T.C. Carr // Arch. Biochem. Biophys. - 1983. - V. 225. - P. 779 - 786.

105. Meng, Q. Identification of growth trait related genes in a Yorkshire purebred pig population by genome-wide association studies / Q. Meng, K. Wang, X. Liu, H. Zhou, L P. Xu, Z. Wang, M. Fang // Asian-Australas J. Anim. Sci. - 2017. - V. 30. - P. 462 -469. - DOI: 10.5713/ajas.16.0548.

106. Milan, D. A mutation in PRKAG3 associated with excess glycogen content in pig skeletal muscle / D. Milan, J.T. Jeon, C. Looft, V. Amarger, A. Robic, M. Thelander, C. Rogel-Gaillard, S. Paul, N. IannuCCelli, L.Rask, H. Ronne, K. Lundstrom, N. Reinsch, J. Gellin, E. Kalm, P.L. Roy, P. Chardon, L. Andersson / Science. - 2000. -V. 288. - P. 1248 - 1251.

107. Misztal, I. BLUPF90 and related programs (BGF90) / I. Misztal, S. Tsuruta, T. Strabel, et al. // Proc. 7th World Congress on genetics applied to livestock production. Montpellier, 2002. Vol. 28. P. 21-22.

108. Nezer, C. An imprinted QTL with major effect on muscle mass and fat deposition maps to the IGF2 locus in pigs / C. Nezer, L. Moreau, B. Brouwers, W. Coppieters, J. Detilleux, R. Hanset, L. Karim, A. Kvasz, P. Leroy, M. Georges // Nat. Genet. - 1999. - V. 21. - P. 155 - 156.

109. Nonneman D.J. A defect in dystrophin causes a novel porcine stress syndrome / D.J.Nonneman, T. Brown-Brandl, S.A. Jones, R.T. Wiedmann, G.A. Rohrer // BMC Genomics. - 2012. - V. 13. - P. 233.

110. Oczkowicz, M. Known mutation (A3072G) in intron3 of the IGF2 gene is associated with growth and carcass composition in Polish pig breeds / M. Oczkowicz, M. Tyra, K. Walinowicz, M. Rozycki, B. Rejduch // J. Appl. Genet. - 2009. - V. 50(3). - P. 257 - 259. - DOI: 10.1007/BF03195681.

111. Onteru, S. K. Whole genome association studies of residual feed intake and related traits in the pig / S.K.Onteru, D.M. Gorbach, J.M. Young, D.J. Garrick, J.C. Dekkers, M.F. Rothschild // PLoS ONE. - 2013. - V. 8. - P. e61756. - DOI: 10.1371/journal.pone.0061756.

112. Petsko, G.A. Protein Structure and Function / G.A. Petsko, D. Ringe Ringe // New Science Press. - 2004. - P. 195.

113. PierzchAA, M. Growth rate and carcass quality in pigs as related to genotype at loci POU1F1/RsaI (Pit1/RsaI) and GHRH/AluI / M. Pierzchaa, T. Blicharski, J. Kury // Animal science papers and reports. - 2003. - V. 21(3). - P. 159 - 166.

114. Pierzchala, M. Growth rate and carcass quality in relation to GH/MspI and GH/HaeII PCR-RFLP polymorphism in pigs / M. Pierzchala, T. Blicharski, J. Kuryl // Anim. Sci. Pap. Rep. - 2004. - V. 22. - P. 57 - 64.

115. Piorkowska, K.L. The association between polymorphisms of three cathepsins and economically important traits in pigs raised in Poland / K.L. Piorkowska, K. Ropka-Molik, R. Eckert, M. Tyra, K. Zukowski // Livestock Science. - 2012. - V. 150. - P. 316 - 323.

116. Piorkowska, K. A comprehensive transcriptome analysis of skeletal muscles in two Polish pig breeds differing in fat and meat quality traits / K. Piorkowska, K.

Zukowski, K. Ropka-Molik, M. Tyra, A. Gurgul // Genet Mol Biol. - 2018. - V. 41(1). -P. 125 - 136. - DOI: 10.1590/1678-4685-GMB-2016-0101.

117. PorcineSNP60 v2 Genotyping BeadChip [Электронный ресурс] / Illumina // Дата обращения: 19.05.2019. - Режим доступа: h7Tps://genomics.neogen.com/pdf/prodinfo/illumina porcine snp60v2 beadchip datas heet.pdf.

118. Ramos, A.M. Design of a high density SNP genotyping assay in the pig using SNPs identified and characterized by next generation sequencing technology / A.M. Ramos, R.P. Crooijmans, N.A. Affara, A.J. Amaral, A.L. Archibald, J.E. Beever, C. Bendixen, C. Churcher, R. Clark, P. Dehais, M.S. Hansen, J. Hedegaard, Z.L. Hu, H.H. Kerstens, A.S. Law, H.J. Megens, D. Milan, D.J. Nonneman, G.A. Rohrer, M.F. Rothschild, T.P. Smith, R.D. Schnabel, C.P. Van Tassell, J.F. Taylor, R.T. Wiedmann, L.B. Schook, M.A. Groenen // PLoS One. - 2009. - V. 4(8). - P. e6524. - DOI: 10.1371/journal.pone.0006524.

119. Rohrer, G.A. Identification of quantitative trait loci affecting birth characters and accumulation of backfat and weight in a Meishan-White Composite resource population / G.A. Rohrer // J Anim Sci. - 2000. - V. 78. - P. 2547 - 2553.

120. Rosen, E.D. Molecular regulation of adipogenesis/ E.D. Rosen, B.M. Spiegelman // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. - 2000. - V. 16. - P. 145 - 171.

121. Rothschild, M.F. The estrogen receptor locus is associated with a major gene influencing litter size in pigs / M.F. Rothschild, C. Jacobson, D. Vaske, C. Tuggle, L.Z. Wang, T. Short, G. Eckardt, S. Sasaki, A. Vincent, D. McLaren, O. Southwood, H. van der Steen, A. Mileham, G. Plastow // Proc. Nat. Acad. Sci. - 1996. - V. 93. - P. 201 -205.

122. Rothschild, M. F. Investigation of the retinol-binding protein 4 (RBP4) gene as a candidate gene for increased litter size in pigs/ M. F. Rothschild, L. Messer, A. Day, R. Wales, T. Short, O. Southwood, G. Plastow. 2000. Investigation of the retinol-binding protein 4 (RBP4) gene as a candidate gene for increased litter size in pigs. Mamm Genome. 2000. - V.11. - p.75-77

123. Rubin, C.J. Strong signatures of selection in the domestic pig genome / C.-J. Rubin, H.-J. Megens, A.M. Barrio, K. Maqbool, S. Sayyab, D. Schwochow, C. Wang, Ö. Carlborg, P. Jern, C.B. J0rgensen, A.L. Archibald, M. Fredholm, M.A.M. Groenen, L. Andersson // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2012. - V. 109(48). -P. 19529 - 19536. - DOI: 10.1073/pnas.1217149109.

124. Russo, V. Single nucleotide polymorphisms in several porcine cathepsin genes are associated with growth, carcass, and production traits in Italian Large White pigs / V. Russo, L. Fontanesi, E. Scotti, F. Beretti, R. Davoli, L. Nanni Costa, R. Virgili, L. Buttazzoni // J Anim Sci. - 2008 - V. 86(12). - P. 3300 - 3314. - DOI: 10.2527/jas.2008-0920.

125. Saiki, R.K. Science / R.K. Saiki, S. Scharf, F. Faalona, K.B. Mullis, G.T. Horn, H.A. Erlich, N. Arnheim // Science. - 1985. - V. 230. - P. 1350.

126. Saiki, R.K. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA-polimerase / R.K. Saiki, D.H. Gelfand, S. Stoffel, S.J. Scharf, R. Higuchi, G.T. Horn, K.B. Mullis, H.A. Erlich // Science. - 1988. - V. 239. - P. 487 -491.

127. Sanchez, M.P. A genome-wide association study of production traits in a commercial population of Large White pigs: evidence of haplotypes affecting meat quality. / M.P. Sanchez, T. Tribout, N. Iannuccelli, M. Bouffaud, B. Servin, A. Tenghe, P. Dehais, N. Muller, MP. Del Schneider, M.J. Mercat, C. Rogel-Gaillard, D. Milan, J.P. Bidanel, H. Gilbert / Genet Sel Evol. - 2014. - V. 46. - P. 12.

128. Saperstien, Restriction fragment length polymorphism analysis using PCR coupled to restriction digest / D.A. Saperstein, J.M. Nickerson // Bio/Techniques. - 1991. - V. 10. - P. 488 - 489.

129. Sato, S Quantitative trait loci analysis for growth and carcass traits in a Meishan x Duroc F2 resource population / S. Sato, Y. Oyamada, K. Atsuji, T. Nade, S.i. Sato, E. Kobayashi, T. Mitsuhashi, K. Nirasawa, A. Komatsuda, Y. Saito, S. Terai, T. Hayashi, Y. Sugimoto // J Anim Sci. - 2003. - V. 81. - P. 2938 - 2949.

130. Schumm, J.W. Identification of more than 500 RFLPs by screening random genomic clones / J.W. Schumm, R.G. Knowlton, J.C. Braman, D.F. Barker, D. Botstein,

G. Akots, V.A. Brown, T.C. Gravius, C. Helms, K. Hsiao, K. Rediker, J.G. Thurston, H. Donis-Keller / Am. J. Hum. Genet. - 1988. - V. 42. - P. 143 - 159.

131. Sironen, A. An intronic insertion in KPL2 results in aberrant splicing and causes the immotile short-tail sperm defect in the pig / A. Sironen, B. Thomsen, M. Andersson, V. Ahola, J. Vilkki // PNAS. - 2006. - V. 103(13). - P. 5006 - 5011.

132. Song, C.Y. Polymorphisms in intron 1 of the porcine POU1F1 gene / C.Y. Song, B. Gao, S.H. Teng, X.Y. Wang, F. Xie, G.H. Chen, Z.Y. Wang, R.B. Jing, J.D. Mao // J Appl Genet. - 2007. - V. 48. - P. 371 - 374.

133. Stancekova, K. Effect of genetic variability of the porcine pituitary-specific transcription factor (PIT-1) on carcass traits in pigs / K. Stancekova, , D. Vasicek, D. Peskovicova, J. Bulla, A. Kubek // Anim. Genet. - 1999. - V. 30. - P. 313-315.

134. Tang, Z. Genome-Wide Association Study Reveals Candidate Genes for Growth Relevant Traits in Pigs / Z. Tang, J. Xu, L. Yin, D. Yin, M. Zhu, M. Yu, X. Li, S. Zhao, X. Liu // Frontiers in Genetics. - 2019. - V. 10. - P 302. - DOI: 10.3389/fgene.2019.00302.

135. Van Laere, A.S. A regulatory mutation in IGF2 causes a major QTL effect on muscle growth in the pig / A.S. Van Laere, M. Nguyen, M. Braunschweig, C. Nezer, C. Collette, L. Moreau, A.L. Archibald, C.S. Haley, N. Buys, M. Tally, G. Andersson, M. Georges, L. Andersson // Nature. - 2003. - V. 425 (6960). - P 832 - 836. - DOI: 10.1038/nature02064.

136. Van Laere, A.-S. From QTL to QTN. Identification of a quantitative trait nucleotide influencing muscle development and fat deposition in pig: Doctoral thesis / Van Laere Anne-Sophie. - Swedish University of agricultural Sciences, Uppsala, 2005. - P. 32.

137. Van den Maagdenberg, K. The Asp298Asn missense mutation in the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene can be used to affect growth and carcass traits without an effect on meat quality / K. Van den Maagdenberg, A. Stinckens, E. Claeys, M. Seynaeve, A. Clinquart, M. Georges, N. Buys, S. De Smet // Animal. - 2007. - V. 1(8). - P 1089-1098. - DOI: 10.1017/S1751731107000456.

138. Walling, G.A. Combined analyses of data from quantitative trait loci mapping studies. Chromosome 4 effects on porcine growth and fatness / G.A. Walling, P.M. Visscher, L. Andersson, M.F. Rothschild, L. Wang, G. Moser, A.M. Groenen, J.P. Bidanel, S. Cepica, A.L. Archibald, H. Geldermann, D.J. Koning, D. Milan, C.S. Haley // Genetics. - 2000. - V. 155. - P 1369-1378.

139. Wang, K Genome wide association analysis reveals new production trait genes in a male duroc population / K. Wang, D. Liu, J. Hernandez-Sanchez, J. Chen, C. Liu, Z. Wu, M. Fang, N. Li // PLoS ONE. - 2015. - V. 10. - P e013920.

140. Wang, W. Polymorphism of growth hormone gene in 12 pig breeds and its relationship with pig growth and carcass traits / W. Wang, L. Huang, J. Gao, J. Ding, K. Chen, J. Ren, M. Luo // AsianAustralas. J. Anim. Sci. - 2003. - V. 16. - P 161 - 164.

141. Weller, J.I. Quantitative trait loci analysis in animals (Modular texts) / J.I. Weller - 2nd edition. - UK. CABI. 2009. - P 288.

142. Yu, T.P. Association of PIT1 polymorphisms with growth and carcass traits in pig / T.P. Yu, C.K. Tuggle, C.B. Schmitz, M.F. Rothschild // J. Anim. Sci. - 1995. -V. 73. - P 1282 - 1288.

143. Zaidi, N Cathepsin D: A cellular roadmap / N. Zaidi, A. Maurer, S. Nieke, H. Kalbacher // Livest. Res. - 2008. - V. 376. - P 5 - 9.

144. Zhang, L.-C. A genome-wide association study of limb bone length using a Large White * Minzhu intercross population / L.-C. Zhang, N. Li, X. Liu, J. Liang, H. Yan, K.-B. Zhao, L. Pu, H.-B. Shi, Y.-B. Zhang, L.-G. Wang, L.-X. Wang // Genetics Selection Evolution. - 2014. - V. 46. - P 56.

145. Kim, K. S. Association of melanocortin 4 receptor (MC4R) and high mobility group AT-hook 1 (HMGA1) polymorphisms with pig growth and fat deposition traits / K.S. Kim, J.J. Lee, H.Y. Shin, B.H. Choi, C.K. Lee, J.J. Kim, B.W. Cho, T.-H. Kim // Animal Genetics. - 2006. - V. 37. - № 4. - P 419 - 421.

Приложение 1

Для служебного пользования

УТВЕРЖДАЮ ? . Директор . ФГБНУф"

• ! - >■ V* Л v i g i j ..... „

ИЖ им. J1.K. Эрнста

1.А. Зиновьева

» янви^я 2019 г.

ЛАБОРАТОРНЫЙ РЕГЛАМЕНТ на производство тест-систем для определения полиморфизма генов HMGA1, CCKAR и DMD свиней на основе метода мультиплексной ПЦР с FLASIl-детекнней (fluorescent amplification-based specific hybridization) по конечной точке

Срок действия регламента до 31 декабря 2020 г.

Содержание

Список сокращений используемых в тексте

1 Характеристика готового продукта

2 Химическая схема производства

3 Технологическая схема производства

4 Аппаратурная схема производства и спецификация оборудования

5 Характеристика сырья, вспомогательных материалов и полупродуктов

6 Изложение технологического процесса

7 Материальный баланс

8 Переработка и обезвреживание отходов производства

9 Контроль производства

10 Безопасная эксплуатация производства

11 Охрана окружающей среды

12 Перечень производственных инструкций

13 Экспериментальные данные, подтверждающие технико-экономические показатели

14 Информационные материалы

Список сокращений, используемых в тексте

BP - стадии вспомогательных работ

ГОСТ - государственный отраслевой стандарт

дАТФ - дезоксиаденозинтрифосфат

дГТФ - дезоксигуанидинтрифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ - дезоксирибонуклеотидфосфат

дТТФ - дезокситимидинтрифосфат

дЦТФ - дезоксицитидинтрифосфат

КТ - контрольные точки

ОБО - стадии обезвреживания отходов

ОСТ - отраслевой стандарт

ОТ - охрана труда

ПР - стадии подготовительных работ; ТБ - техника безопасности

ТП - стадии основных технологических процессов; ТУ - технические условия

CAS-No - уникальный идентификационный номер вещества сервисной службы CAS рН - концентрация водородных ионов;

Настоящий лабораторный регламент обязателен для применения в ФГБНУ ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста и предназначен для добровольного применения организациями и предприятиями отрасли по производству тест-систем. Для этих организаций и предприятий обязательность использования настоящего лабораторного регламента наступает в силу приказа или иного организационно-распорядительного документа организации (предприятия) о применении (внедрении) настоящего регламента в данной организации (предприятии).

1. ХАРАКТЕРИСТИКА ГОТОВОГО ПРОДУКТА

Наименование продукции: тест-системы для определения полиморфизма генов HMGA1, CCKAR и DMD свиней на основе ПЦР с FLASH-детекцией, разработанная в рамках выполнения диссертационной работы Карпушкиной Т.В.

Основное назначение продукции: тест-система предназначена для анализа полиморфизма генов HMGA1, CCKAR и DMD свиней при проведении лабораторных исследований племенного материала свиней.

Краткое описание внешнего вида и потребительских свойств: тест-система для определения полиморфизма генов HMGA1, CCKAR и DMD свиней на основе ПЦР с FLASH-детекцией, представляет собой комплект реагентов (табл. 1), рассчитанный на проведение 100 анализов, включая контроли.

Таблица 1 - Состав тест-системы для определения полиморфизма генов HMGA1, CCKAR и

DMD свиней на основе ПЦР с FLASH-детекцией.

Наименование реагента Маркировка Фасовка Условия хранения

Специальные реагенты: олигонуклеотиды разработаны Oligo1_ STA_SEQ Oligo2_ STA_SEQ Oligo3_STA_SEQ Oligo1_ LSP_SEQ Oligo2_ LSP_SEQ Oligo3_ LSP_SEQ Oligo1_ ASP1_SEQ Oligo2_ ASP1_SEQ Oligo3_ ASP1_SEQ Oligo1_ ASP2_SEQ Oligo2_ ASP2_SEQ Oligo3_ ASP2_SEQ 2 пробирки по 0,055 см3(мл) минус 20°С

Реагент для ПРЦ №1 (10х буфер для ПЦР) разработан Реагент для ПЦР № 2 (2 мМ дНТФ) ПЦР № 1 ПЦР № 2 1 пробирка, 0,165 см3 (мл) 1 пробирка, 0,165 см3 (мл) минус 20°С минус 20°С

заимствован

Наименование реагента

Маркировка

Фасовка

Условия хранения

Реагент для ПЦР № 3 (Бшай-полимераза) заимствован Вода для ПЦР заимствован

Контрольный образец 1 (ДНК с известным генотипом концентрацией 50 нг/мкл) разработан

Контрольный образец 2 (ДНК с известным генотипом концентрацией 50 нг/мкл) разработан

ПЦР № 3

ШОыёевг К1

К2

1 пробирка, 0,022 см3 (мл)

1 пробирка, 1,0 см3 (мл) 1 пробирка, 0,11 см3 (мл)

1 пробирка, 0,11 см3 (мл)

минус 20°С

минус 20°С минус 20°С

минус 20°С

Нормативные требования к упаковке, маркировке, условиям хранения: отдельные реагенты в составе тест-систем упакованы в полипропиленовые пробирки (флаконы) с закручивающимися крышками; на пробирки (флаконы) наклеены этикетки с указанием краткого наименования компонента, количества реагента в пробирке (флаконе), номера серии и даты изготовления.

Пробирки (флаконы) вложены в пакет из полиэтилена. На каждой упаковке тест-систем наклеена (или вложена) этикетка, на которой указаны: наименование предприятия-изготовителя, полное наименование тест-системы, номер серии, дату изготовления, срок годности, условия хранения и надпись «Для животных». В каждую упаковку вложена инструкция по применению тест-системы.

Тест-систему необходимо транспортировать при температуре от -20°С (в сухом льду). При получении тест-систему рекомендуется разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.

Срок годности тест-системы - 18 месяцев с даты изготовления

2. ХИМИЧЕСКАЯ СХЕМА ПРОИЗВОДСТВА

Химическая схема производства отсутствует, так как химических превращений в процессе производства не происходит.

3. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА ПРОИЗВОДСТВА.

Технологическая схема производства приведена на рисунке 1.

Рисунок 1 - Технологическая схема производства тест-системы для определения полиморфизма генов HMGA1, CCKAR и DMD свиней на основе ПЦР с FLASH-детекцией

4. АППАРАТУРНАЯ СХЕМА ПРОИЗВОДСТВА И СПЕЦИФИКАЦИЯ

ОБОРУДОВАНИЯ

Аппаратурная схема производства приведена на рисунке 2.

I II III IV

Примечание: I - помещение для подготовки воды, маркированных пробирок (флаконов) с этикетками (стадии ВР.1. - ВР.2., ТП. 3.1), II - помещение для подготовки сырья (стадии ТП.3.2. - ТП.3.6.), III - помещение для выделения ДНК и приготовления К1, К2 (ТП.3.7., ТП.4.5.), IV -помещение для приготовления компонентов тест-системы (ТП.4.1-4.5.). Помещения II-IV оборудованы настольными боксами с бактерицидными лампами. Используемое оборудование: 1. Система очистки воды, 2. Стерилизатор паровой, 3. Шкаф сушильный. 4 . Этикеточная машина. 5. Весы аналитические. 6. Магнитная мешалка, 7. рН-метр, 8. Холодильник, 9. Термостат, 10. Центрифуга, 11. Вортекс, 12. Спектрофотометр, 13. Морозильник. Спецификация оборудования приведена в табл. 2 (номер оборудования на рисунке соответствует номеру оборудования в табл. 2).

Рисунок 2 - Аппаратурная схема производства тест-системы для определения полиморфизма генов HMGA1, CCKAR и DMD свиней на основе ПЦР с FLASH-детекцией.

Таблица 2 - Спецификация оборудования.

№ п/п Наименование Кол-во единиц Техническая характеристика

1 Этикетировочная машина для маркировки флаконов (например, термотрансферный принтер этикеток 1 Термотрансферный принтер этикеток Zebra TLP 2844 используется для изготовления этикеток шириной до 104мм, устойчивых к воздействию неблагоприятных условий.

№ Наименование Кол-во Техническая характеристика

п/п единиц

Zebra TLP 2844, Zebra Technologies) Работает в режимах термо- и термотрансферной печати Производительность принтера Zebra TLP 2844 составляет до 2000 этикеток в день.

2 Стерилизатор паровой горизонтальный (автоклав) 1 ГК-10-1 «ТЗМОИ»

3 Шкаф сушильный (сухожар) 1 KoZZerman, Германия

4 Система очистки воды (например, Simplicity, Millipore, Франция) 1 Персональная система получения сверхчистой воды для исследователей-аналитиков, которым требуется не более 5 литров сверхчистой воды в день. Область применения: - высокоэффективная жидкостная хроматография -газовая хроматография и газовая хроматография с масс-спектрометрией -капиллярный электрофорез -атомная адсорбционная и атомная эмиссионная спектроскопия -и др. -Сопротивление > 18 MW. см -ТОС <, 15 ppb или <, 5 ppb (Simplicity 185) -Производительность: от 0.4 до 0.8 л/мин Отличительные особенности: -Производительность: от 0.4 до 0.8 л/мин

5 Весы аналитические (например, весы PB 153-S/Fact Весы лабораторные MeZTler Toledo) 1 НПВ, г: 151 Цена деления, г: 0.001 Способ калибровки: Автоматическая Функциональная классификация: Advanced Класс: II высокий Размер платформы (мм): 0 100 mm

6 Мешалка магнитная (например IKA- RCT) 1 Места для перемешивания 1 Макс. Объем (H2O) 20 l Производимая мощность привода 9 W Направление ротации правое Диодный дисплей Контроль диапазона скоростей Диапазон вращающего момента 50 - 1500 rpm Задание точности скорости 10 rpm Мин. длина перемешивающего стержня 20 mm Макс. длина магнитного мешальника 80 мм Саморазогрев нагревательной плитки (Т(комн.): 22°С/длительность:1 час) 28 +K Мощность нагрева 600 W Диапазон нагревания температур комнатная температура - 310 °C Контроль нагрева Скорость нагрева 6.5 K/мин Разъем для подключения контактного термометра PT1000

№ п/п Наименование Кол-во единиц Техническая характеристика

Регулируемый безопасный нагрев мин. 50 °C Регулируемый безопасный нагрев макс. 360 °C Нагревательная пластина материал Алюминиевый сплав Нагревательная пластина размер 0 135 мм Размеры 160 x 85 x 270 мм Вес 2.5 кг Допустимая температура окружающей среды 5 - 40 °C Допустимая относительная влажность 80% Класс защиты согласно DIN EN 60529 Напряжение 220 - 230 / 115 / 100 V Частота 50/60 Hz Потребляемая мощность 650 W

7 рН-метр (например, ЭКОТЕСТ - 120, НПФ «Эконикс») 1 Диапазоны измерений активность, ед. рХ (pH)-20 - +20 ЭДС, Eh, мВ-4000 - +4000 температура (Т), 0С-20 - +150 Измерение кислорода (ХПК) мг/дм3 -20 - +150 Диапазон автоматической и ручной компенсации - 2000С- +1500С Погрешность при измерении активности ионов, рХ (pH)± 0,005 при измерении ЭДС, мВ± 0,2 температуры, 0С± 0,5 кислорода 12% Масса не более 400 грамм. Габаритные размеры 150x160x30 мм.

8 Холодильники (например, Атлант МХМ 1704-0) 2 Тип: холодильник с морозильником Расположение: отдельно стоящий Расположение морозильной камеры: снизу Цвет / Материал покрытия: белый / краска Управление: электромеханическое Энергопотребление: класс B Количество компрессоров: 2 Количество камер: 2 Количество дверей: 2 Габариты (ШхГхВ): 60x63x195 см Размораживание морозильной камеры: ручное Размораживание холодильной камеры: капельная система Автономное сохранение холода: до 15 ч Мощность замораживания: до 15 кг/сутки Минимальная температура в морозильной камере: -18 °C Сигнализация открытой двери: звуковая

9 Термостат твердотельный (например, ТЕРМО 1 Термостат твердотельный (от 25С до 120С) (блок 48x1.5 мл и 35x0.5 мл)

№ п/п Наименование Кол-во единиц Техническая характеристика

48, ООО «Компания «Биоком»

10 Микроцентрифуга для микропробирок типа Эппендорф (например, 5415D, Eppendorf) 2 Центрифуга для микропробирок, 13 200 об./мин (16 100 g), 24 места

11 Вортекс (например, IKA MS 3 basic, IKA) 2 Траектория встряхивания Орбитальная Диаметр орбиты 4.5 mm Макс. встряхиваемый вес (с платформой) 0.5 kg Потребляемая мощность привода 10 W Производимая мощность привода 8 W Разрешенное время во вкл. состоянии 100 % Скорость мин.(регулируемая) 200 1/min Диапазон вращающего момента 0 - 3000 1/min Индикатор скорости Шкала Таймер нет Режим работы Непрерывная работа Touch функция - управление прикосновением да Фиксация подвижных частей на встряхивателе нет Работа с микропланшетами да Кол-во микротитрационных планшетов 1 Размеры 148 x 63 x 205 mm Вес 2.9 кг Допустимая температура окружающей среды 5 - 40 °C Допустимая относительная влажность 80 % Класс защиты по DIN EN 60529 IP 21 Разъем RS 232 нет Аналоговый выход нет Напряжение 100 - 240 V Частота 50/60 Hz Потребляемая мощность 20 W Постоянное напряжение 24 V= Энергопотребление 800 mA

12 Спектрофотометр (например, GeneQuant pro, Amersham Biosciences) 1 GeneQuant Pro (Amersham) для измерения концентрации ДНК, РНК, олигонуклеотидов и белка в УФ области, белка в видимой области 546 нм, 562 нм и 595 нм, а также бактериальных клеток при 600 нм.

13 Морозильные камеры (например, Атлант 163-80) 2 Размеры (ВхШхГ): 131x60x63 см Количество компрессоров: 1 шт. Класс энергопотребления: B Управление: механическое Система охлаждения: статическая Система No Frost: нет Объем 200 л Цвет: белый Наименование модели: ММ-163 Габариты (ВхШхГ): 1310x600x630 мм Количество компрессоров: 1 Общий объем: 200 л Дополнительные характеристики: Количество отделений в морозильной камере : 3/2

№ п/п Наименование Кол-во единиц Техническая характеристика

Перенавеска двери : + Режим быстрого замораживания: + Класс энергетической эффективности : В Мощность замораживания : 20 кг/сутки Температура в морозильной камере : -18 °С Хладагент : R134a Время повышения t до -9°С при откл. эл. энергии : 13 ч Масса : 56 кг Расход электроэнергии : 0,96 кВт.ч/сутки

14 Настольный бокс с бактерицидной лампой (напримерУФ Бокс БАВ-ПЦР-«Ламинар-С» ЗАО «Ламинарные системы») 3 Внешние габаритные размеры, мм: 1020 х 600 х 745 Габаритные размеры рабочей камеры, мм: 1015 х 530 х 535 Габаритные размеры подставки, мм: 1015 х 510 х 660 Освещение рабочей поверхности, не менее, Лк: 1000 Масса бокса, кг: 50 Мощность лампы УФО, Вт: 30 Мощность, потребляемая боксом (610/ 620), Вт, не более: 70/90 Диапазон задаваемого времени работы УФО, мин: 1-599 Бокс БАВ-ПЦР-«Ламинар-С» с проточным УФ рециркулятором обеспечивает защиту рабочего места от внешней среды, предназначен для чистой работы с ДНК-пробами при проведении ПЦР-диагностики. Блок УФ-облучения на время работы в ПЦР боксе по направляющим задвигается под рабочую столешницу. Механизм подъема переднего стекла позволяет фиксировать стекло в двух положениях и обрабатывать рабочую камеру и стекло с обратной стороны дезрастворами. Корпус ПЦР-бокса выполнен без стыковых соединений и угловых сварочных швов Рабочая столешница ПЦР-бокса из нержавеющей стали. Блок освещения ПИР бокса вынесен за пределы рабочей камеры. Окраска - порошковая эмаль светлых тонов, стойкая к обработке дезинфекционными растворами. Таймер УФО. Встроенная евророзетка.

5. ХАРАКТЕРИСТИКА СЫРЬЯ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ И

ПОЛУПРОДУКТОВ

Таблица 3 - Характеристика сырья, материалов, промежуточных продуктов

Наименование Обозначение Стандарт Показатели Примечание

НТД или артикул обязательные для проверки

«А» Основное сырье:

Вода для 1-я степень Подлинность, для получения

лабораторного ГОСТ Р чистоты удельная «маточных» и рабочих

анализа 52501-2005 электрическая проводимость при темп. 25С - не более 0,010мСм/м растворов реагентов; для комплектации тест-системы

Вода ГОСТ Х.ч. Подлинность, для получения воды

дистиллированная 6709-72 удельная электрическая проводимость при темп. 20С - не более 0,5мСм/м для лабораторного анализа

Олигонуклеотиды (праймеры) ЗАО «Евроген» Паспорт Очистка ВЭЖХ Содержание продукта не менее 95%, концентрация не менее 100 нмоль/см3 Для приготовления раствора праймеров

Трис-гидрохлорид ООО 373654. Подлинность, Для приготовления

С4Н12СЮ3 «Диа-М» 1211 наличие основного 1,354 М раствора,

Молярный вес 157,6 (Panreac) вещества не менее pH=8,8

г/моль 99%

CAS-No. 1185-53-1

Магний хлористый 6- ГОСТ Подлинность, Для приготовления 1,5

водн. 4209-77 Х.ч. наличие основного М раствора хлорида

MgCl2*6H2O) вещества не менее магния

Молярный вес 203,3 г/моль 98 %

CAS-No. 7791-18-6

Сульфат аммония ГОСТ 10873- Х.ч. Подлинность, Для приготовления 1,66

(NH4)2SO4 73 наличие основного М раствора аммония

Молярный вес 132,1 г/моль вещества не менее 99 % сульфата

CAS-No. 57-50-1

Твин 20 ООО 162312. Подлинность Для приготовления 10%

Молярный вес 1227,7 г/моль «Диа-М» (Panreac) 1608 раствора Твин 20

CAS-No. 9005-64-5

Дезоксирибо- СибЭнзим N025 Подлинность, Для приготовления

нуклеотидфосфаты (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) 10мМ каждого раствора дНТФ

Наименование Обозначение Стандарт Показатели Примечание

нтд или артикул обязательные для проверки

Бшай-полимераза Диалат Лтд. БТ-250 Подлинность Для ПЦР

(5Ед/мкл)

Раствор ДНК свиней Подлинность концентрация 50 нг/мкл, соотношение оптической плотности Х260/Х280= 1,6-1,8 Для приготовления контрольных образцов

«Б» вспомогательные материалы

Соляная кислота ГОСТ ОСЧ Подлинность, На вспомогательные

14261-77 наличие основного вещества не менее 35 % работы, для приготовления растворов Трис-гидрохлорида,

Набор для выделения ЗАО ЕХ-509 Подлинность Для приготовления

ДНК из крови «Синтол» контрольных образцов

Пробирки резьбовые 1,5 см3, конические Компания 8Б1-2230 Внешний вид, Для упаковки реагентов

Хеликон (Axygen) целостность упаковки, выдерживают центрифуг. до 20000 g, автоклав. при +121°С и замораж. до -20°С Сертиф. на отсутствие ДНКаз, РНКаз, чел.ДНК и пр. ингибит. ПЦР тест-системы

Крышки с кольцевой Компания 8Б1-2002А Внешний вид, Для упаковки реагентов

прокладкой Хеликон (Axygen) целостность упаковки тест-системы

Посуда мерная ГОСТ внешний вид, На вспомогательные

лабораторная 1770-74Е химическая работы

стеклянная, цилиндры, устойчивость

мензурки, пробирки ГОСТ 25336-82Е

Пробирки типа Компания ББГ Внешний вид, На вспомогательные

Эппендорф, Хеликон 1260-00 целостность работы, для

1,5 см3 (Axygen) упаковки, выдерживают центрифугировани е до 20000 ^ автоклавирование при +121°С и замораживание до -20°С приготовления контрольного образца

Наименование Обозначение нтд Стандарт или артикул Показатели обязательные для проверки Примечание

Сертифицированы на отсутствие ДНКаз, РНКаз, человеческой ДНК, и прочих ингибиторов ПИР

Одноразовые наконечники 0,1-10 мм3 Компания Хеликон (Axygen) ББГ 4120-00 внешний вид, целостность упаковки, автоклавирование при +121°С и замораживание до -20°С Сертифицированы на отсутствие ДНКаз, РНКаз, человеческой ДНК, и прочих ингибиторов ПИР На вспомогательные работы

Одноразовые наконечники 0,1-10 мм3 Компания Хеликон (Axygen) ББГ 4210-06 На вспомогательные работы, аликвотирование компонентов тест-системы

Одноразовые наконечники до 1000 мм3 Компания Хеликон (ОшшИр) НТ1000-576 На вспомогательные работы, аликвотирование компонентов тест-системы

Одноразовые наконечники с аэрозольным барьером до 200 мм3 Axygen ТБ-200-Я-Б внешний вид герметичная упаковка Стерильные Градуированные, с фаской, бесцветные С Гидрофобным фильтром из полиэтилена Автоклавируются при 121°С, 15 мин. Сертифицированы на отсутствие ДНКаз, РНКаз, человеческой ДНК, и прочих ингибиторов ПИР На вспомогательные работы

Перчатки анатомические ТУ 38-106140-81 Внешний вид На вспомогательные работы

Бумага типографская для печати ГОСТ 18510-87 внешний вид На изготовление инструкций

Бумага самоклеющаяся ЗАО «Комус» внешний вид На изготовление этикеток

Моющее средство «Астра», «Миф», «Кристалл», и др. внешний вид На вспомогательные работы, мойка стеклянной посуды

6. ИЗЛОЖЕНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА

ВР.1. Обработка производства.

ВР.1.1. Подготовка помещений.

Участок производства должен быть разделен на 4 помещения (зоны): Г-ГУ, при этом помещения (зоны) П-^ должны быть оборудованы настольными боксами с бактерицидными лампами.

Помещения (зоны) должны содержаться в полном соблюдении условий санитарно-гигиенического режима и быть надлежащим образом освещено. Полы, стены и потолки во всех производственных помещениях (зонах) должны быть гладкими, без щелей, выполненными из непылящих материалов, легко мыться и подвергаться дезинфекции. Трубы, осветительные приборы и вентиляционные устройства в производственных помещениях должны располагаться таким образом, чтобы их можно было легко чистить.

Производственные помещения (зоны) должны подвергаться влажной уборке с применением моющих и дезинфицирующих средств (моющие средства «Астра», «Миф», «Кристалл» и др.). Сухая уборка категорически запрещается. Полы моются не реже 1 раза в смену, стены и двери не реже 1 раза в неделю. Потолки не реже 1 раза в месяц очищаются от пыли влажной ветошью. Оконные стекла, рамы моются не реже 1 раза в месяц горячей водой с мылом или моющими средствами. Снаружи окна моются только в теплое время года.

ВР.1.2. Подготовка оборудования и инструментов.

Оборудование должно быть установлено таким образом, чтобы оптимизировать потоки исходных и упаковочных материалов, продукции, исключить риск загрязнения или выполнения ошибочных действий.

Погрешность приборов для измерения массы и другого измерительного оборудования должна соответствовать производственным и контрольным операциям, в которых они используются.

Периодичность калибровки (поверки) измерительных, регистрирующих, контрольных приборов и оборудования для измерения массы должна соответствовать указанной в соответствующих методиках. Результаты калибровки (поверки) должны быть документированы.

Проверяют исправность электропроводки электрооборудования и включают в сеть. В случае обнаружения неисправности вызывают мастера.

Подготовка оборудования к работе проводится в соответствии с рабочими инструкциями, которые должны быть на рабочих местах.

Для производства тест-систем используют одноразовые расходные материалы, не требующие предварительной подготовки (полипропиленовые пробирки, наконечники, наконечники с аэрозольным барьером и т.п.).

Ножницы, используемые для работы с биологическим материалом, после работы заливают водой с раствором моющих средств и оставляют на 10-12 часов. После чего их моют в теплой воде и ополаскивают дистиллированной водой 4-5 раз. Ножницы сушат в сушильном шкафу при постоянной температуре 100-105 °С в течении 30 мин.

Стеклянную посуду (пробирки, пипетки, флаконы емкостью 100-200 см3, банки, мерные цилиндры, используемые в работе при изготовлении и контроле), подвергают мойке с использованием синтетических моющих средств. Посуду укладывают в ванну из нержавеющей стали, куда заливают моющий раствор и кипятят. При мойке с использованием 0,1 % моющего средства типа «Лотос» и т.п. посуду кипятят в течение 30-60 мин. При остывании посуды до температуры (35-37°С) посуду моют с помощью щетки «ерш» и ополаскивают в теплой водопроводной и дистиллированной воде не менее 4-5 раз. Вымытую стеклянную посуду в перевернутом виде просушивают в сушильном шкафу при температуре (60-80°С) в течение 1 ч.

ВР.1.3. Подготовка персонала.

Персонал должен иметь образование, подготовку и опыт работы, позволяющие выполнять производственные операции в соответствии с должностными инструкциями.

Персонал обязан:

• работать в чистой одежде, конструкция которой соответствует выполняемым обязанностям;

• строго соблюдать требования производственной дисциплины;

• строго соблюдать инструкции, регламентирующие состояние здоровья и требования гигиены;

• периодически проходить переподготовку и медицинские осмотры;

• вход в помещения и выход из них осуществлять в соответствии с письменными инструкциями. Доступ в производственные помещения ограничен;

• перед входом в помещения надевает специальную или технологическую одежду;

• смена одежды и обуви происходит в специальных помещениях для переодевания.

ВР-2. Подготовка пробирок с этикетками

С использованием этикетировочной машины для маркировки флаконов (например, термотрансферный принтер этикеток Zebra TLP 2844, Zebra Technologies) готовят необходимое количество самоклеющихся этикетках, на которые наносят наименование компонентов тест -системы.

В ламинарном шкафу вскрывают пакет с пробирками объемом 1,5 см3 и соответствующими им закручивающимися крышками. Навинчивают крышки на пробирки. Наклеивают этикетки.

Пробирки с этикетками используют на стадии УМО.5.

ТП.3. Подготовка сырья.

ТП.3.1. Подготовка воды

Чистые стеклянные бутыли (флаконы) с закручивающимися крышками (ВР.1.2.) стерилизуют с использованием стерилизатора парового, например, ГК-10-1 «ТЗМОИ» (рис. 2, № 2) при 130 Атм. в течение 1 ч., после чего в перевернутом виде просушивают в сушильном шкафу, например, KoTTerman, Германия (рис. 2, № 3), при температуре 60-80°С в течение 1 ч. Воду для лабораторного анализа 1-й степени чистоты (ГОСТ Р 52501-2005) получают с использованием системы для очистки воды (например, Simplicity, Millipore, Франция) (рис. 2, № 4), фильтруя непосредственно в стерильные стеклянные бутыли или флаконы. Флаконы с водой хранят при комнатной температуре.

ТП.3.2. Приготовление стоков («маточных» растворов) праймеров. Для приготовления «маточных» растворов олигонуклеотидов (праймеров) Oligo1_ STA_SEQ, Oligo2_ STA_SEQ, Oligo3_STA_SEQ, Oligo1_ LSP_SEQ, Oligo2_ LSP_SEQ, Oligo3_ LSP_SEQ, Oligo1_ ASP1_SEQ, Oligo2_ ASP1_SEQ, Oligo3_ ASP1_SEQ, Oligo1_ ASP2_SEQ Oligo2_ ASP2_SEQ, Oligo3_ ASP2_SEQ берут лиофилизированные олигонуклеотиды, синтезированные в соответствии с заданными последовательностями (ЗАО «Евроген», г. Москва, Россия), и добавляют воду для лабораторного анализа 1-й степени чистоты (ГОСТ Р 52501-2005) до конечной концентрации праймеров 250 нмоль/см3. Расчет необходимого количества воды для приготовления «маточного» раствора олигонуклеотидов проводят по формуле:

V = v /250 *1000, где

V - необходимый объем воды, см3

v - количество лиофилизированных праймеров в соответствии с паспортом производителя, нмолъ

Растворы готовят согласно ГОСТ 4517-87 путем добавления соответствующего количества воды с помощью дозатора переменного объема («Лабсистемс», г. Санкт-Петербург) и одноразового наконечника с аэрозольным барьером (ООО «Компания Хеликон», г. Москва). «Маточные» растворы праймеров применяют для приготовления рабочих растворов праймеров Oligo 1 и Oligo 2 в составе тест-системы.

Готовые маточные растворы хранят при -20°C.

ТП.3.3. Приготовление 1,354 М раствора Трис-гидрохлорида, pH=8,8.

Сведения о видах и количестве используемых и получаемых в производстве сырья на стадии ТП.3.4. представлены в таблицах 4.1 и 4.2.

Таблица 4.1 - Израсходовано на стадии ТП.3.4. (суммарно)

Наименование полупродуктов и Содержание Израсходовано

сырья основного Масса г осн. г/ Объем Штук

вещества, % (г) вещ-ва моль (см3)

Б. Сырье

1. Трис гидрохлорид >99,0 10,67 10,67 157,6 10,67 -

2. 1 M HCl >98,5 до 5* до 0,02 36,5 до 5*

3. Вода >99,9 до 50 до 50 - до 50 -

4. Пробирка (флакон) 50 см3 - - - - - 1

5. Крышка для пробирки 50 см3 - - - - - 1

Примечание: необходимое количество (объем) 1 M HCl определяется в результате титрования.

Таблица 4.2 - Получено на стадии ТП.3.4. (суммарно)

Наименование Содержание Получено

полупродуктов и сырья основного Масса г осн. вещ- г/моль Объем Штук

вещества, % (г) ва (см3)

Б. Сырье

1. 1,354 М Tris-HCl 21,34 50 10,67 157,6 50 1

Для приготовления 1,354 М раствора Трис-гидрохлорида производят навеску Трис-гидрохлорида в соответствии с необходимым объемом конечного раствора. Массу навески определяют в зависимости от конечного объема раствора по следующей формуле: штрис = 157,6 * 1,354 * у /1000, где

ттрис - масса навески Трис-гидрохлорида (г); у - необходимый конечный объем раствора Трис-гидрохлорида заданной молярности (см3).

Навеску пересыпают в емкость для приготовления раствора и добавляют воду для лабораторного анализа 1-й степени чистоты (ГОСТ Р 52501-2005) до ок. 2/3 конечного объема раствора. Емкость с раствором помещают на магнитную мешалку для растворения Трис-гидрохлорида посредством перемешивания. После полного растворения Трис-гидрохлорида производят потенциометрическое определение концентрации водородных ионов, pH (ГФ XI, стр.113 Определение концентрации водородных ионов). Для получения нужной pH раствора с помощью дозатора и наконечника производят добавление по каплям 0,5 М гидроксида натрия при постоянном помешивании. Проводят измерение pH после каждого добавления раствора гидроксида натрия. По достижении заданного значения pH растворы переливают в мерные цилиндры, добавляют воду для лабораторного анализа 1-й степени чистоты до необходимого

конечного объема растворов. Полученные растворы хранят при комнатной температуре в течение 6 мес.

ТП.3.4. Приготовление 1,5 М раствора магния хлористого.

Сведения о видах и количестве используемых и получаемых в производстве сырья на стадии ТП.3.5. представлены в таблицах 5.1 и 5.2.

Таблица 5.1 - Израсходовано на стадии ТП.3.5. (суммарно)

Наименование полупродуктов и Содержание Израсходовано

сырья основного Масса г осн. г/ Объем Штук

вещества, % (г) вещ-ва моль (см3)

Б. Сырье