Влияние напряжения кислорода на работу Na+/K+АТФазы в сердце крысы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Лапина, Наталья Евгеньевна

• Лапина, Наталья Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лапина, Наталья Евгеньевна

Содержание

Список используемых сокращений

Введение

Глава I Обзор литературы

§ 1.1. Введение

§ 1.2. Строение Мг+/А^АТФазы

§ 1.2.1. Общее строение Nal/1С АТФъзы

§ 1.2.2. а - субъединица

§ 1.2.3. (3 - субъединица

§ 1.2.4. Семейство FXYD белков (у-субъединица)

§ 1.2.5. Анкирины

§ 1.3. Работа Л^+/ГАТФазы

§ 1.4. Влияние напряжения кислорода на синтез АТФ

§ 1.5. Значение уровня свободных радикалов для клетки

§ 1.6. Активность миелопероксидазы (МП) в сердце при ишемии

§ 1.7. Предполагаемые механизмы регуляции ТУйЛ/А^АТФазы в условиях разного напряжения кислорода

Глава II Материалы и методы исследований

§2.1. Объект исследований

§ 2.2. Используемые растворы и реактивы

§ 2.3. Метод изоляции сердца

§ 2.4. Метод перфузии изолированного сердца по Лангендорффу

§ 2.4.1. Цротоколы проведения перфузии сердца

§ 2.5. Приготовление проб к анализу. Гомогенизация

§ 2.5.1. Подготовка проб для измерения гидролитической активности Na+АТФгзы

§ 2.5.2. Подготовка проб для проведения измерения АТФ и

GSH/GSSH

§ 2.5.3. Подготовка проб для измерения пероксидаз

§ 2.6. Измерение гидролитической активности Nct+/t?АТФазы

§ 2.7. Измерение АТФ в гомогенате перфузйрованного сердца

§ 2.8. Измерение GSH/GSSG в гомогенате перфузйрованного сердца

§ 2.9. Измерение пероксидаз в гомогенате перфузйрованного сердца

§2.10. Определение белка

§ 2.11. Измерение количества воды в пробе сердца

§2.12. Методы обработки результатов экспериментов

Глава III Результаты и обсуждения

§ 3.1.Изменения гидролитической активности в зависимости от времени перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе

§ 3.1.1. Кислород зависимые изменения гидролитической активности Net/К* АТФ азы

§ 3.1.2. Зависимость гидролитической активности Na/KtАТФазы от напряжения кислорода в перфузионном растворе за 15 минут перфузии

§ 3.2. Изменения концентрации АТФ в гомогенате желудочков сердца при перфузии сердца в разных условиях

§ 3.2.1. Кинетические изменения концентрации АТФ в гомогенате желудочков сердца

§ 3.2.2. Зависимость концентрации АТФ в гомогенате желудочков сердца от напряжения кислорода в перфузионном растворе за 15 минут перфузии

§3.3. Изменения окисленной и восстановленной форм глутатиона в гомогенате желудочков сердца

§ 3.3.1. Кинетические изменения окисленной и восстановленной форм глутатиона в гомогенате желудочков сердца

§ 3.3.2. Зависимость уровня окисленной и восстановленной форм глутатиона в гомогенате желудочков сердца от напряжения кислорода в перфузионном растворе за 15 минут

§3.4. Кислород зависимые изменения уровня пероксидаз в гомогенате желудочков сердца желудочков сердца

§ 3.4.1. Кинетические изменения уровня пероксидаз в гомогенате желудочков сердца

§ 3.4.2. Зависимость уровня пероксидаз в гомогенате желудочков сердца от напряжения кислорода в перфузионном растворе за 15 минут

§3.5. Кинетические изменения количества воды в ткани желудочков сердца

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние напряжения кислорода на работу Na+/K+АТФазы в сердце крысы»

JVaVi^ АТФаза - встроенный в плазматическую мембрану фермент, который за счет энергии гидролиза АТФ связывает ионы Na и К", перенося их через мембрану против градиента концентрации со следующим соотношением:

АТФ + 3 Nain + 2 lC0Ut= АДФ +Pi + 3 Na out +2 1С in. где Na+in входящий ион натрия, Na+ out - выходящий ион натрия, 1Сout - выходящий ион калия, 1С т - входящий ион калия, Р, -неорганический фосфат.

Таким образом, Na+/lCАТФаза, которая присутствует во всех клетках животных, образует электрогенный обменник внутриклеточного Na+ на внеклеточный 1С. Na+/lCАТФаза состоит из 3 субъединиц - а, р и у.

В исследованиях предыдущих лет уделяли большое внимание строению и функциям фермента, теперь все больше вопросам регуляции и активности Na+/fCАТФазы в различных условиях.

В сердце Na+/lC АТФаза непосредственно участвует в стабилизации трансмембранного градиента. Энергия, необходимая для совместного транспорта трех молекул Na+ из внешней среды во внутреннюю и двух молекул 1С из внутренней во внешнюю среду, обеспечивается гидролизом одной молекулы АТФ. Соотношение 3 Na : 2 1С, необходимое для работы фермента, было показано в ткани сердца на различных видах животных [133, 134]. Электрохимический градиент, создаваемый ионами, может быть заново использован для трансформирования энергии, а также для транспорта в клетку таких субстратов как аминокислоты, сахара, витамины, фосфат, Са2\ Н* и другие с использованием систем вторичного транспорта.

Содержание кислорода в крови человека (у крысы оно практически такое же, поскольку содержание гемоглобина близкое) составляет при р02 20 кРа или 120 мм рт ст (20% 02), то есть 20 объемных процентов (20,2 мл 02 на 100 мл крови), а в водном растворе при 37,7°С эта величина примерно в 100 раз меньше (0,3 объемных процента). Это значит, что хотя в плазме растворимость 02 такая же, как в любом растворе, количество кислорода, которое получает ткань при перфузии кровью, во много раз больше, чем при перфузии раствором, пусть даже насыщенным 100% 02. Поэтому результаты, полученные в рамках данной работы, могут быть взяты за базовые исследования с целью дальнейших разработок в данном направлении, но уже применительно к человеку.

Транспортная и гидролитическая активность AfoViT1" АТФазы в нейронах, эритроцитах, гепатоцитах зависит от уровня кислорода в ткани [16]. Ишемия сердца также сопровождается понижением гидролитической активности Л^аУЛГ1" АТФазы в ткани сердца [54]. Тридцатиминутная ишемия снижает уровень миокардиальной АТФ на 50% [153]. Ишемия сопровождается изменением количества синтезируемого АТФ в клетках [54]. При этом по данным исследований, проведенным на сердце для поддержания должного количества АТФ и обеспечения необходимой работы синтез АТФ перестраивается. Многие проводимые исследования посвящены работе и регуляции Na /1САТФазы в условиях ишемии [54, 19, 15] при этом работа и регуляция фермента в условиях гипоксии до сих пор остается не достаточно выясненной. В связи с этим остается непонятным значение недостатка кислорода в механизме изменения гидролитической активности Na/}CАТФазы.

Цель настоящей работы заключалась в изучении влияния величины напряжения кислорода в перфузионном растворе с учетом временного фактора на работу Ncf/K* АТФазы и выяснения механизма влияния кислорода.

Задачи работы:

1. Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на гидролитическую активность Na/K* АТФазы

2. Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на уровень АТФ в ткани и зависимость гидролитической активности Na+/lCАТФазы от изменения уровня АТФ

3. Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на уровень окисленной и восстановленной форм глутатиона в ткани

4. Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на активность пероксидаз в ткани

5. Изучить возможность влияния изменения продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе на количество воды в ткани как показатель набухания и повреждения ткани

Заключение диссертации по теме «Физиология», Лапина, Наталья Евгеньевна

Выводы

1. Уровень АТФ в ткани практически не изменялся от продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе, следовательно, не мог влиять на изменения гидролитической активности Na+/lC АТФазы.

2. Гидролитическая активность Na+/K* АТФазы изменяется в зависимости от продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе, причем нет прямой зависимости от времени перфузии или напряжения кислорода в перфузионном растворе. Это свидетельствует о действии других факторов, изменяющихся в зависимости от этих показателей. Такими факторами могут быть активные формы кислорода и азота.

3. Уровень окисленной и восстановленной формы глутатиона в ткани изменяется в зависимости от продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе, что свидетельствует об изменении количества активных форм кислорода и азота при данных условиях.

4. Максимум уровня пероксидаз приходится на 15 минутную перфузию, при этом гидролитическая активность при 15 минутной перфузии изменяется в зависимости от напряжения кислорода в перфузионном растворе.

5. Изменение продолжительности перфузии и напряжения кислорода в перфузионном растворе не влияло на количество воды в ткани, следовательно, не происходило набухания и повреждения ткани.

§ 3.6. Заключение

По данным Houston ct al [70] напряжение кислорода в ткани изолированного сердца при перфузии кровью составляет около 35 мм. рт. ст., при ишемии снижается практически до 0, после восстановления циркуляции крови напряжение восстанавливается до первоначального уровня.

Если сравнивать напряжение кислорода в крови и перфузионном растворе, то несмотря на то, что в плазме растворимость Oi такая же, как в любом растворе, количество кислорода, которое получает.ткань при перфузии кровью во много раз больше, чем при перфузии раствором, пусть даже насыщенным 100% 02. При этом перфузия раствором с напряжением кислорода 138,11 мм., рт. ст. (напряжение кислорода сравнимо р показателями в артериальной крови - 120 мм. рт. ст.) дает значение гидролитической активности достоверно ниже, чем 69,05 мм. рт. ст. (показатель сравним со значением напряжения кислорода в венозной крови). При. снижении напряжения кислорода от 34,374 до 9,062 мм. рт. . ст. мы видим невысокие значения гидролитической активности. Это можно объяснить воздействием на Net/1С АТФазу активных форм кислорода и азота. АФА могут образовываться за счет выделения сосудами сердца NO, как расслабляющего сосуды фактора для увеличения потока крови (перфузионного раствора) и присутствию в среде О2- Напряжение кислорода 6,333 мм. рт. ст. является критичной точкой, поскольку напряжение кислорода в ткани.бьющегося сердца показано 6 мм.рт. ст. [145]. Увеличение значение гидролитической активности в данном случае по сравнению точкой 9,062 мм. рт. ст. соответствует литературным данным, когда все ресурсы клетки направлены на поддержание внутриклеточного ионного состава.

Возможное действие АФА на клетки подтверждается тем, что добавление N-LAME (блокатор Ж>-синтазы) снижает скорость падения уровня АТФ в сердце [35]. Действие на уровень АТФ не оказывает NO [1], поскольку в работе использование NO доноров -SNAP (S-nitroso-N-acetylpenicillamine) не изменяет уровень АТФ при гипоксии без ацидоза. Скорость снижения уровня АТФ меньше изменяется в условиях ишемшг с применением блокатора М?-сшггазы (L-NAME) [35], чем при ишемии без добавление блокатора.

Мы получали значения для грубого гомогената ткани сердца, который показывал, что при гипоксических условиях наблюдается снижение гидролитической активности. Данные хорошо коррелируют с литературными данными [54]. При этом очищенный фермент (сарколеммная фракция) показывает наоборот возрастание гидролитической активности Na^/fCАТФазы. Fuller et al [54] считают, что большое значение в активации Nct/K?АТФазы, показанной на сарколеммной фракции, играет фосфорилирование PLM. *В данном случае PLM будет интегральной частью ферментативного комплекса в сердце.

Все полученные данные могут свидетельствовать, что для разного напряжения кислорода в перфузионном растворе имеют значение разные клеточные радикалы (таблица З.1.). Для напряжения кислорода в перфузионном растворе до 34,374 мм. рт. ст. (что соответствует венозной крови) большее действие оказывают АФА, действуя на фосфорилирование, митохондриальные АФК, изменения цитоскелета клетки. При напряжение кислорода от 34,374 до 69,05 мм. рт. ст. - АФК и АФА. Далее только АФК. цитоскелета клетки. При напряжение кислорода от 34.374 до 69.05 мм. рт. ст. - АФК и АФА. Далее только АФК.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лапина, Наталья Евгеньевна, 2005 год

1. Agullo L., Garicia-Dorado D., Escalona N., Ruiz-Meana M., Inserte J., Solder-Solder J. Effect of Iscemia on soluble and particulate guanylyl Cyclase-mediated cGMP synthesis in cardiomyocytes AmJ. Physiol Heart Circ Physiol 284, H2170-21176, 2003

2. Albers R.W. Biochemical aspect of active transport. Annual Review of Biochemistry 36, 727-756, 1967 # ;

3. Allan G., Bhattacherjee P., Brook C.D., Read N.G., Parke A.J.,

4. Andersen J.P., Vilsen B. Overview: subunit interaction and conformational states. Ca-ATPase and Na,K-ATPase compared Prog Clin Biol Res. 268A:603-22, 1988

5. Andriambeloson E., Witting P.K. Chemical regulation of nitric oxide: a1 role for intracellular myoglobin? Redox Report, 1, 3, H131-H135, 2002,

6. Arystarkova E., Wetzer R., Asinovski N.K., Sweadner J. The gamma subunit modulates Na(+) and K(+) affinity of the renal Na,K-ATPase. J Biol Chem., 274 (47), 33183-33185, 1999

7. Askari A., in Na,K ATPase and Related ATPases pp 17-26, 2000 j

8. Aufricht C., Bidmon В., Ruffingshofer D., Regele H., Herkner K., SiegelI

9. N.J., Kashgarian M., Van Why S.K. Ischemic conditioning prevents Na,KI

10. ATPase dissociation from the cytoskeletal cellular fraction after repeat renalischemia in rats. Pediatr Res. Jun;51(6):722-7, 2002

11. Axelsen K.B., Plamgren M.G. Evolution of substrate specificities in the P-type ATPase superfamily J. Mol Evol 46, 84-101, 1998 ,

12. Balaban R.S. Cardiac Energy Metabolism Homeostasis: Role of Cytosolic Calcium, J Mol Cell Cardiol 34, HI259 -H1271, 2002s