Комбинированные криоконсерванты в сохранении функций лейкоцитов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.21, доктор биологических наук Полежаева, Татьяна Витальевна

• Полежаева, Татьяна Витальевна
• доктор биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации доктор биологических наук Полежаева, Татьяна Витальевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ВЛИЯНИИ ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУР НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КЛЕТОК (обзор литературы)

1.1 Факторы криоповреждения и криозащиты клеток. Гипотезы, теории, концепции

1.2 Криопротекторы и криоконсерванты

1.3 Методы оценки функционального состояния клеток, подвергнутых криовоздействию

1.4 Методы криоконсервирования лейкоцитов

ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Характеристика объекта исследования

2.2 Разработка новых комбинированных криозащитных растворов, обеспечивающих сохранность лейкоцитов при различных отрицательных температурах

2.3 Методы исследования физико-химических свойств криозащитных растворов

2.4 Биологические методы исследования криозащитных растворов

2.5 Разработка программ замораживания и отогрева лейкоцитов

2.6 Методы оценки структурно-функционального состояния лейкоцитов, подвергнутых воздействию отрицательных температур

2.7 Методы статистического анализа

ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Структурно-функциональные показатели лейкоцитов,

перенесших воздействие температуры переохлаждения (-10°С)

3.2 Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие субумеренно-низкой температуры (-20°С)

3.3 Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (-40°С)

3.4 Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие низкой температуры (-80°С)

3.5 Физико-химические и биологические свойства эффективных криозащитных растворов

ГЛАВА IV ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1,2-ПД - пропандиол или а-пропиленгликоль АОА - антиоксидантная активность АФК - активные формы кислорода

А-378 или ГМБТОЭМ - гексаметиленбистетрагидроксиэтилмочевина

ГМФШ - гексозомонофосфатный шунт

ГЭК - гидроксиэтилкрахмал

ДМАЦ - диметилацетамид

ДМСО - диметилсульфоксид

ЛД 50 - средняя летальная доза

ЛК - лейкоконцентрат

ЛКБ - лизосомально-катионные белки

НАДФ - никотинамиддинуклеотидфосфат

НСТ - нитросиний тетразолий

ОМЭПС - сукцинат гидроксиметилэтилпиридина

ПВП - поливинилпирролидон

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЭО-4СЮ - полиэтиленоксид с молекулярной массой

СЦК - средний цитохимический коэффициент

ФАН - фагоцитарная активность нейтрофилов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комбинированные криоконсерванты в сохранении функций лейкоцитов»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Для создания общей теории криоповреждения и криозащиты клеток, а также эффективных научно обоснованных методов их криоконсервирования важным является всестороннее изучение структурно-функциональных изменений биологических мембран (плазматических, ядерных, лизосомальных и др.) и метаболических процессов, протекающих с их участием. Изменения окружающей среды (понижение температуры, вымерзание воды, рН, электролитный баланс, вязкость, появление чужеродных молекул и др.) первыми воспринимают плазматические мембраны. Основной причиной их первичных повреждений являются нарушения распределения липидов, обеспечивающих высокую пластичность и растяжение ^мембраны. С трансформацией липидных компонентов взаимосвязаны фазово-структурные переходы фракций клеточной воды (свободной, связанной, фиксированной), каждая из которых имеет свою зону кристаллизации с определенной степенью замедления метаболизма (Сведенцов, 2004). С учетом того, что существенное снижение метаболических процессов в клетке наступает при низкой температуре (-70° -98°С) общепринятым является консервирование клеток при температурах ниже указанных с применением жидкого азота.

Для эритроцитов и тромбоцитов крови человека используют способы консервирования (Чечеткин и др., 2005) при температурах от -20°С до -80°С в электрорефрижераторах под защитой криоконсервантов. В зависимости от используемой температуры срок хранения клеток составляет от 1 года до 5 лет. Применение электрических холодильников позволяет отказаться от громоздкого, дорогостоящего оборудования и не зависит от периодического восполнения запасов азота, кратковременные колебания в них температур не являются фатально губительными для клеточного материала. Все это имеет важное значение в практической деятельности криобанков. Возможность сохранности ядросодержащих клеток при температурах выше -196°С

остается малоизученной, что связано с быстрым истощением энергетических запасов и накоплением продуктов метаболизма.

Для повышения криоустойчивости биообъекта используют криопротекторы и стабилизирующие добавки. Действие первых основано на способности создавать прочные связи с молекулами воды (вне и внутри клетки, более прочные, чем связи воды между собой) и на способности снижать концентрацию солей, что делает минимальным риск повреждения белковых структур клеток, а также образовывать связи со структурными компонентами мембраны, предохраняя их от разрушения кристаллами льда. Всего в мире обнаружено и создано более 120 криофилактических средств с экзоцеллюлярным, эндоцеллюлярным и смешанным криозащитным действием. Однако выраженными криопротекторными свойствами обладают: глицерин, ДМСО (диметилсульфоксид), ДМАЦ (диметилацетамид), 1,2-ПД (пропандиол), ПЭ0400 (полиэтиленоксид), которые имеют определенную токсичность и требуют отмывания после размораживания биообъекта, что дополнительно травмирует клетки. С 2003 г Минздравом РФ разрешено использование высокоочищенного ДМСО для криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток периферической крови и костного мозга. Производство криоконсервантов в России осуществляется главным образом в лабораторных условиях с использованием зарубежных протекторов.

В последние годы положительно зарекомендовало себя применение комбинированных криозащитных растворов, состав которых по причине видоспецифичности биологического объекта весьма вариабелен: классические экзо- и эндоцеллюлярные протекторы (Корниенко, Бондаренко, 2008; Сведенцов, 2010); обладающие протекторным действием антифризные протеины, гликопротеины (Андреев и др., 2008) и клатратные соединения инертных газов (Тельпухов, Щербаков, 2006; Sheleg et al., 2008); антиоксиданты и стабилизаторы биологических мембран, усиливающие устойчивость клеток к эндо- и экзогенным факторам физико-химического воздействия (Dalvit et al., 1988; Carrol J. et al., 1993), активаторы

энергетического метаболизма клеток - гетерозиды (Кабачный, Горбунова, 2004); стабилизаторы температур замораживания и отогрева - наночастицы ферромагнетика (Сукач и др., 2008).

Однако, несмотря на достигнутые успехи, продолжается поиск универсального для различных клеток и тканей криопротектора. Актуальным остается разработка эффективных технологий длительного хранения биообъектов в нетоксичных криоконсервантах при широком диапазоне отрицательных температур.

Цель исследования - определить сохранность функций лейкоцитов при температурах от -10°С до -80°С с применением комбинированных криоконсервантов.

Задачи исследования:

1. Разработать комбинации криозащитных растворов, содержащие криопротекторы с различной проникающей способностью и реставрирующие компоненты, не требующие отмывания после отогрева биообъекта.

2. Сравнить влияние комбинированных криозащитных растворов на степень устойчивости лейкоцитов к воздействию отрицательных температур: переохлаждения (-10°С), субумеренно-низкой (-20°С), умеренно-низкой (~40°С), низкой (-80°С).

3. Установить возможные сроки структурно-функциональной сохранности лейкоцитов в условиях указанных отрицательных температур под защитой разработанных криозащитных растворов.

4. Определить влияние эффективных криозащитных растворов на характер перекисных процессов в мембранах лейкоцитов на разных этапах криоконсервирования и при варьировании сроков хранения.

5. Изучить физико-химические и биологические особенности (токсичность, пирогенность) эффективных криозащитных растворов и определить переносимость лабораторными животными внутривенных аутогемотрансфузий криоконсервированных с данными растворами лейкоцитов.

6. Разработать способы электрорефрижераторного криоконсерви-рования лейкоцитов крови в нетоксичных ограждающих растворах при температурах от -10°С до -80°С.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Комбинирование в замораживаемой биосреде непроникающих и проникающих криопротекторов, антиоксидантных и противогипоксантных компонентов обеспечивает высокую криоустойчивость лейкоцитов периферической крови при замораживании - отогреве и позволяет снизить токсичность ограждающего раствора.

2. Предложенные комбинированные криоконсерванты не вызывают активацию перекисного окисления липидов в мембранах лейкоцитов и обеспечивают сохранность морфофункциональных параметров у более 75% клеток по разным тестам при -10°С в течение 9 суток (патент РФ № 2261595, 2005), при -20°С - 21 суток (патент РФ № 2240000, 2004), при -30°С - 30 суток (патент РФ №2184449, 2002) и при -80°С в течение 180 суток (срок наблюдения; патент РФ № 2290808, 2007).

3. Комбинированные криозащитные растворы нетоксичны, апирогенны и хорошо переносятся лабораторными животными в смеси с размороженными аутологичными лейкоцитными концентратами.

4. Способы электрорефрижераторного криоконсервирования лейкоцитов крови при температурах от -10°С до -80°С являются эффективными, доступными для широкого использования и рекомендуются в качестве альтернативы замораживанию биообъектов в жидком азоте.

Научная новизна. В лабораторно-экспериментальном исследовании на примере лейкоцитов крови человека показана эффективность комбинирования в замораживаемой клеточной среде непроникающих и проникающих криопротекторов, реставрирующих компонентов, что обеспечивает сохранность биологического объекта при температурах от -10°С до -80°С и позволяет снизить токсичность ограждающего раствора, что доказано в опытах на экспериментальных животных.

Предложено охлаждение лейкоцитов до —10°С по нелинейной программе в незамерзающем криоконсерванте, содержащем проникающий протектор глицерин (в исходной концентрации 7%), непроникающий протектор желатин со средним молекулярным весом 16 кДа (7,5%) и антигипоксант-антиоксидант ОМЭПС (0,3%), что обеспечивает криоустойчивость более 75% лейкоцитов по разным тестам в течение 9 суток хранения.

Криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ обеспечивает указанную сохранность лейкоцитов в широком диапазоне температур: при -20°С в исходной концентрации 28% совместно с ОМЭПС (0,2%) в течение 21 суток; при -40°С в концентрации 30% совместно с антигипоксантом фумаратом натрия (2,8%) и лимонной кислотой (0,06%) в течение 30 суток; при -80°С в концентрации 22% совместно с проникающим протектором ДМСО (8%) и ОМЭПС (0,4 %) в течение 180 суток (срок наблюдения). На основании полученных данных, а также имеющихся сведений об эффективности применения указанного криопротектора при ультранизком замораживании тромбоцитов и клеток костного мозга сформулирована концепция об универсальном криозащитном действии данного вещества.

Найден новый вид непроникающих криопротекторов - растительные полисахариды, которые наряду с иммуномодулирующими свойствами способны оказывать криозащитный эффект за счет своих функциональных групп и не обладают токсичностью. Впервые показана перспективность использования лемнана пектинового полисахарида ряски малойАктуальным остается в составе комбинированной криозащитной среды для -10°С. Установлено, что криоконсервант, содержащий глицерин (в исходной концентрации 7%), лемнан со средним молекулярным весом 400 кДа (0,3%) и ОМЭПС (0,3%) обеспечивает сохранность исходных морфофункциональных параметров у лейкоцитов в течение 1 суток.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые сведения о возможности хранения ядросодержащих клеток не только в

условиях ультранизкой (-196°С) температуры, но и при температурах от -10°С до -80°С, что является ценным для трансфузиологии, ветеринарной медицины, микробиологии, ихтиологии.

Результаты проведенных исследований вносят вклад в создание общей теории криоповреждения и криозащиты клеток, т.к. указывают на то, что в используемых нетоксичных комбинациях консервантов каждый протектор проявляет защитное свойство при определенных температурных условиях, что в итоге позволяет устранить несколько причин криоповреждения клеток с сохранением аддитивной криопротекторной эффективности выбранной комбинации ингредиентов.

Показана эффективность применения электрорефрижераторной технологии консервирования биообъектов при температурах от — 10°С до -80°С в нетоксичных комбинированных консервантах, которая отличается от традиционной с использованием жидкого азота простотой выполнения и не требует дорогостоящего оборудования. С практической точки зрения важным является использование электрических морозильников и щадящих нелинейных программ замораживания, предупреждающих выброс кристаллизационного тепла и последующую рекристаллизацию, вызывающую гибель клеток. Особую значимость представляют предложенные криозащитные растворы (патенты РФ: № 2184449, 2002; № 2240000, 2004; № 2261595, 2005; № 2290808, № 2301524, 2007; № 2439877, 2012), которые не уступают по своей эффективности существующим консервантам, но при этом являются нетоксичными и не требуют отмывания клеток перед применением, что увеличивает число жизнеспособных лейкоцитов и снижает экономические затраты. Предложенные технологии криоконсервирования ядросодержащих клеток периферической крови являются доступными широкому кругу учреждений и могут быть использованы при создании запаса клеток для его одномоментного использования при ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций вследствие техногенных причин, природных явлений, террористических

актов и вооруженных конфликтов, частота появления которых увеличивается в последние годы, а также для сохранения биоматериала во время космических перелетов, в длительных научных экспедициях.

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГБОУ ВПО «Вятский государственный гуманитарный университет» и ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия» Минздрава России.

Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены на Международных конференциях: «Сохранение генетических ресурсов» (С.-Петербург, 2004), «Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия» (Пущино, 2008), «Фундаментальные и прикладные аспекты физиологии» (Гродно, 2009); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2010); на XVIII и XIX Съездах Всероссийского физиологического общества им И.П.Павлова (Казань, 2001; Екатеринбург, 2004); на Всероссийских научно-практических конференциях «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (С.Петербург, 2002, 2007); на Всероссийских совещаниях «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Киров, 2008, 2012); на научной сессии Кировского филиала РАЕ и Кировского областного отделения РАЕН (Киров, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 59 научных работ, в том числе 1 монография, 6 патентов Российской Федерации, 4 статьи в зарубежных, 10 статей в Российских рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 200 машинописных страницах, содержит 34 таблицы и 31 рисунок. Список

литературы включает 342 источник, в том числе 124 статьи зарубежных авторов.

Работа выполнена в лаборатории криофизиологии крови Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН в рамках плановых тем НИР «Функциональная активность ядросодержащих клеток крови, перенесших холодовой анабиоз разной глубины» (ГР № 01.200 107400) и «Закономерности восстановления функциональной активности ядросодержащих клеток крови, подвергнутых воздействию отрицательных температур» (ГР № 0120.0 602860). Частично работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (№08-0401423).

Глава I СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ВЛИЯНИИ ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУР НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КЛЕТОК (обзор литературы)

1.1 Факторы криоповреиздения и криозащиты клеток. Гипотезы, теории, концепции

При охлаждении клеток от 0°С до -196°С многообразие проявлений криоповреждений зависит от неблагоприятного воздействия комплекса факторов, среди которых существенное значение имеют образование кристаллов экзо- и эндоцеллюлярного льда, избыточная дегидратация и фазовые превращения биополимеров и надмолекулярных структур, гиперконцентрация солей и ионной силы раствора, изменение величины рН и зарядовых характеристик мембран.

Большинством авторов (Иткин Ю.А., Бронштейн В.Л., Гордиенко Е.А. и др., 1983; Белоус A.M. и др., 1987, 1988, 1994; Smith A.U., 1961, 1963) принято, что основные повреждения клетки получают при фазовом переходе воды в лед, что связано с образованием кристаллов льда вне и внутри замораживаемых клеток. При непосредственном наблюдении процесса замораживания клеток под микроскопом установлено (Пушкарь Н.С. и др., 1975, 1976, 1977; Diller K.R. et al., 1975; Mazur P., 1984), что образование внеклеточного льда опережает образование льда внутри клеток.

Молекулы воды вследствие электростатического притяжения их полярных участков стремятся к образованию льдоподобных агрегатов (Гулевский А.К., Релина Л.И., 2010). По мере снижения температуры и замедления теплового движения молекул воды тенденция к агрегации усиливается, а вероятность возникновения критически большого кластера молекул быстро увеличивается. В результате гомогенной нуклеации (спонтанной агрегации молекул воды) формируется зародыш кристалла льда

13

большого размера. Критический размер кластера при -5°С - около 45000 молекул воды, а при -40° - лишь 70 (Valí G., 1995). При наличии в воде нуклеаторов льда или льдонуклеирующих агентов (чужеродных частиц и примесей) происходит гетерогенная нуклеация (как правило, в диапазоне от -2°С до -15°С), которая зависит от химической природы и концентрации вещества в замерзающей системе. Фазовый переход воды (внеклеточной и внутриклеточной) из жидкого в твердое состояние при замораживании биообъектов происходит в широкой температурной зоне — от температуры начала кристаллизации до полного отвердевания образца в зоне эвтектических температур (Merymen Н.Т., 1974).

Степень и скорость повреждения клеток предопределяется целым рядом условий, среди которых наиболее важную роль играет скорость охлаждения биообъекта (Леонтович В.А., Абезгауз H.H., Перфильев В.Я. и др., 1973; Леонтович В.А., Абезгауз H.H., Трошина В.М, 1975; Леонтович В.А., Трошина В.М., Новичков В.Т. и др., 1975; Махатадзе И.К., Каличава Л.Х, Мгебришвили H.H. и др., 1975).

Так, при ускоренном прохождении биообъектом зоны фазовых превращений (Mazur Р., 1963, 1984) снижается уровень дегидратации и время нахождения клеток в дегидратированном состоянии. При этом, наблюдается образование множества мелких кристаллов льда (Медведев П.М. и др., 1972) и сокращается время действия гиперконцентрированных растворов солей (Ре Луи, 1962; Цуцаева A.A., 1983; Pushkar N.S., Itkin Yu.A., Bronshtein V.L. et al., 1976), однако при больших скоростях замораживания биообъекта возрастает частота образования внутриклеточных кристаллов льда (Shimada К., Asahia Е., 1975) и повреждений, вызванных его воздействием. Кроме того, сохранность быстро замороженных клеточных суспензий сильно снижается при медленном отогреве, который сопровождается рекристаллизацией (то есть укрупнением) внеклеточного льда (Morris G.J., 1981), нарушением физиологических концентраций растворов солей вне и внутри клеток,

способствующих вакуолизации, обводнению и осмотическому лизису клеток (Merymen Н.Т., 1974).

При медленном охлаждении клеток идут зарождение, формирование и рост внеклеточных кристаллов льда, жидкое содержимое клетки достаточно сильно концентрируется за счет вымораживания свободной воды (Mazur Р., 1970; Pushkar N.S., Itkin Yu.A., Bronshtein V.L. et al., 1976). При этом, клетки могут захватываться растущими кристаллами льда и повреждаться при их механическом сдавливании (Симонова Л.И., 1969; Лозина-Лозинский Л.К., 1972; Иткин Ю.А., 1972, 1983; Пушкарь Н.С. и др., 1975, 1976, 1977, 1981; Ишков Г.С., 1986; Кулешова Л.Г. и др., 1988; Luyet B.J. et al., 1960, 1970; Rapatz G. и Luyet B.J., 1971, 1975; Diller K.R. et al., 1975), a также подвергаться неблагоприятному воздействию концентрированных растворов солей (Пушкарь Н.С., Белоус A.M., 1975, 1981; Белоус A.M. и др., 1985, 1987; Кулешова Л.Г., Розанов Л.Ф., 1988; Боброва Е.Н., Зинченко А.В., 2002; Polge С., Lovelock J.E., 1952; Lovelock J.E., 1953; Smith A.U., 1953; Rey L., 1959; Smith A.U., 1961, 1963). Показано (Бондаренко B.A., Лемешко B.B., Белоус A.M., 1975), что в липидной части биомембраны в условиях медленного замораживания активируются цепные перекисные процессы, что вызывает потерю холестерина и нарушение функций митохондрий.

В процессе эволюции клетка унаследовала от первичной жизнеспособной структуры способность обратимо снижать содержание воды, что способствует сохранению структуры клетки и ее функций (Привалов П.Л., 1968; Алексеев A.M., 1969, 1971; Лозина-Лозинский Л.К., 1972; Самыгин Г.А., 1974; Mazur Р., 1960; Farrant J., 1965, 1977; Karrow A.M. et al., 1965; Levitt J., 1966, 1967; Meryman H.T., 1966, 1970; Rapatz G., Luyet В., 1971; Burke M.J. et al., 1974; Williams W.P., 1985; Bernard A.G. et al.,1990). При замораживании дегидратация может стать как причиной повреждения в результате гипертонического стресса, так и способом предотвращения внутриклеточного кристаллообразования (Meryman Н.Т., 1971).

Изменения осмотического давления внеклеточной среды, вызываемые процедурой криоконсервирования, отражаются на содержании внутриклеточной воды в клетках, величине клеточного объема и степени деформации мембранных структур (Белоус A.M., Гордиенко Е. А., Розанов Л.Ф, 1987; Бондаренко В. А., Бондаренко Т. П., Руденко С. В., 1992). При замораживании биообъекта с криопротекторомом клетки могут погибнуть от гипертонического стресса (Mazur Р., 1965; Meryman Н.Т., 1971), на этапе удаления - в результате постгипертонического стресса (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994). Поэтому определение коэффициентов проницаемости клеток для криопротекторов и воды является необходимым условием прогнозирования осмотического поведения клеток в процессе криоконсервирования.

Мишенью приложения факторов криоповреждения клетки в зоне фазовых превращений преимущественно является плазматическая мембрана (Белоус A.M., Луговой В.И., Гулевский А.К., 1975; Lyons J.M., 1972; Farrant J., Morris G.J., 1973). Развитие этой концепции привело к гипотезе, согласно которой дегидратация является фактором, управляющим состоянием мембранного цитоскелета, а охлаждение индуцирует в нём дополнительные напряжения, способные привести к нарушению мембранной проницаемости (Бондаренко В.А., 1988; Диллер K.P., 1990; Поздняков В.В.и др., 1990; Розанов Л.В., 1995; Бондаренко В.А., Пакулова O.K., Жуйкова А.Е., 2008).

Форму и объем клеток, а также состояние поверхности мембраны, регулирует белковый цитоскелет, который играет важную роль в сохранении важнейших физиологических процессов: реализацию генетической программы развития и роста, динамику структурной интеграции метаболизма, пространственное расположение молекулярных и субклеточных компонентов клетки, цитокинез, динамику хромосом и биотрансформацию энергии АТФ в клетке (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994). А поскольку развитие температурного шока (Осташко В.Ф., Осташко Ф.И., 2004; Lyons J.M., 1972; Farrant J., Morris G.J., 1973) тесно связано с

модификацией белков цитоскелета, то, прежде всего, имеют значение те ионы, которые влияют на структурно-функциональное состояние биополимеров (Na+, Са2+, К+, Mg2+, Н+). Если нарушается соотношение указанных выше катионов внутри клетки, то это приводит к изменению структуры и функции белков цитоскелета, стабилизирующих ее структуру.

Изменение рН в щелочную сторону (с максимумом до 8,0) сопровождается увеличением микровязкости внутриклеточных белков. Механизмы, при помощи которых рН оказывает влияние на компоненты мембран и белки цитозоля при замораживании клеток, остаются до конца неясными.

Различают несколько типов мембранных белков, которые могут по-разному повреждаться при охлаждении, замораживании и отогреве: белки, погруженные в липидный бислой будут с большей вероятностью сохранять свои специфические свойства, чем белки, гидрофильная часть которых направлена во внешнюю среду, где она будет подвергаться действию «эффекта растворов» и кристаллов льда. Отмечено, что при охлаждении лимфоцитов в мембранах наблюдается «вымораживание» белков из одного монослоя липидов в другой перпендикулярно плоскости мембраны. Белковые агрегаты, «выдавленные» в наружный монослой, наиболее подвержены действию высокой осмотической активности среды, рН и дегидратации (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994).

Весьма чувствительным к величине рН, которая может изменяться в жидких микро-фазах ледяных канальцев при замораживании, является липидный бислой мембран (Пушкарь Н.С., Белоус A.M., 1975). Это связано с тем, что протонирование головок липидов играет важную роль в их упаковке и фазовых переходах. Например, в смешанных фосфолипидных везикулах фазовый переход при рН 7,4 происходит при 0°С, а при рН 2,5-при 26°С, т. е. в случае сильного протонирования карбоксильных группировок липидов они разделяются по фазам и затвердевают. При криоконсервации биообъектов часто используют различные буферные

растворы, которые могут влиять на величину рН в жидких микроканальцах по мере концентрирования замороженного раствора (Mazur Р., 1970). Чем сильнее деформируется клеточная мембрана под влиянием рН и тоничности среды, тем больше создается условий для открепления от мембраны и элиминации цитоскелетных и других внутриклеточных белков из клеток. Инкубация клеток при кислых значениях рН (4,0-5,0) может приводить к формированию поперечных сшивок мембранных белков в результате окисления их SH-групп и уменьшению «микровязкости» внутриклеточных белков.

Степень нарушения структурно-фазового состояния липидов отличается при разных температурах (Белоус A.M., Бондаренко В.А., 1982). Так, при снижении температуры окружающей среды от +37°С до 0°С фазовым переходам в первую очередь подвергаются анулярные липиды. Наблюдается латеральное разделение липидов в мембранах с высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот и низким содержанием холестерина. Чем меньше холестерина, тем при более высокой температуре происходит кристаллизация липидов (Левин C.B., 1976). В результате ослабевания гидрофобных взаимосвязей в мембране, угнетаются функции ферментов, нарушаются проницаемость мембраны, транспорт ионов и биомолекул, что приводит к нарушению синтеза веществ и энергопродукции и соответственно к гибели клетки. С другой стороны, к такому результату приводит и развивающаяся гипоксия, которая способствует изменению рН, накоплению недоокисленных продуктов, падению уровня макроэргов,

9 4-

накоплению Са в гиалоплазме, в результате чего активируются мембранные фосфолипазы, нарушается проницаемость мембраны для ионов, разобщаются процессы дыхания и окислительного фосфорилирования. Следствием гипоксии является также активация ПОЛ, которая приводит к повышению проницаемости мембран лизосом, выходу в цитоплазму лизосомальных гидролаз и повреждению систем синтеза белков и нуклеиновых кислот.

При дальнейшем снижении температуры (0° ч- -30°С) в следствие кристаллизации водной фазы (первичная кристаллизация) гибель клетки может быть вызвана: механоэлектрическими эффектами образующихся кристаллов; гиперконцентрацией ионов и метаболитов в жидкой фазе микроканальцев - изменяются рН и ионные силы среды, свойства воды жидкой фазы как растворителя; дегидратацией клетки - ее осмотическое сжатие, структурно-биохимическая модификация субмембранного ретикулума, деформация мембраны, кренирование клетки. Кроме того, в данном температурном диапазоне наблюдаются фазовые переходы основной массы мембранных липидов, латеральное разделение которых приводит к образованию структурных дефектов, нарушению проницаемости мембраны и перераспределению ионов и биомолекул, элиминации лизосомальных гидролаз в цитоплазму клетки и повреждению систем синтеза белков, нуклеиновых кислот и биоэнергетики. Фазовые переходы основной массы мембранных липидов вызывают также конформационные превращения и изменения активности ферментов, блокирование клеточных и гормональных механизмов регуляции метаболизма; образование различных по стабильности белок-липидных и липид-липидных комплексов в плоскости мембраны, пространственное сближение субстратов и активаторов ПОЛ, агрегацию поверхностных рецепторов и трансмембранных белков. Результатом описанных событий является гибель клетки.

В настоящее время известны следующие теории (гипотезы, концепции) криоповреждения клеток.

Механическая гипотеза. Впервые о механической гипотезе повреждения цитоплазматических мембран и межклеточных контактов растущими кристаллами льда упоминается в работах Н.А. Максимова (1913), в дальнейшем она рассматривается рядом исследователей (Иткин Ю.А. и др., 1983; Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994). Т. (1962) и С. Ьшепа (1965) считали, что плазматические мембраны клеток проявляют устойчивость только к медленно растущим кристаллам льда и сильно повреждаются в

случае взрывного роста кристаллов внутри клетки, что приводит к механическому разрыву мембраны.

Эти явления проявляются и при рекристаллизации (укрупнении кристаллов льда при отогреве).

Рекристаллизационная гипотеза. При изучении механизмов морозоустойчивости растительных и животных клеток показано (Asachina Е., 1966), что некоторые клетки могут выживать при возникновении внутриклеточного льда при условии формирования мелкозернистых кристаллов, не способных к росту. Если, при этом, отогрев клеток проводить очень быстро, то они полностью сохраняют свои биологические свойства (Цуцаева А.А. и др., 1981). Н. Moor (1964) полагает, что внутриклеточные кристаллы льда, размер которых не превышает 0,01 мкм, безвредны для клеток. В литературе (Лозина-Лозинский Л.К., 1963; Rapatz G., Sherman J., 1964; Asahina E. et al., 1970) имеются ссылки на то, что образование льда внутри форменных элементов не всегда вызывает грубые морфологические изменения и не ухудшает функциональные свойства при пересадке клеток. Многие авторы считают, что повреждение клеточных структур в основном происходит не в процессе замерзания воды, а во время отогревания и рекристаллизации, когда наблюдается укрупнение кристаллов льда. Избежать это возможно при высокой скорости отогревания, тогда под влиянием роста кристаллов льда структура плазматических мембран не успевает разрушиться и удаётся избежать дополнительной дегидратации клеток и связанных с ней повреждений (Пушкарь Н.С. и др., 1975, 1976, 1977; Лозина-Лозинский Л.К. и др., 1972, 1986; Asahina Е.М., 1966, 1970; Meryman Н.Т., 1970; Sakai А., 1971; Rail W.F. et al., 1980). Рекристаллизационная гипотеза криоповреждений имеет место также при гибели криоконсервированных клеток при проведении технологических операций в низкотемпературном банке, вызывающих колебания температуры хранения биологических объектов (Высеканцев И.П. и др., 2005). При этом,

количество погибших клеток увеличивается с повышением температуры и увеличением количества циклов ее колебания.

Концепция гиперконцентрированных растворов. Повреждающее действие может оказывать и концентрация солей, возникающая при вымораживании чистой воды в лед (Lovelock J.E., 1953). Согласно этой концепции разрушение замораживаемого биообъекта происходит за счет воздействия гиперконцентрированных растворов электролитов на структуру плазматической мембраны клеток: нарушаются водородные, ионные и гидрофобные связи между компонентами мембран, в результате чего мембраны теряют часть фосфолипидов и холестерин. Изменяется поток ионов и метаболитов, осмотическая устойчивость мембран клеток резко снижается, и они могут лизировать. Гипотеза, выдвинутая J. Е. Lovelock (1953), претерпела ряд модификаций (Doebbler D., 1966; Mazur P., 1966; Nei T., 1968; Meryman H., 1971).

Двухфакторная концепция. P. Mazur (1970) выдвинул и математически смоделировал двухфакторную концепцию криоповреждений клеток, в которой отметил, что гибель клеток происходит в результате роста внеклеточного льда и действия «эффектов раствора», а также большую роль играет быстрая скорость замораживания биообъекта, когда переохлажденные клетки не успевают дегидратировать и повреждаются в основном внутриклеточными кристаллами льда. Экспериментальные данные, полученные для тканевой культуры почки китайского хомячка (Mazur P. et al., 1969, 1972), эритроцитов (Rapatz G. et al., 1968; Miller R.H. et al., 1976; Nei N., 1976) и миелокариоцитов (Leibo S.P., 1980) укладываются в рамки этой гипотезы.

Получены данные, о том, что определяющим криоповреждение фактором служит объём потерянной клеткой воды (Привалов П.Л., 1968; Farrant J., 1965; Karrow A.M. et al., 1965; Meryman H.T., 1968, 1970; Burke M.J. et al., 1974).

Концепция минимального объема клетки. Согласно Н.Т. Мегушап (1971), обезвоживание клеток сопровождается уменьшением их объема и развитием механического напряжения на мембране. Н.Т. Мегушап выдвинул концепцию "минимального объема клетки", при достижении которого процесс дегидратации приостанавливается и дальнейшее увеличение осмотичности среды способствует потере барьерных свойств плазматической мембраны, а затем разрушению клетки. В основе лежит способность плазматической мембраны сжиматься до определенного уровня, после которого она начинает испытывать сопротивление внутриклеточного содержимого. В результате максимального сжатия на мембране возникает градиент гидростатического давления, который приводит к ее разрыву. Однако это не было подтверждено последующим биофизическим моделированием (Фуллер Б., Грин К., Грищенко В.И., 2003). Известно, что повреждение плазматической мембраны при охлаждении носит более сложный характер, связанный с развитием перекисного окисления липидов, их фазового разделения в плоскости мембраны, нарушением структурно-функционального состояния белков цитоскелета. Гипотеза минимального объема аналогична гипотезе J. Е. Lovelock (1953) и предполагает необходимость наличия криопротектора как внутри, так и вне клеток для эффективной криозащиты.

Сульфгидрилъная теория. Некоторые положения концепции минимального объема были дополнены сульфгидрильной теорией криоповреждений биообъектов (Levitt J., 1966; Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994), согласно которой в результате пространственного сближения микромалекул и взаимодействия реакционно способных группировок формируются ковалентные дисульфидные связи в белках типа S-S-сшивок, которые устраняют функцию активных SH-групп ферментов и тем самым нарушают биологические свойства белков мембран и цитозоля. Подобное утверждают A.B. Зинченко и др. (2004), указывая, что даже при успешном криоконсервировании и получении стеклообразного состояния материала,

замороженный биологический объект будет подвергаться

термомеханическим напряжениям.

Мембранная концепция. Выявление механизмов криоповреждений клеток позволило сформулировать (Белоус А. М., Грищеко В.И. 1994) мембранную концепцию криоповреждений. Показано, что основным механизмом повреждения мембраны в условиях охлаждения, замораживания и отогрева являются фазовые превращения липидов и белков, приводящие к нарушению барьерных свойств мембраны и утечке из цитоплазмы ионов и биомолекул через трансмембранные дефекты (ТМД). Формирование и судьба ТМД зависят от условий и способов замораживания, а также структурного состояния белков цитоскелета, которые контролируют прочность ассоциативных связей в мембране, поддерживая тем самым нативную форму и объем клеток. Существует температурная зависимость криоповреждения мембран, которая характеризуется различной степенью нарушения гидрофобных свойств плазматических мембран, что приводит к нарушению барьерных параметров мембраны при неадекватных режимах криоконсервации, аномальному перераспределению ионов по обе стороны мембраны и потере свойств белкового цитоскелета, поддерживающего структуру мембраны (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994). При этом, теряются упруго эластические свойства мембраны, возникают ТМД и клетка может разрушиться. В данной концепции главным является формирование ТМД в плазматической мембране, эволюция которых зависит от степени модификации белкового цитоскелета и липидного бислоя мембраны.

Потеря клетками цитохрома С с последующим снижением биоэнергетических реакций - основной механизм криоповреждения ядерных клеток костного мозга и крови (Обозная Э.И., Маркова О.П., 1976), дрожжей (Mori Y., Suzuki Н., Nei Т., 1986), гепатоцитов крыс (Petrenko A.Yu, Subbota N.P., 1986). Выход из повреждённых митохондрий цитохрома С, взаимодействующего с цитозольным белком Apaf-1, обеспечивает переход каспазы 3 (остаток аспарагиновой кислоты) в каталитически активную форму

(Губский Ю.И., 2001), что является одним из пусковых механизмов процесса апоптоза. На клетках яичника китайского хомячка показано (Pritchard D.E. et al., 2000), что проникающая способность митохондрий играет важную роль в регуляции освобождения митохондриального цитохрома С. Это может быть наиболее существенным моментом на пути апоптоза, который приводит клетки к смерти.

Концепция резонансной гидродинамической волны. Помимо повреждений клеток при температурном шоке, вызываемых осмотическими процессами, В.Ф. Осташко и Ф.И. Осташко (2004) указывают в своей работе на разрушительную силу удара резонансной гидродинамической волны, которая появляется в результате внезапных изменений скорости движения в закрытую полость клетки потока воды и его внезапной остановки напряженной до критического (резонансного) уровня цитоплазматической мембраной, утратившей свойство упругой деформации.

Наряду с указанными концепциями криоповреждений клеток большое внимание в криобиологии и криомедицине уделяется концепциям криообновления (программам реабилитации и перевода клетки на более высокий уровень гомеостаза).

Цитохром С, несомненно, играет ведущую роль в механизме криообновления путём непосредственного включения его во внешнюю и внутреннюю митохондриальные мембраны и взаимодействия с ними (Грищенко В.И., Алексеевская Э.И., 2005). Роль цитохрома С в механизме криообновления обусловлена действием низких температур, которые: регулируют гены, под контролем которых находятся цитохром С и НАД.Н, участвующий в его транспортной функции через наружную митохондриальную мембрану (Storey К.В., 1998); увеличивают концентрацию цитохромов (Мохова С.Н., Жигачёва И.В., 1977); усиливают митохондриогенез; лабилизируют клеточные мембраны (Обозная Э.И. и др., 1981); повышают проницаемость гематоэнцефалического барьера (Бабийчук

Г.А., Марченко B.C., Пастухов Ю.Ф. и др., 1995), облегчая тем самым прохождение молекулы цитохрома С, являющегося индуктором пиноцитоза (Серавин Л.Н., 1968), через эти барьеры; изменяют структуру митохондрий, что обеспечивает наиболее благоприятное взаимодействие с ними цитохрома С (Loncar D., Bedrica L., Mayer J. et al., 1986). Способность цитохрома С встраиваться в митохондриальные мембраны и снижать процессы ПОЛ является одним из механизмов его лечебного действия (Слепнёва Л.В, Манойлов Ю.С., Криворучко Л.И., 1974; Мхитарян Л.М., 1987; Кривцова И.М., Алексеева H.H., 1990; Новиков B.C., 1990).

Одним из общих свойств клеток всех типов живых организмов является то, что в ответ на снижение температуры они включают синтез специфического набора белков, которые помогают клетке выжить в условиях температурного стресса и вернуться после его прекращения к нормальной жизни (Северин Е.С., 2003; Siegenthaler R.K., Christen P., 2005). Установлено, что недостаток кислорода, повышение концентрации тяжелых металлов и этанола (Miller D., 1989), а также низкие температуры (Lee R. Е., 1990) могут индуцировать синтез этих белков. Показана также активация апопотоза после криоконсервирования (Borderie V., Lopez М., Lombet A. et al., 1998). В частности, через 6-18 ч после оттаивания в культивированных фибробластах человека (Baust J., Van Buskirk R., Baust G., 2000) увеличивалась транскрипция вовлеченных в апоптоз ферментов (каспаз), что предполагает возможность участия апоптоза в уничтожении сублетально поврежденных клеток.

В настоящее время большой интерес вызывает изучение белков, индуцируемых теплом (белков теплового шока - БТШ) (Pennell С.А., 2005; Srivastava Р.К., 2005) или холодом (белки холодового шока - БХШ) (Гулевский А.К., Релина Л.И., 2003).

Считают, что молекулярные шапероны обеспечивают ренатурацию белков после стрессового воздействия и убиквитин-зависимый протеолиз белков, не подлежащих ренатурации. Две группы белков, с молекулярной

массой 70 и 90 кДа (БТШ-70 и БТШ-90) являются одними из самых консервативных белков в природе (Lindguist S., 1986). Экзогенный БТШ-70 обладает защитными и антисептическими свойствами (Слащева Г.А., Мурашев А.Н., 2010). БТШ-70 блокирует агрегацию денатурированных белков, связываясь с гидрофобными областями, которые становятся доступными при денатурации, и ускоряет АТФ-зависимую ренатурацию белков. Во время нормальных физиологических процессов молекулярные шапероны принимают участие в транспортировке белков сквозь мембраны, особенно сквозь мембраны эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и митохондрий, помогают полипептидам сворачиваться и облегчают сборку белковых комплексов (Miller D., 1989).

Представители семейства белков холодового шока (БХШ) обнаружены у многих эубактерий. Полагают, что белки действуют, как РНК-шапероны, препятствуя сворачиванию РНК во вторичную структуру (Wouters J.A., Rombouts F.M., Kuipers O.P. et al., 2000). Они участвуют в различных клеточных процессах, включая адаптацию к низким температурам, рост клеток, стационарную фазу и др. В БХШ открыт домен -домен холодового шока, который обнаруживает удивительно высокую гомологию и сходные РНК-связывающие свойства со все более многочисленным рядом эукариотических белков, способных связывать нуклеиновые кислоты, что указывает на древнее происхождение этих белков (Graumann P.L., Marahiel M.А., 1998).

В настоящее время выделено три класса белков, контролирующих процессы нуклеации и рекристаллизации (Гулевский А.К., Релина Л.И., 2009): белки-нуклеары - индуцируют кристаллизацию, являясь матрицей формирования льда, и препятствуют переохлаждению (обнаружены у бактерий, насекомых, лягушек и черепах); антинуклеирующие белки -ингибируют формирование зародышевых кристаллов льда при гетерогенной нуклеации (обнаружены у бактерий); антифризные белки (АФП; новый термин - белки, структурирующие лед) снижают температуру замерзания,

модифицируют или останавливают рост кристаллов льда, ингибируют рекристаллизацию и защищают клеточные мембраны от повреждений. Антифризные протеины (АФП) найдены у позвоночных, беспозвоночных, у растений, бактерий и грибов (Barrett J., 2001).

АФП по степени активности делятся на три группы: очень слабые - их основная функция ингибирование рекриталлизации, вследствие их чрезвычайно слабой термогистерезисной активности (представители - белок паслена горько-сладкого, белок многолетнего плевела); умеренно-активные -блокируют рост кристаллов за пределами базальных поверхностей (Scotter A.J., Marshall C.B., 2006); к ним относится большинство известных антифризных пектинов и гликопротеидов рыб (Аванов A.JL, 1990), бактерий; гиперактивные - предотвращают рост кристаллов льда на базальной поверхности (белок плазмы крови камбалы массой 16,7 кДа).

Накопленные сведения (Гулевский А.К., Релина Л.И., 2009) пока не позволяют сформировать гипотезу о едином механизме действия антифризных пектинов и гликопротеидов. Можно перечислить лишь те признаки, по которым эти вещества были выделены в отдельную группу. Биологические антифризы понижают температуру замерзания неколлигативно, т.е. функция зависимости снижения температуры замерзания их растворов от их концентрации не прямая, а подобна гиперболе с плато в области высоких концентраций АФП, что свидетельствует об эффективности насыщения. При этом АФП понижают температуру замерзания растворов в несколько сотен раз эффективнее, чем другие макромолекулы сопоставимых размеров. Понижая температуру замерзания антифризы практически не влияют на температуру плавления, в результате равновесие между твердой и жидкой фазами антифризных систем отсутствует. Молекулы АПФ не концентрируются в жидкой фазе при замерзании растворов, они равномерно распределяются между твердой и жидкой фазами, молекулы АПФ адсорбируются на поверхности

зародышевых кристаллов льда в виде монослоя и блокируют дальнейший рост кристалла.

Накопленный за последние 10 лет опыт, свидетельствует о том (Гулевский А.К., Релина Л.И., 2009), что эффект АФП на жизнеспособность клеток и термодинамических свойств среди растворов во время низкотемпературного консервирования сложен и противоречив. АФП могут проявлять и защитное и цитотоксическое действие в зависимости от протокола хранения, дозы и типа АФП, состава консервирующей среды, типа биоматериала (Wang J.H., Bian H.W., Zhang Y.X et al., 2001). При достижении интенсивности взаимодействий комплексов АФП-лед -с клеточными мембранами и другими молекулярными комплексами определенного уровня, указанные комплексы могут агрегировать, теряя способность ингибировать рекристаллизацию (Wang J.H., 2000). Наряду с природными АФП создаются их синтетические аналоги, например, АФП камбалы (Chakrabartii A., Yang D.S., Hew C.L., 1989), которые применяют для исследования механизмов действия биологических антифризов. Предпринята попытка использования АФП при хранении сердца при -1,3°С (Amir G., Horowitz L., Rubinsky В. et al., 2004), при этом в присутствии АФП орган не замерзал и имел лучшие показатели деятельности (скорость сокращения, коронарный ток и давление). В настоящее время изучение биологических антифризов продолжается.

1.2 Криопротекторы и криоконсерванты

Криопротекторы - вещества, обладающие способностью предупреждать развитие криоповреждений биологических объектов и обеспечивать их сохранность в жизнеспособном состоянии после замораживания. К таким веществам относятся (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994) различные классы соединений: спирты, оксиды, аминоксилоты, амиды кислот, углеводы, белки, полимерные соединения. Коллигативные криопротекторы природного происхождения представляют собой

низкомолекулярные соединения, содержащие гидроксильные группы. К ним относятся, например, полигидрооксиспирты (глицерин, инозитол, сорбитол, маннитол, рибитол и др.), сахара (глюкоза, фруктоза, арабиноза, манноза, трегалоза и др.) и другие (Каранова М.В., 2003).

Несмотря на то, что криопротекторы являются предметом исследований на мировом уровне более 50 лет, механизмы их действия и взаимодействия с различными биологическими структурами окончательно не выяснены (Нардид O.A., 2009). Выделяют следующие механизмы: подавление возрастания концентрации солей в растворах (Moiseyev V.A., Nardid O.A., Belous A.M., 1982), снижение повреждения клеток и клеточных мембран при дегидратации (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994), уменьшение количества кристаллов образовавшегося льда внутри клетки (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994) и другие (Бауст Дж.Г., Бауст Дж.М., Шнайдер К. и др., 2008).

Криопротекторы, по предложению J. Е. Lovelock (1954), разделяются на экзоцеллюлярные (непроникающие в клетку) и эндоцеллюлярные (способные проникать в клетку). Позднее Н.С. Пушкарь (1978) предложил еще хладоограждающие растворы смешанного типа.

К проникающим в клетку относятся: гицерин, диметилсульфоксид -ДМСО (Пушкарь Н.С., Шраго М.Н., Белоус A.M., Калугин Ю.В.., 1978; Makino М., Baba М. А, 1997), диметилацетамид - ДМАЦ (Трошина В.М., Абезгауз H.H., Леонтович В.А., 1977), 1,2-пропандиол - 1,2-ПД.

Непроникающие криопротекторы: поливинилпирролидон - ПВП (Лаврик С.С., Когут Г.И., Афанасьева Е.Ю., 1971), полиэтиленоксид - ПЭО-1500 и с более высокой молекулярной массой (Лобынцева Г.С., Щербак Г.М., Полякова А.И., 1974).

К криопротекторам смешанного действия относятся ПЭО-400 (Пушкарь Н.С., Шраго М.Н., Белоус A.M., Калугин Ю.В., 1978; Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994), ГМБТОЭМ (Сведенцов Е.П., 1995 - 2005), которые

обезвоживают клетки, обволакивают их мембраны и могут в небольшом количестве проникать в клетки.

Защитное действие внутриклеточных криофилактиков выражается в том, что, обладая низкой молекулярной массой, эти вещества легко проникают в клетку, связывают воду, способствуют переохлаждению клеток, изменяют кристаллообразование, стимулируя образование преимущественно мелких кристаллов льда при замораживании. Кроме того, являясь хорошими растворителями, они снижают концентрацию солей внутри и вне клеток, этим самым, предохраняя их от обезвоживания и уменьшая повреждение белковых структур клеток (Цуцаева A.A., 1983; Белоус A.M., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф., 1987). Также эти вещества образуют связи со структурными компонентами мембраны клеток, что ведет к снижению степени ее повреждения при замораживании (Виноград - Финкель Ф.Р., Киселев А.Е., 1970; Смольянинова Е.И., Липник Т.Н., Гордиенко О.И., 2004; Pushkar N.S., Itkin Yu.A., Bronshtein V.L. et al., 1976).

Механизм действия экзоцеллюлярных криопротекторов основан на их способности образовывать прочные связи с внеклеточной водой, вызывать дегидротацию клеток, замедлять скорость образования кристаллов и изменять их структуру, взаимодействовать с клеточной мембраной, следствием чего является повышение ее устойчивости к повреждающему действию кристаллов (Цуцаева A.A., 1983; Pushkar N.S., Itkin Yu.A., Bronshtein V.L. et al., 1976). Однако применение непроникающих криопротекторов связано с трудностями выбора условий эквилибрации: температуры, скорости введения криопротектора, его концентрации и др. (Mazur P., Cole K.W., 1989; Dutheil D., Underhaung G., Petit-Paris I. et al., 2009).

Всего в мире обнаружено и создано более 120 криофилактических соединений, однако выраженными криопротекторными свойствами обладаю всего 6: глицерин, ДМСО, ДМАЦ, 1.2-ПД, вещество А-378 или ГМБТОЭМ и ПЭО-400. Слабее указанные свойства у ПВП. Самые слабые у многоатомных

спиртов, Сахаров, гидроксиэтилкрахмала, сывороточных белков и других органических соединений. К сожалению, у всех названных выше криопротекторов выявлено свойство оказывать токсическое действие на клетки. Так, например, ЛД50 при внутривенном введении ГМБТОЭМ для мышей составляет 15,5±0,6 г/кг массы тела животного (м.т.) (Сведенцов Е.П. и др., 1987; 1999). 1,2-ПД ЛД50 для мышей - 15-18 г/кг м.т. (Гучок В.М. и др., 1984, 1987). Летальная доза ПВП для мышей при внутривенном введении 25% раствора препарата составляет от 12 до 15 г/кг м.т. (Михайлов В.Г., 1975, 1979; Пушкарь Н.С. и др., 1978, 1981). ЛД50 глицерина составляет 4,57±0,14 к/кг м.т. (Andersen К.С. et al., 1950), ЛД50 ДМСО - 3,8±0Д г/кг м.т. (Ashwood-Smith M.G., 1961), для ПЭО-400 ЛД50=12,5 г/кг м.т. (Пушкарь Н.С. и др., 1978), для ДМАЦ ЛД50=4,2 г/кг м.т. (Цуцаева A.A. и др., 1983).

В настоящее время к криопротекторам предъявляют следующие требования (Сведенцов Е.П., 2010): эффективный криозащитный эффект; хорошо растворяться в воде и стабилизировать ее молекулы; способствовать образованию мелких кристаллов льда и стеклованию вне- и внутриклеточной воды; участвовать в процессах метаболизма; должен быть нетоксичным (не требующим отмывания от размороженного биообъекта); не накапливаться в организме и быстро выводится из него; не разрушать клеточные мембраны и органеллы; не приводить к развитию побочных эффектов при гемотрансфузиях и др.

Ниже приведена краткая характеристика наиболее часто применяемых криопротекторов.

Глицерин - многоатомный спирт с молекулярной массой 92,1. СзН8Оз. Чаще всего для замораживания используют 15% раствор. К положительным эффектам глицерина относят (Пушкарь Н.С. и др., 1978; Луговой В.И. и др., 1981) его способность уменьшать размер кристалла льда, так как способность глицерина сжиматься при замерзании способствует тому, что превращение воды в лед не сопровождается увеличением его объема. При этом идет образование мелкокристаллического льда с переходом в стеклование.

Защитные свойства глицерина связаны также с его способностью поддерживать переохлажденное состояние клетки, поскольку его молекулы образуют стабильные водородные связи с водой. При обычных температурах (22-37°С) глицерин легко проникает в клетки и защищает мембрану и внутриклеточные структуры, действуя как противосолевой буфер. Кроме того, глицерин уравнивает осмотическое давление по обе стороны мембраны, то есть предупреждает развитие осмотических градиентов на мембране. А также он формирует комплексы с солями и металлами и с активными центрами ферментов, вызывая временную блокаду функциональной активности ряда ферментных систем в клетке. Образует гидратную и частично из молекул глицерина защитную оболочку вокруг молекул белков, что предотвращает их коагуляцию.

Однако при действии глицерина на ядросодержащие клетки было замечено набухание митохондрий, отрыв внутренних мембран и их частичный лизис, а иногда появление «вуали» и сглаживание структуры ядра (Терентьева Э.И. и др., 1966). Существует мнение, что глицерин не обеспечивает полноценной криозащиты лейкоцитов, вызывает их необратимую агрегацию и лизис, требует применения отмывающих растворов (Утемов C.B. и др., 1995). В связи с токсичностью глицерина, для его удаления из клеток используют разнообразные методы: диализ, отмывание гипертоническими растворами глюкозы, хлорида натрия и цитрата, непрерывное отмывание и центрифугирование, разведение или осаждение декстраном, агломерацию с неэлектролитами или дисагрегацию в солевых растворах. В процессе отмывания глицерина в клетках возникают дополнительные повреждения, которые устраняют с помощью различных реабилитационных средств.

В настоящее время глицерин широко используется в качестве моноэндоцеллюлярного криоконсерванта для эритроцитов при -196°С (Чечеткин A.B. и др., 2005), в диапазоне от -60°С до -80°С (Виноград-Финкель Ф.Р., Гинзбург Ф.Г., Федорова Л.И. и др., 1973), от -25°С до -38°С

(Мельникова В.Н., Замалетдинова Т.В., Кирьянова Г.Ю., 1995), а также для консервирования клеток косного мозга при -70°С (Федотенков А.Г., 1967).

Диметилсулъфоксид (ДМСО). Соединение относится к классу оксидов, молекулярная масса которого 78,13. СгН680. Представляет собой бесцветную, прозрачную жидкость с неприятным специфическим запахом и горьковатым вкусом, разлагается на открытом воздухе и при автоклавировании. ДМСО хорошо проникающий в клетки, реорганизует структуру образующегося льда - происходит мелкоячеистая кристаллизация, близкая по своей природе к аморфной (Абезгауз Н. Н., Леонтович В.А., 1966; Франке Ф., 1985; Пичугин Ю.И., 1993; Takahashi Т., Hirsh А., 1985; Tsvetkov Т. et al., 1986; Makino М., Baba М., 1997). Силы взаимодействия между молекулами ДМСО и воды в 1,5 раза больше, чем между молекулами воды (Пушкарь Н.С. и др., 1978). Однако, при исследовании фазовых переходов и стеклования в бинарных водных растворах ДМСО и в клеточных суспензиях эритроцитов кордовой крови с добавками ДМСО установлено (Зинченко A.B., Боброва E.H., Щетинский М.И., 2003), что в системах, содержащих ДМСО, в отличие от систем с криопротекторами из ряда полиолов наблюдается кристаллизация эвтектических составов. Это явление, наряду с девитрификацией, может представлять собой дополнительный криоповреждающий фактор. ДМСО обладает высокой способностью вступать в реакции с солями и оксидами фосфата, серы, формировать связи с глицерином, сахарозой, мочевиной, стеариновой кислотой и другими органическими соединениями. Известны противоишемическое и антиоксидантное свойства ДМСО (Чуйко В.А., 1989). Однако ДМСО является токсичным (Klein Е. et al., 1967) и обуславливает необходимость его удаления после размораживания, что существенно усложняет процедуру получения качественных деконсервированных клеток и приводит к потере части клеток в процессе отмывания. В РФ ДМСО под названием «Димексид» разрешен до 2003 г только для наружного применения (Машковский М.Д., 2002). Для консервирования тромбоцитов при -196°С ДМСО применяется в

концентрации 5-11% (Djurassi J., Roy A., Kim J., Cavins J., 1971), при этом, сохранность клеток составляет 30-80%. Однако при переливании размороженных тромбоцитов у 33% реципиентов наблюдались озноб и лихорадка, а само переливание сопровождалось резким запахом ДМСО (Фефелова И.В., Мхеидзе Д.М., Селидовкин Р.Д. и др., 1991). Для консервирования лейкоцитов при -196°С ДМСО применяется в концентрации 6-15%, при этом, лимфоциты переносили замораживание удовлетворительно (Rowe A., Cohen Е., 1965), а в мембранах гранулоцитов наблюдались сильные нарушения (Crowley J.R., Rene A., Valéry R.C., 1974). Применяется ДМСО и для криоконсервирования ядросодержащих клеток кордовой крови (Laroche V., McKenna D., Moroff G. et al., 2005). Например (Бабийчук Л.А., Кудокоцева О.В., Зубов П.М., Зубова О.Л., 2008), применение 4-х этапной программы замораживания и ДМСО в конечной концентрации 3,5% (приготовленного на растворе полиглюкин) способствует сохранности до 95% жизнеспособных клеток.

Диметилацетамид (ДМАЦ) относится к классу амидов, молекулярная масса 87. C4H9NO. В отличие от глицерина и ДМСО и ряда других криопротекторов, способность которых образовывать водородные связи (в частности с водой) связана с атомом кислорода, в молекуле ДМАЦ водородным акцептором является атом азота. При сравнении эффективности 3-х криофилактиков проникающего действия - глицерина, ДМСО и ДМАЦ оказалось, что последний обеспечивает лучшую морфофункциональную полноценность размороженных гранулоцитов. Например (Трошина В.М. и др., 1977, 1981; Аграненко В.А. и др., 1982, 1986), при консервировании лейкоцитов с криозащитным раствором «лейкокриодмац» (содержащим 6,7% ДМАЦ в конечной концентрации) через 2 года хранения при (—196°С) сохранность лейкоцитов составляет 78%. Кроме того, ДМАЦ химически стоек, менее токсичен и лишен свойственного ДМСО неприятного запаха. Применяется ДМАЦ в конечной концентрации 3% для криоконсервирования (-196°С) костного мозга (Тюрин Р.В., 1996).

Пропиленгликоль (1,2-ПД). Эндоцеллюлярный криопротектор с м.м. 76. СзН802. Впервые описан в 1987 г (Воротилин A.M., 1987). Являясь двухатомным спиртом, легко проникает в клетки и за счет своих функциональных групп (-ОН; СН3+-) связывает фракции свободной и связанной воды, тем самым снижает эвтектическую температуру замерзания и способствует формированию мелкозернистых кристаллов льда. Кроме того, он связывает и соли, защищая мембраны от гиперосмотического шока. Обнаружен в мозге крыс, мышечной ткани кролика. В организме подвергается распаду до лактата. Обладает слабым антиоксидантным и антибактериальным свойствами. Используется (Вильянинов В.Н., 1997; Чечеткин A.B. и др., 2005) для консервирование эритроцитов при -80°С и -140°С в конечной концентрации 18,5%-й раствор ПД в смеси с 5%-м ДМАЦ; или в концентрации 7% при криоконсервировании репродуктивных клеток животных (Белоус A.M., Грищенко В. И., 1994). Применяется также как основа гидрофобных мазей, растворитель лекарственных средств.

Тексометшенбистетрагидроксиэтилмочееина (ГБТОЭМ или вещество А-378) - криопротектор смешанного действия (Сведенцов Е.П., 1987, 2010). Молекулярная масса 378. (HOCH2CH2)2NCONH(CH2)6 NHCON(CH2 СН2ОН)2 Представляет собой мелкокристаллическое вещество белого цвета без запаха, горьковато-сладковатого вкуса, хорошо растворимое в воде, а при нагревании - в метаноле, этаноле, хлороформе, четыреххлористом углероде. Температура плавления +89° -ь +91°С. Водные растворы ГМБТОЭМ (10-40%) прозрачны, имеют рН=7,8-7,9. Обладает выраженным хладоограждающим действием, образует прочные связи с внеклеточной водой, замедляет скорость образования кристаллов и изменяет их структуру. Точка эвтектики 15-25% водных растворов составляет -8,1°. Взаимодействует с мембраной клеток, следствием чего является повышение ее устойчивости к повреждающему действию кристаллов, тем самым, проявляя экзоцеллюлярное воздействие. Так же он оказывает и эндоцеллюлярное воздействие: проникает в клетку, связывает воду,

способствует образованию преимущественно мелких кристаллов льда при замораживании, снижает концентрацию солей внутри и вне клеток, предохраняя их от чрезмерного обезвоживания и уменьшая повреждение белковых структур клеток, образует связи со структурными компонентами мембраны клеток, что ведет к снижению степени ее повреждения при замораживании. Впервые вещество синтезировано в 1974 году в Казанском химико-технологическом институте (В.П. Архиреев и соавт.) и после открытия у него криопротекторных свойств в 1982 году новым способом в бидистиллированной воде. На основе данного протектора разработаны эффективные мало токсичные консервирующие растворы, позволяющие сохранять в жизнеспособном состоянии ядросодержащие клетки костного мозга при -196°С в криоконсерванте «гекмолит» (Svedentsov Е.Р., Archireyev V.P., Simkin D.S et al., 1997), тромбоцитов при -196°C в растворе «кримолит» (Селезнева О.М., 1996), при -80°С - в «кримолит-М» (Кузнецов К.В., 2006) в течение 12 мес (срок наблюдения), при -40°С - в «кримолит-Ф» (Яленский А.Ю., 2007) 4 мес, а также лейкоцитов при -80°С в растворе ГМБТОЭМ с конечной концентрацией 15% (Утемов C.B., 2005) в течение 12 мес (срок наблюдения).

Полиэтиленоксид (ПЭО) - искусственное полимерное соединение с молекулярным весом от 400 до 15000. Н0СН2-(СН2-СН2-0-)п-СН2-0Н. Криозащитный эффект ПЭО заключается в его способности стабилизировать молекулы воды, кроме того, он может способствовать сохранению структуры биополимеров мембран в процессе замораживания - оттаивания, а также изменять характер кристаллизации водного раствора с образованием аморфного льда (Полякова А.И. и др., 1975; Пушкарь Н.С. и др., 1978). В отличие от ранее применявшихся криофилактиков, ПЭО - это биологически инертное вещество, не требующее отмывания. В настоящее время (Бабийчук JT.A. и др., 2008) разработан эффективный безотмывочный метод криоконсервирования (-196°С) ядросодержащих клеток кордовой крови, в том числе и гемопоэтических, с использованием 30% раствора ПЭО-1500,

приготовленном на физиологическом растворе. Данный метод обеспечивает высокую сохранность и жизнеспособность (в том числе по ДНК красителю 7ААБ) после криоконсервирования популяции лимфоцитов, моноцитов, а также гемопоэтических (СБ34+) клеток. Низкомолекулярные ПЭГ и ПЭО с молекулярной массой 300-600 и их производные применяются в качестве синтетической основы для мазей, таблеток, солюбилизаторов и стабилизаторов суспензий и эмульсий.

Поливинилпирролидон (ПВП) - относится к классу искусственных полимеров. Растворы ПВП обладают высокими адсорбционными свойствами к воде и различным веществам, способностью комплексообразования по отношению к лекарственным препаратам, токсинам, красителям и солям. Поэтому ПВП в составе с различными препаратами, особенно антибиотиками и гормонами, способствует их пролонгированному действию в организме. В медицинской практике препараты ПВП используют в качестве плазмозаменителя (Черненко Г.Т., 1999). Механизм криозащитного действия ПВП связан с его коллигативными свойствами и способностью влиять на структуру воды, в результате чего формируется аморфный лед. Растворы ПВП в довольно низкой концентрации в большей степени, чем другие криопротекторы - полиэтиленгликоль (ПЭГ), ДМСО, сахароза тормозят формирование кристаллов льда в системе вплоть до -20°С. Опыты показали, что в качестве криопротектора эффективнее всего применять водный раствор ПВП с м.м. 12600 (Лаврик С.С., 1966). Однако по данным рассеяния света в растворах ПВП, даже при очень низких концентрациях полимера существует агрегация, что затрудняет определение его точной молекулярной массы (Франке Ф., 1985). В настоящее время ПВП используется для криоконсервирования (от -80°С до -196°С) ГСК кордовой крови (Перехрестенко П.М. и др., 1998), замороженная взвесь гемопоэтических стволовых клеток в 17% (исходная концентрация) низкомолекулярном ПВП может храниться при -196°С в течение 10 лет без снижения жизнеспособности.

Гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) - соединение, получаемое в результате оксиэтилирования водорастворимой фракции крахмала, представляет собой полидисперсную систему, охватывающую довольно широкий диапазон фракций с молекулярной массой 250—500 кД. Растворы ГЭК так же, как и ПВП и ПЭО, формируют водородные связи с водой и стабилизируют ее решетку. При этом, структурированность воды изменяется, и в процессе замораживания повышается способность ее молекул формировать аморфные кристаллы льда. Растворы ГЭК также оказывают стабилизирующее влияние на плазматическую мембрану клеток, однако механизм этого взаимодействия остается неисследованным. ГЭК считается биологически инертным препаратом, поэтому его используют в качестве плазмозаменителя или разделителя форменных элементов крови. В РФ используется как трансфузионная среда (6% и 10% растворы с ММ 200000). В качестве криопротектора ГЭК используется в 6% конечной концентрации совместно с 5% ДМСО для консервирования эритроцитов и ядерных клеток кордовой крови при -196°С (Stiff P.J., Murgo J.A., Zarolus C.G., 1987). ГЭК не токсичен, поэтому не требует отмывания после отогрева биообъекта. Вопрос о криопротекторных свойствах ГЭК окончательно не решен, так как результаты криоконсервирования клеток под защитой этого полимера весьма противоречивы. Необходимо дальнейшее изучение его криопротекторных свойств.

В настоящее время перспективным направлением является (Корниенко Е.М., Бондаренко В.А., 2008) применения комбинированных хладоограждающих растворов, состав которых по причине видоспецифичности биологического материала вариабелен: экзо- и эндоцеллюлярные протекторы, а также антиоксиданты и стабилизаторы биологических мембран (витамин Е, глутатион восстановленный, сывороточный альбумин и др.), усиливающим устойчивость клетки к эндо- и экзогенным факторам физико-химического воздействия (Dalvit G.C., Cetica P.D., Beconi M.T., 1988; Carrol J., Wood M.J., Whittinham D.G., 1993). В

состав консервантов часто вводят сахара: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, рафинозу и их комбинации. Сахара являются соединениями, регулирующими осмотические и метаболические процессы в клетках, способствуя тем самым более эффективной репарации нарушенных структур клеток крови в цикле замораживания - отогрева. Кроме того, в раствор для замораживания вводится какой - либо антикоагулянт (например, ЭДТА Na2, цитрат натрия и др.), так как при хранении in vitro клетки приобретают способность образовывать необратимые агломераты. В состав консервантов часто вводят предшественников нуклеиновых кислот (инозин, аденин) в комбинации с фосфатами и глюкозой, которые служат веществами, также способствующими активации восстановительных процессов, присутствуют такие вещества, как антиоксид анты и антигипоксанты.

Для сохранности и восстановления активности энергопродуцирующих ферментов (сукцинат-, малат-, лактатдегидрогеназа) в условиях криоконсервирования клеток (+4°С; сперматозоиды быка) в состав консервирующих сред рекомендованы (Кабачный В.И., Горбунова Н.И., 2004) добавки - гетерозиды (К321 или 7-метил-Ы-малеогетерозид; К322 - N-малеогетерозид), которые обладают криопротекторным действием и являются активаторами энергетического метаболизма клетки.

Показана целесообразность использования в качестве дополнительных компонентов криозащитных составов веществ биологического происхождения. В частности, А.А.Андреев и др. (2008) предлагают использовать для замораживания биообъектов наряду с классическими криопротекторами антифризные протеины и гликопротеины из крови полярных рыб, а также липиды замораживаемого организма. Последние, кроме того, что активно влияют на форму и размеры микрочастиц льда, могут также участвовать в репарации поврежденных при замораживании - отогреве клеточных мембран.

Новым направлением в криобиологии является комбинирование криопротекторов и наночастиц ферромагнетика (ФМ) - Fe304. Например

(Сукач А.Н., Грищук В.П., Грищенко В.И., 2008), показано, что в присутствии частиц ФМ (50-100 нм) повышается температура кристаллизации сахарозной среды, содержащей 10% ДМСО на 1,7°С в сравнении со средой без ФМ, т.е частицы ФМ становятся центрами нуклеации, вследствие чего снижается степень переохлаждения растворов. Кроме того, связывание наночастиц ФМ с клеточной мембраной и внутриклеточными структурами способствует повышению чувствительности к магнитным и электрическим полям. В следствии способности нагреваться под влиянием электромагнитного излучения присутствие наночастиц ФМ в клеточных суспензиях открывает перспективу разработки не только контролируемых методов замораживания, но и отогрева.

Малоизученным до настоящего времени является применение клатратных соединений азота, кислорода, аргона, криптона, ксенона, а также некоторых клатратов смешанного типа в качестве газовых клатратных криопротекторов. Эффективность замораживания (-196°С) биологических объектов (сперматозоиды, кровь, сердце крысы) в барокамере-капсуле при давлении и в тяжелых инертных газах была показана в исследованиях П.В Щербакова и В.И. Тельпухова (2006). Подтверждено защитное действие клатратного ксенона при криоконсервировании (-196°С) кардиомиоцитов мышей (8Ье1е§ Б. ег. а!., 2008).

1.3 Методы оценки функционального состояния клеток, подвергнутых криовоздействию

Для определения степени сохранения жизнеспособности клеток после замораживания - отогрева используют биохимические, морфологические, физико-химические и физиологические методы оценки. Все методы оценки структурно - функционального состояния клеток условно можно разделить на две категории: во-первых, это экспресс-методы, позволяющие оценить состояние биообъекта после замораживания - отогрева (микроскопические методы с использованием суправитальных красителей); во-вторых, методы,

позволяющие оценивать специфические структурные и функциональные изменения в биообъекте с помощью более тонкого биохимического, физиологического, биофизического и электронно - микроскопического тестирования биообъектов (Белоус, Грищенко, 1994).

Одним из наиболее часто применяемых методов оценки состояния клеток после замораживания — оттаивания является исследование проницаемости плазматической мембраны для различных веществ, в том числе красителей. Для этого используют чаще всего красители типа трипанового синего или эозина (лейкоциты с поврежденной мембраной окрашиваются в розово-красный цвет), а также люминесцирующие красители (акридиновый оранжевый, тетрациклин). В последние годы для выявления повреждений мембран клеток применяют флуоресцентные зонды (Добрецов Г.Е., 1989). Например, флуоресцентный краситель К8-3010 окрашивает цитоплазму и внутриклеточные органеллы поврежденных клеток в ярко-зеленый цвет (Буряк И.А., 2007). 3-гидрокси-4-(1Ч,Ы-диметиламино)флавон (Линник Т.П. и др., 2007) при электронном возбуждении (внутримолекулярный фотоперенос протона) образует изомеры: N-форму (зелено-голубая полоса эмиссии) и Т-форму (желтая полоса), положение и интенсивность полос зависят от способности образовывать межмолекулярные водородные связи, от полярности и вязкости микроокружения.

Одним из наиболее адекватных методов оценки проницаемости плазматических мембран клеток для молекул воды и криопротекторов является метод волюмометрии (Коваленко Г.В. и др., 2009). В сочетании с физико-математическим моделированием процессов трансмембранного переноса этот метод позволяет определить значения коэффициентов проницаемости мембран индивидуальных клеток для молекул воды и криопротектора путем сопоставления экспериментальных зависимостей объема клетки от времени с адекватным решением теоретической модели для условий конкретного опыта. В качестве исходных параметров теоретическая

модель включает, в частности, поверхностно-объемное отношение клетки и ее относительный осмотически неактивный объем (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994), который определяет долю внутриклеточных веществ, неспособных покинуть клетку без повреждения мембраны: нуклеиновые кислоты, белки, связанная вода, мембранные структуры, структурные элементы цитоскелета.

К морфологическим тестам относится изучение лейкограмм. Исследования ученых (Пушкарь Н. С. и др., 1978; Утемов C.B., 1999; Сведенцов Е.П. и др., 2004; Grant С.К., 1976; Taylor M.J., Bank H.L., 1988; Vingerhoets J., 1995; Lund P.K, 2000) показали, что наиболее чувствительными к замораживанию и оттаиванию являются гранулоциты, а наиболее устойчивыми оказались лимфоциты и моноциты.

Изменение ультраструктуры клеток устанавливают при использовании электронно-микроскопических методов (Терентьева Э.И. и соавт., 1978; Livesey S.A. et al., 1989): например, исследование изменений субмикроскопического строения гранулоцитов человека при их хранении как в обычной глюкозоцитратной плазме, так и в специальном растворе. Ультратонкие срезы готовили стеклянным ножом на ультрамикротоме. Изучение срезов производили в электронном микроскопе УВМ-100 при ускорении 75 кв. уже через сутки хранения лейкоцитов в глюкозоцитратной плазме крови наряду с интактными клетками в некоторых из них обнаруживали заметное изменение ультраструктур цитоплазмы. Наблюдали образование значительного количества полостей, лакун и цистерн, свидетельствующих о значительном развитии эндоплазматической сети. Также был заметен активный пиноцитоз клеток, на что указывало наличие большого числа вакуолей. В отдельных клетках в этот срок хранения находили изменения в строении специальных гранул - отслоение содержимого гранул, расплывание их пограничной мембраны, лизис гранул. Показано (Аграненко В.А., Файнштейн Ф.Э., Ермолович С.С. и др., 1982),

что у оттаянных лейкоцитов наблюдается уменьшение размера клетки, увеличение базофилии и вакуолизация цитоплазмы, уплотнение ядра и др.

К функциональным тестам относится изучение фагоцитарной активности.

Например, В.А. Алмазова и С.И. Рябова (Алексеев H.A., 2002) для реакции фагоцитоза использовали 18-24 часовую агаровую культуру золотистого стафилококка. После 30 мин инкубации стафилококка при +37°С с лейкоцитами готовили мазки и определяли фагоцитарную активность, фагоцитарный индекс - среднее количество стафилококков, захваченных одной клеткой и количество клеток, находящихся в стадии аттракции. Аналогичные исследования проводили с нативными и криоконсервированными ядросодержащими клетками лейкоконцентрата кордовой крови человека (Гольцев А.Н. и др., 2010). В окрашенных азур-эозином мазках определяли количество фагоцитирующих и нефагоцитирующих клеток среди 200 подсчитанных. Определяли число клеток в стадии аттракции и поглощения, фагоцитарное число (количество фагоцитированных микроорганизмов одним фагоцитом).

По методике С.Г. Потаповой и др. (1977) функциональную активность исследуемых нейтрофилов оценивают по поглотительной способности клеток с использованием инертных частиц латекса. Для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) определяют процент фагоцитировавших клеток, а по количеству захваченных частиц латекса клеткой - фагоцитарный индекс.

Известен также метод оценки состояния деконсервированных клеток - реакция бласттрансформации - культивирование in vitro в присутствии неспецифического стимулятора - фитогемагглютинина (ФГА) (например, по методике Гольдман И.Л. и Брауде Н.И., 1966). Этим способом оценивается функциональное состояние лимфоидных клеток крови. Так, установлено (Абезгауз H.H., Леонтович В. А., 1966) при изучении способности лимфоцитов пролиферировать в культуре тканей, что способность

трансформироваться в этих условиях достаточно хорошо сохраняли молодые формы лимфоцитов даже после замораживания. Прежде всего, к 24 часам культивирования появлялись лимфоциты больших размеров с рыхлой структурой хроматина и нуклеолами, при нарастании сроков культивирования (48 ч) число таких клеток увеличивалось, и появлялись клетки в 2-3 раза превышающие нормальные лимфоциты с крупным рыхлым ядром, нуклеолами и нежно-голубой цитоплазмой. Они напоминали бластные клетки. К 72 ч число трансформированных клеток уменьшалось, а нормальных лимфоцитов - увеличивалось.

К биофизическим методам определения жизнеспособности клеток и тканей можно отнести следующие: криомикроскопия, рентгенография, вискозиметрия, термография, электрометрия и другие. Ценность этих методик заключается в том, что ряд из них позволяет исследовать состояние биообъекта при отрицательных температурах, без его отогрева, не нарушая целостности клеток.

Частота диэлектрической релаксации молекул воды является параметром, характеризующим подвижность молекул в СВЧ поле, и, следовательно, степень их взаимодействия с окружением. Структурные нарушения и конформационные изменения компонентов крови влекут за собой отличия в соотношении свободная-связанная вода в системе и сопровождаются изменением диэлектрических параметров, которые можно обнаружить методом СВЧ-диэлектрометрии в диапазоне частот, соответствующих области дисперсии молекул воды (Горобченко О.П. и др., 2004; Нардид Э.О., Горобченко O.A., Николов О.Т., 2005). Это позволяет использовать значение диэлектрической проницаемости биологических объектов как физический критерий при оценке структурных нарушений макромолекул и клеток, вызванных различными факторами (Batyuk L.V., Gatash S.V., Gorobchenko O.A., Nikolov O.T, 2002).

Метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) являются двумя

взаимодополняющими методами, которые применяются в криобиологии для исследования насыщения тканей криопротектором (КП), количественного определения концентраций и времени, позволяющих описать процесс проникновения КП в ткань. Указанные методы используются для определения температур стеклования, величин скачка теплопоглощения при стекловании, а также температур фазовых переходов (Боброва E.H., Зинченко A.B., Щетинский М.И., 2005).

В качестве показателей сохранения структурно-функциональной полноценности митохондрий деконсервированных клеток можно использовать такие критерии жизнеспособности, как дыхание и окислительное фосфорилирование. Для изучения дыхательной и фосфорилирующей активности лимфоцитов применяется полярографический метод (Коваленко Е.А., Березовский В.А., Эпштейн И.М., 1975). Регистрация кинетики потребления кислорода лимфоцитами проводится на полярографе с применением закрытого электрода типа Кларка.

Для выявления специфических криоповреждений мембран клеток исследуют активность мембраносвязанных маркерных ферментов, таковыми могут быть холинэстераза либо Na+-K+ - АТФ, принизывающая липидный бислой. Например, появление в супернатанте повышенного количества К+ может свидетельствовать о нарушениях регуляции таких важных функций в клетке, как синтез белков, ДНК и РНК, в биоэнергетике клетки и работе транспортных АТФаз. Эти методы в сочетании с суправитальной окраской могут оказаться весьма информативным диагностическим приемом при оценке состояния деконсервированных клеток и указывать на глубину и топографию клеточных криоповреждений (Арзуманян В.Г., Ожован Н.М., 2002).

Криоповреждения внутриклеточных структур можно определять с помощью гистологических, гистохимических и электронно-микроскопических методов.

В.И. Луговой с соавторами (1981) предлагают энзиматическую диагностику криоповреждений клеток лейкоконцентрата.

К функциональным тестам относится цитохимическое выявление катионных белков в гранулах нейтрофилов (Славинский A.A., Никитина Г.В., 1999). Данные белки обеспечивают кислороднезависимую микробицидность клеток (Пигаревский В.Е., 1978). Для их выявления зафиксированные в парах неразбавленного нейтрального забуференного формалина мазки крови окрашивают 0,2% раствором амидо черного 10Б в боратном буфере. Гранулы катионных белков окрашиваются в синий цвет. По формуле Астальди-Верга вычисляется средний цитохимический коэффициент (СЦК).

Для выявления уровня сохранения функции генетической системы клеток, биосинтеза специфических белков и нуклеиновых кислот применяют соответствующие меченые предшественники и по уровню их включения судят о нарушениях в обмене белков, нуклеиновых кислот либо других биополимеров в размороженной клетке в динамике. Достаточно информативным является авторадиографический метод специфического мечения тех или иных структур в клетках, срезах, тканях с помощью 3Н -предшественников, позволяющих проявить треки с помощью фоточувствительной эмульсии (Hayhoe F.G., Quaglino D., 1980). Путем микроскопического подсчета числа треков судят о функциональной активности ДНК, РНК или белков.

Количество популяций, субпопуляций лимфоцитов, моноцитов и предшественников зрелых клеточных типов в консервированных клеточных суспензиях определяют с помощью моноклональных антител в флюоресцентном тесте (Гольцев А.Н. и др., 2010).

Гранулоциты и моноциты являются мощными генераторами активных форм кислорода (АФК). Одним из инструментов изучения АФК, определения степени генерации супероксидного анион-радикала (Babior В.М. et al., 1973), является реакция восстановления нитросинего тетразолия - HCT - тест, который отражает, прежде всего, функцию гексозомонофосфатного шунта

(ГМФШ) и связанную с ним наработку свободных радикалов. Данный тест не только позволяет выявить фагоцитирующие нейтрофилы, но может характеризовать и состояние их ферментных систем, использоваться для дифференциального диагноза бактериальных и вирусных инфекций, а так же для оценки резервной функции системы фагоцитоза. Принцип метода состоит в том, что в активированных нейтрофилах HCT восстанавливается посредством супероксидного анион-радикала в диформазан, который в виде грубодисперсных темно-синих гранул откладывается в клетках, по концентрации которого и судят об АФК (Маянский А.Н., Маянский Д.Н. 1989; Попов C.B., 1999; Герасимов И.Г., Калуцкая O.A., 2000; Герасимов И.Г., Игнатов Д.Ю., 2001; Clark R.A., 1983, 1990, 1999; Dang P.M. et al., 1999).

Клетки животных и растений обладаю собственным слабым свечением - митогенетическими лучами (Гурвич А.Г., 1934). На основе этого в настоящее время разработаны методы биохемилюминесценции, позволяющие регистрировать слабое излучение клеток, возникающее, в первую очередь, в связи с образованием активных форм кислорода (Журавлев А.И., Журавлева А.И., 1975; Владимиров Ю.А., 1999). Данный метод применяется для анализа функциональной активности как нейтрофилов (Галеева K.P., 2000), так и фагоцитов (Митерева Д.Е., Агафонов В.Е., 2004).

Экспериментальные исследования подвижности нейтрофилов ведутся с середины XIX века (Адо А.Д., 1961). В 1962 году S. Boyden описал метод количественной оценки подвижности лейкоцитов, который получил широкое применение в экспериментальных и клинических исследованиях (Boyden S., 1962). Суть метода состоит в миграции лейкоцитов через поры мембранного фильтра с диаметром: для нейтрофилов - 3 мкм, для эозинофилов 5 мкм, для макрофагов 8 мкм из верхнего отсева камеры в нижний. В 1975 году был описан метод исследования подвижности под агарозой (Nelson R.D., Quie P.G., Simmons R.L., 1975), а в 1988 году - визуальный метод или метод изучения подвижности на стеклах (Haston W.S., Wilkinson P.S., 1988).

Прогресс в этой области исследования связан с разработкой методов регистрации разнообразных параметров движения. В целом методы исследования подвижности лейкоцитов позволяют оценивать среднюю подвижность по всей популяции, неоднородность двигательной активности клеток внутри популяции, регистрировать поведение индивидуальных клеток с целью изучения механизмов движения и минимизируют время, затраченное на исследование (Галкин A.A., Тимин E.H., Карелин A.A., 2003).

Для оценки физиологического состояния лейкоцитов крови человека, клеток иммунокомпетентных тканей (костного мозга, селезенки, тимуса, лимфатических узлов), лимфоцитов на высоте иммунной реакции, сперматоцитов и др. определяется также количество ореолообразующих клеток, которые по причине высокого отрицательного заряда отталкивают эритроциты от своей поверхности (Кичигин А.И., 1988; Терещенко И.П. и др., 1984).

Существуют и другие методы, которые могут быть применены для оценки жизнеспособности размороженной ядросодержащей клетки. Однако наиболее эффективным будет комплексный подход.

1.4 Методы криоконсервирования лейкоцитов

1.4.1 Способы получения лейкоцитного концентрата и его практическое применение

Лейкоконцентрат (Аграненко В.А., Тибилова H.H., 1997; Сведенцов Е.П., 1999; Bux J., 1996) — трансфузионная среда с высоким содержанием лейкоцитов периферической крови от 10x109 до 40-50x109 лейкоцитов в 200—500 мл суспензионной среды с незначительной примесью эритроцитов, тромбоцитов, стволовых клеток и плазмы.

Лейкоцитные концентраты нашли свое применение при лейкоцитопениях, когда количество лейкоцитных клеток в периферической

крови больного менее 1,5х109/л, при различных патологических состояниях с угрозой развития или развивающимися инфекционными осложнениями; гипо- и апластических состояниях кроветворения, медикаментозных агранулоцитозах; тяжелом сепсисе, онкологических и гематологических заболеваниях с резким угнетением лейкопоэза в результате применения химио- и лучевой терапии (Заривчацкий М.Ф., 1995); токсической и терминальной фазах разлитого перитонита с выраженными признаками иммунодефицита (Рыжков C.B. и др., 1992; Ханевич М.Д., Маринин A.B.,

1995); гнойных заболеваниях плевры и легких, обширных глубоких ожогах в стадии генерализации инфекционного процесса с признаками иммунодефицита тяжелой степени и при неэффективности проводимого лечения (Мельникова В.Н. и др., 1993); нейтропениях (Балашов Д.Н., 2001) и выраженном сепсисе у новорожденных (Cairo M.S. и др., 1992; Neppert J.,

1996).

Абсолютными противопоказаниями к применению лейкоконцентрата служат свежие тромбозы и эмболии различного генеза, тяжелые аллергические реакции и острые нарушения мозгового кровообращения. Переливание лейкоконцентрата относительно противопоказано при тяжелых формах сердечной недостаточности, инфаркте миокарда, гипертоническом кризе. Так же противопоказаниями являются: наличие антилейкоцитарных тел у больного и невозможность подобрать совместимый концентрат лейкоцитов по системе HLA; концентраты лейкоцитов, заготовленные от больных хроническим миелолейкозом. Не имеет смысла переливать концентрат лейкоцитов, в котором число лейкоцитов не соответствует лечебной дозе или лейкоциты нежизнеспособны (Сведенцов Е.П., 1999).

Критерием эффективности трансфузий концентрата лейкоцитов является повышение эффективности проводимой антибактериальной терапии и снижение активности воспалительного процесса при одновременном увеличении числа лейкоцитов в периферической крови (Заривчацкий М.Ф., 1995).

В настоящее время для получения данного компонента крови на ряду с классическими методами (Гусейнов И.С., Федорова Л.И., 1963; Леонтович В.А., Абезгауз H.H., Трошина В.М., 1971; Калинин И.Н., 1980; Мельникова В.Н., 1995): снятие лейкоцитной пленки, остающейся над эритроцитами после отделения плазмы при спонтанном оседании эритроцитов; сбор из флаконов с кровью, в которых наблюдают спонтанно ускоренное оседание эритроцитов при получении плазмы, обогащенной лейкоцитами; ускоренное осаждения эритроцитов с применением коллоидных осадителей и получение плазмы, обогащенной лейкоцитами все шире применяют аппаратные методы: гравитационный лейкоцитаферез на фракционатарах крови с непрерывным и прерывистым током крови и фильтрационный лейкоцитаферез с пропусканием гепаринизированной крови через специальные фильтры (нейлон, дакрон, и др.), задерживающие лейкоциты. Последние методы позволяют выделить от одного здорового донора до 30x109 - 50x109 лейкоцитов (Утемов C.B., 1995).

Российским НИИ гематологии и трансфузиологии предложены методы получения лейкоцитной взвеси путем повторного двойного и тройного лейкоцитаферезов с применением контейнеров «Гемакон-500/300», «Компопласт-300», лабораторных центрифуг К-70 или ЦЛ-4000. При двойном лейкоцитаферезе от донора получают 200 мл лейкоцитной взвеси, содержащей до 4,0x109 лейкоцитов. В тройном лейкоцитаферезе получают 300 мл взвеси, содержащей до 6,0x109 лейкоцитов. В лейкоцитной взвеси, заготовленной приведенным методом, содержатся 47% нейтрофильных гранулоцитов, 5% моноцитов и 43% лимфоцитов. За рубежом применяют аппаратный лейкаферез с использованием центрифужных сепараторов непрерывного («Amico», IMB-2997, «Fenwal-3000») и прерывистого («Hemonetics-30», «Hemonetics-50» и др.) потока. Получают лейкоцитные концентраты, содержащие от 14,0x109 до 24,0x109 клеток, среди которых гранулоциты составляют 70% (Шевченко Ю.Л и др., 2003).

1.4.2 Методы низкотемпературного консервирования лейкоцитов

На основании проведенного анализа опубликованных данных можно отметить превалирующий подход к решению проблемы сохранности ядросодержащих клеток крови с использованием жидкоазотной технологии при ультранизкой температуре -196°С.

Абезгауз H.H. и Леонтович A.A. (1966) предложили использовать для длительного хранения лейкоцитов крови человека при ультранизких температурах следующие криопротекторы: 15% глицерин, 15% ДМСО и 20% ГТВП. В любом случае, фоном являлся следующий раствор: сахароза или лактоза, глюкоза и ЭДТА Na2. Перед замораживанием лейкоциты, взвешенные в плазме, смешивали с равным объемом одного из названных ограждающих растворов. Использовали термоизолированный сосуд с налитым в него этиловым спиртом и алюминиевые контейнеры. Режим замораживания был следующий: 1°С/мин до -15°С, затем по 10°С/мин до -79°С. Далее переносили для хранения при -196°С. Быстрое размораживание проводили в водяной бане при +40°С без перегрева препарата выше 10-15°С. Перед трансфузией осуществляли 5-10 минутное разбавление (в 2 раза) изотоничным раствором сахарозы с ЭДТА Na2 в спаренных пластикатных мешках закрытым способом. При изучении морфофункциональных свойств лейкоцитов установлено, что жизнеспособность при использовании глицерина составила 70%, ДМСО - 75%, а ПВП - 92%. Фагоцитарная активность гранулоцитов - 50%. Реакция бласттрансформации, т.е. процент трансформированных клеток после замораживания составил 80-90%. В 1973 году этими же авторами для замораживания гранулоцитов и лимфоцитов человека под защитой 15% глицерина была предложена следующую программа замораживания: 1°С в минуту до -13°С и далее по 10°С в минуту как в камере, так и в биопродукте. Эффективность метода определялась по суправитальной окраске: эозинорезистентных гранулоцитов наблюдалось 79%, лимфоцитов 83%.

Леонтович В.А. с соавторами (1975) предложил режим замораживания гранулоцитов человека с постоянной скоростью охлаждения при использовании 30% глицерина в углеводно-солевом растворе. При этом за 30 мин до замораживания взвесь гранулоцитов обрабатывали криоконсервантом. Замораживание с переменной скоростью проводили в аппарате конструкции Института кибернетики АН Грузинской ССР. Определено лучшее условие охлаждения камеры - со скоростью 2°С/ мин. Суправитальная окраска эозином, при этом, была на 10% ниже, чем при предыдущей программе.

Махатадзе И.К. с соавторами (1975) провели замораживания лейкоцитов под защитой 9% ПВП, 7,5% и 15% глицерина, 10% и 20% ДМСО и 15% ПЭО в оригинальном аппарате «Тбилиси» по одноэтапной программе (1-10°С/мин) и двухэтапной программе (2-10°С/мин). Наилучшие результаты по жизнеспособности клеток получены при использовании 9% ПВП и 15% ПЭО по обеим программам замораживания.

Наиболее подробное изучение влияния отрицательной температуры -196° и 10% криопротектора ПЭО-400 на сохранность клеток лейкоконцентрата и лимфоконцентрата периферической крови провела Полякова А.И. (1975). После 30 минутной экспозиции клеток с протектором проводилось замораживание по двухэтапной программе: 1°/мин до -10° далее -400° /мин (для гранулоцитов) и 5°/мин до -10° далее -400° /мин (для лимфоцитов). Хранились замороженные клетки при ультранизких температурах до 3-х лет. Быстрое размораживание осуществлялось в водяной бане со скоростью 540-500°/мин при температуре +40°С и +30°С. Установлено, что лимфоциты, консервированные данным способом, наиболее устойчивы, чем гранулоциты.

Пушкарь Н.С. с соавторами (1978) предложили замораживание лейкоцитов с 10% ПЭО-400 в аппарате «Биокомплекс». Время экспозиции клеток с протектором - 30 мин. Замораживание 2-5°С/мин до тепловой остановки (5-10 мин) далее 400° С/мин до -196°С. Размораживание - на

водяной бане при температуре +40°С (скорость 500° С/мин). При этом количество незрелых клеток снизилось на 45%, зрелых гранулоцитов и агранулоцитов соответственно на 14% и 7%. Фагоцитарная активность уменьшилась на 8%, фагоцитарное число не изменилось, а количество клеток, находящихся в состоянии аттракции, повысилось на 6,4%. Двигательная активность лейкоцитов не изменилась (индекс миграции 1,08±0,22). Сохранилась также способность к трансформации.

В практической трансфузиологии известен способ консервирования лейкоцитов, предложенный Аграненко В.А. с соавторами (1986) под защитой хладоограждающего раствора «Лейкокриодмаца» (приказ Минздрава СССР №1646 от 25.12.85): ДМАЦ - 20,0 мл, глюкоза - 20,0 г, ЭДТА Na2 - 0,4 г, вода для инъекций - до 100 мл. Соотношение лейкоконцентрат: 3:1, т.е. конечная концентрация ДМАЦ - 5%. При замораживании по линейной программе (3°С/ми до -1°С; 5°С-10°С до -100°С с перемещением в жидкий азот) через 2 года хранения жизнеспособными остаются 78% отогретых лейкоцитов.

Q. Zhang, Т. R Tiersch (1995) замораживали лейкоциты канального сома с глицерином, ДМСО и метанолом с их последующим цитогенетическим анализом, хранили 7 сут. Выявили снижение жизнеспособности клеток, консервированных с глицерином на 24-27%, с ДМСО - на 25-43%, с метанолом на 67-100%; при медленном замораживании (-2.7°С/мин) жизнеспособность была выше, чем при быстром (-45°С/мин).

С 2003 г. в России (приказ Минздрава РФ №325 «О развитии клеточных технологий» от 25.07.2003) для криоконсервирования (-150°С) концентрата стволовых клеток пуповинной/плацентарной крови человека в научных целях начали применять высокоочищенный ДМСО (10%) в «полиглюкине». Некоторым крупным НИИ было разрешено применять деконсервированные ГСК для аутотрансплантаций в клинических целях. Согласно методическим рекомендациям «Заготовка гемопоэтических стволовых клеток» (Утв. ФМБА России 30.05.2007) замораживают биообъект в парах жидкого азота: на первом этапе со скоростью 1,1°С-2,5°С/мин до

-40°С, на втором по 3°С-5°С/мин до -120°С. Хранение осуществляют при -196°С в течение многих лет в физиологически полноценном состоянии.

Для консервирования лейкоцитов также был использован диапазон низких температур (-80°С).

J.P. Crowley (1974) исследовал восстановление структуры и функции различных видов лейкоцитов крови человека, охлаждённых с ДМСО в концентрации от 6 до 15%. При замораживании клеток до -80°С со скоростью 1°С/мин и хранении в течение недели жизнеспособность клеток составляла около 95%, а сохранность гранулоцитов - 29%. После отмывания протектора жизнеспособность снижалась до 50% и через 24 часа составляла 40%. При этом электронная микроскопия показала значительные изменения в морфологии гранулоцитов, но не лимфоцитов.

F.J. Lionetti (1975) используя ДМСО (5%, 10%) осуществил замораживание (2°С/мин до -80°С) и хранение лейкоцитов в течение 3 месяцев. При этом сохранность гранулоцитов составила 60,0±9,7%, после отмывания снижалась до 43%. Также автор применил комбинацию криопротекторов 10% ДМСО с 4% ГЭК и получил положительный результат.

Аналогичный подход использовал P. Boonlayangoor (1980). При использовании ДМСО (5, 10%) с ГЭК (4% для отмывания) и замораживании 2-3°С/мин -80°С через 2 месяца хранения 50% клеток оставались жизнеспособными, их фагоцитарная активность составляла 58% и снижалась по мере хранения клеток (максимальный срок - 4 мес).

Утемовым C.B. с соавторами (1999) предложен метод консервирования лейкоцитов при -80°С с применением нелинейной программы замораживания и малотоксичного консерванта: криопротектор ГМБТОЭМ - 15%, лимонная кислота - 0,35% и бидистиллированная вода - до 200 мл. Через 12 месяцев хранения при низкой температуре сохраняется 52,5±10,2% функционально активных лейкоцитов.

Возможность консервирования лейкоцитов при температурах выше -80°С до настоящего времени остается не изученной.

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Полежаева, Татьяна Витальевна

выводы

1. Разработаны новые комбинированные криозащитные растворы, содержащие криоиротекторы непроникающего, проникающего, смешанного типа действия и реставрирующие компоненты, не требующие отмывания после отогрева биообъекта.

2. В присутствии предложенных комбинированных растворов у лейкоцитов на всех этапах криоконсервирования и при варьировании сроков хранения не происходит активация ПОЛ

3. При —10°С сохранность более 75% лейкоцитов по разным тестам в течение 9 суток обеспечивает незамерзающий криозащитный раствор, содержащий глицерин (в исходной концентрации 7%), желатин со средней молекулярной массой 16 ООО (7,5%) и антигипоксант-антиоксидант ОМЭПС (0,3%).

4. Комбинирование в замораживаемой клеточной среде ГМБТОЭМ (28%) с ОМЭПС (0,2%) обеспечивает полноценность лейкоцитов крови человека при -20°С в течение 21 суток.

5. Структурно-функциональные параметры у более 75% лейкоцитов сохраняются в условиях температуры —40°С в течение 30 суток в среде криозащитного раствора, содержащего ГМБТОЭМ (30%), фумарат натрия (2,8%) и лимонную кислоту (0,06%).

6. Сохранность лейкоцитов при -80°С в течение 180 суток обеспечивает криозащитный раствор, содержащий ГМБТОЭМ (22%), ДМСО (8%) и ОМЭПС (0,2 %).

7. Криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ, обладающий выраженной криозащитной активностью в широком диапазоне температур (от -20°С до -80°С) и характеризующийся низкой токсичностью среди подобных веществ, может рассматриваться в качестве универсального протектора.

8. Предложен новый вид непроникающего криопротектора -растительный полисахарид лемнан, который в исходной концентрации 0,3% совместно с глицерином (7%) и ОМЭПС (0,3%) обеспечивает сохранность исходных морфофункциональных параметров у лейкоцитов при — 10°С в течение 1 суток.

9. Разработанные комбинированные криозащитные растворы по физико-химическим и биологическим свойствам не токсичны, апирогенны и без осложнений переносятся лабораторными животными в смеси с размороженными аутологичными лейкоцитными концентратами.

10. Способы электрорефрижераторного криоконсервирования ядросодержащих клеток периферической крови в нетоксичных ограждающих растворах при температурах от —10°С до -80°С являются эффективными, доступными для широкого круга учреждений медицинского и биологического профиля и могут быть рекомендованы в качестве альтернативы криоконсервированию биообъектов в жидком азоте.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Предложены доступные способы криоконсервирования лейкоцитов крови человека под защитой комбинированных криозащитных растворов, обеспечивающих высокую сохранность морфологических и функциональных свойств клеток. Рекомендуются в качестве альтернативы замораживанию биообъектов в жидком азоте.

2. Для эффективного консервирования лейкоцитов: а) при -10°С в течение 7 суток клетки смешивают (1:1) со свежеприготовленным криозащитным раствором, содержащим глицерин (в исходной концентрации 7%), желатин со средней молекулярной массой 16 000 (7,5%) и ОМЭПС (0,3%). Стоимость 1 литра раствора составляет приблизительно 1300 руб. Смесь выдерживают 20 мин при комнатной температуре и помещают для охлаждения и последующего хранения в заполненную антифризом (45%-ным этиловым спиртом) и охлажденную до -10°С емкость. Деконсервирование клеток производят покачиванием контейнера в емкости с водой, нагретой до +38°С до температуры биообъекта +2 +4°С. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 2-3 мин. б) при -20°С в течение 21 суток - клетки смешивают (1:1) с криозащитным раствором, содержащем ГМБТОЭМ (28%) и ОМЭПС (0,2%), и выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Стоимость 1 литра раствора составляет приблизительно 900 руб. Биообъект на 10 мин для замораживания помещают в охлажденную до -20°С емкость с 96%-ным этиловым спиртом, после чего переносят в воздушную камеру для последующего хранения. Деконсервирование клеток производят аналогично пункту 2.а. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 40 сек. в) при -40°С в течение 30 суток - клетки смешивают (1:1) с криозащитным раствором, содержащем ГМБТОЭМ (30%), фумарат натрия (2,8%) и лимонную кислоту (0,06%), выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Стоимость 1 литра раствора составляет приблизительно 300 руб. Для замораживания смесь помещают на 15 мин в охлажденную до -28°С емкость с 96%-ным этиловым спиртом, после чего переносят для дальнейшего замораживания и хранения в воздушную камеру электрического морозильника на -40°С. Деконсервирование клеток производят аналогично пункту 2.а. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 45 сек. г) при -80°С в течение 180 суток - клетки смешивают (1:1) со свежеприготовленным криозащитным раствором, включающем в себя ДМСО (8%), ГМБТОЭМ (22%) и ОМЭПС (0,2%). Стоимость 1 литра раствора составляет приблизительно 1300 руб. Смесь выдерживают 20 мин при комнатной температуре и помещают для замораживания на 15 мин в охлажденную до -28°С емкость с 96%-ным этиловым спиртом, после чего переносят для дальнейшего замораживания и хранения в воздушную камеру на -80°С. Деконсервирование клеток производят аналогично пункту 2.а. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 45 сек.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Полежаева, Татьяна Витальевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абезгауз H.H., Леонтович В. А. Замораживание белых клеток периферической крови для длительного хранения при ультранизких температурах // Проблемы гематологии и переливания крови. 1966. №9. С. 24-30.

2. Аванов А.Л. Биологические антифризы и механизм их активности // Молекулярная биология. 1990. Т.24.№3. С. 581-597.

3. Аграненко В.А., Абезгауз H.H., Трошина В.М., Мартынова В.А., Ермакова Г.Л. Консервирование гранулоцитов с раствором «лейкокриодмац» // Гематология и трансфузиология. 1986. №12. С. 2629.

4. Аграненко В.А., Тибилова H.H. Консервирующие растворы для крови и ее компонентов // Кровезаменители, консерванты крови и костного мозга: Справочник / Под ред. Г.Н.Хлябича. М.: Медицина, 1997. С. 150-161.

5. Аграненко В.А., Файнштейн Ф.Э., Ермолович C.B. Биологические свойства криоконсервированных лейкоцитов и их клиническое применение // Проблемы гематологии и переливания крови. 1982. №4. С. 6-10.

6. Адо А.Д. Патофизиология фагоцитов. Москва. 1961. С.6-293.

7. Алексеев A.A. Водный режим растений в связи с обменом веществ и структурированностью цитоплазмы // Тимирязевские чтения. 1969. Т.28. С.3-36.

8. Алексеев A.M. О молекулярной структуре внутриклеточной воды и ее возможном биологическом значении // Состояние воды и водный режим культурных растений. Москва: Наука. 1971. С.11-23.

9. Алексеев H.A. Клинические аспекты лейкопений, нейтропений и функциональных нарушений нейтрофилов. СПб.: Фолиант. 2002. 416 с.

10. Андреев A.A., Андреева JI.А., Тараховский Ю.С., Салихов И.С. Замерзание водных растворов в присутствии липосом // Биофизика живой клетки. 2000. Т.9. С.20.

11. Арзуманян В.Г., Ожовян Н.М. Модифицированный метод оценки целостности цитоплазматической мембраны клеток эукариот // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2002. Т. 134, №7. С. 118-120.

12. Бабийчук Г.А., Марченко B.C., Пастухов Ю.Ф., Шило A.B., Ломако В.В., Ломакин И.И. К механизмам регуляции проницаемости гематоэнцефалогического барьера охлаждённого мозга. Сообщение 1 // Проблемы гематологии. 1995. №1. С. 10-19.

13. Бабийчук Л.А., Зубов П.М., Рязанцев В.В., Зубова О.Л. Безотмывочный метод криоконсервирования кордовой крови: оценка популяционного состава ядросодержащих клеток // Проблемы криобиологии. 2008. Т. 18, №3. С.348-351.

14. Бабийчук Л.А., Кудокоцева О.В., Зубов П.М., Зубова О.Л. Новые подходы к криоконсервированию и оценки жизнеспособности ядросодержащих клеток кордовой крови // Украинский химиотерапевтический журнал. 2008. №1-2 (22). С.85-87.

15. Балашов Д.Н. Лечебные трансфузии гранулоцитов для лечения тяжелых инфекционных осложнений у пациентов с нейтропенией: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Москва, 2001. 24 с.

16. Барабой В. А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов // Успехи современной биологии. 1991. Т.111, вып. 6. С. 21-28.

17. Барабой В.А., Брехман И.И., Голотин В.Г., Кудряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. СПб.: Наука. 1992. 148 с.

18. Бауст Дж.Г., Бауст Дж.М., Шнайдер К. Биосохранение - уменьшение отрицательных последствий консервирования на молекулярном уровне //Проблемы криобиологии. 2008. Т.18,№2. С. 163.

19. Белоус A.M., Луговой В.И., Гулевский А.К. Актуальные проблемы криобиохимии // Криобиология и криомедицина. Киев. 1975. С. 8-15.

20. Белоус A.M. Бондаренко В.А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. Киев: Наукова думка. 1982. 256 с.

21. Белоус A.M., Бондаренко В.А., Бабийчук JI.A. Единый механизм повреждения клетки при термальном шоке, замораживании и постгипертоническом лизисе // Криобиология. 1985. № 2. С. 25-32.

22. Белоус A.M., Гордиенко Е. А., Розанов Л.Ф. Биохимия мембран: замораживание и криопротекция. М.: Высш. школа, 1987. 80 с.

23. Белоус A.M., Гулевский А.К. Барьерные свойства биомембран при низких температурах. Киев: Наукова думка. 1988. 208 с.

24. Белоус A.M., Грищенко В.И. Криобиология. Киев: Наукова Думка, 1994. 430 с.

25. Белоус A.M. Проблемы криобиохимии мембранных структур // Проблемы криобиологии. 1997. №.1-2. С. 19-23.

26. Берсенев A.B. Судороги и кома как осложнения, связанные с токсичностью криопротектора (ДМСО) при инфузии гемопоэтических клеток в клинике трансплантации костного мозга // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2006. №1(3). С.31-32.

27. Биохимия / Под ред. Е.С. Северина. М.: ГЭОТАР-МЕД., 2003. С. 36-296

28. Боброва E.H., Зинченко A.B., Щетинский М.И. Исследование насыщения ткани плаценты глицерином и 1,2-пропандиолом // Проблемы криобиологии. 2005. ТЛ5, №.2. С. 147-152.

29. Боброва E.H., Зинченко A.B. О девитрификации в суспензии эритроцитов кордовой крови при охлаждении и нагреве с 1,2-пропандиолом и глицерином // Проблемы криобиологии. 2002. №1. С. 122-123.

30. Бондаренко В.А., Лемешко В.В., Белоус A.M. Влияние разных режимов замораживания - оттаивания на хемилюминесценцию митохондрий печени щук // Украинский биохимический журнал. 1975. Т. 47. № 6. С. 746-783.

31. Бондаренко В.А. Развитие и предупреждение температурного шока эритроцитов: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. Харьков, 1988. 48 с.

32. Бондаренко В. А., Бондаренко Т. П., Руденко С. В. Эффекты дегидратации в контроле холодовой и осмотической чувствительности клеток // Проблемы криобиологии. 1992. №4. С. 14-25.

33. Бондаренко В.А., Пакулова O.K., Жуйкова А.Е. Поведение клеток в неизотонических условиях: дифференцированный подход к механизмам структурных нарушений и адаптации // Проблемы криобиологии. 2008. Т. 18, №2. С.209.

34. Буряк И. А. Исследование криоповреждений дрожжей флуоресцентными методами // Проблемы криобиологии. 2007. Т. 17, №2. С. 197.

35. Виксман М.Е., Маянский А.Н. Применение реакции восстановления нитросинего тетразолия для оценки функционального состояния нейтрофилов человека // Казан, мед. журн. 1997. Т. 55, №5. С.99-100.

36. Вильянинов В.Н. Низкотемпературное консервирование эритроцитов под защитой комбинированного криопротектора на основе пропиленгликоля и диметилацетамида: Автореф. дис....канд. мед. наук. Санкт-Петербург, 1997. 21 с.

37. Виноград-Финкель Ф.Р., Киселев А.Е. Актуальные проблемы замораживания крови // Проблемы гематологии и переливания крови. 1970. №4. С. 3-4.

38. Виноград-Финкель Ф.Р., Гинзбург Ф.Г., Федорова Л.И., Семенова Н.В., Сухова А.Г., Тальская И.Н.. Кудряшова Н.И., Обшивалова H.H. Криоконсервирование эритроцитов и их функциональная полноценность // Проблемы гематологии и переливания крови, 1973. Т. 18, №9. С.3-10.

39. Владимиров Ю.А. Свечение, сопровождающее биохимические реакции // Соросовский образовательный журнал. 1999. №6. С.25-32.

40. Воротилин A.M. Криоконсервирование эритроцитов человека под защитой криопротекторов на основе низкомолекулярных диолов: Автореф. дис....докт. биол. наук. Харьков, 1987. 32 с.

41. Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода "Ускоренного старения" при повышенной температуре: И-42-2-82: утв. М-вом мед. пром-сти, М-вом здравоохранения СССР в 1982 г. М.: 1983. 13 с.

42. Высеканцев И.П., Кудокоцева О.В., Петренко Т.Ф., Турина Т.М., Трошева М.И., Марценюк В.Ф., Кощий C.B. Влияние колебаний температуры хранения на жизнеспособность консервированных клеток про-и эукариот//Проблемы криобиологии. 2005. Т. 15, №.1. С. 3341.

43. Газизов В.З., Жданов C.JL, Бояринцев JI.E. Биохимические реакции перекисного окисления липидов и физиологические процессы антиоксидантной защиты организма плотоядных. Киров: ВГСХА. 2001. с.37.

44. Галеева K.P. Диагностика, лечение и прогноз бронхитов у детей раннего возраста на основе XJI нейтрофилов крови: Автореф. дис ... канд. мед. наук. Москва, 2000. 20 с.

45. Галкин A.A., Тимин E.H.. Карелин A.A. Методы исследования подвижности нейтрофилов // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. № 1.С. 22-33.

46. Герасимов И.Г., Игнатов Д.Ю. Функциональная неравнозначность нейтрофилов крови человека: генетика активных форм кислорода // Цитология. 2001. Том 43, №5. С. 432-436.

47. Герасимов И.Г., Калуцкая O.A. Кинетика реакции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами крови человека // Цитология. 2000. Том 42, №2. С. 160-165.

48. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Москва: Практика, 1998. 459 с.

49. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск: Изд-во Томского гос. ун-та, 1992. 264 с.

50. Гольдина O.A., Горбачевский Ю.В. Преимущество современных препаратов гидроксиэтилированного крахмала в ряду плазмозамещающих инфузионных растворов // Вестник службы крови России. 1998. №3. С. 41.

51. Гольдман И.Л., Браузе М.И. Лимфоцитарный тест для определения иммунологической совместимости тканей // Вестник хирургии. 1966. №6. С. 69-73.

52. Гольцев А.Н., Волина В.В., Останков М.В., Гольцев К.А., Сокол Л.В., Бровко Е.В., Чернышенко Л.Г., Кожина О.Ю. Влияние криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека // Проблемы криобиологии. 2010. Т.20,№1. С. 66-72.

53. Гордиенко А.Д., Кудокоцева Е.В. Изучение функционального состояния митохондрий в клеточных суспензиях, экспонированных в растворе криопротектора // Криобиология и криомедицина. 1980. Вып. 7. С. 32-34.

54. Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспензий. Киев: Наук, думка, 1994. 142 с.

55. Горобченко О.П., Мошко Ю.А., Николов О.Т., Нардид Э.О., Липина О.В., Гаташ С.В. Влияние режимов замораживания на диэлектрические свойства сыворотки кордовой крови // Проблемы криобиологии. 2004. №2. С. 4-10.

56. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. 11-е изд., доп. М.: Медицина, 1990. 400 с.

57. Государственная Фармакопея Российской Федерации. 12-е изд., ч.1 -М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2007. 704 с.

58. Грищенко В.И., Алексеевская Э.И. Возможные механизмы мембранного транспорта белков: перенос цитохрома С через митохондриальные мембраны и его роль в механизме криообновления // Проблемы криобиологии. 2005. Т15, №1. С. 42-49.

59. Губский Ю.И. Токсическая гибель клетки: свободнорадикальное повреждение ДНК и апоптоз // Лшування тадгагностика. 2001. №4. С.8-13.

60. Гулевский А.К.. Бондаренко В.А., Белоус A.M. Барьерные свойства биомембран при низких температурах. Киев: Наукова думка. 1988. 208 с.

61. Гулевский А.К., Релина Л.И. Молекулярные шапероны и холодовая адаптация организмов//Проблемы криобиологии. 2003. №1. С. 26-37.

62. Гулевский А.К, Релина Л.И. Антифризные белки. Сообщение I. Классификация и механизм действия // Проблемы криобиологии. 2009. Т. 19, №1. С.18-24.

63. Гулевский А.К., Релина Л.И. Антифризные белки. Сообщение II. Распространение в природе // Проблемы криобиологии. 2009. Т. 19, №2. С.121-236.

64. Гулевский А.К., Релина Л.И. Антифризные белки. Сообщение И. Регуляция, происхождение, стабильность и применение // Проблемы криобиологии. 2009. Т. 19, №3. С.273-282.

65. Гулевский А.К., Релина Л.И Белки-нуклеаторы бактериального происхождения. Сообщение I. Общая характеристика и классификация // Проблемы криобиологии. 2010. Т.20, №1. С. 18-24.

66. Гурвич А.Г. Митогентическое излучение. М.: Госмедиздат. 1934. 45 с.

67. Гусейнов И.С., Федорова Л.И. Выделение лейкоцитов из крови доноров для экспериментальных и клинических целей // Проблемы гематологии и переливания крови. 1963. №4. С. 52-55.

68. Гучок В.М., Верховская Л.З. Изучение влияния 1,2-пропандиола на свертывающую систему крови и целостный организм // Научно-технический прогресс в медицине и фундаментальные проблемы биологии: Тез. докл. обл. научно-практич. конф. (сентябрь 1987). Харьков. 1987. С.18-19.

69. Деветьярова О.Н. Функциональная активность лейкоцитов, перенесших криоанабиоз при -20°С: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Киров, 2005. 20 с.

70. Диллер K.P. Изменение и моделирование осмотического поведения клеток при замораживании // Криобиология. 1990. №1. С.11-17.

71. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. Москва: Наука. 1989. 277 с.

72. Дюмаев К. М., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС. М., 1995. 271 с.

73. Журавлев А.И., Журавлева А.И. сверхслабое свечение сыворотки крови и его значение в комплексной диагностике. Москва. Медицина. 1975. С. 5-51.

74. Зинченко A.B., Боброва E.H., Щетинский М.И. Влияние ДМСО на фазовые переходы и стеклование в суспензии эритроцитов кордовой крови ниже 0°С // Проблемы криобиологии. 2003. №2. С. 16-21.

75. Зинченко A.B., Зинченко В.Д., Копейка Е.Ф., Онищенко Е.В. О возможных факторах повреждения биологических объектов и их ДНК при криоконсервации // Цитология. 2004. Т. 46, №9. С. 796.

76. Иткин Ю.А. Исследование некоторых биофизических процессов, происходящих в клетках костного мозга при замораживании: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Харьков, 1972. 25 с.

77. Иткин Ю.А., Гордиенко Е.А., Бронштейн B.JI. Физико-математический анализ механизмов криоповреждения и криозащиты клеток // Актуальные проблемы криобиологии. Киев: Наукова Думка. 1981. С.300-344.

78. Иткин Ю.А., Бронштейн B.JL, Гордиенко Е.А., Марценюк В.Ф. Замораживание: факторы, механизмы и гипотезы криоповреждения биологический суспензий // Консервирование клеточных суспензий. Киев: Наукова Думка, 1983. С. 26-34.

79. Ишков Г.С. Криомикроскопическое исследование процесса замораживания клеточных суспензий в градиенте температуры: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Харьков, 1986. 21 с.

80. Кабачный В.И., Горбунова Н.И. Производные гетерозидов -эффективные добавки к криозащитным средам // Проблемы криобиологии. 2004. №2. С. 28-35.

81. Калинин И.Н. Получение и применение концентрата тромбоцитов и лейкоцитов // Проблемы гематологии и переливания крови. 1980. №10. С. 50-56.

82. Каранова М.В., Гахова Э.Н. Высокая концентрация глюкозы в гемолимфе адаптированного к зиме озерного бокоплава // Биофизика живой клетки. 2003. Т.7. С. 38-41.

83. Каранова М.В., Андреев A.A., Петропавлов H.H., Нестеров В.И. О возможных криопротекторах пресноводной рыбы Dallia pectoralis // Биофизика живой клетки. 2003. Т.7. С. 34-37.

84. Кичигин А.И. Оценка функционального состояния лейкоцитов по количеству ореолообразующих клеток крови // Научные доклады Коми НЦ УрО РАН. Сыктывкар. 1988. 24 с.

85. Клебанов Г.И., Любицкий О.Б., Васильева О.В., Климов Ю.В., Пензулаева О.Б., Тепляшин A.C., Толстых М.П., Проморенко В.К., Владимиров Ю.А. Антиоксидантные свойства производных

3-оксипиридина: мексидола, эмоксипина и проксипина // Вопросы медицинской химии. 2001. Т47. №3. С.288-300.

86. Коваленко Е.А., Березовский В.А., И.М.Эпштейн. Полярографическое определение кислорода в организме. Москва: Медицина. 1975. С. 132136.

87. Коваленко Г.В., Коваленко И.Ф., Линник Т.П., Кощий C.B. Диффузия многоатомных спиртов и их метоксипроизводных через мембраны эритроцитов крысы и кролика // Проблемы криобиологии. 2009. Т. 19, №4. С. 413-420.

88. Корниенко Е.М., Бондаренко В.А. Перспективность использования комбинированных криопротекторов при замораживании компонентов крови одноступенчатым способом при температуре -196°С // Проблемы криобиологии. 2008. Т.18, №2. С.248.

89. Костяев A.A. Низкотемпературное консервирование гемопоэтических стволовых клеток при -80°С в режиме быстрого двухступенчатого замораживания: Автореф. дис....докт. мед. наук. СПб, 2003. 35 с.

90. Кривцова И.М., Алексеева H.H. Цитохром С-фосфолипидный комплекс (получение и изучение в эксперименте) Цитохром С и его клиническое применение. // Сб.науч.трудов НИИ гематологии и переливания крови. Д.,1990. С.74-78.

91. Кузнецов К.В. Консервирование тромбоцитов замораживанием при -80°С по экспоненциальной программе: Автореф. дис....канд. мед. наук. СПб, 2006. 23 с.

92. Кулешова Л.Г. Кинетика льдообразования в живых клетках и модельных системах: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Харьков, 1983. 24 с.

93. Кулешова Л.Г., Розанов Л.Ф. Роль структуры внеклеточного льда в процессе криоповреждения клеток // Моделирование криобиологических процессов: Сб. науч. Тр. Харьков, 1988. С. 25-34.

94. Лаврик С.С. Применение поливинилпирролидона в качестве защитной среды для консервирования костного мозга глубоким замораживанием // Врачебное дело. 1966. №32. С.63-68.

95. Лаврик С.С., Когут Г.И., Афанасьева Е.Ю. Применение низкомолекулярного ПВП в качестве защитной среды для консервирования и длительного хранения лейкоцитов методом глубокого замораживания // Врачебное дело. 1971. №12. С. 80-83.

96. Левин C.B. Структурные изменения клеточных мембран. Ленинград: Наука. 1976. 197 с.

97. Леонтович В.А., Трошина В.М., Новичков В.Т., Абезгауз H.H. Испытание эффективности режимов с постоянной скоростью охлаждения для замораживания гранулоцитов человека // Проблемы гематологии и переливания крови. 1975. №9. С. 23-25.

98. Леонтович В.А., Абезгауз H.H., Перфильев В.Я., Мгебришвили H.H., Трошина В.М. Разработка оптимальных программ охлаждения для замораживания гранулоцитов и лимфоцитов человека // Проблемы гематологии и переливания крови. 1973. №9. С. 44-47.

99. Леонтович В.А., Абезгауз H.H., Трошина В.М. Получение лейкоцитной массы из периферической крови человека и ее фракционирование на гранулоциты и лимфоциты // Проблемы гематологии и переливания крови. №1. 1971. С.51-57.

100. Леонтович В.А., Абезгауз H.H., Трошина В.М. Метод замораживания гранулоцитов с диметилацетамидом // Современные проблемы криобиологии и криомедицины. Москва. 1975. С.75-84.

101. Линник Т.П., Дюбко Т.С., Егоров М.И., Пивоваренко В.Г. Исследование влияния криопротекторов на липосомы из суммарных липидов сперматозоидов собаки // Проблемы криобиологии. 2007. Т. 17, №2. С.141-149.

102. Лобынцева Г.С., Щербак Г.М., Полякова А.И. Низкотемпературное консервирование ядросодержащих клеток крови под защитой

полиэтиленоксида различного молекулярного веса // Материалы симпозиума «Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины», Киев: Наукова Думка. 1974. С. 69-70.

103. Лозина-Лозинский Л.К., Успенская З.И. системное направление в криобиологии // Криобиология. 1986. №4. С.10-16.

104. Лозина-Лозинский Л.К. Реакция насекомых на глубокое охлаждение // Реакция клеток на экстремальные воздействия. М.-Л. 1963. С. 34-53.

105. Лозина-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии. Адаптация и устойчивость организмов и клеток к низким и сверхнизким температурам Л. К. Лозина-Лозинский. Л.: Наука. 1972. 288 с.

106. Луговой В.И., Дзюба А.Н., Кравченко Л.П., Золочевская Л.И. Энзиматическая диагностика криоповреждений клеток лейкоконцентрата // Материалы I Всесоюзного симпозиума «Консервирование крови и ее компонентов». 27-29 сентября, Москва. 1981. С.64-65.

107. Малов А.Н., Неупокоева A.B. Голографические регистрирующие среды на основе дихромированного желатина: супрамолекулярный дизайн и динамика записи. Иркутск: ИВВАИУ(ВИ), 2006. 345 с.

108. Мамаев А. Е., Ханевич М.Д., Селиванов Е.А. Модежель как новое средство инфузионной терапии разлитого гнойного перитонита // Актуальные вопросы специальной медицинской помощи. Сборник научных трудов. Энгельс, 1998. С.35.

109. Мамаев А. Е., Ханевич М.Д., Селиванов Е.А. Опыт применения взвеси эритроцитов в модежеле в комплексном лечении больных разлитым перитонитом // Terra medika nova. 1997. Т.З, №3. С.42-44.

110. Мамаев А.Е. Применение модежеля и взвеси эритроцитов в модежеле в комплексном лечении больных разлитым перитонитом: Автореф. дис. ...канд.мед.наук. СПб, 1998. 16 с.

111. Максимов H.A. О замерзании и холодостойкости растений. СПб.: Изд. Лесн. Института. 1913. 136 с.

112. Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2 т. Т.2./ Изд. 14-е, перераб., испр. и доп. М.: Новая волна. 2002. 608 с.

113. Махатадзе И.К., Каличава Л.Х., Мгебришвили H.H., Кахиани Ш.В. Корреляция скоростей охлаждения с ограждающей средой в поиске оптимальных режимов замораживания гранулоцитов // Проблемы гематологии и переливания крови. 1975. №9. С. 25-27.

114. Маянский А. Н. Механизмы рекогносцировочных реакций // Успехи современной биологии. 1986. Т.102, №3. С.360-375.

115. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние. 1989. 344 с.

116. Маянский А. Н., Цырендоржиев Д.Д. Активация макрофагов // Успехи современной биологии. 1990. Т.109, №3. С.352-368.

117. Медведев П.М., Фисонович Т.И. Процессы льдообразования и режимы охлаждения суспензии клеток крови и костного мозга // Актуальные вопросы консервации и трансплантации костного мозга и крови. Харьков. 1972. С. 11-26.

118. Меерсон Ф.З. Основные закономерности индивидуальной адаптации // Сб. Физиология адаптационных процессов. М.: Наука, 1986. С.10-76

119. Межидов С.Х., Беляева И.М., Воротилин A.M., Моисеев В.А. Влияние сочетания поливинилпирролидона и 1,2-пропандиола на сохранность эритроцитов при криоконсервировании // Проблемы криобиологии. 1996. №2. С. 22-25.

120. Мельникова В.Н., Замалетдинова Т.В., Кирьянова Г.Ю. Усовершенствование методов консервирования эритроцитов при умеренно-низких и ультранизких температурах // Мед.технологии. 1995. №5. С.23-26.

121. Мельникова В.Н. Получение и клиническое применение при гнойно-септических заболеваниях лейкоцитарной взвеси из крови иммунных доноров // Трансфузионная медицина. СПб. 1995. №5. С.32-36.

122. Мельникова В.Н., Волкова С.Д., Кайтанаджан Е.И. Опыт получения и клинического применения лейкоцитарной взвеси из крови иммунных доноров при гнойно-септических заболеваниях // В кн.: Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии (Тез. докл. Российской конференции). СПб. 1993. С.342-343.

123. Михайлов В.Г. Трансплантация костного мозга. Ташкент: Медицина. 1975. 174 с.

124. Михайлов В.Г. Консервация костного мозга. Москва: Медицина. 1979. 144 с.

125. Митерева Д.Е., Агафонов В.Е. Модификация метода хемилюминесцентного анализа для оценки активности фагоцитов цельной крови сенсибилизированных животных // Клиническая лабораторная диагностика. 2004. №3. С.47-50.

126. Мороз Б. Б. Влияние мексидола на систему крови в условиях эмоционального стресса после воздействия ионизирующей радиации // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Приложение 1. С.213.

127. Мохова С.Н., Жигачёва И.В. Концентрация цитохромов в митохондриях и гомогенате печени при адаптации к холоду // Митохондрии. Аккумуляция энергии и регуляция ферментативных процессов. М.: Наука, 1977. С. 13 8-143.

128. Мхитарян JI.M. Механизм лечебного действия цитохрома С при остром вирусном гепатите "В" // Эксперим. и клин, медицина. 1987. Т. 27, №6. С. 585-589.

129. Нардид Э.О., Горобченко O.A.. Николов О.Т. Изучение влияния низких температур на сыворотку кордовой крови методом диэлектрометрии свервысоких частот // Физиологический журнал. 2005. Т.51, №5. С. 5660.

130. Нардид O.A. Исследование влияния низкомолекулярных криопротекторов на дыхательную цепь митохондрий методом ЭПР

спинового зонда // Проблемы криобиологии. 2009. Т.19, №2. С. 177185.

131. Новиков B.C. Применение цитохрома С для коррекциинарушенной резистентности. Цитохром С и его клиническое применение // Науч. труды НИИ гематологии и переливания крови. Л., 1990. С. 52-57.

132. Обозная Э.И., Маркова О.П. Некоторые пути восстановления биоэнергетики клеток криоконсервированного костного мозга // Проблемы гематологии. 1976. №9. С.6-10.

133. Обозная Э.И., Пушкарь Н.С., Маркова О.П., Панков Е.Я. Цитохимия замороженной клетки. Киев: Наукова думка, 1981. 176 с.

134. Оводова Р.Г., Головченко В.В., Шашков A.C., Попов СВ., Оводов Ю.С. Структурное исследование и физиологическая активность лемнана, пектина из Lemna minor II Биоорган, химия. 2000. Т.26. №.10. С. 743751.

135. Онищенко Е.В., Зинченко A.B. Исследование влияния некоторых проникающих криопротекторов на микросомы методом хемилюминесценции // Проблемы криобиологии. 2005. Т. 15, №1. С. 5055.

136. Орлик В.В. Результаты лабораторно-клинического изучения размороженных отмытых эритроцитов, криоконсервированных при -20°С // Проблемы криобиологии. 1998. №1. С. 53-57.

137. Орлик В.В., Кочаровский Б.В., Криворучко P.A. Длительное хранение эритроцитов при умеренно-низкой температуре (-40°С) и клиническая оценка их эффективности // Проблемы криобиологии. 1991. №2. С. 2731.

138. Основы трансфузиологии / Под ред. М.Ф. Заривчацкого. Пермь: Изд-во Пермского ун-та. 1995. С. 74-75.

139. Осташко В.Ф., Осташко Ф.И. Температурный шок клеток как гидравлический удар в резонансной системе // Цитология. 2004. Т. 46, №9. С. 831-832.

140. Панасенко Л.М., Краснова Е.И., Ефремов A.B. Клиническое значение хемилюминесцентного ответа лейкоцитов крови при коклюше // Бюллетень СО РАМН 2005. Т.117. №3. С. 44-47.

141. Перехрестенко П.М., Когут Г.И., Глухинькая Г.Т. Методические рекомендации: Заготовка криоконсервированных гемопоэтических клеток хордовой крови для клинического применения. Киев. 1998. 11 с.

142. Пигаревский В.Е. Зернистые лейкоциты и их свойства. Москва: Медицина. 1978. С.104-108.

143. Пичугин Ю.И. Итоги и перспективы поиска новых эндоцеллюлярных криопротекторов // Проблемы криобиологии. 1993. №2. С.3-10.

144. Поздняков В.В., Бондаренко В.А. «Объемный сдвиг» как фактор, контролирующий осмотическую устойчивость эритроцитов в растворах низкомолекулярных криопротекторов // Физико-химические свойства и биологическое действие криопротекторов. Харьков. 1990. С. 115-123.

145. Полякова А.И. Изучение влияния низких температур (-196°С) и криопротектора (ПЭО-400) на сохранность клеток лейкоконцентрата и лимфоконцентрата периферической крови: Автореферат канд. дисс. Харьков. 1975. 14 с.

146. Попов C.B. Функциональные реакции нейтрофилов и макрофагов на растительные полисахариды: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Сыктывкар, 1999. 19 с.

147. Потапова С.Г., Хрустиков B.C., Демидова Н.В., Козинец Г.И. Изучение поглотительной способности нейтрофилов крови с использованием инертных частиц латекса // Проблемы гематологии и переливания крови. 1977. №9. С.58-59.

148. Привалов П.Л. Вода и ее роль в биологических системах // Биофизика. 1968. Т.13, №1. С.163-177.

149. Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Введение в криобиологию. Киев: Наукова Думка. 1975. С. 187-189.

150. Пушкарь Н.С., Полякова А.И, Цуцаева A.A., Иткин Ю.А. Низкотемпературная консервация лимфоцитов // Проблемы гематологии и переливания крови. 1974. №7. С.23-26.

151. Пушкарь Н.С., Белоус A.M., Цуцаева A.A., Панков Е.А. Низкотемпературное консервирование костного мозга. Киев: Наукова думка. 1976. 288 с.

152. Пушкарь Н.С., Белоус A.M., Цуцаева A.A. Актуальные проблемы криоконсервирования костного мозга // Криобиология и криомедицина. 1976. №2. С.3-16.

153. Пушкарь Н.С., Белоус A.M., Иткин Ю.А., Вишневский В.И., Розанов Л.Ф. Низкотемпературная кристаллизация в биологических системах. Киев: Наукова думка. 1977. 238 с.

154. Пушкарь Н.С., Шраго М.Н., Белоус A.M., Калугин Ю.В.. Криопротекторы. Киев: Наукова Думка, 1978. 204 с.

155. Пушкарь Н.С., Лобынцева Г.С., Полякова А.И., Тимошенко Ю.П., Вотякова И.А. Разработка оптимальных режимов программного замораживания лейкоцитов // Пробл. гематол. и переливания крови. 1978. №8. С.8-13.

156. Пушкарь Н.С. Капрельянц A.C., Панков Е.Я. Ультраструктура клетки при низкотемпературном консервировании. Киев: Наукова думка. 1978. 149 с.

157. Пушкарь Н.С. Актуальные проблемы криобиологии. Киев: Наукова думка. 1981. 605 с.

158. Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Актуальные проблемы криобиологии. Киев: Наукова думка. 1981. 483 с.

159. Рагимов A.A., Щербаков Т.Н. Руководство по инфузионно-трансфузионной терапии. М.: Медицинское информагентство. 2003. С.95-101.

160. Рамазанов В.В. Влияние комбинированных сред на повреждение эритроцитов, замороженных с различным гематокритом // Проблемы криобиологии. 2006. Т.16, №2. С. 155-163.

161. Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Проявление и устранение эффекта «упаковки» в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами // Проблемы криобиологии. 2009. Т.19, №3. С. 312316.

162. Ре Луи. Консервация жизни холодом. Москва: Мир. 1962. 155 с.

163. Розанов Л.В. Кинетика реакций клеток на действие факторов криоконснервирования: Автореф. дис. ... док. биол. наук. Харьков, 1995. 24 с.

164. Российская Федерация. Законы. О донорстве крови и ее компонентов: [Федер.закон : принят 9 июня 1993г.] // Дом Советов России. М., 1993. №5142-1.

165. Рыжков C.B., Калеко С.П., Плоцкий А.Н. Клиническое применение лейкоконцентрата // Вестник хирургии. 1992. №1-3. С. 78-82.

166. Самыгин Г.А.. Причины вымерзания растений. Москва: Наука. 1974. 192 с.

167. Сведенцов Е.П. К классификации разных уровней отрицательных температур, используемых для консервирования биообъектов // Материалы научной сессии (30-31 марта 2004 г.). Киров: Изд-во Кировского областного Бюро медицинской статистики и информатики, 2004. С. 117-120.

168. Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. Сыктывкар. Коми научный центр УрО РАН. 2010. 80 с.

169. Сведенцов Е.П. Переливание концентрата лейкоцитов // Глава в кн.: Руководство по трансфузионной медицине. Киров, 1999. С.421-426.

170. Сведенцов Е.П. Получение и криоконсервирование костного мозга для клинического применения // Автореферат дисс. ... док. мед. наук. Л., 1987. 45 с.

171. Сведенцов Е.П., Костяев А.Н. Отечественные криоконсерванты для костного мозга // Вестник службы крови России. 1997. №1.С.26-27.

172. Сведенцов Е.П., Костяев А.Н. Консервирование компонентов крови при отрицательных температурах // Глава в кн.: Руководство по трансфузионной медицине. Киров, 1999. С.263-297.

173. Сведенцов Е.П., Костяев А.А, Волкова Н.Б. Новый ограждающий раствор для низкотемпературного (-80°С -90°С) консервирования костного мозга // Вопросы трансфузиологии и клинической медицины. Материалы научно-практической конференции. Киров, 1995. Cl 1-12.

174. Сведенцов Е.П., Туманова (Полежаева) Т.В., Оводова Р.Г., Головченко В.В., Зайцева О.О., Соломина О.Н., Степанова Е.С., Оводов Ю.С. Криозащитное действие лемнана, пектина ряски малой // Доклады академии наук. 2008. Т.421. №4. С. 559-561.

175. Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., Щеглова О.О., Деветьярова О.Н., Утемов C.B. Использование холодового анабиоза (-40°С) для консервирования гранулоцитов // Пермский медицинский журнал. Том 21. №3. 2004. С. 82-85.

176. Сведенцов Е.П., Щеглова О.О., Туманова Т.В., Деветьярова О.Н., Костяев A.A., Утемов C.B. Фагоцитарная активность нейтрофилов и лимфоцитов после различных сроков хранения в состоянии холодового анабиоза (-40°С) // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Том 138. № 10. 2004. С.400-402.

177. Сведенцов Е.П., Утемов C.B., Костяев A.A., Новосадов В.М. Консервирование лейкоцитов замораживанием при низких температурах (-60° -г -80° С) // Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии. С.Петербург, 2000. С. 261-262.

178. Свиридов С. В. Гетерогенные коллоидные плазмозамещающие растворы: настоящее и будущее // Российский Журнал Анестезиологии и Интенсивной Терапии. 1999. № 2. С. 12-18.

179. Селезнева О.М. Криоконсервированне тромбоцитов с применением нового ограждающего раствора: Автореф. дис ....канд.биол.наук. СПб., 1996. 21 с.

180. Серавин JI.H. О различиях механизмов пиноцитоза и фагоцитоза (на примере А. Proteus) // Цитология. 1968. Т. 10, №4. С.506-526.

181. Симонова Л.И. Биологическая характеристика пересадки консервированной (-196°С) гемопоэтической ткани плодов при острой лучевой болезни в эксперименте. Автореф.дис ... .канд.биол.наук. Харьков, 1969. 16 с.

182. Славинский A.A., Никитина Г.В. Цитохимическое выявление катионных белков в гранулоцитах крови амидо черным 10Б для визуальной оценки и компьютерного анализа изображения // Клин. лаб. диагностика. 1999. №2. С.35-37.

183. Слащева Г.А., Мурашев А.н. Стресс-белки как защитное средство от эндотоксинов // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине. Ред. А.П.Кудинов, Б.В.Крылов. Политех. Ун-т, С-Петербург. 2010. Т4. С. 162-169.

184. Слепнёва Л.В, Манойлов Ю.С., Криворучко Л.И. Исследование механизма лечебного действия цитохрома С // Лечебные препараты из крови и тканей: сб.науч.тр. НИИ гематологии и переливания крови. Л., 1974. С.131-133.

185. Смирнов Л. Д. Фармакологические свойства и перспективные области клинического применения антиоксидантов гетероароматического ряда // Свободные радикалы и антиоксиданты в химии и биологии. Тезисы докладов. М.: РАН. 2000. С.11.

186. Смольянинова Е.И., Линник Т.П., Гордиенко О.И. Проницаемость мембран ооцитов мыши для криозащитных веществ ряда диолов и амидов // Цитология. 2004. Т. 46, №9. С. 855-857.

187. Современные антиоксиданты в медицине / Под ред. В.И. Петрова. Волгоград: ФГУП «ИПК «Царицын». 2001. 12 с.

188. Сукач А.Н., Грищук В .П., Грищенко В.И. Перспективы использования наночастиц ферромагнетиков для криоконсервирования клеток // Проблемы криобиологии. 2008. Т.18,№4. С. 401-403.

189. Тепаев Д. В. Исследование возможности фармакологической коррекции мексидолом вегетативных и иммунных нарушений у лиц с признаками вегетативных изменений // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Приложение 1. С. 86.

190. Терентьева Э.И., Леонтович В.А, Шишканова З.Г., Абезгауз H.H. Электронная микроскопия лейкоцитов в процессе их хранения // Проблемы гематологии и переливания крови. 1966. №1. С. 28-34.

191. Терентьева Э.И., Леонтович В.А., Шишканова З.Г., Абезгауз H.H. Электронная микроскопия лейкоцитов в процессе их хранения // Проблемы гематологии и переливания крови. 1978. N 8. С. 8-13.

192. Терещенко И.П., Кашулина А.П., Соболева З.И., Александрова Л.М. О новом информативном показателе функционального состояния сегментоядерных нейтрофилов // Бюл. эксп.. биол. и мед. 1984. Т. 48. Вып. 10. С. 505-506.

193. Теселкин Ю. О., Давыдов Б. В. Ингибирование мексидолом пероксидного окисления липопротеинов сыворотки крови // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Приложение 1. С.139.

194. Точилкин А. И. Лимонная кислота // БМЭ. 1980. Т. 13. С.131-132.

195. Трошина В.М. Криоконсервирование гранулоцитов с диметилацетамидом: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 1981. 14 с.

196. Трошина В.М., Абезгауз H.H., Леонтович В. А. Применение диметилацетамида в качестве криопротектора при замораживании гранулоцитов // Проблемы гематологии и переливания крови. 1977. №5. С.50-53.

197. Тюрин P.B. Криоконсервирование костного мозга под защитой 3% раствора диметилацетамида: Автореф. дис ....канд.мед.наук. СПб., 1996. 25 с.

198. Утемов C.B. Низкотемпературное (-80°С) консервирование лейкоцитных концентратов (экспериментальное исследование): Автореф. дис .... канд. мед. наук. СПб., 2005. 23 с.

199. Утемов C.B., Сведенцов Е.П., Костяев A.A. Современные методы низкотемпературного консервирования лейкоцитов // Препараты крови и кровезаменители - производство, контроль и клиническое применение. Киров: Кировская обл. типография. 1995. С. 69-70.

200. Утемов C.B., Сведенцов Е.П., Костяев A.A., Новосадов В.М. Криоконсервирование лейкоцитов с новым ограждающим раствором // Материалы 6-й научной конференции молодых ученых «Вопросы трансфузионной и клинической медицины» 29-30 марта 1999 г. Киров. 1999. С. 28.

201. Утемов C.B. Методы выделения лейкоцитов для клинических целей // Препараты крови и кровезаменители - производство, контроль и клиническое применение. Киров: Кировская обл. типография. 1995. С. 68.

202. Федотенков А.Г. Консервирование косного мозга для клинических целей: Автореф. дис....докт.мед.наук. Москва., 1967. 43 с.

203. Фефелова И.В., Мхеидзе Д.М., Селидовкин Р. Д. и др. Криоконсервирование тромбоцитов с диметилсульфоксидом // Гематология и трансфузиология. 1991. №6. С.30-32.

204. Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа. 1993. С. 348-350.

205. Франке Ф. Вода и водные растворы при температурах ниже 0°С (Пер. с англ.) / Под рад. Ф. Франке. Киев: Наукова Думка. 1985. 387 с.

206. Фуллер Б., Грин К., Грищенко В.И. Криоконсервирование для создания банка клеток: современные концепции на рубеже XXI столетия // Проблемы криобиологии. 2003. №.2. С. 62-83.

207. Ханевич М.Д., Маринин A.B. Использование лейкоцитарной массы при лечении тяжелых форм разлитого перитонита // Доклады Российской конф «Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии. 1955. СПб. С.344-345.

208. Хвойнов Д. В. Применение мексидола в интенсивной терапии гнойных нейроинфекций у детей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Приложение 1. С. 91

209. Черненко Г.Т. Кровезаменители и их медицинское применение // В кн.: Руководство по трансфузионной медицине / под ред Е.П.Сведенцова. Киров. 1999. С. 630-641.

210. Чечеткин A.B., Вильянинов В.Н., Багаутдинов Ш.Б., Калеко С.П. Низкотемпературные технологии хранения клеток крови и костного мозга в современной трансфузиологии // Здравоохранение и медтехника. 2005. №4. С. 16-19.

211. Чуйко В. А. Механизмы криозащитной эффективности и фармакологические свойства ДМСО // Криобиология. 1989. № 1. С. 310.

212. Шевченко Ю.Л, Шабалин В.Н., Заривчацкий М.Ф, Селиванов Е.А. Руководство по общей и клинической трансфузиологии. СПб.: Фолиант, 2003.608 с.

213. Шраго М.И., Гучок М.М., Калугин Ю.В., Ханина Л.А. О некоторых путях создания криопротекторов // Проблемы гематологии и переливания крови. 1981. №6. С.3-6.

214. Щербаков П.В., Тельпухов В.И. Бессмертие под газом // Химия и жизнь. 2006. №8. С.34-39.

215. Цуцаева А. А., Аграненко В.А., Федорова Л.И. и др. Криоконсервирование клеточных суспензий / Под ред. А.А. Цуцаевой. Киев: Наукова думка. 1983. 240 с.

216. Цуцаева А. А., Попов А.Н., Воскобойникова Т.Н. и др. Криоустойчивость лимфоцитов крови и лимфоидных тканей // Консервирование крови и ее компонентов: Сб. мат-лов I Всесоюзн. симпоз. (Москва, 27-29 сентября, 1981 г.). М., 1981. С.75-77.

217. Цуцаева А.А., Котляров А.О., Кудокоцева О.В., Гордиенко А.Д.. Федец О.И. Механизмы индукции и репарации нелетальных криоповреждений // Цитология. 2004. Т. 46, №9. С. 879.

218. Яленский А.Ю. Функциональное состояние тромбоцитов, вышедших из криоанабиоза (—40°С): Автореф.дис....канд.мед.наук. Киров, 2007. 20 с.

219. Andersen К.С., Harris R.W., Chen К.К. Toxicological stadies on synthatic glycerin // J. Amer. Assoc. Sci. 1950. Vol 39, №8. P. 583-586.

220. Amir G., Horowitz L., Rubinsky В., Yousif B.S., Lavee J., Smolinsky A.K. Subzero nonfreezing ctyopresevation of rat hearst using antifreeze protein I and antifreerze protein III // Cryobiology. 2004. Vol. 48, №3. P. 273-282.

221. Asachina E. Cryobiology // Acad. Pres. N.Y. London, 1966. P.326-332.

222. Asahina E.Shimida K., Hisada Y.A. A stable state of frozen protoplasm with invisible intracellular ice crystals obtained by rapid cooling // Exp. Cell. 1970. Vol.59, №2. P.349-358.

223. Ashwood-Smith M.G. Preservation of mouse bone marrow at -79°C with dimethylsulphoxide //Nature. 1961. Vol 180, №4778. P. 1204-1205.

224. Babior B.M., Kipnes R.S., Curnutte J.T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent // J. Clin. Invest. 1973. Vol. 52. P. 741-744.

225. Babior Bernard M. Granulocytes in buffer with gelatin and plasma: Patent 589237. Austrulia, МКИ4 A 61 К 035/14, A 01 N 001/02/ New england medical center hospitals, inc. N 66279| 89. (или Granulocytes in buffer

with gelatin and plasma: Патент 589237. Австралия МКИ 4 A61K 035/14, A 01 N 001/02/ Babior Bernard M.; New England medical center hospitals, inc. N 66279/89.)

226. Barrett J. Thermal hysteresis proteins // Int.J.Biochem.Cell Biol. 2001. Vol.33, Issue 2. P. 105-117.

227. Batyuk L.V., Gatash S.V., Gorobchenko O.A., Nikolov O.T. Dielectric properties of human erythrocytes in normal and carcinogenic state // Вестник Харк. ун-та, №560, Биофизический вестник. Вып. 1 (10). 2002. С. 54-57.

228. Baust J., Van Buskirk R., Baust G. Cell viability improves following inhibition of cryopreservation-induced apoptosis // In Vitro Dev. Biol. Animal. 2000. Vol. 36, N4. P. 262-270.

229. Bernard A.G., Fuller B.J., Shaw R.W. The osmotic response of hyman and mouse oocytes following cooling: evidence of altered morphological characteristics // Cryoletters. 1990. Vol.11, №5. P.307-314.

230. Boonlayangoor P. Cryopreservation of Human Granulocytes: Study of Granulocyte Function and Ultrastructure / P. Boonlayangoor, M. Telischi, S. Boonlayangoor, T.F. Sinclair, E.W. Millhouse // Blood. 1980. Vol. 56. P. 237-245.

231. Borderie V., Lopez M., Lombet A., Carvajal-Gonzales S., Cywiner C., Laroche L. Cryopreservation and culture of human corneal keratocytes // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998. Vol. 39, N8. P. 1511-1519.

232. Borregaard N., Cowland J. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte // Blood. 1997. Vol. 89, N 10. P. 3503

233. Boy den S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leukocytes // J. Exp. Med 1962. Vol.115. P.453-465.

234. Burke M.J., Bryant R.G., Weiser C.J. Nuclear magnetic resonance of water in cold acclimated red osier djgwood stem // Plant Physiology. 1974. Vol.54, №2. P.392-398.

235. Bux J. Herstellung von Blutcomponenten // Zn: Transfusionsmedizin. C. Mueller-Eckhurut-Hrig. Berlin: Springer. 1996. S. 229-244.

236. Cairo M.S., Worchester C.C., Rucker R.W., Hanten S., Amile R.N., Sender L. Randomized trial of granulocyte transfusions versus intravenous immuneglobulin therapy for neonatal neutropenia and sepsis // J.Pediatr. 1992. Vol.120. P.281-285.

237. Carrol J., Wood M.J., Whittinham D.G. Normal fertilization and development of frozen-thawed mouse oocytes: protective action of certain macromolecules // Biol. Reprod.1993. Vol. 48. P. 606-612.

238. Chakrabartii A., Yang D.S., Hew C.L. Structure-function relationship in a winter flounder antifreeze polypeptide. II. Alteration of the component growth rates of ice by synthetic antifreeze polypeptides // J. Biol.Chem.

1989. Vol. 264, №19. P. 11313-11316.

239. Clark R.A. Extracellular effects of the myeloperoxidase-hydrogen peroxide-halide system // In: Weissmann G, ed. Advances in Inflammation Research. New York, NY: Raven Press. 1983. P. 107-146.

240. Clark R.A. The human neutrophil respiratory burst oxides // J. Infect. Dis.

1990. V. 161. №12. P. 1140-1147.

241. Clark R.A. Activation of the neutrophil respiratory burst oxides // J. Infect. Dis. 1999. Vol. 179. P. 309-317.

242. Crowley J.R., Rene A., Valery R.C. The recovery, structure and function of hyman blood leukocytes after freeze-preservation // Cryobiology. 1974. Vol.11, №3. P. 395-409.

243. Dalvit G.C., Cetica P.D., Beconi M.T. Effect of alpha tocopherol and ascorbic acid on bovine sperm in vitro fertilization // Theriogenology.1988. Vol. 49. №3. P. 619-627.

244. Dang P.M., Dewas C., Gaudry M., Fau M., Pedruzzi E., Gougerot-Pocidalo M.A., Eibenna J. Priming of human neutrophil respiratory burst by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) involves

partial phosphorylation of p47(phox) // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 20704-20708.

245. Diller K.R. Intracellular freezing: effects of extracellular supercooling // Cryobiology. 1975. Vol.12, №5. P.480-485.

246. Djurassi J., Roy A., Kim J., Cavins J. Demithylacetamide, a New Cryopotective Agent for Platelets // Transfusion. 1971. Vol. 11, № 2. P.72-76.

247. Doebbler D., Rowe A.W., Rinfert A.P. Freezing mammalian blood and its constituents // In: Cryobiology ed by H.I.Merymen. London-N.York. 1966. P.407-450.

248. Dutheil D., Underhaug G., Petit-Paris I., Mauco G., Holmsen H. Polyethylene glycols interact with membrane glycerophospholipids: is this part of their mechanism for hypothermic graft protection // J. Chem. Biol. 2009. Vol.2, №1. P. 39-49.

249. Farrant J. Mechanism of cell damage during freezing and thawing and its preservation//Nature. 1965. Vol. 205. P. 1284.

250. Farrant J., Morris GJ. Thermal shock and dilution shock as the causes of freezing injury // Cryobiology. 1973. Vol.10, №2. P. 134-140.

251. Farrant J., Walter C.A., Lee H., McGann L.E. Use of two-step procedure to examine factors influencing cell survival following freezing and thawing // Cryobiology. 1977. Vol.14, №3. P.273-286.

252. Golovchenko V.V., Ovodova R.G., Shashkov A.S., Ovodov Yu.S. Structural studies of the pectic polysaccharide from duckweed Lemna minor L. // Phytochemistry. 2002. Vol 60. P. 89-97.

253. Grant C.K. A simple method for the cryopreservation of lymphocytes. Retention of specific immune effector functions by frozen-stored cells // Clinical Experimental Immunology. 1976. Vol.23, № 1. p. 166-174.

254. Graumann P.L., Marahiel M.A. A superfamily of proteins that contain the cold-shock domain // Trends Biochem. Sci. 1998. Vol. 23. P. 286-290.

255. Haston W.S., Wilkinson P.S. Visual methods for measuring leukocyte locomotion//Meth. Enzymol. 1988. Vol. 162. P. 17-38.

256. Hayhoe F.G.J., Quaglino D. Haematological Cytochemistry. Churchill Livingston. Edinburgh, London. New York. 1980. P. 55-56.

257. Karrow A.M.Jr., Webb W.R. Tissue freezing. A theory for injury and survival // Cryobiology. 1965. №2. P. 99-108.

258. Klein E., Lyman R.B., Peterson L., Berger R.I., Smith O.K. Effect of dimethylsulphoxide on lipiproyeins stored at low temperatures // Cryobiology. 1967. Vol.4, №3. P.328-334.

259. Laroche V., McKenna D., Moroff G., Schierman T., Kadidlo D., McCullough J. Cell loss and recovery in umbilical cord blood processing: a comparison of postthaw and postwash samples // Transfusion. 2005. Vol.45, №12. P. 1909-1916.

260. Lee R. E. Insect cold-hardiness: to freeze or not to freeze? How insects survive low temperatures // Bioscience. 1990. № 39. P. 308-313.

261. Leca G., Benichou G., Bensussan A., Mitenne F., Galanaud P., Vazguez A. Respiratory burst in human B lymphocytes. Triggering of surface Ig receptors induces modulation of Chemiluminescence signal // J. Immunol. 1991. Vol. 146. P. 3542-3549.

262. Leibo S.P. Water permeability and ist activation energy of fertilized and unfertilized mouse ova // J. Membrane Biol. 1980. Vol.53, №3. P. 179-188.

263. Levitt J. Criobiology. London: Acad. Press. N.Y. 1966. P. 495.

264. Levitt J.A. The roll of SH and SS-groups in resistance of cells to high and low temperatures // In: The cell and environmental temperature ed by A.S. Troshin, Pergamon Press. 1967. P. 269-274.

265. Lindguist S. The heat shock response // Ann.Rev.Biochem. 1986. №55. P. 1151-1191.

266. Lionetti F.J., Hunt S.M., Gore J.M., Curby W.A. Cryopreservation Of Human Granulocytes//Cryobiology. 1975. Vol. 12. P. 181-191.

267. Liu K.Y., Dong W.C., Wang Y.L., Jiang Y.J., Gao Z.Y., Huang N.W., Lu D.P. Study on non-programmed process using dimethyl sulfoxide and hydroxyethyl starch as cryoprotectants in cryopreservation of cord blood hematopoietic cells // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2004. Vol. 12, №5. P. 670-673.

268. Livesey S.A., Buescher E.S., Krannig G.L., Harrison D.S., Linner J.G., Chiovetti R. Human neutrophil granule heterogeneity: immunolocalization studies using cryofixed, dried and embedded specimens // Scanning Microsc. Suppl. 1989. Vol.231, №9. P. 239-240.

269. Loncar D., Bedrica L., Mayer J., Cannon B., Nedergaard J.A., Afzelius B/A., Svajger A. The effect of intermittant cold treatment of the adipose tissue of the cat. Apparent transformation from write to brown adipose tissue // J. Ultrastruct. and Mol. Struct. Res. 1986. Vol. 97, №1-3. P. 119-129.

270. Lovelock J. E. The mechanism of the protective action of glycerol against haemolysis by freezing and thawing // Biochim. et Biophys. Acta. 1953. Vol.11 P. 28-36.

271. Lovelock J. E. Physical instability and thermal shock in red cells // Nature (London). 1954. Vol.173. P. 650-661.

272. Lund P.K., Joo G.B., Westvik A.B., Ovstebo R., Kierulf P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years experience // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2000. Vol.60, №5. P. 357-365.

273. Luo K., Wu G., Wang Q., Sun Y., Liu H. Effect of dimethylsulfoxide and hydroxyethyl starch in the pteservation of fractionated human marrow cells // Cryobiology. 1994. Vol. 31, №4. - P. 349-354.

274. Lusena C.V. Release of enzymes from rat liver mitochondria by freezing // Canad. J. Biochem. 1965. Vol.43. P. 1787-1798.

275. Luyet B J. Physical changes occurring in frozen solutions during rewarming and melting // The Frozen Cell. London. 1970. P.27-43.

276. Lyons J.M. Phase transitions and control of cellular metabolism at low temperatures // Cryobiology. 1972. №9. P.341-350.

277. Makino M., Baba M. A cryopreservation method of human peripheral blood mononuclear cells for efficient production of dendritic cells // Scand. J. Immunol. 1997. Vol.45. P.618-622.

278. Maruyama M., Kenmochi T., Sakamoto K., Arita S., Iwashita C., Kashiwabara H. Simplified method for cryopreservation of islets using hydroxyethyl starch and dimethylsulfoxide as cryoprotectants // Transplant. Proc. 2004. Vol. 36, №4. P. 1133-1134.

279. Mazur P. Physical factors implicated in the death of microorganisms // Ann. New York Acad. Sci. 1960. Vol. 85. P. 610-629.

280. Mazur P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing // J. Gen. Physiol. 1963. Vol. 47, №3. P. 347-369.

281. Mazur P. The role of cell membranes in the freezing of yeast and other ' single cells // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1965. Vol. 125. P. 658-652.

282. Mazur P. Theoretical and experimental effects of cooling and warming velocity on the survival of frozen thawed cells // Cryobiology. 1966. Vol. 2, №2. P. 181-192.

283. Mazur P., Farrant J., Leibo S.P., Chu E.H. Survival of hamster tissue culture cells after freezing and thawing: interactions between protective solutes and thawing : warming rates // Cryobiology. 1969. Vol. 6, №1. P. 1-19.

284. Mazur P. Cryobiology. The freezing of biological system // Science. 1970. Vol. 169, №5135. P. 939-949.

285. Mazur P., Leibo S.P., Chu E.H. Two-factors hypothesis of freezing injury-evidence from chines hamster tissue culture cells. Exp.Cell.Res // 1972. Vol. 71, №2. P. 345-355.

286. Mazur P. Freezing of living cells: mechanism of implication in injury // Cell Physiol. 1984. Vol. 16, №1. P. 125-142.

287. Mazur P., Cole K.W. Roles of unfrozen fraction, salt concentration, and changes in cell volume in the survival of frozen human erythrocytes // Cryobiology. 1989. Vol. 26, №1. P. 1-29.

288. Meryman H.T. Freeze-drying // Cryobiology (Meryman H.T. ed). London-New Yore: Acad. Press. 1966. P. 609-663.

289. Meryman H.T. Observations on the present state of blood preservation by freezing//Cryobiology. 1968. Vol. 5. P. 144.

290. Meryman H.T. The exceeding of a minimum tolerable cell volume in hypertonic suspensions as a cause of freezing injury // In: The Frozen Cell. Churchill. London. 1970. P. 51-63.

291. Meryman H.T. Crioprotective agents // Cryobiology. 1971. Vol. 3, № 2. P. 173-183.

292. Meryman H.T. Red cell membrane changes produced by extracellular cryoprotectans and allied compounds // Cryobiology. 1971. Vol. 8, №4. P. 401-408.

293. Meryman H.T. Osmotic stress as a mechanism of freezing injury // Cryobiology. 1971. Vol. 8, №5. P. 489-500.

294. Meryman H.T. Freezing injure and its prevention in living cells // Annu. Rev. Biophysical and Bioeng. 1974. №3. P. 341-363.

295. Miller D. Heat-shock proteins to the rescue // New Scientist. 1989. №1. P. 47-50.

296. Miller R.H., Mazur P. Survival of frozen-thawed human red cells as a function of cooling and warming velocitie // Cryobiology. 1976. Vol. 13, №4. P. 404-414.

297. Moiseyev V.A., Nardid O.A., Belous A.M. On a possible mechanism of the protective action of cryoprotectans // Cryoletters. 1982. Vol.3, №1. P. 17-26.

298. Morris G.J. In: Effect of low temperatures in biological membranns (G.J. Morris and A. Clarke). London: Academs. Press. 1981. P. 241-262.

299. Moor H. Die gefrier-fixation lebender zellen und ihre anwenduhg in der elektronenmikroskopie //Z.Zellforsch. 1964. Vol.62, №6. P. 546-580.

300. Mori Y., Suzuki H., Nei T. Freezing injury in the yeast respiratory system // Cryobiology. 1986. Vol.23, №1. P. 64-71.

301. Nei T. Electron microscopic study of microorganisms subjected to freezing and drying: cinematographic observations of yeast and coli cells // Exp. Cell. Res. 1962. №28. P. 560-575.

302. Nei T. Mechanism of haemolysis of erytrocytes by freezing at near zero temperatures. I. Microscopic observation of haemolyzing eryhrocytes during the freezing and thawing process//Cryobiology. 1968. Vol 4. P. 153-156.

303. Nei N. Ffreezing injury to eryhricotes. I. Ffreezing patterns and post-thaw hemolysis // Cryobiology. 1976. Vol 13, №3 P. 278-286.

304. Nei N. Ffreezing injury to eryhricotes. II. Morfological alterations of cell membranes // Cryobiology. 1976. Vol 13, №3 P. 287-294.

305. Nelson R.D., Quie P.G., Simmons R.L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring Chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes // J.Immunol. 1975. Vol. 115. P.1650-1656.

306. Neppert J. Therapie mit Granulozyten// Transfusions - medizin, Berlin: Verlog- Springer. 1996. S. 339-344.

307. Pennell C.A. Heat shock proteins in immune response in the Fall of 2004 // Immunology. 2005. Vol. 114, №3. P. 297-300.

308. Petrenko A.Yu, Subbota N.P. Inhibition on the activity of mitochondrial electron transport chain by low temperature: losses of cytochrome C // Cryo-Letters. 1986. №7. P.395-402.

309. Polge C., Lovelock J.E. Preservation of but semen at -79°C // Vet.Rec.1952. Vol 64. P. 396-398.

310. Pritchard D.E, Singh J., Carlisle D.L, Patierno S.R. Cyclosporin A inhibits chromium(VI)-induced apoptosis and mitochondrial cytochrome c release and restores clonogenic survival in CHO cells // Carcinogenesis. 2000. Vol. 21, №11. P. 2027-2033.

311. Pushkar N.S., Itkin Yu.A., Bronshtein V.L., Gordiyenko E.A., Kozmin Y.V. On the problem of dehydration and intracellular crystallization during freezing of cell suspension // Ibid. 1976. V.13, №2. P. 147-152.

312. Rail W.F., Reid D.S., Farrant J. Innocuous biological freezing during rewarming // Nature. 1980. Vol 286, №5772. P. 511-514.

313. Rapatz G., Luyet B. Microscopic observations on the development of the ice phase in the freezing of blood // Biodynamica. 1960. Vol. 8, №166. P. 195239.

314. Rapatz G., Sullivan J., Luyet B. Preservation of erythrocytes in blood containing various cryoprotective agents, frozen at various rates and brought to a given final temperature // Cryobiology. 1968. Vol 5, №1. P. 18-25.

315. Rapatz G., Luyet B. Hemolysis in several animals species after rapid freezing of blood // J. Cell. Phsiol. 1971. V.77, №3. P.373-376.

316. Rapatz G., Luyet B., MacKenzie A. Effect of cooling and rewarming rates on glycerolated hyman erythrocytes // Cryobiology. 1975. Vol 12, №4. P. 223-208.

317. Rey L. Conservation de la vie par le froid. Paris. 1959. 204 p.

318. Rowe A., Cohen E. Phagocytic activity and antigic inferity of leukocytes preserved with DMSO at a cryogenic temperature (-196°C) // Vox.Sang., 1965. V.10,№3. P. 382-384.

319. Sakai A. Some factors contributing to the survival of rapidly cooled plant cells // Cryobiology. 1971. Vol 8, №2. P. 225-234.

320. Schreck R. A method for counting the viable cells in normal and malignant cell suspension // Ann. J. Cancer. 1936. Vol.28. P.389-391.

321. Scotter A.J., Marshall C.B., Graham L.A., Gilbert J.A., Garnham C.P., Davies P.L. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins // Cryobiology. 2006. Vol 53, №2. P. 229-239.

322. Sekkat C., Dornand J., Gerber M. Oxidative phenomena are implicated in human T-cell stimulation//Immunology. 1988. Vol. 63. P. 431-437

323. Sheleg S., Hixon H., Cohen В., Lowry D., Nedzved M. Cardiac mitochondrial membrane stability after deep hypothermia using a xenon clathrate cryostasis protocol an electron microscopy study // Int. J. Cin. Exp. Pathol. 2008. №1. P. 440-447.

324. Sherman J. R. Effects of size of intracellular ice on consumption of oxygen and nuclear alteration of mouse kidney cells // Anat. Res. 1964. Vol. 149, №3. P. 591-596.

325. Siegenthaler R.K., Christen P. The importance of having thermosensor control in the DnaK chaperone system // J. Biol. Chem. 2005. № 10. P. 8057.

326. Smith A.U., Smiles T. Microscopic studies of mammalian tissues during cooling to -79°C // T.Roy. Miroscop. Soc. 1953. V. 231. P. 134-139.

327. Smith A.U. Biological effect of freezing and supercooling // Baltimore, Williams and Wilkins. 1961. 104 p.

328. Smit О. Биологическое действие замораживания и охлаждения. Москва: ИЛ, 1963. 503 с.

329. Srivastava Р.К. Immunotherapy for human cancer using heat shock protein-Peptide complexes // Curr. Oncol. Rep. 2005. Vol. 7, №2. P. 104-108.

330. Stiff P.J., Murgo J.A., Zarolus C.G. Unfractionated human marrow cells cryopreservation using dimethylsulfoxide and hydroxyethyl starch // Cryobiology. 1987. Vol. 20. P. 17-24.

331. Storey K.B. Freeze-incluced gene expression in vertebrates // Cryo-98, 35-th Annual Meeting of the Society for Cryobiology. Pittsburg, Pensylvania, USA.1998. P.167.

332. Svedentsov E.P., Archireyev V.P., Simkin D.S., Kuznetsov E.V. Cryoprotectiveagent to freeze bone marrow // Infusiontherapie and Transfusionsmedicine, 1997. B.24, H.4. S. 233.

333. Takahashi T, Hirsh A. Calorimetric studies of the state of water in deeply frozen human monocytes // Biophys. J. 1985. Vol. 47, №3. P. 373-380.

335.

336.

337.

338.

339.

340.

341.

Taylor M.J., Bank H.L. Function of lymphocytes and macrophages after cry ©preservation by procedures for pancreatic islets: potential for reducing tissue immunogenicity // Cryobiology. 1988.Vol. 25, №1. - P. 1-17. Tsvetkov T., Nickolov C., Buckureshtliev A., Mincheff M., Tsoney L., Terziev R., Popov D. Isolation and cryopreservation of human peripheral blood monocytes // Cryobiology. 1986. Vol. 23, №6. P. 531-536. Vali G., Lee E Jr., Warren G.J., Gusta L.V. Principles of ice nucleation // Biological ice nucleation and its applications. St. Paul: APS Press, 1995. P.

Vingerhoets J., Vanham G., Kestens L., Gigase P. A convenient and economical freezing procedure for mononuclear cells // Cryobiology. 1995. Vol. 32, №1. P. 105-108.

Wang J.H., Bian H.W., Zhang Y.X., Cheng H.P. The dual effect of antifreeze protein on cryopreservation of rice (Oryza sativa L.) embryogenic suspension cells// Cryoletters. 2001. Vol. 22, №3. P. 175-182. Wang J.H. A comprehensive evaluation of the effects and mechanisms of antifreeze proteins during low-temperature preservation // Cryobiology. 2000. Vol. 41, №1.-P. 1-9.

Williams W.P. Low temperature and dehydration-induced changes in lipid phase behaviour temperature preservation // Cryobiology. 1985. Vol. 22. P.

Wouters J.A., Rombouts F.M., Kuipers O.P., de Vos W.M., Abee T. The role of cold-shock proteins in low-temperature adaptation of food related bacteria//Syst. Appl. Microbiol. 2000. Vol. 23. P. 165-173. Zhang Quiyang, Tiersch T. R. Cryopreservation of leukocytes of channel catfish gor subsequent cytogenetic analysis// J. Fish Biol. 1995. P.1016-