Влияние низких температур и криопротекторов на структуру и функцию изолированной цитохромоксидазы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.22, кандидат биологических наук Розанова, Екатерина Дмитриевна

• Розанова, Екатерина Дмитриевна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Розанова, Екатерина Дмитриевна

Введение

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Влияние замораживания-оттаивания на белок-липидные комплексы и белки

1.2. Влияние состава растворителя и температуры на белок-липидные комплексы и белки

1.3. Структура и функция цитохромоксидазы

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Влияние замораживания-оттаивания на цитохромоксидазу.

Глава 4. Влияние солей на цитохромоксидазу

Глава 5. Влияние криопротекторов на цитохромоксидазу

5.1. Влияние криопротекторов. на .^структурно-функциональное состояние .диадромоксидазы

5.2. Замораживание-оттаивание цитохромоксидазы в присутствии криопротекторов

Обсуждение

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние низких температур и криопротекторов на структуру и функцию изолированной цитохромоксидазы»

Одним из наиболее актуальных направлений современной криобиологии является изучение механизмов криоповреждения и криоза-щиты биологических объектов.

Анализ механизмов криоповреждений на различных уровнях биологической организации привел большинство криобиологов к выводу, что наиболее чувствительными к действию низких температур структурами являются биологические мембраны [5,7,8,59,62,158]. Однако молекулярные механизмы повреждения мембран при замораживании-оттаивании изучены недостаточно. Необходимым этапом выяснения молекулярных механизмов криоповреждения мембран является исследование влияния низких температур и сопряженных с их действием факторов на белок-липидные комплексы. Целесообразность таких исследований подтверждается данными об изменении активности ряда мембраносвязанных ферментов после замораживания клеток и клеточных органел [52,76,108,180] . Большой интерес для криобиологии представляет изучение криоповреждений мембран митохондрий, вследствие их высокой криолабильности [8] и существенной роли в обеспечении жизнедеятельности клетки. Ферментные системы, встроенные в мембраны митохондрий, осуществляют реакции окисления-восстановления, сопряженные с генерацией и аккумуляцией энергии [ 66 ] . Определяющая роль митохондрий в обеспечении энергетического баланса клеток позволяет ряду авторов считать, что именно их повреждение является основной причиной гибели клеток при замораживании [147,162,178] .

Одним из важнейших ферментов внутренней мембраны митохондрий является дитохром-с -оксидаза (ЕС 1.9.3.1) - терминальный участок дыхательной цепи, сопряженной с цепью окислительного фосфорилирования.

Исследование состояния этого фермента в тканях после замораживания свидетельствует о снижении его активности [52,53,180]. Работы, проведенные на изолированном лилопротеиновом комплексе, показывают, что замораживание до -20°С может приводить к изменению структуры фермента [141,196] .

Вместе с тем, остается невыясненным вопрос о взаимосвязи структурных и функциональных изменений цитохромоксидазы при замораживании-оттаивании. Поскольку процесс замораживания-оттаивания представляет собой целый комплекс физико-химических изменений, на характер которых может влиять и искусственная крио-защита, неясно также, какие именно факторы и каким образом оказывают влияние на структуру и функцию фермента.

Действие низких температур и криопротекторов на изолированный липопротеиьовый комплекс представляет интерес и с точки зрения теоретической криобиологии; в литературе имеются лишь единичные сообщения, посвященные изучению механизмов криопов-реждения и криозащиты липопротеинов [21,197 "i.

В связи с вышесказанным, целью настоящей работы явилось выяснение характера структурно-функциональных изменений цитохромоксидазы, вызываемых действием низких температур, и выявление основных факторов криоповреждения и криозащиты фермента.

В задачи работы входило: изучение структурно-функциональных изменений цитохромоксидазы под действием различных режимов замораживания-отогрева фермента в средах с различным солевым составом; изучение структурно-функциональных изменений цитохромоксидазы под действием различных концентраций солей и криопротекторов; выяснение возможных путей криопротекции цито-хром- с-оксидазы при замораживании-оттаивании.

Исследования проводились на цитохром- с -оксидазе, выделенной из сердца крупного рогатого скота. Для решения поставленных задач был применен комплекс биофизических и биохимических методов. Для характеристики структурного состояния цитохром- с-оксидазы использовали методы дифференциальной спектрофотометрам, температурной пертурбационной дифференциальной спектрофотомет-рии, сольвентной пертурбационной дифференциальной спектрофотоиетрии, электрофореза в полиакриламидном геле, определение количества фосфора на молекулу белка для оценки количества липи-дов, входящих в состав липопротеинового комплекса. Оценка функционального состояния производилась измерением ферментативной активности и расчетом кинетических параметров реакции, катализируемой цитохром- с-оксидазой. Для оценки возможности деструкции липопротеинового комплекса в результате процессов перекис-ного окисления проводили реакцию на наличие малонового альдегида.

Экспериментальные исследлвания впервые позволили охарактеризовать функциональные изменения цитохром-с-оксидазы при действии замораживания-оттаивания во взаимосвязи со структурными изменениями фермента. Показано, что замораживание-оттаивание цитохром-с-оксидазы приводит к изменению конформации фермента, затрагивающему область его активного центра, и к нарушению бе-лок-липидных взаимодействий. Выяснено, что определяющую роль в криоповреждении цитохром- с -оксидазы играет солевой состав среды, при этом влияние анионного состава более выражено, чем ка-тионного.

Установлено, что хлориды натрия, калия и лития в концентрациях выше 1,5 М вызывают необратимые структурные изменения цитохромоксидазы, сопровождающиеся инактивацией фермента. Сравнение экспериментальных результатов, полученных при изучении влияния на цитохромоксидазу замораживания-оттаивания и концентрированных растворов солей, показало, что криоповрекдение фермента обусловлено, главным образом, концентрированием растворов солей при вымерзании воды, однако, в него включаются и другие факторы, приводящие к инактивации фермента или усиливающие действие солей.

Показано, что все изученные криопротекторы с ростом концентрации приводят к смещению предденатурационного перехода цитохромоксидазы в область высоких температур, а при достижении определенной для каждого криопротектора концентрации этот переход не наблюдается. Показано, что все изученные криопротекторы стабилизируют белок-липидные взаимодействия в процессе замораживания-оттаивания и все, за исключением этиленгликоля, обеспечивают сохраненре структуры белковой части комплекса. Установлено, что концентрация криопротектора, необходимая для эффективной криозащиты фермента, находится в прямой зависимости от концентрации соли в среде замораживания. Предложен возможный механизм криозащиты фермента, заключающийся в стабилизации бе-лок-липидных взаимодействий при сорбции молекул криопротекторов на поверхности липопротеинового комплекса и нейтрализации повреждающего цитохромоксидазу действия солей за счет образования комплексов ионов с криопротекторами.

Впервые получены температурные пертурбационные дифференциальные спектры цитохромоксидазы и показана возможность их использования для изучения конформационных переходов фермента.

Практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные найдут применение в разработке общей теории криоза-щиты биологических объектов, в создании эффективных методов криопротекции ферментных ансамблей и в обосновании научных подходов к выбору основных компонентов криозащитных сред.

Основные положения, подлежащие к защите.

1. Криолабильность цитохромоксидазы в значительной мере зависит от солевого состава раствора, в котором находится фермент. Инактивация фермента после замораживания-оттаивания более выражена в средах, содержащих анионы С С .

2. Повреждающий эффект замораживания-оттаивания выражается в изменении конформации белковой части липопротеинового комплекса и нарушении белок-липидных взаимодействий. Каждое из этих структурных изменений сопровождается снижением ферментативной активности цитохромоксидазы.

3. Основным фактором криопровреждения фермента является повышенная концентрация соли в среде замораживания. Обеспечение криозащиты цитохромоксидазы достигается применением криопротек-торов, которые стабилизируют белок-липидные взаимодействия и предотвращают изменения белковой части комплекса.

Заключение диссертации по теме «Криобиология», Розанова, Екатерина Дмитриевна

выводы

1. Установлено, что замораживание-оттаивание изолированной цитохромоксидазы приводит к необратимому изменению конформации белка в области активного центра и потере связанных с белком липидов. Эти изменения сопровождаются инактивацией фермента.

2. Установлено, что криолабильность цитохромоксидазы в значительной степени определяется составом среды, в которой суспендирован фермент. Наиболее выражено криоповреждение фермента в растворах, содержащих анионы С1

3. Основными факторами криоповреждения фермента являются эвтектические растворы, о чем свидетельствует: большая устойчивость цитохромоксидазы к быстрому замораживанию, чем к медленному, и выраженный повреждающий эффект охлаждения фермента до температур -20 * -30°С и экспозиции в концентрированных растворах солей.

4. Установлено, что хлориды No , К a Li в концентрациях выше 1,5М вызывают необратимые конформационные изменения цитохромоксидазы в области активного центра, сопровождающиеся потерей ферментативной активности. Инактивация фермента увеличивается при увеличении экспозиции фермента в растворах солей. Инакти-вирующее действие солей замедляется при понижении температуры.

5. Методом температурной пертурбационной дифференциальной спектрофотометрии показано, что с ростом концентрации криопро-текторов предденазеу рационный конформационный переход сдвигается в область высоких температур, а при достижении определенной для каждого криопротектора концентрации не наблюдается.

6. Показано, что этиленгликоль, ПЭГ-400, глицерин, 1,2-про-ландиол, сахароза предотвращают отщепление липидов при замораживании цитохромоксидазы в солевых растворах. Все эти криопротек-торы, кроме этиленгликоля, защищают также и белковую часть комплекса.

7. Эффективность криопротекции определяется соотношением количества солей и криопротекторов в растворе: при увеличении количества солей для эффективной криозащиты необходимо увеличить и количество криопротектора.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ

1. Результаты исследований, касающиеся влияния низкой температуры и состава среды на структуру цитохромоксидазы используются в лекционном курсе кафедры молекулярной и прикладной биофизики Харьковского государственного университета им.А.М.Горького (справка о внедрении от Ц мая 1984 г.).

2. По результатам диссертационной работы опубликовано в открытой печати 4 работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Розанова, Екатерина Дмитриевна, 1984 год

1. Актуальные проблемы криобиологии. Под редакцией Н.С.Пушкаря, A.M.Белоуса. К., Наукова думка, 1981, 606 с.

2. Белоус A.M., Лемешко В.В. Сравнительная характеристика действия ПЭ0-400 и глицерина на функциональное состояние митохондрий. Актуальные вопросы консервации и трансплантации костного мозга и крови. Харьков, 1972, - с.123.

3. Белоус A.M., Бондаренко В.А., Бондаренко Т.П. Молекулярные механизмы криоповреждений биомембран при воздействии низких температур. Механизмы криоповреждения и криозащиты биологических структур. К., Наукова думка, 1977, - с.3-4.

4. Белоус A.M., Бондаренко В.А., Бондаренко Т.П. Влияние замораживания-оттаивания на липидный состав митохондрий. Биохимия, 1978, 43, Ш 12, C.2I75-2I82.

5. Белоус A.M., Бондаренко В.А., Бондаренко Т.П. Биохимическая модификация липидов биомембран как причина гибели клеток при низкотемпературном консервировании. Криобиология и криоме-дицина, 1978, вып.4, с.3-8.

6. Белоус A.M., Шраго М.И., Пушкарь Н.С. Криоконсерванты. К., Наукова думка, 1979, 198 с.

7. Белоус A.M., Бондаренко В.А. Криоповреждения биомембран. Структурно-функциональные нарушения митохондрий и лизосом. -Актуальные проблемы криобиологии. К., Наукова думка, 1981, с. 41-100.

8. Белоус A.M., Бондаренко В.А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. К., Наукова думка, 1982,с.255.

9. Белоусов В.П., Кочнев И.Н., Сидоров А.И. Спектральные и термодинамические свойства и строение водных растворов спиртов. Молекулярная физика и биофизика водных систем. Л,, 1974, вып.2, с.3-15.

10. Богач П.Г., Зима В.Л., Данилова В.М., Дубонос В.Н. Температурная зависимость флуоресценции миозина скелетных мышц. -ДАН УССР, 1975, сер.Б, № I, с.54-56.

11. Брондс Д.Ф. Конформационные переходы белков в воде и в смешанных водных растворителях. Структура и стабильность биологических макромолекул. М., Мир, 1973, с.174-254.

12. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М., Наука, 1972, 348 с.

13. Волькенштейн М.В. Биофизика. М., Наука, 1981, 256 с.

14. Ворот1л1н О.М., Шраго M.I. Про захисну д1ю пол1мер1в окису етилену на еритроцити людини при заморажуваннЬ ДАН УРСР, 1966, Ш 5, с.638-643.

15. Гаврилова И.И. Изучение влияния низкой температуры и криопротекторов на структурно-конформационные переходы в некоторых белках и мембранах эритроцитов. Канд.дисс., Харьков, 1982.

16. Гусева Н.Р. Изменение АТФазной активности мембран эритроцитов при действии низких температур. Современные вопросы-криобиологии. К., Наукова думка, 1976, с.61-65.

17. Демченко 0.11., Зима В.Л. Температурно-пертурбац1йна спектрофотометр^ тирозину I триптофану. Укр. б!ох!м.журнал,1974, 45, № 3, с.345-350.

18. Демченко А.П. Температурные эффекты в электронных спектрах поглощения и структуры белков. Молекулярная биология, К., 1978, вып.27, с.3-15.

19. Демченко А.П. Ультрафиолетовая спектрофотометрия и структура белков. К., Наукова думка, 1981, 208 с.

20. Дузу П. Криобиохимия. М., Мир, 1980, 283 с.

21. Жегунов Г.Ф. Влияние замораживания-отогрева и криопротекторов на структурно-функциональное состояние C<l -транспортирующей системы мембран саркоплазматического ретикулума. Канд. дисс., Харьков, 1979.

22. Зима В.Л., Демченко А.П. Температурно-зависимые конформационные переходы белков и состояние хромофорных групп. Молекулярная биология. К., Наукова думка, 1976, вып.14, с.42-53.

23. Зима В.Л., Варецкая Т.В., Свитальская Л.А. и др. Влияние температуры на конформационное состояние фибриногена и его производных. Укр. биохим. журнал, 1978, 50, № 4, с.459-464.

24. Зинченко А.В., Моисеев В.А. Исследование низкотемпературных фазовых переходов в водных растворах ПЭГ-400 калориметрическим методом. Криобиология и криомедицина, 1979, вып.5, с.27-30.

25. Иванов Л.В., Гаврилова И.И., Моисеев В.А. Исследование действия низких температур и криопротекторов на белки различной структуры. Механизмы криоповреждения и криозащиты биологических структур. К., Наукова думка, 1977, с.34.

26. Иванов Л.В., Моисеев В.А., Гаврилова И.И. Исследование влияния гиперконцентрации солей на структуру Ж методом спинметок. Всесоюзн. конф. по спектроскопии биополимеров. Тез.докл. Харьков, 1977, с.82-83.

27. Иванов В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран. М., Наука, 1982, 223 с.

28. Карева Л.В., Луговой В.И. Активность иммобилизованного и растворимого трипсина после замораживания-оттаивания. -3-ий Укр. биохим. съезд. Мат.стенд.докл. Донецк, 1977, с.130-131.

29. Кейтс М. Техника липидологии. М., Мир, 1975, 175 с.

30. Коган Г.А. Применение метода дифференциальной спектроскопии для изучения структуры белков. Молекулярная биология. М., ВИНИТИ, 1973, вып.З, с.216-286.

31. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М., Мир, 1979, 280 с.

32. Кулиш М.А., Миронов А.Ф. Цитохромоксидаза. Строение и механизм действия. Биоорган, хим., 1979, 5, to 7, с.965-986.

33. Левин С.В. Структурные изменения клеточных мембран. Л., Наука, 223 с.

34. Лемешко В.В., Белоус A.M. Действие неглубокого замораживания на окислительное фосфорилирование, дыхание и флуоресценцию НАД-Н гомогенатов печени крысы. Актуальные вопросы консервации и трансплантации костного мозга. Харьков, 1972, с.147-151.

35. Лемешко В.В. Влияние различных режимов замораживания и криопротекторов (ПЭ0-400 и глицерина) на дыхание и окислительное фосфорилирование. Автореф.канд.дисс., Харьков, 1973.

36. Лемешко В.В. Функциональное состояние митохондрий печени крыс в различные фазы медленного замораживания и хранения суспензии митохондрий при температуре -25°С. Научн. докл.высш.школы, оер.биол.науки, 1975, Ш 2, с.56-60.

37. Ленинджер А. Биохимия. М., Мир, 1967, 957 с.

38. Лобышев В.И., Калиниченко Л.П. Изотопные эффекты £>гО в биологических системах. М., Наука, 1978, 215 с.

39. Лозина-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии. Л., Наука, 1972, 288 с.

40. Луговой В.И., Воловельская Е.Л. Влияние низких температур на изоферменты лактатдегидрогеназы. 3-ий Укр^ биохим. съезд. Матер, стенд, докл. Донецк, 1977, с.123-124.

41. Луговой В.И., Кравченко Л.П., Гусева Н.Р. Механизмы криопов-реждения мембраносвязанных ферментов. 3-ий Укр. биохим. съезд. Матер, стенд, докд. Донецк, 1977, с.124-125.

42. Луговой В.И., Моисеев В.А. Влияние низких температур на растворимые ферменты. Биофизика, М., ВИНИТИ, 1979, вып.9, с. 53-79.

43. Луговой В.И. Криоповреждение ферментов и ферментных систем.- Актуальные проблемы криобиологии. К., Наукова думка, 1981, с.15-41.

44. Малеев В.Я. Исследование структурных переходов биополимеров в растворе. Докт.дисс., Харьков, 1974.

45. Маркосян К.А., Погосян Г.Г., Пайтян Н.А. и др. Взаимодействие неорганических анионов с атомами меди цитохромоксидазы.- Биохимия, 1979, 44, № 5, с.844-848.

46. Микелсаар X., Северина И.И., Скулачев В.П. Фосфолипиды и окислительное фосфолирование. Успехи соврем, биол., 1974, 78, № 3(6), с. 348-370.

47. Моисеев В.А., Иванов Л.В., Гаврилова И.И. Исследование действия криолротекторов и гиперконцентраций солей на структуру сыворотных белков методом спиновых маток. Всесоюзн.конф. по спектроскопии биополимеров. Тез. докл. Харьков, 1977, с.83-84.

48. Моисеев В.А., Морозова Т.Ф., Микупинский Ю.Е. Влияние гиперконцентраций солей на конформационное состояние иммуноглобулина лошади. Криобиология и криомедицина, 1980, вып.7,с.51-52.

49. Морозова Т.Ф., Грек A.M., Коптелов В.А. и др. Изменение спектральных свойств бычьего сывороточного альбумина в концентрированных растворах хлористого натрия. Криобиология и криомедицина, 1982, вып.10, с.22-27.

50. Морозова Т.Ф., Моисеев В.А. Влияние солей на стабильность иммуноглобулина лошади. Криобиология и криомедицина, 1982, вып.10, с.27-29.

51. Нардид О.А., Моисеев В.А., Лемешко В.В. Эффекты комплексиро-вания полиэтиленоксидов с "биометаллами11. Криобиология и криомедицина, 1976, вып.2, с.19-21.

52. Обозная Э.И., Маркова О.П. Исследование конечного звена ци-тохромоксидазной цепи цитохромоксидазы в клетках костного мозга после глубокого охлаждения. - Криобиология и криомедицина, 1075, вып.1, с. 60-62.

53. Обозная Э.И., Пушкарь Н.С., Маркова О.П., Панков Б.Я. Цитохимия замороженной клетки. К., Наукова дуика, 1981, 174 с.

54. Орловская Н.Н., Зима В.Л., Демченко А.П. и др. Аномальное конформационное состояние триптофановых остатков в альдолазе. ДАН УССР, 1976, сер.Б, 1,2 2, с.167-170.

55. Петренко А.Ю. Влияние скорости замораживания и отогрева на активность дыхательной цепи митохондрий печени крыс. Криобиология и криомедицина, 1983, вып.12.

56. Поликар А. Поверхность клетки и ее микросреда. М., Мир,1975, 183 с.

57. Пушкарь Н.С., Белоус A.M., Цуцаева А.А. и др. Низкотемпературное консервирование костного мозга. К., Наукова думка,1976, 287 с.

58. Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус A.M. и др. Криопротекторы. К., Наукова думка, 1978, 204 с.

59. Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Введение в криобиологию. К., Наукова думка, 1975, 243 с.

60. Радченко И.В., Шестаковский Ф.К. Рассеяние рентгеновских лучей смесями метанола с водой. Журн.физ.хим., 1955, 29, Ш 5, с.1456-1461.

61. Ройтруб Б.А. Конформационные переходы в белках крови при различных функциональных состояниях нервной системы. К., Наукова думка, 1977, 190 с.

62. Рэ Л. Консервация жизни холодом. М., Медгиз, 1962, 175 с.

63. Сабурова Е.А., Елфимова Л.И., Ягодина Л.А. и др. Роль кон-формации белка в механизме связывания белков с ионами. -Конформационные изменения биополимеров в растворах. Мат.

64. У совещ. по конформ. измен, биополим. в раств. Тбилиси, 1981, с.71.

65. Салянов В.И., Погребняк В.Г., Скуридин С.Г. и др. О связи между молекулярным строением водных растворов полиэтилен-гликоля и компактизацией двухцепочечных молекул ДНК. -Мол.биол., 1978, 12, № 3, о.485-493.

66. Синюков В.В. Структура одноатомных жидкостей, воды и водных растворов. М., Наука, 1976, 287 с.

67. Скулачев В.П. Трансформация энергии в биомембранах. М., Наука, 1972, 202 с.

68. Татаринов Б.А., Черенкевич С.Н., Комяк А.И. Изучение зависимых от температуры конформационных повреждений сывороточного альбумина при помощи адсорбированного красителя. -Мол.биол., 1978, 12, to I, с.83-90.

69. Тищенко Е.И., Киселев П.А., Ахрем А.А. Влияние алифатических спиртов на спектральные характеристики гемопротеинов. 1У Всесоюзн. конф. по спектроскопии биополимеров. Тез. докл. Харьков, 1981, с.175-176.

70. Троицкий Г.В., Завьялов В.П., Кирюхин И.Ф. Обратимые конфор-■ мационные переходы белков в области физиологических температур. Биохимия, 1071, 36, № 6, с. 1107-1114.

71. Троицкий Г.В. Конформация белка и ее устойчивость в организме. Молек. биол. К., 1972, вып.8, с.З-П.

72. Троицкий Г.В., Матвеева М.Г., Тэтин С.Ю. и др. Эффект, оказываемый пертурбантами (этиленгликолем, глицерином, сахарозой) на конформации иммуноглобулинов. 1У Всесоюзн. конф. по спектроскопии биополимеров. Харьков, I98X, с.176-178.

73. Уильяме В., Уильяме X. Физическая химия для биологов. М., Мир, 1976, 600 с.

74. Утевский A.M., Губина Н.Ф., Чуйко В.А. Охлаждение биологических структур и адренергические механизмы. Актуальные проблемы криобиологии. К., Наукова думка, 1981, с.125-151.

75. Хьюз М. Неорганическая химия биологических процессов. М., Мир, 1983, 414 с.

76. Шраго М.И., Гучок М.М., Калугин Ю.В. Некоторые принципы направленного синтеза криопротекторов. Актуальные проблемы криобиологии. К.,Наукова думка, 1981, с.157-200.- 124

77. Araki Т. Freezing injury in mitochondrial membranes. I.Susceptible components in the oxidation systems of frozen and thawed rabbit liver mitochondria. Cryobiology, 1977, 14, N2, p.144-150.

78. Araki T. Inactivation of mitochondrial-oxyglutarate dehydrogenase complex as a result of phospholipid degradation induced by freeze-thawing. Cryobiology, 1977, U, N2, p.151-159.

79. Auer H.E., Sun M., Greulick M. Characterization of the pH-de-pendent dimer-protomer transformation of cytochrome с oxidase at alkaline pH. Physiol.Chem.Phys., 1979, Ц, N1, p.9-22.

80. Azzi A., Casey R.P. Molecular aspects of cytochrome oxidase structure and dynamics. Moll.Cell.Biochem., 1979, 28, N1-3, p.169-184.

81. Balcavage B,X., Beck J.C., Burk D.P. Cryobiological studies of yeast mitochondria. Cryobiology, 1979, 6, Ю, p.385-389.

82. Bauman H., Rieske I. Involvment of water in electron transfer in complexes III and IY of the mitochondrial electron transport chain. Biochem.Biophys.Res.Communs., 1966, 24, H1,p.1-9.

83. Bayless N. The effect of electrostatic polarization of the solvent on electronic absorption spectra in solution. J. Chem.Phys,, 1950, J8, N3, p.292-296.

84. Beinert H., Hansen R.E., Hartzell C.R. Kinetic studies on cytochrome с oxidase by combined EPR and reflactance spectroscopy after rapid freezing. BBA (Biochem.Biophys.Acta), 1976, 423, N2, p.339-356.

85. Beinert H., Shaw R. On the identity of the high spin heme components of cytochrome с oxidase. Biochem.Biophys.Acta, 1977, 462, N1, p.121-130.

86. Bezdekova A., Vetterl V., Kleinwachter V. Absorption spectra-1 25of aggregated polyadenic acid and neitral and acid pH. -Studia biophysica, 1978, 70, N1, p.63-78.

87. Brady R.S., Flatmark Т., Autoreduction of horse heart ferry-cytochrome c. J.Mol.Biol., 1971, 57, N3, p.529-531.

88. Bruni A., Van Dijck W.M., de Gier J. The role of phospholipid acyl chains in the activation of mitochondrial ATPase comples. Biochem.Bioph.ys.Acta, 1975, 406, N2, p.315-328.

89. Cabral P., Love B. The heme environment in ferric and ferrous cytochrome с oxidase. Biochemistry, 1974, 13., N10,p.2038-2043.

90. Capaldi R.A. Structure of cytochrome oxidase. Membrane protein energy transduction, N.Y., Basel, 1979, p.201-231.

91. Caughey W.S., Barlow C.H., Maxwell J.C. Cytochrome oxidase. -Ann.N.Y.Acad.Sci., 1975, 244, N1, p.1-9.

92. Caughey W.S., Smythe G.A., O'Kufe D.M. Heme a of cytochrome с oxidase. Structure and properties: comparison with hemes

93. В, С and S derivates. J.Biol.Chem., 1975, 250, N19, p.7602r 7622.

94. Caughey W.S., Wallonce W.J., Volpe J.A. Cytochrome с oxidase. Enzymes, 1976, 13., Part С 3rd ed., p.299-344.

95. Chapman D., Peel W.E., Kingston B. Lipid phase transition model biomembranes. The effect of ions on phosphatidylcholine bilayers. Biochem.Biophys.Acta, 1977, 464, N2, p.260-275.

96. Chilson O.P., Costello G.A., Kaplan N.O. Effect freezing on enzymes. Fed.Proc., 1965, 24, N2, p.55-65.

97. Chuang T.P., Crane P.L. Phospholipids in the cytochrome oxidase reaction. J.Bioenerg., 1973, 4, N6, p.563-578.

98. Chuang T.F., Awasthi J.C., Crane P.L. A model mosaic membrane: Association of phospholipids and cytochrome oxidase.

99. J.Bioenerg., 1973, 5, N1, p.27-72.

100. Dasgupta W., V/harton D.C. The use of maleimido spin label to detect conformational changes in cytochrome с oxidase. -Arch.Biochem.Biophys., 1977, 183, N1, p.260-272.

101. Deisseroth A., Daunce A.L. Nature of the change produced in cat alase by lyophilization. Arch.Biochem.Biophys., 1967, 120, N3, p.671-692.

102. Demchenko A.P., Zymo V.L. Thermal perturbation spectroscopy of proteins. 1.Medium polarity effect. Stud.Biophys., 1975, 52, N3, p.209-221.

103. Docter M.E., Steinmann A., Shatz G. Mapping of yeast cytochrome с oxidase by fluorescence resonance energy transfer. Distance between subunit II, heme a and cytochrome с bound to subunit III. J.Biol.Chem., 1978, 253, N"1, p.311-317.

104. Downer N.W., Robinson N.C., Capaldy R.A. A resolution of seven polypeptide subunits of beaf heart cytochrome с oxidase.-Biophys.J., 1976, 16, N2, part II, p.114-120.

105. Drost-Hansen W. Structural and functional aspects in interfa-cial (vicinal) water as related to membrane and cellular systems. Colloid.int.CNRS, 1976, N246, p.177-186.

106. Drost-Hansen W. Water at biological interfaces-structural and functional aspects. Phys. and Ghem. Liquids, 1978, 7, ИЗ, p.243-348.

107. Eytan G.D., Schotz G. Cytochrome с oxidase from baker's yeast. V.Arrangement of the subunits in the isolated and membrane-bound enzyme. J.Biol.Chem., 1975, 250, N2, p.767-774.

108. Eytan G.D., Corrol R.G., Schatz G. Arrangement of the subunits in solubilized and membrane-bound cytochrome с oxidase from bovine heart. J.Biol.Chem., 1975, 250, N22, p.8598-8603.

109. Pink A.L., Cartwright S.J. Gryoenzymology, GRG Gut.Rev. in

110. Biochem., 1981, 11., N2, p. 145-207.

111. Pishbein W.N. Studies on the mechanism of freezing damage to mouse liver using a mitochondrial enzyme assay. Ill.Cry-ophylaxis with dimethyl sulfoxide and enzyme localization.-Cryobiology, 1971, 8, N3, p.293-297.

112. Fishbein W.N., Griffin J.L. Parametres of freezing damage to mouse liver. Cryobiology, 1976, 13, N5, p.542-556.

113. Pishbein W.N., Winkert J.W. Low temperature zone of cryophy-llactant damage in phosphate-buffered saline. Cryobiology,1977, 14, N7, p.705.

114. Pishbein W.N., Winkert J.W. Parametres of biological freezing damage in simple solutions: catalase. Cryobiology,1978, 15, N2, p.168-177.

115. Pishbein W.N., Winkert J.W. Parameters of freezing damage to enzymes. In: Low temperature proteins at low temperatures. Washington, 1979, p.55-82.

116. Pranks P. Solvent mediated influences on conformation and activity of proteins. Charact.Protein.Conform, and Funct., London, S.R., 1980, p.37-53.

117. Pry M., Vanderzande H., Green D.E. Resolution of cytochrome oxidase into 2 component complexes. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1978, 75, N12, p.5908-5911.

118. Pry M., Green D. Cardiolipin requirement by cytochrome oxidase and the catalytic role of phospholipid. Biochem.Biophys. Res.Communs., 1980, 93, N4, p.1238-1246.

119. Greiff D., Myers M., Privitera C.A. The effect of glycerol) freezing and storage at low temperature and drying by vacuumsublimation on oxidative phosphorylation by mitochondrial suspensions. Biochim.Biophys.Acta, 1961, 50, N2, p.233-242.

120. Hackenbrock C.R., Hammon K.M. Cytochrome с oxidase in livermitochondria. Distribution and orientation determined with affinity purified immunoglobulin and ferritin conjugates. -J.Biol.Chem., 1975, 250, N23, p.9185-9197.

121. Halaka F.G., Baboock G.T., Dye y.u. Kinetic distinction between cytochrome a and a^ in cytochrome с oxidase. J.Biol. Chem., 1981, 256, N3, p.1084-1087.

122. Hanafusa N. Denaturation enzyme protein by freeze-thawing. -Cellular injury and resistance in freezing organisms., N.Y., 1966, p.33-48.

123. Hanafusa N. Denaturation of enzyme protein by freeze-thawing and freeze-drying. Freezing and drying of microorganisms. 1969, p.

124. Hanafusa N. Denaturation of enzyme protein by freeze-thaw-ing and freeze-drying. Gontr.Inst.Low Temp.Sci., S.B., 1972, N17, p.1-38.

125. Hanafusa N. Freezing and drying of enzyme proteins. Free-ze-drying of biological materials. - International Inst.of Refrigeration, Bulletin Annexe, 1973, 5, p.9-18.

126. Hatefi Y., Haavik A.G., Fowler L.R., Griffiths D.E. Studies on the electron transfer system. XLII.Reconstitution of the electron transfer system. J.Biol.Chem., 1962, 237, p.2661.

127. Hatefi Y., Hanstein G. Solubilization of particulate proteins by chaotropic agents. Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 1969, 62, N6, p.1129-1136.

128. Heber U. Freezing injury in relation to loss enzyme activities and protection against freezing. Cryobiology, 1968, 5, N2, p.188-201.

129. Helenius A., Simons K. Solubilization of membranes by detergents. Biochem.Biophys.Acta, 1975, Ц5, N1, p.29-79.

130. Henderson R., Capaldi R.A., Leigh J.S. Arrangement of cytochrome oxidase moleculea in two-dimensional vesicle crystals. J.Mol.Biol., 1977, 112, N4, p.631-648.

131. Heremans K. Pressure effects on biological macromolecules. -High Pressure Res. and Ind. 8 AIRAPT Conf., 1981, Proc. V.2, Uppsala, 1982, p.815-820.

132. Heron G., Gore M., Ragan C.J. The effects of lipid phase transitions on the interaction of mitochondrial NADH-ubiqu-inone oxidoreductase with ubiquinol-cytochrome с oxidore-ductase. Biochem.J., 1979, 178, N3, p.415-436.

133. Ingham K.C. Poly(ethyleneglycol) in aqueous solution: solvent perturbation and gell filtration studies. Biophysical J., 1977, 17, H2, p.112a.

134. Karow A.M.J., Webb W.R., Stapp J.B. The preservation of hearts by freezing. Arch.Surg., 1965, 91, N3, p.572-579.

135. Karow A.M.J. Cryoprotectants a new class of drugs. -J.Pharm.Pharmac., 1969, 21., N4, p.203-223.

136. Kawato S., Ikegami A., Yoshida S. Fluorescent probe study of temperature-induced conformational changes in cytochrome oxidase in lecitin vesicle and solubilized systems. -Biochemistry, 1980, N8, p.1598-1603.

137. Khan A.W., Davidkova E., Van den Berg L. On cryodenaturation of chicken myofibrillar protein. Cryobiology, 1968, 4, N4, p.184-188.

138. King Т.Е. Reconstitution of respiratory chain enzyme systems. J.Biol.Chem., 1967, 236, N8, p.2342-2348.

139. Krab K., Wikstrom M. Proton-translocating cytochrome с oxidase in artificial phospholipid vesicles. Biochem.Biophys. Acta, 1978, 504, N1, p.200-214.

140. Kuasne S., Siseheman G., Czado G. Freezing and melting of lipid bilayers and model of action of nonaction valinomycin- 130 and granuoidin. Science, 1971, 174, N4007, p.1412-1415.

141. Kuboyama M., Yong P.O., King Т.Е. Studies on cytochrome oxidase. J.Biol.Chem., 1972, 247, N20, p.6375-6383.

142. Lee A.G. Annular events: lipid protein interactions. -Trends.Biochem.Sci., 1977, 2, N10, p.231-233.

143. Leigh J.S., Wilson D.P., Owen C.S. Heme-heme interaction in cytochrome с oxidase; the cooperativity of the hemes of cytochrome с oxidase as evidenced in the reaction with GO. -Arch.Biochem.Biophys., 1974, 160, N2, p.476-486.

144. Lemberg R. Hemes and hemoproteins. Acad.Press, N.Y., 1966, 120 p.

145. Lemberg M.R. Cytochrome oxidase. Physiological Reviews, 1969, 49, N1, p.48-121.

146. Levitt Y. A sulphydryl-disulfide hypothesis of frost injury and resistance of plants. J.Theor.Biol., 1962, 3, N2,p.355-391.

147. Levitt Y. The role of proteins in freezing injury and resistance of biological materials. Protein at low temperatures, Washington, 1979, p.141-159.

148. Lipinsel H. Beinfussing der aktivitaten der Ponkreosfermente bei koltekonservierung. Diss.Dolct.Med., Meinchen, 1973, 71S.

149. Lovelock J.E. The haemolysis of human red blood cells by freezing and thawing. Biochem.Biophys.Acta, 1953, .10, N4, p.414-420.

150. Lovelock J.E. Preservation and transplantation of normal tissues. Boston, 1964

151. Lusena C.V., Doss C.M. Structural changes associated with the release of enzyme from rat liver mitochondria.

152. Can.J.Biochem., 1966, 44, N6, p.775-781.

153. Luyet B.J., Rapatz G.L., Gehenio P.M. On the model action of rapid freezing in preventing haemolysis. Ped.Proc., 1963, 22, N3, p.429-431.

154. Lyons J. Phase transitions and control of cellular metabolism at low temperatures. Cryobiology, 1972, 9, N4, p.341-350.

155. Molmstrom B.G. Cytochrome oxidase. Quart. Rev. Biophys., 1973, 6, p.389-431.

156. Molmstrom B.G. Cytochrome с oxidase. Structure and catalytic activity. Biochim.Biophys.Acta, 1979, 549, Ю-4, p.281-303.

157. Market C.L. Lactate dehydrogenase isozymes: dissociation and recombination of subunits. Science, 1963, 140, N3573,p.1329-1330.

158. Markwell M.A.K., Beiber L.L. Localization and solubilization of rat liver microsomal carnitine acetyl transferase. Arch. Вiochem.Biophys., 1976, Г72, N3, p.502-510.

159. Mason T.L., Poyton R.O., Wharton D.C., Shatz G. Cytochrome с oxidase and properties. J.Biol.Chem., 1973, 248, N4, p.1346-1354.

160. Meryman H.T. Modified model for mechanism of freezing injury to erythrocytes. Nature, 1968, 218, N5141, p.333-336.

161. Meryman H.T. Observation on the present state of blood preservation by freezing. Cryobiology, 1968, 5, N2, p.144.

162. Meryman H.T. The cryoprotective agents. Cryobiology, 1971, 8, N7, p.181-190.

163. Meryman H.T. Osmotic stress as a mechanism of freezing injury. Cryobiology, 1971, 8, N5, p.489-500.

164. Meryman H.T., Mitchell P., Green D. Cardiolipin requirement by cytochrome oxidase and the catalytic role of phospholipid. Biochem.Biophys.Res.Communs., 1980, 93, N4, p.1238-1246.

165. Mo Murchue E.J., Rayson J.K. Membrane lipids fluidity and its effect on the activation energy of membrane associated enzymes. Biochim.Biophys.Acta, 1979, 554, N2, p.364-374.

166. Myer G.P. Conformation of cytochromes. V.Cytochrom с oxidase. J.Biol.Chem., 1971, 246, N5, p.1241-1248.

167. Offerijns E.G., Terwell H.Z. The effect of freezing of sue percooling and DMSO of the function of mitochondria and on the contractility of the heart. Cryobiology, 1974, Ц, N2, p.152-159.

168. Orii G., Tsudzuki K. Inhibitors acting on cytochrome oxidase. Oxidases and relat. redox, system. Vol.2, Baltimore e.a., 1973, p.649-663.

169. Orii G. Iron and cooper proteins, H.Y., 1976, p.228-239.

170. Papahadiopoulo3 D. Effects of bivalent cations and proteins on the thermotropic properties of phospholipid membranes. Implications for the molecular mechanism of fusion and en-docytosis. J.Colloid.Interface Sci., 1977, 58, N3, p.459-470.

171. Phillippont J., Authier M.H. Study of human red blood cells membrane using sodium deoxycholate concentrations on ATPase activities. Bdiochem.Biophys.Acta, 1973, 293, N2, p.887-892.

172. Proteins at low temperatures, Washington, 1979, 159p.

173. Quillory B.J., Rocher E. Oxidation phosphorylation in brown adipose mitochondria. Biochim.Biophys.Acta, 1968, 153, N5, p.490-493.

174. Racker E., Hinkle P.C. Effect of temperature on the function of a proton pump. J.Membr.Biol., 1974, 17, N2, p.181-188.

175. Raison J.K., Lyons J.M., Thomson W.W. The influence of membranes on the temperature-induced changes in the kinetics of- 133 gome respiratory enzymes of mitochondria. Arch.Biochem. Biophys., 1971, 142, N1, p.83-90.

176. Raison J.K., Mc Murchue E.G. Two-temperature induced changes in mitochondrial membranes detected by spin labelling and enzyme kinetics. Biochim.Biophys.Acta, 1974, 363, N2,p.135-140.

177. Rond R.P. Structural studies by X-ray diffraction of model lipoprotein membranes of serum albumin-cardiolipin. Biochim.Biophys.Acta, 1971, 241, p.823-834.

178. Reynolds J.A., Gillbert D.B., Tanford C. Empirical correlation between hydrophobic free energy and aqueous cavity surface area. Proc.Nat.Aoad.5ci., USA, 1974, Ц, N8, p.2925-2927.

179. Robinson N.G., Oapaldi P.A. Interaction of detergents with cytochrome oxidase. -Biochemistry, 1977, 16, N3, p.374-381.

180. Rosen S. Purification of beaf heart cytochrome с oxidase. -Biochemistry, 1977, 16, N3, p.375-381.

181. Sanderman H. Regulation on membrane enzyme by lipids. -Biochem.Biophys.Acta, 1978, 515, N2, p.209-237.

182. Seiter G.H.A., Angelos C.G., Perreault P.A. An EPR signal from the invisible cooper of cytochrome oxidase. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1977, 78, N3, p.761-765.

183. Sherman J.K. Freeze-thaw-induced latent injury as a pheno-men in cryobiology. Cryobiology, 1967, 3, N5, p.407-413.

184. Sherman J.K. Correlation in cryoinjury of mitochondrial ul-trastructure with respiratory control ratio, cytochrome oxidase activity and rate of tissue oxygen consumption (Abort). Cryobiology, 1970, 7, N6, p.581-590.

185. Sherman J.K. Correlation in ultrastruetural cryoinjury of mitochondria with aspects of their respiratory function. -Exp.Cell,Res., 1971, 66, p.378-384.- 134

186. Sherman J.K. Comparison of in vivo and in situ ultrastructu-ral cryoinjury and cryoprotection of mitochondria. Cryobiology, 1972, 9, N2, p.112-122.

187. Shikama K., Yamazaki B. CryoprotectantsNature, 1963, 190, p.83.

188. Singer S.J. Thermodynamics, the structure of integral proteins and transport. J.Supromol.Struct., 1977, S, N3, p.313-325.

189. Smith K.M. Porphyrins and metalloporphyrins. Amsterdam, 1975, 173p.

190. Sun S.F., Chang T.S., del Rosario И.О. Bovine serum albumin in lithium chloride solutions. Changes in conformation. -Int.J.Peptide Protein.Res., 1974, 6, N1, p.87-94.

191. Toborsky G. Protein alterations at low temperatures. An overview proteins at low temperatures. Washington, 1979, p.1-27.

192. Tanaka M., Hanin M., ZeitlinsS. Sequence of the cysteine peptide from the cooper-subunit of bovine cardiac cytochrome oxidase. Biochem.Biophys.Res.Communs., 1975, .66, N1, p.357-367.

193. Tanaka M., Haniu M., Yasunobu K.T. Amino acid sequence of the heme a subunit of bovine heart cytochrome oxidase and sequence homology with haemoglobin. Biochem.Biophys.Res. Commune, 1977, 76, N5, p.1014-1019.

194. Tanaka M., Hanin M., Yasunobu K.T. Aminoacid sequence of sub-unit. J.Biol.Chem., 1979, 254, N10, p.3879-3885.

195. Tyler D., Estabrook R. The influence of deterium oxide and organic solvents on the interaction of respiratory chain components. J.Biol.Chem., 1966, 241, N8» p.1972-1981.

196. Tracy R.P., Chan S.H.P. Analysis of electrophoretic behavior of cytochrome с oxidase subunits. Retardation coefficient- 135 versus molecular weight in dodecyl sulfate urea gel3. -Biochim.Biophys.Acta, 1979, 576, Fl, p.109-117.

197. Verheul P.В., Boonman J.C.P., Driver G.E. The isolation of bovine heart cytochrome с oxidase subunits. Dependence on phospholipid and cholate content. Biochem.Biophys.Acta, 1979, 54§» N2, p.397-416.

198. Vik S.B., Capaldi K.A. Conditions for optimal electron transfere activity of cytochrome-c oxidase isolated from beef heart mitochondria. Biochem.Biophys.Res.Communs., 1981, 94, Fl, p.348-354.

199. Volpe J.A., Coughey W.S. Method of isolated cytochrome oxidase. -Biochem.Biophys.Res.Communs., 1974, 61, N2, p.502-509.

200. Wainio W.W., Hicodem V. Sulfhydryl groups of cytochrome oxidase. J.Bioenerg., 1973, 4, N6, p.579-590.

201. Wainio W.W. Biological reduction of 02 to HgO by cytochrome oxidase, Mol.Oxygen.Biol.Amsterdam e.a., 1974, p.275-314.

202. Wainio W.W., Laskowska-Klita Т., Rosmon J. J.Bioenerg., 1973, 4, N4, p.455-467.

203. Walloch D.F.H., Bier R. Models of lipid-protein interaction in biomembranes. Ann.N.Y.Acad.Sci., 1975, 264, p.142-160.

204. Wikstrom M.K.F., Harmon H.J., Ingledew W.J. A re-evaluation of the spectral potentiometric and energy-linked properties of cytochrome oxidase in mitochondria. FEBS Lett., 1976, 65, N3, p.259-277.

205. Wikstrom M.K.F. Cytochrome oxidase. Mitochondria and microsomes. Addison-Wesley publ. сотр., 1981, p.249-269.

206. Wilms Y., Van Rijn J.L., Van Gelder B.F. The effect of pH and ionic strength on the steady-state activity of isolated cytochrome oxidase. Biochem.Biophys.Acta, 1980, 593, N1, p.17-23.- 136

207. Winkert J.W., Fishbein w.n. Specific interaction of phosphate and saline in cryodamage to catalase. Cryobiology, 1977, 14, N3, p.706.

208. Yasunobu К., Tanaka H., Wen Yah-huci. J.Sci and Ind.Res., 1980, 39, N12, p.796-801.

209. YeagleP.L., LangdonR.G., Martin R.В. Phospholipid-protein interactions in human low density lipoprotein detected by 3'p nuclear magnetic resonance. Biochemistry, 1977, 16, N15, p.3487-3491.

210. Yu C., Yu L. Identification of subunits of bovine heart cytochrome oxidase. Biochim.Biophys.Acta, 1977, 495, N2,p.248-259.

211. Zavyalov V.P., Troitslcy G.V., Demchenko A.P. Temperature and pH dependent changes of immunoglobulin G structure. Biochim.Biophys.Acta, 1975, 386, N1, p.155-167.

212. Zavyalov V.P., Demchenko A.P., Sukhomudrenko A.G. Temperature-dependent changes of myeloma immunoglobulin G (K)/VA. Bemce-Jones protein (K-type)/VA and its fragments. Biochim. Biophys.Acta, 1977, 491, N1, p.7-15.