Влияние нативного яда некоторых представителей аспидовых змей на реологические свойства крови тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Савушкин, Андрей Владимирович

• Савушкин, Андрей Владимирович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Савушкин, Андрей Владимирович

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ЭКОЛОГИЯ РОДА НАСТОЯЩИХ КОБР (NAJA)

1.2. ХАРАКТЕРИСТИКА И СОСТАВ ЯДА КОБР

1.3. КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА ОТРАВЛЕНИЯ

1.4. ВОЗДЕЙСТВИЕ ЯДА И ЕГО КОМПОНЕНТОВ НА КРОВЬ

1.4.1. Воздействие яда и его компонентов на эритроциты

1.4.2. Действие яда на свёртывающую систему крови

1.5. ГЕМОРЕОЛОГИЯ И ЕЁ ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ

1.5.1. Вязкость крови и определяющие её факторы

1.5.2. Вязкость плазмы

1.5.3. Эритроцитарная агрегация

1.5.4. Деформируемость эритроцитов

1.6. РЕОЛОГИЯ И ГЕМОДИНАМИКА

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

2.2. МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

2.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НАТИВНОГО ЯДА НА РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРОВИ IN VITRO

3.1. ИЗМЕНЕНИЕ РЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРОВИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПОСЛЕ ЕЁ ИНКУБАЦИИ С НАТИВНЫМ ЯДОМ КОБРЫ

3.2. ИЗМЕНЕНИЕ РЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРОВИ ПРАКТИЧЕСКИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ ПОСЛЕ ЕЁ ИНКУБАЦИИ С НАТИВНЫМ ЯДОМ КОБРЫ

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НАТИВНОГО ЯДА НА РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРОВИ IN VIVO

4.1. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ЭКСПЕРИМЕНТА НА РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРОВИ КРЫС

4.2. ИЗМЕНЕНИЕ РЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРОВИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПОДВЕРГНУТЫХ ВОЗДЕЙСТВИЮ НАТИВНОГО ЯДА КОБРЫ

ГЛАВА 5. КОМПЬЮТЕРНАЯ ФАЗОМЕТРИЯ ЭРИТРОЦИТОВ

ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

5.1.РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ КРИТЕРИЕВ ОЦЕНКИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ИНТАКТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И КРЫСЫ

5.2.ХАРАКТЕРИСТИКА МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ФАЗОВО-ИНТЕРФЕРЕНЦИОННЫХ ИЗОБРАЖЕНИЙ ИНТАКТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И КРЫС

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

124

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЦНС - центральная нервная система; МАП - мембрано-активные полипептиды; ПЛФ - прямой литический фактор; Ht - гематокрит;

ЭФП - электрофоретическая подвижность;

НЬ - гемоглобин;

АТФ - аденозин-5'-трифосфат;

LD50 - средняя смертельная доза;

КФМ - компьютерный фазовый микроскоп;

Dmax - максимальный диаметр фазового образа клетки;

Per - периметр фазового образа клетки;

Vol - объем фазового образа клетки.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние нативного яда некоторых представителей аспидовых змей на реологические свойства крови»

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Ежегодно на земле, по данным Всемирной организации здравоохранения, от змеиных укусов страдает около 1000000 человек из них 50000 погибают, а часть из оставшихся становятся инвалидами [Бердыева А.Т., 1994]. Это определяет необходимость глубокого изучения характера повреждающего действия зоотоксинов на различные системы органов человека для выявления спектра средств и способов специфического и неспецифического воздействия на организм пострадавшего.

Общим является мнение, о том что под влиянием яда кобр развивается комплекс реакций, вызывающих существенные изменения метаболической и функциональной активности клеток красной крови. При этом своеобразие наблюдаемых эффектов зависит главным образом от состояния эритроцитарной мембраны и внутренних эритроцитарных факторов, степень повреждения которых находит объективное отражение в нарушении реологии крови.

Фундаментальные исследования А.М.Чернуха (1975) позволили установить, что реологические свойства крови - вязкость, способность эритроцитов образовывать крупные и устойчивые агрегаты, а также способность эритроцитов к деформации при прохождении через капилляры, диаметр которых меньше их собственного, в значительной мере влияют на состояние микро- и макрогемодинамики. Несмотря на то, что эти показатели во многом определяют интегральную картину отравления, в литературе имеются лишь отдельные, не систематизированные, сведения о гемореоло-гических расстройствах при интоксикации ядами змей [Корнеева Н.В., 1986, Орлов Б.Н., 1987].

В связи с этим проведение широкого круга исследований реологии крови при интоксикации ядами змей продиктовано не только практической необходимостью, но имеет и немаловажное

теоретическое значение. Это объясняется тем, что гемореологи-ческие расстройства, в частности повышение вязкости крови и склонность эритроцитов к образованию агрегатов, лежат в основе нарушения микроциркуляции жизненно важных органов и являются одной из ведущих причин их функциональной недостаточности. Детальное исследование изменений реологических особенностей крови под влиянием природных химических раздражителей, с которыми человек сталкивается в процессе естественных взаимоотношений с природой, поможет полнее установить возможные последствия и определить наиболее эффективные пути их коррекции в условиях действия биотических эколого-химических факторов окружающей среды.

Кроме этого немаловажное значение имеет развитие и расширение арсенала новейших методов исследования, являющихся неотъемлемым условием научного прогресса. Современные требования к аппаратуре подобного рода заключается в высокой чувствительности, точности, простоте, экспрессности и обеспечении автоматизированной оценки полученных результатов.

Достаточно перспективной в этом отношении является компьютерная морфометрия, основанная на комплексном оптико-геометрическом подходе к анализу морфофункциональных характеристик форменных элементов периферической крови, которые во многом определяют её реологические свойства [Жукоцкий А. и др., 1992; Коган Э.М. и др., 1994].

Всё вышеизложенное определяет актуальность выбранного направления исследований, а использование новых более совершенных и высокочувствительных методов анализа позволяет установить неизвестные ранее особенности реакции организма на воздействие зоотоксинов.

Целью настоящего исследования является изучение изменения реологических свойств крови при остром отравлении натив-ным ядом красной кобры (Naja pallida).

В соответствии с этой целью представлялось важным уделить внимание решению следующих конкретных задач:

1.Определить токсичность используемого яда;

2.Изучить изменение основных реологических показателей периферической крови при действии различных доз нативного яда Naja pallida в экспериментах in vitro;

3.Изучить изменение основных реологических показателей периферической крови при действии различных доз нативного яда Naja pallida в экспериментах in vivo;

4.Изучить особенности морфофункционального состояния эритроцитов в норме и при интоксикации с использованием методов сканирующей электронной микроскопии и прижизненной компьютерной фазометрии;

5.Установить наиболее существенные и информативные показатели, определяющие характер ответной реакции эритроцитов, на основе анализа динамики их фазовых изображений;

6.Показать возможность практического использования метода прижизненной компьютерной фазометрии для объективной оценки степени морфофункциональных нарушений эритроцитов в условиях интоксикации, прогнозирования возможных последствий и определения эффективных способов коррекции выявленных нарушений.

Научная новизна работы. Представленная работа выполнена с использованием нативного яда змей Naja pallida.

Впервые проведён сравнительный анализ изменений реологических свойств крови в динамике интоксикации при действии различных доз нативного яда Naja pallida в системах in vitro и in vivo;

Апробирована технология прижизненной компьютерной фазовой морфометрии на основе принципиально нового компьютерного фазово-интерференционного микроскопа "Цитоскан", включающая способ подготовки исследуемых препаратов, алгоритмы анализа изображений эритроцитов, методов статистической обработки данных.

Проведена комплексная оценка морфофункционального статуса эритроцитов периферической крови человека и крыс в норме и при интоксикации на основе многомерного анализа метрических и динамических оптико-геометрических показателей, объективно отражающих состояние клеточного гомеостаза.

Впервые получены прижизненные спектральные характеристики фазовых изображений эритроцитов в норме и при воздействии нативного яда. Установлены конкретные частоты, отражающие степень нарушения метаболической активности клеток красной крови при интоксикации в условиях in vivo и in vitro.

Научно-практическая ценность. Выявлены особенности влияния нативного яда аспидовых змей на реологические свойства крови и установлена зависимость динамики развития гемореоло-гических нарушений от времени и уровня интоксикации.

Полученные результаты расширяют существующие представления об общих механизмах действия яда Naja pallida с учетом клеточного и субклеточного уровней реализации регистрируемых токсических реакций, позволяют оценить роль компенсаторно-

приспособительных возможностей живого организма в условиях прогрессирующей интоксикации.

Метод прижизненной фазовой морфометрии клеток периферической крови может быть использован в практике для проведения цитодиагностики развития токсических состояний, а также при оценке эффективности и адекватности проводимых лечебных мероприятий.

Основные положения выносимые на защиту.

1.В патогенезе токсических состояний при отравлении ядами змей важная роль отводится нарушению гемореологических свойств периферической крови, которые являются объективным показателем тяжести состояния и стадии развития интоксикации у реципиента.

2.Метрические и динамические параметры фазовых изображений эритроцитов периферической крови объективно отражают морфо-функциональное состояние живых цитообъектов и могут служить показателями состояния нормы и степени отклонения от неё.

3.Реакции эритроцитов на времязависимое действие натив-ного яда Naja pallida в системах in vivo и in vitro носит различный характер.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на международном симпозиуме "Биологическая подвижность: Современные методы исследования" (Пущино, 1998); XVI научно-практической конференции «Морфо-метрия в диагностике болезней» (Москва, 1998); семинаре кафедры биофизики МГУ им. М.В. Ломоносова «Фазометрия клеток периферической крови» (1999).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 рисунком и 17 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, трёх глав, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждение, общего заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 55 отечественных и 121 зарубежных источников.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Савушкин, Андрей Владимирович

124 ВЫВОДЫ

1. Установлено, что под влиянием нативного ядовитого секрета красной кобры развивается комплекс гемореологических нарушений, проявляющийся в изменении структурной и динамической вязкости крови, снижении агрегационной активности и деформируемости эритроцитов.

2. В экспериментах in vitro показано, что характер изменения реологии крови после её инкубации с нативным ядом Naja pallida зависит от дозы яда. Действие сублетальной дозы используемого секрета ядовитых желёз (0,02LD50) вызывает уменьшение структурной вязкости крови вследствие снижения агрегационной активности эритроцитов без изменения их деформационных свойств. Действие летальной дозы яда (2LD50) приводит к увеличению вязкости крови, в основе которой лежат снижение деформационной способности эритроцитов, пойкило-цитоз и гемолиз.

3. В экспериментах in vivo установлено, что острое отравление нативным ядом кобры приводит к увеличению вязкости крови, снижению агрегационной активности, уменьшению деформационной способности эритроцитов и повышению гематокрита. Разнонаправленность изменения таких показателей, как вязкость крови и агрегация эритроцитов, свидетельствует о специфичности механизма воздействия используемого секрета ядовитых желёз на систему крови, в частности, на белки плазмы. При этом степень гемореологических нарушений находится в прямой зависимости от времени и уровня интоксикации.

4. Реализация токсических эффектов используемого ядовитого секрета сопровождается стереоструктурными повреждениями эритроцитов. Это приводит к изменению популяционного состава клеток красной крови: снижению количества нормоцитов, увеличению числа эхиноцитов и появлению деформированных форм клеток.

5. Действие нативного яда находит объективное отражение в прижизненном изменении метрических параметров фазовых изображений эритроцитов: времязависимом уменьшении диаметра, периметра и увеличении фазовой высоты клеток в опытах in vitro и in vivo.

6. Характер изменений динамических показателей фазовых изображений эритроцитов позволяет оценить уровень перестройки внутриклеточных процессов в условиях токсического воздействия секрета ядовитых желёз кобры. В экспериментах in vitro выявлено времязависимое тотальное снижение мощности клеточного спектра, отражающее процесс трансформации диско-цитов в эхиноциты и связанное с повышением регидности мембран эритроцитов. В системе in vivo - незначительное снижение интенсивности характерных частот с увеличением ппотности гармонических компонент спектра в диапазоне 2-4, 14-16 Гц на терминальной стадии интоксикации.

7. Разработан комплекс критериев прижизненной оценки морфо-функционального статуса эритроцитов периферической крови на основе комбинации метрических (диаметр, периметр, высота, площадь, объем) и динамических (Фурье-спектр) показателей их фазовых изображений, который может быть использован для дискриминации измененных клеток при анализе степени воздействия на организм факторов окружающей среды, в частности, ядов змей.

126

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Изучение биологически активных веществ, с помощью которых живые организмы воздействуют друг на друга в природе, давно привлекает внимание многих исследователей. К этой категории относятся и ядовитые секреты змей, сведения о биологических свойствах и действии которых широко представлены в работах отечественных и зарубежных авторов [Сахибов Д.Н., Сорокин

B.М., Юкельсон Л.Я., 1972; Орлов Б.Н., Вальцева И.А.,1977; Lee

C.Y. et al., 1979].

Современная физиология позволяет расширить наше представление о механизмах действия зоотоксинов, новых сторонах их биологической активности, ранее не известных свойствах ядовитых секретов. Однако ряд вопросов остается еще не до конца изученным. Так, практически не исследованным к настоящему времени является действие животных ядов на реологические свойства крови.

В литературе практически полностью отсутствуют сведения относительно тех закономерностей, согласно которым развиваются гемореологические расстройства при остром отравлении ядами аспидовых змей. Не выявлена специфичность основных проявлений гемореологических нарушений и степень гемореологических сдвигов в зависимости от особенностей патогенеза и тяжести отравления.

Следует подчеркнуть, что общая оценка показателей гемо-реологии при интоксикации ядами змей и определение механизмов, приводящих к изменению текучести крови - проблемы чрезвычайно актуальные. Это обусловлено тем, что при укусах кобры вследствие преобладающего воздействия яда на центральную и периферическую нервную систему на первый план выступают общие симптомы интоксикации, маскирующие нарушения реологических свойств крови.

Также необходимо отметить, что изменяя биофизические характеристики кровотока, реологические свойства крови в некоторых случаях могут являться одним из звеньев патогенеза основного заболевания, в других - усугублять его течение вплоть до развития недостаточности функциональных систем организма [Александрова Н.П., 1987].

Всё это послужило основанием для проведения настоящей работы, целью которой являлось изучение изменения реологических свойств крови при остром отравлении нативным ядом красной кобры (Naja pallida).

В соответствии с поставленной целью нами решались задачи по определению токсичности используемого яда и изучению изменений основных реологических показателей периферической крови при действии различных доз нативного яда Naja pallida в системах in vivo и in vitro. Была проведена сравнительная оценка морфо-метрических параметров эритроцитов в норме и при интоксикации с использованием методов сканирующей электронной микроскопии и прижизненной компьютерной фазометрии; установлены наиболее существенные и информативные показатели, определяющие характер ответной реакции эритроцитов, на основе анализа динамики их фазовых изображений; показана возможность практического использования метода прижизненной компьютерной фазометрии для объективной оценки степени морфофункциональных нарушений эритроцитов в условиях интоксикации, прогнозирования возможных последствий и определения эффективных способов коррекции выявленных нарушений.

Представленная работа выполнена с использованием нативного яда Naja pallida. Материалом для исследований служила кровь белых нелинейных крыс и практически здоровых людей.

Для разрешения поставленных задач в работе были использованы методы определения вязкости крови, агрегационной активности эритроцитов, гематокрита, деформируемости эритроцитов. Для установления механизма полученных изменений исследовали особенности клеточной поверхности и формы эритроцитов при помощи сканирующей электронной микроскопии. Кроме того, нами была апробирована оригинальная технология прижизненной компьютерной фазовой морфометрии цитологических объектов, позволяющая проводить комплексную оценку морфофункциональ-ного статуса клеток красной крови в норме и в условиях интоксикации используемым зоотоксином.

В рамках очерченных задач в настоящем исследовании получены 3 группы результатов, представляющих определённое теоретическое и практическое значение. Во-первых, в динамике изучен комплекс реологических изменений крови белых нелинейных крыс и практически здоровых людей, подвергшейся воздействию нативного яда кобры в системе in vitro.

Проведённые исследования показали, что многокомпонентный состав яда в организме оказывает одновременное и подчас разнонаправленное влияние на все (или почти все) реологические параметры крови.

Установлено, что действие ядовитого секрета кобры в условиях in vitro, в дозе 0,02LDso вызывает снижение структурной вязкости крови и угнетение агрегационной активности эритроцитов без изменения их деформационных свойств. Данные изменения наблюдались как у человека, так и экспериментальных животных только при 5-минутной инкубации. Увеличение времени токсического воздействия 0,02LD5o нативного яда до 30 минут и 1 часа приводит к повышению структурной и динамической вязкости крови, снижению агрегационной активности эритроцитов и снижению их деформируемости.

Инкубация периферической крови человека и экспериментальных животных с летальной дозой нативного зоотоксина (2LD50) на всех этапах наблюдения вызывает повышение структурной и динамической вязкости крови, снижение агрегационной активности и деформируемости эритроцитов. При больших сроках инкубации эти изменения микрореологических свойств эритроцитов и текучести крови выражены наиболее ярко.

Анализ экспериментальных данных выявил наличие достоверной взаимосвязи между гемореологическими нарушениями и изменениями морфологии эритроцитов при действии ядовитого секрета Naja pallida.

Морфологические исследования показали, что под влиянием используемого нативного зоотоксина эритроциты человека и крыс трансформируются из дискоцитов в эхиноцитоподобные клетки. Причина наблюдаемых изменений, вероятно, связана со снижением уровня АТФ и блокадой или угнетением работы Са2+,Мд2+-АТФазы [Fourie A.M. et a I., 1983]. Это приводит к повышению концентрации внутриклеточного Са2+ и увеличению регидности эритроцитов [Сорокова В.И. и др., 1994]. По мере увеличения сроков инкубации отмечается прогрессирующее ухудшение морфологического состояния эритроцитов и их реологических свойств, о чем свидетельствует снижение фильтруемости, и гемолиз красных клеток крови.

Полученный экспериментальный материал даёт основание предположить возможные механизмы изменения вязкости крови при воздействии нативного ядовитого секрета Naja pallida в условиях in vitro.

В основе увеличения вязкости под действием зоотоксина лежит снижение деформационной способности эритроцитов, пойкилоцитоз, и гемолиз красных клеток крови.

Наблюдаемая картина гемореологических изменений отличается от таковой при классическом синдроме гипервязкости, причиной которого является усиление агрегации и снижение деформируемости эритроцитов при условии сохранённого белкового компонента плазмы крови.

По-нашему мнению, объектами, наиболее чувствительными к действию нативного яда Naja pallida являются, в первую очередь, белки и липиды плазмы, а также мембраны эритроцитов. В пользу этого свидетельствует отсутствие агрегационного процесса в исследованных образцах крови, обязательным условием которого является наличие фибриногена и других высокомолекулярных белков. На этом фоне изменяются эластические свойства красных клеток. Они становятся жёсткими и увеличивают вязкость крови прямо пропорционально их количеству и качеству. Кроме того, на повышение степени вязкости крови большое влияние оказывает ярко выраженный пойкилоцитоз. Появление в результате действия нативного яда регидных сфероэхиноцитов сопровождается их разрушением и выходом свободного гемоглобина в кровоток, также способствующего увеличению вязкости цельной крови.

Выявленное увеличение вязкости крови, снижение деформируемости и подавление агрегационной активности эритроцитов наблюдались не только в опытах in vitro, но и при экспериментальной интоксикации, о чём свидетельствует вторая группа результатов. Установлено, что при внутрибрюшинной инъекции крысам нативного яда Naja pallida подобный эффект достигается только при введении летальной дозы, причём с увеличением срока инкубации степень изменения этих показателей возраста.

Следует отметить, что при применении малых доз яда вызванная in vivo трансформация эритроцитов является обратимой и не влечёт за собой гемолиз. Отсутствие гемолиза, вероятно, объясняется рядом причин: количеством лизолецитина, присоединённого к эритроциту, и продолжительностью его прикрепления, которые в свою очередь будут зависеть, во-первых, от первоначального уровня лецитина в плазме; во-вторых, от уровня плазменных белков, способных защищать сфероидные клетки от разрушения, и, в-третьих, от функционального состояния селезёнки. Анализ данных литературы свидетельствует о существующем более высоком уровне лецитина в плазме человека. Поэтому не исключено, что, по сравнению с полученными результатами при экспериментальном отравлении крыс, в аналогичных ситуациях in vivo у человека гемолиз может иметь место.

Одним из механизмов увеличения вязкости крови при действии яда кобр является и повышение сосудистой проницаемости, связанной с изменением агрегатного состояния кислых мукополи-сахаридов.

Усиление фильтрации жидкости из капилляров в ткань приводит к тому, что, в первую очередь, из капилляров уходит вода, растворенные в ней соли и мелкодисперсные альбумины и, следовательно, увеличивается гематокрит.

Ещё один возможный механизм повышения вязкости связан с воздействием яда на высокомолекулярные белки плазмы. Так, в результате разрушения структуры фибриногена [Kini R.M., Evans H.J., 1991] снижается онкотическое давление плазмы, жидкая её часть выходит в интерстециальное пространство. Таким образом, отмечается как бы двойной эффект: 1) яд действует на стенку сосуда; 2) яд действует на плазменные белки крови. Всё это отражается на её реологии (деформируемость, Ht, вязкость).

Вышеизложенные факты могут служить причиной наблюдаемого нами резкого увеличения вязкости крови на терминальной стадии отравления ядом Naja pallida, которое приводит к нарушению кровообращения. Это несомненно усугубляет общую картину отравления, и, вероятно, является одним из факторов, определяющим летальный исход.

В этих условиях нормализация реологических свойств крови затруднена, так как гемореологические расстройства сами по себе в организме выступают как факторы патогенеза.

С целью оценки влияния яда аспидовых змей на морфофунк-циональное состояние эритроцитов и определения степени реактивности популяции клеток в рамках настоящего исследования нами была апробирована оригинальная технология прижизненной компьютерной фазовой морфометрии цитологических объектов. Экспериментальные данные этих исследований составили третью группу результатов.

Для эффективного получения и обработки данных компьютерной фазовой морфометрии (КФМ) была предпринята попытка создания алгоритма, который обеспечивал бы комплексный подход к анализу статистических и динамических показателей, объективно характеризующих поведение живой клетки с учётом её основных физиологических функций.

На основании метрических (максимальный диаметр, периметр, высота, площадь, объём) и динамических (спектр Фурье) параметров фазовых клеточных изображений разработаны информативные критерии, характеризующие состояние нормы и степени отклонения от неё.

Указанные параметры клеток являются традиционным набором, эффективно используемым при решении цитодиагностических задач в рамках количественной морфометрии [Погорелов В.М. и др., 1995; Козинец Г.И. и др., 1998; Tichell А. Et al., 1992]. Необходимо отметить, что в контексте данного метода эти величины несут дополнительную информационную нагрузку.

Результаты автоматизированной оценки морфофункциональ-ного состояния эритроцитов периферической крови человека и белых крыс дали возможность оценить в реальном времени некоторые особенности стуктурно-метаболических изменений связанных с воздействием ядовитого секрета некоторых представителей ас-пидовых змей, в живых функционирующих клетках.

Использование разработанного алгоритма оценки морфо-функционального статуса красных клеток крови в условиях воздействия нативного яда Naja pallida позволило выделить типологические особенности их реактивности: уменьшение максимального диаметра, периметра и увеличение высоты фазовых изображений эритроцитов по сравнению с интактными клетками; изменения характера распределения анализируемых цитологических параметров в диаграммах.

Фазовые изображения непривычны для зрительного восприятия и, как правило, представляются или в псевдоцвете, когда они подобны гипсометрическим географическим картам поверхности, или в виде рельефа (трёхмерное изображение). В случае оптически неоднородных объектов, а также при соизмеримых с длинной волны размерах структурных элементов профиль в фазовом изображении может заметно отличаться от реального геометрического. В ряде случаев возникают неустранимые разрывы поверхности волнового фронта (дислокации), не соответствующие реальной поверхности, и другие артефакты. Интерпретация фазовых изображений, как, впрочем, и других функциональных изображений, например температурных или получаемых на туннельных микроскопах, иногда вызывает затруднения. В связи с этим, как правило, необходимы некоторый опыт, априорная информация или одновременная регистрация обычного и фазового изображений. С этой точки зрения сочетание использования сканирующей электронной микроскопии и компьютерной фазовой микроскопии несомненно перспективным и научно оправданным.

Морфометрические показатели в значительной мере отражают функциональное состояние клеток. Развитие новейших автоматизированных методов морфологического анализа открывает перспективы более глубокого и точного изучения изменений структурно-функциональных отношений в биологической системе. Можно считать установленным, что начало любого патологического процесса или различные внешние физико-химические воздействия приводят к нарушению работы звеньев внутриклеточного конвейера. Эти тончайшие повреждения, ещё не улавливаемые обычными методами морфологических исследований, могут сопровождаться соответствующими объективными функциональными проявлениями [Саркисов Д.С., 1993].

С этой точки зрения особый интерес представляют результаты анализа динамических показателей эритроцитов периферической крови человека и экспериментальных животных при интоксикации нативным ядом кобры в условиях in vitro и in vivo.

Известно [Бродский В.Я., 1966, 1988; Гринченко С.Н., 1989; Кроль А.Ю. и др., 1989], что исследование иерархии клеточных ритмов на основе методов прижизненной микроскопии непосредственно характеризует эффекты взаимодействия трёх основных относительно автономных гомеостатических систем (ионной, энергетической и пластической) регулирующих структурно-метаболическую организацию клетки. Однако, многочисленные попытки установить причинно-следственные связи регистрируемой различными способами внутриклеточной динамики с морфологическими и биохимическими (биосинтетическими) изменениями цитообъектов, ещё не привели к однозначным выводам в отношении интерпретации получаемых результатов. Анализ имеющихся научных фактов показывает, что некоторые ритмы энергетики, трофики и ионного обмена могут определяться в живой клетке даже в состоянии её покоя. Например, колебания в гликолетической цепи составляют 1-3 минуты, окисление сукцината происходит с периодом около 15 сек [Кондрашова М.Н., Каминский Ю.Г., 1971; Hess В., 1976]. При этом, несмотря на интенсивные разработки данной проблемы, многие вопросы касающиеся внутриклеточной динамики, остаются невыясненными и достаточно дискутабельными.

В наших исследованиях был оценён характер импульсной активности эритроцитов периферической крови человека и крыс с частотой от 0 до 17 Гц, что соответствует процессам, происходящим с интервалом 0,05-1 сек. Этот период не ограничен возможностями прибора. Мы сочли его приемлемым на этапе стандартизации метода динамической компьютерной фазометрии.

Полученные результаты в определённой мере выявляют некоторые качественные и количественные изменения пространственно временной конфигурации клеток в отношении частоты, мощности и амплитуды регистрируемых сигналов, соответствующих состоянию нормы или патологии определяемой воздействием используемого ядовитого секрета.

Так, анализ динамических показателей интактных эритроцитов и клеток, подвергнутых действию нативного яда в системах in vitro и in vivo, показал наличие общих константных частот, соответствующих 9.67 и 12.10 Гц, и характерных "зон молчания" в области 3.8-9.6 Гц. При этом в группе клеток, подвергнутых действию нативного яда, были выявлены специфические особенности влияния используемого зоотоксина на мембрану и метаболическую активность эритроцитов, которые нашли отражение в тотальном снижении мощности клеточного спектра при исследовании in vitro и in vivo, а также в увеличении плотности периодических компонент в диапазоне 2-4, 14-16 Гц при экспериментальном отравлении на терминальной стадии интоксикации.

Несмотря на значительный прогресс в попытках конкретной интерпретации получаемых результатов мы не можем сейчас дать удовлетворительное объяснение некоторым процессам которые наблюдались нами на микроскопе "Цитоскан" в эритроцитах периферической крови человека и нелинейных крыс, эта область научных исследований находится практически на уровне феноменологического описания соответствующих явпений. В определённой мере сдерживающим фактором в развитии данного направления является сложность, громоздкость или отсутствие методов, позволяющих идентифицировать природу внутриклеточных событий, обуславливающих изменение тех или иных параметров цитообъек-та, особенно регистрируемых с помощью КФМ сигналов в клеточных спектрах. Вместе с тем применённый нами метод уже способствовал установлению некоторых общих закономерностей развития некоторых патологических процессов и механизмов воздействия различных лекарственных препаратов [Vasilenko i.A. et al., 1998; Кривцова И.В.,1998].

Разумеется, проведённое исследование не может исчерпывающе ответить на многие в высшей степени сложные вопросы динамики развития гемореологических нарушений при остром от-равпении секретами активноядовитых животных. В этой области остаются ещё спорные или неясные вопросы. Тем не менее, полученные результаты представляют большой интерес и дают направления будущим исследованиям.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Савушкин, Андрей Владимирович, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Автандилов Г.Г. Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии: Сб.научн.тр. -М.:РМАПО, 1996. - С. 256.

2. Александрова Н.П. Общие закономерности развития геморео-логических нарушений у хирургических больных: Автореф. дис. докт. биол. наук. - М., 1987. - 46 с.

3. Александрова Н.П., Петухов Е.Б., Васильев В.Е. Реология крови у хирургических больных. Методы определения их коррекции. - М.: МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова, 1989. - 23 с.

4. Бабаев О.Г. Хирургические аспекты укусов ядовитых змей II В сб.: Проблемы теоретической и прикладной токсинологии. -Ашхабад: Ылым, 1991. - С. 41-45.

5. Бабаянц Г.А. Ядовитые животные Туркменистана. - Ашхабад: Ылым, 1982. - 102 с.

6. Балуда В.П., Сушкевич Г.Н., Лукашева Т.И. Роль ПТ, тромбок-санов и простациклина в регуляции процесса агрегации и реакции высвобождения тромбоцитов в норме и при патологии // Пат. физиол. - 1980. - № 4. - С. 80-85.

7. Баркаган З.С, Мительманн Л.Ш., Ягодкин С.И. Новый антикоагулянт из яда среднеазиатской кобры //В кн.: Вопросы гематологии и иммунопатологии. - Душанбе: Ирфон, 1967. - С.194-196.

8. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л.: Медгиз, 1963. - 152 с.

9. Бердыева А.Т. Патофизиологические аспекты действия змеиных ядов. - Ашхабад: Ылым, 1990. - 157 с.

10. Бердыева А.Т., Батыров Б.Б. Змеиный яд и почки. - Ашхабад: Ылым, 1994. - 169 с.

11. Быховец Г.П., Махоненко Е.В. Ядовитые змеи Центральной Африки и их укусы // Тр. Центр, ин-та усовершенствования врачей. - 1978. - Т. 224. - С. 121-124.

12. Бродский В.Я. Трофика клетки. - М.: Наука, 1966. - 356 с.

13. Бродский В.Я., Нечаева Н.В. Ритм синтеза белка. - М.: Наука, 1988. - 288 с.

14. Вальцева И.А., Крылов В.Н., Шешина Н.П. Патогенетические особенности поражающего действия ядов среднеазиатской кобры и бунгаруса // В сб.: Нарушение механизмов регуляции и их коррекция. - М., 1989. - Т. 2. - С. 372-376.

15. Вальцева И.А., Липахин В.К., Иваненко Л.С. О влиянии яда среднеазиатской кобры на мионевральные синапсы дыхательной мускулатуры // В сб.: Моделирование, методы изучения и экспериментальная терапия патологических процессов. - М., 1974.- С. 37-40.

16. Василенко И.А., Шабалин В.Н., Тычинский В.П. и др. Новая технология прижизненной компьютерной фазовой микроскопии: диагностические возможности и перспективы // Радиоэлектроника в медицинской диагностике (оценка функций и состояния организма). - М., 1995. - С. 164-169.

17. Васильев Д.Б., Кудрявцев C.B., Шумаков О.В. Руководство по технике безопасности, методам работы с ядовитыми змеями в условиях зоопарка, профилактике и лечению укусов. Antivenom index. - M.: ЕАРАЗА, 1997. - 87 с.

18. Глазунова Г.А., Григорьев Г.П., Баркаган З.С., Колтакова С.И. Влияние гепарина на повреждение эритроцитов при различных токсикогенных ДВС-синдромах // Гематол. и трансфузиол. -1990. - Т. 35. - № 7. - С. 3-5.

19. Гринченко С.Н., Загускин С.Л. Механизмы живой клетки: алгоритмическая модель. - М.: Наука, 1989. - 232 с.

20. Гусейнов Ч.С., Хундадзе С.Ш., Лагутина Н.Я. Фибриноген (физиология, биохимия, патология, клиническое применение). -Тбилиси: Саабчота Сакартвело, 1975. - 217 с.

21. Давлятов Я.Д., Крылова Е.С. Изменение биологических свойств ядов среднеазиатских змей // В кн.: Содержание ядовитых змей Средней Азии в неволе. - Ташкент: Фан, 1972. - С. 163-170.

22. Жукотский A.B., Якубов H.И., Пономарёв А.Б. Новый метод морфометричеокого исследования почки с использованием компьютерного комплекса "ДИАМОРФ" // Бюл. экспер. биол. -1992. - Т. 113. - № 4. - С. 417-419.

23. Исследование системы крови в клинической практике / Под ред. Г.И.Козинца, В.А.Макарова. - М.: Триада-Х, 1998. - 480с.

24. Коган Э.М., Жукотский A.B., Копылов В.М. Компьютерный морфоденситометрический анализ клеток крови при воздействии малых доз радиации // В сб. научн. тр.: Молекулярно-генетические механизмы действия малых доз радиации. - М.: РМА, 1994. - С. 145-169.

25. Кондрашова М.Н., Каминский Ю.Г. Колебательные реакции ми-тахондрий при транспорте ацетата натрия // В сб. Колебательные процессы в биологических и химических системах. / Пу-щино, 1971. - Т. 2. - С. 72-75.

26. Корнеева Н.В., Романова Е.Б., Москаленко Л.А. Изменение реологических свойств крови при действии некоторых зооток-синов //Механизмы действия зоотоксинов: Межвуз. Сб-к. Научных трудов / Горьк.ун-т, 1986. - С. 35-39.

27. Кривцова И.В., Василенко И.А., Конрадов A.A. Некоторые особенности внутриклеточной динамики мононуклеаров периферической крови в норме и патологии // В сб. материалов Международного симпозиума "Биологическая подвижность: Современные методы исследования" /Пущино, 1998.-С.73-74.

28. Кроль А.Ю., Гринфельд М.Г., Смильгявичус А.Д., Левин C.B. Быстрые локальные колебания поверхности эритроцитов человека // Цитология. - 1989. - Т. 31. - № 5. - С. 563-568.

29. Крымский Л.Д., Нестайко Г.В., Рыбалов А.Г. Растровая электронная микроскопия сосудов и крови. - М.: Медицина, 1976. -168 с.

30. Левин Г.Я., Шереметьев Ю.А. Роль а-ацетилнейраминовой кислоты и отрицательного заряда эритроцитов в их агрегации // Пробл. гематол. - 1981. - № 6. - С. 6-8.

31. Левин Г.Я., Шереметьев Ю.А. Изменение функциональных свойств клеток крови под воздействием некоторых компонентов яда кобры //Механизмы действия зоотоксинов: Межвуз. Сб-к. Научных трудов / Горьк.ун-т, 1981. - С. 52-58.

32. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1973. - 343 с.

33. Левтов В.А., Регирер С.А., Шадрина Н.Х. Реология крови. - М.: Медицина, 1 982. - 270 с.

34. Маслова М.Н. Активность мембранных ферментов эритроцитов при различных стрессорных воздействиях // Физиол. журн. - 1994. - Т. 80. - № 7. - С. 76-80.

35. Маркосян P.A., Ермолаев И.В. Влияние гепарина на электро-форетическую подвижность тромбоцитов // В кн. Гепарин: физиология, биохимия, фармокологическое и клиническое применение. М.: Наука, 1973. - С. 202-203.

36. Нигматов 3. Очистка холинэстеразы яда среднеазиатской кобры и изучение её некоторых свойств // Механизмы действия зоотоксинов: Межвуз. Сб. Научных трудов / Горьк.ун-т, 1985. -С. 32-35.

37. Омаров Ш.М. Влияние пчелиного яда и яда кобры на фибриноген и на фибринолитическую активность крови // Механизмы действия зоотоксинов: Межвуз. Сб. Научных трудов / Горьк.ун-т, 1970. - С. 22-24.

38. Омаров Ш.М. Влияние зоотоксинов на ультраструктурную организацию тромбоцитов// Механизмы действия зоотоксинов: Межвуз. Сб. Научных трудов / Горьк.ун-т, 1978. - С. 73-75.

39. Омаров Ш.М. Патофизиологические аспекты антикоагулирую-шего действия зоотоксинов и их ингредиентов: Автореф. дис. докт. мед. наук. - М., 1980. - 32 с.

40. Орлов Б.Н., Вальцева И.А. Яды змей (токсикологические биохимические и патофизиологические аспекты). - Ташкент: Медицина, 1977. - 252 с.

41. Орлов Б.Н., Гелашвили Д.Б. Зоотоксинология (ядовитые животные и их яды). - М.: Высшая школа, 1985. - 280 с.

42. Орлов Б.Н., Корнева Н.В., Романова Е.Б. Реологические свойства крови и эритроцитарных суспензий в условиях воздействия зоотоксинов // Науч. докл. высш. школы. Биол. науки. -1987.- № 4.- С. 51-55.

43. Павлова O.E. Влияние азона на реологические свойства крови: Автореф. дис. канд. биол. наук. - М., 1998. - 17 с.

44. Петухов Е.Б., Александрова Н.П., Савушкин A.B., Квитко H.H., Васильев Д.Б. Морфологические и реологические изменения эритроцитов под влиянием нативного яда красной кобры (Naja pallida) II Бюл.экспер.биол. -1995. -Т.120. - №10. - С. 425-427.

45. Пулатов А.Т., Хан И.Б. Первая помощь и лечение детей после укуса ядовитых змей // Вестн.хир. - 1974. - №7. - С.72-75.

46. Савушкин A.B., Александрова Н.П. Тромбоэластографическая характеристика свёртывания крови при интоксикации натив-ным ядом Naja pallida (красной кобры) // В сб.научн.трудов МПГУ. Сер.: Естеств. науки. М.:"Прометей", 1999. - С.310-312.

47. Саркисов Д.С. Очерки истории общей патологии. - М.: Медицина, 1993. - 510 с.

48. Сахибов Д.Н., Сорокин В.М., Юкельсон Л.Я. Химия и биохимия змеиных ядов. - Ташкент: Фан, 1972. - 186 с.

49. Сорокова В.И., Моченова H.H., Никитина Г.М. Ультраструктура эритроцитов при кальций-активируемом старении in vitro II Бюл. экспер. биол. - 1994. - Т. 117. - № 5. - С. 555-557.

50. Султанов М.Н. Опыт лечения отравлений при укусах змей // Клин. мед. - 1983. - № 7. - С. 36-39.

51. Тычинский В.П. Компьютерный фазовый микроскоп. - М.: Знание, 1989. - 63 с.

52. Тычинский В.П. Микроскопия субволновых структур // Успехи физич. наук. - 1996. - Т. 166. - № 11. - С. 1219-1229.

53. Тычинский В., Вышенская Т., Ягужинский Л. и др. Регистрация в реальном времени кооперативной F-iFo-ферментатив-ной активности в изолированной липосоме // В сб. материалов Меж-

дународного симпозиума "Биологическая подвижность: Современные методы исследования" / Пущино, 1998. - С. 167-168.

54. Черницкий Е.А., Воробей А.И. Структура и функции эритроци-тарных мембран. - Минск: Наука и техника, 1981. - 215 с.

55. Чернух A.M., Александров Н.П., Алексеев О.В. Микроциркуляция. - М.: Медицина , 1975. - С. 396-406.

56. Adams R.A., Evans S.A., Jones J.G. Characterization of leukocytes by filtration of diluted blood // Biorheology. - 1994. -Vol. 31. - N 6,- P. 603-615.

57. Anderson R.A., Lovrien R.E. Glycophorin is linked by band 4.1 protein to the human erythrocyte membrane skeleton // Nature. -1984. - Vol. 307. - P. 655-658.

58. Baker R.F., Clark L.J. Assay of red cell membrane deforma-bility with some applications // Biomed. Biochim. Acta. - 1983. - Vol. 42. - N 11-12. - P. 91-96.

59. Ballas S.K., Mohaudas N.. Clark M.R., Shohet S.B. Reologi-cal properties of antibody-coated red cells // Transfusion. - 1984. -Vol. 24. - N 2. - P. 124-129.

60. Batenburg A.M., Bougis P.E., Rochat H. et al. Penetration of a cardiotoxin into cardiolipin model membranes and its implication on lipid organisation // Biochemistry, - 1985. - N 24. - P. 71017110.

61. Beaven G.H., Parmar J., Nash G.B. et al. Effect of magnesiumion of red cell membran properties II J. Membr. Biol. - 1990. -Vol. 118. - N 3. - P. 251-257.

62. Bennet V. The membrane skeleton of human erythrocytes and its implication for more complex cells // Annu. Rev. Biochem. - 1985. - Vol. 54. - P. 273-304.

63. Bessis M. Red cell shapes. An illustrated classification and its rationale // Nouv. Rev. frans. Hemat. - 1973. - Vol. 12. - N 6. - P. 721-746.

64. Bessis M., Feo C., lones E. Quantitation of red cell deformability during progressive deoxygenation and oxygena-tion in sickling disorders // Blood Cell. - 1982. - Vol. 8. - N 3. - P. 17-23.

65. Borovoi A.G., Naats E.I., Oppel U.G. Scattering of light by a red blood cell //J. Biomed. Optics - 1998. - Vol.3.- N3. - P.364-372.

66. Bougis P.E., Khelif A., Rochat H. On the inhibition of [Na+,K+]-ATPases by the components of Naja mossambica mossambica venom: evidence for two distinct rat brain [Na+,K+]-ATPase activities // Biochemistry. - 1989. - Vol. 28. - N 7. - P. 3037-3043.

67. Bougis P.E., Marchot P., Rochat H. In vivo synergy of cardiotoxin and phospholipase A2 from the elapid snake Naja mossambica mossambica // Toxicon. - 1987. - Vol. 25. - N 4. - P. 427-431.

68. Byers T.J., Branton D. Visualization of the protein association in the erythrocyte membrane skeleton // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1985. - Vol. 82. - P. 6153-6157.

69. Chabanel A., Reinhart W., Chein S. Increased resistance to membrane deformation of shape-transformed human red blood cell // Blood. - 1987. - Vol. 69. - N 3. - P. 739-743.

70. Chen Y.H., Liou R.F., Hu C.T., Juan C.C., Yang J.T. Interaction of snake venom cardiotoxin (a membrane-disruptive polypeptide) with human erythrocyte // Mol. Cell. Biochem. - 1987. - Vol. 73. -N 1.- P. 69-76.

71. Chong P.L.-G., Fortes P.A.G., Jameson D.M. Mechanisms of inhibition of (Na,K)-ATPase by hydrostatic pressure studied with fluorescent probes // J.Biol. Chem. - 1985. - Vol. 260. - P. 1448414490.

72. Condrea E., da Vries A., Mager J. Hemolysis and splitting of human erythrocyte phospholipids by snake venoms // Biochim. Biophys. Acta. - 1964. - Vol. 84. - P. 60-73.

73. Condrea E. Membrame-active polypeptides from snake venom cardiotoxins and haemocytotoxins // Experientia. - 1974. - Vol. 30. - N 2. - P. 121-129.

74. Cook G.M., Heard D.H., Seaman G.V. Sialic acids and the electrokinetic change of the human erythrocyte // Nature. -1961. -Vol. 191. - P. 44-47.

75. Copley A.L., Scott Blair G.G. Comparative observations on adherence and cousistency of various blood systems in living and artificial cappilary // Rheol.Acta. -1958. -Vol.1. -P.170-176.

76. Cossins A.R., Sinensky M. Adaptation of membrane to temperature, pressure, and exogenous lipids // In: Physiology of membrane fluidity /Ed. M. Shinitzky. -Boca Raton, 1984. - Vol.2. -P.1-20.

77. Cox H.A. The influence of electrokinetic charge on the Theological properties of red blood cell suspensions // Proc. of the 4th Int. Congress on Rheology. - 1965. - P. 337-351.

78. Dewey T.G., Bann J.G. Protein dynamics and 1/F noise // Biophys. J. - 1992. - Vol. 63. - P. 1-7.

79. Dijksta B.W., Kalk K.H., Drenth J., de Haas G.H., Egmont M.R., Slotboom A.J. Role of the N-terminusin the interaction of pancreatic phospholipase A2 with aggregated substrates. Properties and crystal structure of transaminated phospholipase A2 // Biochemistry. - 1984. - Vol. 23. - P. 2759-2766.

80. Dintenfass L. Internal viscosity of the red cell and a blood viscosity equation //Nature - 1968. - Vol. 219. - P.956-968.

81. Dintenfass L. Rheology of blood in diagnostic and preventive medicine. - Lond., 1976. - P. 197-211.

82. Dintenfass L. Some rheological factors in pathogenesis of thrombosis // Lancet. - 1965. - Vol. 2. - P. 7480-7531.

83. Dintenfass L., Forbes C.D. Effect of fibrinogen on aggregation of red cells on apparent viscosity of artificial thrombin in haemophilia myocardial infarction, cancer and control systems: affect of ABO blood groups // Microvasc. Res. - 1975. - Vol. 9. -N 1. - P. 107-118.

84. Ditzel J., Kampman J. Whole-blood viscosity hematocrit and plasma protein in normal subjects at different ages // Acta Physiol. Scand. - 1971. - Vol. 81. - N 2. - P. 264-268.

85. Dormandy J.A., Flute P.T., Primak-Michelinaki S.M., Reid H. Erythrocyte deformability and blood viscosity in peripheral circulatory disease // J. Physiol. (Lond.). - 1978. - Vol. 275. - P. 19-20.

86. Dufourcq J., Faucon J.F., Bernard E., Pezolet M., Tessier M., van Rietschoten J., Delori P., Rochat H. Structure-function relationships for cardiotoxins interacting with phospholipids // Toxicon. - 1982. - Vol. 20. - N 1. - P. 165-174.

87. Dunlop M.J., Lee M.M., Canham P.B., Taylor C.P.S. Kinetics of adhesive interaction in vitro of human erythrocytes in plasma //Microvasc.Res. - 1984. - Vol.28. - N 1. - P. 62-74.

88. Fawcett J.P., Menkes D.B. Does cholesterol depletion have adverse effects on blood rheology? // Angiology. - 1994. - Vol. 45. - N 3. - P. 199-206.

89. Feo C., Mohaudas N. Clarification of role of ATP in red cell morphology and function // Nature. - 1977. - Vol. 256. - N 5590. -P. 166-168.

90. Feo C., Mohaudas N. Role ATP depletion on red cell shape and deformability // Blood Cell. - 1977. - Vol. 3. - N 1. - P. 153-161.

91. Feo C., Phillips W.M. The influence of suspension osmolarity and erythrocyte volume on cell deformability // Nouv. Rev. franc. Hemat. - 1982. - Vol. 24. - N 5. - P. 295-299.

92. Fletcher J.E., Jiang M.S., Gong Q.H., Yudkowsky M.L., Wieland S.J. Effects of a cardiotoxin from Naja naja kaouthia venom on skeletal muscle: involvement of calcium-induced calcium release, sodium ion currents and phospholipases A2 and C //Toxicon. -1991. - Vol.29. - N 12. - P. 1489-1500.

93. Fletcher J.E., Jiang M.S., Tripolitis L., Smith L.A., Beech J. Interactions in red blood cells between fatty acids and either

snake venom cardiotoxin or halothane // Toxicon. - 1990. - Vol. 28. - N 6. - P. 657-667.

94. Fourie A.M., Meltzer S., Berman M.C., Louw A.I. The effect of cardiotoxin on [Ca2+,Mg2+]-ATPase of the erythrocyte and sarcoplasmic reticulum // Biochem. Int. - 1983. - Vol. 6. - N 5. -P. 581-591.

95. Fung Y.C. Theoretical considerations of the elasticity of red cells and small blood vessels // Fed. Proc. - 1966. - Vol. 25. - P. 17611767.

96. Gaehtgens P., Benner C.U. Desaggregation of human red blood cells by various surface-active agents as related to changes of cell shape and hemolysis // Acta Haematol. - 1975. - Vol. 53. - N 2. - P. 82-89.

97. Galante A., De Luca A., Pietroiusti A., Tiratterra F., Benincasa E., Domenici B., Baldelli C., Valenzi C. Effects of opiates on blood rheology // J. Toxicol. Clin. Toxicol. - 1994. - Vol. 32. - N

4. . p. 411-417.

98. Galla H.J., Hartman W., Theilen U., Sackmann E. On two-dimensional passive random walls in lipid bilayers and fluid pathways in biomembranes // J. Membr. Biol. - 1979. - Vol. 48. -P. 215-236.

99. Ganguly S.N., Malkana M.T. Indian snake venoms. II. Cobra venom: its chemical composition, protein fractions and their physiological actions IIInd. J. Med. Res. - 1936. - Vol. 24. - P. 281-286.

100. Gardner K., Bennett V. Modulation of spectrin-actin assembly by erythrocyte adducin // Nature. - 1987. - Vol.328. - P.359-362.

101. Gedde M., Yang E., Huestis W. Shape response of human erythrocytes to altered cell pH // Blood. - 1995. - Vol. 86. - N 4. -P. 1595-1599.

102. Goldstone J., Schmidt-Schonbein H., Wells R. The rheology of red blood cell aggregates //Microvasc.Res. - 1970. - Vol. 2. - P. 273-286.

103. Graf D., Barras J. Rheological properties of hum an blood plasma // Experientia. - 1979. - Vol.35. - N 2. - P.224-225.

104. Habermann E. Hemmung der oxydativen Phosphorylierung durch tierische Gifte //Naturwissenschaft.- 1954. -Bd.41. - N18. - P. 429-430.

105. Halpern D., Secomb T.W. The squezing of red blood cells through capillaries with near-minimal diametrs // J. Fluid Mech. -

1989. - Vol. 203. - P. 381-400.

106. Harvey A.L., Hider R.C., Khader F. Effect of phospholipase A on actions of cobra venom cardiotoxins on erythrocytes and skeletal muscle // Biochim. Biophys. Acta. - 1983. - Vol. 728. - N 2. - P. 215-221.

107. Hess B. Oscillations in biochemical systems // Life Sei. Res. -1976. - N 1. - P. 175-191.

108. Hess W.R. Gehorcht das Blut dem allgemeinen Strömungsgesetz Flügers Archiv ges. // Physiol. - 1915. - Vol. 162. - P. 187-191.

109. Hinman C.L., Jiang X.L., Tang H.P Selective cytolysis by a protein toxin as a consequence of direct interaction with the lymphocyte plasma membrane // Toxicol. Appl. Pharmacol. -

1990. - Vol. 104. - N 2. - P. 290-300.

110. Hint H. In vitro studies of the influence of different colloids on the aggregation of erythrocytes // Pharmacology and pertinent rheology: Conf. on Evaluation of low molecular wieght dextran in shock. - Washington, 1963. - P. 79-81.

111. Hiruma H., Noguchi C.T., Uyesaka N., Hasegawa S., Blanchette Mackie E.J., Schechter A.N., Rodgers G.P. Sickle cell rheology is determined by polymer fraction not cell morphology //Am.J.Hematol. - 1995,- Vol.48. - N1. - P.19-28.

112. Hovav E., Halle D., Yedgar S. Viscous macromolecules inhibit erythrocyte hemolysis induced by snake venom phospholipase A2 // Biorheology. - 1987. - Vol. 24. - N 4. - P. 377-384.

113. Hurt E.C., Schatz G. A cytosolic protein oontans a cryptic mitochondrial targeting signal // Nature. - 1987. - Vol. 325. - P. 499-503.

114. Jain M.K.1, de Haas G.H., Marecek J.F., Ramirez F. The affinity of phospholipase A 2 for the interface of the substrate and analogs // Biochim. Biophys. Acta. - 1986. - Vol. 860. - P. 475-483.

115. Jain M.K.2, Rogers J., Jahagirdar D.V., Marecek J.F., Ramirez F. Kinetic of interfasial catalisis by phospholipase A2 in intravesicle scooting mode, and heterofusion of anionic and zwitterionic vesicles // Biochim. Biophys. Acta. - 1986. - Vol. 860.

. p. 435-447.

116. Jain M.K.3, Rogers J., Marecek J.F., Ramirez F., Eibl H. Effect of the structure of phospholipid on the kinetics of intravesicle scooting of phospholipase A2 // Biochim. Biophys. Acta. - 1986. -Vol. 860. - P. 462-474.

117. Kini R.M., Evans H.J. Inhibition of platelet aggregation by a fibrinogenase from Naja nigricollis venom is independent of fibrinogen degradation // Biochim. Biophys. Acta. - 1991. - Vol. 1095. - N 2. - P. 117-121.

118. Knisely M.H. Special problems of blood rheology // Trans. Soc. Rheology. - 1962. - Vol. 6. - P. 13.

119. Knisely M.H., Elliot Т., Bloch E.H. Slage blood in traumatic shock II Arch. Surg. - 1945. - Vol. 51. - P. 220.

120. Komori Y. Complet primary structure of the subunits of heterodimeric phospholipase A2 from Vipera a. rinnikeri // Arch.Biochem.Biophys. - 1996. - Vol.327. - N 2. - P.303-307.

121. La Celle P.L., Weed R.I. The contribution of normal and pathological erythrocytes to blood rheology // Prog. Hematol. -1971. - Vol. 14. - N 5. - P.1-31.

122. La Celle P.L., Weed R.J., Sautillo P.А. Патофизиопогическое значение нарушения формы эритроцитов // Мембраны и бо-пезнь: Пер. с англ. - М.: ГЦНМБ, 1980. - С. 17-34.

123. Larcan A., Stoltz M., Stoltz J.F. Influence of various plasma substitutes (Dextran, Plasmagel, Haemacel and Subtosan) on the "sludge phenomenon". A correlative study of some hemorheological parameters // Microvasc. Res. - 1971. - Vol. 3. -N 4. - P. 434-436.

124. Lebland P.F., La Celle P.L., Weed R.J. Cellular deformability: A possible determinant of the normal release of maturing erythrocytes from the bone marrow // Blood. - 1971. - Vol. 37. -P. 861-863.

125. Lee C.-Y. Snake venom. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 1979. - 1 130 p.

126. Levin G.G., Vishnyakov G.N., Kozinets G.I. et al.Blood cells research using methods of microinterferometry // SPIE. - 1997. -Vol. 2982. - P. 490-495.

127. Levinsky H., Rothman G., Lapidot M., Allolouf D. Red blood cell memrane and serum sialic acid in relation to erythrocyte sedimentation date // Acta Haematol. - 1980. - Vol. 64. - P. 276280.

128. Litvin M.S., Chapman K., Stoliar J.B. Blood viscosity in the normal man // Surgery. - 1970. - Vol. 67. - P. 342-345.

129. Livera G.A. A comparative study of in vitro hemolysis by Vipera ammodytes poison conducted on 73 vertebrate species // Biol. Latina. - 1958. - Vol. II. - N 1. - P. 141-147.

130. Louw A.I., Visser L. The synergism of cardiotoxin and phospholipase A2 in hemolysis // Biochim. Biophys. Acta. - 1978. - Vol. 512. - N 1. - P. 163-171.

131. Low P.S. Structure and function of the cytoplasmic domain of band 3: Center of erythrocyte membrane-peripheral protein interactions // Biochim. Biophys. Acta. - 1986. - Vol. 864. - P. 145-167.

132. McGrath M.A., Penny R. Paroproteinemia: blood hyper-viscosity and clinical manifestations // J. Clin. Invest. - 1976. - Vol. 58. -P. 1155-1159.

133. Mellanby J.H. The coagulation of blood. Part II. The action of snake venom, peptone and leech extract // J. Physiol. (Lond.). -1909. - Vol. 38. - P. 441-503.

134. Merrill E.W., Margetts W.G., Cokelet G.R. et al. Influence of plasma proteins on the rheology of human blood // Proc. 4th Int. Congr. on Rheol. Pt. 4. Symp. on Biorheol. - N.Y., 1965,- P. 601611.

135. Merrill E.W. Rheology of blood // Physiol.Rev. - 1969. - Vol.49.

- P. 863-883.

136. Merrill E.W., Cokelet G.R., Britten A., Wells R.E. Non-newtonian rheology of human blood-effect of fibrinogen deduced by substruction //Circ.Res. - 1963. - Vol.13. - N 1. - P. 48-55.

137. Mircevova L., Viktora L., Kodicek M. et al. The role of spectrin-dependent ATPase in erythrocyte shape maintenance //Biomed.Biochim.Acta. -1983. - Vol.42. - N11-12. - P.67-71.

138. Nash G.B., Gratzer W.B. Structural determinants of the rigidity of the red cell membrane // Biorheology. - 1993. - Vol 30. - N 5-6.

- P. 397-407.

139. Nordt F.J., Knox R.J., Seaman G.V.F. Red cell aging 2. Anomalous electrophoretic properties of neuraminidase treted human erythrocytes // J. Cell Physiol. - 1978. - Vol. 97. - N 2. -P. 209-220.

140. Osorio e Castro V.R., Ashwood E.R., Wood S.G., Vernon L.P. Hemolysis of erythrocytes and fluorescence polarization changes elicited by peptide toxins, aliphatic alcohols, related glycols and benzylidene derivatives // Biochim. Biophys. Acta. - 1990. - Vol. 1029. - N 2. - P. 252-258.

141. Pape L., Kristensen B.J., Bengston O. Sialic acid electrophoretic mobility and transmembrane potential of annphiuma red cell // Biochim. Biophys. Acta. - 1975. - Vol. 406.

- N 4.- P. 516-525.

142. Piatt O.S., Falcone J.-F. Membrane protein interactions in sickle red blood cells: Evidence of abnormal protein 3 function II Blood.

- 1995. - Vol. 86. - N 5. - P. 1992-1998.

143. Rampling M.W. Plasma protein induced aggregation of erythrocytes its causes estimation and effects on blood flow // Stud. Biophys. - 1989. - Vol. 134. - N 1-2. - P. 91-94.

144. Ransac S., Aarsman A.J., van den Bosch H., Gancet C., de Haas G.H., Verger R. Rat platelet phospholipase A2. Kinetic characterization using the monomolecular film technique // Eur. J. Biochem. - 1992. - Vol. 204. - N 2. - P. 793-797.

145. Raval P.J., Allan D. Phospholipid asymmetry in the membranes of intact human erythrocytes and in spectrin-free microvesicles derived from them // Biochim. Biophys. Acta. - 1984. - Vol. 772. -N 2. - P. 192-196.

146. Reid H.A., Theakston D. Treatment of snakebites // Bull. Wld Hlth Org. - 1983. - Vol. 61. - N 6. - P. 71-75.

147. Ruhenstroth-Bauer G. Mechanism and significance of erhytrocyte sedimentation rate // Br. Med. J. - 1961. - N 5442. -P. 1804.

148. Russel F.E., Picchioni A.I. Snake venom poisoning // Clin. Toxic. Cons. - 1983. - N 73. - P. 377.

149. Sasaki O., Okasaki H., Sasaki M. Sinusoidal phase modulating interferometer using integrating-bucket method // Applied Optics.

- 1987. - Vol. 26. - N 6. - P. 1089-1092.

150. Schmid-Schonbein H. Towards an unified theory of hemorheology // Hemorheology and diseases. Proc. of the 1st Europ. symp. on clinical hemorheology. Nancy, October 1979 / Eds. J.F. Stoltz, P. Douin. - Paris, 1980. - P. 13-29.

151. Schmid-Schonbein H., Gallasch G., Volger E., Klose H.J. Microrheology and protein chemistry of pathological red cell aggregation (blood sludge) studies in vitro // Biorheology. - 1973.

- Vol. 10. - N 2. - P. 213-227.

152. Schmid-Schonbein H., Wells R. Rheological concequences of osmotic red cells crenation // Pflugers Arch. - 1969. - Vol. 307. -P. 59-69.

153. Schroer H., Volkl K.P. Die Rolle des Fibrinogens beim FlieSverhalten des Blutes //Homostaseologie. -1984. - N1. - P.8-10.

154. Seaman G.V.F. In: The red blood cell. New York, 1975. - Vol.2. -P.1135.

155. Seplowitz A.H., Chien S., Smith F.R. Effects of lipoproteins on plasma viscosity // Atherosclerosis. - 1981. - Vol. 38. - N 1-2. -P. 89-95.

156. Shen B.W., Josephs R., Steck T.L. Ultrastructure of the intact skeleton of the human erythrocyte membrane // J. Cell Biol. -1986. - Vol. 102. - P. 997-1006.

157. Shinitzky M. Membrane fluidity and cellular functions. Physiology of membrane fluidity / Ed. M.Shinitzky. - Boca Raton, 1984. - Vol. 1. - P. 1-51.

158. Skalak R., Branemark P.I. Deformation of red blood cell in capillary // Sience. - 1969. - Vol. 165. - P. 717-719.

159. Smallwood R.H., Tindale W.B., Trowbridge E.A. The physics of red cell sedimentation // Phys. Med. Biol. - 1985. - Vol.30. - N2. -P. 125-137.

160. Smith A.D., Gul S., Thompson R.H.S. The effect of fatty acids and of albumin on the action of a purified phospholipase A 2 from cobra venom on synthetic lecithins. // Biochim. Biophys. Acta. -1972. - Vol. 289. - P. 147-157.

161. Smith B.D., La Celle P.L. Parallel decrease of erythrocyte membrane deformability and spectrin solubility at low pH // Blood. - 1979. - Vol. 53. - N 1. - P. 15-18.

162. Spawls S., Branch B. The dangerous snakes of Africa. - Lond., 1995. - 192 p.

163. Stolz J.F., Donner M. Erythrocyte aggregation: Experimental approaches and clinical implications // J. Int. Angiol. - 1987. -Vol. 6. - N 2. - P. 193-200.

164. Stolz J.F., Donner M., Larcan A. Introduction to hemo-rheology: Theoretical aspect and hyperviscosity syndromes // J. Int. Angiol.

- 1987. - Vol. 6. - N 2. - P. 119-132.

165. Stolz J.F., Guerlet B., Lucius M. Modeles rheologiques du globule rouge humain. Etude critique Cahuer du Groupe Français // Rheologie. - 1977. - Bd. 4. - S. 205-217.

166. Suhr S., Kim D.-S. Identification of the snake venom substance that induces apoptosis // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1996. - Vol. 224. - N 1. - P. 134-139.

167. Teitel P. Clinical investigation on improved filtration // Biorheology. - 1972. - Vol. 9. - P. 164-165.

168. Teng C M., Kuo Y.P., Lee L.G., Ouyang C.H. Characteri-zation of the anticoagulants from Taiwan cobra (Naja naja atra) snake venom // Toxicon. - 1987. - Vol. 25. - N 2. - P. 201-210.

169. Thurston George B. Viscoelastic stress-strain relation in blood: effects of hematocrit // Phys. Med. Biol. - 1988. - Vol. 33. -Suppl. - N 1. - P. 348.

170. Tillmann W., Levin C., Prindull G., Schroter W. Rheological properties of young and aged human erythrocytes // Klin. Wschr.

- 1980. - Vol. 58. - N 11. - P. 569-574.

171. Vasilenko I., Babakova S., Kiseleva E. et al. Real-time monitoring of the functional status of platelets treated by infukoll using computer-aided laser phase microscope // SPIE. - 1998. -Vol. 3567. - P. 310-322.

172. Vidal C.A., Cattaneo P., Stoppani A.O.M. Some characteristic properties of phospholipase A2 from Bothrops neuwiedii venom // Arch. Biochem. Biophys. - 1972. - Vol. 151. - P. 168-179.

173. Wuster W., Golay P., Warrell D.A. Sinopsis of recent developments in venomous snake systematics // Toxicon. - 1997.

- Vol. 35. - N 3. - P. 319-340.

174. Weisse R.S., Clement K. Studies on cell deformability: some rheological considerations // Exp. Cell. Res. - 1969. - Vol. 58. -P. 379-387.

175. Zeller E.A. Enzymes of snake venoms and their biological significance // Adv.Enzymol. - 1948. - Vol. 8. - P. 459-495.

176. Zuzman N., Miklas T.M., Graves T., Dambach G.E., Hudson R.A. On the interaction of cobra venom protein cardiotoxins with erythrocytes // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1984. - Vol. 124. - N 2. - P. 629-636.